JPH08510636A - 多重翻訳開始部位から多量体タンパク質を発現出来るレトロウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 キャップ独立多シストロン様式で単一真核転写物から多重翻訳開始のため多重内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）として利用されるウイルス５′未翻訳領域（ＵＴＲｓ）とおよび細胞にとり込まれるレトロウイルスベクターが開示される。望ましいものは多重細胞ＩＲＥＳ、およびもしくはウイルスＩＲＥＳであり、例えばヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）の２１０塩基対５′未翻訳領域、あるいは脳心筋ウイルスからの５′ＵＴＲ、また他のウイルスあるいは細胞源からの他のＩＲＥＳなどである。二硫化物あるいは他の架橋材により翻訳後結合される時に、単一機能性ヘテロ二量体タンパク質を形成するいくつかのポリペプチドをこのベクターが生産する。この発明のベクターで生産されるタンパク質は、いくつかの異なったＭＨＣヘテロ二量体タンパク質を含む移植寛容性を導入するのにとりわけ有用なタンパク質である。

Description

【発明の詳細な説明】 多重翻訳開始部位から多量体タンパク質を発現出来るレトロウイルスベクター この出願は１９９３年１月２０日受理されたアメリカ合衆国出願番号０８／０ ０６，４７８を部分継承するものである。 この発明は単一の多シストロン性ｍＲＮＡからの真核性タンパク質の多重ポリ ペプチドサブユニットを発現するレトロウイルスベクターおよびこれらのベクタ ーから生産されるタンパク質に関する。発現されたタンパク質は移植寛容性を導 入するのに特に有用である。 レトロウイルスベクターは遺伝子移転を真核細胞に媒介する因子として有用で ある。これらのベクターは、ウイルスの構築遺伝子をコードする多数の配列が欠 失され対象となる遺伝子により代替される形で一般に構築される。レトロウイル スベクターはウイルスのパッケージングに必要なシグナルを含むが、感染性ウイ ルス粒子の生成に必要な情報は含まない。レトロウイルスベクターは（プラスミ ドＤＮＡの形態で）パッケージング細胞系に形質移入され、この細胞系がウイル ス粒子を生成するのに必要なレトロウイルス遺伝子産物をトランス形で供給する ことが出来る。パッケージング細胞系はレトロウイルスベクター不在下ではレト ロウイルスを増大させることは不可能である。形質移入パッケージング細胞系に より生産されるウイルス は、レトロウイルスパッケージング細胞系および造血細胞を含む他の細胞を感染 するのに使用することが出来る。レトロウイルスベクター配列は、レトロウイル ス媒介組込みにより宿主ゲノムに組込まれ、レトロウイルスベクター内に含まれ る対象となる遺伝子は組込みプロウイルス形態から離れてしっかりと発現するこ とが出来る。パッケージング細胞系は、レトロウイルス構築遺伝子およびレトロ ウイルスベクターに存在する配列の内の組換えの能力を最小にするような様式で 生成されることが必要である。もしこのような組換えが生じるものとすると、感 染性レトロウイルスベクター粒子は、いずれの宿主細胞でも複製できるように生 成されるであろう。 対象となる遺伝子はいくつかの一般的方法でプロウイルスバックボーンにとり 込まれる。もっとも直接的な構築物は、レトロウイルスの構造遺伝子が単一の遺 伝子により代替され、次いで長末端反復（ＬＴＲ）内のウイルス調節配列の制御 の下で転写される構築物である。他のベクターは５′ＬＴＲに含まれるウイルス プロモーターに加えてプロモーターを含む。 最近レトロウイルスベクターは、転写を開始する内部プロモーター要素の使用 を含むように設計されてきた。多重転写ユニットを含むレトロウイルスベクター についての一つの潜在的な問題は、もし選択が１個の遺伝子に適用されるなら、 他の遺伝子の発現は削減されるか完全に消失させ得るということである。これは 「プロモーターサプレッション」と命名されている（エマーソンおよびテマン、 １９８６年、核酸研究、１４巻、９３８１−９３９６ページ）。プロモーターサ プレッションの この現象は、この分野でのもっとも最近の文献報告が単一転写からの多重遺伝子 発現が望ましいと結論付けていることによる（アダム，エム．エイ．他、１９９ １年、ウイルス学。６５巻、４９８５−４９９０ページ；ガッタス，アイ．アー ル．他、１９９１年、分子細胞生物学、１１巻、５８４８−５８５９ページ、お よびモーガン，アール．エイ．他、１９９２年、核酸研究、２０巻、１２９３− １２９９ページ）。 単一真核転写物からの多重遺伝子の遺伝子発現はまずピコルナウイルスｍＲＮ Ａで観察された。これらウイルスｍＲＮＡの５′未翻訳配列は内部リボソームエ ントリー部位（ＩＲＥＳ）として作用し、ｍＲＮＡの最初のＡＵＧから下流に位 置する配列からタンパク質翻訳を容易にするように機能する一つの配列を含むこ とが十分に立証されてきた。ピコルナウイルスＩＲＥＳを用いて３個の遺伝子が 単一構築物から発現され、ここで遺伝子の１個がＳＶ４０プロモータにより転写 的に駆動され、残りの２個はレトロウイルスＬＴＲプロモーターにより同じく転 写的に駆動された（アダム他、前掲）。一つの例では２個のＩＲＥＳ配列が１個 の単一転写物に使用された（モーガン他、前掲）。 免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ、またＧＲＰ７８として知られる もので、分子量７８，０００のグルコース調節タンパク質）ｍＲＮＡの５′未翻 訳配列が、５′キャップ独立様式において哺乳類細胞にあるｍＲＮＡに対して直 接内部リボソーム結合を与えることが出来、これは内部リボソーム結 合メカニズムによる翻訳開始がこの細胞ｍＲＮＡにより使用されることを意味し ていることをメイスジャックおよびサーノーが報告した（（１９９１年）ネイチ ャー、３５３巻、９０−９４ページ）。 この発明はＢｉＰ ＩＲＥＳをレトロウイルスベクターに最初に使用したもの である。それはまた単一のレトロウイルス転写物からの翻訳開始のために２個以 上のＩＲＥＳを初めて使用し、また、単一構築物に同じＩＲＥＳの多重コピー（ 複製）を初めて使用したものである。更に初めて単一レトロウイルス構築物から ４乃至５個のポリペプチドを別個に発現する可能性を提示する。この発明は更に 単一、機能的、多量体タンパク質を形成することが出来る単一レトロウイルス構 築物により多重ポリペプチドの生産を可能にする。この発明の特に貴重な実施例 は細胞表面にヘテロ二重体主要組織適合タンパク質を発現するためのこの種のレ トロウイルスによるアプローチの最初の事例である。とりわけこのベクターは潜 在的移植受容体に移植寛容性を導入するという特異な目的のために異種タンパク 質を発現するのに使用することが出来る。 この発明のレトロウイルスベクターは、単一真核転写物から多重翻訳開始のた めの内部リボソーム結合部位として作用する真核細胞ＤＮＡあるいはウイルス配 列から誘導されるいくつかの５′未翻訳領域（ＵＴＲ）を持つように構築された 。この発明に従って望ましい５′未翻訳領域は、ヒト免疫グロブリン重鎖結合領 域（ＢｉＰ）ｍＲＮＡの５′未翻訳領域に該当する２１０塩基対断片の多重コピ ーとなり得る。代替的にこのベク ターはＢｉＰ ＩＲＥＳ配列と同じくピコルナウイルス配列から誘導されるＩＲ ＥＳ配列を含むことが出来る。このベクターはいくつかのポリペプチドを生産す ることが出来、ポリペプチドは翻訳後に結合されると機能的ヘテロ多重体タンパ ク質を形成する。この発明のベクターで生産されるタンパク質はいくつかの異な った主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ヘテロ二重体タンパク質を含む移植寛容性を 誘導するのに特に有用なタンパク質である。この発明は更にこれらのレトロウイ ルスベクターを構築する方法を提示する。 略語は以下の通りである。 