JP2015043785A - 複数の組み込みベクターを含む宿主細胞 - Google Patents

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Abstract

【課題】宿主細胞におけるタンパク質の産生方法の提供、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞の提供。【解決手段】使用に適した組み込みベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、トランスポゾンベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。組み込みベクターを高い感染多重度で用いることによって宿主細胞を調製する方法を開発した。宿主細胞は、医薬タンパク質、スクリーニングアッセイに用いるためのタンパク質の変種の産生、および高速スクリーニングにおける直接的な使用に関して有用である。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、組み込みベクターの組み込まれた複数のコピーを含む宿主細胞に関する。
発明の背景
医薬・バイオテクノロジー産業は、哺乳類細胞における組換えタンパク質の産生を拠り所としている。これらのタンパク質は、多くの疾患および状態の治療的処置のために不可欠である。多くの場合、これらのタンパク質の市場は年間10億ドルを上回る。哺乳類細胞における組換え産生が行われているタンパク質の例には、エリスロポエチン、第VIII因子、第IX因子およびインスリンが含まれる。これらのタンパク質の多くに関しては、正しい翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはsilation；例えば、米国特許第5,721,121号（特許文献1）を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）が必要なことから、哺乳類細胞における発現の方が原核細胞における発現よりも好ましい。
組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための方法はいくつか知られている。最も基本的な方法では、異種タンパク質をコードする遺伝子および適切な調節領域を含む核酸構築物を宿主細胞に導入して組み込ませる。導入方法には、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、リポフェクションおよびエレクトロポレーションが含まれる。他の方法では、選択方式を用いて、導入した核酸構築物を増幅する。これらの方法では、増幅可能な選択マーカーをコードする遺伝子および異種タンパク質をコードする遺伝子により、細胞の共トランスフェクションを行う（例えば、SchroderおよびFriedl、Biotech. Bioeng. 53（6）：547〜59［1997］（非特許文献1）を参照）。最初の形質転換体の選択の後に、培地中の選択用物質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）を段階的に増やすことにより、トランスフェクトした遺伝子を増幅する。場合によっては、これらの手順によって外因性遺伝子を数百倍に増幅しうる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の他の発現方法では、エピソーム性ベクター（例えば、プラスミド）によるトランスフェクションを用いる。
組換えタンパク質の発現用の哺乳類細胞系を作製するための現行の方法にはいくつか欠点がある（例えば、Mielkeら、Biochem. 35：2239〜52［1996］（非特許文献2）を参照）。エピソーム系は、組換えタンパク質の高レベルの発現を可能にするが、短期的にしか安定でないことが多い（例えば、KlehrおよびBode、Mol. Genet.（Life Sci. Adv.）7：47〜52［1988］（非特許文献3）を参照）。外因性遺伝子が組み込まれた哺乳類細胞系はそれよりも幾分安定しているが、安定性は外因性遺伝子の少数のコピー、場合によっては単一のコピーのみの存在に依存しているという知見が増しつつある。
標準的なトランスフェクション法は、導入遺伝子の複数のコピーを宿主細胞のゲノムに導入するのに好都合である。多くの場合、導入遺伝子の複数の組み込みは本質的に不安定であることが判明している。この本質的な不安定性は、相同組換えによるコード配列の消失を促す特徴的な頭-尾様式の組み込みに起因すると思われ（例えば、Weidleら、Gene 66：193〜203［1988］（非特許文献4）を参照）、これは特に導入遺伝子が転写される際に想定される（例えば、McBurneyら、Somatic Cell Molec. Genet. 20：529〜40［1994］（非特許文献5）を参照）。宿主細胞にも、複数のコピーの組み込みイベントに対する後成的な防御機構がある。植物では、この機構は「共抑制」と呼ばれている（例えば、Allenら、Plant Cell 5：603〜13［1993］（非特許文献6）を参照）。実際に、発現レベルがコピー数と逆相関することは珍しくない。これらの観察結果は、外因性遺伝子の複数のコピーが、メチル化（例えば、Mehtaliら、Gene 91：179〜84［1990］（非特許文献7）を参照）およびそれに続く変異誘発（例えば、Krickerら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89：1075〜79［1992］（非特許文献8）を参照）による不活性化、またはヘテロクロマチン形成によるサイレンシング（例えば、DorerおよびHenikoff、Cell 77：993〜1002［1994］（非特許文献9）を参照）を受けるようになるという所見と一致する。
したがって、当技術分野では、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための改良された方法が必要とされている。宿主細胞は、長期間にわたって安定であって、導入遺伝子によってコードされるタンパク質を高レベルで発現するものが好ましい。
米国特許第5,721,121号
SchroderおよびFriedl、Biotech. Bioeng. 53（6）：547〜59［1997］ Mielkeら、Biochem. 35：2239〜52［1996］ KlehrおよびBode、Mol. Genet.（Life Sci. Adv.）7：47〜52［1988］ Weidleら、Gene 66：193〜203［1988］ McBurneyら、Somatic Cell Molec. Genet. 20：529〜40［1994］ Allenら、Plant Cell 5：603〜13［1993］ Mehtaliら、Gene 91：179〜84［1990］ Krickerら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89：1075〜79［1992］ DorerおよびHenikoff、Cell 77：993〜1002［1994］
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞に関する。本発明は、特定の数の組み込みベクターがトランスフェクトされた宿主細胞には限定されない。実際には、広範囲にわたる組み込みベクターを含む宿主細胞を考えている。いくつかの態様において、本発明は、好ましくは少なくとも約2つの組み込まれた組み込みベクターを含むゲノムを含む宿主細胞を提供する。またさらなる態様において、ゲノムは好ましくは少なくとも3つの組み込まれた組み込みベクターを含み、最も好ましくは少なくとも4つの組み込まれた組み込みベクター、5つの組み込まれた組み込みベクター、6つの組み込まれた組み込みベクター、7つの組み込まれた組み込みベクター、10個の組み込まれた組み込みベクター、15個の組み込まれた組み込みベクター、20個の組み込まれた組み込みベクター、または50個の組み込まれた組み込みベクターを含む。
本発明は、単一の関心対象のタンパク質（すなわち、外因性タンパク質）をコードするベクターを含む宿主細胞には限定されない。実際には、細胞には、複数の関心対象のタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトすることを考えている。いくつかの態様において、組み込みベクターは少なくとも2つの外因性遺伝子を含む。いくつかの好ましい態様において、少なくとも2つの外因性遺伝子は多シストロン性配列として配置される。いくつかの特に好ましい態様において、少なくとも2つの外因性遺伝子はリボソーム内部進入部位によって隔てられる。他の好ましい態様において、少なくとも2つの外因性遺伝子は多シストロン性配列として配置される。またさらなる態様において、2つの外因性遺伝子は免疫グロブリン分子の重鎖および免疫グロブリン分子の軽鎖を含む。他の態様において、少なくとも2つの外因性遺伝子の一方は選択マーカーである。さらに他の態様において、宿主細胞は、第1の外因性遺伝子を含む第1の組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピー、および、第2の外因性遺伝子を含む第2の組み込みベクターまたは他のベクターの少なくとも1つの組み込まれたコピーを含む。またさらなる態様において、宿主細胞は、第1の外因性遺伝子を含む第1の組み込みベクターの少なくとも10個の組み込まれたコピー、および第2の外因性遺伝子を含む第2の組み込みベクターまたは他のベクターの少なくとも1つの組み込まれたコピーを含む。
いくつかの好ましい態様において、組み込みベクターは、プロモーターと機能的に結合した少なくとも1つの外因性遺伝子を含む。本発明は、特定のプロモーターを含むベクターには限定されない。実際には、さまざまなプロモーターを考えている。本発明のいくつかの態様において、プロモーターは、α-ラクトアルブミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびモロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列からなる群より選択される。他の好ましい態様において、組み込みベクターは、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナルをさらに含む。さらに他の態様において、組み込みベクターは、外因性遺伝子と機能的に結合したRNA移行因子（RNA export element）をさらに含む。
本発明は、特定の組み込みベクターには限定されない。実際には、さまざまな組み込みベクターを考えている。本発明のいくつかの態様において、組み込みベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターからなる群より選択される。いくつかの好ましい態様において、レトロウイルスベクターは偽型のレトロウイルスベクターである。他の好ましい態様、偽型のレトロウイルスベクターはG糖タンパク質を含む。本発明のレトロウイルスベクターは特定のG糖タンパク質には限定されない。実際には、さまざまなG糖タンパク質を考えている。いくつかの特に好ましい態様において、G糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラ（Mokola）ウイルスのG糖タンパク質からなる群より選択される。またさらなる態様において、レトロウイルスベクターは長い末端反復配列を含む。本発明のレトロウイルスベクターは特定のLTRには限定されない。実際には、MoMLV、MoMuSV、MMTVの長い末端反復配列を含むが、これらに限定されない、さまざまなLTRを考えている。
他の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの好ましい態様において、レンチウイルスベクターは偽型化されたものである。いくつかの特に好ましい態様において、レンチウイルスベクターはG糖タンパク質を含む。またさらなる態様において、G糖タンパク質は、G糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラウイルスのG糖タンパク質からなる群より選択される。さらに他の態様において、レンチウイルスベクターは、HIVおよびウマ伝染性貧血ウイルスの長い末端反復配列からなる群より選択される長い末端反復配列を含む。
本発明のまたさらなる態様において、組み込みベクターはトランスポゾンベクターである。いくつかの好ましい態様において、トランスポゾンベクターはTn5、Tn7およびTn10トランスポゾンベクターから選択される。
本発明は特定の宿主細胞には限定されない。実際には、さまざまな宿主細胞を考えている。本発明のいくつかの態様では、宿主細胞をインビトロで培養する。本発明のまたさらなる態様において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞およびウシ乳腺上皮細胞から選択される。いくつかの好ましい態様において、宿主細胞はクローン由来である。他の態様において、宿主細胞は非クローン由来である。いくつかの態様において、宿主細胞のゲノムは10回を上回る継代に対して安定である。他の態様において、ゲノムは50回を上回る継代に対して安定であり、さらに他の態様において、ゲノムは100回を上回る継代に対して安定である。さらに他の態様において、宿主細胞は胚性幹細胞、卵母細胞または胚でありうる。いくつかの態様において、組み込まれたベクターは選択がなされない状態で安定である。
本発明は、特定の関心対象のタンパク質をコードするベクターには限定されない。実際には、外因性遺伝子によってコードされるさまざまな関心対象のタンパク質をコードするベクターを考えている。いくつかの態様において、関心対象のタンパク質は、B型肝炎表面抗原、MN14抗体、LL2抗体、ボツリヌス毒素抗体およびcc49IL2から選択される。いくつかの態様において、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子にはイントロンがなく、また別の態様において、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子は少なくとも1つのイントロンを含む。
本発明は、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入のための方法であって、1）a）ゲノムを含む宿主細胞、およびb）複数の組み込みベクターを提供すること；ならびに2）少なくとも2つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させること、を含む方法も提供する。いくつかの態様において、本条件は、10を上回る感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。他の態様において、本条件は、約10〜1,000,000の感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。またさらなる態様において、本条件は、約100〜10,000の感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。またさらなる態様において、本条件は、約100〜1,000の感染多重度で宿主細胞を接触させることを含む。本発明のさらに他の態様において、本方法はさらに、2つの組み込みベクターのそれぞれが異なる外因性遺伝子を含む、少なくとも2つの組み込みベクターを前記宿主細胞にトランスフェクトすることを含む。さらに他の態様において、本条件は、宿主細胞に対して、関心対象のタンパク質をコードするベクターによる少なくとも第1のトランスフェクションまたは形質導入でトランスフェクションまたは形質導入を行い、続いて、別のトランスフェクションまたは形質導入の段階で再度のトランスフェクションまたは形質導入を行う、宿主細胞の連続的なトランスフェクションまたは形質導入を含む。
本発明はさらに、関心対象のタンパク質を産生する方法であって、1）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む少なくとも1つの組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、ゲノムを含む宿主細胞を提供すること、および2）関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養すること、を含む方法を提供する。いくつかの好ましい態様において、組み込みベクターは、前記外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む。他の態様において、本方法は、段階3）関心対象のタンパク質を単離することをさらに含む。本発明は何らかの特定の培養システムには限定されない。実際には、回転瓶培養、灌流培養、流加培養およびペトリ皿培養を含むが、これらに限定されない、さまざまな培養システムを考えている。いくつかの態様において、細胞系はクローン的に選択され、また別の態様において、細胞は非クローン的に選択される。
本発明の方法は、何らかの特定の数の組み込まれた組み込みベクターを含む宿主細胞には限定されない。実際には、いくつかの態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの3つを上回る組み込まれたコピーを含む；他の態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの4つを上回る組み込まれたコピーを含む；さらに他の態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの5つを上回る組み込まれたコピーを含む；さらなる態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの7つを上回る組み込まれたコピーを含む；またさらなる態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの10個を上回る組み込まれたコピーを含む。他の態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの約2〜20個の組み込まれたコピーを含む。いくつかの態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの約3〜10個の組み込まれたコピーを含む。
本発明の方法は何らかの特定の組み込みベクターには限定されない。実際には、さまざまな組み込みベクターの使用を考えている。いくつかの態様において、組み込みベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの好ましい好ましい態様において、レトロウイルスベクターは偽型のレトロウイルスベクターである。他の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
本発明の方法は、何らかの特定の宿主細胞の使用には限定されない。実際には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ウシ乳腺上皮細胞、卵母細胞、胚、幹細胞および胚性幹細胞を含むが、これらに限定されない、さまざまな宿主細胞の使用を考えている。
本発明の方法は、宿主細胞からの、何らかの特定の量の外因性タンパク質（すなわち、関心対象のタンパク質）の産生には限定されない。実際には、本発明の方法による種々の発現レベルが許容されると考えている。いくつかの態様において、宿主細胞は、細胞1個当たり1日につき約1ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する。他の態様において、宿主細胞は、細胞1個当たり1日につき約10ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する。またさらなる態様において、宿主細胞は、細胞1個当たり1日につき約50ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する。
他の態様において、本発明は、化合物のスクリーニングのための方法であって、1）a）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む少なくとも1つの組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、ゲノムを含む宿主細胞；およびb）1つまたは複数の被験化合物を提供すること；2）関心対象のタンパク質が発現される条件下で、宿主細胞を培養すること；3）宿主細胞を1つまたは複数の被験化合物で処理すること；ならびに4）宿主細胞における被験化合物に対する反応の有無をアッセイすること、を含む方法を提供する。本発明のいくつかの態様において、外因性遺伝子は、レポータータンパク質、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、癌遺伝子によってコードされるおよびタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする。
またさらなる態様において、宿主細胞はレポーター遺伝子をさらに含む。いくつかの特に好ましい態様において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびβ-ラクタマーゼからなる群より選択される。いくつかの態様において、アッセイの段階は、レポーター遺伝子からのシグナルを検出することをさらに含む。他の態様において、宿主細胞のゲノムは、それぞれが異なる外因性遺伝子を含む、少なくとも2つの組み込みベクターを含む。
さらに他の態様において、本発明は、タンパク質活性を比較するための方法であって、1）a）第1の外因性遺伝子が第1の関心対象のタンパク質をコードする、第1の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む第1の組み込みベクターを含む第1の宿主細胞、およびb）第2の外因性遺伝子が第1の関心対象のタンパク質の変種である第2の外因性遺伝子をコードする、第2の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む第2の組み込みベクターを含む少なくとも第2の宿主細胞を提供すること；2）第1および第2の関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養すること；ならびに3）第1および第2の関心対象のタンパク質の活性を比較すること、を含む方法を提供する。
いくつかの態様において、外因性遺伝子は、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、細胞周期タンパク質、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする。他の態様において、第1および第2の関心対象のタンパク質は単一のアミノ酸のみの点で異なる。またさらなる態様において、第1および第2の関心対象のタンパク質の同一性は95％を上回り、好ましくは90％を上回り、最も好ましくは80％を上回る。
他の態様において、本発明は、1）a）少なくとも1つの組み込まれた外因性遺伝子を含むゲノムを含む宿主細胞；およびb）複数の組み込みベクターを提供すること；ならびに2）組み込みベクターの少なくとも2つが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させること、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、組み込まれた外因性遺伝子には組み込みベクターが含まれる。他の態様において、宿主細胞はクローン的に選択される。代替的な態様において、宿主細胞は非クローン的に選択される。
またさらなる態様において、本発明は、関心対象のタンパク質の発現を間接的に検出する方法であって、IRESによって機能的に結合したシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を含む多シストロン性配列をコードするベクターによるトランスフェクションを行った宿主細胞を提供すること、ならびにシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含み、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されるような方法を提供する。本発明の方法は何らかの特定の関心対象のタンパク質の発現には限定されない。実際には、Gタンパク質共役受容体を含むが、これらに限定されない、さまざまな関心対象のタンパク質の発現を考えている。本発明は何らかの特定のシグナルタンパク質の使用には限定されない。実際には、免疫グロブリン重鎖および軽鎖、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、緑色蛍光性タンパク質ならびにルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない、さまざまなシグナルタンパク質の使用を考えている。特に好ましい態様において、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質の発現は同一のプロモーターによって駆動され、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質は単一の転写単位として転写される。
定義
本発明の理解を容易にするために、数多くの用語を以下に定義する。
本明細書で用いる「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれにあるかを問わず、任意の真核生物細胞（例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）のことを指す。
本明細書で用いる「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養物のことを指す。この用語には、連続継代細胞系（例えば、不死化した表現型を有するもの）、初代細胞培養物、有限継代性細胞系（例えば、非形質転換細胞）ならびに、卵母細胞および胚を含む、インビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。
本明細書で用いる「ベクター」という用語は、適切な制御因子を伴った場合に複製可能であり、細胞間の遺伝子配列の移行を可能とする、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝因子のことを指す。このため、この用語には、クローニング用および発現用の媒体、さらにウイルスベクターも含まれる。
本明細書で用いる「組み込みベクター」という用語は、核酸（例えば、染色体）へのその組み込みまたは挿入がインテグラーゼを介して行われるベクターのことを指す。「組み込みベクター」の例には、レトロウイルスベクター、トランスポゾンおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「組み込まれた」という用語は、ゲノム中（すなわち、宿主細胞の染色体中）に安定的に挿入されたベクターのことを指す。
本明細書で用いる「感染多重度」または「MOI」という用語は、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入の際に用いられる組み込みベクター：宿主細胞の比のことを指す。例えば、100,000個の宿主細胞の形質導入に1,000,000個のベクターを用いる場合には、感染多重度は10である。この用語の使用は形質導入を伴うイベントには限定されず、リポフェクション、マイクロジェクション、リン酸カルシウム沈殿および電気穿孔などの方法による宿主細胞へのベクターの導入も含まれる。
本明細書で用いる「ゲノム」という用語は、生物体の遺伝物質（例えば、染色体）のことを指す。
「関心対象のヌクレオチド配列」という用語は、その操作が何らかの理由（例えば、疾患の治療、質の改善、宿主細胞における関心対象のタンパク質の発現、リボザイムの発現など）で望ましいと当業者が考える、任意のヌクレオチド配列（例えば、RNAまたはDNA）のことを指す。このようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子のコード配列（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子など）、および、mRNAまたはタンパク質産物をコードしない非コード性調節配列（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、エンハンサー配列など）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「関心対象のタンパク質」とは、関心対象の核酸によってコードされるタンパク質のことを指す。
本明細書で用いる「シグナルタンパク質」という用語は、関心対象のタンパク質とともに発現され、適切なアッセイによって検出された場合に関心対象のタンパク質の発現の間接的な証拠となるタンパク質のことを指す。本発明において有用なシグナルタンパク質の例には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「外因性遺伝子」という用語は、宿主生物もしくは細胞に自然条件下では存在しない、または宿主生物もしくは細胞に人工的に導入された遺伝子のことを指す。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆物質（例えば、プロインスリン）の産生のために必要なコード配列を含む核酸（例えば、DNAまたはRNA）配列のことを指す。ポリペプチドは完全長コード配列によってコードされてもよく、または、完全長もしくは断片の必要な活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保たれている限り、コード配列の任意の部分によってコードされてもよい。この用語には構造遺伝子のコード領域も含まれ、遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するような、コード領域の5'および3'端に隣接して位置する約1kbまたはそれ以上の範囲にわたる配列も含まれる。コード領域の5'側に位置し、mRNAにも存在する配列は5'非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3'側または下流に位置し、mRNAにも存在する配列は3'非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のcDNAおよびゲノム型の両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、コード領域が「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたものを含む。イントロンは、核RNA（hnRNA）へと転写される遺伝子の区域である；イントロンはエンハンサーなどの調節因子を含むことがある。イントロンは核内転写産物または一次転写産物から除去または「スプライスアウト（splice out）」される；このため、イントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写産物中には存在しない。mRNAは翻訳時に新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定する働きをする。
本明細書で用いる「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」により（すなわち、RNAポリメラーゼの酵素作用による）、遺伝子にコードされた遺伝情報がRNA（例えば、mRNA、rRNA、tRNAまたはsnRNA）に変換されるプロセス、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、mRNAの「翻訳」によってタンパク質に変換される過程のことを指す。遺伝子発現はその過程における多くの段階で調節可能である。「上方制御（up-regulation）」または「活性化」とは、遺伝子発現産物（すなわち、RNAまたはタンパク質）の産生を増加させる調節のことを指し、「下方制御（down-regulation）」または「抑制」とは、産生を減少させる調節のことを指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）はしばしば、それぞれ「活性化因子（activator）」および「抑制因子（repressor）」と呼ばれる。
天然のタンパク質分子のアミノ酸配列に言及して本明細書に「アミノ酸配列」を詳述する場合、「アミノ酸配列」および類似の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸配列を、詳述するタンパク質分子にみられる完全な天然型アミノ酸配列には限定しないものとする。
本明細書で用いる「コードする核酸分子」「コードするDNA配列」「コードするDNA」「コードするRNA配列」および「コードするRNA」という用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸のストランドに沿って並んだデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列のことを指す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序が、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿って並ぶアミノ酸の順序を決定する。したがって、DNA配列またはRNA配列はアミノ酸配列をコードする。
本明細書で用いる「変種」という用語は、タンパク質に言及して用いる場合、部分的に相同な核酸によってコードされるタンパク質のことを指し、このため、タンパク質のアミノ酸配列は異なる。本明細書で用いる「変種」という用語は、タンパク質の機能の変化を引き起こさない保存的および非保存的なアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質のほかに、タンパク質の機能の低下（例えば、ヌル変異）またはタンパク質の機能の上昇を引き起こすアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質も含む。
