KR19980702961A - 재조합 인간 면역 결핍 바이러스 생산 세포주 - Google Patents

재조합 인간 면역 결핍 바이러스 생산 세포주 Download PDF

Info

Publication number
KR19980702961A
KR19980702961A KR1019970706369A KR19970706369A KR19980702961A KR 19980702961 A KR19980702961 A KR 19980702961A KR 1019970706369 A KR1019970706369 A KR 1019970706369A KR 19970706369 A KR19970706369 A KR 19970706369A KR 19980702961 A KR19980702961 A KR 19980702961A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
immunodeficiency virus
human immunodeficiency
sequence
cells
Prior art date
Application number
KR1019970706369A
Other languages
English (en)
Inventor
다까시 시마다
가쓰히꼬 아끼야마
히데까즈 구마
요스께 스즈끼
Original Assignee
나까도미 히로다까
히사미쓰 세이야꾸 가부시끼 가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 나까도미 히로다까, 히사미쓰 세이야꾸 가부시끼 가이샤 filed Critical 나까도미 히로다까
Publication of KR19980702961A publication Critical patent/KR19980702961A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Abstract

인간 면역결핍 바이러스 게놈으로 암호화되는 gag, pol 및 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 패키징 시그널이 결핍된 재조합 인간 면역결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포에 도입하여 수득하고, 상기 유전자를 안정하게 유지하는 재조합 인간 면역결핍 바이러스 생산 세포. 이 세포로 HIV 벡터를 다량으로 효율적 및 안정하게 제조하는 것이 가능하다.