ＬＴＲ−レトロウイルス長末端反復 ＢｉＰ−ヒト免疫グロブリン鎖結合タンパク質から得られるＩＲＥＳ ＧＰＴ−酵素キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコー ド化する大腸菌ｇｐｔ遺伝子の配列 ＣＡＴ−酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコード化す る大腸菌遺伝子の配列 Ｎｅｏ−酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコード化する大腸菌Ｔ ｎ５遺伝子の配列 ＤＲαおよびＤＲβ−ミニブタＭＨＣ ＩＩＤＲαおよびＤＲβ（Ｃハプロタ イプ）ｃＤＮＡ遺伝子 ＥＭＣ−脳心筋ウイルスからのＩＲＥＳ配列 形質移入ＧＰ／・ｅｎｖＡＭ１２細胞は接頭辞ＡＭにより識 別され、一方形質移入ＧＰ／Ｅ−８６細胞は接頭辞ＧＰにより識別される。ＧＰ ／Ｅ−８６細胞から生成されるウイルスを持つ形質導入ＰＡ３１７細胞は接頭辞 ＧＰＡで固定される。 図１はレトロウイルスベクターｐＬ７ｇＣＡＴおよびｐＰＢＭ１からｐＰＢＭ ５までの各ベクターおよびｐＰＢＭ７からｐＰＢＭ１０までの各ベクターを図で 示し、各ベクターは簡単に下記の通り説明される。 ｐＬ７ｇＣＡＴ：このレトロウイルスベクターはｐＬＮＣＸ（ミラーおよびロ スマン、１９８９年、バイオテクニク、７巻、９８０−９９０ページ）の誘導体 であり、３個のＢｉＰ ＩＲＥＳの翻訳制御の下で３個の異なる遺伝子を発現す ることか出来る。このベクターはまたクロラムフェニコールアセチルトランスフ ェラーゼ（ＣＡＴ）およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ ーゼ（ＧＰＴ）をコード化する２個のリポーター遺伝子を含む。 ｐＰＢＭ１：ｐＬ７ｇＣＡＴに存在するＭ−ＭＬＶの３′ＬＴＲがＭ−ＭＰＳ Ｖ（マウス骨髄増殖性肉腫ウイルス）の３′ＬＴＲにより代替されたものである 。 ｐＰＢＭ２：ＣＯＳＭ６細胞からの遺伝子の検出可能な一過性発現を達成する ために、無エンハンサーＳＶ４０複製起点のコピーがＣ１ａＩ部位の３′ＬＴＲ の前に挿入され、ｐＰＢＭ２が生成された。ユニークＢｇIII部位がｐＰＢＭ２ 構築の間に創り出された。ｐＰＢＭ２はＧＰＴおよびＣＡＴを発現するように設 計されている。 ｐＰＢＭ３：ミニブタＭＨＣクラスII ＤＲ ｃＤＮＡ遺伝 子（グスタフソン他、１９９０、免疫学ジャーナル、１４５巻、１９４６−１９ ５１ページ）がＨｉｎｄIIIおよびＮｏｔＩ部位の間で最初のＢｉＰ ＩＲＥＳ の後にｐＰＢＭ２に挿入された。ｐＰＢＭ３はＤＲβ、ＧＰＴおよびＣＡＴを発 現するように設計されている。 ｐＰＢＭ４：ポリリンカー配列がｐＰＢＭ３のＥｃｏＲＩ部位に挿入された。 この修飾は５′ＬＴＲから翻訳されるも一つの遺伝子の導入を強化する。Ｅｃｏ ＲＩ部位はこの修飾の間に破壊された。ｐＰＢＭ４はＤＲβ，ＧＰＴおよびＣＡ Ｔを発現するように設計されている。 ｐＰＢＭ４−プライム：ＳＶ４０ ｏｒｉ断片の指向はｐＰＢＭ４の指向から 逆転された。ｐＰＢＭ４−プライムの構築の間にポリリンカー配列はベクターか ら除去され、ＥｃｏＲＩ部位は再生成されＣ１ａＩ部位の一つは破壊された。 ｐＰＢＭ５：ネオマイシン耐性遺伝子がｐＰＢＭ４のＮｏｔＩおよびＢｇ１II 部位の間でＢｉＰ ＩＲＥＳ配列の第２コピーの下流に挿入された。ｐＰＢＭ５ はＤＲβおよびネオマイシン遺伝子を発現するように設計されている。 ｐＰＢＭ７：ミニブタＭＨＣクラスII ＤＲα ｃＤＮＡはｐＰＢＭ４のＮｏ ｔＩ−Ｂｇ１II部位にある第２ＢｉＰ ＩＲＥＳ配列の後に挿入された。ｐＰＢ Ｍ７はＤＲαおよびＤＲβのミニブタＭＨＣクラスII ｃＤＮＡ遺伝子を発現す るように設計された。 ｐＰＢＭ８：ｐＰＢＭ７が第３ＢｉＰ ＩＲＥＳ配列および ネオマイシン耐性遺伝子を含むように修飾された。ｐＰＢＭ８はネオマイシン耐 性遺伝子と共にＤＲαおよびＤＲβのミニブタＭＨＣクラスII ｃＤＮＡ遺伝子 を発現するように設計された。 ｐＢＭ９：２．８キロベース断片がｐＰＢＭ８を鋳型として利用してＨｉｎｄ III結合５′ＤＲβ（配列識別番号７）およびＣ１ａＩ結合３′ＳＶ４０ｏｒｉ （配列識別番号５）のプライマーを用いるＰＣＲによって生成された。この断片 はＨｉｎｄIIIおよびＣ１ａＩ消化ｐＰＢＭ４に挿入された。 ｐＰＢＭ１０：ｐＰＢＭ１０はＳＶ４０ ｏｒｉが除去される点を除けばｐＰ ＢＭ９と同一である。２．６２キロベース断片がＨｉｎｄIII結合５′ＤＲβ（ 配列識別番号７）およびＣ１ａＩ結合３′ネオマイシン（配列識別番号１９）の プライマー、更に鋳型としてｐＰＢＭ８を用いるＰＣＲにより生成された。ＤＮ Ａ断片はＨｉｎｄIIIおよびＣ１ａＩ消化ｐＰＢＭ４に挿入された。 図２はｐＬ７ｇＣＡＴからｐＰＢＭ１を構築するのに使用された実験記録の概 略図を示す。この場合ｐＬ７ｇＣＡＴのＣ１ａＩ−ＳａｃＩ断片は、骨髄増殖性 肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）の転写プロモーターエンハンサー領域を含むハイブリ ッド３′ＬＴＲでｐＬ７ｇＣＡＴのＭＯＭＬＶ３′ＬＴＲを代替するために、ｐ ＭＰＺｅｎの断片と交換された（ジョンソン他、１９８９年、ＥＭＢＯ Ｊ．、 ８巻、４４１−４４８ページ）。Ｊ１，Ｊ２，Ｊ３およびＪ４は、ポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを 示し、それぞれ配列識別番号１、配列識別番号２、配列識別番号３および配列識 別番号４に相当する。 図３はクロラムフェニコール アセチル トランスフェラーゼの活性に対する 検定（ＣＡＴ検定）の結果を描く薄層クロマトグラフィープレートのオートラジ オグラフを示す。この検定では、ＣＡＴ遺伝子（ｐＲＳＶｃａｔ−ＡＴＣＣ３７ １５２）のラウス肉腫ウイルスプロモーター駆動発現が、¹⁴Ｃ標識クロラムフェ ニコールのそのアセチル化単量体形態への転換を示す正の対照となる。他のすべ てのベクターは本文に記載されている通りである。 図４はレトロウイルス構築物ｐＢＮ５の一過性発現に続き、ＣＯＳＭ６細胞ラ イゼートのｍｌ当たりで生産されるネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ ポリペプチドの量を示す棒グラフを表す。Ｎｅｏ−ｐｌおよびＮｅｏ−フラスコ は、ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＰＢＭ５がそれぞ れ組織培養プレート（Ｎｅｏ−ｐｌ）あるいは組織培養フラスコ（Ｎｅｏ−フラ スコ）で成長するＣＯＳＭ６細胞に形質移入された時に、高水準のネオマイシン ホスホトランスフェラーゼを発現したことを示す実験に関する。ＲＳＶ−ｐｌ は負の対照として用いられたｐＲＳＶ−ＣＡＴを用いる類似の形質移入を表わす 。 図５はＣＯＳＭ６細胞の一時的形質移入に続きミニブタＭＨＣクラスIIの発現 を詳細に説明するフローサイトメトリー分析を示す。 Ａ．ＤＲα配列を含まないｐＰＢＭ４で形質移入されたＣＯ ＳＭ６細胞のフローサイトメトリー分析の同時ヒストグラム。細胞がＭＨＣクラ スII特異抗体であるＩＳＣＲ３で染色され、イソタイプ対照抗体７４−１２−４ で染色された細胞の蛍光強度と比較した時、蛍光強度の明らかな移動は観察され ない。 Ｂ．ｐＰＢＭ７で形質移入されたＣＯＳＭ６細胞の同時ヒストグラム。ＩＳＣ Ｒ３抗体による細胞の染色でより高い蛍光強度が、イソタイプ対照抗体７４−１ ２−４で得られるものと比較してＩＳＣＴ３で得られるヒストグラムの移動によ り示される。 図６は実施例２で報告される実験のフローチャート要約である。 図７は組込み多シストロン性レトロウイルス構築物から得られるミニブタＭＨ ＣクラスIIＤＲα／βヘテロ二量体の表面発現のフローサイトメトリー分析を示 す。 ヒストグラムは、ＤＲα／βヘテロ二量体を特異的に認識する抗体４０Ｄ、お よびＩｇＧ２ｂに特異的であり４０Ｄに対するイソタイプ対照である７６−２− １１を用いて染色することで得られる。 （Ａ）および（Ｂ）−それぞれ非形質移入ＧＰ／Ｅ−８６およびＧＰ／Ｅ−Ｅ ｎｖＡＭ１２細胞の染色パターン。 （Ｃ）および（Ｄ）−ｐＰＢＭ８で形質移入されたそれぞれＧＰ／Ｅ−８６お よびＧＰ／Ｅ−ｅｎｖＡＭ１２のＧ４１８耐性サブクローンの混合母集団（「バ ルク」）の染色パターン。 （Ｅ）および（Ｆ）−サブクローンの混合物（「バルク」） で形質導入された細胞の染色パターン。（Ｅ）形質移入ＧＰ／Ｅ−ｅｎｖＡＭ１ ２細胞から得られるパッケージウイルスは、ＧＰ＞ＡＭバルクとして記述され、 ＧＰ／Ｅ−８６細胞系を形質導入するために使用された。（Ｆ）−形質移入ＧＰ ／Ｅ−８６細胞から得られるパッケージウイルスはＡＭ＞ＧＰバルクとして記載 され、ＧＰ／Ｅ−ｅｎｖＡＭ１２細胞系を形質導入するために使用された。 