本明細書で用いる「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則により関連づけられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に言及して用いられる。例えば、配列「A-G-T」は配列「T-C-A」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って合致するというように「部分的」でもよい。または、核酸の間に「完全」または「全体的」な相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは核酸同士の結合に依存する増幅反応ならびに検出方法において特に重要である。
「相同性」および「一致率（percent identity）」という用語は、核酸に関して用いる場合、相補性の程度のことを指す。これは部分的な相同性（すなわち、部分的同一性）でもよく、完全な相同性（すなわち、完全な同一性）でもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸配列とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するもののことであり、これは「実質的に相同な」という機能的用語を用いて呼ばれる。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーションなど）を低ストリンジェンシー条件下で用いて検討しうる。実質的に相同な配列またはプローブ（すなわち、関心対象の別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド）は、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な配列と標的配列との結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）と競合する、またはそれを阻害すると考えられる。低ストリンジェンシー条件は非特異的な結合が許容されるような条件という訳ではない；低ストリンジェンシー条件は、2つの配列の相互の結合が特異的な（すなわち、選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異的結合がないことは、部分的な程度の相補性すらない（例えば、同一性が約30％未満）第2の標的を用いることによって検証しうる；非特異的結合がないとプローブは第2の非相補的な標的とハイブリダイズしないと考えられる。
当技術分野では、さまざまな同等な条件を用いて低ストリンジェンシー条件を構成しうることが周知である；プローブの長さおよび性質（DNA、RNA、塩基組成物）ならびに標的の性質（DNA、RNA、塩基組成物、溶液中に存在する、または固定化されているなど）ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無）などの要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して、上に挙げた条件とは異なるものの同等な低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を得ることができる。さらに、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを促す条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄段階の温度を高める、ハイブリダイゼーション溶液中にホルムアミドを用いるなど）も当技術分野で周知である。
cDNAまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方のストランドとハイブリダイズしうる任意のプローブのことを指す。
一本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズしうる（すなわち、その相補物である）任意のプローブのことを指す。
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合を指して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、用いる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、および核酸内部のG：C比などの要因による影響を受ける。単一の分子が構造の内部に相補的核酸の対合を含む場合には「自己ハイブリダイズした（self-hybridized）」という。
本明細書で用いる「Tm」という用語は、核酸の「融解温度」を指して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団の半分が一本鎖に解離する温度のことである。核酸のTmを算出するための式は当技術分野で周知である。標準的な参考文献に示されているように、核酸が1M NaCl水溶液中にある場合、T値の単純な推定値は以下の式によって算出しうる：
Tm＝81.5＋0.41（％G＋C）
（例えば、AndersonおよびYoung、定量的フィルターハイブリダイゼーション（Quantitative Filter Hybridization）、核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）［1985］中を参照）。その他の参考文献には、Tmの算出に配列特性のほかに構造特性も考慮に入れた、より精巧な計算が含まれる。
本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う温度、イオン強度および有機溶媒などの他の化合物の存在といった条件を指して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的塩基配列の頻度が高い核酸断片の間のみで核酸塩基対合が起こると考えられる。このため、遺伝的に異なる生物に由来する核酸同士に対しては、相補的配列の頻度が通常低いことから、「弱」または「低」ストリンジェンシーの条件がしばしば必要となる。
「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2Oおよび1.85g/l EDTA、pHはNaOHで7.4に調整）、0.5％SDS、5×デンハルト試薬および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、0.1×SSPE、1.0％SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
「中程度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2Oおよび1.85g/l EDTA、pHはNaOHで7.4に調整）、0.5％SDS、5×デンハルト試薬および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、1.0×SSPE、1.0％SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
「低ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2Oおよび1.85g/l EDTA、pHはNaOHで7.4に調整）、0.1％SDS、5×デンハルト試薬［50×デンハルト試薬は500ml当たり以下のものを含む：5g Ficoll（400型、Pharamcia）、5g BSA（第V画分；Sigma）］および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、5×SSPE、0.1％SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。
1つの遺伝子から、RNA一次転写産物の異なるスプライシングによって生成される多数のRNA種が生じてもよい。同一遺伝子のスプライス変種であるcDNAは、配列同一性または完全な相同性を有する領域（両方のcDNAに同じエクソンまたは同じエクソンの部分が存在することを表す）および完全に同一でない領域（例えば、cDNA 1にエクソン「A」が存在し、cDNA 2はその代わりにエクソン「B」を含むことを表す）を含む。2つのcDNAは配列同一性のある領域を含むため、それらはいずれも、両方のcDNAに認められる配列を含む遺伝子全体または遺伝子の部分に由来するプローブとハイブリダイズすると考えられる；このため、2つのスプライス変種はこのようなプローブおよびお互いと実質的に相同である。
「機能的な組み合わせにある（in operable combination）」「機能的な順序にある（in operable order）」および「機能的に結合した」という用語は、本明細書で用いる場合、所定の遺伝子の転写および/または望ましいタンパク質分子の合成を指令しうる核酸分子が生じる様式で複数の核酸配列が結び付いていることを指す。この用語は、機能的なタンパク質が生じる様式で複数のアミノ酸配列が結び付いていることも指す。
本明細書で用いる「選択マーカー」という用語は、通常であれば必須栄養素と考えられるものを含まない培地中での増殖能力を付与する酵素活性をコードする遺伝子（例えば、酵母細胞におけるHIS3遺伝子）のことを指す；さらに、選択マーカーは、選択マーカーが発現された細胞に抗生物質または薬剤に対する耐性を付与するものでもよい。選択マーカーは「優性」であってもよい；優性選択マーカーは、あらゆる真核生物細胞系で検出可能な酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例には、薬剤G418に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド3'リン酸転移酵素遺伝子（neo遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンGリン酸転移酵素（hyg）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子とも呼ばれる）が含まれる。他の選択マーカーには、関連する酵素活性を欠く細胞系とともに用いる必要があるという点で優性でないものがある。非優性選択マーカーの例には、tk-細胞系とともに用いられるチミジンキナーゼ（tk）遺伝子、CAD欠損細胞とともに用いられるCAD遺伝子、およびhprt-細胞系とともに用いられる哺乳類ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hprt）遺伝子が含まれる。哺乳類における選択マーカーの使用に関する総説は、サムブルック（Sambrook, J.）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（1989）pp.16.9〜16.15にある。
本明細書で用いる「調節因子」という用語は、核酸配列の発現の何らかの面を制御する遺伝因子のことを指す。例えば、プロモーターは、機能的に結合したコード領域の転写開始を促す調節因子である。他の調節因子には、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結シグナル、RNA移行因子、リボソーム内部進入部位などがある（以下に定義する）。
真核生物における転写制御シグナルには、「プロモーター」因子および「エンハンサー」因子が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するDNAの短い配列からなる（Maniatisら、Science 236：1237［1987］）。プロモーター因子およびエンハンサー因子は、酵母、昆虫および哺乳類細胞の遺伝子を含む種々の真核生物供給源、ならびにウイルスから単離されている（類似の制御因子、すなわちプロモーターは原核生物にも認められる）。個々のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどの細胞種を用いるかに依存する。真核生物プロモーターおよびエンハンサーの中には、宿主範囲が幅広いものもあり、限定的な細胞種のサブセットのみで機能するものもある（総説については、Vossら、Trends Biochem. Sci.、11：287［1986］；およびManiatisら、前記を参照）。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類種に由来するさまざまな細胞種で高い活性を示し、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に広く用いられている（Dijkemaら、EMBO J. 4：761［1985］）。広範囲の哺乳類種において活性のあるプロモーター/エンハンサー因子の他の2つの例は、ヒト伸長因子1α遺伝子（Uetsukiら、J. Biol. Chem.、264：5791［1989］；Kimら、Gene 91：217［1990］；ならびにMizushimaおよびNagata、Nuc. Acids. Res.、18：5322［1990］）、ならびにラウス肉腫ウイルス（Gormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：6777［1982］）およびヒトサイトメガロウイルス（Boshartら、Cell 41：521［1985］）の長い末端反復配列（long terminal repeat）からのものである。
本明細書で用いる「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能（すなわち、プロモーター因子およびエンハンサー因子によって与えられる機能、これらの機能に関する考察については上記参照）を提供しうる配列を含むDNAの区域のことを指す。例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列はプロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を含む。エンハンサー/プロモーターは「内因性」でもよく、「外因性」または「異種」でもよい。「内因性」エンハンサー/プロモーターは、ゲノム中で所定の遺伝子と自然条件下で結合しているものである。「外因性」または「異種」エンハンサー/プロモーターは、遺伝子の転写が結合したエンハンサー/プロモーターによって指令されるように、遺伝子操作（すなわち、クローニングおよび組換えなどの分子生物学の技法）によって遺伝子と並置されたものである。
調節因子は組織特異的または細胞特異的なものでもよい。「組織特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の組織（例えば、肝臓）に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、異なる種類の組織（例えば、肺）における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。
調節因子の組織特異性を、例えば、レポーター遺伝子をプロモーター配列（組織特異的でないもの）および調節因子と機能的に結合させてレポーター構築物を作製し、レポーター構築物を動物のゲノムに導入して、その結果得られるトランスジェニック動物の全組織にレポーター構築物を組み込んだ上で、トランスジェニック動物の種々の組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出すること（例えば、レポーター遺伝子によってコードされるmRNA、タンパク質またはタンパク質の活性を検出すること）によって評価してもよい。1つまたは複数の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルが他の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルよりも高いことを検出することにより、調節因子が、相対的に高い発現レベルが検出された組織に対して「特異的」であることが示される。したがって、本明細書で用いる「組織特異的「（例えば、肝特異的）」という用語は、発現の絶対的特異性を必要としない相対的な用語である。言い換えると、「組織特異的」という用語は、1つの組織の発現レベルが極めて高く、別の組織には全く発現がないことを要しない。1つの組織の発現が別のものよりも高いことで十分である。これに対して、「厳密な」または「絶対的な」組織特異的発現とは、単一の種類の組織（例えば、肝臓）における発現がみられ、他の組織における発現が検出不能であることを示すものとする。
「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の細胞に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、同じ組織中の異なる種類の細胞における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、単一組織中のある領域における関心対象のヌクレオチド配列の選択的発現を促しうる調節因子のことも意味する。
調節因子の細胞種特異性は、当技術分野で周知の方法（例えば、免疫組織化学的染色および/またはノーザンブロット分析）を用いて評価しうる。簡潔に述べると、免疫組織化学的染色のためには、組織切片をパラフィン中に包埋し、このパラフィン切片を、調節因子によって発現が調節される関心対象のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物に対して特異的な一次抗体と反応させる。一次抗体に対して特異的な標識化した（例えば、ペルオキシダーゼを結合させた）二次抗体を切片化した組織と結合させ、特異的結合を顕微鏡によって検出する（例えば、アビジン/ビオチンを用いる）。簡潔に述べうると、ノーザンブロット分析のためには、RNAを細胞から単離し、アガロースゲル上で電気泳動を行ってRNAをサイズ別に分画した後に、RNAをゲルから固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）に移す。続いて、固定化したRNAを標識化したオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブまたはDNAプローブにより検索し、用いたプローブに対して相補的なRNA種を検出する。ノーザンブロットは分子生物学者にとって標準的なツールである。
「プロモーター」「プロモーター因子」または「プロモーター配列」という用語は、本明細書で用いる場合、関心対象のヌクレオチド配列と連結した場合に関心対象のヌクレオチド配列のmRNAへの転写を制御しうるDNA配列のことを指す。プロモーターは、mRNAへの転写を制御する関心対象のヌクレオチド配列の5'側（すなわち、上流）に位置し、転写開始のためにRNAポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合が起こる部位を備えることが、必然的ではないものの一般的である。
プロモーターは構成性でも調節性でもよい。「構成性」という用語は、プロモーターに言及する場合、プロモーターが、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）がなくとも、機能的に結合した核酸配列の転写を指令しうることを意味する。これに対して、「調節性」プロモーターとは、刺激（例えば、熱ショック、化学物質など）の存在下で、機能的に結合した核酸配列の、刺激の非存在下における機能的に結合した核酸配列の転写レベルとは異なるレベルの転写を指令しうるもののことである。
発現ベクターに「スプライシングシグナル」が存在すると、組換え転写産物の発現レベルの上昇がしばしば起こる。スプライシングシグナルはRNA一次転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー部位およびアクセプター部位からなる（Sambrookら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York［1989］、pp.16.7〜16.8）。よく用いられるスプライスドナー部位およびアクセプター部位は、SV40の16S RNAに由来するスプライス部位である。
真核生物細胞における組換えDNA配列の効率的発現には、効率的な転写終結およびその結果生じた転写産物のポリアデニル化を指令するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流に認められ、長さは数百ヌクレオチドである。本明細書で用いる「ポリA部位」または「ポリA配列」という用語は、転写終結および新生RNA転写産物のポリアデニル化を指令するDNA配列のことを表す。ポリA尾部を持たない転写産物は不安定で急速に分解されるため、組換え転写産物が効率的にポリアデニル化されることが望ましい。発現ベクター中に用いるポリAシグナルは「異種」でも「内因性」でもよい。内因性ポリAシグナルとは、ゲノム中で所定の遺伝子のコード領域の3'端に天然に認められるもののことである。異種ポリAシグナルとは、1つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の3'側に配置されたもののことである。よく用いられる異種ポリAシグナルはSV40ポリAシグナルである。SV40ポリAシグナルは237bpのBamHI/BclI制限断片に含まれており、転写終結およびポリアデニル化の両方を指令する（Sambrook、前記、16.6〜16.7）。
真核生物発現ベクターが「ウイルスレプリコン」または「ウイルス複製起点」を含んでいてもよい。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿主細胞におけるベクターの染色体外複製を可能とするウイルスDNA配列である。SV40またはポリオーマウイルスの複製起点を含むベクターは、適切なウイルスT抗原を発現する細胞内で高「コピー数」（最大104コピー/細胞）へと複製される。ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン-バーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは染色体外で「低コピー数」（ほぼ100コピー/細胞）の複製が起こる。しかし、発現ベクターは何らかの特定のウイルス複製起点には限定されないものとする。
本明細書で用いる「長い末端反復配列」または「LTR」とは、レトロウイルスゲノムの5'および3'側のU3領域に位置するか、またはそこから単離された転写制御因子のことを指す。当技術分野で知られている通り、長い末端反復配列をレトロウイルスベクター中の制御因子として用いてもよく、または、レトロウイルスゲノムから単離して他の種類のベクターからの発現を制御するために用いてもよい。
本明細書で用いる「分泌シグナル」という用語は、シグナルペプチドをコードする組換えDNA配列と機能的に結合させた場合に組換えポリペプチドの分泌を引き起こすことができる任意のDNA配列のことを指す。一般に、シグナルペプチドは一連の約15〜30個の疎水性アミノ酸残基を含む（例えば、Zwizinskiら、J. Biol. Chem. 255（16）：7973〜77［1980］、Grayら、Gene 39（2）：247〜54［1985］およびMartialら、Science 205：602〜607［1979］を参照）。このような分泌シグナル配列は、組織特異的発現の標的となる細胞種から分泌されるポリペプチド（例えば、乳腺分泌細胞における発現およびそれからの分泌の目的には乳タンパク質）をコードする遺伝子に由来することが好ましい。しかし、分泌性DNA配列はこのような配列には限定されない。多くの細胞種および生物体から分泌されるタンパク質に由来する分泌性DNA配列を用いてもよい（例えば、t-PA、血清アルブミン、ラクトフェリンおよび成長ホルモンに対する分泌シグナル、ならびに酵母、糸状菌および細菌などの分泌性ポリペプチドをコードする微生物遺伝子に由来する分泌シグナル）。
本明細書で用いる「RNA移行因子」または「mRNA前駆体プロセシングエンハンサー（PPE）」とは、核からのRNAの輸送を増強する3'および5'シス作用性転写後調節因子のことを指す。「PPE」因子には、メルツ（Mertz）配列（米国特許第5,914,267号および第5,686,120号に記載、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）およびウッドチャックmRNAプロセシングエンハンサー（WPRE；国際公開公報第99/14310号および米国特許第6,136,597号、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「多シストロン性」と言う用語は、複数のポリペプチド鎖をコードするmRNAのことを指す（例えば、国際公開公報第93/03143号、国際公開公報第88/05486号および欧州特許第117058号を参照、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。同様に「多シストロン性配列中に配置された」という用語は、単一のmRNA中に2つの異なるポリペプチド鎖をコードする遺伝子の配置のことを指す。
本明細書で用いる「リボソーム内部進入部位」または「IRES」という用語は、二シストロン性mRNAの翻訳の内部開始によって第2の遺伝子から生じる発現産物の産生を可能とする、多シストロン性遺伝子の間に位置する配列のことを指す。リボソーム内部進入部位には、口蹄疫ウイルス（FDV）、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルスおよびRDVに由来するものが含まれるが、これらに限定されない（Scheperら、Biochem. 76：801〜809［1994］；Meyerら、J. Virol. 69：2819〜2824［1995］；Jangら、1988、S. Virol. 62：2636〜2643［1998］；Hallerら、J. Virol. 66：5075〜5086［1995］）。IRESが組み入れられたベクターは当技術分野で知られた通りに構成しうる。例えば、多シストロン性配列を含むレトロウイルスベクターは、機能的に結び付いた以下の因子を含みうる：ヌクレオチドポリリンカー、関心対象の遺伝子、リボソーム内部進入部位および哺乳類選択マーカーまたは関心対象の別の遺伝子。多シストロン性カセットは、5' LTRプロモーターからの転写によって多シストロン性メッセージカセットが転写されるような、レトロウイルスベクター内部の5' LTRと3' LTRとの間の位置に置かれる。多シストロン性メッセージカセットの転写を、用途に即して好ましいと思われる内部プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）または誘導性プロモーターによって駆動させてもよい。多シストロン性メッセージカセットはさらに、機能的に結び付いたcDNAまたはゲノムDNA（gDNA）配列をポリリンカー内部に含みうる。任意の哺乳類選択マーカーを、多シストロン性メッセージカセットの哺乳類選択マーカーとして用いることができる。このような哺乳類選択マーカーは当業者に周知であり、これにはカナマイシン/G418、ハイグロマイシンBまたはミコフェノール酸耐性マーカーが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「レトロウイルス」という用語は、細胞内に侵入し、レトロウイルスゲノム（二本鎖プロウイルスとして）を宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルス粒子のことを指す（すなわち、この粒子は、宿主細胞表面と結合して宿主細胞の細胞質へのウイルス粒子の侵入を促進しうる、外被タンパク質またはウイルスG糖タンパク質などの膜関連タンパク質を含む）。「レトロウイルス」という用語には、オンコウイルス亜科（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMOLV）、モロニーマウス肉腫ウイルス（MoMSV）およびマウス乳腺癌ウイルス（MMTV））、スプマウイルス亜科およびレンチウイルス亜科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルスが含まれる；例えば、米国特許第5,994,136号および第6,013,516号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。
本明細書で用いる「レトロウイルスベクター」という用語は、関心対象の遺伝子を発現するように改変されたレトロウイルスのことを指す。レトロウイルスベクターは、ウイルスの感染プロセスを利用することにより、宿主細胞に遺伝子を効率的に導入するために用いることができる。レトロウイルスゲノム中にクローニングされた（すなわち、分子生物学の技法を用いて挿入された）外来遺伝子または異種遺伝子を、レトロウイルス感染に対する感受性のある宿主細胞に効率的に送達することができる。よく知られた遺伝子操作により、レトロウイルスゲノムの複製能を消失させることが可能である。この結果得られる複製能欠損ベクターは新たな遺伝物質を細胞に導入するために用いうるが、自らは複製を行えない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系を、ベクター粒子の集合および細胞からの流出を可能にするために用いることができる。このようなレトロウイルスベクターは、少なくとも1つの関心対象の遺伝子をコードする核酸配列（多シストロン性核酸配列は複数の関心対象の遺伝子をコードしうる）、5'レトロウイルスの長い末端反復配列（5' LTR）；および3'レトロウイルスの長い末端反復配列（3' LTR）を含む複製能欠損レトロウイルスのゲノムを含む。
「偽型のレトロウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質を含むレトロウイルスベクターのことを指す。「膜関連タンパク質」という用語は、ウイルス粒子を取り囲む膜に付随するタンパク質のことを指す（例えば、VSV、ピリー（Piry）、チャンディプラ（Chandipura）およびモコラ（Mokola）などのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはGタンパク質）；これらの膜関連タンパク質はウイルス粒子の宿主細胞への侵入を媒介する。レトロウイルス外被タンパク質の場合のように膜関連タンパク質が特異的な細胞表面タンパク質受容体と結合する場合もあり、またはラブドウイルス科のメンバーに由来するGタンパク質の場合のように膜関連タンパク質が宿主細胞の原形質膜のリン脂質成分と相互作用する場合もある。
「異種膜関連タンパク質」という用語は、ベクター粒子のヌクレオキャプシドタンパク質の由来である同じウイルス綱または科のメンバーではないウイルスに由来する膜関連タンパク質のことを指す。「ウイルス綱または科」とは、国際ウイルス分類委員会（International Committee on Taxonomy of Virus）により指定された網または科という分類学上の等級を指す。
「ラブドウイルス科」という用語は、ヒトを含む動物および植物を感染させる、外被を有するRNAウイルスの科のことを指す。ラブドウイルス科は、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、コカル（Cocal）ウイルス、ピリー（Piry）ウイルス、チャンディプラ（Chandipura）ウイルスおよびコイ春ウイルス病ウイルスを含むベシクロウイルス属を含む（コイ春ウイルス病ウイルスをコードする配列はGenBankアクセッション番号U18101で入手可能）。ベシクロウイルス属のウイルスのGタンパク質はウイルスにコードされた内在性膜タンパク質であり、受容体結合および膜融合に必要な、外側に突出したホモ三量体棘状糖タンパク質複合体を形成する。ベシクロウイルス属のウイルスのGタンパク質には、共有結合したパルミチン酸（C16）部分がある。ベシクロウイルス由来のGタンパク質のアミノ酸配列はかなりよく保存されている。例えば、ピリーウイルスのGタンパク質とVSVのGタンパク質の同一性は約38％であり、類似性は約55％である（VSVにはIndiana株、New Jersey株、Orsay株、San Juan株などの複数の株が知られており、それらのGタンパク質の相同性は高い）。チャンディプラウイルスのGタンパク質とVSV Gタンパク質の同一性は約37％であり、類似性は52％である。ベシクロウイルスのGタンパク質の保存性（アミノ酸配列）が高度であり、機能特性（例えば、合胞体形成を含む、ウイルスの宿主細胞との結合および膜融合）が類似していることを考えると、ウイルス粒子の偽型化のために、VSV以外のベシクロウイルス由来のGタンパク質をVSV Gタンパク質の代わりに用いうると考えられる。リサウイルス（ラブドウイルス科に属する別の属）のGタンパク質も、VSV Gタンパク質との間に高度の保存性があり、同様の様式で作用するため（例えば、膜融合を媒介する）、ウイルス粒子の偽型化のためにVSV Gタンパク質の代わりに用いうる。リサウイルスには、モコラ（Mokola）ウイルスおよび狂犬病ウイルスが含まれる（狂犬病ウイルスには複数の株が知られており、それらのGタンパク質はクローニングおよび配列決定がなされている）。モコラウイルスのGタンパク質にはVSV Gタンパク質と相同な領域があり（特に細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン）、VSV Gタンパク質との同一性は約31％、類似性は48％である。好ましいGタンパク質は、VSV Gタンパク質と少なくとも25％の同一性、好ましくは少なくとも30％の同一性、最も好ましくは少なくとも35％の同一性を有するものである。ニュージャージー株からのVSV Gタンパク質（このGタンパク質の配列はGenBankアクセッション番号M27165およびM21557に示されている）を、基準VSV Gタンパク質として用いる。
本明細書で用いる「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルス亜科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルス）に由来する、非分裂細胞への組み込みが可能なレトロウイルスベクターのことを指す（例えば、米国特許第5,994,136号および第6,013,516号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。