Description

재조합 인간 면역결핍 바이러스 생산 세포주
최근의 유전공학에서의 빠르 진보는 분자 생물학에서의 다양한 기술의 발전을 촉발하였다. 이것은 유전정보의 분석 및 유전자 기능의 해명에서의 놀랄만한 진보와 함께 이루어졌으며, 실제적인 치료 환경에서 상기의 성취를 활용하고자 많은 시도가 행해지고 있다. 가장 현저한 진보를 보이는 분야중의 하나는 유전자 치료 분야이다. 각종 유전병의 병인 유전자가 한편으로는 발견 및 해독되었고, 또 한편으로는 물리적 및 화학적 기술로 이러한 유전자를 세포로 옮기는 방법을 개발하였으며; 그 결과, 유전자 치료는 예비임상실험에서 실제적 임상적용에까지 진전되었다.
유전자 전달용 세포 (목표 세포)의 유형에 따라, 유전자 치료는 배선세포유전자 치료 또는 체성세포유전자 치료로 분류된다.
또 다른 분류방법은 비정상 (병인성) 유전자는 온전히 둔채, 새로운(정상) 유전자를 첨가하는 증가 유전자치료 및 비정상 유전자를 정상유전자로 대체하는 대체 유전자치료이다. 현 단계에서, 체성세포의 증가유전자치료만이 윤리적 및 기술적 제한을 고려하여 실용되고 있다. 좀더 구체적으로는, 현 실행의 유전자 치료 방법은 환자로부터 목표유전자를 발취하고, 삽입할 유전자를 목표 세포로 전달시킨후, 이를 환자의 몸으로 환원시키는 자가이식(예, 체외유전자치료)에 의한 방법이다. 장래의 가능성 때문에 검토중인 방법은 환자에게 유전자를 직접 투여하는 방법이다(체내유전자치료).
전술한 유전자치료의 임상적 적용을 위한 주요한 기술적 난제중의 하나는 효율적이고 일관된 방법으로 외인성 유전자를 목표 세포에 도입하는 방법의 개발이다. 80년대 초반에, 마이크로주사와 같은 물리적 기술이 시도되었다; 그러나, 이러한 방법은 낮은 유전자 전달 효율, 일관된 전달의 달성 불능 및 대규모 세포배양의 이용가능한 기술의 제한과 같은 여러 문제점으로 인해 결국 상용화되지 못하였다. 유전자치료의 임상적 적용이 가능해진 것은 외인성 유전자를 효과적으로 목표 세포에 삽입하기위하 재조합 바이러스(바이러스 벡터)를 개발한 이후이다.
미합중국에 있어서, 약 70개의 유전자 치료의 프로토콜이 승인되었으며, 실제적으로 200명이상의 환자가 현재 유전자치료를 받고 있다. 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV, 또는 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스) 벡터가 가장 통상적으로 사용되는 유전자 전달 수단이다. MoMLV는 일종의 레트로바이러스이고, 만일 이의 표면상의 외피가 숙주 세포의 표면상의 수용체에 특이적으로 결합하면 숙죽세포를 감염시킨다. 재조합 MoMLV은 외피의 종류에 따라 상이한 세포종에 유전자 전달할 수 있으며, 예컨대, 단지 설취류만을 감염시키는 에코트로픽(ecotropics) 및 설취류 및 인간세포 양쪽을 감염시키는 암포트로픽(ampotropics)으로 분류된다.
재조합 MoMLV 벡터의 제조에는 첫째로, 하나는 MoMLV 게놈에서 암호화되는 gag, pol 및 env 유전자 및 이러한 유전자의 구동용 프로모터를 갖는 헬퍼 플라스미드이고, 다른 하나는 약제로서 작용하는 유전자의 양 말단에 삽입된 MoMLV 의 말단 반복 서열(LTR)을 갖는 벡터 플라스미드인, 두개의 플라스미드의 구축이 요구된다. 이 경우에 있어서, 야생형 바이러스의 생성을 방지하기 위해서, 유전자를 바이러스의 입자로 패키징시키는 시그널 서열인 패키징 시그널을 헬퍼 플라스미드로부터 미리 제거시킨다. 반대로, 패키징 시그널은 벡터 플라스미드에 포함된다. 많은 경우에서, 바이러스 벡터로 트랜스펙션된 세포만을 인식하거나 선택하는 리포터 유전자를 벡터 플라스미드의 유전자 서열에 삽입한다. 세포를 이러한 두 종류의 유전자로 공트랜스펙션시키는 것으로 재조합 바이러스 벡터가 배양물의 상층물내에서 생성된다.
최근에, 패키징 세포로 불리우는 세포주가 MoMLV 벡터의 좀더 효과적인 제조를 달성하기 위한 수단으로서 확립되었다. 이것은 MoMLV 벡터의 제조에 필요한 헬퍼 플라스미드 및/또는 벡터 플라스미드가 세포 게놈 DNA에 안정되게 통합되어 있는 세포주이다. 이러한 세포주의 사용은 많은 이점을 제공하며, 이러한 것들중에서 하기의 것들을 특히 언급할 만하다:
(1) 바이러스 벡터의 제조에서의 트랜스펙션의 번잡함이 제거된다;
(2) 세포로의 유전자 전달의 효율에서 제한적인 인산칼슘절차에 의해 전형화된 트랜스팩션 절차와 비교하여, 중요한 유전자가 모두 미리 트랜스펙션된 패키징 세포를 사용하는 것이 고능력의 바이러스 벡터를 제조하는데 유리하다;
(3) 만일 트랜스펙션이 인산칼슘절차에 의해 여러 장소에서 행해지면, 유전자 전달 효율이 장소들 사이에서 흩어져, 일관된 능력의 바이러스 벡터는 일정하게 공급될 수 없으나, 패키징 세포를 이용한 제조절차의 경우에는 그렇지 않으며, 유전자 전달 효율의 분산은 적다; 그리고
(4) 인산칼슘 절차에 있어서, 다량의 바이러스 벡터의 제조에는 트랜스펙션을 위해 상당히 많은 양의 플라스미드가 필요하나, 만일 패키징 세포를 사용하면 이럴 필요가 없다.
상기 및 다른 이점들 때문에, 패키징 세포의 사용이 현재 MoMLV 벡터 제조의 가장 통상적인 방법이다.