図８はｐＰＢＭ８の形質移入の後で得られる個別のＧ４１８耐性サブクローン のフローサイトメトリー分析を示す。各パネルにおいて、４０Ｄ抗体の染色によ り得られたヒストグラムは、７６−２−１１で得られたものの上に重ねられた。 細胞は更にＭＨＣクラスＩ抗体であるＢ１０９４で染色された。（Ａ）および（ Ｃ）はそれぞれＧＰ／Ｅ−８６およびＧＰ／Ｅ−ｅｎｖＡＭ１２細胞系から得ら れたヒストグラムである。（Ｂ）はＧＰ／Ｅ−８６細胞をｐＰＢＭ８で形質移入 することで誘導されたＧＰ１²−２サブクローンのヒストグラムである。（Ｄ） はＧＰ／Ｅ−ｅｎｖＡＭ１２細胞をｐＰＢＭ８で形質移入することで誘導された ＡＭ１¹α−６サブクローンのヒストグラムである。 図９は、ブタＤＲβ ｃＤＮＡの５′末端に特異的なプライマー、ＨｉｎｄII I結合５′ＤＲβ（配列識別番号７）とブタＤＲα ｃＤＮＡの３′末端に特異 的なプライマー、Ｂｇ１II結合３′ＤＲα（配列識別番号１６）を併用してポリ メラーゼ連鎖反応により生産されたＤＮＡ断片を示すアガロースゲルの写真を示 す。ＰＣＲ分析に使用された鋳型ＤＮＡは個々のレト ロウイルスサブクローンから得られた。レーン１はλＢｓｔＥII ＤＮＡマーカ ーである。レーン２はＤＦＫ細胞で負の対照である（ヒルシュ，エフ．他、１９ ９２年、免疫学ジャーナル、１４９巻、８４１−８４６ページ）。レーン３はＡ Ｍ¹ａ−６である。レーン４はＡＭ¹ａ−４である。レーン５はＡＭ¹ｃ−３であ る。レーン６はＧＰ２³−１である。レーン７はＧＰ９¹ａ−３であり、またレー ン８はＧＰ１²−２である。 図１０はｐＰＢＭ８を使用して生成された形質移入Ｇ４１８耐性生産者細胞系 から得る染色体ＤＮＡのサザンブロッティング分析を示す。 （Ａ）はオートラジオグラフを示し、ここでは形質移入細胞系のそれぞれの名 称が各レーントップに示される。放射線標識プローブは無作為にプライムされた ブタＤＲβ ｃＤＮＡ断片であった。ＤＮＡ断片のサイズはλＢｓｔＥII ＤＮ Ａマーカーのそれに対するバンドの移動度を比較することにより推定された。各 レーンのＤＮＡ断片の推定サイズは矢印により示されている。 （Ｂ）はｐＰＢＭ８へのレトロウイルス挿入の図解的表示である。ＢｉＰ配列 の間の組換の結果として生じる潜在的欠失事象を通じて生成されたＤＮＡ断片の サイズが示されている。 図１１はｐＰＢＭ１３およびｐＰＢＭ１４ベクターをそれぞれのグラフによる 図解を示す。ｐＰＢＭ１３は、５′ＬＴＲの翻訳調節下でのＤＲβ配列およびＢ ｉＰ ＩＲＥＳ配列の翻訳調節下でのＤＲα配列を発現するように設計されてい る。 ｐＰＢＭ１４はＥＭＣＶ ＩＲＥＳの調節下にあるネオマイシン耐性遺伝子を含 むことを除けばｐＰＢＭ１３と同一である。 図１２はｐＰＢＭ１３で一過性形質移入されたＣＯＳＭ６細胞表面でのミニブ タＭＨＣクラスII ＤＲα／βヘテロ二量体についてのフローサイトメトリー分 析を示している。このヒストグラムは細胞を抗体７６−２−１１（イソタイプ対 照）、抗体Ｗ３６２（サル クラスＩを特異的に認識するもの）、あるいは抗体 ４００（ＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロ二量体に特異的なもの）で染色するこ とにより得られた。 図１３はＧＰ／Ｅ−８６の表面でのミニブタＭＨＣクラスII ＤＲα／βヘテ ロ二量体の発現についてのフローサイトメトリー分析を示している。（Ａ）．Ｄ Ｒα／βヘテロ二量体の発現を可能とする配列を含まないｐＰＢＭ５で形質移入 されたＧＰ／Ｅ−８６細胞。（Ｂ）−（Ｄ）はｐＰＢＭ１４でのＧＰ／Ｅ−８６ を細胞の形質移入により生成した個々のＧ４１８耐性クローンのヒストグラムを 示す。 図１４はｐＰＢＭ１４で形質移入されたＧＰ／Ｅ−８６細胞から得た一過性発 現ウイルス上澄みで形質導入されたＰＡ３１７細胞系から誘導されるサブクロー ンのフローサイトメトリー分析を示す。（Ａ）はモック形質移入ＧＰ／Ｅ−８６ 細胞から得られた上澄みで形質導入されたＰＡ３１７細胞のフローサイトメトリ ー分析である。（Ｂ）−（Ｆ）は個別形質導入Ｇ４１８耐性サブクローンのフロ ーサイトメトリー分析である。 図１５はイソタイプ対照に比較して、与えられたいずれの時間においても表面 にＭＨＣクラスII ＤＲα／βヘテロ二量体を発現する細胞の割合を詳細に説明 する棒グラフを示す。各サブクローンの名称は棒グラフの横座標に示されている 通りである。 図１６はＧ４１８耐性サブクローンの上澄みから分離されたＲＮＡのスロット ブロット ハイブリッド形成実験の結果を示す。（Ａ）無作為感作放射線標識Ｄ Ｒαプローブを用いてハイブリッド形成されたブロット。（Ｂ）無作為プライム 放射線標識ＤＲβプローブでハイブリッド形成されたブロット。サブクローンの 名称は示されている通りである。 一つの見地において、この発明はレトロウイルスベクターを提供し、このレト ロウイルスベクターは（１）その５′領域にある単一の転写調節配列、（ii）第 １ＤＮＡコード配列、（iii）少なくとも１個の追加ＤＮＡコード配列、および （iv）そのような（iii）の追加ＤＮＡコード配列の翻訳を調節するＩＲＥＳ配 列よりなり、ここでこのベクターは翻訳後の組合せが少なくとも１個の機能的多 量体タンパク質を形成出来る多重個別ポリペプチドを発現する。レトロウイルス ベクターは、例えば主要組織適合複合体の機能的ヘテロ二量体タンパク質を生産 する。 この見地の望ましい実施例において、ＩＲＥＳはＢｉＰ ＩＲＥＳである。Ｉ ＲＥＳがＢｉＰ ＩＲＥＳであるこのベクターは、望ましくは主要組織適合複合 体の単一ヘテロ二量体タンパク質を生産する。典型的なベクターはｐＬ７ｇＣＡ Ｔ，ｐＭＢ１からｐＭｂ１４およびそのいずれかの誘導体のグルー プから選択される（「誘導体」は構造的には修飾されるが実質的には機能上同等 な構築物として引用される）。更に考慮されたのはその細胞が望ましくは哺乳類 （とりわけヒト）であるようなこの見地のレトロウイルスベクターを含む細胞で ある。 この発明のも一つの見地は、（ｉ）その５′領域における単一転写調節配列、 （ii）第１ＤＮＡコード配列、（iii）少なくとも２個の追加ＤＮＡコード配列 、および（iv）そのＩＲＥＳの少なくとも１個が細胞ＩＲＥＳである少なくとも １個の機能的多量体タンパク質を発現するための各追加コード配列の翻訳を調節 するＩＲＥＳよりなるレトロウイルスベクターを提供する。望ましくは、少なく とも１個のこのようなＩＲＥＳは哺乳類ＩＲＥＳ（例えばＢｉＰ ＩＲＥＳ）で あり、他のＩＲＥＳはウイルスＩＲＥＳ（例えば脳心筋ＩＲＥＳ、ポリオウイル スＩＲＥＳあるいは肝炎ウイルスＩＲＥＳ）であることが出来る。 も一つの見地において、この発明はこの発明のレトロウイルスを含ませるよう な細胞あるいは組織を提供する。 も一つの見地において、この発明は移植に対するヒト受容体への免疫寛容性を 導入する方法を提供し、それは前記ヒト受容体から外移植された細胞を再導入し この発明のウイルスをそれに含ましめることよりなる。望ましくはＤＮＡコード 配列は、非ヒトの主要組織適合複合体の機能的ヘテロ二量体タンパク質をコード する。望ましくは非ヒトはブタ（例えばミニブタ）あるいは霊長類である。 この発明のベクターのタンパク質産物は架橋成分、すなわち 「リンカー」、例えば二硫化物架橋により結合される多重ポリペプチドサブユニ ットで形成される機能的タンパク質である。 一つの実施例において、移植受容体候補者に供与体特異的寛容性を導入するた めに、この発明のベクターは少なくとも１個のヘテロ二量体主要組織適合複合体 タンパク質の両方の鎖を発現するように構築される。 この発明の特に望ましい実施例において、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパ ク質（ＢｉＰ）から得る２１０塩基対５′未翻訳配列の１個のコピーを利用する 多シストロン性レトロウイルスベクターが構築された。これはすべてＢｉＰ配列 を利用して単一転写物から３個のポリペプチドを発現する。更にも一つの発現可 能遺伝子が５′ＬＴＲの直接調節の下に置かれ、しかもも一つの遺伝子がＳＶ４ ０プロモーターエンハンサーの下に置くことが出来る。 この発明の特に望ましい実施例において、ヒト免疫重鎖結合タンパク質（Ｂｉ Ｐ）から得る２１０塩基対５′未翻訳配列の１個のコピーおよび脳心筋ＩＲＥＳ の１個のコピーを利用する多シストロン性レトロウイルスベクターが構築された 。