「偽型のレンチウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質（例えば、VSV、ピリー、チャンディプラおよびモコラなどのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはGタンパク質）を含むレンチウイルスベクターのことを指す。
本明細書で用いる「トランスポゾン」という用語は、ゲノム中の1つの位置から別の位置への移動または転位が可能な転位因子（例えば、Tn5、Tn7およびTn10）のことを指す。一般に、転位はトランスポザーゼによって制御される。本明細書で用いる「トランスポゾンベクター」という用語は、関心対象の核酸がトランスポゾンの末端と隣接したものをコードするベクターのことを指す。トランスポゾンベクターの例には、米国特許第6,027,722号；第5,958,775号；第5,968,785号；第5,965,443号および第5,719,055号（これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター」という用語は、AAV-1、AAV-2、AAV3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むが、これらに限定されない血清型のアデノ随伴ウイルスに由来するベクターのことを指す。AAVベクターは、全体または一部、好ましくはrepおよび/もしくはcap遺伝子が欠失しているものの機能的なフランキングITR配列は保持している、1つまたは複数のAAV野生型遺伝子を有しうる。
AAVベクターは、当技術分野で知られた組換え技術を用いて、機能的なAAV ITRが両端（5'および3'）に隣接した1つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むように構築することができる。本発明の実施に際して、AAVベクターは少なくとも1つのAAV ITR、異種ヌクレオチド配列の上流に位置する適したプロモーター配列、および異種配列の下流に位置する少なくとも1つのAAV ITRを含みうる。「組換えAAVベクタープラスミド」とは、ベクターがプラスミドを含む、ある種の組換えAAVベクターのことを指す。一般的なAAVベクターの場合と同じく、5'および3' ITRが選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する。
AAVベクターは、ポリアデニル化部位などの転写配列のほか、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、および転写の誘導を可能とする他の制御因子を含むこともできる。このような制御因子については上に述べた。
本明細書で用いる「AAVビリオン」という用語は、完全なウイルス粒子のことを指す。AAVビリオンは野生型AAVウイルス粒子（線状の一本鎖AAV核酸ゲノムを含み、AAVキャプシド、すなわちタンパク質外被を伴う）でもよく、組換えAAVウイルス粒子（以下に述べる）でもよい。この点に関して、一本鎖AAV核酸分子（センス/コード鎖またはアンチセンス/アンチコード鎖のいずれか。これらの用語は一般的な定義による）はAAVビリオンへのパッケージングが可能である；センス鎖およびアンチセンス鎖には同じ感染性がある。
本明細書で用いる「組換えAAVビリオン」または「rAAV」という用語は、5'および3'側にAAV ITRが隣接した異種ヌクレオチド配列がAAVタンパク質外殻でキャプシド化された（すなわち、タンパク質外被で囲まれた）ものから構成される、感染性のある複製能欠損ウイルスのことを指す。組換えAAVビリオンを構築するための技法は当技術分野で数多く知られている（例えば、米国特許第5,173,414号；国際公開公報第92/01070号；国際公開公報第93/03769号；Lebkowskiら、Molec. Cell. Biol. 8：3988〜3996［1988］；Vincentら、Vaccines 90［1990］（Cold Spring Harbor Laboratory Press）；Carter、Current Opinion in Biotecnhnology 3：533〜539［1992］；Muzyczka、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158：97〜129［1992］；Kotin、Human Gene Therapy 5：793〜801［1994］；ShellingおよびSmith、Gene Therapy 1：165〜169［1994］；ならびにZhouら、J. Exp. Med. 179：1867〜1875［1994］を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。
AAVベクター（実際には、本明細書に記載のすべてのベクター）中に用いるのに適したヌクレオチド配列には、機能的に適切な任意のヌクレオチド配列が含まれる。このため、本発明のAAVベクターは、標的細胞ゲノムでは欠陥があるもしくは欠失しているタンパク質をコードする、または望ましい生物的もしくは治療的効果（例えば、抗ウイルス作用）を有する非天然タンパク質をコードする任意の望ましい遺伝子を含むことができ、または、配列がアンチセンスもしくはリボザイムの機能を有する分子に対応してもよい。適した遺伝子には、以下の疾患の治療のために用いられるものが含まれる：AIDS、癌、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症などの疾患を含む炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性疾患および感染症；種々の貧血、サラセミアおよび血友病を含む種々の血液疾患；嚢胞性線維症、ゴーシェ病、アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症、肺気腫などの遺伝的欠損。癌およびウイルス性疾患に対するアンチセンス療法において有用な、さまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、mRNAの翻訳開始部位（AUGコドン）の周りの配列に対して相補的な短いオリゴヌクレオチド）が当技術分野では記載されている（例えば、Hanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：4313〜4317［1991］；Uhlmannら、Chem. Rev. 90：543〜584［1990］；Heleneら、Biochim. Biophys. Acta. 1049：99〜125［1990］；Agarwalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：7079〜7083［1989］；およびHeikkilaら、Nature 328：445〜449［1987］を参照）。適したリボザイムに関する考察については、例えば、チェック（Cech）ら（1992）J. Biol. Chem. 267：17479〜17482および米国特許第5,225,347号（これらは参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「AAV ITR」とは、DNA複製起点およびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシス的に協同作用する、AAVゲノムの両端に存在する当技術分野で認知されているパリンドローム領域を意味する。本発明に用いるためには、選択した1つまたは複数の異種ヌクレオチド配列の5'および3'側にフランキングAAV ITRを配置し、これをrepコード領域またはRep発現産物と併用することにより、選択した配列の標的細胞ゲノム中への組み込みが得られる。
AAV ITR領域のヌクレオチド配列は知られている（例えば、AAV-2配列に関しては、Kotin、Human Gene Therapy 5：793〜801［1994］；Berns, K.I. 「パルボウイルスおよびその複製（Parvoviridae and their replication）」、「基礎ウイルス学（Fundamental Virology）」、第2版（B.N. FieldsおよびD.M. Knipe編）を参照）。本明細書で用いる「AAV ITR」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、除去または置換によって改変してもよい。さらに、AAV ITRは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むが、これらに限定されない複数のAAV血清型のいずれに由来してもよい。選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する5'および3' ITRは、意図した通りに機能する限り、すなわちrep遺伝子が（同じまたは異なるベクター上に）存在する場合またはRep発現産物が標的細胞内に存在する場合に、付随する異種配列の標的細胞ゲノム中への組み込みを行える限り、必ずしも同一である必要はなく、同じAAV血清型または分離株に由来する必要もない。
本明細書で用いる「インビトロ」という用語は、人工的環境、および人工的環境で起こるプロセスまたは反応のことを指す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物から非制限的に構成される。「インビボ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で起こるプロセスまたは反応のことを指す。
本明細書で用いる「クローン由来である（clonally derived）」とは、単一細胞に由来する細胞系のことを指す。
本明細書で用いる「非クローン由来である」とは、複数の細胞に由来する細胞系のことを指す。
本明細書で用いる「継代」という用語は、特定の密度または集密度（例えば、70％または80％の集密度）まで増殖した細胞の培養物を希釈し、希釈した細胞を再び望ましい特定の密度または集密度へと増殖させるプロセスのことを指す（例えば、細胞の再プレーティング、または細胞を用いて新たな回転びん培養物を樹立することによる）。
本明細書で用いる「安定な」という用語は、ゲノムに言及して用いる場合、ゲノムの情報内容が1つの世代から次の世代に、または細胞系という特定の場合には、1つの継代物から次の継代物へと安定的に維持されることを指す。したがって、ゲノムに大きな変化（例えば、遺伝子の欠失または染色体転座）が起こっていなければゲノムは安定であるとみなす。「安定な」という用語は、ゲノムに点変異などのわずかな変化が起こっている可能性を否定するものではない。
本明細書で用いる「反応（response）」という用語は、アッセイに言及して用いる場合、検出可能なシグナル（例えば、レポータータンパク質の蓄積、イオン濃度の上昇、検出可能な化学生成物の蓄積）の発生のことを指す。
本明細書で用いる「膜受容体タンパク質」という用語は、リガンド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）が結合する膜貫通タンパク質のことを指す。当技術分野で知られているように、タンパク質のリン酸化は、調節シグナルを細胞外から核へと運ぶタンパク質を選択的に修飾するために細胞が用いる一般的な調節機構である。これらの生化学的修飾を遂行するタンパク質は、プロテインキナーゼとして知られる一群の酵素である。それらはさらに、リン酸化の標的とする基質残基によっても定義しうる。プロテインキナーゼの1つの群に、標的タンパク質のチロシン残基を選択的にリン酸化するチロシンキナーゼ（TK）がある。チロシンキナーゼの一部は膜結合型受容体（RTK）であり、これらはリガンドによって活性化されると基質の修飾に加えて自己リン酸化も行いうる。リガンド刺激による連続的リン酸化の開始は、例えば上皮増殖因子（EGF）、インスリン、血小板由来増殖因子（PDGF）および線維芽細胞増殖因子（FGF）などの、この種のエフェクターの作用の基盤を成すパラダイムである。これらのリガンドに対する受容体はチロシンキナーゼであり、これらはリガンド（ホルモン、増殖因子）の標的細胞との結合、および1つまたは複数の生化学的経路の活性化によるシグナルの細胞内への伝達のインターフェースとなる。受容体チロシンキナーゼに対するリガンドの結合により、その固有の酵素活性が活性化される（例えば、UllrichおよびSchlessinger、Cell 61：203〜212［1990］を参照）。チロシンキナーゼは細胞質の非受容体型酵素のこともあり、これはシグナル伝達経路の下流成分として作用する。
本明細書で用いる「シグナル伝達タンパク質」という用語は、膜受容体タンパク質に対するリガンド結合または何らかの他の刺激により、活性化または別の様式の影響を受けるタンパク質のことを指す。シグナル伝達タンパク質の例には、アデニルシクラーゼ、ホスホリパーゼCおよびGタンパク質が含まれる。多くの膜受容体タンパク質はGタンパク質と共役している（すなわち、Gタンパク質共役受容体（GPCR）；総説については、Neer、1995、Cell 80：249〜257［1995］を参照）。一般に、GPCRは7つの膜貫通ドメインを含む。既知のGPCRとの配列相同性に基づいて、GPCRと推定されるものを同定することが可能である。
GPCRは、GPCRの細胞外部分に対するリガンドの結合によって生じる、細胞膜を介したシグナル伝達を媒介する。GPCRの細胞内部分はGタンパク質と相互作用し、細胞の外側から内側へのシグナル伝達の調節を行う。このため、GPCRはGタンパク質と「共役している」という。Gタンパク質は、GTPと結合してそれを加水分解するαサブユニットおよび二量体のβγサブユニットという3つのポリペプチドサブユニットから構成される。活性化されていない基底状態では、Gタンパク質はαおよびβγサブユニットのヘテロ三量体として存在する。Gタンパク質が活性化されると、グアノシン二リン酸（GDP）がGタンパク質のαサブユニットと会合する。GPCRがリガンドと結合して活性化されると、GPCRはGタンパク質ヘテロ三量体と結合し、GαサブユニットのGDPに対する親和性を低下させる。活性化状態では、GサブユニットはGDPをグアニン三リン酸（GTP）と交換し、活性型Gaサブユニットが受容体および二量体βγサブユニットの両方から解離する。解離した活性型Gαサブユニットは、細胞内のGタンパク質シグナル伝達経路の「下流」にあるエフェクターにシグナルを伝達する。最終的に、Gタンパク質の内因性GTPアーゼ活性により、活性型GサブユニットはGDPおよび二量体βγサブユニットと会合した不活性状態に復帰する。
ヘテロ三量体Gタンパク質ファミリーのメンバーは数多くクローニングされており、これには種々のGαサブユニットをコードする20種を上回る遺伝子が含まれる。これらの種々のGサブユニットは、アミノ酸配列および機能的相同性に基づいて4つのファミリーに分類されている。これらの4つのファミリーはGαs、Gαi、GαqおよびGα12と命名されている。機能的には、これらの4つのファミリーは、活性化する細胞内シグナル伝達経路および共役するGPCRの点で異なる。
例えば、ある種のGPCRは通常Gαsと共役しており、これらのGPCRはGαsを介してアデニリルシクラーゼ活性を刺激する。他のGPCRは通常GGαqと共役しており、これらのGPCRはGGαqを介して、ホスホリパーゼCのβアイソフォーム（すなわちPLCβ、StermweisおよびSmrcka、Trends in Biochem. Sci. 17：502〜506［1992］）などのホスホリパーゼC（PLC）を活性化することができる。
本明細書で用いる「核酸結合タンパク質」という用語は、核酸と結合するタンパク質のことを指し、特に、遺伝子からの転写を増加させる（すなわち、活性化物質または転写因子）または減少させる（すなわち、阻害物質）タンパク質のことを指す。
本明細書で用いる「イオンチャネルタンパク質」という用語は、細胞膜を介したイオンの流入または流出を制御するタンパク質のことを指す。イオンチャネルタンパク質の例には、Na＋-K＋ATPアーゼポンプ、Ca2＋ポンプおよびK＋漏洩チャネルが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「プロテインキナーゼ」という用語は、ヌクレオシド三リン酸に由来するリン酸基のタンパク質のアミノ酸側鎖への付加を触媒するタンパク質のことを指す。キナーゼは既知の酵素スーパーファミリーのうち最大のものであり、その標的タンパク質は極めて広範囲にわたる。キナーゼは、チロシン残基をリン酸化するタンパク質チロシンキナーゼ（PTK）、ならびにセリンおよび/またはトレオニン残基をリン酸化するタンパク質セリン/トレオニンキナーゼ（STK）に分類しうる。一部のキナーゼは、セリン/トレオニンおよびチロシン残基に対する二重特異性を有する。ほとんどすべてのキナーゼは、保存的な250〜300アミノ酸の触媒ドメインを含む。このドメインはさらに11種のサブドメインに分けることができる。N末端サブドメインI〜IVはフォールディングにより、ATPドナー分子と結合してそれを正しい方向に配置させる二葉状構造を生じ、サブドメインVはこの二葉部分にまたがる。C末端サブドメインVI〜XIはタンパク質の基質と結合し、γリン酸をセリン、トレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基に転移させる。11種のサブドメインはそれぞれ、そのサブドメインに特徴的な特定の触媒残基またはアミノ酸モチーフを含む。例えば、サブドメインIは8アミノ酸のグリシンに富むATP結合コンセンサスモチーフを含み、サブドメインIIは最大限の触媒活性のために必要な決定的に重要なリジン残基を含み、サブドメインVI〜IXは高度に保存された触媒コアを含む。STKおよびPTKは、サブドメインVIおよびVIIIにヒドロキシアミノ酸特異性を付与すると思われる独特な配列モチーフも含んでいる。一部のSTKおよびPTKは双方のファミリーの構造的特徴を共有している。さらに、キナーゼを、キナーゼドメインに隣接して、またはその内部に存在する、一般に5〜100残基の付加的なアミノ酸配列によって分類することもできる。
非膜貫通型PTKは、原形質膜受容体の細胞質ドメインとシグナル伝達複合体を形成する。非膜貫通型PTKを通じてシグナルを伝達する受容体には、サイトカイン受容体、ホルモン受容体および抗原特異的リンパ球受容体が含まれる。多くのPTKは最初、PTK活性化が正常な細胞制御を受けていない癌細胞における癌遺伝子の産物として同定された。実際に、既知の癌遺伝子の3分の1はPTKをコードしている。さらに、細胞形質転換（発癌）はしばしばチロシンリン酸化活性の上昇を伴う（例えば、Carbonneau、H.およびTonks、Annu. Rev. Cell Biol. 8：463〜93［1992］を参照）。このため、PTK活性の調節は、ある種の癌を抑制する上で重要な戦略であると考えられる。
プロテインキナーゼの例には、cAMP依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼCおよびサイクリン依存性プロテインキナーゼが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第6,034,228号；第6,030,822号；第6,030,788号；第6,020,306号；第6,013,455号；第6,013,464号；および第6,015,807号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。
本明細書で用いる「プロテインホスファターゼ」という用語は、タンパク質からリン酸基を除去するタンパク質のことを指す。プロテインホスファターゼは一般に、受容体型および非受容体型のタンパク質という2つの群に分けられる。ほとんどの受容体型プロテインチロシンホスファターゼは、それぞれ240アミノ酸残基の区域を含む、2つの保存的な触媒ドメインを含む（例えば、Saitoら、Cell Growth and Diff. 2：59〜65［1991］を参照）。受容体型プロテインチロシンホスファターゼは、細胞外ドメインのアミノ酸配列の多様性に基づいてさらに細分することができる（例えば、Kruegerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：7417〜7421［1992］を参照）。プロテインホスファターゼの例には、cdc25 a、bおよびc、PTP20、PTP1DおよびPTPλが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第5,976,853号；第5,994,074号；第6,004,791号；第5,981,251号；第5,976,852号；第5,958,719号；第5,955,592号；および第5,952,212号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。
本明細書で用いる「癌遺伝子によってコードされるタンパク質」という用語は、直接的または間接的に、宿主細胞の悪性形質転換を引き起こすタンパク質のことを指す。癌遺伝子の例には以下の遺伝子が含まれるが、これらに限定されない：src、fps、fes、fgr、ros、H-ras、abl、ski、erbA、erbB、fms、fos、mos、sis、myc、myb、rel、kit、raf、K-rasおよびets。
本明細書で用いる「免疫グロブリン」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。免疫グロブリンには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、Fab断片、F(ab')2断片が含まれるが、これらに限定されず、以下のクラスの免疫グロブリンが含まれる：IgG、IgA、IgM、IgD、IbEおよび分泌型免疫グロブリン（sIg）。免疫グロブリンは一般に、2つの同一な重鎖（γ、α、μ、δまたはε）および2つの軽鎖（κまたはλ）を含む。
本明細書で用いる「抗原結合タンパク質」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。「抗原結合タンパク質」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む免疫グロブリン；Fab断片、F(ab')2断片およびFab発現ライブラリー；ならびに一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で知られたさまざまな手順がポリクローナル抗体の作製のために用いられる。抗体の産生のためには、望ましいエピトープに対応するペプチドの注射による免疫処置を、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含むが、これらに限定されない種々の宿主動物に行うとよい。1つの好ましい態様では、ペプチドを免疫原性担体（例えば、ジフテリアトキソイド、ウシ血清アルブミン（BSA）またはキーホールリンペットヘモシアニン（KLH））と結合させる。免疫応答を高めるために、フロイントアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質、ならびにBCG（カルメット-ゲラン菌）およびコリネバクテリウムパルブム（Corynebacterium parvum）などの有用と考えられるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない種々のアジュバントを宿主種に応じて用いる。
モノクローナル抗体の調製のためには、培養下にある連続継代細胞系による抗体分子の産生を用いうる（例えば、HarlowおよびLane、「抗体：実験マニュアル（Antibody：A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照）。これらには、ケーラー（Kohler）およびミルシュタイン（Milstein）によって最初に開発されたハイブリドーマ法（KohlerおよびMilstein、Nature 256：495〜497［1975］）のほか、トリオーマ（trioma）法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（例えば、Kozborら、Immunol. Today 4：72［1983］参照）、ならびにヒトモノクローナル抗体の産生を目的とするEBV-ハイブリドーマ法（Coleら、モノクローナル抗体および癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）、Alan R. Liss, Inc.、pp.77〜96［1985］）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、一本鎖抗体の作製を目的として記載された技法（米国特許第4,946,778号；参照として本明細書に組み入れられる）を、必要な特異的一本鎖抗体を作製するために適合化することができる。本発明のもう1つの態様では、望ましい特異性を備えたモノクローン性Fab断片の迅速かつ容易な同定が可能となるように、Fab発現ライブラリーの構築を目的とする当技術分野で知られた技法を用いる（Huseら、Science 246：1275〜1281［1989］）。
抗体分子のイディオタイプ（抗原結合領域）を含む抗体断片は、既知の技法によって作製することができる。例えば、このような断片には以下のものが含まれるが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化によって作製しうるF(ab')2断片；F(ab')2断片のジスルフィド結合の還元によって作製しうるFab'断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製しうるFab断片。
抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野で知られた方法によって単離することができる。抗体の作製に際しては、当技術分野で知られた技法により、望ましい抗体に関するスクリーニングを実施しうる（例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA（固相酵素免疫アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素標識または放射性同位体標識を用いる）、ウエスタンブロット法、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなど）。
本明細書で用いる「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイしうるタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。レポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（例えば、deWetら、Mol. Cell. Biol. 7：725［1987］ならびに米国特許第6,074,859号；第5,976,796号；第5,674,713号；および第5,618,682号；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）、緑色蛍光タンパク質（例えば、GenBankアクセッション番号U43284；さまざまなGFP変種がクロンテックラボラトリーズ社（CLONTECH Laboratories、Palo Alto、CA）から販売されている）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「精製された」という用語は、自然環境から採取、単離または分離された、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかである分子のことを指す。このため、「単離された核酸配列」は精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、自然条件下で付随する他の成分を少なくとも60％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％含まない。
「被験化合物」という用語は、疾患、疾病、病もしくは身体機能の障害の治療および/もしくは予防に有用と考えられる、または試料の生理的状態もしくは細胞状態を別の様式で変化させると考えられる、任意の化学的実体、医薬品、薬剤などを指す。被験化合物には、既知の治療的化合物およびその可能性のあるものの両方が含まれる。本発明のスクリーニング法を用いるスクリーニングにより、被験化合物が治療的であることを判定することができる。「既知の治療的化合物」とは、このような治療または予防に有効なことが示されている（例えば、動物試験、またはヒトに対する過去の投与の経験により）、治療的化合物のことを指す。
変性条件下で泳動させ、抗ヒトIgG（Fc）および抗ヒトIgG（κ）によりプローブ検索を行った15％SDS-PAGEゲルのウエスタンブロットである。 経時的なMN14発現に関するグラフである。 非変性条件下で泳動させ、抗ヒトIgG（Fe）および抗ヒトIgG（κ）によりプローブ検索を行った15％PAGEのウエスタンブロットである。 ハイブリッド型ヒト-ウシα-ラクトアルブミンプロモーターの配列を提示したものである（配列番号：1）。 変異型PPE配列の配列を提示したものである（配列番号：2）。 IRES-シグナルペプチド配列の配列を提供する（配列番号：3）。 CMV MN14ベクターの配列を提供する（配列番号：4）。 図7Aの続きを示す図である。 CMV LL2ベクターの配列を提供する（配列番号：5）。 図8Aの続きを示す図である。 MMTV MN14ベクターの配列を提供する（配列番号：6）。 図9Aの続きを示す図である。 図9Bの続きを示す図である。 α-ラクトアルブミンMN14ベクターの配列を提供する（配列番号：7）。 図10Aの続きを示す図である。 図10Bの続きを示す図である。 図10Cの続きを示す図である。 α-ラクトアルブミンBotベクターの配列を提供する（配列番号：8）。 図11Aの続きを示す図である。 図11Bの続きを示す図である。 LSRNLベクターの配列を提供する（配列番号：9）。 図12Aの続きを示す図である。 α-ラクトアルブミンcc49IL2ベクターの配列を提供する（配列番号：10）。 図13Aの続きを示す図である。 α-ラクトアルブミンYPベクターの配列を提供する（配列番号：11）。 図14Aの続きを示す図である。 図14Bの続きを示す図である。 IRES-カゼインシグナルペプチド配列の配列を提供する（配列番号：12）。 LNBOTDCベクターの配列を提供する（配列番号：13）。 図16Aの続きを示す図である。 図16Bの続きを示す図である。 CMVプロモーター細胞系における、インベーダーアッセイによる遺伝子比を示すグラフを提供する。 α-ラクトアルブミンプロモーター細胞系における、インベーダーアッセイによる遺伝子比を示すグラフを提供する。 Gタンパク質共役受容体および抗体軽鎖を発現するレトロウイルスベクターの配列を提供する。 図19Aの続きを示す図である。 図19Bの続きを示す図である。 図19Cの続きを示す図である。
発明の詳細な説明
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞に関する。本発明は、関心対象の遺伝子をコードする核酸を高コピー数含む細胞系を作製するために、組み込みベクター（すなわち、インテグラーゼまたはトランスポザーゼによって組み込みを行うベクター）を利用する。高コピー数細胞（high copy number cell）のトランスフェクトされたゲノムは、反復継代（例えば、少なくとも10回の継代、好ましくは少なくとも50回の継代、最も好ましくは少なくとも100回の継代）に対して安定である。さらに、本発明の宿主細胞は、高レベルのタンパク質を産生することができる（例えば、1pg/細胞/日を上回る、好ましくは10pg/細胞/日を上回る、より好ましくは50pg/細胞/日を上回る、最も好ましくは100pg/細胞/日を上回る）。
本発明の宿主細胞のゲノム安定性および高い発現レベルは、以前に記載された細胞培養の方法を上回る明確な利点をもたらす。例えば、遺伝子の複数のコピーを含む哺乳類細胞系は本質的に不安定であることが当技術分野では知られている。実際に、この不安定性は、高速スクリーニングアッセイを含むさまざまな目的に哺乳類細胞系を用いたいと考えている研究者が直面する、認知された問題である（例えば、Sittampalamら、Curr. Opin. Chem. Biol. 1（3）：384〜91［1997］を参照）。
本発明は特定の作用機序には限定されないものとする。実際には、機序の理解は本発明の構成および使用に必要ではない。しかし、本発明の宿主細胞のゲノム安定性およびタンパク質発現レベルの高さは、組み込みベクター（例えば、レトロウイルスベクター）に特有の特性に起因すると考えられる。例えば、レトロウイルスは多くの生物の生殖系列における遺伝性因子であることが知られている。実際に、哺乳類ゲノムの5〜10％もの割合は逆転写に起因する因子からなると考えられており、このことは高度の安定性を意味する。同様に、これらの種類のベクターの多くは、ゲノム中の活性のある（例えば、DNA分解酵素I高感受性部位）転写部位を標的とする。
多くの研究が、レトロウイルスおよびトランスポゾンによる組み込みの有害な影響を対象としている。ゲノムの活性領域を標的とする性質があるため、レトロウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターはプロモータートラップ法および飽和変異誘発法に用いられている（例えば、米国特許第5,627,058号および第5,922,601号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。プロモータートラップ法では、細胞を、プロモーターを含まないレポーターベクターに感染させる。プロモーターを含まないベクターがプロモーターの下流（すなわち、遺伝子内）に組み込みを行うと、ベクターによってコードされるレポーター遺伝子が活性化される。続いて、プロモーターのクローニングを行い、さらに特徴分析を行うことができる。
理解されるであろうが、これらの方法は内因性遺伝子の破壊に依拠している。このため、通常であれば遺伝子の破壊を招くと考えられる、組み込みベクターを高い感染多重度で用いる本発明の方法により、関心対象のタンパク質を大量に発現する安定な細胞系が開発されたことは驚くべきことである。これらの細胞系の開発について以下にさらに詳細に述べる。説明は以下のセクションに分かれる：I）宿主細胞；II）ベクターおよびトランスフェクションの方法；ならびにIII）トランスフェクトされた宿主細胞の使用。