MoMLV 벡터의 또 다른 특성은 숙주 특이성의 결핍이다. 이 특성은 다양한 세포가 MoMLV 벡터의 목표 세포가 될 수 있고, 각종 질병과 관련하여 벡터를 사용하는 것이 가능함을 보여준다. 한편, 고려하의 바이러스 벡터의 특성인 숙주 특이성의 내생적 결핍은 이것을 체내로 투입하는 것을 어렵게 한다.
사실, 만일 이러한 바이러스 벡터를 치료목적으로 이용하고자 한다면, 투여 방법에 대해서 어떤 고려를 하여야 한다. 일례로, 이것을 혈구에 투입하고자하는 경우, 현재 사용하는 방법은 체내로부터 치료하고자 하는 세포를 취하고, 유전자를 전달한후, 세포를 다시 체내로 넣는 단계들로 구성된다(체외 유전자 전달); 그러나, 이 기술에는 특별한 장치가 필요하여 단지 제한된 시설에서만 치료목적으로 사용될 수 있다. 만일 바이러스 벡터를 특정 기관 또는 조직에 정착된 세포에 투여하고자 한다면, 현재 사용되는 방법은 치료하고자하는 기관 또는 조직에 국부적으로 투여하는 것이다: 그러나, 이러한 접근은 국부적 투여를 가능케 하기 위해서는 외과수술을 행하여 할 필요가 있는 것과 같은 여러 문제점을 갖는다.
조직 특히 바이러스 벡터가 전술한 문제점을 해결하기 위한 수단으로서 개발되었다. HIV 벡터는 CD4 양성 세포로 특이 유전자 전달을 할 수 있는 일종의 조직 트이 바이러스 벡터이고, 감염동안 CD4 양성 T 임파구의 표면상의 CD4 단백질에 특이적으로 결합하는 HIV 외피 단백질 gp120의 능력을 이용한다( 시마다, 티.,등. J. clin. Invest. 88. 1043, 1991). 이러한 바이러 벡터를 이용한 유전자 치료로 치료가 기대되는 질병에는 CD4 양성 임파구가 병인성 인자이기 때문에 특별히 높은 사망률을 갖으며 이에 대한 치료방법이 확립되어 있지 않는 후천성면역결핍증(AIDS) 및 성인 T-세포백혈병 (ATL)이 포함된다.
후천성 면역 결핍증(AIDS)는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 의한 CD4 양성 임파구의 감염에 의해 유발되고, 그 결과 세포-중재 면역성에 심각한 손상을 가져오는 질병이고, 이는 각종 기회감염, 림프종, 신경병증등의 유발을 촉발한다. 현재 사용되는 HIV의 치료법은 뉴클레오티드 종류의 역전사효소 억제제로서 분류된 약제이고, 3'-아지도-2', 3',-디데옥시트타이미딘 (AZT), 2'-3'-디데옥시이노신(ddI), 2',3'-디데옥시사이티딘(ddC)등을 독립적으로 또는 조합하여 사용한다.
그러나, 이러한 약제들중 어느것도 이미 감염된 세포를 물리칠 수 있는 능력을 갖지 않으며; 또한, 약제 내성 바이러스 균주의 발생 뿐만아니라 현격한 골수 억제 및 소화기관에서의 증후를 포함한 심각한 부작용을 유발하는 문제점과 같은 큰 문제점을 갖는다; 이러한 상황하에서, 좀더 효과적이고, 부작용이 덜하며 더 적은 바이러스내성 균주가 발생하는 새로운 유형의 약제의 개발이 강력히 요구된다.
성인 T-세포 백혈병(ATL)에 있어서, 이것은 우끼야마등에 의해서 제안된 개념적인 질병이고(우끼야마, 티. 등, Blood, 50, 481-492, 1977), HTLV-1은 이 질병의 병인성 바이러스로서 간주되고 있다 (히누마, 와이. 등, Proc. Nat1. Acad, Sci. USA, 78, 6476-6480, 1981); 그러나 ATL 발증의 메카니즘 및 ATL 세포의 성장의 메카니즘과 관련하여 설명하여야 할 것이 많이 남아 있다. 급성 임파구 백혈병에 관하여서는, 방사선치료 및/또는 골수이식과 화학치료의 조합이 오늘날 상당히 높은 경감 또는 치료의 빈도를 가져오는 것으로 입증되었다. 그러나, ATL에 대해서는, 이러한 방법에 의한 치료는 만족스러운 결과를 가져오지 모하고 새로운 치료 방법의 개발이 긴급히 요구된다.
최근에, 이러한 난치병에 대한 유전자 치료의 적용이 예비임상 검토하에 있다. AIDS에 관해서는, 정연한 방법의 HIV 복제의 메카니즘을 이용하는 다양한 치료 시스템이 제안되었고, 이것에는 이하의 단계로 구성된다: TAR 및 RRE 데코이와 같은 RNA 데코이를 이용하여 HIV 복제의 유력한 촉진제로 믿어지는 Tat 및 Rev의 작용을 억제시키는 단계 (술렌거. 비. 에이. 등, Cell 63, 601, 1990); 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 HIV mRNA 또는 DNA와의 혼성 단계 (채터지, 에스. 등, Science, 258, 1485, 1992); 리보좀을 이용한 HIV의 RNA의 절단단계 (스테벨로, 케이.엠.등, Virology, 190, 176, 1992); 및 HIV 복제에 필수적인 단백질의 기능을 억제하는 트랜스도미넌트 돌연변이체를 이용하는 단계 (호프, 티. 제이. 등, J. Virol, 66, 1849, 1992).
ATL과 관련하여서는, 인간 심플렉스(simplex) 헤르페스 바이러스내 타이미딘 카나아제 유전자를 ATL 세포에 통합시키는 시스템이 검토중이며, 이 유전자는 단지 ATL 세포만이 특이적으로 간시클로비르(ganciclovir)에 의해 죽도록 발현된다(자즈노리 이마다 및 다꾸 우찌야마, ZOKETSU INSHI (조혈인자), 5,4,501-503, 1994).