第３ポリペプチドはレトロウイルス５′ＬＴＲの翻訳調節下で発現される。こ のベクターは単一転写物から３個のポリペプチドを発現し、その内の２個は主要 組織適合複合体の多量体タンパク質を形成するために結合する。またも一つの発 現可能遺伝子はＳＣ４０プロモーターエンハンサーの直接制御の下に置くことが 出来る。 ＢｉＰを利用する主な利点は、（ｉ）二次構造の欠除、（ii）いずれの内部Ａ ＵＧ配列も不在、（iii）ウイルスパッケージ目的に適う小さいサイズ、および （iv）５′ＬＴＲから下流の距離にあるにも拘らず３個の位置すべてから直接翻 訳開始が殆ど出来る能力である。 このレトロウイルスベクターの追加の新規な見地はハイブリッド３′ＬＴＲの 使用であり、ここでＵ５配列はマウス増殖性肉腫ウイルス（Ｍ−ＭＰＳＶ）から 得られ、またＲおよびＵ３配列はＭ−ＭＬＶから採取されたが、それはＭ−ＭＰ ＳＶが骨髄性組織に置いて過剰発現を駆動する非常に強力な転写エンハンサーを 持つことがこれまでで示されたからであった（ボーテル，ディー．ディー．エル ．他、１９８８年、ウイルス学ジャーナル、６２巻、２４６４−２４７３ページ ）。 使用されるレトロウイルスベクターの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、 脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびハーヴェイ肉腫ウイルスから誘導 されるベクターを含む。この発明に従って構築される特異的ベクターは実施例で 説明される。 実施例 多シストロン性レトロウイルスベクターの構築と分析 ｐＬ７ｇＣＡＴの構築 ミラーおよびロスマン、１９８９年、バイオテクニク、７巻、９８０−９９０ ページに記載されたレトロウイルスベクターＬＮＣＸはネオマイシン ホスホト ランスフェラーゼ遺伝子およびＣＭＶプロモーターを除去することで修飾され、 それ は多シストロン性ベクター、ｐＬ７ｇＣＡＴに転換された。 ｐＭＢ１の構築 この構築（図１）において、目的はｐＬ７ｇＣＡＴから得るＭ−ＭＬＶ ３′ ＬＴＲをマウス骨髄増殖性肉腫ウイルス（Ｍ−ＭＰＳＶ）の３′ＬＴＲで代替す ることであり、後者は骨髄組織から誘導される細胞に転写するための相対的に強 力なエンハンサープロモーターを持っていた。この操作は３′ＬＴＲ領域で行わ れたが、それは３′ＬＴＲがレトロウイルス統合過程の間に重複され、それによ り統合プロウイルス状態から得る５′ＬＴＲ転写エンハンサープロモーターとし て機能するためであった。一つのＰＣＲ断片（ムリス，ケイ．ビー．およびファ ルーナ，エフ．エイ．、１９８９年、方法酵素学、１５５巻、３３５−３５０ペ ージ。サイキ，アール．ケイ．他、科学、２３９巻、４８７−４９１ページ。） がＪ１（配列識別番号１）およびＪ２（配列識別番号２）と命名された２個のオ リゴヌクレオチドプライマーおよびプラスミドｐＭＰＺＥＮ（ジョンソン他、１ ９８９年、ＥＭＢＯ Ｊ．８巻、４４１−４４８ページ）を用いて生成された。 プライマーＪ１はＭ−ＭＰＳＶ（ジェンバンク アクセス番号Ｋ０１６８３）の ヌクレオチド２１０２から２１１９に相当する。プライマーＪ２はＭ−ＭＰＳＶ 配列のヌクレオチド２６９３から２７０９の逆補体に相当する。６０８塩基対（ ｂｐ）ＰＣＲ断片は制限エンドヌクレアーゼＣ１ａＩおよびＳａｃＩで消化され 、アガロースゲルを通じて電気泳動を受けた。５５１塩基対Ｃ１ａＩ／ＳａｃＩ ＤＮＡ断片はジェネク リーンII ＤＮＡ精製キット（バイオ１０１インコーポレイテッド、ラホーラ、 カリフォルニア）を用いて切除され、分離された。ｐＬ７ｇＣＡＴもＣ１ａＩお よびＳａｃＩで消化されアガロースゲルを通じて電気泳動を受けた。ジェネクリ ーンIIで精製されたＰＣＲ断片はＣ１ａＩ／ＳａｃＩ消化ｐＬ７ｇＣＡＴに結合 された。この結合混合物は大腸菌ＪＭ１０９（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換 するために使用された。正のサブクローンが、ｐＭＰＺＥＮおよびＪ３（配列識 別番号３）更にＪ４（配列識別番号４）をＰＣＲプライマーとして使用する３２ Ｐ識別１０４塩基対ＰＣＲ生成断片を用いてコロニーハイブリッド形成により確 認された。Ｊ３はヌクレオチド２１２７−２１４３に相当し、Ｊ４はＭ−ＭＰＳ Ｖのヌクレオチド２２１５−２２３１の逆補体に相当する。クローンｐＰＢＭ１ は、ｐＰＢＭ１内でのＭ−ＭＰＳＶ配列の存在を確認するためにＪ１をプライマ ーに使用してＤＮＡ配列分析を受けた。 ｐＬ７ｇＣＡＴおよびｐＰＢＭ１から得るＣＡＴ発現の分析 ＣＯＳＭ６細胞（形質転換アフリカミドリザル腎細胞系）がｐＰＢＭ１および ｐＬ７ｇＣＡＴで形質移入され（アラッフォ，エイ．およびシード，ビー．、１ ９８７年、全米科学アカデミー紀要、１９８４年、８５７３−８５７７ページ） 、ＣＡＴ発現のため検定された（ゴーマン他、１９８２年、分子細胞生物学、２ 巻、１０４４−１０５１ページ。プロスト，イー．およびムーア，ディー．、１ ９８６年、遺伝子、４５ 巻、１０７−１１１ページ）。ＣＡＴ活性は２個のプラスミドのどちらを使って も形質移入体から検出出来なかった。ＣＡＴ発現の欠除に対し二つの可能な説明 があった。つまり（１）ｐＬ７ｇＣＡＴの予備ＤＮＡ配列分析が正しくなかった 。また（２）どちらのベクターもＳＶ４０ｏｒｉを含んでいなかったため、遺伝 子発現の欠除はＣＯＳＭ６細胞内でＤＮＡ複製を受けるのにベクターが無能であ った結果によるということであった。ｐＬ７ｇＣＡＴおよびｐＰＢＭ１のＤＮＡ 配列分析は、一方でイニシエーターであるメチオニンおよび続く配列がＣＡＴ遺 伝子内では無傷であり、第３ＢｉＰ配列の３′結合部とＣＡＴ遺伝子の間に１１ 個のヌクレオチドの欠失があったことを明らかにした。これら１１個のヌクレオ チドが内部翻訳開始にとって本質的であったかどうかを立証するために、ＳＶ４ ０ｏｒｉ配列がｐＰＢＭ１に挿入された。このベクターはｐＰＢＭ２として説明 される。 ｐＰＢＭ２の構築 一つのＰＣＲ断片がｐＣＤＭ８プラスミドＤＮＡ（シード，ビー．、１９８７ 年、ネイチャー、３２９巻、８４０−８４２ページ）を鋳型として、Ｃ１ａＩ結 合３′ＳＶ４０ｏｒｉ（配列識別番号５）およびＣ１ａＩ−Ｂｇ１II結合５′Ｓ Ｖ４０ｏｒｉ（配列識別番号６）プライマーを使って生成された。このＰＣＲ断 片はＣ１ａＩで切断され、ゲル精製された。Ｃ１ａＩ消化ＰＣＲ断片はｐＰＢＭ １のＣ１ａＩ部位にサブクローンされた。この構築物内で、ＳＶ４０ｏｒｉ配列 はＢｇ１II部位が３′ＬＴＲに隣接して位置するように指向され た（図１：ｐＰＢＭ２参照）。 ｐＰＢＭ２からのＣＡＴ発現の分析 ＣＯＳＭ６細胞はｐＰＢＭ２で形質移入され，ＣＡＴ生産のために分析された 。ｐＰＢＭ２で形質移入されたＣＯＳＭ６細胞から収穫されたＣＡＴの一過性発 現は対照プラスミドｐＲＳＶＣＡＴで形質移入された細胞により生産されるＣＡ Ｔの水準と比較された（図３）。これらの結果、ｐＬ７ｇＣＡＴからの１１個の ヌクレオチドの欠除がベクターｐＬ７ｇＣＡＴおよびｐＰＢＭ１におけるＣＡＴ 遺伝子の明白な発現の欠除を表わさなかったことが示された。むしろ、発現の欠 除はこれらのベクターがＣＯＳＭ６細胞に複製することが出来ないことによる結 果であった。 ｐＰＢＭ３の構築 ミニブタＭＨＣクラスII ＤＲα／β ｃＤＮＡ遺伝子を発現出来るベクター に最後に帰着するベクターシリーズにおける次のベクターは、ミニブタＭＨＣク ラスII ＤＲ８ ｃＤＮＡ遺伝子を含むベクターであった。ＤＲβ ｃＤＮＡ含 有プラスミドｐＰＢＳＫＳII−ＤＲβｃ（グスタフソン，ケイ．他、１９９０年 、全米科学アカデミー紀要、８７巻、９７９８−９８０２ページ。シェイファー ，ジー．イー．他、１９９１年、全米科学アカデミー紀要、８８巻、９７６０− ９７６４ページ）はＨｉｎｄIII結合５′ＤＲβ（配列識別番号７）およびＮｏ ｔＩ結合３′ＤＲβ（配列識別番号８）プライマーの存在下でのＰＣＲ反応で鋳 型として使用された。この断片はＨｉｎｄIIIおよびＮｏｔＩで切断され、ｐＰ ＢＭ２の ＨｉｎｄIIIおよびＮｏｔＩ部位の間に挿入された。生成するベクターはｐＰＢ Ｍ３として説明される。ｐＰＢＭ３から得るＣＡＴ遺伝子の一過性発現の分析は 、ＤＲβ ｃＤＮＡ配列の挿入がｐＰＢＭ２に関連してＣＡＴ発現の水準に影響 を与えなかったことを示した。 