I．宿主細胞
本発明は、組み込みベクターによる種々の宿主細胞のトランスフェクションを考えている。当技術分野では数多くの哺乳類宿主細胞系が知られている。一般に、これらの宿主細胞は、以下により詳細に述べる適切な栄養素および増殖因子を含む培地中での単層培養または懸濁培養下においた場合に生育および生存が可能である。典型的な場合、細胞は関心対象の特定のタンパク質を大量に発現し、培地中に分泌する。適した哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO-K1、ATCC CC1-61）；ウシ乳腺上皮細胞（ATCC CRL 10274；ウシ乳腺上皮細胞）；SV40により形質転換されたサル腎臓CV1系（COS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎細胞系（293細胞または懸濁培養下での生育用にサブクローニングされた293細胞；例えば、Grahamら、J. Gen Virol.、36：59［1977］参照）；ベビーハムスター腎細胞（BHK、ATCC CCL 10）；マウスセルトリ細胞（TM4、Mather、Biol. Reprod. 23：243〜251［1980］）；サル腎細胞（CV1 ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76、ATCC CRL-1587）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2、HB 8065）；マウス乳腺腫瘍（MMT 060562、ATCC CCL51）；TRI細胞（Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci.、383：44〜68［1982］）；MRC 5細胞；FS4細胞；ラット線維芽細胞（208F細胞）；MDBK細胞（ウシ腎細胞）；およびヒト肝細胞癌株（Hep G2）が含まれるが、これらに限定されない。
哺乳類細胞系に加えて、本発明は、組み込みベクターによる低いまたは高い感染多重度での植物プロトプラストのトランスフェクションも考えている。例えば、本発明は、少なくとも1つの組み込みベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、最も好ましくは偽型のレトロウイルスベクターが組み込まれた植物細胞または全植物体を考えている。プロトプラストからの再生による産生が可能な植物はすべて、本発明によるプロセスを用いてトランスフェクトすることができる（例えば、ナス属、タバコ属、アブラナ属、トウジシャ属、エンドウ属、インゲンマメ属、ダイズ属、ヒマワリ属、ネギ属、カラスムギ属、オオムギ属、イネ属、エノコログサ属、ライムギ属、モロコシ属、コムギ属、トウモロコシ属、バショウ属、ヤシ属、マルメロ属、ナシ属、リンゴ属、ナツメヤシ属、アブラヤシ属、クサイチゴ属、ヘビイチゴ属、サクラ属、ラッカセイ属、キビ属、サトウキビ属、コーヒー属、ツバキ属、アナナス属、ブドウ属またはカンキツ属の栽培植物）。一般に、プロトプラストは従来の方法に従って作製する（例えば、米国特許第4,743,548号；第4,677,066号、第5,149,645号；および第5,508,184号；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。植物組織を適切な浸透ポテンシャル（例えば、3〜8重量％の糖ポリオール）および1つまたは複数の多糖ヒドロラーゼ（例えば、ペクチナーゼ、セルラーゼなど）を有する適切な培地中に分散させ、プロトプラストが得られるのに十分な時間をかけて細胞壁を分解させてもよい。濾過後にプロトプラストを遠心処理によって分離し、続いて以降の処理または使用のために再懸濁してもよい。培養下に保ったプロトプラストの全植物体への再生は、当技術分野で知られた方法によって行われる（例えば、Evansら、「植物細胞培養ハンドブック（Handbook of Plant Cell Culture）」、1：124〜176、MacMillan Publishing Co.、New York［1983］；Binding、植物プロトプラスト（Plant Protoplasts）、p.21〜37、CRC Press、Boca Raton［1985］）ならびにPotrykusおよびShillito、「酵素学の方法（Methods in Enzymology）」、第118巻、「植物分子生物学（Plant Molecular Biology）」、A.およびH. Weissbach編、Academic Press、Orlando［1986］を参照）。
本発明は、両生類宿主細胞系および昆虫宿主細胞系の使用も考えている。適した昆虫宿主細胞系の例には、蚊細胞系（例えば、ATCC CRL-1660）が含まれるが、これらに限定されない。適した両生類宿主細胞系の例には、ヒキガエル細胞系（例えば、ATCC CCL-102）が含まれるが、これらに限定されない。
II．トランスフェクションのためのベクターおよび方法
本発明によれば、上記のものなどの宿主細胞に対して、組み込みベクターによる形質導入またはトランスフェクションを行う。組み込みベクターの例には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明におけるこれらのベクターの設計、作製および使用については以下に述べる。
A．レトロウイルスベクター
レトロウイルス（レトロウイルス科）は一般に、以下の3つの群に分けられる：スプマウイルス（例えば、ヒト泡沫状ウイルス）；レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒツジビスナウイルス）およびオンコウイルス（例えば、MLV、ラウス肉腫ウイルス）。
レトロウイルスは、動物細胞を感染させる、外被を有する（すなわち、宿主細胞由来の脂質二重層膜に囲まれた）一本鎖RNAウイルスである。レトロウイルスに細胞が感染すると、そのRNAゲノムは線状二本鎖DNA形態に変換される（すなわち、逆転写される）。次に、DNA形態のウイルスはプロウイルスとして宿主細胞ゲノムに組み込まれる。プロウイルスはさらにウイルスゲノムおよびウイルスmRNAを産生するためのテンプレートの役割を果たす。ゲノムRNAの2つのコピーを含む成熟ウイルス粒子が感染細胞の表面から出芽する。ウイルス粒子は、ゲノムRNA、逆転写酵素および他のpol遺伝子産物をウイルスキャプシド（ウイルスgag遺伝子産物を含む）の内部に含み、これがさらにウイルス外被糖タンパク質（膜関連タンパク質とも呼ばれる）を含む宿主細胞由来の脂質二重層膜によって囲まれている。
さまざまなレトロウイルスのゲノム構成が当技術分野では知られており、これにより、レトロウイルスベクターの作製を目的とするレトロウイルスゲノムの適合化が可能となった。関心対象の遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターの作製は一般に、2つの段階で行われる。
第1に、関心対象の遺伝子を、関心対象の遺伝子の効率的な発現のために必要な配列（プロモーターおよび/またはエンハンサー因子を含む。これはウイルスの長い末端反復配列（LTR）、または内部プロモーター/エンハンサーおよび適切なスプライシングシグナルによって提供してもよい）、ウイルスRNAの感染性ビリオンへの効率的なパッケージングに必要な配列（例えば、パッケージングシグナル（Psi）、tRNAプライマー結合部位（-PBS）、逆転写のために必要な3'調節配列（+PBS））およびウイルスLTRを含むレトロウイルスベクター中に挿入する。LTRは、ウイルスゲノムRNAの会合、逆転写酵素およびインテグラーゼの機能に必要な配列、ならびにウイルス粒子へのパッケージングを行おうとするゲノムRNAの発現の指令に関与する配列を含む。安全面の理由から、多くの組換えレトロウイルスベクターはウイルス複製に必須な遺伝子の機能的コピーを持たない（これらの必須遺伝子は除去または無効化されている）；このため、この結果得られるウイルスは複製能欠損性と呼ばれる。
第2に、組換えベクターを構築した後に、ベクターDNAをパッケージング細胞系に導入する。パッケージング細胞系は、望ましい宿主範囲を有するウイルス粒子へのウイルスゲノムRNAのパッケージングのためにトランス的に必要なウイルスタンパク質を提供する（すなわち、ウイルスにコードされたgag、polおよびenvタンパク質）。宿主範囲は一部には、ウイルス粒子の表面に発現される外被遺伝子産物の種類によって調節される。パッケージング細胞系が同種指向性、両種指向性または異種指向性の外被遺伝子産物を発現してもよい。または、パッケージング細胞にウイルス外被（env）タンパク質をコードする配列がなくてもよい。この場合には、パッケージング細胞系は膜関連タンパク質（例えば、envタンパク質）を含まない粒子中へのウイルスゲノムのパッケージングを行うと考えられる。ウイルスの細胞内への侵入を可能にすると考えられる膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を作製するためには、レトロウイルス配列を含むパッケージング細胞系に、膜関連タンパク質（例えば、水疱性口内炎ウイルス（VSV）のGタンパク質）をコードする配列をトランスフェクトすることが一般的である。トランスフェクトされたパッケージング細胞は、トランスフェクトされたパッケージング細胞系によって発現された膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を産生すると考えられる；別のウイルスの外被タンパク質によるキャプシド形成がなされたウイルスに由来するウイルスゲノムRNAを含むこのようなウイルス粒子を偽型のウイルス粒子という。
本発明のレトロウイルスベクターを、追加的な調節配列を含むようにさらに改変することができる。上記の通り、本発明のレトロウイルスベクターは機能的に結び付いた以下の因子を含む：a）5' LTR；b）パッケージングシグナル；c）3' LTR；ならびにd）5'および3' LTRの間に位置する、関心対象のタンパク質をコードする核酸。本発明のいくつかの態様において、内部プロモーターからの転写が望ましい場合には、関心対象の核酸を5' LTRに対して反対の向きに配置してもよい。適した内部プロモーターには、α-ラクトアルブミンプロモーター、CMVプロモーター（ヒトまたはサルのもの）およびチミジンキナーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の他の態様において、関心対象のタンパク質の分泌が望ましい場合には、関心対象のタンパク質と機能的に結び付いたシグナルペプチド配列を含めることにより、ベクターを改変する。組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長ホルモン、ラクトフェリン、α-カゼインおよびα-ラクトアルブミンに由来するものを含むが、これらに限定されない、いくつかの適したシグナルペプチドの配列が当技術分野で知られている。
本発明の他の態様では、RNA移行因子を、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の3'側または5'側に組み入れることによってベクターを改変する（例えば、米国特許第5,914,267号；第6,136,597号；および第5,686,120号；ならびに国際公開公報第99/14310号を参照。これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。RNA移行因子の使用により、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列にスプライスシグナルまたはイントロンを組み入れなくても、関心対象のタンパク質の高レベルの発現を得ることが可能になると考えられる。
さらに他の態様において、ベクターは、少なくとも1つのリボソーム内部進入部位（IRES）配列をさらに含む。口蹄疫ウイルス（FDV）、脳心筋炎ウイルスおよびポリオウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない、いくつかの適したIRESの配列が入手可能である。IRES配列を2つの転写単位（例えば、異なる関心対象のタンパク質、または抗体などの多サブユニットタンパク質の複数のサブユニットをコードする核酸）の間に介在させることにより、2つの転写単位が同一のプロモーターから転写される多シストロン性配列を形成することができる。
本発明のレトロウイルスベクターに、形質転換細胞の選択を容易にする選択マーカーをさらに含めてもよい。薬剤G418に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ（hyg）遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（gpt遺伝子とも呼ばれる）を含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られたさまざまな選択マーカーを本発明に用いうる。いくつかの態様において、選択マーカー遺伝子は、関心対象のタンパク質をもコードする多シストロン性配列の一部として提供される。
本発明のさらに他の態様において、レトロウイルスベクターは組換え系によって認識される組換え因子を含んでもよい（例えば、cre/loxPまたはflpリコンビナーゼ系を参照：例えば、Hoessら、Nucleic Acids Res.、14：2287-2300［1986］、O'Gormanら、Science 251：1351-55［1991］、van Deursenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：7376-80［1995］および米国特許第6,025,192号を参照。これらは参照として本明細書に組み入れられる）。宿主細胞のゲノム中へのベクターの組み込みの後に、組み込まれたベクター中に関心対象の核酸配列が挿入されるように、リコンビナーゼ酵素（例えば、Creリコンビナーゼ）、またはリコンビナーゼ酵素をコードする核酸配列、および組換え酵素によって認識される配列が隣接した関心対象のタンパク質をコードする1つもしくは複数の核酸配列を、宿主細胞に一時的にトランスフェクトすることができる（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクションによる）。
組換えレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターは、リン酸カルシウム-DNA共沈、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーションまたは核酸のマイクロインジェクションなどの他の技法に比べて、遺伝子を細胞内に導入するより効率的な手段となる。ウイルス導入の効率は一部には、核酸の移行が受容体を介するプロセスである（すなわち、ウイルスは標的細胞の表面にある特異的な受容体タンパク質と結合する）という事実によると考えられている。さらに、ひとたび細胞内に入った後も、ウイルスにより導入された核酸は制御の下で組み込まれるが、これは非ウイルス的に導入されたものとは対照的である；リン酸カルシウム-DNA共沈などの他の手段によって導入された核酸は再配列および分解を被る。
最もよく用いられる組換えレトロウイルスベクターは、両種指向性であるモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）である（例えば、MillerおよびBaltimore、Mol. Cell. Biol. 6：2895［1986］を参照）。MoMLV系にはいくつか利点がある：1）この特定のレトロウイルスは多くの異なる細胞種を感染させることができる、2）樹立されたパッケージング細胞系を組換えMoMLVウイルス粒子の産生に用いうる、および3）導入した遺伝子が宿主細胞の染色体に永続的に組み込まれる。確立されているMoMLVベクター系は、レトロウイルス配列の一部（例えば、ウイルスの長い末端反復配列または「LTR」、およびパッケージングシグナルまたは「psi」シグナル）を含むDNAベクター、およびパッケージング細胞系を含む。導入しようとする遺伝子をDNAベクター中に挿入する。DNAベクターに存在するウイルス配列は、ベクターRNAのウイルス粒子中への挿入またはパッケージング、および挿入された遺伝子の発現のために必要なシグナルを提供する。パッケージング細胞系は、粒子の集合に必要なタンパク質を提供する（Markowitzら、J. Virol. 62：1120［1988］）。
これらの利点にもかかわらず、MoMLVをベースとする既存のレトロウイルスベクターは、いくつかの本質的な問題によって制限されている：1）非分裂細胞を感染させない（Millerら、Mol. Cell. Biol. 10：4239［1990］）、ただし、おそらく卵母細胞は例外と思われる；2）産生される組換えウイルスの力価が低い（MillerおよびRosman、BioTechniques 7：980［1980］およびMiller、Nature 357：455［1990］）；および3）ある種の細胞種（例えば、ヒトリンパ球）に対する感染効率が低い（Adamsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：8981［1992］）。MoMLVをベースとするベクターの力価が低いことは、少なくとも一部には、ウイルスによってコードされる外被タンパク質の不安定性に起因するとされている。レトロウイルスのストックを物理的手段に（例えば、超遠心および限外濾過）によって濃縮すると、感染性ウイルスの重大な喪失を招く。
MoMLVをベースとするベクターの力価の低さおよびある種の細胞種に対する感染効率の低さは、VSVのGタンパク質を膜関連タンパク質として含む偽型のレトロウイルスベクターを用いることによって克服されてきた。特異的な表面タンパク質受容体と結合して細胞内に侵入するレトロウイルス外被タンパク質とは異なり、VSV Gタンパク質は原形質膜のリン脂質成分と相互作用する（Mastromarinoら、J. Gen. Virol. 68：2359［1977］）。VSVの細胞内への侵入は特異的なタンパク質受容体の存在に依存しないため、VSVの宿主範囲は極めて広範囲にわたる。VSV Gタンパク質を有する偽型のレトロウイルスベクターは、VSVに特徴的な変化した宿主範囲を有する（すなわち、それらは脊椎動物、無脊椎動物および昆虫細胞のほぼすべての種を感染させうる）。重要なこととして、VSV G-偽型のレトロウイルスベクターは、感染性を明らかに低下させずに超遠心による2000倍またはそれ以上に濃縮することができる（Burnsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：8033［1993］）。
本発明は、ウイルスGタンパク質をウイルス粒子内部の異種膜関連タンパク質として用いる場合に、VSV Gタンパク質の使用には限定されない（例えば、米国特許第5,512,421号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）。ピリウイルスおよびチャンディプラウイルスなどのVSV以外のベシクロウイルス属のウイルスのGタンパク質はVSV Gタンパク質と非常に相同性が高く、共有結合したパルミチン酸を含む（Brunら、Intervirol. 38：274［1995］およびMastersら、Virol. 171：285（1990］）。このため、ウイルス粒子の偽型化のために、VSV Gタンパク質の代わりにピリウイルスおよびチャンディプラウイルスのGタンパク質を用いることができる。さらに、狂犬病ウイルスおよびモコラウイルスなどのリサウイルス属に属するウイルスのVSV Gタンパク質にもVSV Gタンパク質との高度の保存性（アミノ酸配列ならびに機能面での保存）が認められる。例えば、モコラウイルスのGタンパク質はVSV Gタンパク質と同様の様式で作用することが示されており（すなわち、膜融合を媒介する）、このためウイルス粒子の偽型化のためにVSV Gタンパク質の代わりに用いうると考えられる（Mebatsionら、J. Virol. 69：1444［1995］）。実施例2に述べるように、ピリ、チャンディプラまたはモコラウイルスのGタンパク質を用いてウイルス粒子を偽型化しうるが、その際には例外として、適したプロモーター因子（例えば、CMV最初期プロモーター；pcDNA3.1ベクター（Invitrogen）などの、CMV IEプロモーターを含むさまざまな発現ベクターが入手可能である）の転写制御下にあるピリ、チャンディプラまたはモコラウイルスのGタンパク質をコードする配列を含むプラスミドを、pHCMV-Gの代わりに用いる。ラブドウイルス科の他のメンバーに由来する他のGタンパク質をコードする配列を用いてもよい；種々のラブドウイルスGタンパク質をコードする配列がゲンバンク（GenBank）データベースから入手可能である。
レトロウイルスの大半は、レシピエント細胞が感染時に細胞周期を進行させている（すなわち、分裂している）場合にのみ、二本鎖線状ウイルス（プロウイルス）をレシピエント細胞のゲノムに導入または組み込むことができる。分裂細胞のみを感染させる、またはそれらをより効率的に感染させることが示されているレトロウイルスには、MLV、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（HIV；HIVは分裂細胞をより効率的に感染させるが、HIVは非分裂細胞も感染させうる）。
MLVウイルスDNAの組み込みは宿主細胞の有糸分裂の進行に依存することが示されており、この有糸分裂に対する依存性は、ウイルス組み込み複合体が核内に侵入するためには核膜の破壊が必要なことを反映している（Roeら、EMBO J. 12：2099［1993］）。しかし、分裂中期で停止した細胞では組み込みは起こらないため、核膜の破壊だけではウイルス組み込みが起こるには不十分であると思われる；ゲノムDNAの凝縮状態などの別の必要条件があると考えられる（Roeら、前記）。
B．レンチウイルスベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたレンチウイルスベクターの使用も考えている。レンチウイルス（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス）はレトロウイルスの亜科であり、非分裂細胞への組み込みを行うことができる。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスDNAは、すべてのレトロウイルスに認められる3つの遺伝子、すなわちgag、polおよびenvを含み、これらは2つのLTR配列によって隣接している。gag遺伝子は内部構造タンパク質（例えば、マトリックス、キャプシドおよびヌクレオキャプシドタンパク質）をコードする；pol遺伝子は逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼタンパク質をコードする；ならびにpol遺伝子はウイルス外被糖タンパク質をコードする。5'および3' LTRはウイルスRNAの転写およびポリアデニル化を制御する。レンチウイルスゲノム中のこのほかの遺伝子には、vif、vpr、tat、rev、vpu、nefおよびvpx遺伝子が含まれる。
種々のレンチウイルスベクターおよびパッケージング細胞系が当技術分野で知られており、本発明に用いることができる（例えば、米国特許第5,994,136号および第6,013,516号を参照。これらはいずれも参照として本明細書に組み入れられる）。さらに、VSV Gタンパク質も、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）をベースとするレトロウイルスベクターの偽型化のために用いられている（Naldiniら、Science 272：263［1996］）。このため、VSV Gタンパク質はさまざまな偽型のレトロウイルスベクターの作製に用いることができ、MoMLVをベースとするベクターには限定されない。レンチウイルスベクターを、種々の調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、RNA移行因子およびIRESのもの）を含むように上記の通りに改変してもよい。レンチウイルスベクターを作製した後には、それらを、レトロウイルスベクターに関して上に述べたように宿主細胞のトランスフェクションに用いてもよい。
C．アデノ随伴ウイルスベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの使用も考えている。AAVは、デペンドウイルス属に属するヒトDNAパルボウイルスである。AAVゲノムは、約4680塩基を含む線状の一本鎖DNA分子から構成される。本ゲノムは、DNA複製起点およびウイルスのパッケージングシグナルとしてシス性に作用する逆方向末端反復配列（ITR）を両端に含む。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれAAV repおよびcap領域として知られる2つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。AAV rep領域からは、見かけの分子量に従って命名されたRep 78、Rep 68、Rep 52およびRep 40という、少なくとも4つのウイルスタンパク質からなるファミリーが合成されている。AAV cap領域は、VP1、VP2およびVP3という少なくとも3つのタンパク質をコードする（AAVゲノムの詳細な説明については、例えば、Muzyczka、Current Topics Microbiol. Immunol. 158：97〜129[1992］；Kotin、Human Gene Therapy 5：793〜801［1994］を参照のこと）。
AAVがウイルス産生性感染を引き起こすためには、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスなどの近縁関係にないヘルパーウイルスとの重複感染を必要とする。このような重複感染がなければ、AAVはゲノムを宿主細胞染色体に挿入することによって潜伏状態を引き起こす。その後のヘルパーウイルス感染により、組み込まれたコピーが復旧し、複製して感染性ウイルスの子孫を産生できるようになる。非偽型のレトロウイルスとは異なり、AAVは宿主範囲が広く、任意の種に由来する細胞において、その種で同じく増殖すると思われるヘルパーウイルスとの重複感染が存在する限り、複製可能である。したがって、例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスに重複感染したイヌ細胞で複製すると考えられる。さらに、レトロウイルスとは異なり、AAVにはヒトまたは動物疾患とのつながりがなく、組み込み後に宿主細胞の生物特性を変化させないと思われるほか、非分裂細胞にも組み込みが可能である。また、AAVが宿主細胞ゲノムへの部位特異的組み込みを行えることも最近明らかになっている。
上記の特性を考慮して、数多くの組換えAAVベクターが遺伝子送達を目的として開発されている（例えば、米国特許第5,173,414号；第5,139,941号；国際公開公報第92/01070号および国際公開公報第93/03769号。これらはどちらも参照として本明細書に組み入れられる；Lebkowskiら、Molec. Cell. Biol. 8：3988〜3996［1988］；Carter, B.J.、Current Opinion in Biotechnology 3：533〜539［1992］；Muzyczka、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158：97〜129［1992］；Kotin, R.M.（1994）Human Gene Therapy 5：793〜801；ShellingおよびSmith、Gene Therapy 1：165〜169［1994］；ならびにZhouら、J. Exp. Med. 179：1867〜1875［1994］を参照）。
組換えAAVビリオンは、AAVヘルパープラスミドおよびAAVベクターの両方をトランスフェクトした適した宿主細胞において産生が可能である。AAVヘルパープラスミドは一般にAAV repおよびcapコード領域を含むが、AAV ITRは含まない。したがって、ヘルパープラスミドは複製を行えず、自らのパッケージングも行えない。AAVベクターは一般に、選択した関心対象の遺伝子が、ウイルス複製およびパッケージング機能を提供するAAV ITRと結合したものを含む。ヘルパープラスミドおよび選択した遺伝子を有するAAVベクターの両方を、一時的トランスフェクションによって適した宿主細胞に導入する。続いて、トランスフェクト細胞を、ヘルパープラスミドに存在してAAV repおよびcap領域の転写および翻訳を指令するAAVプロモーターをトランス活性化する、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。選択した遺伝子を有する組換えAAVビリオンが形成され、これを調製物から精製することができる。AAVベクターをひとたび作製すれば、高コピー数宿主細胞を作製する目的で、それらを宿主細胞に対して望ましい感染多重度でトランフェクトすることができる（例えば、米国特許第5,843,742号を参照。これは参照として本明細書に組み入れられる）。当業者には理解されるであろうが、AAVベクターを、種々の調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、RNA移行因子およびIRESのものなど）を含むように上記の通りに改変してもよい。
D．トランスポゾンベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたトランスポゾンベクターの使用も考えている。トランスポゾンは、ゲノム中の1つの位置から別の位置への移動または転位が可能な移動性遺伝因子である。ゲノム内部での転位は、トランスポゾンによってコードされる酵素トランスポザーゼによって制御される。トランスポゾンの例は当技術分野で数多く知られており、これには、Tn5（例えば、de la Cruzら、J. Bact. 175：6932〜38［1993］を参照）、Tn7（例えば、Craig、Curr. Topics Microbiol. Immunol. 204：27〜48［1996］を参照）およびTn10（例えば、MorisatoおよびKleckner、Cell 51：101〜111［1987］を参照）が含まれるが、これらに限定されない。トランスポゾンがゲノム中に組み込みを行う能力は、トランスポゾンベクターの作製に利用されている（例えば、米国特許第5,719,055号；第5,968,785号；第5,958,775号；および第6,027,722号を参照；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。トランスポゾンは感染性でないため、トランスポゾンベクターは当技術分野で知られた方法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクション）によって宿主細胞に導入される。このため、トランスポゾンベクターと宿主細胞との比を調整することにより、本発明の高コピー数宿主細胞を作製するのに望ましい感染多重度が得られる。
本発明における使用に適したトランスポゾンベクターは一般に、関心対象のタンパク質をコードする核酸が、2つのトランスポゾン挿入配列の間に介在するものを含む。いくつかのベクターは、トランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列も含む。これらのベクターでは、挿入配列の1つを、組換えの際に宿主細胞のゲノム中に組み入れられないように、トランスポザーゼ酵素と関心対象のタンパク質をコードする核酸との間に配置する。または、トランスポザーゼ酵素を適した方法によって提供してもよい（例えば、リポフェクションまたはマイクロインジェクション）。当業者には理解されるであろうが、トランスポゾンベクターを、種々の調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、RNA移行因子およびIRESのもの）を含むように、上記の通りに改変してもよい。
E．高い感染多重度でのトランスフェクション
関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクター（例えば、レトロウイルスベクター）をひとたび作製すれば、それらを宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入に用いることができる（その例は上のセクションIに述べた）。好ましくは、宿主細胞に対して、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つまたはそれ以上のレトロウイルスベクターの組み込みが生じるのに十分な感染多重度で、組み込みベクターによるトランスフェクションまたは形質導入を行う。いくつかの態様では、感染した宿主細胞のゲノムが組み込まれたベクターの2〜100個のコピー、好ましくは組み込まれたベクターの5〜50個のコピーを含むように、10〜1,000,000の感染多重度を用いうる。他の態様では、10〜10,000の感染多重度を用いる。非偽型のレトロウイルスベクターを感染用に用いる場合には、宿主細胞を、望ましい力価（すなわち、コロニー形成単位、CFU）の感染性ベクターを含むレトロウイルス産生細胞から得た培地とともにインキュベートする。偽型のレトロウイルスベクターを用いる場合には、ベクターを超遠心によって適切な力価に濃縮した後に宿主細胞培養物に添加する。または、濃縮したベクターを細胞種に適した培地中に希釈してもよい。さらに、宿主細胞による複数の関心対象のタンパク質の発現が望ましい場合には、宿主細胞に対して、異なる関心対象のタンパク質をコードする核酸をそれぞれが含む複数のベクターをトランスフェクトすることができる。
いずれの場合も、宿主細胞は、感染およびそれに続くベクターの組み込みが起こるのに十分な期間にわたり、感染性レトロウイルスベクターを含む培地に曝露される。一般に、細胞を重ねるために用いる培地の量は、細胞1個当たりの組み込みイベントが最大量となるように、できるだけわずかな容積に保つ必要がある。一般的な指針としては、1ミリリットル当たりのコロニー形成単位（cfu）の数は、望ましい組み込みイベントの数に応じて、約105〜107cfu/mlである必要がある。