이미 언급하였듯이, HIV 벡터는 조직 특이 바이러스 벡터로서 매우 높은 유용성을 갖으나 제조 절차와 함께 여러 문제점을 갖는다. 현재 사용되고 있는 HIV 벡터의 제조방법은 사용하기 직전에 COS 세포를 헬퍼 플라스미드 및 벡터 플라스미드로 공트랜스펙션시키는 것이다. 그러나, 앞서 지적된 바와 같이, 인산 칼슘방법으로 전형화된 트랜스펙션 절차는 (1) 번잡한 조작, (2) 유전자 전달의 제한된 효율, (3) 유전자 전달의 효율에서의 장소에 따른 변동 및 (4) 플라스미드의 대규모 제조의 필요를 포함하는 많은 문제점을 갖는다.
비록 HIV 벡터는 조직 특이 바이러스 벡터로서 유용한 전망이 있지만, 이의 제조 방법에는 많은 문제점이 수반되고, 현재 사용되고 있는 방법은 사용직전에 헬퍼 플라스미드와 벡터 플라스미드의 공트랜스펙션에 의한 것이다. 그러나, 후술되는 바와 같이, 이 방법에는 여러 큰 문제점이 존재한다: (1) 트랜스펙션 효율이 장소마다 변할 수 있어, 벡터의 능력이 변동하여 일관된 공급이 불가능하다; (2) 트랜스펙션 조작의 번잡함 때문에, 벡터는 다량으로 제조할 수 없다; 그리고 (3) 만일 다량의 HIV 벡터를 제조하고자 한다면, 이에 따라 다량의 플라스미드 벡터를 제조하여야 한다. MoMLV 벡터와 관련하여서는, 게놈 DNA에 안정하게 통합된 헬퍼 플라스미드 및 벡터 플라스미드를 갖는 패키징 세포주는 이미 확립되어 있다; 그러나, HIV 벡터에 대한 패키징 세포주의 확립은 아직 이루어지지 않았다. 이에 대한 이유는 쥐 3T3 세포와 같은 마우스-유래 MoMLV 유지용 세포와 비교하여, 인간-유래 세포를 HIV 벡터 유지용 세포로서 사용하여야 하기 때문이다.
본 발명은 재조합 인간 면역결핍 바이러스 벡터 (이후, HIV 벡터로 칭함), 이 벡터의 제조방법 및 이러한 벡터를 안정하게 유지할 수 있는 생산 세포에 관한 것이다.
제1도는 헬퍼 플라스미드 CGPE(-)의 구조를 보여주는 도이다; 제2도는 벡터 플라스미드 HXN의 구조를 보여주는 도이다; 제3도는 네오마신 내성 세포주의 배양물의 상층물내 함유된 p24 단백질의 ELISA 정량화(일차 스크리닝)의 결과를 도식적으로 보여주는 도이다. 제4도는 이차 스크리닝의 결과를 도식적으로 보여준다.
본 발명은 이와 같은 상황하에서 완성되었고, HIV 벡터의 대규모 및 일관된 제조를 위하여 재조합 인간 면역결핍 바이러스를 생산하는 세포를 제공하는 목적을 갖는다.
언급한 목적을 달성하기 위하여 행하여 집중적인 연구의 결과로, 본 발명자는 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag, pol 및 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고 패키징 시그널 서열이 결핍된 특정 종류의 재조합 인간 면역 결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물 세포에 도입하고, 여기에서 안정되게 유지시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag, pol 및 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고 패키징 시그널이 결핍된 재조합 인간 면역결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물 세포에 도입하여 수득되고, 도입된 유전자를 안정하게 유지시키는 재조합 인간 면역결핍 바이러스 생산 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag, pol 및 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 이 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 상기 재조합 인간 면역결핍 바이러스 생산 세포 확립용 재조합 인간 면역결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라, 재조합 인간 면역결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드는, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드 뿐만아니라, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag 및 pol 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드를 포함한다.
본 발명의 또 하나의 구현예에 따라, 재조합 인간 면역결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드는, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드 뿐만아니라, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag 유전자의 서열을 적어도 포함하고 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 pol 유전자의 서열을 적어도 포함하고 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드를 포함한다.
또한 본 발명은 상기 플라스미드 벡터를 이용한 패키징 세포를 확립하는 방법 및 상기 패키징 세포를 이용한 재조합 HIV 벡터를 제조하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 구성 및 바람직한 구현예는 지금부터 상세히 설명될 것이다.