ｐＰＢＭ４およびｐＰＢＭ４プライム ＢｓｔＸＩ、ＳｓｐＩおよびＭ１ｕＩ制限部位を含むポリリンカー配列が２個 の２５塩基対長相補性オリゴヌクレオチドポリ１（配列識別番号９）およびポリ ２（配列識別番号１０）をアニーリングすることで創出され、この断片をｐＰＢ Ｍ３のＥｃｏＲＩ部位に挿入することでｐＰＢＭ４が生成された。ｐＰＢＭ４の ＤＮＡ配列分析はポリリンカーの３個のコピーがプラスミド内に存在することを 明らかにした。続く構築のためには、Ｂｇ１II部位がＳＶ４０ｏｒｉ断片の５′ 末端に位置するようにＳＶ４０ｏｒｉの指向を変える必要があった。従ってＳＶ ４０ｏｒｉ断片は切除され、Ｃ１ａＩ消化ｐＰＢＭ４ベクターで再びサブクロー ンされ、ｐＰＢＭ４プライムが生成された。ｐＰＢＭ４プライムの構築の間にポ リリンカーは除去され、ＥｃｏＲＩ部位が再創出され、ＳＶ４０ｏｒｉ配列の３ ′末端にあるＣ１ａＩ部位は破壊された。 ｐＰＢＭ５の構築 ＢｉＰ ＩＲＥＳ含有ＤＮＡ断片は、ヒトＧＲＰ７８配列（ジェンバンク ア クセス番号Ｍ１９６４５）のヌクレオチド３７６−４００およびＮｏｔＩ部位を 含むプライマーＮｏｔＩ結合５′プライマー（配列識別番号１１）、およびヒト ＧＲＰ ７８配列（ジェンバンク アクセス番号Ｍ１９６４５）のヌクレオチド５６９− ５８７の逆補体およびＥｃｏＲＩ部位を含むプライマーＥｃＩＲを用いるＰＣＲ により、ｐＬ７ｇＣＡＴから生成された。このＰＣＲ断片はＮｏｔＩおよびＥｃ ｏＲＩで切断され、ゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎIIにより精製された 。ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子含有ＤＮＡ断片は、ネオ マイシン耐性遺伝子のヌクレオチド１４９−１７７（ジェンバンク アクセス番 号Ｊ０１８３４）およびＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位を含むプライマーＥＸｎｅｏ （配列識別番号１３）、およびネオマイシン耐性遺伝子ヌクレオチド９２２−９ ４５およびＢｇ１II部位を含むプライマーＢｇ１II結合３′ネオマイシン（配列 識別番号１４）を用いてＰＣＲにより生成された。プラスミドｐＳＶ２Ｎｅｏ（ ＡＴＣＣ３７１４９）がＰＣＲ反応における鋳型として使用された。このＰＣＲ 断片はＥｃｏＲＩおよびＢｇ１IIで切断され、ゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌ ｅａｎIIにより精製された。２個のＰＣＲ断片はＮｏｔＩおよびＢｇ１II消化ｐ ＰＢＭ４プライムに指向的に挿入され、ｐＰＢＭ５の増加を与えた（図１）。 ｐＰＢＭ５からのネオマイシン トランスフェラーゼ活性の分析 ＣＯＳＭ６はｐＰＢＭ５で形質移入された。形質移入の４８時間後細胞は収穫 され、ＮＰＴII エリザキット＃５３０７−５４３２１０（５プライムから３プ ライム社、ボールダー、コロラド）を用いて細胞内で発現されたネオマイシン ホスホト ランスフェラーゼ活性の水準を分析された。検定の結果は図４で示される。 ｐＰＢＭ７の構築 ｐＰＢＭ４プライムはブタＤＲの遺伝子をサブクローニングするためのベクタ ーとして使用された。ブタＭＨＣクラスIIＤＲα遺伝子（ヒルシュ他、１９９２ 年、免疫学ジャーナル、１４９巻、８４１−８４６ページ）はＳａ１Ｉ結合５′ プライマー（配列識別番号１５）およびＢｇ１II結合３′プライマー（配列識別 番号１６）を用いてｐＰＢＳＫＳII−ＤＲα^cを鋳型プラスミドにして誘導され た。ＢｉＰ配列はＮｏｔＩ結合５′プライマー（配列識別番号１１）およびＳａ １Ｉ結合３′プライマー（配列識別番号１７）を用いてｐＬ７ｇＣＡＴからＰＣ Ｒにより分離された。ベクターはｐＰＢＭ４プライムをＮｏｔＩおよびＢｇ１II で消化して生成された。ＢｉＰ ＩＲＥＳ配列およびＤＲα配列は次いでｐＰＢ Ｍ４プライムに指向的にサブクローンされ、ｐＰＢＭ７に増大した。ｐＰＢＭ７ はＤＲαおよびＤＲβのミニブタＭＨＣクラスII ｃＤＮＡ配列を含んでいる。 ｐＰＢＭ８の構築 ｐＰＢＭ７はＢｇ１IIで消化され、ベクターの５′末端はコウシ腸アルカリ性 ホスファターゼ（プロメガ社、マジソン、ウイスコンシン）を用いて脱リン酸化 された。Ｂｇ１II部位に挿入されるべきＢｉＰ−ネオマイシン断片はｐＰＢＭ５ を鋳型として用いてＢｇ１II結合５′ＢｉＰプライマー（配列識別番号１８）お よびＢｇ１II結合３′ネオマイシンプライマー（配列 識別番号１４）を利用するＰＣＲによって分離された。サブクローンにある断片 の指向性を決定するために、サブクローンより得るＤＮＡはいくつかの制限酵素 の組合せによる消化で分析された。ｐＰＢＭ８はＤＲαおよびＤＲβ用のミニブ タＭＨＣクラスII ｃＤＮＡおよびＦ４１８耐性遺伝子を含んでいる。 ｐＰＢＭ９の構築 ｐＰＢＭ８の構築が完了した後、ｐＰＢＭ４からｐＰＢＭ４プライムの構築の 際にポリリンカー配列が除去されたことが発見された。従ってポリリンカー配列 をｐＰＢＭ８に挿入するために、２．８キロベースＰＣＲ断片がｐＰＢＭ８を鋳 型としプライマーＨｉｎｄ III結合ＤＲβ（配列識別番号７）およびプライマ ーＣ１ａＩ結合３′ＳＶ４０ｏｒｉ（配列識別番号５）を使用して生成された。 ＰＣＲ断片はＨｉｎｄIIIおよびＣ１ａＩで切断され、ｐＰＢＭ４のＣ１ａＩお よびＮｏｔＩ部位の間に挿入されてｐＰＢＭ９を創り出した。ｐＰＢＭ９はＤＲ αおよびＤＲβのミニブタＭＨＣクラスII ｃＤＮＡ遺伝子のための配列を含ん でいる。 ｐＰＢＭ１０の構築 一つのＰＣＲ断片がプライマーＨｉｎｄIII結合５′ＤＲβ（配列識別番号７ ）およびＣ１ａＩ結合３′ネオマイシン（配列識別番号１９）を使用しまたｐＰ ＢＭ８を鋳型として用いて生成された。このＰＣＲ断片はＨｉｎｄIIIおよびＣ １ａＩで切断され、ゲル電気泳動およびＧｅｎｅＣｌｅａｎIIで精製された。断 片はＮｏＣＩおよびＣ１ａＩ消化ｐＰＢＭ４のベク ター断片に挿入され、ｐＰＢＭ１０を生成した。ｐＰＢＭ１０はＤＲαおよびＤ ＲβのミニブタＭＨＣクラスII ｃＤＮＤ遺伝子の配列を含むが、ＳＶ４０ｏｒ ｉ配列が除去されているために、ｐＰＢＭ９とは異なる。ｐＰＢＭ１０はミニブ タＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現するように設計され、レトロウ イルスパッケージング細胞系の生成に使用された。 多シストロン性レトロウイルスベクターからのミニブタ−ＭＨＣクラスIIIＤ Ｒα／βの発現 ＣＯＳＭ６細胞は一過的に（Ａ）ｐＰＢＭ５あるいは（Ｂ）ｐＰＢＭ７で形質 移入された。４８時間後、細胞はＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体の細胞 表面発現を分析された。細胞の表面でのクラスII遺伝子発現の検出のために使用 された一次抗体はＩＳＣＲ３であり、これはＤＲαおよびＤＲβ両方が細胞表面 のヘテロニ量体として存在している場合にＤＲαのみのエピトープを特異的に認 識するものである（渡辺，エム．他、１９８３年、移植、３６巻７１２−７１８ ページ）。染色処理のための対照として、細胞はサルＭＨＣクラスＩタンパク質 を特異的に認識するＷ６３２抗体で更に染色された（ペスコヴィッツ，エム．デ ィー．他、１９８４年、実験医学ジャーナル、１６０巻、１４９５−１５０５ペ ージ）。一次抗体反応は、二次抗体であるフルオレセイン イソチオシアネート （ＦＩＴＣ）接合ヤギ抗マウス免疫グロブリンで細胞を保温することに続く。染 色された細胞はファクスキャンフローサイトメーター（ベクトンディキンソン社 ，サンホセ，カリフォル ニア）を使って分析された。図５は細胞数（縦座標）対蛍光対数（横座標）での ヒストグラム形式で示されたデータである。死滅細胞は、適切なゲーティングで 分析から除去された。すべての場合、データはその特定の抗体の対応するイソタ イプ対照（ＩＳＣＲ３に対し７６−２−１１およびＷ３６２に対し７４−１２− ４）を使って得られたデータと照合し比較された。重ね合わせられたヒストグラ ム（図５）は、ＤＲβ ｃＤＮＡ遺伝子のみを発現するｐＰＢＭ５で形質移入さ れた細胞全体にわたる増強蛍光強度で明示された多シストロン性様式のＤＲαお よびＤＲβ ｃＤＮＡ両方を含むｐＰＢＭ７で形質移入された１０−１５％のＣ ＯＳＭ６細胞を示している。