本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、作用機序の理解は本発明の実施のために必要ではない。しかし、ベクターの拡散速度は極めて低いことが知られている（例えば、米国特許第5,866,400号、これは拡散速度の考察に関して参照として本明細書に組み入れられる）。このため、実際の組み込み率は感染多重度よりも低くなる（場合によってははるかに低くなる）と考えられる。米国特許第5,866,400号の式を適用すると、106cfu/mlの力価の場合の平均ベクター-ベクター間隔は1ミクロンである。MMLVベクターが100ミクロン動くのに要する拡散時間は約20分である。したがって、ベクターは1時間に約300ミクロン移動しうる。1000個の細胞をT25フラスコ内にプレーティングした場合、細胞間隔は平均2.5mmとなる。これらの値を用いると、1時間以内に任意の細胞と接触すると予想されるウイルス粒子は56個に過ぎない。以下の表は、特定のベクター力価に対して、T25フラスコ内の所定数の細胞に関して予想される接触率を示している。しかし、以下の実施例の項に示すように、実際に得られた組み込みの数はこれらの式によって予想されるよりもはるかに少ない。
Figure 2015043785
したがって、実際の組み込み率は、感染多重度だけでなく、接触時間（すなわち、宿主細胞を感染性ベクターに曝露させる時間）、トランスフェクトしようとする宿主細胞の集密度または形状、およびベクターが含まれる培地の容積にも依存することが考えられる。これらの条件は、本明細書の教示のように、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞系が作製されるように変更しうると考えられる。実施例8および9に示すように、MOIは、細胞数を一定に保ってCFUを変化させることにより（実施例9）、またはCFUを一定に保って細胞数を変化させることにより（実施例8）、変更可能である。
いくつかの態様では、トランスフェクションまたは形質導入の後に細胞を増殖させ、続いてトリプシン処理を行って再プレーティングを行う。続いて、クローン的に選択された細胞系を得るために個々のコロニーを選択する。またさらなる態様では、望ましい数の組み込みイベントが起こったことを確認するために、クローン的に選択した細胞系をサザンブロット法またはインベーダー（INVADER）アッセイによってスクリーニングする。また、クローン選択により、より優れたタンパク質産生細胞系の同定も可能になると考えられる。他の態様では、トランスフェクション後に細胞のクローン選択を行わない。
いくつかの態様では、宿主細胞に対して、異なる関心対象のタンパク質をコードする複数のベクターをトランスフェクトする。異なる関心対象のタンパク質をコードするベクターを用いて細胞に同時にトランスフェクトすることもでき（例えば、宿主細胞を、異なる関心対象のタンパク質をコードする複数のベクターを含む溶液に曝露させる）、またはトランスフェクションが連続的であってもよい（例えば、宿主細胞に第1の関心対象のタンパク質をコードするベクターをまずトランスフェクトし、一定時間をおいた後に、宿主細胞に第2の関心対象のタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトする）。いくつかの好ましい態様では、宿主細胞を第1の関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクターに感染させて、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む高発現性細胞系を選択した上で（例えば、クローン的に選択する）、選択した細胞系に、第2の関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクターをトランスフェクトする。複数の関心対象のタンパク質を導入するためにはこの工程を反復するとよい。いくつかの態様では、関心対象のタンパク質の発現を増加または減少させるために、感染多重度を操作（例えば、高めるまたは低くする）してもよい。同様に、関心対象のタンパク質の発現を変化させるために異なるプロモーターを用いてもよい。これらのトランスフェクション方法は、外因性代謝経路全体を含む宿主細胞系を構築するため、またはタンパク質のプロセシングの能力が高まった宿主細胞（例えば、翻訳後修飾に必要な酵素を宿主細胞に付与することができる）を得るために用いうると考えられる。
またさらなる態様では、細胞系に対して、同一の遺伝子をコードする複数のベクターを連続的にトランスフェクトする。いくつかの好ましい態様では、宿主細胞に（例えば、約10〜100,000、好ましくは100〜10,000のMOIで）関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクターをトランスフェクトし、組み込みベクターの単一もしくは複数の組み込まれたコピーを含む細胞系、または望ましいタンパク質を高レベルで発現する細胞系を選択した上で（例えば、クローン的に選択する）、選択した細胞系にベクターを再びトランスフェクトする（例えば、約10〜100,000、好ましくは100〜10,000のMOIで）。いくつかの態様では、ベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピーを含む細胞系を同定および選択する。この工程を、望ましいタンパク質発現レベルが得られるまで複数回繰り返してもよく、複数の関心対象のタンパク質をコードするベクターを導入するために繰り返してもよい。予想外のことに、同一の遺伝子による連続トランスフェクションにより、その結果得られた細胞からは、単に相加的ではないタンパク質産生の増加がもたらされる。
III．トランスフェクトされた宿主細胞の用途
高い感染多重度でトランスフェクトされた宿主細胞は、さまざまな目的に用いることができる。第1に、本宿主細胞は、医薬品、産業、診断および他の目的のためのタンパク質の産生に有用である。第2に、特定の1つまたは複数のタンパク質を発現する宿主細胞はスクリーニングアッセイに有用である（例えば、高速スクリーニング）。第3に、本宿主細胞は、タンパク質の複数の変種を産生し、続いてタンパク質変種の活性を分析するのにも有用である。これらの用途のそれぞれについて、以下により詳細に説明する。
A．タンパク質の産生
本発明の宿主細胞は、医薬品、産業、診断および他の用途を目的とするタンパク質の産生に有用と考えられる。本発明は何らかの特定のタンパク質の産生には限定されない。実際には、以下のものを含むが、これらに限定されない、非常にさまざまなタンパク質の産生を考えている：エリスロポエチン、α-インターフェロン、α-1プロテイナーゼインヒビター、アンジオゲニン、アンチトロンビンIII、β酸デカルボキシラーゼ、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、ヒト血清アルブミン、β-インターフェロン、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、第VIII因子、第IX因子、第X因子、インスリン、ラクトフェリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ミエリン塩基性タンパク質、インスリン、プロインスリン、プロラクチン、B型肝炎抗原、免疫グロブリン、モノクローナル抗体CTLA4 Ig、Tag 72モノクローナル抗体、Tag 72一本鎖抗原結合タンパク質、プロテインC、サイトカインおよびその受容体、例えば腫瘍壊死因子αおよびβ、それらの受容体ならびにそれらの誘導体など；レニン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-1-アンチトリプシン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；フォンビルブラント因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ；ボンベシン；トロンビン；造血系増殖因子；エンケファリナーゼ；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（MIP-1-α）；血清アルブミン、例えばミューラー管抑制物質など；リラキシンA鎖；リラキシンB鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ；DNA分解酵素；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（VBGF）；ホルモンまたは増殖因子の受容体；インテグリン；プロテインAまたはD；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン-3、-4、-5もしくは-6（NT-3；NT-4；NT-5またはNT-6）、またはNGF-βなどの神経成長因子；血小板由来増殖因子（PDGF）；線維芽細胞増殖因子、例えばaFGFおよびbFGFなど；上皮増殖因子（EGF）；トランスフォーミング増殖因子（TGF）、例えばTGF-αおよびTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4またはTGF-β5を含むTGF-β；インスリン様増殖因子-Iおよび-II（IGF-IおよびIGF-II）；デス(1-3)-IGF-I（脳IGF-I）；インスリン様増殖因子結合タンパク質；CDタンパク質、例えばCD-3、CD-4、CD-8およびCD-19など；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（BMP）；インターフェロン、例えばインターフェロン-α-βおよび-γなど；コロニー刺激因子（CSF）、例えばM-CSF、GM-CSFおよびG-CSFなど；インターロイキン（IL）、例えばIL-1〜IL-10など；スーパーオキシドジスムターゼ；T細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばAIDS外被の一部など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレッシン；調節タンパク質；抗体；キメラタンパク質、例えばイムノアドヘシンなど、ならびに以上に挙げた任意のものの断片。これらのタンパク質の核酸配列およびタンパク質配列は公開データベース（例えば、GenBank）から入手可能である。
いくつかの態様では、本発明のベクターを、複数の外因性タンパク質を発現させるために用いる。例えば、宿主細胞が、第1の関心対象のタンパク質をコードする第1のベクターの少なくとも1つの組み込まれたコピー、および第2の関心対象のタンパク質をコードする第2の組み込みベクターの少なくとも1つの組み込まれたコピーを含むように、宿主細胞に複数の異なる関心対象のタンパク質をコードするベクターによるトランスフェクション（例えば、第1の関心対象のタンパク質をコードする1つのベクターおよび第2の関心対象のタンパク質をコードする第2のベクターによる感染多重度1000での共トランスフェクションもしくは感染、または連続的トランスフェクションもしくは感染）を行ってもよい。他の態様では、多シストロン性配列（例えば、二シストロン性または三シストロン性配列）として複数の異なる関心対象のタンパク質をコードする核酸を配置することにより、複数のタンパク質を発現させる。この配置は、異なる関心対象のタンパク質の発現が約1：1のモル比であることが望ましい場合に特に有用である（例えば、免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖の発現）。
またさらなる態様では、宿主細胞においてリボザイムを発現させる。リボザイムは、種々の表現型を備えた宿主細胞を得ることを目的として、特定の遺伝子の発現を下方制御するために、またはTET、エクジソン、グルココルチコイドエンハンサーなどの遺伝子スイッチとともに、用いることができると考えられる。
トランスフェクトされた宿主細胞は当技術分野で知られた方法に従って培養する。哺乳類細胞に適した培養条件は当技術分野で周知である（例えば、J. Immunol. Methods（1983）56：221〜234、「動物細胞培養：実践的アプローチ（Animal Cell Culture：A Practical Approach）」、第2版、Rickwood, D.およびHames, B. D.編、Oxford University Press、New York［1992］を参照）。
本発明の宿主細胞培養物は、培養する特定の細胞に適した培地中で調製する。栄養液の例には、ハムF10培地（Sigma、St. Louis、MO）、最小必須培地（MEM、Sigma）、RPMI-1640（Sigma）およびダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、Sigma）などの市販の培地がある。適した培地は、米国特許第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第5,122,469号および第4,560,655号；ならびに国際公開公報第90/03430号および国際公開公報第87/00195号にも記載されている；これらは参照として本明細書に組み入れられる。これらのいずれかの培地に対して、必要に応じて、血清、ホルモンおよび/または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、緩衝液（HEPESなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシンなど）、微量元素（最終濃度がμMの範囲で通常存在する無機化合物と定義される）、脂質（リノール酸または他の脂肪酸など）およびそれらの適した担体、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要な補充成分を当業者に知られた適切な濃度で含めてもよい。哺乳類細胞培養の場合、培地の重量オスモル濃度は一般に約290〜330mOsmである。
本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞用のさまざまな培養システム（例えば、ペトリ皿、96穴プレート、回転瓶およびバイオリアクター）の使用も考えている。例えば、宿主細胞を灌流システム中で培養することができる。灌流培養とは、高い細胞密度で維持している培養物に培地の連続流を与えることを指す。細胞は浮遊状態とし、生育のための固体支持体は必要でない。一般に、新たな栄養素を連続的に供給し、同時に有害代謝産物の除去、さらに理想的には死細胞の選択的除去を行う必要がある。濾過、捕捉（entrapment）およびマイクロカプセル化の方法はいずれも培養環境を十分な速度で回復するのに適している。
もう1つの例として、いくつかの態様では、流加培養法を用いうる。好ましい流加培養法では、哺乳類宿主、細胞および培地を最初に培養容器に供給し、追加用の培養栄養成分を培養中の培養物に連続的または不連続的に加え、培養終了までそのままおくか、または細胞および/もしくは細胞の定期的な収穫を行う。流加培養には、例えば、培養物全体（細胞および培地を含む）を生育容器から取り出し、新たな培地と交換する半連続的流加培養が含まれうる。流加培養は、培養プロセスの開始時に細胞培養のためのすべての成分（細胞およびすべての培養栄養成分を含む）を培養容器に供給するという点で、単純なバッチ培養とは区別される。流加培養はさらに、プロセスの最中に上清を培養容器から取り出さない限りにおいては、灌流培養とも区別しうる（灌流培養では、細胞を培養下に拘束し（例えば、濾過、カプセル封入、微粒子担体への付着など）、培地を連続的または間欠的に導入して、培養容器から取り出す）。いくつかの特に好ましい態様において、バッチ培養は回転瓶の中で行う。
さらに、培養物の細胞を、個々の宿主細胞および個々の産生計画に適した任意の方式または定型的手順に従って増殖させてもよい。したがって、本発明は一段階ならびに多段階の培養手順を考えている。一段階培養では、宿主細胞を培養環境に接種し、細胞培養物の単一の産生期の間に本発明のプロセスを用いる。または、他段階培養も考えている。多段階培養では、細胞を複数の工程または期で培養する。例えば、細胞をおそらくは貯蔵物から取り出し、生育および高い生存性を促すのに適した培地中に接種するという第1の工程または生育期の培養で細胞を生育させてもよい。宿主細胞培養物に対する新たな培地の添加により、細胞を適切な期間にわたって生育期に維持してもよい。
流加培養または連続細胞培養の条件は、細胞培養物の生育期にある哺乳類細胞の生育が増強されるように考慮する。生育期では、生育のために最適化された条件および期間の下で細胞を生育させる。温度、pH、溶存酸素（dO2）などの培養条件は個々の宿主に用いられるものであり、当業者には明らかである。一般に、pHは酸（例えば、CO2）または塩基（例えば、Na2CO3またはNaOH）を用いて約6.5〜7.5のレベルに調整する。CHO細胞などの哺乳類細胞の培養に適した温度の範囲は約30℃〜38℃であり、適したdO2は空気中飽和量の5〜90％である。
ポリペプチド産生期に続いて、関心対象のポリペプチドを、当技術分野で十分に確立された技法を用いて培地から回収する。関心対象のタンパク質は分泌型ポリペプチドとして培地から回収することが好ましい（例えば、関心対象のタンパク質の分泌はシグナルペプチド配列によって導かれる）が、宿主細胞の可溶化物から回収してもよい。第1の段階として、粒状細胞片を除去するために培地または可溶化物を遠心処理にかける。続いて、ポリペプチドを混入性の可溶性タンパク質およびポリペプチドから任意の適した方法を用いて精製するが、適した精製手順の例は以下の通りである：免疫親和性またはイオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ、またはDEAEなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；ゲル濾過、例えばSephadex G-75を用いるもの；およびIgGなどの混入物を除去するためのプロテインAセファロース（Sepharose）カラム。フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）などのプロテアーゼインヒビターも精製時のタンパク質分解を抑制するには有用と思われる。さらに、関心対象のタンパク質を、関心対象のタンパク質の精製を可能にするマーカー配列とインフレーム形式で融合させることもできる。マーカー配列の非制限的な例には、ベクター、好ましくはpQE-9ベクターによって供給しうるヘキサヒスチジンタグ、およびヘマグルチニン（HA）タグが含まれる。HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する（例えば、Wilsonら、Cell、37：767［1984］参照）。当業者は、関心対象のポリペプチドに適した精製法に、組換え細胞培養物における発現時のポリペプチドの特性の変化に対応するために修正を要する場合があることを理解している。
本発明の宿主細胞は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）および他の膜貫通タンパク質を発現させるためにも有用である。これらのタンパク質を発現させると、それらは膜の内部に本来のコンフォメーションで正しく挿入されると考えている。このため、当技術分野で知られた方法により、GPCRおよび他の膜貫通タンパク質を膜画分の部分として精製しうる、または膜から精製しうると思われる。
さらに、本発明のベクターは、アッセイが存在しない、またはアッセイが困難な、関心対象のタンパク質を共発現させる目的にも有用である。このシステムでは、関心対象のタンパク質およびシグナルタンパク質を多シストロン性配列として配置する。IRES配列がシグナルタンパク質と関心対象のタンパク質（例えば、GPCR）を隔て、シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質をコードする遺伝子が単一の転写単位として発現されることが好ましい。本発明は何らかの特定のシグナルタンパク質には限定されない。実際いは、容易なアッセイが存在するさまざまなシグナルタンパク質の使用を考えている。これらのシグナルタンパク質には、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよび抗体重鎖または軽鎖が含まれるが、これらに限定されない。シグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を多シストロン性配列から発現させる場合には、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されると考えられる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、関心対象のタンパク質の発現を間接的に検出するための方法であって、IRESによって機能的に結合したシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質を含む多シストロン性配列をコードするベクターによるトランスフェクションを行った宿主細胞を提供すること、ならびにシグナルタンパク質および関心対象のタンパク質が産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含み、シグナルタンパク質の存在によって関心対象のタンパク質の存在が示されるような方法を提供する。
B．化合物の活性に関するスクリーニング
本発明は、活性に関する化合物のスクリーニングのため、特にコンビナトリアルライブラリー（例えば、104種を上回る化合物を含むライブラリー）からの化合物の高速スクリーニングのための、高コピー数細胞系の使用を考えている。本発明の高コピー数細胞系はさまざまなスクリーニング法に用いることができる。いくつかの態様において、本細胞は、細胞表面受容体の活性化後のシグナル伝達を観測するための二次メッセンジャーアッセイに用いうる。他の態様において、本細胞は、細胞反応を転写/翻訳レベルで観測するレポーター遺伝子アッセイに用いることができる。またさらなる態様では、本細胞を、外部刺激に対する細胞の全体的増殖/増殖反応のないことを観測するための細胞増殖アッセイに用いうる。
二次メッセンジャーアッセイでは、宿主細胞に対して、上記の通りに、細胞表面受容体、イオンチャネル、細胞質受容体、またはシグナル伝達に関与する他のタンパク質（例えば、Gタンパク質、プロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼ）をコードするベクターをトランスフェクトすることが好ましい（例えば、米国特許第5,670,113号；第5,807,689号；第5,876,946号；および第6,027,875号を参照；これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。続いて、宿主細胞を1つまたは複数の化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリーからのもの）で処理し、反応の有無についてアッセイする。コンビナトリアルライブラリー中の化合物の少なくとも一部は、ベクターによってコードされる1つまたは複数のタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、活性化物質または阻害物質として作用しうると考えられる。また、コンビナトリアルライブラリー中の化合物の少なくとも一部は、シグナル伝達経路内でベクターによってコードされる蛋白質の上流または下流で作用するタンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、活性化物質または阻害物質として作用しうると考えられる。
非制限的な例として、膜貫通型受容体と結合するアゴニストは、特徴が詳細に解明されているいくつかのプロモーター/エンハンサー因子（例えば、AP1、cAMP応答配列（CRE）、血清応答配列（SRE）および活性化T細胞核因子（NF-AT））の調節と機能的に関係することが知られている。GαS共役受容体が活性化されると、アデニリルシクラーゼが刺激され、細胞内cAMP濃度の上昇、プロテインキナーゼAの刺激、CRE結合タンパク質（CREB）のリン酸化、およびCRE配列を有するプロモーターの誘導が生じる。Gαi共役受容体は、同じシグナル伝達の成分を阻害することによってCRE活性を抑制する。Gαqおよび一部のβγ対は、ホスホリパーゼC（PLC）、ならびにイノシトール三リン酸（IP3）およびジアシルグリセロール（DAG）の生成を刺激する。一過性の細胞内カルシウム流入は、カルシニューリンおよびNA-FT、さらにはカルモジュリン（CaM）依存性キナーゼおよびCREBの誘導を促す。DAG濃度の上昇はプロテインキナーゼC（PKC）およびエンドソーム/リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼ（aSMアーゼ）を刺激する；aSMアーゼ経路が優位になると、NTκB阻害因子IκBの分解ならびにNFκB活性化の両方を誘導する。代替的な経路では、増殖因子受容体などの受容体が活性化され、Sosを原形質膜に動員してRasの刺激を引き起こし、次にこれがセリン/トレオニンキナーゼRafを原形質膜に動員する。Rafは活性化されるとMEKキナーゼをリン酸化し、次にこれがMAPKおよび転写因子ELKのリン酸化および活性化を行う。ELKはSRE配列を有するプロモーターからの転写を駆動して転写因子FosおよびJunの合成をもたらし、これによってAP1部位を活性化しうる転写因子複合体を形成させる。ここに述べた経路を形成するタンパク質、さらには他の受容体、キナーゼ、ホスファターゼおよび核結合タンパク質はコンビナトリアルライブラリー中の化合物の標的であり、本発明の宿主細胞において発現させる候補でもあると考えられる。
いくつかの態様では、二次メッセンジャーアッセイにより、膜受容体およびイオンチャネル（例えば、リガンド依存性イオンチャネル；Denyerら、Drug Discov. Today 3：323〜32［1998］；およびGonzalesら、Drug. Discov. Today 4：431〜39［1999］を参照）の刺激に起因する細胞内変化（例えば、Ca2＋濃度、膜電位、pH、IP3、cAMP、アラキドン酸遊離）に反応する、レポーター分子からの蛍光シグナルを測定する。レポーター分子の例には、FRET（蛍光共鳴エネルギー転移）系（例えば、Cuo-脂質およびオキソノール、EDAN/DABCYL）、カルシウム感受性指示薬（例えば、Fluo-3、FURA 2、INDO 1およびFLUO3/AM、BAPTA AM）、塩素イオン感受性指示薬（例えば、SPQ、SPA）、カリウム感受性指示薬（例えば、PBFI）、ナトリウム感受性指示薬（例えば、SBFI）およびpH感受性指示薬（例えば、BCECF）が含まれるが、これらに限定されない。
一般には、宿主細胞に対して化合物への曝露の前に指示薬を添加する。化合物による処理に対する宿主細胞の反応は、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡（例えば、FCSシステム）、フローサイトメトリー、ミクロ流動装置、FLIPRシステム（例えば、SchroederおよびNeagle、J. Biomol. Screening 1：75〜80［1996］を参照）およびプレート読取りシステムを含むが、これらに限定されない、当技術分野で知られた方法によって検出することができる。いくつかの好ましい態様では、活性がわかっていない化合物によって引き起こされた反応（例えば、蛍光強度の上昇）を既知のアゴニストによって生じた反応と比較し、既知のアゴニストによる最大反応に対する百分率として表現する。既知のアゴニストによって引き起こされる最大反応は100％の反応と定義される。同様に、既知のアンタゴニストまたは被験アンタゴニストを含む試料に対するアゴニストの添加後に記録された最大反応は、100％反応よりも検出可能な程度に小さい。
本細胞はレポーター遺伝子アッセイにも有用である。レポーター遺伝子アッセイには、レポーター遺伝子のコード配列が結合した、標的遺伝子（すなわち、疾患標的の生物的な発現および機能を制御する遺伝子）の転写制御因子を含む核酸をコードするベクターをトランスフェクトした宿主細胞の使用が含まれる。このため、標的遺伝子の活性化によってレポーター遺伝子産物の活性化が生じる。本発明において有用なレポーター遺伝子の例には、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ホタルおよび細菌のルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼならびに緑色蛍光性タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。これらのタンパク質の産生は、緑色蛍光性タンパク質を除き、特異的基質（例えば、X-galおよびルシフェリン）の化学発光性、比色定量性または生物発光性産物を用いることによって検出される。活性が知られた化合物と活性がわかっていない化合物との比較を上記の通りに行ってもよい。
C．変種タンパク質の活性の比較
本発明は、変種の活性を比較できるようにタンパク質の変種を作製することを目的とした、高コピー数宿主細胞の使用も考えている。いくつかの態様において、変種は、単一のアミノ酸の違いを引き起こす一塩基多型（SNP）の点で異なる。他の態様において、変種は複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、インビボまたは細胞抽出物における変種タンパク質の活性をアッセイする。他の態様では、タンパク質を精製し、インビトロでアッセイする。いくつかの態様において、変種タンパク質を、容易な精製を可能にする配列（例えば、his-タグ配列）またはレポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光性タンパク質）と融合させることも考えている。タンパク質の活性は、当技術分野で知られた適した方法（例えば、基質の生成物への変換）によってアッセイしうる。いくつかの好ましい態様では、野生型タンパク質の活性を測定し、変種型の野生型タンパク質の活性を野生型タンパク質の活性に対する百分率として表現する。さらに、それぞれが野生型タンパク質の異なる変種を発現する複数の宿主細胞系を作製することにより、変種タンパク質の細胞内活性を比較してもよい。続いて、変種タンパク質（例えば、シグナル伝達経路に関与するタンパク質の変種）の活性を、上記の二次メッセンジャーアッセイのためのレポーターシステムを用いて比較してもよい。したがって、いくつかの態様では、刺激またはアゴニストもしくはアンタゴニストの結合に対する変種タンパク質の直接的または間接的な反応（例えば、シグナル伝達経路の上流または下流の活性化によるもの）を比較する。いくつかの好ましい態様では、野生型タンパク質の反応を測定し、変種型の野生型タンパク質の反応を野生型タンパク質の反応に対する百分率として表現する。
実施例
以下の実施例は、本発明のいくつかの好ましい態様および面を例示するためのものであり、その範囲を制限するものとみなされるべきではない。
以下の実験の開示においては、以下の略号を用いる：M（モル濃度）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；nM（ナノモル濃度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；gm（グラム）；mg（ミリグラム）；μg（マイクログラム）；pg（ピコグラム）；L（リットル）；ml（ミリリットル）；μl（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μm（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；AMP（アデノシン5'-一リン酸）；BSA（ウシ血清アルブミン）；cDNA（コピーDNAまたは相補的DNA）；CS（子ウシ血清）；DNA（デオキシリボ核酸）；ssDNA（一本鎖DNA）；dsDNA（二本鎖DNA）；dNTP（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）；LH（黄体形成ホルモン）；NIH（米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）、Besthesda、MD）；RNA（リボ核酸）；PBS（リン酸緩衝食塩水）；g（重力）；OD（光学密度）；HEPES（N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N-[2-エタンスルホン酸]）；HBS（HEPES緩衝食塩水）；PBS（リン酸緩衝食塩水）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；Tris-HCl（トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン-塩酸）；クレノー（Klenow）（DNAポリメラーゼIラージ（クレノー）フラグメント）；rpm（毎分回転数）；EGTA（エチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)N,N,N',N'-四酢酸）；EDTA（エチレンジアミン四酢酸）；bla（β-ラクタマーゼまたはアンピシリン耐性遺伝子）；ORI（プラスミド複製起点）；lad（lac抑制因子）；X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル-D-ガラクトシド）；ATCC（米国菌培養収集所（American Type Culture Collection）、Rockville、MD）；ギブコ社（GIBCO/BRL）（GIBCO/BRL、Grand Island、NY）；パーキンエルマー社（Perkin-Elmer）（Perkin-Elmer、Norwalk、CT）；およびシグマ社（Sigma）（Sigma Chemical Company、St. Louis、MO）。
実施例1
ベクターの構築
下記の実施例には、以下の実験に用いるベクターの構築について述べる。
A．CMV MN14
CMV MN14ベクター（配列番号：4；MN14抗体は米国特許第5,874,540号に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられる）は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：CMVプロモーター；MN14重鎖シグナルペプチド、MN14抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のIRES；ウシα-ラクトアルブミンシグナルペプチド；MN14抗体軽鎖；および3' MoMuLV LTR。CMV MN14ベクターは、配列番号：4に記載された配列に加えて、5' MoMuLV LTR、MoMuLV伸長型ウイルスパッケージングシグナルおよびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：7に示されている；本明細書に記載の構築物のそれぞれにおいて5' LTRはモロニーマウス肉腫ウイルスに由来するが、これは組み込まれるとMoMuLV 5' LTRに変換される）。