본 발명의 패키징 세포는 하기의 절차로 제조할 수 있다. 도 1에 나타낸 구조의 헬퍼 플라스미드는 공지된 방법으로 구축한다; 나타낸 바와 같이, 야생형 HIV 게놈 서여의 gag, pol 및 env 유전자의 상류에 이들 유전자의 구동자인 사이토메갈로바이러스 유래 프로모터를 측면에 삽입하고, 리포터 유전자인 네오마이신 내성 유전자 및 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스-유래 타이미딘 키나아제의 프로모터를 gag, pol 및 env 유전자 서열의 하류에 삽입하며, 이러한 유전자의 군을 발현 벡터에 통합하여, 헬퍼 플라스미드를 구축한다.
헬퍼 플라스미드내에 포함된 gag, pol 및 env 유전자를 구동하기 위한 프로모터는 사이토메갈로바이러스-유래 프로모터에만 제한되지 않고, B19 유래 프로모터 및 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스 유래 타이미딘 키나아제의 프로모터와 같은 다른 것 들로 대체될 수 있다. 또한 리포터 유전자는 임의의 특정 유형에만 한정되지 않으며, 네오마이신 내성 유전자외에, 하이그로마이신 내성 유전자와 같은 기타 리포터 유전자를 특정 용도 및 목적에 따라 사용할 수 있다.
도 1에 나타낸 헬퍼 플라스미드의 사용결과로 야생형 HIV가 발생하는 경우는 지금까지 보고된 바 없다. 향상된 안전성을 확보 하기 위하여, 또한 패키징 세포는 둘 또는 세개의 플라스미드내에 gag, pol 및 env 유전자를 재구성하고 폴라스미드로 목표 세포를 공트랜스펙션시켜 확립할 수 있다.
이렇게 구축된 헬퍼 플라스미드는 이어서 세포를 트랜스펙션시키기 위하여 사용하고, 세포는 COS 세포, HeLa 세포와 같은 종양세포 및 H9 및 CEM과 같은 임파구 세포를 포함한 임의의 유형일 수 있다. 또한 트랜스펙션의 방법은 결코 제한받지 않으며, 인산칼슘절차, 리포펙션 및 당업자에게 공지된 각종 기타 방법을 사용할 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 수일간 배양하고, 배양접시로부터 발취하여 새로운 접시에 재접종한다. 수신간후, 네오마이신 상동체 G418를 적당량으로 배양액에 첨가하고, 단지 외인성 유전자에 의해 형질전환된 세포만을 선별한다. 만일 하이그로마이신 내성 유전자가 헬퍼 플라스미드내 서열중의 임의의 하나에 리포터 유전자로서 포함되면, 또한 적당량의 하이그로마이신을 배양배지에 첨가한다. CO2인큐베이터에서 7-10일간 배양한후, 생성된 클로니를 하나씩 취하여 새로운 접지에 각각 재접종한다. 7-10일 더 배양한 후, 배양액의 상층물을 후속의 스크리닝을 위해 저장한다.
HIV 벡터 생산용 패키징 세포는 하기의 절차로 선별할 수 있다.
시료로서 사용된 전술한 배양액의 상층물의 일부를 갖고, p24 단백질 및/또는 gp120 단백질의 발현성을 ELISA 방법으로 정량화하여 일차 스크리닝을 행한다. 정량화의 다른 방법, 예컨대 형광 항체를 이용한 FACS (형광 활성 세포 소팅)의 분석 또는 서던 블롯팅 또는 노던 블롯팅에 의한 유전자 분석을 이용할 수 있다. 상기 정량화 방법중의 하나로 높은 단백질 발현성을 갖는 것으로 발견된 클론을 저장한다.
재조합 HIV 벡터는 일차 스크리닝으로 수득한 클론을 이용하여 제조하고, 이들의 능력을 분석하여 이차 스크리닝을 행한다. 이러한 클론의 각각은 공지된 방법으로 벡터 플라스미드로 트랜스펙션시킨다. 벡터 플라스미드는 야생형 HIV 게놈 서열로부터 gag, pol 및 env 유전자를 결실시키고, 리포터 유전자 서열을 빈 공간에 삽입하며 생성된 유전자 군을 발현 벡터에 통합하여 제조한다. 삽입하는 리포터 유전자는 임의의 특별한 유형에만 한정되지 않으며, 네오마이신 내성 유전자 및 하이그로마이신 내성 유전자와 같은 약제내성 유전자 또는 CD4 단백질과 같은 세포표면 항원을 암호화하는 유전자들 중에서 선택할 수 있다. 2일간 배양후, 배양물의 상층물을 CD4 양성 세포에 작용하도록 방치하고(형질도이을 위해), 배양을 2일간 더 지속한다. 세포를 배양접시로부터 발취하고 새로운 접시에 재접종한다. 만일 삽입된 리포터 유전자가 약제내성 유전자이면, 상응하는 약제를 배양액에 첨가한다. 수일간 배양한 후, 리포터 유전자의 발현성을 전술한 공지의 방법중의 하나로 단백질 또는 유전자 수준에서 분석한다. 만일 약제내성을 선별에 이용하면, 형질도입을 겪은 세포가 콜로니로서 관찰되며, 이를 계수하여 제조된 재조합 HIV 벡터의 능력을 측정한다. 각각의 클론으로부터 수득한 재조합 HIV 벡터는 능력에 대해서 비교하고, 가장 높은 능력을 가진 클론을 패키징 세포로서 저장한다.
이렇게 수득한 클론은 재조합 HIV 벡터의 제조를 위하여 이용할 수 있다. 전술한 패키징 세포는 임의의 공지된 방법으로 임의의 벡터 플라스미드로 트랜스펙션시켜 마킹과 같은 예비임상 실험용 벡터 또는 약제 유전자를 세포에 전달시키기 위한 유전자 치료용 벡터와 같은 임의의 재조합 HIV 벡터를 제조할 수 있다. 이와는 달리, 페키징 세포주는 서열내에 리포터 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드로 트랜스펙션되거나 헬퍼 플라스미드와 리포터 유전자료 공트랜스펙션시킬 수 있고, 선별은 리포터 유전자에 대한 적절한 방법 행하여, 세포내에 벡터 플라스미드를 안정하게 유지시키는 신규의 패키징 세포주를 확립시킨다. 이러한 신규한 패키징 세포주의 사용은 재조합 HIV 벡터를 제조하는 경우 트랜스펙션을 할 필요가 없는 이점을 갖는다.