このデータは従って我々の多シストロン型レトロウ イルスベクターがヘテロニ量体ＤＲα／βを細胞表面に発現出来ることを強調す るものである。 これはこの発明に従う一つのシステムを示すものであり、そのためレトロウイ ルスＤＮＡベース構築物における多重遺伝子の発現が安定した選択を行う必要も なく、またその被覆タンパク質内で組換えレトロウイルスＤＮＡをパッケージン グする必要もなく一過的に形質移入されたＣＯＳＭ６細胞内で容易に検出するこ とが出来る。 実施例２ ｐＰＢＭ８を使用してブタＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現する レトロウイルス生産者細胞系の生成 この実施例は、レトロウイルス被覆タンパク質内で３個の遺伝子を多シストロ ン型に発現出来る構築物のパッケージング、 およびその細胞系を形質導入する能力について報告するものである。この実施例 で報告される実験のフローダイヤグラムが図６で示される。Ｇ４１８耐性クロー ンから得る３個の遺伝子すべてから高水準の発現がモニターされ、多シストロン 型でのＢｉＰ ＩＲＥＳ配列の使用が成功したことを結論付けている。 パッケージング細胞系の形質移入および形質導入 ｐＰＢＭ８レトロウイルスベクターがエコトロピックパッケージング細胞系で あるＧＰ／Ｅ８６、あるいは両栄養性パッケージング細胞系であるＧＰ／Ｅ−ｅ ｎｖＡＭ１２を形質移入キット（ストラータジェン社，カリフォルニア）を用い て形質移入するのに使用された。両細胞系はアーサー バンク博士（コロンビア 大学）より得られた。形質移入の４８時間後、上澄み内の一過性発現ウイルスは 低タンパク質結合注射器フィルターを通じ濾過により回収され、８ｍｇ／ｍｌの ポリブレン（シグマ社，セントルイス，ミズーリ）の存在下で形質導入のために 受容体細胞の２０％から３０％の密集プレートに加えられた。ＧＰ／Ｅ−ｅｎｖ ＡＭ１２細胞は、ＧＰ／Ｅ−８６細胞からの上澄みに対する受容体細胞であり、 その逆もそうであった。形質移入の４時間後に、ウイルス上澄みは除去され、細 胞が２〜３日で複製２−３サイクルを受けるように完全培地が加えられた。この 時点において、形質導入細胞はいくつかの希釈溶液に分割され、０．８ｍｇ／ｍ ｌの活性Ｇ４１８含有培地が加えられた。これらの成長条件下で、ネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を発現する細胞だけが生存した。 Ｇ４１８含有培地内での選択の１４日後に、形質導入サブクローンは分離サブク ローンあるいはサブクローン混合物のいずれかでとり上げられ拡大した。一方、 形質移入細胞もまた選択培地で成長し、次いでＤＲα／β発現のため分析された 。 ミニブタＭＨＣクラスIIＤＲａ／ｂ ｃＤＮＡ遺伝子を含む組換えレトロウイ ルスにより形質導入された細部母集団の分析 フローサイトメトリー分析 形質導入細胞系のフローサイトメトリー分析がＩＳＣＲ３（渡辺他，前掲同書 ）あるいは４０Ｄ（ピエール，エム．他，１９８０年，免疫学ヨーロッパジャー ナル，１０巻，９５０−９５７ページ）のような抗体を用いて行われ、その両方 ともブタＭＨＣクラスIIＤＲαのポリペプチドがＤＲβポリペプチドとヘテロニ 量体を形成する時だけ前者を認識した。図７は「バルク」として引用されるサブ クローン混合物から得られるデータを示す。非形質移入細胞系のいずれも抗クラ スII抗体４０Ｄ（図７Ａおよび７Ｂ参照）で染色した蛍光の上昇を示さない。ｐ ＰＢＭ８で形質移入されたサブクローンの混合物は小さな移動を示し（図７Ｃお よび７Ｄ）、一方形質導入細胞は蛍光強度の明白な移動を示す（図７Ｅおよび７ Ｆ参照）。ＧＰ／Ｅ−ｅｎｖＡＭ１２細胞で作られたウイルスが、ＧＰ／Ｅ−８ ６細胞をより効率的に形質導入し、ＤＲα／βの発現をよりよく上昇させるとい う事実が示すのは相当するイソタイプのそれに関連し、４０Ｄで染色されて得ら れる著しい移動により明らかである（図７）。統計上の分析が示す所によると、 形質導入され たＧ４１８耐性ＧＰ／Ｅ−８６（ＡＭ＞ＧＰで示されている）細胞の３５％が表 面にＤＲα／βヘテロニ量体を発現出来ることがわかった。 ｐＰＢＭ８を用いてパッケージング細胞系の形質移入で生成した個別サブクロ ーンの分析 フローサイトメトリーで形質移入および形質導入された細胞のバルク母集団を 分析した後に、バルク母集団は希釈を制限することで個別Ｇ４１８耐性サブクロ ーンに対し印がつけられた。個別サブクローンは次いでフローサイトメトリーに より分析された。エコトロピックと同じく両栄養性生産者サブクローンの代表的 な蛍光ヒストグラムが図８で示される。図８Ａは、表面をブタＤＲα／βヘテロ ニ量体に対する抗体４０Ｄおよびイソタイプ対照抗体７６−２−１１で染色して 得られた対照（非形質移入Ｇ４１８感受性）ＧＰ／Ｅ−８６細胞の重ね合わせヒ ストグラムを示す。マウスＭＨＣクラスＩ抗原に特異的な抗体Ｂ１０９４（ディ ー．エッチ．サックス博士，マサチューセッツ総合病院，ボストン，マサチュー セッツ）を持つ細胞を染色して得られたヒストグラムは好結果の染色に対する正 の対照として役立った。４０Ｄヒストグラムにおける蛍光強度のピークの移動が ないということはイソタイプヒストグラムのそれと関連して、非形質移入パッケ ージング細胞系がＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現しないことを示 している（図８Ａ）。しかし図８Ｂで示されるように、形質移入細胞系ＧＰ１２ −２はヒストグラムを上昇させ、これは４０Ｄ抗体の蛍光ピークに明白な移動を 示す。非形質移入細胞系 ＧＰ／Ｅ−ｅｎｖＡＭ１２はＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現しな いが（図８Ｃ）、一方形質移入細胞系ＡＭ¹ａ−６はＤＲα／βヘテロニ量体の 高水準の発現を示す（図８Ｄ）。蛍光ヒストグラムの道理にかなったゲーティン グで得られる統計分析は、全細胞母集団の４２％および６５％がそれぞれエコト ロピックおよび両栄養性生産者サブクローンからＤＲα／βヘテロニ量体を発現 することを示した。 統合ＤＮＡの分析 細胞ＤＮＡを鋳型として使用して、ポリメラーゼ連鎖反応がプライマーＨｉｎ ｄIII結合５′ＤＲβ（配列識別番号１７）およびプライマーＢｇIII結合３′Ｄ Ｒα（配列識別番号１６）を使用し個別サブクローンの染色体に存在する結合Ｄ ＮＡ断片を分析するために行われた。ＰＣＲ断片はＤＮＡの完全性を確かめるた め、つまり組換えレトロウイルスベクターがベクター配列内で何らかの遺伝子再 調整を受けることなく細胞染色体に統合することを確実にするために配列された 。 １．８キロベースＰＣＲ断片の外観は理論的推定から予想されたものであった （図９）。配列分析は、統合ゲノムが細胞拡張の第１週に何らかの再調整も受け なかったことを明らかにした。負の対照においても現われたより短いバンドの世 代はアーチファイト（人工産物）であるか、あるいはいくつかの細胞配列におけ るプライマーの非特異性アニーリングが生成されたものであった。 ウイルス力価 ＮＩＨ−３Ｔ３の生産者細胞系の両方から生産されるウイル ス株の力価は約２×１０⁵であると決定された。 かくしてこれらのデータはレトロウイルス遺伝子治療目的のため多重タンパク 質でを発現するのに多シストロン性ベクターの使用が有効であることを強く支持 するものとなる。 実施例３ ｐＰＢＭ８で形質移入された細胞からのＤＮＡ分析 ｐＰＢＭ８で形質移入された後で得られる生産者細胞系の継代を続けている間 に、細胞がミニブタＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現する能力を徐 々に失ったことが認められた。統合ＤＮＡのサザンブロッティング分析が行われ た。ゲノムＤＮＡは、１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１００％密集培養プレ ートを２回洗浄して細胞系から分離された。細胞は４００μｍの２Ｘ溶解緩衝液 を追加して溶解された（２Ｘ溶解緩衝液はｐＨ７．０のトリス−塩酸、０．２Ｍ ，Ｎａ₂ＥＤＴＡ，０．１Ｍ，ＳＤＳ２％，ＮａＣｌ，０．１Ｍ，プロティナー ゼＫ４００μｇ／ｍｌを含む）。溶解細胞は室温で削られ、一晩５５℃で保温さ れた。この溶液は次いで緩衝飽和フェノールクロロホルムで５回抽出された。Ｄ ＮＡはエタノール沈殿され、トリス塩酸，ｐＨ７．