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために5' MoMuLV LTRを用いる。MN14抗体の発現はCMVプロモーターによって制御される。MN14重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はIRES配列によって結合している。CMVプロモーターは、IRESによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むmRNAの産生を駆動する。リボソームはmRNAのCAP部位およびIRES配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のmRNAから産生される。LTRならびにCMVプロモーターからのmRNA発現は3' LTRで終結し、そこでポリアデニル化される。構築物は以下のセクションBに述べるものと同様の方法によってクローニングした。
IRES配列（配列番号：3）は、プラスミドpLXIN（Clontech）由来のIRESとウシα-ラクトアルブミンシグナルペプチドとの融合物を含む。IRESからの翻訳開始が最も効率化されるように、シグナルペプチドの最初のATGをIRESと結合した。シグナルペプチドの3'末端は、関心対象の任意のタンパク質が容易に結合して、シグナルペプチドとの融合タンパク質が作製されるようにマルチクローニングサイトを備えている。このIRES配列は翻訳エンハンサーとして作用することに加えて、単一のmRNAから2つのタンパク質が産生されるようにする第2の翻訳開始部位を形成する。
IRES-ウシα-ラクトアルブミンシグナルペプチドは以下の通りに構築した。ECMV IRESを含むプラスミドpLXIN（Clontech、Palo Alto、CA）の部分を、以下のプライマーを用いてPCR増幅した。
Figure 2015043785
プライマー2は、ウシα-ラクトアルブミンシグナルペプチドコード領域の開始部に対応する尾部をIRES配列と結合させる。さらに、IRES配列からの翻訳を効率化するために、ラクトアルブミンシグナルペプチドの第2のトリプレットコドンをATGからGCCに変異させた。この変異により、タンパク質配列にメチオニンからアラニンへの変化が生じた。この変異を導入した理由は、IRESがタンパク質鎖の第2のアミノ酸としてアラニンを好むためである。この結果得られたIRES PCR産物は断片の5'末端（上記のプライマー1のすぐ下流）にEcoRI部位を含む。
次に、α-ラクトアルブミンシグナルペプチドを含む配列を、以下のプライマーを用いてα-LAシグナルペプチドベクター構築物からPCR増幅した。
Figure 2015043785
プライマー3は、IRES配列の3'末端に対応する尾部をα-ラクトアルブミンシグナルペプチドコード領域と結合させる。上記の通り、IRES配列からの翻訳が効率化されるように、ウシα-ラクトアルブミンシグナルペプチドの第2のトリプレットコドンを変異させた。この結果得られたシグナルペプチドのPCR断片は、3'末端にNaeI、NcoI、EcoRV、XbaI、BglIIおよびXhoI部位を含む。
IRESおよびシグナルペプチドを上記のプライマーを用いて個別に増幅した後に、2つの反応産物を混合し、プライマー1およびプライマー4を用いてPCRを行った。この反応の結果として得られた産物は、IRESが完全長α-ラクトアルブミンシグナルペプチドと結合したものを含むスプライス断片である。シグナルペプチドの開始部をコードするATGを、ベクターpLXIN中に存在するネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をコードするATGと同じ位置に置かれている。この断片は、5'末端にEcoRI部位、3'末端にNaeI、NcoI、EcoRV、XbaI、BglIIおよびXhol部位も含む。
このスプライシングを受けたIRES/α-ラクトアルブミンシグナルペプチドPCR断片をEcoRIおよびXhoIで消化した。α-LAシグナルペプチドベクター構築物も同じくEcoRIおよびXhoIで消化した。これらの2つの断片を連結してpIRES構築物を得た。
pIRESベクターのIRES/α-ラクトアルブミンシグナルペプチド部分の配列決定を行ったところ、IRESの5'末端を変異を含んでいないことが明らかになった。これらの変異はCの長い連鎖として存在し、単離したすべてのクローンに認められた。
この問題点を修復するために、pLXIN DNAをEcoRIおよびBsmFIで消化した。IRES配列の一部に対応する500bpのバンドが単離された。変異型IRES/α-ラクトアルブミンシグナルペプチド構築物もEcoRIおよびBsmFIで消化し、変異型IRES断片を取り出した。続いて、変異型IRES/α-ラクトアルブミンシグナルペプチド構築物のIRES断片をpLXINからのIRES断片によって置換した。この結果得られたプラスミドのIRES/α-LAシグナルペプチド部分をDNA配列決定によって確認した。
この結果得られた構築物の配列には、クロンテック社（Clontech）から入手した予想されるpLXIN配列とは多くの違いがあることが判明した。本発明者らは、クロンテック社から購入したpLXINのIRES部分の配列決定も配列を確認するために行った。予想された配列との違いは、本発明者らがクロンテック社から入手したpLXINプラスミドにも存在すると思われた。配列には以下の4つの違いが同定された：
bp 347 Tは、pLXIN配列ではGであった。
bp 786〜788 ACGは、LXIN配列ではGCであった。
B．CMV LL2
CMV LL2（配列番号：5；LL2抗体は米国特許第6,187,287号に記載されている。これは参照として本明細書に組み入れられる）構築物は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：5' CMVプロモーター（Clontech）、LL2重鎖シグナルペプチド、LL2抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のIRES；ウシα-LAシグナルペプチド；LL2抗体軽鎖；および3' MoMuLV LTR。CMV LL2ベクターは、配列番号：5に記載された配列に加えて、5' MoMuLV LTR、MoMuLV伸長型ウイルスパッケージングシグナルおよびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：7に示されている）。
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために5' MoMuLV LTRを用いる。LL2抗体の発現はCMVプロモーター（Clontech）によって制御される。LL2重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はIRES配列によって結合している。CMVプロモーターは、IRESによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むmRNAの産生を駆動する。リボソームはmRNAのCAP部位およびIRES配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のmRNAから産生される。LTRならびにCMVプロモーターからのmRNA発現は3' LTRで終結し、そこでポリアデニル化される。
IRES配列（配列番号：3）は、プラスミドpLXIN（Clontech）由来のIRESとウシα-ラクトアルブミンシグナルペプチドとの融合物を含む。IRESからの翻訳開始が最も効率化されるように、シグナルペプチドの最初のATGをIRESと結合した。シグナルペプチドの3'末端は、関心対象の任意のタンパク質が容易に結合して、シグナルペプチドとの融合タンパク質が作製されるようにマルチクローニングサイトを備えている。このIRES配列は翻訳エンハンサーとして作用することに加えて、単一のmRNAから2つのタンパク質が産生されるようにする第2の翻訳開始部位を形成する。
LL2軽鎖遺伝子を以下の通りにIRESα-ラクトアルブミンシグナルペプチドと結合させた。LL2軽鎖を以下のプライマーを用いてベクターpCRLL2からPCR増幅した。
Figure 2015043785
これらのプライマーは、成熟LL2軽鎖のコード領域の開始部にHincII部位を付加する。PCR産物をHincIIで消化すると、成熟LL2をコードする最初のGACから始まる平滑末端断片が5'末端に得られる。プライマー2は、遺伝子の3'末端の停止コドンの直後にBglII部位を付加する。この結果得られた PCR産物をHincIIおよびBglIIで消化し、NaeIおよびBglIIで消化したIRES-シグナルペプチドプラスミド中に直接クローニングした。
続いて、LL2重鎖遺伝子のコザック配列を改変した。ベクターpCRMN14HCをXhoIおよびAvrIIで消化し、約400bpの断片を取り出した。続いてPCRを用いて、XhoI-AvrII消化によって取り出したLL2重鎖構築物の同じ部分を増幅した。この増幅によって遺伝子の5'末端の変異も生じ、より優れたコザック配列がクローンに付加された。典型的なIgGコザック配列に類似させるためにコザック配列を改変した。PCRプライマーを以下に示す。
Figure 2015043785
このPCR産物をXhoIおよびAvrIIで消化し、以前に消化しておいたプラスミド骨格中に挿入し直した。
続いて、この「優れた」コザック配列を軽鎖遺伝子に付加した。「優れた」コザックLL2重鎖遺伝子構築物をEcoRIで消化し、重鎖遺伝子を含む断片を単離した。IRES-αラクトアルブミンシグナルペプチドLL2軽鎖遺伝子構築物も同じくEcoRIで消化した。続いて重鎖遺伝子をIRES軽鎖構築物のEcoRI部位にクローニングした。これにより、重鎖遺伝子がIRES配列の5'端に配置された。
次に、LNCXレトロウイルス骨格のプラスミド中にマルチクローニングサイトを付加した。LNCXプラスミドをHindIIIおよびClaIで消化した。2つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製して互いにアニーリングさせ、二本鎖DNAマルチクローニングサイトを作製した。以下のプライマーを互いにアニーリングさせた。
Figure 2015043785
アニーリングの後に、マルチクローニングサイトをLNCX中に連結し、LNC-MCSを作製した。
次に、二重鎖遺伝子断片をレトロウイルス骨格の遺伝子構築物中に連結した。上記の通りに作製した二重鎖遺伝子構築物をSalIおよびBglIIで消化し、二重鎖を含む断片を単離した。レトロウイルス発現プラスミドLNC-MCSをXhoIおよびBglIIで消化した。続いて二重鎖断片をLNC-MCSレトロウイルス発現骨格中にクローニングした。
次に構築物におけるRNAスプライシングの問題を修正した。構築物をNsiIで消化した。この結果得られた断片をEcoRIで部分消化した。この部分消化によって得られた約9300塩基対のサイズの断片をゲル精製した。LL2重鎖遺伝子の3'端のスプライスドナー部位を変異させるためにリンカーを作製した。さらに、2つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって二本鎖DNAリンカーを形成させることによってリンカーを再び作製した。リンカーの作製に用いた2つのプライマーを以下に示す。
Figure 2015043785
アニーリングの後に、部分消化の際に除去された当初のNsiI/EcoRI断片の部分をこのリンカーで置換した。
C．MMTV MN14
MMTV MN14（配列番号：6）構築物は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：5' MMTVプロモーター；二重変異型PPE配列；MN14抗体重鎖；脳心筋炎ウイルス由来のIRES；ウシαLAシグナルペプチド；MN14抗体軽鎖；WPRE配列；および3' MoMuLV LTR。MMTV MN14ベクターは、配列番号：6に記載された配列に加えて、MoMuLV LTR、MoMuLV伸長型ウイルスパッケージングシグナル；MMTVプロモーターの5'側に位置するネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子をさらに含む（これらの追加的な因子は配列番号：7に示されている）。
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために5' MoMuLV LTRを用いる。MN14抗体の発現はMMTVプロモーターによって制御される。MN14重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はIRES/ウシα-LAシグナルペプチド配列（配列番号：3）によって結合している。MMTVプロモーターは、IRES/ウシα-LAシグナルペプチド配列によって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むmRNAの産生を駆動する。リボソームはmRNAのCAP部位およびIRES/ウシα-LAシグナルペプチド配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のmRNAから産生されるようになる。さらに、mRNAの核から細胞質への輸送を補助し、mRNAのポリアデニル化を補助する2つの遺伝因子がmRNAには含まれる。PPE配列はRNA CAP部位とMN14タンパク質コード領域の開始部との間に含まれ、WPREはMN14タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。LTRならびにCMVプロモーターからのmRNA発現は3' LTRで終結し、そこでポリアデニル化される。
望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、PPE因子（配列番号：2）内部のATG配列を変異させた。この変異配列の2つのコピーを頭-尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド-コード領域の上流に配置した。WPREはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくmRNAの移行を補助するとともに、mRNAに安定性をもたらす。この配列がRNAの3'非翻訳領域に含まれると、このRNAからのタンパク質発現レベルは最大10倍に上昇する。
D．α-LA MN14
α-LA MN14（配列番号：7）構築物は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：5' MoMuLV LTR、MoMuLV伸長型ウイルスパッケージングシグナル、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子、ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター、二重変異型PPE因子、MN14重鎖シグナルペプチド、MN14抗体重鎖、脳心筋炎ウイルス由来のIRES/ウシαLAシグナルペプチド、MN14抗体軽鎖、WPRE配列；および3' MoMuLV LTR。
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために5' MoMuLV LTRを用いる。MN14抗体の発現はハイブリッド型α-LAプロモーター（配列番号：1）によって制御される。MN14重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はIRES配列/ハイブリッド型α-LAプロモーター（配列番号：3）によって結合している。α-LAプロモーターは、IRESによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むmRNAの産生を駆動する。リボソームはmRNAのCAP部位およびIRES配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のmRNAから産生される。
さらに、mRNAの核から細胞質への輸送を補助し、mRNAのポリアデニル化を補助する2つの遺伝因子がmRNAには含まれる。この変異型PPE配列（配列番号：2）はRNA CAP部位とMN14タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、PPE因子（配列番号：2）内部のATG配列を変異させた。この変異配列の2つのコピーを頭-尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド-コード領域の上流に配置した。WPREはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくmRNAの移行を補助するとともに、mRNAに安定性をもたらす。この配列がRNAの3'非翻訳領域に含まれると、このRNAからのタンパク質発現レベルは最大10倍に上昇する。WPREはMN14タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。LTRならびにウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのmRNA発現は3' LTRで終結し、そこでポリアデニル化される。
ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：1）は、ヒトおよびウシのα-ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター/エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（tsp）を基準として+15からtspを基準として-600までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはtspを基準として-550〜-2000に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスRNAの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。
ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンプロモーターの構築のために、ヒトゲノムDNAを単離して精製した。ヒトα-ラクトアルブミンプロモーターの部分を以下の2つのプライマーを用いてPCR増幅した。
Figure 2015043785
この2つのプライマーにより、PCR断片の5'末端にNdeI部位が作製され、PCR断片の3'末端にEcoRI部位が作製された。
上記のプライマーを用いて作製したヒトPCR断片を制限酵素NdeIおよびEcoRIで二重消化した。プラスミドpKBaP-1も同じくNdeIおよびEcoRIで二重消化した。プラスミドpKBaIP-1は、ウシα-ラクトアルブミン5'隣接領域にマルチクローニングサイトが結合したものを含む。このプラスミドにより、種々の遺伝子をウシα-ラクトアルブミンプロモーターと結合させることが可能になる。
次に、二重消化の際にpKBaP-1プラスミドから除去されたプロモーターのウシ断片の部分をヒト断片で置換した。この結果得られたプラスミドはウシおよびヒトのα-ラクトアルブミンプロモーター/調節領域のハイブリッドであることがDNA配列決定によって確認された。
MN14軽鎖遺伝子のIRESα-ラクトアルブミンシグナルペプチドとの結合は以下の通りに行った。MN14軽鎖を、以下のプライマーを用いてベクターpCRMN14LCからPCR増幅した。
Figure 2015043785
これらのプライマーは、成熟MN14軽鎖のコード領域の開始部にHincII部位を付加する。PCR産物をHincIIで消化すると、成熟MN14をコードする最初のGACから始まる平滑末端断片が5'末端に得られる。プライマー2は遺伝子の3'末端の停止コドンの直後にBglII部位を付加する。この結果得られた PCR産物をHincIIおよびBglIIで消化し、NaeIおよびBglIIで消化したIRES-シグナルペプチドプラスミド中に直接クローニングした。
次に、ベクターpCRMN14HCをXhoIおよびNruIで消化し、約500bpの断片を取り出した。続いてPCRを用いて、XhoI-NruI消化によって取り出したMN14重鎖構築物の同じ部分を増幅した。この増幅によって遺伝子の5'末端の変異も生じ、より優れたコザック配列がクローンに付加された。典型的なIgGコザック配列に類似させるためにこのコザック配列を改変した。PCRプライマーを以下に示す。
Figure 2015043785
このPCR産物をXhoIおよびNruIで消化し、以前に消化しておいたプラスミド骨格中に挿入しなおした。
次に、この「優れた」コザックMN14重鎖遺伝子構築物をEcoRIで消化し、重鎖遺伝子を含む断片を単離した。IRES-αラクトアルブミンシグナルペプチドMN14軽鎖遺伝子構築物も同じくEcoRIで消化した。続いて重鎖遺伝子をIRES軽鎖構築物のEcoRI部位にクローニングした。これにより、重鎖遺伝子がIRES配列の5'端に配置された。
続いて、LNCXレトロウイルス骨格のプラスミド中にマルチクローニングサイトを付加した。LNCXプラスミドをHindIIIおよびClaIで消化した。2つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製して互いにアニーリングさせ、二本鎖DNAマルチクローニングサイトを作製した。以下のプライマーを互いにアニーリングさせた。
Figure 2015043785
アニーリングの後に、マルチクローニングサイトをLNCX中に連結し、LNC-MCSを作製した。
続いて、二重鎖遺伝子断片をレトロウイルス骨格の遺伝子構築物中に連結した。段階3において作製した二重鎖遺伝子構築物をSalIおよびBglIIで消化し、二重鎖を含む断片を単離した。レトロウイルス発現プラスミドLNC-MCSをXhoIおよびBglIIで消化した。続いて二重鎖断片をLNC-MCSレトロウイルス発現骨格中にクローニングした。
次に、構築物におけるRNAスプライシングの問題を修正した。構築物をNsiIで消化した。この結果得られた断片を次にEcoRIで部分消化した。この部分消化によって得られた約9300塩基対のサイズの断片をゲル精製した。MN14重鎖遺伝子の3'端のスプライスドナー部位を変異させるためにリンカーを作製した。さらに、2つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングによって二本鎖DNAリンカーを形成させることによってリンカーを再び作製した。リンカーの作製に用いた2つのプライマーを以下に示す。
Figure 2015043785
アニーリングの後に、部分消化の際に除去された当初のNsiI/EcoRI断片の部分をこのリンカーで置換した。
次に、変異型二重鎖断片をα-ラクトアルブミン発現性レトロウイルス骨格のLNα-LA-Mertz-MCS中に挿入した。上記の通りに作製した遺伝子構築物BarnHIおよびBglIIで消化し、変異型二重鎖遺伝子を含む断片を単離した。このLN α-LA-Mertz-MCSレトロウイルス骨格プラスミドをBglIIで消化した。続いてBarnHI/BglII断片をレトロウイルス骨格プラスミド中に挿入した。
続いてWPRE因子を遺伝子構築物中に挿入した。WPRE因子を取り出すためにプラスミドBluescriptII SK+ WPRE-B11をBamHIおよびHincIIで消化し、この因子を単離した。上記の通りに作製したベクターをBglIIおよびHpaIで消化した。WPRE断片をBglIIおよびHpaT部位と連結し、最終的な遺伝子構築物を作製した。
E．α-LA Bot
α-LA Bot（配列番号：8、ボツリヌス毒素抗体）構築物は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター、変異型PPE因子、cc49シグナルペプチド、ボツリヌス毒素抗体軽鎖、脳心筋炎ウイルス由来のIRES/ウシα-LAシグナルペプチド、ボツリヌス毒素抗体重鎖、WPRE配列および3' MoMuLV LTR。加えて、αLAボツリヌス毒素抗体ベクターは5' MoMuLV LTR、MoMuLV伸長型ウイルスパッケージングシグナル、およびネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子を含む（これらの追加的な因子は配列番号：7に示されている）。
この構築物は、ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の産生を制御するために5' MoMuLV LTRを用いる。ボツリヌス毒素抗体の発現はハイブリッド型α-LAプロモーターによって制御される。ボツリヌス毒素重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子はIRES/ウシα-LAシグナルペプチド配列（配列番号：3）によって結合している。ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターは、IRESによって結合した重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むmRNAの産生を駆動する。リボソームはmRNAのCAP部位およびIRES配列と結合する。これにより、重鎖および軽鎖タンパク質の両方が単一のmRNAから産生されるようになる。
さらに、mRNAの核から細胞質への輸送を補助し、mRNAのポリアデニル化を補助する2つの遺伝因子がmRNAに含まれる。変異型PPE配列（配列番号：2）はRNA CAP部位とMN14タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、PPE因子（配列番号：2）内部のATG配列を変異させた。この変異配列の2つのコピーを頭-尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド-コード領域の上流に配置した。WPREはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくmRNAの移行を補助するとともに、mRNAに安定性をもたらす。この配列がRNAの3'非翻訳領域に含まれると、このRNAからのタンパク質発現レベルは最大10倍に上昇する。WPREはMN14タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。LTRならびにウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのmRNA発現は3' LTRで終結し、そこでポリアデニル化される。
ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：1）は、ヒトおよびウシのα-ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター/エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（tsp）を基準として+15からtspを基準として-600までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはtspを基準として-550〜-2000に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスRNAの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。
F．LSRNL
LSRNL（配列番号：9）構築物は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：5' MoMuLV LTR、MoMuLVウイルスパッケージングシグナル；B型肝炎表面抗原；RSVプロモーター；ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子；および3' MoMuLV LTR。
この構築物は、B型肝炎表面抗原遺伝子の産生を制御するために5' MoMuLV LTRを用いる。ネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子の発現はRSVプロモーターによって制御される。LTRならびにRSVプロモーターからのmRNA発現は3' LTRで終結し、そこでポリアデニル化される。
G．α-LA cc49IL2
α-LA cc49IL2（配列番号：10；cc49抗体は米国特許第5,512,443号；第5,993,813号；および第5,892,019号に記載されている；これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる）構築物は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：5'ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター；cc49-IL2コード領域；および3' MoMuLV LTR。この遺伝子構築物は、一本鎖抗体cc49がインターロイキン-2と結合した融合タンパク質を発現する。融合タンパク質の発現はウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターによって制御される。
ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：1）は、ヒトおよびウシのα-ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター/エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（tsp）を基準として+15からtspを基準として-600までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはtspを基準として-550〜-2000に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスRNAの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。3'ウイルスLTRはmRNAのポリアデニル化配列を提供する。
H．α-LA YP
α-LA YF（配列番号：11）構築物は、5'側から3'側の順に以下の因子を含む：5'ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター；二重変異型PPE配列；ウシαLAシグナルペプチド；ペスト菌（Yersenia pestis）抗体重鎖Fabコード領域；EMCV IRES/ウシα-LAシグナルペプチド；ペスト菌抗体軽鎖Fabコード領域；WPRE配列；3' MoMuLV LTR。
この遺伝子構築物は、ペスト菌マウスFab抗体の発現を引き起こすと考えられる。遺伝子構築物の発現はウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターによって制御される。PPE配列およびWPRE配列はmRNAの核から細胞質への移動を補助する。IRES配列により、重鎖および軽鎖遺伝子の両方が同一のmRNAから翻訳されるようになる。3'ウイルスLTRはmRNAのポリアデニル化配列を提供する。
さらに、mRNAの核から細胞質への輸送を補助し、mRNAのポリアデニル化を補助する2つの遺伝因子がmRNAに含まれる。変異型PPE配列（配列番号：2）はRNA CAP部位とMN14タンパク質コード領域の開始部との間に含まれる。望ましくない翻訳開始が起こるのを防ぐために、PPE因子（配列番号：2）内部のATG配列を変異させた（配列番号：2の塩基4位、112位、131位および238位をGからTに変更した）。この変異配列の2つのコピーを頭-尾配列として用いた。この配列をプロモーターのすぐ下流で、コザック配列およびシグナルペプチド-コード領域の上流に配置した。WPREはウッドチャック肝炎ウイルスから単離したものであり、同じくmRNAの移行を補助するとともに、mRNAに安定性をもたらす。この配列がRNAの3'非翻訳領域に含まれると、このRNAからのタンパク質発現レベルは最大10倍に上昇する。WPREはMN14タンパク質コード部位の終末部とポリアデニル化部位との間に含まれる。LTRならびにウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーターからのmRNA発現は3' LTRで終結し、そこでポリアデニル化される。
ウシ/ヒトα-ラクトアルブミンハイブリッド型プロモーター（配列番号：1）は、ヒトおよびウシのα-ラクトアルブミンプロモーター配列に由来するモジュール型プロモーター/エンハンサー因子である。プロモーターのヒト部分は、転写開始点（tsp）を基準として+15からtspを基準として-600までの範囲である。続いてウシ部分をヒト部分の末端に結合するが、これはtspを基準として-550〜-2000に対応する。このハイブリッドは、ウシプロモーターに存在するポリアデニル化シグナルを除去し、レトロウイルスRNAの産生を妨げる目的で開発した。また、ヒト遺伝子には存在するがウシには存在しない遺伝制御因子を含めることも目的として開発した。同様に、この構築物はウシには存在するがヒトには存在しない制御因子を含む。
実施例2
MoMLV gagおよびpolタンパク質を安定的に発現する細胞系の作製