전술한 패키징 세포의 구체적인 예는, 일본 이바라끼껭 쓰꾸바시 히가시 1쵸메, 1-3에 소재하는 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 기탁된 HCN-348 이며, 이는 기탁번호 FERM P-14834하 1995년 3월 15일에 원 기탁원으로부터 기탁번호 FERM-5467하 1996년 3월 11일자로 국제 기탁원으로 부다페스트 조약하 이관되었다.
하기 실시예는 추가로 본 발명을 설명하기 위하여 제공한 것이며, 결코 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1(플라스미드 구축)
플라스미드를 구축하기 위한 모든 절차는 유전자 재조합 기술의 통상적 절차에 따른다. 도 1은 헬퍼 플라스미드 CGPE(-)의 구조를 보여준다; 야생형 HIV 게놈에 배열된 gag, pol 및 env 유전자의 상류에 이 유전자들을 구동하는 사이토메갈로바이러스 유래 프로모터(CMV) 서열이 측면 삽입되어 있고, 네오마이신 내성 리포터 유전자 (neo) 및 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스 유래 타이미딘 키나아제(TK)이 프로모터가 gag, pol 및 env 유전자의 하류에 삽입되어 있으며, 이러한 유전자의 군이 암피실린 내성 유전자(amp) 및 SV40 복제 오리진 (SV40ori)을 포함하는 발현 벡터에 통합되어, 헬퍼 플라스미드 CGPE(-)가 구축된다.
도 2는 벡터 플라스미드 HXN의 구조를 보여준다; 야생형 HIV 게놈 서열로부터 gag, pol 및 env 유전자는 결실되고, 결실된 공간에 네오마이신 내성 리포터 유전자(neo)가 삽입되어 있으며, 이의 상류에는 neo를 구동시키는 프로모터로서 인간 심플렉스 헤르페스 바이러스 유래의 타이미딘 키나아제 (TK)가 삽입되어 있고, 이러한 유전자들의 군이 암피실린 내성 유전자(amp) 및 SV40 복제 오리진(SV40ori)를 포함하는 발현벡터에 통합되어 벡터 플라스미드 HXN이 구축된다.
실시예 2 (헬퍼 플라스미드에 의한 HeLa 세포의 트랜스펙션 및 약제에 의한 트랜스펙션체의 선별)
통상의 인산칼슘 절차로 트랜스펙션을 행한다. 실시예 1에 따라 제조한 CGPE(-) 10㎍에, 살균정제수 및 염화칼슘액을 첨가하여 총 0.5mL를 만든다. 액성 혼합물을 교반하 HBSP 완충액(0.5mL)에 적가하고, 실온에서 30분간 방치하여 플라스미드-인산칼슘 공침전물을 생성시킨다. 별개의 단계로, HeLa 세포를 약 50% 컨플루언스까지 9-cm 접시에서 배양한다. 공침전물을 배양액에 첨가하고, 이를 CO2인큐베이터에서 4시간동안 배양하고; 이후, 배양액을 새로운 배양액으로 대체하여 2일 더 배양한다. 이어서, 세포내에서 외인성 유전자 안정하게 유지시키는 트랜스펙션체만을 선별하기 위하여, 네오마이신 상동체 G418을 배양액에 첨가하여 1,000㎍/mL의 최종농도를 수득하고, 배양을 10일간 지속시킨다. 생존하는 세포 개체군(콜로니)를 하나씩 분리하고, 추가로 1,000㎍/mL의 농도에서 G418을 함유하는 새로운 배양액에서 배양하여, 네오마이신 내성 세포주를 수득한다.
실시예 3 (일차 스크리닝:ELISA에 의한 p24 단백질의 정량화)
실시예 2에서 수득한 네오마이신 내성 세포주를 3.5-cm 배양 접시에 접종하고 2일간 배양한다. 각각의 배양물의 상층물을 분리하고 상층물내 p24 단백질의 농도를 ELISA 방법으로 정량화한다. 또한 실시예 1 및 2의 절차를 거치지않은 HeLa 세포인, 음성 대조군에 대한 정량화를 실시한다. 결과를 도 3에 나타내었다. 일차 스크리닝으로 p24 양성임으로 밝혀진 세포주는 이차 스크리닝을 위해 저장한다.
실시예 4 (이차 스크리닝:HIV 벡터의 제조 및 이의 능력의 분석)
실시예 3에서의 일차 스크리닝으로 선별된 세포주를 9-cm 배양 접시에 접종하고 50% 컨플루언스까지 배양한다. 배양된 세포주의 각각을 인산 칼슘 절차로 벡터 플라스미드 HXN (도 2 참조) 10㎍으로 트랜스펙션시킨다. 2일간의 배양후, 배양물의 상층물을 원심분리관으로 옮겨 2,000rpm으로 10분간 원심분리시킨다. 생성된 상층액의 일부 (3mL)를 분리하여 새로운 배양액 3mL과 혼합하고; 혼합물을 50% 컨플루언스까지 배양된 CD4 양성 HeLa 세포에 작용하도록 방치한다. 동일한 절차를 실시예 1 및 2의 절차를 거치지 않은 HeLa 세포인, 음성 대조군에 적용한다. 2일간의 배양후, 세포를 트립신 및 EDTA의 혼합물을 이용하여 발취하고, 1,000㎍/mL의 G418을 함유하는 새로운 배양액에 현탁하고 9-cm 접시에 재접종한다. 10일간의 배양후, 생성된 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색한다(도 4 참조). 알아볼 수 있을 만한 콜로니는 음성 대조군에서는 형성되지 않는 반면 실시예 3에서 수득한 세포주는 알아볼 수 있는 콜로니를 생성시킨다. 따라서 이는 본 발명의 세포주는 재조합 HIV 벡터 제조용 패키징 세포로서 작용함을 실증한다.
본 발명의 인간 면역결핍 바이러스 생산 세포는 대규모 및 일관된 HIV 벡터의 제조를 종래의 기술보다 좀더 효율적으로 할 수 있다.