０，１０ｍＭ，Ｎａ２ＥＤＴ Ａ１ｍＭ，デオキシリボヌクレーゼ欠失リボヌクレアーゼ５０μｇ／ｍｌを用い て３７℃，１時間再溶解された。ＤＮＡはフェノールクロロホルムで再抽出され エタノール沈殿された。ＤＮＡはｐＨ７．０のトリス演算１０ｍＭ，Ｎａ₂ＥＤ ＴＡ１ｍＭで再懸濁された。サザンブロッティング分析のためにＤＮＡ（２０μ ｇ）はＳａｃＩで消 化され、このＳａｃＩはレトロウイルスベクターを５′および３′ＬＴＲのみで 切断する。消化ＤＮＡはアガロース１％を経由して電気泳動され、ニトロセルロ ースフィルター（シャイハー アンド シェル社，キーン，ニューハンプシャー ）に移動された。膜は無作為プライム放射線（ベーリンガーマンハイム無作為プ ライミングキットに記載されている方法を用いる）プローブ（ＤＲαあるいはＤ Ｒβ断片のいずれか）に最適な条件下で一晩ハイブリッド化された。膜は緊縮条 件下で洗浄され、コダックＸオーマットフィルムに被曝された。図１０Ａはブタ ＤＲβプローブにハイブリッド化する配列の存在をプローブする細胞系から得る ＳａｃＩ消化ＤＮＡのオートラジオグラフを示す。４．９キロベース，３．６キ ロベースおよび３．０キロベースに相当するバンドの多重性は図１０Ｂの概略図 を用いて解釈出来、またもし統合されたＤＮＡがＢｉＰ ＩＲＥＳ配列のコピー の間で相同組換えを受けたならそれに期待されるサイズに相当することが出来る 。形質移入レトロウイルスパッケージング細胞系における欠失事象の頻度は、宿 主細胞に重複感染する生産されたウイルスの能力およびそれに続くレトロウイル ス仲介相同組換えにより説明することが出来る。重複感染現象は既に報告されて いる（メンチョー他，１９９０年，ウイルス学，１７６巻，２６２−２６５ペー ジ）。レトロウイルス仲介相同組換えの発生に関する文献にいくつかの最新の報 告がある（ザンおよびテマン，１９９３年，サイエンス，２５９巻２３４−２３ ８ページ。テマン，エイチ．１９９３年，全米科学アカデミー紀要，９０巻，６ ９００−６９０３ページ）。 容易に説明出来ないサイズに相当するバンドの存在は、明白でない配列相同性の 短い伸長の間での組換え事象の結果であると言える。全長プロウイルスＤＮＡ配 列に相当するバンドの強度（４．８キロベースバンド）は、異なったサブクロー ンに対してＤＲα／βヘテロニ量体の発現水準に相関する（図８）。 実施例４ ｐＰＢＭ１４でレトロウイルス形質導入されたパッケージング細胞系の生成と 分析 ｐＰＢＭ１３の構築 ｐＰＢＭ７（図１）は修飾されて、ＤＲβ ｃＤＮＡは翻訳開始のために５′ ＬＴＲの直接制御の下になることが出来た。これを行うために、ｐＢＳＫＳII− ＤＲβプラスミドからのＤＲβの５′ｃＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＥ Ｉ断片（ガスタフソン，ケイ．他，１９９０年，全米科学アカデミー紀要，８７ 巻９７９８−９８０２ページ）は、ＤＲβの５′配列だけでなく第１ＢｉＰ Ｉ ＲＥＳ配列も含むｐＰＢＭ７から得る類似の断片を代替するために使用された。 新たな構築物ｐＰＢＭ１３（図１１）は、かくして５′ＬＴＲの翻訳調節の下で ＤＲβ遺伝子を含む。ＤＲα ｃＤＮＡ遺伝子は翻訳調節の下に留る。ｐＰＢＭ １３は真核細胞における選択のための配列を含まない。 ｐＰＢＭ１４の構築 薬剤耐性マーカーをとり込むために、ｐＰＢＭ１３が下記のように修飾された 。第２の非相同性ＩＲＥＳを含むＤＮＡ 断片がポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成された。このプラスミドｐＧ１ＥＮ（ ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド，ゲイザーズバーグ，メリー ランド）はプライマーＢｇ１II−ＸｈｏＩ結合５′ＥＭＣ（配列識別番号２０） およびＢｇ１II結合３′ネオマイシン（配列識別番号１４）の存在下でポリメラ ーゼ連鎖反応を受けた。このように増幅された断片は脳心筋ウイルス（ＥＭＣＶ ）の５′非翻訳領域およびネオマイシンホスホントランスフェラーゼ遺伝子を含 む。ＤＮＡ断片はＢｇ１IIで切断され、ｐＰＢＭＢのＢｇ１II部位に挿入される 前に精製され、かくしてｐＰＢＭ１４を生成した（図１１）。 ｐＰＢＭ１３のＣＯＳＭ６細胞への形質移入に続くＭＨＣクラスIIＤＲａ／ｂ の分析 ＣＯＳＭ６細胞への形質移入は、実施例１に記載されているＤＥＡＥ硫酸デキ ストラン法によってＣｓＣｌ精製高次ニイルプラスミドＤＮＡを用いて行われた 。形質移入４８時間後に、細部はＮａ₂ＥＤＴＡ，０．２％を含む１Ｘリン酸緩 衝食塩水（ＰＢＳ−１ＸＰＢＳはＮａＣｌ，１３７ｍＭ，ＫＣｌ，２．７ｍＭ， Ｎａ₂ＨＰＯ４．７Ｈ₂Ｏ，４．３ｍＭ，ＫＨ₂ＰＯ４，１．４ｍＭ，ｐＨ７．３ ）の存在下で培養プレートを削り収穫された。集められた細胞は１Ｘ ＰＢＳで ２回水洗いされ、１０⁶細胞（１００μＬ内）は９６ウエル、マイクロタイタプ レートの各ウエルに付加された。適切に希釈された第一次抗体は３０分室温で染 色された細胞に加えられた。非反応性抗体は水洗いされ、ＦＩＴＣ接合第２次抗 体が３０分 間４０℃で加えられた。細胞緊縮水洗いの後、細胞はフローサイトメトリーによ り分析された。リン酸ヨウ化物ゲーティング（ベクトン−ディキンソン マニュ アル）は、死滅細胞を取り除くために使用された。図１２はフローサイトメトリ ー分析の結果を示し、データは細胞数を縦座標とし蛍光強度を横座標として使用 するヒストグラム形式で表される。ベクターｐＰＢＭ１３がｐＰＢＭ７が行った と同様に効率的にミニブタＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現するこ とを図１２が明らかにしている。 ｐＰＢＭ１４を用いるＧｐ／Ｅ−８６への形質移入および続くＰＡ３１７レト ロウイルスパッケージング細胞への形質導入エコトロピックＧＰ／Ｅ−８６レト ロウイルスパッケージング細胞系が哺乳類形質移入キット（ストラータジェン， ラホーラ，カリフォルニア）を使ってｐＰＢＭ１４で形質移入された。ＧＰ／Ｅ −８６細胞からの一過性発現細胞は形質移入４８時間後に収穫され、低タンパク 質結合０．４５μＭフィルター（ジェルマン サイエンシズ社，アンアーバー， ミシガン）を通じて濾過され、両栄養性パッケージングが細胞系ＰＡ３１７（Ａ ＴＣＣ ＣＲＬ９０７８）を形質導入するために使用された。レトロウイルスタ イタ１０４／ｍｌでは１８時間細胞を形質導入した後に、形質導入細胞は、適切 な希釈で分割され、５００μｇ／ｍｌ活性Ｇ４１８がＧ４１８耐性細胞を選択す るために培地に加えられた。形質移入効率をモニターするために、形質移入ＧＰ ／Ｅ−８６細胞はＧ４１８耐性クローンをスコアするために限定された希釈での 活性Ｇ４１８含有培地 １ｍｇ／ｍｌの存在下でプレートされた。 ｐＰＢＭ１４の（ａ）ＧＰ−Ｅ８６細胞および（ｂ）その後のＰＡ３１７細胞 の形質導入に続くＭＨＣクラスIIＤＲα／β発現の分析 ｐＰＢＭ１４でしっかりと形質移入されたＧｐ／Ｅ−８６細胞のフローサイト メモリー分析結果が図１３で示される。すべてのＧ４１８耐性細胞はその範囲を 異にしながらもＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現した（４個の個別 の形質移入Ｇ４１８耐性サブクローンのフローサイトメトリー分析については図 １３参照）。 ＧＰ／Ｅ−８６細胞に形質移入した４８時間後に一時的発現エコトロピックレ トロウイルスが両栄養性細胞系ｐＡ３１７を形質導入するために使用された。形 質導入サブクローンはＧ４１８での選択に続いて得られた。Ｇ４１８耐性クロー ンのフローサイトメトリー分析は、９０％以上の個別形質導入サブクローンがＭ ＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体の発現に正であったことを示した。図１４ Ａは負の対照、すなわちモック形質移入ＧＰ／Ｅ−８６細胞から生成された上澄 みで形質導入されたＰＡ３１７細胞を示す。抗体４０Ｄで得られたヒストグラム の大多数はピーク蛍光強度の単一の明白な移動を示した（５個の代表的なヒスト グラムが図１４Ｂ−Ｂで示されている）。１個のヒストグラム（図１４下）はピ ーク蛍光強度の二重の移動を示しており、これはＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテ ロニ量体発現サブクローンの混合母集団を多表示しているものである。 図１５は特定の母集団における形質導入細胞の割合を示す棒グラフを示し、こ れはイソタイプ対照を認識する抗体と比較してＤＲα／βヘテロニ量体を認識す る抗体の持つ蛍光強度の水準がより高いことを示している。 生産者クローンでＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体を発現する能力を失 うかどうかを測定するために、Ｇ４１８の最適以下の濃度（ＰＡ３１７誘導系に は２００μｇ／ｍｌまたＧＰ／Ｅ−８６誘導系には５００μｇ／ｍｌ）の存在下 で拡張された。約３０回の細胞分裂の後、生産者クローンはフローサイトメトリ ー分析で再分析された。発現水準は一定で変らず、ｐＰＢＭ８から誘導される系 （データはここで示されていない）で観測された急激な再調整／欠失現象を統合 レトロウイルス配設が受けなかったことを示していた。 ウイルスＲＮＡの分析 ＭＨＣクラスIIＤＲα／βヘテロニ量体の発現が単一プロウイルス統合事象に 存在する配列の発現の結果であることを確かめるために、ＲＮＡがペレット化ウ イルスから抽出され、ＲＮＡスロット ブロッティング分析が行われた。図１６ にあるオートラジオグラフは、放射性プローブとしてそれぞれのｃＤＮＡでのハ イブリッド形成の強度により識別されるように、クローンに対して同じ量のＤＲ αおよびＤＲβ ＲＮＡが存在することを示している。これは生産者サブクロー ンにあるプロウイルスゲノムの完全性を支持して論じる。もしも組換え／欠失が 起こったとしたら、ＤＲαあるいはＤＲβのいずれかに特異的なＲＮＡ転写物の 比率に差異を予想したことであろ う。というのは２個の異なったタイプのＲＮＡゲノムを持つウイルスは異なった 量のＲＮＡを発現することがあり得るためである。 ウイルス力価の検定 ウイルスは新鮮培養培地５ｍｌを第１日に１６時間８０％密集１０ｃｍ皿に加 えることでウイルス生産細胞から収穫された。第２日には、ウイルスを含む上澄 みが、低タンパク質結合フィルター０．４５μＭをとして濾過され、培地で適切 に希釈された。次いで各種希釈液からの上澄み０．５ｍｌがポリブレン４μｇ／ ｍｌの存在下で受容体ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）の４０％密集 皿に加えられた。第３日には、活性Ｇ４１８，１ｍｇ／ｍｌを含む新鮮培地が形 質導入細胞に加えられ、ネオマイシン耐性コロニーが細胞をメタノール内に固着 し細胞をギームサ染料で染色することで１０〜１２日後にスコアされた。ウイル ス力価は表１で示されるようにコロニー形成単位／ｍｌ（ｃｆｕ／ｍｌ）で計数 された。 形質導入ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増幅による複製可能レトロウイルスの存在の検 定 安定性Ｇ４１８耐性ＮＩＨ−３Ｔ３細胞が増幅され、複製可能レトロウイルス （ＲＣＲ）の存在を検定された。もし仮りに何らかの雑菌混入あるいは組換え事 象がＮＩＨ−３Ｔ３細胞に感染させるのに使用される両栄養性ウイルス上澄み内 でＰＣＲに上昇を与えることが出来るとするなら、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の拡張は ＲＣＲの何倍かの増幅に帰着するであろう。この増幅技法により、指示細胞系と してＰＧ４を使用するマーカーレス キューＳ＋Ｌ−検定を行うことにより（ハーパラ，ディー．他，１９８５年，ウ イルス学ジャーナル，５３巻，８２７−８３３ページ）、あるいは包膜タンパク 質の配列に相当するプライマー配列を用いるＰＣＲにより、単一ＲＣＲの空破（ 分離）を検出することが出来た。これらの方法の詳細は記載されている通りであ る（アンダースン，ダブリュ．エフ．，１９９３年，ヒト遺伝子治療，４巻，３ １−３２１ページ）。ＰＧ４細胞上に焦点を形成することがそれぞれのＮＩＨ− ３Ｔ３細胞からの上澄みでは出来ないことは、複製可能ウイルスが存在しなかっ たか、あるいはレトロウイルスベクターおよびパッケージング細胞系の特定の組 合せで生成されなかったことを示すものであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 35/76 8314−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 38/00 ＡＢＣ 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ル ガーン，クリスチャン エイ. アメリカ合衆国，02161 マサチューセッ ツ，ニュートン ハイランズ，ディッカー マン ロード 140 (72)発明者 シード，ブライアン アメリカ合衆国，02114 マサチューセッ ツ，ボストン，５Ｊ，ホーソン プレイス ９ (72)発明者 バナージー，ペイピス ティー. アメリカ合衆国，02173 マサチューセッ ツ，レキシントン，ウォード ストリート 67

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一つのレトロウイルスベクターであって、 （i）その５′領域にある単一転写調節配列 （ii）第１ＤＮＡコーディング配列 （iii）少くとも一つの追加ＤＮＡコーディング配列 （iv）（iii）の各ＤＮＡコーディング配列の翻訳を制御する一つのＩＲＥＳで あり、ここでベクターが少くとも１個の機能性多量体タンパク質を形成するため に翻訳後組合せの可能な多重個別ポリペプチドを発現するＩＲＥＳ、 よりなることを特徴とするレトロウイルスベクター。 ２．ＩＲＥＳがＢｉＰ ＩＲＥＳであることを特徴とする請求の範囲第１項記載 のレトロウイルスベクター。 ３．少くとも１個の機能性多量体タンパク質を形成するために翻訳後組合せの可 能な多重個別ポリペプチドを発現することを特徴とする請求の範囲第２項記載の レトロウイルスベクター。 ４．主要組織適合複合体の単一の機能性ヘテロニ量体タンパク質を生産すること を特徴とする請求の範囲第２項記載のレトロウイルスベクター。 ５．ｐＬ７ｇＣＡＴ，ｐＰＢＭ１からｐＰＢＭ１４、およびそのいずれかの誘導 体のグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載のレトロウ イルスベクター。 ６．請求の範囲第１項記載のレトロウイルスベクターを含むことを特徴とする一 つの細胞。 ７．細胞が哺乳類のものであることを特徴とする請求の範囲第６項記載の細胞。 ８．細胞がヒトのものであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の細胞。 ９．一つのレトロウイルスベクターであって、 （i）その５′領域にある単一転写調節配列 （ii）第１ＤＮＡコーディング配列 （iii）少くとも二つの追加ＤＮＡコーディング配列、および （iv）少くとも１個の機能性多量体タンパク質を発現するために各追加コーディ ング配列の翻訳を制御するＩＲＥＳであって、ここで少くとも１個のそのような ＩＲＥＳが細胞ＩＲＥＳであること よりなることを特徴とするレトロウイルスベクター。 １０．細胞ＩＲＥＳが哺乳類ＩＲＥＳであることを特徴とする請求の範囲第９項 記載のレトロウイルスベクター。 １１．細胞ＩＲＥＳがＢｉＰ ＩＲＥＳであることを特徴とする請求の範囲第１ ０項記載のレトロウイルスベクター。 １２．請求の範囲第９項、（ｉｖ）記載の少くとも１個のＩＲＥＳがウイルスＩ ＲＥＳであることを特徴とするレトロウイルスベクター。 １３．移植のためヒト受容体負疫寛容性を導入する一つの方法であって、前記ヒ トから細胞が外植され、機能性多量体タンパク質を生産するために翻訳後結合す る多重個別哺乳類ポリペプチドを発現するベクターを含ませた細胞を前記ヒト受 容体に再導入することを特徴とする方法。 １４．請求の範囲第１３項記載の方法であって、ここで前記ＤＮＡコーディング 配列が非ヒトの主要組織適合複合体の機能 性ヘテロニ量体タンパク質のポリペプチドをコードすることを特徴とする方法。 １５．非ヒトがブタであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。 １６．非ヒトが霊長類であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。