実施例2〜5では、偽型のレトロウイルスベクターの作製について述べる。これらの方法は、上記のベクターの作製に一般的に適用可能である。融合誘導性VSV Gタンパク質が細胞表面に発現されると合胞体形成および細胞死が起こる。このため、VSV Gタンパク質を膜関連タンパク質として含むレトロウイルス粒子を作製するために二段階アプローチを採用した。第1に、MoMLV由来のgagおよびpolタンパク質を高レベルで発現する安定的な細胞系を作製した（例えば、293GPSD細胞）。gagおよびpolタンパク質を発現する安定的な細胞系は、膜関連タンパク質（例えば、外被タンパク質）を含まない非感染性ウイルス粒子を産生する。続いて、安定的な細胞系に対して、リン酸カルシウム沈殿を用いてVSV-Gおよび関心対象の遺伝子プラスミドDNAによる共トランスフェクションを行った。作製した偽型ベクター遺伝子を用いて293GPSD細胞を感染させ、安定的な形質転換細胞系を作製した。安定的な細胞系には、VSV Gタンパク質の高レベルの発現を指令しうるプラスミドを一時的にトランスフェクトしうる（以下参照）。この一時的トランスフェクト細胞はVSV G-偽型レトロウイルスベクターを産生し、合胞体形成の結果として産生細胞が死滅するまでの3〜4日の期間にわたり、これを細胞から収集することが可能である。
VSV G-偽型レトロウイルスベクターの作製における第1の段階である、MoMLV gagおよびpolタンパク質を発現する安定的な細胞系の作製について以下に述べる。ヒトアデノウイルスAd-5によって形質転換された胚腎細胞系293（ATCC CRL 1573）に対して、pCMVgag-pol、およびフレオマイシンをコードする遺伝子による共トランスフェクションを行った。pCMV gag-polは、CMVプロモーターの制御下にあるMoMLV gagおよびpol遺伝子を含む（pCMV gag-polはATCCから入手しうる）。
リン酸カルシウム共沈法（GrahamおよびVan der Eb、Virol. 52：456［1973］）を用いて、プラスミドDNAを293細胞に導入した。DNA共沈物を添加する前日に、約5×105個の293細胞を100mm組織培養プレートにプレーティングした。10％FCSおよび10μg/mlフレオマイシンを含むDMEM-高グルコース培地（選択培地）中で生育させることにより、安定的な形質転換体を選択した。選択培地中で生育したコロニーを細胞外逆転写酵素活性（Goffら、J. Virol. 38：239［1981］）および細胞内p30gag発現に関してスクリーニングした。p30gag発現の存在は、ヤギ抗p30抗体（NCI抗血清 77S000087）を用いるウエスタンブロット法によって判定した。レトロウイルス遺伝子の安定的な発現を呈したクローンを選択した。このクローン293GPSD（293gag-pol-San Diego）と命名した。ヒトAd-5で形質転換された胚腎細胞系293の派生物であるこの293GPSD細胞系を、10％FCSを含むDMEM-高グルコース培地中で生育させた。
実施例3
VSVのG糖タンパク質を保有する偽型レトロウイルスベクターの調製
VSV Gタンパク質偽型レトロウイルスを作製するために以下の手順を用いた。293GPSD細胞系に対して、VSV-Gプラスミドおよび関心対象のDNAプラスミドによる共トランスフェクションを行った。この共トランスフェクションにより、293GPSD細胞を感染させてパッケージング細胞系を作製するために用いる感染性粒子が作製される。本実施例では、偽型LNBOTDCウイルスの作製について述べる。この一般的な方法を、実施例1に記載したベクターの任意のものを作製するために用いてもよい。
a）細胞系およびプラスミド
パッケージング細胞系293GPSDを、10％FCSを含むα-MEM-高グルコース培地中で生育させた。偽型ウイルスの力価は208F細胞（Quade、Virol. 98：461［1979］）またはNIH/3T3細胞（ATCC CRL 1658）を用いて判定しうる；208FおよびNIH/3T3細胞は10％CSを含むDMEM-高グルコース培地中で生育させる。
プラスミドLNBOTDCは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下にあるBOTDをコードする遺伝子を含み、LTRプロモーターの転写制御下にあるネオマイシンリン酸転移酵素（Neo）をコードする遺伝子がこの後に続く。プラスミドpHCMV-Gは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下にあるVSV G遺伝子を含む（Yeeら、Meth. Cell Biol. 43：99［1994］）。
b）安定的なパッケージング細胞系、偽型ベクターの作製、および偽型LNBOTDCベクターの力価判定
LNBOTDC DNA（配列番号：13）をpHCMV-G DNAとともにパッケージング細胞系293GPSDに共トランスフェクトして、LNBOTDCウイルスを作製した。次に、この結果得られたLNBOTDCウイルスを用いて293GPSD細胞を感染させ、細胞の形質転換を行った。偽型LNBOTDCウイルスの作製のための手順は記載の通りに行った（Yeeら、Meth. Cell Biol. 43：99［1994］。
これは、感染性のある複製能欠損レトロウイルスベクターの生成に伴い、関心対象の細胞内への上記の配列の挿入が引き起こされると考えられるレトロウイルス遺伝子構築物である。挿入が起こると、CMV調節配列がボツリヌス毒素抗体重鎖および軽鎖遺伝子の発現を制御する。IRES配列により、重鎖および軽鎖遺伝子の両方が同一のmRNAから翻訳されるようになる。3'ウイルスLTRはmRNAのポリアデニル化配列を提供する。
ボツリヌス毒素抗体の重鎖および軽鎖タンパク質の両方がこのシグナルmRNAから産生される。この2つのタンパク質が会合すると活性のあるボツリヌス毒素抗体が形成される。また、重鎖および軽鎖タンパク質は互いに等しいモル比で形成されるように思われる。
簡潔に述べると、第1日に約5×104個の293GPSD細胞を75cm2組織培養フラスコに播いた。その翌日（第2日）に、標準的なリン酸カルシウム共沈法（GrahamおよびVan der Eb、Virol. 52：456［1973］）を用いて、293GPSD細胞に25μgのpLNBOTDCプラスミドDNAおよび25μgのVSV-GプラスミドDNAをトランスフェクトした。10〜40μgの範囲のプラスミドDNAを用いうる。293GPSD細胞が組織培養プレートに固着するには24時間以上を要する場合があるため、293GPSD細胞をトランスフェクションの48時間前に75cm2フラスコに入れておくとよい。トランスフェクトされた293GPSD細胞は、偽型のLNBOTDCウイルスを生じる。
第3日に、トランスフェクトされた293GPSD細胞から偽型ウイルスを収集する24時間前に、約1×105個の293GPSD細胞を75cm2組織培養フラスコに入れた。第4日に、pLNBOTDCおよびVSV-G DNAの適用から48時間後にトランスフェクトされた293GPSD細胞から、培地を採取した。培地を0.45μmフィルターで濾過し、ポリブレンを添加して最終濃度を8μg/mlとした。LNBOTDCウイルスを含む培地を用いた293GPSD細胞の感染は以下の通りに行った。培地を293GPSD細胞から除去し、LNBOTDCウイルスを含む培地に交換した。細胞に対する添加後にポリブレンを培地に加えた。ウイルスを含む培地中に293GPSD細胞を24時間保った。感染時期から16時間後（第5日）に培地を293GPSDから除去し、400μg/ml G418（GIBCO/BRL）を含む新たな培地に交換した。培地をほぼ3日毎に交換したところ、約2週間後にG418耐性コロニーが出現した。
このG418耐性293コロニーを単細胞として96個のウェルにプレーティングした。高生産性クローンを同定するために、60〜100個のG418耐性コロニーをBOTDC抗体の発現に関してスクリーニングした。96穴プレート中の上位10種のクローンを6穴プレートに移し、集密に達するまで生育させた。
この上位10種のクローンを高力価産生に関してスクリーニングした。タンパク質発現および力価産生に基づいて5つのクローン細胞系を選択した。1つの細胞系をマスター細胞バンクに指定し、他の4つを予備細胞系とした。偽型ベクターは以下の通りに作製した。約1×106個の293GPSD/LNBOTDC細胞を75cm2組織培養フラスコに播いた。24時間後にリン酸カルシウム共沈法を用いて細胞に25μgのpHCMV-GプラスミドDNAをトランスフェクトした。6〜8時間後にカルシウム-DNA沈殿物を細胞に適用し、DNA溶液を新たな培地（G418を含まないもの）に交換した。トランスフェクション時間の長い方（一晩）では、293GPSD/LNBOTDC細胞の大半がプレートから剥離したことが判明したため、これは用いていない。トランスフェクトされた293GPSD/LNBOTDC細胞は偽型LNBOTDCウイルスを産生した。
トランスフェクトされた293GPSD/LNBOTDC細胞から生じた偽型LNBOTDCウイルスは、トランスフェクションから24〜96時間の間は少なくとも1日1回収集することができる。最も高いウイルス力価は最初のpHCMV-Gトランスフェクションから約48〜72時間後に得られた。トランスフェクションから約48時間後に合胞体形成がトランスフェクト細胞の大半に認められるようになったが、細胞は組織培養プレートに付着し続ける限り、少なくともさらに48時間にわたって偽型ウイルスの産生を続けた。VSV G-偽型LNBOTDCウイルスを含む収集した培地をプールし、0.45μmフィルターで濾過した上で、-80℃で保存するか、または直ちに濃縮した後に-80℃で保存した。
続いて、VSV G-偽型LNBOTDCウイルスの力価を以下の通りに判定した。約5×104個のラット208F線維芽細胞を6穴プレートにプレーティングした。プレーティングから24時間後に、8μg/ml ポリブレンの存在下で、LNBOTDCウイルス含有培地を連続希釈したものによって細胞を感染させた。ウイルスによる感染から24時間後に、培地を400μg/mlのG418を含む新たな培地に交換し、G418耐性コロニーが認められるようになるまで14日間にわたって選別を続けた。ウイルス力価は一般に約0.5〜5.0×106コロニー形成単位（cfu）/mlであった。以下に述べる通り、ウイルスストックの力価が109cfu/mlを上回るまで濃縮することが可能であった。
実施例4 偽型レトロウイルスベクターの濃縮
超遠心分離を1サイクル行うことにより、VSV G-偽型LNBOTDCウイルスを濃縮して高力価とした。しかし、さらに濃縮するために2サイクルを行うことが可能である。実施例2に記載した通りに収集した、偽型LNBOTDCウイルスを含む凍結培地を37℃水浴中で解凍し、あらかじめオートクレーブによって滅菌しておいたオークリッジ型遠心管（密封蓋付きの50mlオークリッジ型遠心管、Nalge Nunc International）に移した。JA20ローター（Beckman）により48,000×g（20,000rpm）、4℃で120分間遠心してウイルスを沈殿させた。次に、バイオセーフティーフード内で培地をチューブから採取し、チューブ内に残った培地を吸引して上清を採取した。ウイルスペレットを最初の容量の0.5〜1％のDMEM培地中に再懸濁した。再懸濁したウイルスペレットを4℃で一晩、攪拌せずにインキュベートした。一晩インキュベートした後には、感染性ウイルスを大きく失うことなく、ウイルスペレットを丁寧なピペッティングで分散させることができた。ウイルスストックの力価は通常、超遠心を1回行った後には100〜300倍に上昇した。感染性ウイルスの回収効率は30〜100％の範囲でさまざまであった。
続いて、視認しうる細胞片、または以上の条件下で再懸濁されなかった凝集ビリオンを除去するために、ウイルスストックを微量遠心管に入れ、低速遠心を4℃で5分間行った。ウイルスストックを卵母細胞または胚への注入に用いる予定がなければ、この遠心段階を省いてもよい。
ウイルスストックをさらに濃縮するためにこのウイルスストックに超遠心をさらにもう1回行うことができる。1回目の遠心後に再懸濁したウイルスをプールし、2回目の超遠心を上記と同じく行うことによってペレット化する。2回目の超遠心後にはウイルス力価は約2000倍に上昇する（偽型LNBOTDCウイルスの力価は、第2回目の超遠心後には一般に1×109cfu/mlとなる）。
遠心前および遠心後の液体の力価を208F細胞の感染によって判定した後（NIH 3T3またはウシ乳腺上皮細胞も用いうる）、上記の実施例2の通りにG418耐性コロニーを選択した。
実施例5
宿主細胞の感染用の偽型レトロウイルスの調製
濃縮した偽型のレトロウイルスを0.1×HBS（2.5mM HEPES、pH 7.12、14mM NaCl、75μM Na2HPO4・H2O）中に再懸濁し、18μlのアリコートを0.5mlバイアル（Eppendorf）に入れた上で、使用時まで-80℃で保存した。1μlの濃縮ウイルスを0.1×HBSで10−7または10−8倍に希釈することにより、濃縮ベクターの力価を判定した。続いて、希釈したウイルス溶液を用いて208Fおよびウシ乳腺上皮細胞を感染させ、ウイルス力価を実施例2に記載した通りに判定した。
実施例6
宿主細胞によるMN14の発現
本実施例では、多数の組み込みベクターをトランスフェクトした細胞からの抗体MN14の産生について述べる。以下のベクターに関して、偽型ベクターをパッケージング細胞系から作製した：CMV MN14、α-LA MN14およびMMTV MN14。ラット線維芽細胞（208F細胞）、MDBK細胞（ウシ腎細胞）およびウシ乳腺上皮細胞に感染多重度1000でトランスフェクションを行った。1000個の細胞をT25フラスコに播き、培地3ml中にて106コロニー形成単位（CFU）のベクターを細胞とともにインキュベートした。感染時間は24時間とし、その後に培地を交換した。トランスフェクション後は細胞を増殖させ、集密化させた。
細胞系をT25フラスコ内で集密化するまで増殖させ、培地5mlを毎日交換した。MN14の存在に関して培地を毎日アッセイした。産生されたMN14はすべて活性があり（ヒトIgGの検出を目的としたELISAで、CEA結合ELISAと全く同じ値が得られた）、ウエスタンブロット法により、重鎖および軽鎖が1：1と思われる比で産生されることが示された。さらに非変性ウエスタンブロットにより、抗体複合体の100％と思われる割合が正しく形成されたことが示された（図1参照：レーン1、85ng対照Mn14；レーン2、ウシ乳腺細胞系、α-LAプロモーター；レーン3、ウシ乳腺細胞系、CMVプロモーター；レーン4、ウシ腎細胞系、α-LAプロモーター；レーン5、ウシ腎細胞系、CMVプロモーター；レーン6、208細胞系、α-LAプロモーター；レーン7、208細胞系、CMVプロモーター）。
図2は、4種の細胞系に関してMN14産生の時間的推移を示したグラフである。Y軸は培地1ml当たりのMN14産生量をng単位で示している。X軸は実験用の培地収集日を示している。グラフ上には4組のデータが示されている。比較はCMVとα-LAプロモーターとの間および208細胞とウシ乳腺細胞との間で行っている。ウシ乳腺細胞系は発現が最も高度であり、次いで208F細胞およびMDBK細胞であった。構築物に関しては、CMV駆動性の構築物が最も高い発現レベルを示し、次いでα-LA駆動性遺伝子構築物およびMMTV構築物であった。第2週の時点で、CMV構築物の1日産生レベルは4.5μg/培地mlであった（T25フラスコ内で22.5mg/日）。発現レベルはその後、以降の週で細胞が極めて高密度に集密化するに伴って徐々に上昇し、40μg/日となった。α-lac-MN14パッケージング細胞系から収集した2.7Lの培地を親和性クロマトグラフィーにより処理し、MN14の精製ストックを得た。
図3は、MN14抗体の重鎖および軽鎖を分離するために変性条件下で泳動を行った15％SDS-PAGEゲルのウエスタンブロットである。レーン1はウシ乳腺細胞系、ハイブリッド型α-LAプロモーターによるMN14を示している；レーン2はウシ乳腺細胞系、CMVプロモーターによるMN14を示している；レーン3はウシ腎細胞系、ハイブリッド型αLAプロモーターによるMN14を示している；レーン4はウシ腎細胞系、CMVプロモーターによるMN14を示している；レーン5はラット線維芽細胞系、ハイブリッド型α-LAプロモーターによるMN14を示している；レーン6はラット線維芽細胞、CMVプロモーターによるMN14を示している。上の図1と一致して、これらの結果は重鎖および軽鎖が約1：1の比で産生されることを示している。
実施例7
細胞1個当たりの産生タンパク質の定量
本実施例では、本発明に従って作製した細胞培養物における細胞1個当たりの産生タンパク質量の定量について述べる。種々の細胞（208F細胞、MDBK細胞およびウシ乳腺細胞）を25cm2培養皿に1000個/培養皿の密度でプレーティングした。この3つの細胞種を感染させるために3種の異なるベクター（CMV-MN14、MMTV-MN14およびα-LA-MN14）をMOI 1000で用いた（力価：それぞれ2.8×106、4.9×106および4.3×106）。すべての培養物から培地をほぼ24時間毎に収集した。培地収集を1カ月間行った後に、208F細胞およびMDBK細胞は状態が悪くMN14発現も弱かったため廃棄した。細胞をT25フラスコに継代し、ウシ乳腺細胞からの培地の収集を約2カ月行ったが、M14の発現は継続していた。T25フラスコ内で2カ月培養した後、CMVプロモーターを用いた細胞は22.5pg/細胞/日、α-LAプロモーターを用いた細胞は2.5pg/細胞/日のMN14を産生した。
T25フラスコ内で2カ月培養した後に、生産規模を拡大するため、および多回継代後もMN14発現が安定しているかどうかを判定するために、回転瓶（850cm2）への播種を行った。2本の回転瓶にCMVプロモーターからMN14を発現しているウシ乳腺細胞を播種し、2つの回転瓶にα-LAプロモーターからMN14を発現しているウシ乳腺細胞を播種した。培養物は約2週後に集密状態に達し、MN14を発現し続けた。回転瓶での発現を以下の表1に示す。
（表１） 回転瓶におけるMN14の産生
Figure 2015043785
実施例8
さまざまな感染多重度でのトランスフェクション
本実施例では、タンパク質発現に対する、さまざまな感染多重度でのトランスフェクションの影響に関して述べる。208Fラット線維芽細胞およびウシ乳腺上皮細胞（BMEC）を、25cm2プレートに種々の細胞数/25cm2でプレーティングした。CFU数を一定に保って感染させる細胞数を変化させることにより、細胞にCMV MN14ベクターまたはαLA MN14ベクターを1、10、1000および10,000のMOIで感染させた。
感染後には培地を毎日交換し、約2カ月にわたって約24時間毎にすべての細胞から培地を収集した。ウシ乳腺上皮細胞における両方のベクターの結果を以下の表2に示している。データのない細胞は、実験が完了する前に感染した培養物であることを示す。「細胞数」の欄は、実験終了時の細胞数を表す。この結果は、MOIが高いほど、1日当たりに産生されるタンパク質の量および総蓄積量のいずれの点からもMN14産生の増加がもたらされることを示している。
（表２） MOIに対するタンパク質産生
Figure 2015043785
実施例9
さまざまな感染多重度でのトランスフェクション
本実施例では、種々のMOI値でのCMV MN14ベクターからのタンパク質産生に関して述べる。ウシ乳腺細胞、CHO細胞およびヒト胚腎細胞（293細胞）を24穴プレート（2cm2）に100個/2cm2ウェルの密度でプレーティングした。細胞をさまざまな希釈度のCMV MN14に感染させ、1、10、100、1000および10000のMOI値を得た。CHO細胞はすべてのMOIで感染から11日以内に集密状態に達した。 しかし、MOI 10,000で感染させた細胞の増殖は比較的緩徐であった。ウシ乳腺細胞および293細胞の増殖はより緩徐であり、これは特に最も高い10,000のMOIでそうであった。続いて、細胞を分散させるために細胞をT25フラスコに継代した。分散の後に、細胞は1週間以内に集密状態に達した。培地を1週間後に収集し、MIN14産生に関して分析した。CHO細胞およびヒト293細胞は長期培養下で良好な増殖を示さなかった。このため、これらの細胞からはデータを収集しなかった。ウシ乳腺上皮細胞に関するデータを以下の表3に示している。この結果は、MN14の産生はMOIが高いほど増加することを示している。
（表３） MOIに対するタンパク質産生
Figure 2015043785
実施例10
ウシ乳腺細胞によるLL2抗体の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞による抗体LL2の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターCMV LL2（7.85×107CFU/ml）を1000および10,000のMOIで感染させ、25cm2培養皿にプレーティングした。MOI 10,000でトランスフェクトした細胞は全く生存しなかった。集密度20％の時点で、250ng/mlのLL2が培地中に存在した。
実施例11
ウシ乳腺細胞によるボツリヌス毒素抗体の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞におけるボツリヌス毒素抗体の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターα-LA Bot（2.2×102CFU/ml）を感染させ、25cm2培養皿にプレーティングした。集密度100％の時点で、6ng/mlのボツリヌス毒素抗体が培地中に存在した。
実施例12
ウシ乳腺細胞によるB型肝炎表面抗原の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞におけるB型肝炎表面抗原（HBSAg）の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターLSRNL（350CFU/ml）を感染させ、25cm2培養皿にプレーティングした。集密度100％の時点で、20ng/mlのHBSAgが培地中に存在した。
実施例13
ウシ乳腺細胞によるcc49IL2抗原結合タンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞におけるcc49IL2の発現に関して述べる。ウシ乳腺細胞にベクターcc49IL2（3.1×105CFU/ml）をMOI 1000で感染させ、25cm2培養皿にプレーティングした。集密度100％の時点で、10μg/mlのcc49IL2が培地中に存在した。
実施例14
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現に関して述べる。MN14を産生する乳腺細胞（CMV-MN14ベクターに感染したもの）にcc49IL2ベクター（3.1×105CFU/ml）をMOI 1000で感染させ、細胞1000個を25cm2培養プレートにプレーティングした。集密度100％の時点で、細胞はMN14を2.5μg/ml、cc49IL2を5μg/ml発現した。
実施例15
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現に関して述べる。MN14を産生する乳腺細胞（CMV-MN14ベクターに感染したもの）にLSNRLベクター（100CFU/ml）をMOI 1000で感染させ、細胞1000個を25cm2培養プレートにプレーティングした。集密度100％の時点で細胞はMN14を2.5μg/ml、肝炎表面抗原を150ng/ml発現した。
実施例16
ウシ乳腺細胞による複数のタンパク質の発現
本実施例では、ウシ乳腺細胞における複数のタンパク質の発現に関して述べる。B型肝炎表面抗原を産生する乳腺細胞（LSRNLベクターに感染したもの）にcc49IL2ベクターをMOI 1000で感染させ、細胞1000個を25cm2培養プレートにプレーティングした。集密度100％の時点で、細胞はMN14を2.4μg/ml、B型肝炎表面抗原を13ng/ml発現した。上記の他の細胞系においても、複数のタンパク質が発現されうることが理解されると考えられる。
実施例17
ウシ乳腺細胞におけるB型肝炎表面抗原およびボツリヌス毒素抗体の発現
本実施例では、回転瓶培養におけるトランスフェクト細胞の培養に関して述べる。208F細胞およびウシ乳腺細胞を25cm2培養皿に1000個/25cm2の密度でプレーティングした。LSRNLまたはα-LA Botベクターを用いて各細胞系をMOI 1000で感染させた。培養および培地収集を1カ月間行った後に、208F細胞は生育および培養状態が悪かったため廃棄した。同様に、α-LA Botに感染させたウシ乳腺細胞もタンパク質発現が弱かったため廃棄した。LSRNLに感染させたウシ乳腺細胞を継代して回転瓶（850cm2）に播種した。約20ng/mlのB型肝炎表面抗原が回転瓶培養物中に産生された。
実施例18
クローン的に選択した細胞系における発現
本実施例では、クローン的に選択した細胞系からのMN14の発現に関して述べる。細胞系をT25フラスコ内で集密状態に達するまで増殖させ、培地5mlを毎日収集した。培地をMN14の存在に関して毎日アッセイした。産生されたMN14すべて活性があり、ウエスタンブロット法により、重鎖および軽鎖がほぼ厳密に1：1と思われる比で産生されることが示された。さらに、非変性ウエスタンブロットにより、抗体複合体のほぼ100％が正しく形成されたことが示された。培養下に約2カ月間おいた後、細胞を回転瓶内で増殖させるか、または単細胞クローンとして96穴プレートにプレーティングした。
培地交換の追加によって週1回の培地交換の場合よりも産生が増加するか否かを明らかにするために、回転瓶における24時間でのMN14の産生を分析した。850cm2回転瓶内のCMVプロモーター細胞は第1日に909ng/ml、第2日に1160ng/ml、第3日の1112ng/mlを産生した。α-LAプロモーター細胞は第1日に401ng/ml、第2日に477ng/ml、第3日に463ng/mlを産生した。これらの値は、CMV細胞で得られた8〜10mg/ml/週、およびα-LA細胞で得られた2〜3mg/mlという値とよく対応する。培地の交換頻度を高めても回転瓶におけるMN14産生は増加しないように思われる。
単細胞系を96穴プレート内に樹立した後に、同じウェルに継代して細胞を集密状態になるまで増殖させた。細胞が集密状態に達したところで、それらを24時間でのMN14産生に関してアッセイした。CMV細胞系からのMN14のクローン性産生量は19ng/ml/日〜5500ng/ml/日の範囲であった。全細胞クローンの平均産生量は1984ng/ml/日であった。α-LA細胞クローンについても同様の結果が得られた。α-LA細胞系からのMN14のクローン性産生量は1ng/ml/日〜2800ng/ml/日の範囲であった。これらの細胞クローンの平均産生量は622ng/ml/日であった。結果を以下の表4に示す。
（表４） クローン細胞系における発現
Figure 2015043785
Figure 2015043785
Figure 2015043785
Figure 2015043785
実施例19
挿入コピー数の推定
本実施例では、感染多重度、遺伝子コピー数およびタンパク質発現の関係について述べる。インベーダーアッセイシステム（Third Wave Teclnologies、Madison、WI）を用いて3種類のDNAアッセイを開発した。アッセイの1つでは、ウシα-ラクトアルブミン5'隣接領域の一部を検出する。このアッセイはウシに対して特異的であり、ブタまたはヒトのα-ラクトアルブミン遺伝子は検出しない。このアッセイでは、すべての対照ウシDNA試料においてα-ラクトアルブミン遺伝子の2つのコピーが検出され、同じくウシ乳腺上皮細胞でも検出されると考えられる。第2のアッセイは、MLVウイルスの伸長型パッケージング領域の一部を検出する。このアッセイはこの領域に対して特異的であり、293ヒト細胞系、ウシ乳腺上皮細胞系またはウシDNA試料におけるシグナルは検出しない。理論的に、MLVに感染していないすべての細胞系または他の試料はシグナルを生じないはずである。しかし、293GP細胞系はDNAの伸長型パッケージング領域を用いて作製されているため、この細胞系はアッセイを行うとシグナルを生じる。初期の分析からは、293GP細胞系は本アッセイによって検出される伸長型パッケージング領域配列の2つのコピーを含むように思われる。最後のアッセイは対照アッセイである。このアッセイは、ウシ、ブタ、ヒトおよび他の数多くの種で同一である、インスリン様増殖因子I遺伝子の一部を検出する。これは、2コピー遺伝子の場合にその試料から生じるシグナルの量を決定するために、検査するすべての試料に対して対照として用いる。検査するすべての試料は、対照遺伝子の2つのコピーを含む必要がある。
DNA試料はさまざまな方法を用いて単離しうる。続いて、2つのアッセイを各試料に対して行う。対照アッセイはウシα-ラクトアルブミンアッセイまたは伸長型パッケージング領域アッセイのいずれかとともに行う。必要な試料および情報の種類により、どの行うべきかが決まると考えられる。対照アッセイおよび導入遺伝子検出アッセイはいずれも、厳密に同じ量のDNAを用いて、同一のDNA試料に対して行う。
本アッセイによって得られるデータは以下の通りである（計数値は任意の蛍光単位を表す）：
伸長型パッケージング領域またはα-ラクトアルブミンのバックグラウンド計数値
伸長型パッケージング領域またはα-ラクトアルブミンによる計数値
内部対照のバックグラウンド計数値
内部対照による計数値
アッセイによる正味の計数値を決定するために、バックグラウンド計数値を実際の計数値から差し引く。これは対照アッセイおよび導入遺伝子検出アッセイの両方に対して行う。正味の計数値が得られれば、導入遺伝子検出アッセイによる正味の計数値と対照アッセイの正味の計数値との比を得ることができる。この値は、導入遺伝子のコピー数を内部対照遺伝子（この場合にはIGF-I）のコピー数と比較した指標である。導入遺伝子検出アッセイおよび対照アッセイは2つの全く異なるアッセイであるため、それらは厳密に同じく振る舞うわけではない。このことは、特定の試料中に導入遺伝子の2つのコピーおよび対照遺伝子の2つのコピーが存在しても、厳密に1：1の比は得られないことを意味する。しかし、値は概ね1：1の比に近い。また、導入遺伝子の挿入部位が異なることも、導入遺伝子アッセイが挿入位置によって異なる振る舞いを示す原因になりうる。
したがって、この比はコピー数の厳密な尺度ではないものの、試料間の相対的なコピー数の良い指標となる。この比の値が大きいほど導入遺伝子のコピー数も多い。このため、試料を最も低いものから最も高いものまでランク付けすると、コピー数に関する試料の極めて正確な比較が得られると考えられる。表5にはEPRアッセイの実際の結果を示している：
（表５）
Figure 2015043785
このデータから、293細胞系は伸長型パッケージング領域/導入遺伝子のコピーを全く持っていないと判断することができる。しかし、293GP細胞は伸長型パッケージング領域の2つのコピーを有するように思われる。残る3つの細胞系は伸長型パッケージング領域の3つまたはそれ以上のコピーを有する（293GP細胞と比べて1つまたはそれ以上のコピーが余分にある）ように思われる。
インベーダーアッセイによる遺伝子比および細胞系のタンパク質産生
ウシ乳腺上皮細胞に対して、CMV駆動性のMN14構築物またはα-ラクトアルブミン駆動性のMN14構築物を感染させた。細胞の感染はベクター1000に対して細胞1の比で行った。感染した細胞を増殖させた。この最初にプールした細胞集団から、α-LAおよびCMV含有細胞の両方に関してクローン細胞系を樹立した。約50種の細胞系を各遺伝子構築物に関して作製した。個々の細胞を96穴プレートにプレーティングした後、同じウェルに継代して細胞を集密状態になるまで増殖させた。細胞系が集密状態に達したところで、それらを24時間でのMN14産生に関してアッセイした。CMV細胞系からのMN14のクローン性産生量は0ng/ml/日〜5500ng/ml/日の範囲であった。全細胞クローンの平均産生量は1984ng/ml/日であった。α-LA細胞クローンについても同様の結果が得られた。α-LA細胞系からのMN14のクローン性産生量は0ng/ml/日〜2800ng/ml/日の範囲であった。これらの細胞クローンの平均産生量は622ng/ml/日であった。
これらのクローン系をさらに分析するために、15種のCMVクローンおよび15種のα-LAクローンを選択した。うち5種は最も発現が高度な系から、5種は最も発現が低い系から、5種は発現が中程度である系から選択した。これらの30種の細胞系を増殖させて貯蔵した。この30種の細胞系のほとんどすべてからDNAを単離した。細胞系を6穴プレートで継代し、集密化するまで増殖させた。集密状態に達した時点で、培地を24時間毎に交換し、各細胞系からの2つの別々の収集物をMN14産生に関してアッセイした。これらの2つのアッセイの結果を平均し、これらの数値を用いて以下の表6および7を作成した。細胞系から得たDNAはインベーダー伸長型パッケージング領域アッセイを用いてアッセイしており、その結果を以下に示した。これらの表には、細胞系の番号、対応する遺伝子比および抗体産生量を示している。
（表６）
Figure 2015043785
（表７）
Figure 2015043785
本グラフ（図17および18）は、タンパク質発現とインベーダーアッセイによる遺伝子比との比較を示している。この結果は、インベーダーアッセイによる遺伝子比とタンパク質産生との間に直接の相関があることを示している。また、タンパク質産生は最大に達しておらず、インベーダーアッセイによる遺伝子比がさらに高い細胞を作製すれば、より多くのタンパク質産生が起こるものと思われた。
インベーダーアッセイによる遺伝子比および複数の細胞系の感染
複製能欠損レトロウイルスベクターの作製に用いた前記の方法を用いて、2つのパッケージング細胞系（293GP）を作製した。細胞系のうち一方は、CMVプロモーターからボツリヌス毒素抗体遺伝子を発現するレトロウイルス遺伝子構築物（LTR-伸長型ウイルスパッケージング領域-Neo遺伝子-CMVプロモーター-Bot軽鎖遺伝子-IRES-Bot重鎖遺伝子-LTR）を含み、もう一方の細胞系は、CMVプロモーターからYP抗体遺伝子を発現するレトロウイルス遺伝子構築物（LTR-伸長型ウイルスパッケージング領域-Neo遺伝子-CMVプロモーター-YP重鎖遺伝子-IRES-YP軽鎖遺伝子-WPRE-LTR）を含む。これらの細胞系はそれぞれ、複製能欠損レトロウイルスベクターを産生する能力を持つことに加えて、ボツリヌス毒素抗体またはYP抗体も産生する。
続いて、これらの細胞系から産生されたベクターを用いて、親細胞系の再感染を行った。この手順は、遺伝子挿入数を増やすため、およびこれらの細胞系からの抗体産生を向上させるために行った。ボツリヌス毒素親細胞系には3日間連続してベクターの新たなアリコートを感染させた。感染を行うために用いたベクターの力価は1×108cfu/mlであった。最後の24時間の感染が完了した時点で細胞のクローン選択を行い、ボツリヌス毒素抗体産生に関して最も多くタンパク質を産生する細胞系を樹立した。YP親細胞系に対しても同様の手順を行った。この細胞系にも3日間連続してベクターの新たなアリコートを感染させた。YPベクターのアリコートの力価は1×104であった。最後の24時間の感染が完了した時点で細胞のクローン選択を行い、YP産生に関して最も多くタンパク質を産生する細胞系を樹立した。
親細胞系および娘細胞である産生細胞系のそれぞれを、伸長型パッケージング領域アッセイを用いてインベーダー遺伝子比に関してアッセイするとともに、タンパク質産生に関してもアッセイした。最も力価が高いベクターを用いて作製したBot産生細胞系は、遺伝子比が最も高かった。これはタンパク質産生量も最も多く、遺伝子コピー数がタンパク質産生と比例することが改めて示唆された。YP産生細胞系も親細胞系より遺伝子比が高く、より多くのタンパク質を産生し、このことからも遺伝子コピーの増加がタンパク質産生の増加と直接相関することが示唆された。データを表8に示す。
（表８）
Figure 2015043785
実施例20
レンチウイルスベクターによるトランスフェクション
本実施例では、レンチウイルスベクターの作製、および高い感染多重度で宿主細胞を感染させるためのその使用に関して述べる。293Tヒト腎細胞における、米国特許第6,013,516号に記載されたプラスミドの一時的な共トランスフェクションにより、複製能欠損ウイルス粒子を作製する。標準的な分子生物学の手順に従って、すべてのプラスミドを大腸菌HB101株に形質転換導入して増殖させる。真核生物細胞のトランスフェクションのためには、CsCl-臭化エチジウム勾配を用いた平衡遠心法によってプラスミドDNAを2倍に精製する。合計40μgのDNAを以下の比率で10cm培養皿内の培養物のトランスフェクションに用いる：10μg pCMVΔR8、20μg pHR'、および10μg envプラスミド（MLV/Ampho、MLV/EcoまたはVSV-Gのいずれか）。10％ウシ胎仔血清および抗生物質を加えたDMEM中にある293T細胞を10％CO2インキュベーター内で増殖させる。細胞をトランスフェクションの前日に1.3×106個/10cm培養皿の密度でプレーティングする。トランスフェクションの前には培地を4〜6時間毎に交換する。チェン（Chen）およびオカヤマ（Okayama）の方法（Mol. Cell. Biol.、7：2745、1987）に従ってリン酸カルシウム-DNA複合体を調製し、5％CO2雰囲気下で細胞を一晩インキュベートする。翌朝に培地を交換し、培養物を再び10％CO2下におく。トランスフェクションから48〜60時間後に馴化培地を回収し、低速遠心（300×g、10分間）によって細胞片を除去した上で、孔径0.45μmのタンパク質低結合性フィルターを通過させる。
ベクター粒子を濃縮するためには、上記の通りに回収したプール馴化培地を20％スクロース溶液（PBS中）の上に重層し、ベックマン（Beckman）SW28ローターにより50,000×gで90分間遠心する。30〜60分間のインキュベーションおよび丁寧なピペッティングによってペレットを1〜4mlのPBS中に再懸濁し、再びベックマンSW55ローターにより50,000×gで90分間遠心する。ペレットを最小容積（20〜50μl）のPBS中に再懸濁し、そのまま感染用に用いるか、または凍結アリコートとして-80℃で保存する。
濃縮したレンチウイルスベクターの力価を判定し、感染多重度1,000で適切な細胞系のトランスフェクションに用いる（例えば、293細胞、Hela細胞、ラット208F線維芽細胞）。外因性タンパク質を発現するクローン的に選択した細胞系の分析により、選択した細胞系がベクターの2つを上回る組み込まれたコピーを含むことが判明すると考えられる。これらの細胞系は、組み込まれたベクターの1つのコピーのみを含む細胞系よりも多くの外因性タンパク質を発現すると考えられる。
実施例21
Gタンパク質共役受容体の発現およびアッセイ
本実施例では、レトロウイルスベクターからのGタンパク質共役受容体タンパク質（GPCR）の発現について述べる。本実施例では、GPCRなどのようにアッセイが難しいタンパク質またはアッセイが存在しないタンパク質の発現のマーカーとしての、IRESからのシグナルタンパク質の発現についても述べる。遺伝子構築物（配列番号：34；図19）は、Gタンパク質共役受容体にIRES-シグナルペプチド-抗体軽鎖が続く形で、pLBCXレトロウイルス骨格のMCS中にクローニングされたものを含む。簡潔に述べると、GPCR-IRES-抗体軽鎖を含むPvuII/PvuII断片（3057bp）をpLBCXのStuI部位にクローニングした。pLBCXは、EM7（T7）プロモーター、ブラスチシジン遺伝子およびSV40ポリAを、pLNCXからのネオマイシン耐性遺伝子に代わって含む。
この遺伝子構築物を用いて複製能欠損レトロウイルスパッケージング細胞系を作製し、この細胞系を用いて複製能欠損レトロウイルスベクターを作製した。続いて、この細胞系から産生されたベクターを用いて293GP細胞（ヒト胚腎細胞）を感染させた。感染後に細胞をブラスチシジン選択条件下に置き、単細胞性ブラスチシジン耐性クローンを単離した。これらのクローンを抗体軽鎖の発現に関してスクリーニングした。上位12種の軽鎖発現性クローンを選択した。続いて、これらの12種の軽鎖発現性クローンを、リガンド結合アッセイを用いてGPCRの発現に関してスクリーニングした。12種の試料はすべて受容体タンパク質も発現した。クローン細胞系およびそれらの発現を表9に示す。
（表９）
Figure 2015043785
実施例22
複製能欠損レトロウイルスベクターによる293細胞の多重感染
本実施例では、レトロウイルスベクターによる細胞の複数回の連続的トランスフェクションについて述べる。複製能欠損レトロウイルスパッケージング細胞系の作製には以下の遺伝子構築物を用いた。
5' LTR＝モロニーマウス肉腫ウイルス5'の長い末端反復配列
EPR＝モロニーマウス白血病ウイルス伸長型パッケージング領域
Blast＝ブラスチシジン耐性遺伝子
CMV＝ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター
Gene＝被験タンパク質をコードする遺伝子
WPRE＝RNA移行因子
3' LTR＝モロニーマウス白血病ウイルス3' LTR
続いて、このパッケージング細胞系を用いて、以下の通りに複製能欠損レトロウイルスベクターを作製した。T150フラスコ内で増殖させた細胞からベクターを産生させて凍結した。凍結ベクターを各感染時に解凍した。感染#3に関しては、ベクターの濃縮溶液を感染に用いた。他のすべての感染は濃縮していないベクターを用いて行った。感染は、集密度30％の293細胞を含むT25フラスコに5mlのベクター/培地溶液を加えることにより、約5カ月間にわたって行った。感染期間中には8mg/mlのポリブレンもベクター溶液に含めた。このベクター溶液を細胞の上に加えて24時間おいた後に除去した。続いて、培地（10％ウシ胎仔血清を加えたDMEM）を細胞に添加した。細胞を完全に集密化するまで増殖させ、新たなT25フラスコに継代した。続いて細胞を集密度30％まで増殖させ、感染手順を再び行った。この工程を12回繰り返したが、その概要を以下の表10に示す。感染1、3、6、9および12の後の、継代後に残った細胞をDNA試料の採取に用いた。感染手順をさまざまな回数行った後に、細胞内のベクター挿入物の数に関する推定値を得るために、DNAをインベーダーアッセイを用いて分析した。その結果、ベクター挿入物の数は時間の経過とともに増加し、12回目の感染後が最も高レベルであったことが示された。0.5の値は、細胞1個当たりのベクター挿入物が1つの場合の平均値とほぼ同じであるため、12回の感染後にも平均ベクター挿入コピー数はまだ2に達していない。これらのデータは、細胞1個当たりの平均ベクターコピー数が1.5コピー/細胞未満であることを示している。また、感染#6から感染#9までは遺伝子コピー数に全く実際の変化はみられなかった。さらに、これらのデータは、標準的な低い感染多重度で行うトランスフェクションでは、レトロウイルスベクターの複数のコピーを細胞に導入できないことも示している。
（表１０）
Figure 2015043785
実施例23
YP抗体の産生
本実施例には、ウシ乳腺上皮細胞およびヒト腎臓線維芽細胞（293細胞）によるペスト菌抗体の産生を示す。細胞系にα-LA YPベクターを感染させた。いずれの細胞系もYP抗体を産生した。抗体のすべてに活性があり、重鎖および軽鎖はほぼ1：1の比で産生される。
実施例24
植物プロトプラストの形質導入
本実施例には、植物プロトプラストの形質導入のための方法を述べる。標準的な工程に従って、タバコ懸濁培養物からプチ・ハバナのタバコ（Nicotiana tabacum cv. Petit Havanna）のタバコプロトプラストを作製する（PotrykusおよびShillito、Methods in Enzymology、vol. 118、Plant Molecular Biology、A.およびH. Weissbach編、Academic Press、Orlando、1986）。6週齢の苗条培養物から完全に開いた葉を無菌条件下で採取し、以下の組成からなる酵素溶液で十分に湿潤させる：酵素溶液：H2O、70ml；スクロース、13g；マセロザイムR 10、1g；セルラーゼ、2g；「オノズカ（Onozuka）」R 10（ヤクルト（Yakult Co. Ltd.）、日本）ドリセラーゼ（Chemische Fabrik Schweizerhalle、Switzerland）、0.13g；および2(n-モルホリン)-エタンスルホン酸（MES）、0.5ml、pH 6.0。
続いて、葉を1〜2cm角の正方形に切り、これを上記の酵素溶液の上に浮かべる。それらを26℃で一晩暗所にてインキュベートする。続いてこの混合物をゆっくりと振盪しながら、消化が完了するまでさらに30分間インキュベートする。
この懸濁液をメッシュ幅100μmのスチール製篩いに通し、0.6Mスクロース（MES、pH 5.6）で十分にすすぎ洗いした後に、4000〜5000rpmで10分間遠心する。培地の表面に集まったプロトプラストを、例えば滅菌注射用シリンジを用いて、プロトプラストの下のものから分けて採取する。
このプロトプラストを、0.4Mスクロースを含むK3培地［スクロース（102.96g/l；キシロース（0.25g/l）；2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（0.10mg/l）；1-ナフチル酢酸（1.00mg/l）；6-ベンジルアミノプリン（0.20mg/l）；pH 5.8］（PotrykusおよびShillito、前記）中に再懸濁する。
形質転換実験を行うためには、プロトプラストをまずすべて洗浄し、計数した上で、単離したプロトプラストの高い生存率が確実に得られるW5培地［154mM NaCl、125mM CaCl2 x 2H2O、5mM KCl、5mMグルコース、pH 5.6）中に、1〜2.5×106個/mlの細胞密度で再懸濁する。6〜8℃で30分間インキュベートした後に、プロトプラストを形質導入実験に用いる。
プロトプラストを、植物特異的プロモーターによって駆動される関心対象のタンパク質をコードする偽型のレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）に対して曝露させる。ベクターは上記の通りに調製し、MOI 1,000で用いる。続いて、プロトプラストを新たなK3培地中に再懸濁する（10mlの新たなK3培地中に0.3mlのプロトプラスト溶液）。さらに、10mlの部分を直径10cmのペトリ皿に入れて24℃で暗所下にてインキュベーションを行い、プロトプラストの集団密度を4〜8×104個/mlとする。3日後に、培地を培養皿当たり0.3倍容量のK3培地で希釈し、インキュベーションを24℃でさらに4日間、3000ルクスの人工光の照射下で続ける。合計7日後に、プロトプラストから発生したクローンを、1％アガロースで固形化した50mg/lのカナマイシンを含む栄養培地中に包埋し、「ビーズ型」培養法に従って24℃で暗所下にて培養する（Shillitoら、Plant Cell Reports、2、244〜247（1983））。栄養培地は5日毎に新たな同じ栄養液と交換する。クローンの分析により、関心対象の遺伝子を発現するものが示される。
実施例25
細胞系におけるベクター挿入物の経時的な安定性
LN-CMV-Botベクターの遺伝子挿入物を含む2つの細胞系を、複数の継代を経た後にもベクター挿入物を維持する能力に関して、ネオマイシン選択を行った場合と行わなかった場合に分けて分析した。第1の細胞系は、少数の挿入コピーを含むウシ乳腺上皮細胞系である。第2の細胞系は、ベクター挿入物の複数のコピーを含む293GP系である。実験開始時に細胞培養物を分割した。これはウシ乳腺上皮細胞の場合は10回目の継代の時点であり、293GP細胞の場合は8回目の継代の時点であった。1件の試料はネオマイシン類似体G418を含む培地中で連続的に継代したが、他の培養物は抗生物質を含まない培地中で継代した。3〜6回の継代のたびに細胞を収集し、インベーダーアッセイを用いて遺伝子比を決定するためにDNAを単離した。細胞はT25フラスコ内で連続的に増殖させて継代した。アッセイの結果を以下に示す：
（表１１） 低遺伝子コピー細胞系
Figure 2015043785
（表１２） 高遺伝子コピー細胞系
Figure 2015043785
これらのデータは、G418で処理した細胞と抗生物質で処理しなかった細胞との間に、遺伝子比に関して一貫した差は認められないことを示している。このことは、ベクター遺伝子挿入物の安定性を維持するためにG418選択は必要でないことを示唆している。また、これらのベクター挿入物は時間経過に対して極めて安定であるように思われる。
上記の明細書中に引用したすべての刊行物および特許は参照として本明細書に組み入れられる。当業者には、発明の範囲および精神を逸脱することなく、本発明に記載の方法およびシステムに対するさまざまな修正および変更が明らかであると考えられる。本発明をその特定の態様とともに説明してきたが、請求する本発明がこのような特定の態様に過度に制限されるべきではないことが理解される必要がある。実際には、本発明の実施に関して説明した態様のさまざまな修正が、分子生物学、タンパク質発酵、生化学または関連分野の当業者には明らかであり、それらも発明の範囲に含まれるものとする。

Claims (102)

  1. ゲノムが少なくとも2つの組み込まれた組み込みベクター（integrated integrating vector）を含み、該組み込みベクターがプロモーターと機能的に結合した少なくとも1つの外因性遺伝子を含む、該ゲノムを含む宿主細胞。
  2. 組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項1記載の宿主細胞。
  3. 組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合したRNA安定化因子をさらに含む、請求項1記載の宿主細胞。
  4. 組み込みベクターが少なくとも2つの外因性遺伝子を含む、請求項1記載の宿主細胞。
  5. 少なくとも2つの外因性遺伝子が多シストロン性配列として配置される、請求項4記載の宿主細胞。
  6. 少なくとも2つの外因性遺伝子が少なくとも1つのリボソーム内部進入部位（internal ribosome entry site）によって隔てられている、請求項5記載の宿主細胞。
  7. 2つの外因性遺伝子が多シストロン性配列として配置される、請求項5記載の宿主細胞。
  8. 2つの外因性遺伝子が免疫グロブリン分子の重鎖および免疫グロブリン分子の軽鎖をコードする、請求項7記載の宿主細胞。
  9. 少なくとも2つの外因性遺伝子の1つが選択マーカーである、請求項4記載の宿主細胞。
  10. 組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項1記載の宿主細胞。
  11. レトロウイルスベクターが偽型のレ（psuedotyped）トロウイルスベクターである、請求項10記載の宿主細胞。
  12. 偽型のレトロウイルスベクターがG糖タンパク質を含む、請求項11記載の宿主細胞。
  13. G糖タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラ（Mokola）ウイルスのG糖タンパク質からなる群より選択される、請求項12記載の宿主細胞。
  14. レトロウイルスベクターが、MoMLV、MoMuSVおよびMMTVの末端反復配列からなる群より選択される末端反復配列を含む、請求項10記載の宿主細胞。
  15. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項11記載の宿主細胞。
  16. レンチウイルスベクターが、HIVおよびウマ伝染性貧血ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される末端反復配列を含む、請求項15記載の宿主細胞。
  17. インビトロ培養およびインビボ培養からなる群より選択される培養系に存在する、請求項1記載の宿主細胞。
  18. チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項1記載の宿主細胞。
  19. クローン由来である、請求項1記載の宿主細胞。
  20. 非クローン由来である、請求項1記載の宿主細胞。
  21. ゲノムが10回を上回る継代に対して安定である、請求項1記載の宿主細胞。
  22. ゲノムが50回を上回る継代に対して安定である、請求項21記載の宿主細胞。
  23. ゲノムが100回を上回る継代に対して安定である、請求項21記載の宿主細胞。
  24. 組み込まれた外因性遺伝子が、選択がなされない状態で安定である、請求項1記載の宿主細胞。
  25. プロモーターが、α-ラクトアルブミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、およびモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される、請求項1記載の宿主細胞。
  26. 少なくとも1つの外因性遺伝子が、抗原結合タンパク質、医薬用タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、核酸結合タンパク質、膜受容体タンパク質、シグナル伝達タンパク質、イオンチャネルタンパク質および腫瘍性タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の宿主細胞。
  27. ゲノムが少なくとも3つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
  28. ゲノムが少なくとも4つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
  29. ゲノムが少なくとも5つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
  30. ゲノムが少なくとも7つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
  31. ゲノムが少なくとも10個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
  32. ゲノムが少なくとも20個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
  33. ゲノムが少なくとも1000個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
  34. 第1の外因性遺伝子を含む第1の組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピー、および第2の外因性遺伝子を含む第2の組み込みベクターの少なくとも1つの組み込まれたコピーをさらに含む、請求項1記載の宿主細胞。
  35. 宿主細胞が1日当たり約10ピコグラムを上回る外因性タンパク質を発現する、請求項1記載の宿主細胞。
  36. 宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、
    1）a）ゲノムを含む宿主細胞、および
    b）複数の組み込みベクター
    を提供する段階；ならびに
    2）少なくとも2つの組み込みベクターが該宿主細胞の該ゲノムに組み込まれる条件下で、該宿主細胞を該複数の組み込みベクターと接触させる段階
    を含む方法。
  37. 条件が、10を上回る感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項36記載の方法。
  38. 条件が、約10〜1000の感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項36記載の方法。
  39. 少なくとも3つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
  40. 少なくとも4つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
  41. 少なくとも5つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
  42. 少なくとも7つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
  43. 少なくとも10個の組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
  44. 組み込みベクターが、プロモーターと機能的に結合した少なくとも1つの外因性遺伝子を含む、請求項36記載の方法。
  45. 組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナルをさらに含む、請求項36記載の方法。
  46. 組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合したRNA安定化因子をさらに含む、請求項36記載の方法。
  47. 組み込みベクターが少なくとも2つの外因性遺伝子を含む、請求項36記載の方法。
  48. 少なくとも2つの外因性遺伝子が多シストロン性配列中に配置される、請求項47記載の方法。
  49. 組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項36記載の方法。
  50. レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項49記載の方法。
  51. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項49記載の方法。
  52. レンチウイルスベクターが、G糖タンパク質を含む偽型のレンチウイルスベクターである、請求項51記載の方法。
  53. 宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項36記載の方法。
  54. トランスフェクトされた宿主細胞をクローン的に（clonally）選択する段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
  55. 2つの組み込みベクターのそれぞれが異なる外因性遺伝子を含む、少なくとも2つの組み込みベクターを該宿主細胞にトランスフェクトする段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
  56. 関心対象のタンパク質を産生する方法であって、
    1）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む、少なくとも1つの組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、該外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、該ゲノムを含む宿主細胞を提供する段階、および
    2）該関心対象のタンパク質が産生される条件下で、該宿主細胞を培養する段階
    を含む方法。
  57. 組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項56記載の方法。
  58. 段階3）関心対象のタンパク質を単離する段階
    をさらに含む、請求項56記載の方法。
  59. 条件が、回転瓶培養、灌流培養、流加培養（batch fed culture）およびペトリ皿培養からなる群より選択される、請求項57記載の方法。
  60. 宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの3つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
  61. 宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの4つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
  62. 宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの5つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
  63. 宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの7つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
  64. 宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの10個を上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
  65. 宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの約2個〜20個の組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
  66. 宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの約3個〜10個の組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
  67. 組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項56記載の方法。
  68. レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項67記載の方法。
  69. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項67記載の方法。
  70. 宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項56記載の方法。
  71. 宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約1ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項56記載の方法。
  72. 宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約10ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項56記載の方法。
  73. 宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約50ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項56記載の方法。
  74. 細胞をクローン的に選択する、請求項56記載の方法。
  75. 化合物のスクリーニングのための方法であって、
    1）a）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む、少なくとも1つの組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、該外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、該ゲノムを含む宿主細胞；および
    b）1つまたは複数の被験化合物
    を提供する段階；
    2）該関心対象のタンパク質が発現される条件下で、該宿主細胞を培養する段階；
    3）宿主細胞を該1つまたは複数の被験化合物で処理する段階；ならびに
    4）該宿主細胞における該被験化合物に対する反応の存在に関してアッセイする段階
    を含む方法。
  76. 外因性遺伝子が、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項75記載の方法。
  77. 宿主細胞がレポーター遺伝子をさらに含む、請求項76記載の方法。
  78. レポーター遺伝子が、緑色蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびβ-ラクタマーゼからなる群より選択される、請求項77記載の方法。
  79. アッセイの段階が、レポーター遺伝子からのシグナルを検出する段階をさらに含む、請求項75記載の方法。
  80. 宿主のゲノムが少なくとも2つの組み込みベクターを含み、該少なくとも2つの組み込みベクターのそれぞれが、異なる外因性遺伝子を含む、請求項75記載の方法。
  81. 組み込みベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項75記載の方法。
  82. 宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項75記載の方法。
  83. タンパク質の機能を比較するための方法であって、
    1）a）第1の外因性遺伝子が第1の関心対象のタンパク質をコードし、該第1の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む、第1の組み込みベクターを含む第1の宿主細胞、および
    b）第2の外因性遺伝子が、第1の関心対象のタンパク質の変種（variant）である第2のタンパク質をコードし、該第2の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む第2の組み込みベクターを含む、少なくとも第2の宿主細胞
    を提供する段階；
    2）該第1および第2の関心対象のタンパク質が産生される条件下で、該宿主細胞を培養する段階；ならびに
    3）該第1および第2の関心対象のタンパク質の活性を比較する段階
    を含む方法。
  84. 外因性遺伝子が、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、細胞周期タンパク質、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項83記載の方法。
  85. 第1および第2の関心対象のタンパク質が、単一のヌクレオチド多型により異なる、請求項83記載の方法。
  86. 第1および第2の関心対象のタンパク質の同一性が95％を上回る、請求項83記載の方法。
  87. 第1および第2の関心対象のタンパク質の同一性が90％を上回る、請求項83記載の方法。
  88. 第1および第2の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの3つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項83記載の方法。
  89. 第1および第2の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの4つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項83記載の方法。
  90. 第1および第2の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの5つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項83記載の方法。
  91. 組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項83記載の方法。
  92. レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項91記載の方法。
  93. レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項91記載の方法。
  94. 1）a）少なくとも1つの組み込まれた外因性遺伝子を含むゲノムを含む、宿主細胞；および
    b）複数の組み込みベクター
    を提供する段階；ならびに
    2）該組み込みベクターの少なくとも2つが該宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、該宿主細胞を該複数の組み込みベクターと接触させる段階
    を含む方法。
  95. 組み込まれた外因性遺伝子が組み込みベクターを含む、請求項94記載の方法。
  96. 宿主細胞をクローン的に選択する、請求項94記載の方法。
  97. 宿主細胞を非クローン的に選択する、請求項94記載の方法。
  98. 条件が、10を上回る感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項94記載の方法。
  99. 条件が、約10から1000の感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項94記載の方法。
  100. 少なくとも3つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項94記載の方法。
  101. 組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項94記載の方法。
  102. レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項101記載の方法。
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