Claims (4)

  1. 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag, pol 및 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고 패키징 시그널이 결핍된 재조합 인간 면역 결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드를 동물세포에 도입하여 수득되고, 상기 유전자를 안정하게 유지시키는 재조합 인간 면역결핍 바이러스 생산 세포.
  2. 인간 면역결핍 바일스 게놈으로 암호화되는 gag, pol 및 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는, 제1항의 재조합 인간 면역결핍 바이러스 생산 세포를 확립하기 위한 재조합 인간 면역 결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드.
  3. 제2항에 있어서, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드 뿐만아니라, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag 및 pol 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드를 포함하는, 재조합 인간 면역결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드.
  4. 제2항에 있어서, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 env 유전자의 서열을 적어도 포함하고, 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드 뿐만아니라, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 gag 유전자의 서열을 적어도 포함하고 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드, 인간 면역결핍 바이러스 게놈에 의해 암호화되는 pol 유전자의 서열을 적어도 포함하고 상기 유전자 서열의 상류에 삽입된 프로모터를 갖는 플라스미드를 포함하는, 재조합 인간 면역결핍 바이러스 헬퍼 플라스미드.
KR1019970706369A 1995-03-17 1996-03-15 재조합 인간 면역 결핍 바이러스 생산 세포주 KR19980702961A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9741095 1995-03-17
JP95-97410 1995-03-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR19980702961A true KR19980702961A (ko) 1998-09-05

Family

ID=14191727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019970706369A KR19980702961A (ko) 1995-03-17 1996-03-15 재조합 인간 면역 결핍 바이러스 생산 세포주

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6048725A (ko)
EP (1) EP0816487A4 (ko)
KR (1) KR19980702961A (ko)
CN (1) CN1103370C (ko)
AU (1) AU4954596A (ko)
WO (1) WO1996029393A1 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002014526A2 (en) * 2000-08-10 2002-02-21 Neurologix, Inc. Replication competent aav helper functions
US9801982B2 (en) 2004-09-28 2017-10-31 Atrium Medical Corporation Implantable barrier device
US8263102B2 (en) 2004-09-28 2012-09-11 Atrium Medical Corporation Drug delivery coating for use with a stent
WO2006036984A2 (en) 2004-09-28 2006-04-06 Atrium Medical Corporation Stand-alone film and methods for making the same
US9000040B2 (en) 2004-09-28 2015-04-07 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
US9012506B2 (en) 2004-09-28 2015-04-21 Atrium Medical Corporation Cross-linked fatty acid-based biomaterials
US9278161B2 (en) 2005-09-28 2016-03-08 Atrium Medical Corporation Tissue-separating fatty acid adhesion barrier
US9427423B2 (en) 2009-03-10 2016-08-30 Atrium Medical Corporation Fatty-acid based particles
US9492596B2 (en) 2006-11-06 2016-11-15 Atrium Medical Corporation Barrier layer with underlying medical device and one or more reinforcing support structures
WO2008057344A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Atrium Medical Corporation Coated surgical mesh
CN100463964C (zh) * 2006-11-08 2009-02-25 武汉大学 一种杂交免疫缺陷病毒株及应用
US20080207756A1 (en) * 2007-02-27 2008-08-28 Atrium Medical Corporation Bio-absorbable oil suspension
US20110038910A1 (en) 2009-08-11 2011-02-17 Atrium Medical Corporation Anti-infective antimicrobial-containing biomaterials
US20110045050A1 (en) * 2009-08-24 2011-02-24 Atrium Medical Corporation Nanoemulsion formulations for direct delivery
US10322213B2 (en) 2010-07-16 2019-06-18 Atrium Medical Corporation Compositions and methods for altering the rate of hydrolysis of cured oil-based materials
US9867880B2 (en) 2012-06-13 2018-01-16 Atrium Medical Corporation Cured oil-hydrogel biomaterial compositions for controlled drug delivery

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3006789A (en) * 1988-02-24 1989-08-24 Smithkline Beckman Corporation Expression of hiv binding proteins

Also Published As

Publication number Publication date
EP0816487A4 (en) 1998-07-15
US6048725A (en) 2000-04-11
CN1179179A (zh) 1998-04-15
CN1103370C (zh) 2003-03-19
EP0816487A1 (en) 1998-01-07
WO1996029393A1 (fr) 1996-09-26
AU4954596A (en) 1996-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2752788B2 (ja) 感染および過剰増殖障害の為の組換え療法
JP2859252B2 (ja) 感染および過剰増殖障害の為の組換え療法
CA2148934C (en) Targetable vector particles
EP0702084B1 (en) Recombinant retroviruses
KR19980702961A (ko) 재조합 인간 면역 결핍 바이러스 생산 세포주
Harrison et al. Inhibition of human immunodeficiency virus-1 production resulting from transduction with a retrovirus containing an HIV-regulated diphtheria toxin A chain gene
EP0759471A1 (en) Recombinant human immunodeficiency virus vector and process for producing the same
JPH06335392A (ja) Ｈｉｖ阻害性アンチセンスおよび他のヌクレオチド配列を含有する発現構成体、レトロウイルスのベクターおよびそれを含有する組換えレトロウイルス
Escaich et al. RevM10-mediated inhibition of HIV-1 replication in chronically infected T cells
US5576201A (en) Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells
JP2000501614A (ja) 高形質導入効率を有するレトロウイルスベクター上清を得るための方法
Piwnica-Worms et al. Retrovirus shuttle vector for study of kinase activities of pp60c-src synthesized in vitro and overproduced in vivo
MORGAN et al. Further evaluation of soluble CD4 as an anti-HIV type 1 gene therapy: demonstration of protection of primary human peripheral blood lymphocytes from infection by HIV type 1
US5650306A (en) Recombinant nucleic acids for inhibiting HIV gene expression
US5837536A (en) Expression of human multidrug resistance genes and improved selection of cells transduced with such genes
WO1997034638A1 (en) Antisense approach to gene inhibition
WO1995019368A1 (en) Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells
US6743631B1 (en) Use of human serum resistant vector particles and cell lines for human gene therapy
US5837503A (en) Vector containing viral gene transcribed by RNA polymerase III and methods for use
US5908923A (en) Method of using transdominant negative retroviral integrase in the treatment of retroviral infection
EP0716710B1 (en) Methods of suppressing immune response by gene therapy
WO1994006921A1 (en) Recombinant retroviral vector against felv and/or fiv
Lee et al. [42] Retroviral transfer of human MDR1 gene into human T lymphocytes
Smith et al. Introduction of new genetic material into human myeloid leukemic blast stem cells by retroviral infection
US6063374A (en) Recombinant HIV and modified packaging cells and method for using

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid