ES2389141T3 - Células huésped que contienen vectores de integración múltiple - Google Patents

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Abstract

Una célula huésped obtenida por selección clonal que comprende un genoma, en el que dicho genomacomprende al menos 10 copias de un vector retroviral seudotipado, en la que dicho vector retroviral comprende almenos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor interno a las repeticiones terminales largas 5' y 3' dedicho vector retroviral, en el que dicho gen codifica una proteína secretada, en el que dicha célula huésped secaracteriza porque sintetiza al menos 1 picogramo de dicha proteína exógena al día.

Description

Células huésped que contienen vectores de integración múltiple
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de proteínas en células huésped y, más particularmente, a células huésped que contienen múltiples copias integradas de un vector de integración.
Antecedentes de la invención
La industria de la biotecnología farmacéutica se basa en la producción de proteínas recombinantes en células de mamífero. Estas proteínas son esenciales para el tratamiento terapéutico de muchas enfermedades y afecciones. En muchos casos, el mercado para estas proteínas supera un billón de dólares al año. Ejemplos de proteínas producidas de forma recombinante en células de mamífero incluyen eritropoyetina, factor VIII, factor IX e insulina. Para muchas de estas proteínas, se prefiere la expresión en células de mamífero sobre expresión en células procariotas dada la necesidad de una modificación postraduccional correcta (p. ej., glicosilación o silación; véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.721.121, incorporada en el presente documento por referencia).
Se conocen varios procedimientos para crear células huésped que expresen proteínas recombinantes. En los procedimientos más básicos, se introduce en la célula huésped una construcción de ácido nucleico que contiene un gen que codifica una proteína heteróloga y regiones reguladoras adecuadas y se deja integrar. Los procedimientos de introducción incluyen precipitación en fosfato cálcico, microinyección, lipofección y electroporación. En otros procedimientos se usa un esquema de selección para amplificar la construcción de ácido nucleico introducida. En estos procedimientos, las células se co-transfeccionan con un gen que codifica un marcador de selección amplificable y un gen que codifica una proteína heteróloga (véase, por ejemplo, Schroder y Friedl, Biotech. Bioeng. 53(6):547-59 [1997]). Tras la selección de los transformantes iniciales, los genes transfeccionados se amplifican mediante incremento escalonado del agente selectivo (p. ej., dihidrofolato reductasa) en el medio de cultivo. En algunos casos, el gen exógeno se puede amplificar varios cientos de veces mediante estos procedimientos. Otros procedimientos de expresión proteica recombinante en células de mamífero usan transfección con vectores episomales (p. ej., plásmidos).
Los procedimientos actuales para crear líneas celulares de mamífero para la expresión de proteínas recombinantes sufren serios inconvenientes. (Véase, por ejemplo, Mielke, y col., Biochem. 35:2239-52 [1996]). Los sistemas episomales permiten niveles elevados de expresión de la proteína recombinante pero con frecuencia solo son estables durante un corto periodo de tiempo (véase, por ejemplo, Klehr y Bode, Mol. Genet. (Life Sci. Adv.) 7:47-52 [1988]). Las líneas celulares de mamífero que contienen genes exógenos integrados son algo más estables, pero hay cada vez más pruebas de que la estabilidad depende de la presencia de únicamente unas pocas copias, o incluso una sola copia, del gen exógeno.
Las técnicas de transfección estándar favorecen la introducción de múltiples copias del transgen en el genoma de la célula huésped. En muchos casos se ha demostrado que la integración múltiple del transgen es intrínsecamente inestable. Esta inestabilidad intrínseca puede deberse al característico modo de integración cabeza-cola que estimula la pérdida de secuencias de codificación mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, Weidle y col., Gene 66:193-203 [1988]) especialmente cuando se transcriben los transgenes (véase, por ejemplo, McBumey y col., Somatic Cell Molec. Genet. 20:529-40 [1994]). Las células huésped también tienen mecanismos de defensa epigenéticos dirigidos a múltiples acontecimientos de integración de copias. En plantas, este mecanismo se ha denominado “co-supresión”. (Véase, por ejemplo, Allen y col., Cell 5:603-13, (1993). De hecho, no es infrecuente que el nivel de expresión esté inversamente relacionado con el número de copias. Estas observaciones son consistentes con los hallazgos de que múltiples copias de genes exógenos se inactivan mediante metilación (véase, por ejemplo, Mehtali y col., Gene 91:179-84 [1990]) y la posterior mutagénesis (véase, por ejemplo, Kricker y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1075-79 [1992]) o silenciarse mediante formación de heterocromatina (véase, por ejemplo, Dorer y Henikoff, Cell 77:993-1002 [1994]).
De acuerdo con esto, en la técnica se necesitan procedimientos mejorados para fabricar células huésped que expresen proteínas recombinantes. Preferentemente, las células huésped serán estables durante periodos extendidos de tiempo y expresan la proteína codificada por un transgen a niveles elevados.
Sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a la producción de proteínas en células huésped y, más particularmente, a células huésped que contienen múltiples copias integradas de un vector de integración. La presente divulgación no está limitada a células huésped transfeccionadas con un número concreto de vectores de integración. De hecho, se pueden concebir células huésped que contienen un amplio abanico de vectores de integración. En algunos casos, una célula huésped puede comprender un genoma que contiene, preferentemente, al menos aproximadamente dos vectores de integración integrados. En otras realizaciones más, el genoma comprende, preferentemente, al menos 3 vectores de integración integrados y, lo más preferentemente, al menos 4 vectores de integración integrados, 5 vectores de integración integrados, 6 vectores de integración integrados, 7
vectores de integración integrados, 10 vectores de integración integrados, 15 vectores de integración integrados, 20 vectores de integración integrados o 50 vectores de integración integrados.
Las células huésped no se limitan a contener vectores que codifican una única proteína de interés seleccionada (es decir, proteína exógena). De hecho, se contempla que las células huésped se transfeccionen con vectores que codifican múltiples proteínas de interés secretadas.
En algunas realizaciones, el vector de integración comprende al menos dos genes exógenos. En otras realizaciones, los al menos dos genes exógenos están dispuestos en una secuencia policistrónica. En otras realizaciones más, los al menos dos genes exógenos están separados por un sitio interno de entrada al ribosoma. En otras realizaciones, los al menos dos genes exógenos están dispuestos en una secuencia policistrónica. En otras realizaciones más, los dos genes exógenos comprenden una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina y una cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina. En otras realizaciones, uno de los al menos dos genes exógenos es un marcador seleccionable. En otras realizaciones más, las células huésped comprenden al menos 2 copias integradas de un primer vector de integración que comprende un primer gen exógeno y al menos 1 copia integrada de un segundo vector de integración u otro vector que comprende un segundo gen exógeno. En otras realizaciones más, las células huésped comprenden al menos 10 copias integradas de un primer vector de integración que comprende un primer gen exógeno y al menos 1 copia integrada de un segundo vector de integración u otro vector que comprende un segundo gen exógeno.
En algunas realizaciones preferidas, los vectores de integración comprenden al menos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor. La presente divulgación no está limitada a vectores que contienen un promotor concreto. De hecho se contemplan varios promotores. En algunas realizaciones, el promotor se selecciona del grupo constituido por el promotor de alfa-lactoalbúmina, el promotor de citomegalovirus y la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney. En otras realizaciones, los vectores de integración comprenden además una señal de secreción unida funcionalmente al gen exógeno. En otras realizaciones más, los vectores de integración comprenden además un elemento de exportación de ARN unido funcionalmente al gen exógeno.
La presente divulgación no está limitada a un vector de integración concreto. De hecho se contemplan varios vectores de integración. En algunas realizaciones, el vector de integración se selecciona del grupo que consiste en un vector retroviral, un vector lentiviral y un vector transposón. En algunas realizaciones preferidas, el vector retroviral es un vector retroviral seudotipado. En otras realizaciones preferidas, el vector retroviral seudotipado comprende una glicoproteína G. Los vectores retrovirales no están limitados a una glicoproteína G concreta. De hecho se contemplan varias glicoproteínas G. En algunas realizaciones, la glicoproteína G se selecciona del grupo que consiste en las glicoproteínas G del virus de la estomatitis vesicular, el virus Piry, el virus Chandipura, la viremia primaveral del virus de la carpa y del virus de Mokola. En otras realizaciones más, el vector retroviral comprende repeticiones terminales largas. Los vectores retrovirales no están limitados a una LTR concreta. De hecho se contemplan varias LTR, incluidas, entre otras, las repeticiones terminales largas MoMLV, MoMuSV, MMTV.
En otras realizaciones, el vector retroviral es un vector lentiviral. En algunas realizaciones preferidas, el vector lentiviral está seudotipado. En algunas realizaciones particularmente preferidas, el vector lentiviral comprende una glicoproteína G. En otras realizaciones más, la glicoproteína G se selecciona del grupo que consiste en las glicoproteínas G del virus de la estomatitis vesicular, el virus Piry, el virus Chandipura, la viremia primaveral del virus de la carpa y del virus de Mokola. En otras realizaciones más, el vector lentiviral comprende repeticiones terminales largas seleccionadas del grupo constituido por las repeticiones terminales largas del VIH y del virus de la anemia infecciosa equina.
La presente divulgación no está limitada a una célula huésped concreta. De hecho se contemplan varias células huésped. En algunas realizaciones, la célula huésped se cultiva in Vitro. En otras realizaciones más, la célula huésped se selecciona de células de ovario de hámster chino, células renales de cría de hámster y células epiteliales mamarias bovinas. En algunas realizaciones preferidas, las células huésped se derivan clonalmente. En otras realizaciones, las células huésped no se derivan clonalmente. En algunas realizaciones, el genoma de la célula huésped es estable durante más de 10 pases. En otras realizaciones, el genoma es estable durante más de 50 pases, mientras que en otras realizaciones más, el genoma es estable durante más de 100 pases. En otras realizaciones más, las células huésped pueden ser una célula madre embrionaria (no humana), oocito o embrión. En algunas realizaciones, el vector integrado es estable en ausencia de selección.
La presente divulgación no está limitada a vectores que codifican una proteína concreta de interés. De hecho se contemplan vectores que codifican varias proteínas de interés codificadas por genes exógenos. En algunas realizaciones, la proteína de interés se selecciona del antígeno de superficie de la hepatitis B, el anticuerpo MN14, el anticuerpo LL2, el anticuerpo contra la toxina botulínica y cc49IL2. En algunas realizaciones, los genes que codifican la proteína de interés carecen de intrones, mientras que en otras realizaciones, los genes que codifican la proteína de interés incluyen al menos un intrón.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para transfeccionar o transducir células huésped que comprenden: 1) proporcionar: a) una célula huésped que comprende un genoma, y b) una pluralidad de vectores de integración; y 2) poner en contacto la célula huésped con la pluralidad de vectores de integración en condiciones
tales que al menos dos vectores de integración se integran en el genoma de la célula huésped. En algunas realizaciones, las condiciones comprenden poner en contacto las células huésped a una multiplicidad de infección superior a 10. En otras realizaciones, las condiciones comprenden poner en contacto las células huésped a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10 a 1.000.000. En otras realizaciones más, las condiciones comprenden poner en contacto las células huésped a una multiplicidad de infección de aproximadamente 100 a
10.000. En otras realizaciones más, las condiciones comprenden poner en contacto las células huésped a una multiplicidad de infección de aproximadamente 100 a 1.000. En otras realizaciones más, el procedimiento comprende además transfeccionar dichas células huésped con al menos dos vectores de integración, en el que cada uno de dichos dos de integración comprende un gen exógeno diferente. En otras realizaciones más, las condiciones comprenden la transfección o transducción en serie o células huésped en las que las células huésped se transfeccionan o transducen en al menos una primera transfección o transducción con un vector que codifica una proteína de interés y, después, se vuelve a transfeccionar o transducir en une etapa de transfección o transducción distinta.
La presente divulgación proporciona además un procedimiento de producir una proteína seleccionada de interés, que comprende: 1) proporcionar una célula huésped que comprende un genoma, en el que el genoma comprende al menos dos copias integradas de al menos un vector de integración que comprende un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor, en el que el gen exógeno codifica una proteína de interés, y 2) cultivar las células huésped en condiciones tales que se produce la proteína secretada de interés. En algunas realizaciones preferidas, el vector de integración comprende además una secuencia señal de secreción unida funcionalmente a dicho gen exógeno. En otras realizaciones, los procedimientos comprenden además le etapa 3) de aislar la proteína de interés. La presente invención no está limitada a ningún sistema de cultivo concreto. De hecho se contemplan varios sistemas de cultivo, incluidos, entre otros, cultivos en frasco giratorio, cultivos en perfusión, cultivos de alimentación semidiscontinua y cultivos en placas petri. En algunas realizaciones, la línea celular se selecciona clonalmente, mientras que en otras realizaciones, las células no se seleccionan clonalmente.
Los procedimientos de la presente divulgación no están limitados a células huésped que contienen un número concreto de vectores de integración. De hecho, en algunas realizaciones, el genoma de la célula huésped comprende más de 3 copias integradas del vector de integración; en otras realizaciones, el genoma de la célula huésped comprende más de 4 copias integradas del vector de integración; en otras realizaciones más, el genoma de la célula huésped comprende más de 5 copias integradas del vector de integración; en realizaciones adicionales, el genoma de la célula huésped comprende más de 7 copias integradas del vector de integración. En otras realizaciones más, el genoma de la célula huésped comprende más de 10 copias integradas del vector de integración (que es el principal objeto de la invención). En otras realizaciones, el genoma de la célula huésped comprende entre aproximadamente 2 y 20 copias integradas del vector de integración. En algunas realizaciones, el genoma de la célula huésped comprende entre aproximadamente 3 y 10 copias integradas del vector de integración.
Los procedimientos de la presente divulgación no están limitados a ningún vector de integración concreto. De hecho, se contempla el uso de varios vectores de integración. En algunas realizaciones, el vector de integración es un vector retroviral. En otras realizaciones, el vector retroviral es un vector retroviral seudotipado. En otras realizaciones, el vector retroviral es un vector lentiviral.
Los procedimientos de la presente divulgación no están limitados al uso de ninguna célula huésped concreta. De hecho, se contempla el uso de varias células huésped, incluidas, entre otras, células de ovario de hámster chino, células renales de cría de hámster, células epiteliales de mamífero bovino, oocitos, embriones, células madre y células madre embrionaria.
Los procedimientos de la presente divulgación no están limitados a la producción de ninguna cantidad concreta de proteína exógena (es decir, proteína de interés secretada) de las células huésped. De hecho, se contempla que varios niveles de expresión son aceptables a partir de los procedimientos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, las células huésped sintetizan más de aproximadamente 1 picogramo por célula al día de la proteína de interés. En otras realizaciones, las células huésped sintetizan más de aproximadamente 10 picogramos por célula al día de la proteína de interés. En otras realizaciones más, las células huésped sintetizan más de aproximadamente 50 picogramos por célula al día de la proteína de interés.
En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un procedimiento para seleccionar compuestos, que comprende: 1) proporcionar a) una célula huésped que comprende un genoma, en el que el genoma comprende al menos dos copias integradas de al menos un vector de integración que comprende un gen exógeno que codifica una proteína de interés secretada; y b) uno o más compuestos de ensayo; 2) cultivar las células huésped en condiciones tales que se expresa la proteína secretada de interés; 3) tratar las células huésped con uno o más compuestos de ensayo; y 4) analizar la presencia o ausencia de una respuesta en las células huésped al compuesto de ensayo. En algunas realizaciones, el gen exógeno codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por proteínas indicadoras, proteínas del receptor de membrana, proteínas de unión a ácido nucleico, proteínas del receptor citoplásmico, proteínas de canales iónicos, proteínas de transducción de señal, proteína quinasas, proteína fosfatasas y proteínas codificadas por oncogenes.
En otras realizaciones más, la célula huésped comprende además un gen indicador. En otras realizaciones, el gen indicador se selecciona del grupo constituido por la proteína fluorescente verde, la luciferasa, la beta-galactosidasa y la beta-lactamasa. En algunas realizaciones, la etapa de ensayo comprende además detectar una señal procedente del gen indicador. En otras realizaciones, el genoma de la célula huésped comprende al menos dos vectores de integración, comprendiendo cada uno de ellos un gen exógeno diferente.
En otras realizaciones más, la presente divulgación proporciona procedimientos para comparar la actividad proteica que comprenden: 1) Proporcionar a) una primera célula huésped que comprende un primer vector de integración que comprende un promotor unido funcionalmente a un primer gen exógeno, en el que el primer gen exógeno codifica una primera proteína de interés secretada, y b) al menos una segunda célula huésped que comprende un segundo vector de integración que comprende un promotor unido funcionalmente a un segundo gen exógeno, en el que el segundo gen exógeno codifica un segundo gen exógeno que es una variante de la primera proteína de interés secretada; 2) Cultivar las células huésped en condiciones tales que se producen la primera y la segunda proteína secretada de interés; y 3) comparar la actividad de la primera y la segunda proteína secretada de interés.
En algunas realizaciones, el gen exógeno codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por proteínas del receptor de membrana, proteínas de unión a ácido nucleico, proteínas del receptor citoplásmico, proteínas de canales iónicos, proteínas de transducción de señal, proteína quinasas, proteína fosfatasas, proteínas del ciclo celular y proteínas codificadas por oncogenes. En algunas realizaciones, la primera y la segunda proteína de interés difieren en un único aminoácido. En otras realizaciones más, la primera y la segunda proteínas de interés tienen una identidad superior al 95 %, preferentemente una identidad superior al 90 % y lo más preferentemente una identidad superior al 80 %.
En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona procedimientos, que comprenden: 1) proporcionar: a) una célula huésped que comprende un genoma que comprende al menos un gen exógeno integrado; y b) una pluralidad de vectores de integración; y 2) poner en contacto la célula huésped con la pluralidad de vectores de integración en condiciones tales que al menos dos vectores de integración se integran en el genoma de la célula huésped. En algunas realizaciones, el gen exógeno integrado comprende un vector de integración. En otras realizaciones, la célula huésped se selecciona clonalmente. En realizaciones alternativas, la célula huésped no se selecciona clonalmente.
En otras realizaciones más, la presente divulgación proporciona procedimientos de detectar indirectamente la expresión de una proteína de interés que comprende proporcionar una célula huésped transfeccionada con un vector que codifica una secuencia policistrónica, en los que la secuencia policistrónica comprende una proteína señal y una proteína de interés unidas funcionalmente por una IRES, y cultivar las células huésped en condiciones tales que se producen la proteína señal y la proteína de interés, en los que la presencia de la proteína señal indica la presencia de la proteína de interés. Los procedimientos de la presente divulgación no están limitados a la expresión de ninguna proteína de interés concreta. De hecho, se contempla la expresión de varias proteínas de interés, incluidas, entre otras, receptores acoplados a proteína G. La presente divulgación no está limitada al uso de ninguna proteína señal concreta. De hecho se contempla el uso de varias proteínas señal, incluidas, entre otras, las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, la beta-galactosidasa, la beta-lactamasa, la proteína fluorescente verde y la luciferasa. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína señal y la proteína de interés está dirigida por el mismo promotor y la proteína señal y la proteína de interés se transcriben como una única unidad transcripcional.
Descripción de las figuras
La Figura 1 es una transferencia Western de una carrera en gel de SDS-PAGE al 15 % en condiciones desnaturalizantes y sondado con IgG (Fc) anti-humana e IgG (Kappa) anti-humana. La Figura 2 es un gráfico de la expresión de MN14 en el tiempo. La Figura 3 es una transferencia Western de una carrera en gel de SDS-PAGE al 15 % en condiciones no desnaturalizantes y sondado con IgG (Fc) anti-humana e IgG (Kappa) anti-humana. La Figura 4 proporciona la secuencia para el promotor híbrido humano-bovino de la alfa-lactoalbúmina (SEC ID Nº 1). La Figura 5 proporciona la secuencia de la secuencia de PPE mutado (SEC ID Nº 2). La Figura 6 proporciona la secuencia de la secuencia del péptido señal-IRES (SEC ID Nº 3). Las Figuras 7a y 7b proporcionan la secuencia del vector CMV MN14 (SEC ID Nº 4). Las Figuras 8a y 8b proporcionan la secuencia del vector CMV LL2 (SEC ID Nº 5). Las Figuras 9a-c proporcionan la secuencia del vector MMTV MN14 (SEC ID Nº 6). Las Figuras 10a-d proporcionan la secuencia del vector MN14 de alfa-lactoalbúmina (SEC ID Nº 7). Las Figuras 11a-c proporcionan la secuencia del vector Bot de alfa-lactoalbúmina (SEC ID Nº 8). Las Figuras 12a-b proporcionan la secuencia del vector LSRNL (SEC ID Nº 9). Las Figuras 13a-b proporcionan la secuencia del vector cc49IL2 de alfa-lactoalbúmina (SEC ID Nº 10). Las Figuras 14a-c proporcionan la secuencia del vector YP de alfa-lactoalbúmina (SEC ID Nº 11). La Figura 15 proporciona la secuencia de la secuencia del péptido señal de caseína-IRES (SEC ID Nº 12). Las Figuras 16a-c proporcionan la secuencia del vector LNBOTDC (SEC ID Nº 13). La Figura 17 proporciona un gráfico que representa la proporción génica del ensayo INVADER en líneas celulares con el promotor del CMV.
La Figura 18 proporciona un gráfico que representa la proporción génica en el ensayo INVADER en líneas celulares con el promotor de la alfa-lactoalbúmina. Las Figuras 19a-d proporcionan la secuencia de un vector retroviral que expresa un receptor acoplado a proteína G y la cadena ligera de anticuerpo.
Definiciones
Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen una serie de términos.
Como se usa en el presente documento, la expresión “célula huésped” se refiere a cualquier célula eucariótica (p. ej., células de mamífero, células de ave, células de anfibio, células vegetales, células de peces y células de insecto), localizadas in Vitro o in vivo.
Como se usa en el presente documento, la expresión “cultivo celular” se refiere a cualquier cultivo de células in vitro. Incluidas en esta expresión se encuentran las líneas celulares contiguas (p. ej., con un fenotipo inmortal), cultivos celulares primarios, líneas celulares finitas (p. ej., células no transformadas) y cualquier otra población celular mantenida in vitro, incluidos oocitos y embriones.
Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmico, cromosoma, virus, virión etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos control adecuados y que puede transferir secuencias génicas entre células. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.
Como se usa en el presente documento, la expresión “vector de integración” se refiere a un vector cuya integración o inserción en un ácido nucleico (p. ej., un cromosoma) se consigue mediante una integrasa. Ejemplos de “vectores de integración” incluyen, entre otros, vectores retrovirales, transposones y vectores de virus adenoasociados.
Como se usa en el presente documento, el término “integrado” se refiere a un vector que se inserta de forma estable en el genoma (es decir, en un cromosoma) de una célula huésped.
Como se usa en el presente documento, la expresión “multiplicidad de infección” o “MDI” se refiere a la proporción entre vectores de integración:células huésped usados durante la transfección o la traducción de células huésped. Por ejemplo, si se usan 1.000.000 vectores para transducir 100.000 células huésped, la multiplicidad de infección es
10. El uso de este término no se limita a acontecimientos que implican transducción, sino que en su lugar abarca la introducción de un vector en un huésped mediante procedimientos tales como lipofección, microinyección, precipitación en fosfato cálcico y electroporación.
Como se usa en el presente documento, el término “genoma” se refiere al material genético (p. ej., cromosomas) de un organismo.
La expresión “secuencia nucleotídica de interés” se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos (p. ej., ARN o ADN), cuya manipulación un experto en la técnica puede estimar deseable por cualquier razón (p. ej., tratar una enfermedad, conferir mejores calidez, expresión de una proteína de interés en una célula huésped, expresión de una ribozima etc.). Dichas secuencias de nucleótidos incluyen, entre otras, secuencias de codificación de genes estructurales (p. ej., genes indicadores, genes marcadores de selección, oncogenes, genes de resistencia a fármacos, factores de crecimiento etc.) y secuencias reguladoras no codificadoras que no codifican un ARNm o producto proteico (p. ej., secuencia promotora, secuencia de poliadenilación, secuencia de terminación, secuencia potenciadora etc.).
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína de interés” se refiere a una proteína codificada por un ácido nucleicos de interés.
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína señal” se refiere a una proteína que se expresa junto con una proteína de interés y que, cuando se detecta mediante un ensayo adecuado, proporciona pruebas indirectas de expresión de la proteína de interés. Ejemplos de proteína señal útiles en la presente invención incluyen, entre otras, las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, la beta-galactosidasa, la beta-lactamasa, la proteína fluorescente verde y la luciferasa.
Como se usa en el presente documento, la expresión “gen exógeno” se refiere a un gen que no está presente de forma natural en un organismo o célula huésped o que se introduce de forma artificial en un organismo o célula huésped.
El término “gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico (p. ej., ADN o ARN), que comprende secuencias de codificación necesarias para la producción de un polipéptido o precursor (p. ej., proinsulina). El polipéptido puede estar codificado por una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia de codificación siempre se conserven la actividad deseada o las propiedades funcionales (p. ej., actividad enzimática, unión del ligando, transducción de la señal, etc.) de l longitud completa o del fragmento. El término también abarca la región de codificación de un gen estructural e incluye las secuencias localizadas adyacentes a la región de
codificación en los extremos tanto 5’ como 3’ para una distancia de aproximadamente 1 kb o más en cualquier extremo de modo que el gen corresponda a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias localizadas en 5’ de la región de codificación y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5’ no traducidas. Las secuencias localizadas en 3’ o cadena abajo de la región de codificación y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 3’ no traducidas. El término “gen" abarca tanto ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región de codificación interrumpida con secuencias no codificantes denominadas “intrones” o “regiones intermedias” o “secuencias intermedias”. Los intrones son segmentos de un gen que se transcribe a ARN nuclear (ARNhn); los intrones pueden contener elementos reguladores, como los potenciadores. Los intrones se eliminan o “cortan” del tránscrito nuclear o primario; por tanto, los intrones no están en el tránscrito de ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia u ordenar los aminoácidos en un polipéptido naciente.
Como se usa en el presente documento, la expresión “expresión génica” se refiere al proceso de convertir la información genética codificada en un gen en ARN (p. ej., ARNm, ARNr, ARNt o ARNsn) mediante la “transcripción” del gen (es decir, mediante la acción enzimática de una ARN polimerasa) y para genes de codificación de proteínas, en la proteína mediante la “traducción” del ARNm. La expresión génica se puede regular en muchas etapas del proceso. La “regulación por aumento” o “activación” se refiere a la regulación que aumenta la producción de los productos de expresión génica (es decir, ARN o proteína), mientras que la “regulación por disminución” o “represión” se refieren a la regulación que disminuye la producción. Las moléculas (p. ej., factores de transcripción) que están implicadas en la regulación por aumento o la regulación por disminución a menudo se denominan “activadores” y “represores”, respectivamente.
Cuando en el presente documento se cita “secuencia de aminoácidos” para hacer referencia a una secuencia de aminoácidos de una molécula proteica natural, con “secuencia de aminoácidos” y términos similares, tales como “polipéptido” o “proteína” no se pretende limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada con la molécula proteica citada.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “molécula de ácido nucleico de codificación”, “secuencia de ADN de codificación”, “ADN de codificación”, “secuencia de ARN de codificación” y “ARN de codificación” se refieren al orden o la secuencia de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos a lo largo de una hebra de ácido desoxirribonucleico o ácido ribonucleico. El orden de estos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica (proteína). Por tanto, la secuencia de ADN o ARN codifica la secuencia de aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, el término “variante”, cuando se usa en referencia a una proteína, se refiere a proteínas codificadas por ácidos nucleicos parcialmente homólogos de modo que la secuencia de aminoácidos de las proteínas varía. Como se usa en el presente documento, el término “variante” abarca proteínas codificadas por genes homólogos que tienen sustituciones conservadoras y no conservadoras que no tienen como resultado un cambio en la función proteica, así como proteínas codificadas por genes homólogos que tienen sustituciones de aminoácidos que disminuyen la función proteica (p. ej., mutaciones nulas) o incrementan la función proteica.
Como se usa en el presente documento, los términos “complementario” o “complementariedad” se usan en referencia a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, para la secuencia "A-G-T," es complementaria a la secuencia "T-C-A." La complementariedad puede ser “parcial”, en la que sólo algunas de las bases nucleotídicas están apareadas de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases. O puede haber complementariedad “completa” o “total” entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre hebras de ácido nucleico. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los procedimientos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.
El término “homología” y “ porcentaje de identidad”, cuando se usa en relación a los ácidos nucleicos se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber homología parcial (es decir, identidad parcial) u homología completa (es decir, identidad completa). Una secuencia parcialmente complementaria es una que inhibe al menos parcialmente la hibridación de una secuencia completamente complementaria con una secuencia de ácido nucleico y se denomina usando la expresión funcional “sustancialmente homólogo”. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria con la secuencia diana se puede analizar usando un ensayo de hibridación (de transferencia Southern o Northern, hibridación en solución y similares) en condiciones de rigurosidad baja. Una secuencia o sonda sustancialmente homóloga (es decir, un oligonucleótido que es capaz de hibridar con otro oligonucleótido de interés) competirá e inhibirá la unión (es decir, la hibridación) de una secuencia completamente homóloga a una secuencia diana en condiciones de rigurosidad baja. Cabe mencionar que las condiciones de rigurosidad baja son tales que se permita la unión inespecífica; las condiciones de rigurosidad baja requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión inespecífica puede analizarse mediante el uso de una segunda diana que carece de incluso un grado parcial de complementariedad (es decir, una identidad inferior a aproximadamente el 30 %); en ausencia de unión inespecífica, la sonda no hibridará con la segunda diana no complementaria.
En la técnica se sabe que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para comprender condiciones de rigurosidad baja; se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (ADN, ARN, composición en bases) de la sonda y la naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición en bases, presente en solución o inmovilizados etc.) y la concentración de las sales y otros componentes (p. ej., la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) y la solución de hibridación se puede variar para generar condiciones de hibridación de rigurosidad baja diferentes, pero equivalentes, de las condiciones enumeradas anteriormente. Además, en la técnica se conocen condiciones que estimulan la hibridación en condiciones de rigurosidad alta (p. ej., incrementar la temperaturas de la hibridación y/o etapas de lavado, el uso de formamida en la solución de hibridación etc.).
Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico bicatenario, tal como un ADNc o clon genómico, la expresión “sustancialmente homólogo” se refiere a cualquier sonda que pueda hibridar con una o ambas hebras de la secuencia de ácido nucleico bicatenario en condiciones de baja rigurosidad, como se ha descrito anteriormente.
Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico monocatenario, la expresión “sustancialmente homólogo” se refiere a cualquier sonda que pueda hibridar ( es decir, es la complementaria de) con la secuencia de ácido nucleico bicatenario en condiciones de baja rigurosidad, como se ha descrito anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término “hibridación” se usa con referencia al emparejamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de la hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) están influidas por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos), la rigurosidad de las condiciones implicadas y la Tm del híbrido formado y la proporción G:C dentro de los ácidos nucleicos. Se dice que una molécula sencilla que contiene apareamiento de ácidos nucleicos complementarios dentro de su estructura se “autohibrida”.
Como se usa en el presente documento, el término “Tm” se usa con referencia a la “temperatura de fusión” de un ácido nucleico. La temperatura de fusión es la temperatura a la que la población de moléculas de ácido nucleico bicatenario se disocia a la mitad en hélices únicas. La ecuación para calcular la Tm de ácidos nucleicos. Como se indica por referencias convencionales, una estimación simple del valor Tm se puede calcular con la ecuación: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C), cuando un ácido nucleico está en solución acuosa a NaCl 1 M (véase, por ejemplo, Anderson y Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985). Otras referencias incluyen cálculos más sofisticados que tienen en cuenta características estructurales, así como características de secuencia para el cálculo de Tm.
Como se usa en el presente documento, el término “rigurosidad” se usa con referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica y presencia de otros compuestos, tales como disolventes orgánicos, en las que se realizan las hibridaciones de ácidos nucleicos. En condiciones de “alta rigurosidad”, el emparejamiento de bases de ácidos nucleicos tendrá lugar solamente entre fragmentos de ácido nucleico que tienen una alta frecuencia de secuencias de bases complementarias. Por tanto, a menudo se requieren condiciones de rigurosidad “débil” o “baja” con ácidos nucleicos que derivan de organismos que son genéticamente diversos, ya que la frecuencia de las secuencias de complementariedad suele ser menor.
"Condiciones de rigurosidad alta”, cuando se usan en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos, comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH2PO4 H2O y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,5 % de SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100 μg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón seguido de lavado en una solución que comprende 0,1X SSPE, 1,0 % SDS a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.
"Condiciones de rigurosidad media”, cuando se usan en referencia a la hibridación de ácidos nucleicos, comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH2PO4 H2O y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,5 % de SDS, 5X reactivo de Denhardt y 100 μg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón seguido de lavado en una solución que comprende 1,1X SSPE, 1,0 % SDS a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.
“Condiciones de rigurosidad baja” comprenden condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42 ºC en una solución que consiste en 5X SSPE (43,8 g/l NaCl, 6,9 g/l NaH2PO4 H2O y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,1 % SDS, 5X reactivo de Denhardt (50X reactivo de Denhardt contiene por 500 ml: 5 g de Ficoll (Tipo400, Pharamcia), 5 g de BSA (Fracción V; Sigma) y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de lavado en una solución que comprende 5X SSPE, 0,1 % SDS a 42 ºC cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.
Un gen puede producir múltiples especies de ARN que se generan mediante corte y empalme diferencial del tránscrito de ARN primario. Los ADNc que son variantes de corte y empalme del mismo gen contendrán regiones de identidad de secuencia u homología completa (que representan la presencia del mismo exón o porción del mismo exón sobre ambos ADNc) y regiones de no identidad completa (por ejemplo, que representan la presencia del exón “A” sobre el ADNc 1 en el que el ADNc 2 contiene el exón “B” en su lugar). Dado que los dos ADNc contienen regiones de identidad de secuencia, ambos hibridarán con una sonda que proceda de todo el gen o de porciones del gen que contienen secuencias encontradas en ambos ADNc; las dos variantes de corte y empalme son, por tanto,
sustancialmente homólogas a dicha sonda y entre sí.
Las expresiones “en combinación funcional”, “en orden funcional” y “funcionalmente unido”, como se usa en el presente documento se refieren a la unión de secuencias de ácido nucleico de un modo tal que se produce una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula proteica deseada. La expresión también se refiere a la unión de secuencias de aminoácidos de un modo tal que se produce una proteína funcional.
Como se usa en el presente documento, la expresión “marcador seleccionable” se refiere a un gen que codifica una actividad enzimática que confiere la capacidad de crecer en medio que carece de lo que, de otro modo, sería un nutriente esencial (p. ej., el gen HIS3 en células de levadura), además, un marcador seleccionable puede conferir resistencia a un antibiótico o fármaco a la célula en la que se expresa el marcador seleccionable. Loas marcadores seleccionables pueden ser “dominantes”; un marcador seleccionable dominante codifica una actividad enzimática que se puede detectar en cualquier línea celular eucariota. Ejemplos de marcadores seleccionables dominantes incluyen el gen de la aminoglucósido 3’ transferasa bacteriana (también denominado el gen neo) que confiere resistencia al fármaco G418 en células de mamífero, el gen de la higromicina G fosfotransferasa (hyg) bacteriana que confiere resistencia al antibiótico higromicina y el gen de la xantina-guanina fosforibosiltransferasa bacteriana (también denominado el gen gpt) que confiere la capacidad para crecer en presencia de ácido micofenólico. Otros marcadores seleccionables no son dominantes en cuanto a que su uso debe ser junto con una línea celular que carece de la actividad enzimática relevante. Ejemplos de marcadores seleccionables no dominantes incluyen el gen de la timidina quinasa (k) que se usa junto con las líneas celulares tk, el gen CAD que se usa junto con células deficientes en CAD y el gen de la hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (hprt) de mamífero que se usa junto con las líneas celulares hprt. Una revisión del uso de marcadores seleccionables en líneas celulares de mamífero se proporciona en Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pág.16.9-16.15.
Como se usa en el presente documento, la expresión “elemento regulador” se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita la iniciación de la transcripción de una región de codificación unida funcionalmente. Otros elementos reguladores son señales de corte y empalme, señales de poliadenilación, señales de terminación, elementos de exportación de ARN, sitios internos de entrada al ribosoma (definidos más adelante).
Las señales de control de la transcripción en eucariotas comprenden elementos “promotores” y “potenciadores”: Los promotores y potenciadores consisten en disposiciones cortas de secuencias de ADN que interaccionan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis y col., Science 236:1237 [1987]). Los elementos promotores y potenciadores se han aislado de diversas fuentes eucarióticas, incluyendo genes en levaduras, células de insecto y de mamífero, y virus (elementos control análogos, es decir promotores, también se encuentran en procariotas). La selección de un promotor y potenciador concreto depende de qué tipo de célula se va a usar para expresar la proteína de interés. Algunos promotores y potenciadores eucarióticas tienen un amplio abanico de huéspedes, mientras que otros son funcionales en un subconjunto limitado de tipos celulares (para una revisión, véase Voss y col., Trends Biochem. Sci., 11:287 [1986]; y Maniatis y col., ant.). Por ejemplo, el potenciador del gen temprano de SV40 es muy activo en una amplia variedad de tipos celulares de muchas especies de mamífero y se ha usado ampliamente para la expresión de proteínas en células de mamífero (Dijkema y col., EMBO
J. 4:761 [1985]). Otros dos ejemplos de elementos promotores / potenciadores activos en un amplio abanico de tipos de células de mamífero son aquéllos del gen del factor 1a de elongación humano (Uetsuki y col., J. Biol. Chem., 264:5791 [1989]; Kim y col., Gene 91:217 [1990]; y Mizushima y Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 [1990]) y las repeticiones terminal largas del virus del sarcoma de Rous (Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 [1982]) y el citomegalovirus humano (Boshart y col., Cell 41:521 [1985]).
Como se usa en el presente documento, el término “promotor / potenciador” indica un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar funcionas de promotor y potenciador (es decir, las funciones proporcionadas por un elemento promotor y un elemento potenciador, véase en lo que antecede una discusión de estas funciones). Por ejemplo, las repeticiones terminales largas de retrovirus contienen funciones de promotor y potenciador. El promotor y potenciador puede ser “endógeno” o “exógeno” o “heterólogo” Un promotor / potenciador “endógeno” es uno que está unido de forma natural con un gen dado en el genoma. Un promotor / potenciador “exógeno” o “heterólogo” es uno que está colocado en yuxtaposición a un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular tales como clonación y recombinación) de modo que la transcripción de dicho gen está dirigida por el promotor / potenciador unido.
Los elementos reguladores pueden ser específicos de tejido o específicos de célula. La expresión “específico de tejido” tal como se aplica a un elemento regulador se refiere a un elemento regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de una secuencia nucleotídica de interés a un tipo específico de tejido (p. ej., vivo) en ausencia relativa de expresión de la misma secuencia nucleotídica de interés en un tipo diferente de tejido (p. ej., pulmón).
La especificidad de tejido de un elemento regulador puede evaluarse mediante, por ejemplo, unión funcional de un gen indicador a una secuencia promotora (que no es específica de tejido) y al elemento regulador para generar una construcción indicadora, introduciendo la construcción indicadora en el genoma de un animal de un modo tal que la
construcción indicadora se integra en cada tejido del animal transgénico resultante y detección de la expresión del gen indicador (p. ej.., detectar ARNm, proteínas o la actividad de una proteína codificada por el gen indicador) en diferentes tejidos del animal transgénico. La detección de un mayor nivel de expresión del gen indicador en uno o más tejidos respecto al nivel de expresión del gen indicador en otros tejidos muestra que el elemento regulador es “específico” de los tejidos en los que se detectan niveles de expresión mayores. Por tanto, la expresión “específico de tejido” (p. ej., específico de hígado), como se usa en el presente documento, es una expresión relativa que no requiere especificidad absoluta de expresión. En otras palabras, la expresión “específico de tejido” no requiere que un tejido tenga niveles extremadamente altos de expresión y que otros tejido no tenga expresión. Es suficiente con que la expresión sea mayor en un tejido que en otro. Por el contrario, con expresión específica de tejido “estricta” o “absoluta” se pretende indicar la expresión en un único tipo de tejido (p. ej., hígado) sin expresión detectable en otros tejidos.
La expresión “específico de tipo celular” tal como se aplica a un elemento regulador se refiere a un elemento regulador que es capaz de dirigir la expresión selectiva de una secuencia nucleotídica de interés a un tipo específico de célula en ausencia relativa de expresión de la misma secuencia nucleotídica de interés en un tipo diferente de célula dentro del mismo tejido. La expresión “específico de tipo celular” cuando se aplica a un elemento regulador también quiere decir un elemento regulador capaz de estimular la expresión selectiva de una secuencia nucleotídica de interés en una región en un único tejido.
La especificidad de tipo celular de un elemento regulador se puede evaluar usando procedimientos bien conocidos en la técnica (p. ej., tinción inmunohistoquímica y/o análisis de transferencia Northern). En pocas palabras, para la tinción inmunohistoquímica, las secciones de tejido se incluyen en parafina y las secciones de parafina se hacen reaccionar con un anticuerpo primario específico del producto polipeptídico codificado por la secuencia nucleotídica de interés cuya expresión está regulada por el elemento regulador. Un anticuerpo secundario marcado (p. ej., peroxidada conjugada) específico del anticuerpo primario se deja unir al tejido seccionado y la unión específica se detecta (p. ej., con avidina/biotina) mediante microscopia. En pocas palabras, para el análisis de transferencia Northern, se aísla el ARN de las células y se somete a electroforesis sobre geles de agarosa para fraccionar el ARN de acuerdo con el tamaño, seguido de transferencia del ARN del gel a un soporte sólido (p. ej., nitrocelulosa o una membrana de nylon). Después, el ARN inmovilizado se sonda con una sonda oligodesoxirribonucleotídica o sonda de ADN marcada para detectar especies de ARN complementarias a la sonda usada. Las transferencias Northern son una herramienta estándar de biólogos moleculares.
El término y las expresiones “promotor”, “elemento promotor” o “secuencia del promotor”, como se usa en el presente documento, hace referencia a una secuencia de ADN que, cuando se liga a una secuencia nucleotídica de interés, es capaz de controlar la transcripción de la secuencia nucleotídica de interés en el ARNm. Normalmente, aunque no necesariamente, un promotor se localiza en 5’ (es decir, cadena arriba) de una secuencia nucleotídica de interés cuya transcripción en ARNm controla, y proporciona un sitio para la unión específica por la ARN polimerasa y otros factores de transcripción para la iniciación de la transcripción.
Los promotores pueden ser constitutivos o regulables. El término “constitutivo”, cuando hace referencia a un promotor, significa que el promotor es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente en ausencia de un estímulo (p. ej., shock término, agentes químicos etc.). Por el contrario, un promotor “regulable” es uno que es capaz de dirigir un nivel de transcripción de una secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente en presencia de un estímulo (p. ej., shock término, agentes químicos etc.) que es diferente del nivel de transcripción de la secuencia de ácido nucleico unida funcionalmente en ausencia del estímulo.
La presencia de “señales de corte y empalme” en un vector de expresión a menudo tiene como resultado niveles mayores de expresión del tránscrito recombinante. Las señales de corte y empalme median en la eliminación de intrones del tránscrito de ARN primario y consisten en un sitio donante y aceptor de corte y empalme (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pág. 16.7-16.8). Un sitio donante y aceptor de corte y empalme de uso habitual es la unión de corte y empalme del ARN 16S del SV40.
Una expresión eficiente de secuencias de ADN recombinante en células eucarióticas requiere la expresión de señales que dirigen la terminación eficiente y la poliadenilación del tránscrito resultante. Las señales de terminación de la transcripción normalmente se encuentran cadena debajo de la señal de poliadenilación y tienen una longitud de pocos ciento de nucleótidos. El término “sitio de poliA” o “secuencia de poliA”, como se usa en el presente documento, indica una secuencia de ADN que dirige la terminación y la poliadenilación del tránscrito de ARN naciente. Es deseable una poliadenilación eficiente del tránscrito recombinante, ya que los tránscritos que carecen de una cola de polo A son inestables y se degradan rápidamente. La señal de poli A usada en un vector de expresión puede ser “heteróloga” o “endógena”. Una señal de poli A endógena es una que se encuentra de forma natural en el extremo 3’ de la región de codificación de un gen dado en el genoma. Una señal de poli A heteróloga es una que se aísla de un gen y se coloca en 3’ de otro gen.
Una señal de poli A heteróloga de uso habitual es la señal de poli A del SV40. La señal de poli A del SV40 está contenida en un fragmento de restricción de BamHI/BclI de 238 pb y dirige tanto la terminación como la poliadenilación (Sambrook, ant, at 16.6-16.7).
Los vectores de expresión eucarióticos pueden también contener “replicones virales” u “orígenes de replicación virales”. Los replicones virales son secuencias de ADN viral que permiten la replicación extracromosómica de un vector en una célula huésped que expresa los factores de replicación adecuados. Los vectores que contienen el origen de replicación del virus SV40 o del polioma se replican en un “número de copias” elevado (hasta 104 copias/célula) en las células que expresan el antígeno T viral adecuado. Los vectores que contienen los replicones del papilomavirus bovino o el virus de Epstein-Barr se replican extracromosómicamente en un “número de copias bajo” (-100 copias/célula). No obstante, no se pretende que los vectores de expresión estén limitados a ningún origen de replicación concreto.
Como se usa en el presente documento, la expresión “repetición terminal larga” o “LTR” se refiere a elementos de control de la transcripción localizados o aislados de la región U3 en 5’ y 3’ de un genoma retroviral. Como se conoce en la técnica, las repeticiones terminales largas se pueden usar como elementos de control en los vectores retrovirales o se pueden aislar del genoma retroviral y usar para controlar la expresión de otros tipos de vectores.
Como se usa en el presente documento, la expresión “señal de secreción” se refiere a cualquier secuencia de ADN que cuando está unida funcionalmente a una secuencia de ADN recombinante codifica un péptido señal que es capaz de producir la secreción del polipéptido recombinante. En general, los péptidos señal comprenden una serie de aproximadamente 15 a 30 residuos de aminoácidos hidrófobos (véase, por ejemplo, Zwizinski y col., J. Biol. Chem. 255(16): 7973-77 [1980], Gray y col., Gene 39(2): 247-54 [1985], y Martial y col., Science 205: 602-607 [1979]). Dichas secuencias de señal de la secreción derivan, preferentemente, de genes que codifican polipéptidos secretados del tipo celular diana para la expresión específica de tejido (p. ej., proteínas secretadas de la leche para la expresión y secreción por las células secretoras mamarias). No obstante, las secuencias de ADN secretoras no están limitadas a estas secuencias. Las secuencias de ADN secretoras de proteínas secretadas de muchos tipos celulares y organismos también se pueden usar (p. ej., las señales de secreción para t-PA, seroalbúmina, lactoferrina y hormona de crecimiento, y señales de secreción de genes microbianos que codifican polipéptidos secretados, tales como levaduras, hongos filamentosos y bacterias).
Como se usa en el presente documento, las expresiones “elemento de exportación de ARN” o “potenciador del procesamiento pre-ARN (PPE)” se refieren a elementos reguladores postranscripciones de acción 3’ y 5’ cis que potencian la exportación del ARN desde el núcleo. Los elementos “PPE” incluyen, entre otros, secuencias de Mertz (descritas en las patentes de EE.UU. Nº 5.914.267 y 5.686.120) y el potenciador del procesamiento de ARNm de marmota (WPRE; WO99/14310 y la patente de EE.UU. Nº 6,136,597).
Como se usa en el presente documento, el término “policistrónico” se refiere a un ARNm que codifica más de una cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, los documentos WO 93/03143, WO 88/05486, y la patente europea Nº 117058). Asimismo, la expresión “dispuesto en secuencia policistrónica” se refiere a la disposición de genes que codifican dos cadenas polipeptídicas diferentes en un único ARNm.
Como se usa en el presente documento, la expresión ”sitio interno de entrada al ribosoma” o “IRES” se refiere a una secuencia localizada entre genes policistrónicos que permite la producción del producto de expresión que se origina del segundo gen mediante inicio interno de la traducción del ARNm dicistrónico. Ejemplos de sitios internos de entrada al ribosoma incluyen, entre otros, los derivados del virus de la enfermedad de pie-boca (FDV), del virus de la encefalomiocarditis, del poliovirus y del RDV (Scheper y col., Biochem. 76: 801-809 [1994]; Meyer y col., J. Virol. 69: 2819-2824 [1995]; Jang y col., 1988, J. Virol. 62: 2636-2643 [1998]; Haller y col., J. Virol. 66: 5075-5086 [1995]). Los vectores que incorporan IRES pueden ensamblarse como se conoce en la técnica. Por ejemplo, un vector retroviral que contiene una secuencia policistrónica puede contener los siguientes elementos en asociación funcional: poliligador nucleotídico, gen de interés, un sitio interno de entrada al ribosoma y un marcador seleccionable en mamíferos u otro gen de interés. El casete policistrónico se sitúa dentro del vector retroviral entre 5' LTR y la 3' LTR en una posición tal que la transcripción desde el promotor de 5' LTR transcribe el casete con el mensaje policistrónico. La transcripción del casete con el mensaje policistrónico puede también estar dirigida por un promotor interno (p. ej., el promotor del citomegalovirus) o un promotor inducible, que puede ser preferible, dependiendo del uso. El casete con el mensaje policistrónico puede además comprender una secuencia de ADNc o ADN genómico (ADNg) asociada funcionalmente dentro del poliligador. Cualquier marcador seleccionable de mamífero se puede usar como marcador seleccionable de mamífero del casete con mensaje policistrónico. Dichos marcadores seleccionables de mamífero son bien conocidos para los expertos en la técnica y pueden incluir, entre otros, los marcadores de resistencia a kanamicina/G412, higromicina B o ácido micofenólico.
Como se usa en el presente documento, el término "retrovirus" se refiere a una particular retroviral que es capaz de entrar en una célula (es decir, la particular contiene una proteína asociada a la membrana tal como una proteína de la cubierta o una glicoproteína G viral que se puede unir a la superficie de la célula huésped y facilitar la entrada de la particular viral en el citoplasma de la célula huésped) e integrar el genoma retroviral (como provirus bicatenario) en el genoma de la célula huésped. El término "retrovirus" abarca Oncovirinae (p.ej., virus de la leucemia murina de Moloney (MoMoLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV) y virus del tumor de mama de ratón (MMTV), Spumavirinae, y Lentivirinae (p. ej., el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la inmunodeficiencia de simios, el virus de la anemia infecciosa equina, el virus de la artritis-encefalitis caprina; véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5.994.136 y 6.013.516).
Como se usa en el presente documento, la expresión “vector retroviral” se refiere a un retrovirus que se ha modificado para expresar un gen de interés. Los vectores retrovirales se pueden usar para transferir genes de un modo eficiente en células huésped explotando el proceso infeccioso viral. Los genes extraños o heterólogos clonados (es decir, insertados usando técnicas de biología molecular) en el genoma retroviral se pueden liberar de un modo eficiente en las células huésped que son susceptibles a la infección por el retrovirus. A través de manipulaciones genéticas bien conocidas, la capacidad de replicación del genoma retroviral se puede destruir. Los vectores resultantes de replicación defectuosa se pueden usar para introducir nuevo material genético en una célula, pero no se pueden replicar. Un virus colaborador o línea celular de empaquetamiento se puede usar para permitie el ensamblaje de la partícula del vector y la salida de la célula. Dichos vectores retrovirales comprenden un genoma de replicación defectuosa que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un gen de interés (es decir, una secuencia de ácido nucleico policistrónico puede codificar más de un gen de interés), una repetición terminal larga retroviral en 5’ (5' LTR) y una repetición terminal larga retroviral en 3’ (3' LTR).
La expresión “vector retroviral seudotipado” se refiere a un vector retroviral que contiene una proteína de membrana heteróloga. La expresión “proteína asociada a la membrana” se refiere a una proteína (p. ej., una glicoproteína de la cubierta viral o las proteínas G de los virus en la familia Rhabdoviridae tal como VSV, Piry, Chandipura y Mokola) que están asociadas con la membrana que rodea una partícula viral; estas proteínas asociadas a la membrana median en la entrada de la partícula viral en la célula huésped. La proteína asociada a la membrana se puede unir a receptores de proteína de la superficie celular específicos, como es el caso para las proteínas de la cubierta retroviral o la proteína asociada a la membrana puede interaccionar con un componente fosfolípidos de la membrana plasmática de la célula huésped, como es el caso para las proteínas G derivadas de miembros de la familia Rhabdoviridae.
La expresión “proteína asociada a la membrana heteróloga” se refiere a una proteína asociada a la membrana que deriva de un virus que no es un miembro de la misma clase o familia viral a partir de la cual deriva la proteína de la nucleocápside de la partícula vector. “Clase o familia viral” se refiere a la clase o familia taxonómica, según lo asignado por el Comité Internacional sobre la Taxonomía de los Virus.
El término "Rhabdoviridae" se refiere a una familia de virus de ARN con cubierta que infectan animales, incluidos seres humanos y plantas. La familia Rhabdoviridae abarca el gen Vesiculovirus, que incluye el virus de la estomatitis vesicular (VSV), el virus Cocal, el virus Piry, el virus Chandipura y el virus de la viremia primaveral de la carpa (las secuencias que codifican el virus de la viremia primaveral de la carpa están disponibles en GenBank con el número de registro U18101). Las proteínas G de los virus del género Vesiculovirus son proteínas integrales de membrana codificadas viralmente, que forman complejos glicoproteicos con picos homotriméricos que se proyectan hacia el exterior que son necesarios para la unión al receptor y la fusión con la membrana. Las proteínas G de los virus del género Vesiculovirus tienen un resto de ácido palmítico (C16) unido de forma covalente. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas G de los Vesiculovirus están bastante bien conservados. Por ejemplo, la proteína G del virus Piry comparten una identidad de aproximadamente el 38 % y una similitud de aproximadamente el 55 % con las proteínas G de VSV (se conocen varias cepas del VSV, por ejemplo Indiana, New Jersey, Orsay, San Juan, etc., y sus proteínas G son altamente homólogas). La proteína G del virus Chandipura y las proteínas G de VSV comparten una identidad de aproximadamente el 37 % y una similitud del 52 %. Dado el elevado grado de conservación (secuencia de aminoácidos) y las características funcionales relacionadas (p. ej., la unión del virus a la célula huésped y la fusión de membranas, incluida la formación de sincitios) de las proteínas G de vesiculovirus, las proteínas G de vesiculovirus que no son VSV se pueden usar en lugar de la proteína G del VSV para el seudotipado de las partículas virales. Las proteínas G de los virus Lyssa (otro género dentro de la familia Rhabdoviridae) también comparten un grado de conservación con las proteínas G del VSV y funcionan de un modo similar (p. ej., median la fusión de membranas) y, por tanto, se pueden usar en lugar de la proteína G del VSV para el seudotipado de partículas virales. Los virus Lyssa incluyen el virus Mokola y los virus de la rabia (se conocen varias cepas del virus de la rabia y sus proteínas G se han clonado y secuenciado). La proteína G del virus Mokola comparte tiras de homología (en particular por los dominios extracelular y transmembrana) con las proteínas G del virus VSV, que muestran una identidad de aproximadamente el 31 % y una similitud del 48 % con las proteínas G del virus VSV. Las proteínas G preferidas comparten una identidad de al menos un 25 %, preferentemente una identidad de al menos un 30 % y, lo más preferentemente, una identidad de al menos un 35 % con las proteínas G del virus VSV. La proteína G del virus VSV de la cepa New Jersey (la secuencia de esta proteína G se proporciona en GenBank con los números de registro M27165 y M21557) se emplea como la proteínas G del virus VSV de referencia.
Como se usa en el presente documento, la expresión “vector lentiviral” se refiere a vectores retrovirales derivados de la familia Lentiviridae (p. ej., el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la inmunodeficiencia en simios, el virus de la anemia infecciosa equina y el virus de la encefalitis-artritis caprina) que son capaces de integrarse en células que no se están dividiendo (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5,994,136 y 6,013,516, ambas incorporadas en el presente documento por referencia).
La expresión “vector lentiviral seudotipado” se refiere a un vector lentiviral que contiene una proteína de membrana heteróloga (p. ej., una glicoproteína de la cubierta viral o las proteínas G de virus de la familia Rhabdoviridae, tal como VSV, Piry, Chandipura y Mokola).
Como se usa en el presente documento, el término “in vitro” se refiere a un ambiente artificial y a procesos o reacciones que se producen dentro de un ambiente artificial. Los ambientes in Vitro pueden consistir en, entre otros, tubos de ensayo y cultivos celulares. El término “in vivo” se refiere al ambiente natural (p. ej., un animal o una célula) y a procesos o reacciones que se producen dentro de un ambiente natural.
Como se usa el presente documento, la expresión “derivado clonalmente” se refiere a una línea celular que deriva de una única célula.
Como se usa el presente documento, la expresión “no derivado clonalmente” se refiere a una línea celular que deriva de más de una célula.
Como se usa el presente documento, el término “pase” se refiere al proceso de diluir un cultivo de células que ha crecido hasta una densidad concreta o confluencia (p. ej., una confluencia del 70 % o del 80 %) y, después, dejar las células diluidas que vuelvan a crecer hasta la densidad concreta o la confluencia deseada (p. ej., volviendo a sembrar las células en placas o estableciendo un nuevo cultivo en frasco giratorio con las células.
Como se usa el presente documento, el término “estable”, cuando se usa en referencia al genoma, se refiere al mantenimiento estable del contenido de información el genoma de una generación a la siguiente o, en el caso concreto de una línea celular, de un pase al siguiente. De acuerdo con esto, se considera que un genoma es estable si no se producen cambios grandes en el genoma (p. ej.,
Deleción de un gen o una translocación cromosómica). El término ”estable” no excluye los cambios sutiles que se pueden producir en el genoma, tales como mutaciones puntuales.
Como se usa el presente documento, el término “respuesta”, cuando se usa en referencia a un ensayo, se refiera a la generación de una señal detectable (p. ej., acumulación de proteína indicadora, incremento de la concentración de iones, acumulación de un producto químico detectable).
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína receptora de membrana” se refiere a proteínas que abarcan la membrana que se unen a un ligando (p. ej., una hormona o un neurotransmisor). Como se conoce en la técnica, la fosforilación de proteínas es un mecanismo regulador de uso habitual por las células para modificar de forma selectiva las proteínas portadoras de señales reguladoras desde fuera de la célula al núcleo. Las proteínas que ejecutan estas modificaciones bioquímicas son un grupo de enzimas conocidas como proteína quinasas. Pueden definirse adicionalmente por el residuo del sustrato al que está dirigida la fosforilación. Un grupo de proteína quinasas son las tirosina quinasas (TK) que fosforilan de forma selectiva una proteína diana en sus residuos de tirosina. Algunas tirosina quinasas son receptores unidos a la membrana (RTK) y, tras la activación por un ligando, pueden autofosforilarse así como modificar sustratos. El inicio de la fosforilación secuencial mediante estimulación de logando es un paradigma que subyace a la acción de dichos efectores tales como, por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Los receptores de estos ligandos son tirosina quinasas y proporcionan la interfaz entre la unión de un ligando (hormona, factor de crecimiento) a una célula diana y la transmisión de una señal en la célula mediante la activación de una o más vías bioquímicas. La unión del ligando a un receptor tirosina quinasa activa su actividad enzimática intrínseca (véase, por ejemplo, Ullrich y Schlessinger, Cell 61:203-212 [1990]). Las tirosina quinasas también pueden ser enzimas citoplasmáticas que no son receptores y actúan como componente posterior en la vía de transducción de señal.
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína de transducción de señal” se refiere a una proteína que se activa o, de otro modo, ejerce su efecto mediante la unión de ligando a una proteína receptora de membrana
o algún otro estímulo. Ejemplos de proteína de transducción de señal incluyen la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C y las proteínas G. Muchas proteínas receptoras de membrana se acoplan a proteínas G (es decir, receptores acoplados a proteína G (GPCR); para una revisión, véase Neer, 1995, Cell 80:249-257 [1995]). Normalmente, los GPCR contienen siete dominios transmembrana. Los supuestos GPCR se pueden identificar en base a la homología de secuencia con GPCR conocidos.
Los GPCR participan en la transducción de señal a través de una membrana celular tras la unión de un ligando a una porción extracelular de un GPCR. La porción intracelular de un GPCR interacciona con una proteína G para modular la transducción de señal desde fuera a dentro de una célula. Por tanto, se dice que un GPCR está “acoplado” a una proteína G. Las proteínas G están compuestas por tres subunidades polipeptídicas: Una subunidad a, que se une e hidroliza el GTP, y una subunidad dimérica �y. En estado basal inactivo, la proteína G existe como heterotrímero de las subunidades a y �y. Cuando la proteína G está inactiva, el guanosina bifosfato (GDP) se asocia con la subunidad a de la proteína G. Cuando un ligando se une a un GPCR y lo activa, el GPCR se une a la proteína G heterotrimérica y disminuye la afinidad de la subunidad Gα por el GDP. En su estado activo, la subunidad G intercambia GDP por guanina trifosfato (GTP) y la subunidad Ga active se disocia del receptor y de la subunidad dimérica �y. La subunidad Ga activa desasociada transduce las señales a efectores que están “después” en la vía de señalización de la proteína G dentro de la célula. En última instancia, la actividad GTPasa endógena de la proteína pasa la subunidad G activa a su estado inactivo, en el que se asocia con GDP y la subunidad �y dimérica.
Se han clonado numerosos miembros de la familia de proteína G heterotrimérica, incluidos más de 20 genes que codifican varias subunidades Ga. Las diversas subunidades G se han clasificado en cuatro familias en base a las secuencias de aminoácidos y la homología funcional. Estas cuatro familias se denominan Gas, Gai, Gaq y Ga12. Funcionalmente, estas cuatro familias difieren con respecto a las vías de señalización intracelular que activan y el GPCR al que se acoplan.
Por ejemplo, ciertos GPCR normalmente se acoplan con las Gas y, a través de las Gas, estos GPCR estimulan la actividad de la adenilato ciclasa. Otros GPCR normalmente se acoplan con GGaq, y a través de GGaq, estos GPCR pueden activar la fosfolipasa C (PLC), tal como la isoforma de la fosfolipasa C (es decir, PLC , Stermweis y Smrcka, Trends in Biochem. Sci. 17: 502-506 [1992]).
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína de unión al ácido nucleico” se refiere a proteínas que se unen a ácido nucleico y, en concreto, a proteínas que aumentan (es decir, activadores o factores de transcripción)
o disminuyen (es decir, inhibidores) la transcripción de un gen.
Como se usa el presente documento, la expresión “proteína de canal iónico” se refiere a proteínas que controlan la entrada o la salida de iones a través de membranas celulares. Ejemplos de proteínas de canal iónico incluyen, entre otros, la bomba ATPasa Na+-K+, la bomba de Ca2+ y el canal de fuga de K+.
Como se usa el presente documento, la expresión “proteína quinasa” se refiere a proteínas que catalizan la adición de un grupo fosfato desde un nucleósido trifosfato a una cadena lateral aminoacídica en una proteína. Las quinasas comprenden la superfamilia de enzimas más grande conocida y varían ampliamente en lo que respecta a sus proteínas diana. Las quinasas se pueden clasificar como proteínas tirosina quinasas (PTK), que fosforilan residuos de tirosina, y proteínas serina/treonina quinasas (STK), que fosforilan los residuos de serina y/o treonina. Algunas quinasas tienen especificidad doble por residuos de serina/treonina y tirosina. Casi todas las quinasas contienen un dominio catalítico conservado de 250-300 aminoácidos. Este dominio se puede dividir adicionalmente en 11 subdominios. Los subdominios I-IV en N-terminal se pliegan en una estructura de dos lóbulos que se une y orienta la molécula donante de ATP y el subdominio V abarca los dos lóbulos. Los subdominios VI-XI en C-terminal se unen al sustrato proteico y transfieren el fosfato gamma desde el ATP al grupo hidroxilo de un residuo de serina, treonina o tirosina. Cada uno de los 11 subdominios contiene residuos catalíticos específicos o motivos de aminoácidos característicos de dicho subdominio. Por ejemplo, el subdominio I contiene un motivo consenso de 8 aminoácidos de unión a ATP rico en glicina, el subdominio II contiene un residuo de lisina crucial necesario para una actividad catalítica máxima y los subdominios VI a IX comprenden el núcleo catalítico altamente conservado. Las STK y las PTK también contienen distintos motivos de secuencia en los subdominios VI y VIII, que pueden conferir especificidad por hidroxiaminoácido. Algunas STK y PTK poseen características estructurales de ambas familias. Además, las quinasas también se pueden clasificar mediante secuencias de aminoácidos adicionales, en general entre 5 y 100 residuos, que flanquean o están dentro del dominio quinasa.
Las PTK que no son transmembrana forman complejos de señalización con los dominios citosólicos de receptores de membrana plasmática. Los receptores que señalan a través de PTK que no son transmembrana incluyen citocinas, hormonas y receptores linfocíticos específicos de antígeno. Muchas PTK se identificaron primero como productos oncogénicos en células cancerosas en las que la activación de PTK ya no estaba sometida a los controles celulares normales. De hecho, aproximadamente un tercio de los con oncogenes conocidos codifican PTK. Además, la transformación celular (oncogénesis) a menudo se acompaña de un incremento de la actividad de la fosforilación de la tirosina (véase, por ejemplo, Carbonneau, H. y Tonics, Annu. Rev. Cell Biol. 8:463-93 [1992]). Por tanto, la regulación de la actividad PTIC puede ser una estrategia importante en el control de algunos tipos de cáncer.
Ejemplos de proteína quinasas incluyen, entre otras, la proteína quinasa dependiente de AMPc, la proteína quinasa C y las proteínas quinasas dependientes de ciclina (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº ,034,228; 6,030,822; 6,030,788; 6,020,306; 6,013,455; 6,013,464; y 6,015,807).
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína fosfatasa” se refiere a proteínas que eliminan un grupo fosfato de una proteína. Las proteína fosfatasas se dividen, en general, en dos grupos, proteínas de tipo receptor y de tipo no receptor. La mayoría de las proteínas tirosina fosfatasas de tipo receptor contienen dos dominios catalíticos conservados, cada uno de los cuales abarca un segmento de 240 residuos de aminoácidos. (Véase , por ejemplo, Saito y col., Cell Growth and Diff. 2:59-65 [1991]). Las proteínas tirosina fosfatasas de tipo receptor se pueden subclasificar además en base a la diversidad de la secuencia de aminoácidos de sus dominios extracelulares. (Véase, Krueger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7417-7421 [1992]). Ejemplos de proteínas fosfatasas incluyen, entre otras, cdc25 a, b, y c, PTP20, PTP1D, y PTPA (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nº 5,976,853; 5,994,074; 6,004,791; 5,981,251; 5,976,852; 5,958,719; 5,955,592; y 5,952,212).
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína codificada por un encogen” se refiere a proteínas que producen, directa o indirectamente, la transformación neoplásica de una célula huésped. Ejemplos de oncogenes incluyen, entre otros, los siguientes genes: src, fps, fes, fgr, ros, H-ras, abl, ski, erbA, erbB, fms, fos, mos, sis, myc, myb, rel, kit, raf, K-ras y ets.
Como se usa en el presente documento, el término “inmunoglobulina” se refiere a proteínas que se unen a un antígeno específico. Las inmunoglobulinas incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, e incluye inmunoglobulinas de las clases siguientes: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE, e inmunoglobulinas secretadas (sIg). En general, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas pesadas idénticas (y, a, 1, 0, o £) y dos cadenas ligeras (K o A).
Como se usa en el presente documento, la expresión “proteína de unión a antígeno” se refiere a proteínas que se unen a un antígeno específico. Las “proteínas de unión a antígeno” incluyen, entre otros, inmunoglobulinas, incluidos anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, y bibliotecas de expresión de Fab y anticuerpos monocatenarios. Se usan varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales. Para la producción de un anticuerpo se pueden inmunizar varios animales huéspedes mediante inyección con el péptido correspondiente en el epítopo deseado, incluidos, entre otros, conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras etc. En una realización preferida, el péptido se conjuga con un vehículo inmunogénico (por ejemplo, toxoide diftérico, seroalbúmina bovina (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH)). Se usan varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica dependiendo de la especie huésped, incluidos, entre otros, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales se puede usar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante cultivos continuos de líneas celulares (véase, por ejemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estas incluyen, entre otras, la técnica del hibridoma inicialmente desarrollada por Köhler y Milstein (Köhler y Milstein 1975, Nature 256:495-497 [1975]), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (véase, por ejemplo, Kosbor, y col., Immunol. Today 4:72 [1983]) y la técnica del hibridoma con EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 7796 [1985]).
De acuerdo con la invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (patente de EE.UU. 4.946.778; incorporada en el presente documento por referencia) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos según se desee. Una realización adicional de la invención usa las técnicas descritas conocidas en la materia para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse, y col., Science, 246:1275-1281 [1989]) para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fb monoclonales con la especificidad deseada.
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo (región de unión a antígeno) de la molécula anticuerpo mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, entre estos fragmentos se incluyen ,entre otros: El fragmento F(ab’)2 que se puede producir mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab’ que se pueden generar mediante la reducción de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab’)2 y los fragmentos Fab que se pueden generar tratando una molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.
Los genes que codifican proteínas de unión a antígeno se pueden aislar mediante procedimientos conocidos en la técnica. En la producción de anticuerpos, la detección selectiva del anticuerpo deseado se puede efectuar mediante técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunosorción ligada a enzimas), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcadores enzimáticos o radioisótopos, por ejemplo), transferencias de tipo western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (p. ej., ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis etc.
Como se usa en el presente documento, “gen indicador” se refiere a un gen que codifica una proteína que se puede someter a ensayo. Ejemplos de genes indicadores incluyen, entre otros, luciferasa (vease, por ejemplo, de Wet y co., Mol. Cell. Biol. 7:725 [1987] y las patentes de EE.UU. Nº 6,074,859; 5,976,796; 5,674,713; y 5,618,682), la proteína fluorescente verde (p.ej., número de registro en GenBank U43284; una serie de variantes de GFP están disponibles comercialmente en CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA), cloranfenicol acetiltransferasa, -galactosidasa, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano.
Como se usa en el presente documento, el término “purificado” se refiere a moléculas, secuencias de ácido nucleico
o de aminoácidos, que se eliminan de su ambiente natural, se aíslan o se separan. Una “secuencia de ácido nucleico aislada” es, por tanto, una secuencia de ácido nucleico purificada. Moléculas “sustancialmente purificadas” carecen de al menos un 60 %, preferentemente de al menos un 75 % y, más preferentemente de al menos un 90 %, de otros componentes con los que se asocian de forma natural.
La expresión “compuesto de ensayo” se refiere a cualquier entidad química, sustancia farmacéutica, fármaco y similares que se pueden usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, patología, afección o trastorno de la función corporal o, de otro modo, para alterar el estado fisiológico o celular de una muestra. Los compuestos de
ensayo comprenden compuestos terapéuticos conocidos y potenciales. Se puede determinar que un compuesto de ensayo es terapéutico mediante detección selectiva usando procedimientos de detección selectiva de la presente invención. Un “compuesto terapéutico conocido” se refiere a un compuesto terapéutico que se ha demostrado (p. ej., mediante ensayos con animales o experiencia previa con administración a seres humanos) que es eficaz en dicho tratamiento o prevención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a la producción de proteínas en células huésped y, más particularmente, a células huésped que contienen múltiples copias integradas de un vector de integración. Los vectores de integración (es decir, vectores que se integran a través de una integrasa o transposasa) se usan para crear líneas celulares que contienen un número elevado de copias de un ácido nucleico que codifica un gen de interés. Los genomas transfeccionados de las células con un número alto de copias son estables mediante pases repetidos (p. ej., al menos 10 pases, preferentemente al menos 50 pases y, más preferentemente, al menos 100 pases). Además, las células huésped de la presente divulgación pueden producir niveles altos de proteína (p. ej., más de 1 pg/célula/día, preferentemente más de 10 pg/célula/día, más preferentemente más de 50 pg/célula/día y lo preferentemente más de 100 pg/célula/día).
La estabilidad genómica y los niveles altos de expresión de las células huésped de la presente divulgación proporcionan claras ventajas sobre procedimientos descritos anteriormente del cultivo celular. Por ejemplo, en la técnica se sabe que las líneas celulares de mamífero que contienen múltiples copias de genes son intrínsecamente inestables. De hecho, esta inestabilidad es un problema reconocido con el que se enfrentan los investigadores que desean usar líneas celulares de mamífero para varios fines, incluidos ensayos de detección selectiva de alto rendimiento (véase, por ejemplo, Sittampalam y col., Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3):384-91 [1997]).
No se pretende que la presente invención esté limitada a un mecaniso de acción concreto. De hecho, no es necesario conocer el mecanismo para efectuar y usar la presente invención. No obstante, se piensa que la estabilidad genómica alta y los niveles de expresión proteica de las células huésped de la presente divulgación se debe a las propiedades únicas de los vectores de integración (p. ej., vectores retrovirales). Por ejemplo, se sabe que los retrovirus son elementos hereditarios en la línea germinal de muchos organismos. De hecho, tanto como un 5-10 % del genoma de mamífero puede consistir en elementos a los que ha contribuido la transcripción inversa, indicativo de un grado alto de estabilidad. Asimismo, muchos de estos tipos de vectores están dirigidos a sitios transcripcionales activos (p. ej., sitios hipersensibles a la ADNasa I) en el genoma.
Muchas investigaciones se han centrado en los efectos perjudiciales de la integración retroviral y de transposones. La propiedad de dirigirse a regiones activas del genoma ha conducido al uso de vectores retrovirales y vectores de transposones en los esquemas de atrapamiento de promotor y para la mutagénesis por saturación (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5,627,058 y 5,922,601). En los esquemas de atrapamiento de promotor las células se infectan con un vector indicador sin promotor. Si el vector sin promotor se integra cadena debajo de un promotor (es decir, en un gen), se activa el gen indicador codificado por el vector. Después, el promotor se puede clonar y caracterizar adicionalmente.
Como se puede observar, estos esquemas dependen de la alteración de un gen endógeno. Por tanto, es sorprendente que los procedimientos de la presente divulgación, que usan vectores de integración a multiplicidades de infección altas que normalmente se creería que conducen a una alteración del gen, condujeron al desarrollo de líneas celulares estables que expresan cantidades altas de una proteína de interés. El desarrollo de estas líneas celulares se describe con más detalle más adelante. La descripción se divide en las secciones siguientes: I) Células huésped; II) Vectores y Procedimientos de Transfección; y III) Usos de Células Huésped Transfeccionadas.
I. Células huésped
La presente divulgación contempla la transfección de diversas células huésped con vectores de integración. En la técnica se conocen una serie de líneas de células huésped de mamífero. En general, estas células huésped son capaces de crecer y sobrevivir cuando se introducen en un cultivo monocapa o en un cultivo en suspensión en un medio que contienen los nutrientes y los factores de crecimiento adecuados, como se describe con mayor detalle más adelante. Normalmente, las células son capaces de expresar y secretar grandes cantidades de una proteína de interés concreta en el medio de cultivo. Ejemplos de células huésped de mamífero adecuadas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO-K1, ATCC CCl-61); células epiteliales de mamífero bovino (ATCC CRL 10274; células epiteliales de mamífero bovino); línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivos en suspensión; véase, por ejemplo, Graham y col., J. Gen Virol., 36:59 [1977]); células renales de hámster chino (BHK, ATCC CCL 10);células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; fibroblastos de rata (células 208F);
células MDBK (células de riñón bovino); y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
II. Vectores y Procedimientos para Transfección
De acuerdo con la presente divulgación, las células huésped como las descritas en lo que antecede se transducen o transfeccionan con vectores de integración, en particular vectores retrovirales y vectores lentivirales. El diseño, la producción y el uso de estos vectores en la presente invención se describen más adelante.
A. Vectores retrovirales
Los retrovirus (familia Retroviridae) se dividen en tres grupos: Los espumavirus (p. ej., virus espumosos humanos), los lentivirus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana y el virus visna de oveja) y los oncovirus (p. ej., MLV, virus del sarcoma de Rous).
Los retrovirus son virus de ARN con cubierta (es decir, están rodeados por una membrana de bicapa lipídica derivada de células huésped) que infectan a las células animales. Cuando un retrovirus infecta a una célula, su genoma de ARN se convierte en una forma de ADN lineal bicatenario (es decir, sufre transcripción inversa). Después, la forma de ADN del virus se integra en el genoma de la célula huésped como un provirus. El provirus sirve como molde para la producción de genomas virales adicionales y ARNm virales. Las partículas virales maduras que contienen dos copias de ARN genómico salen de la superficie de la célula infectada. La partícula viral comprende el ARN genómico, transcriptasa inversa y otros productos del gen pol dentro de la cápside viral (que contiene los productos del gen gag) que está rodeado por una membrana de bicapa lipídica derivada de la célula huésped que contiene las glicoproteínas de la cubierta viral (también denominadas proteínas asociadas a la membrana).
La organización de los genomas de numerosos retrovirus es bien conocida en la técnica y esto ha permitido la adaptación del genoma retroviral para producir vectores retrovirales. La producción de un vector retroviral recombinante portador de un gen de interés normalmente se consigue en dos etapas.
En primer lugar, el gen de interés se inserta en un vector retroviral que contiene las secuencias necesarias para la expresión eficiente del gen de interés (incluidos los elementos promotor y/o potenciador que pueden proporcionar las repeticiones terminales largas (LTR) virales o un promotor/potenciador interno y señales de corte y empalme relevantes), secuencias requeridas para el empaquetamiento eficiente del ARN viral en viriones infecciosos (p. ej., la señal de empaquetamiento (Psi), el sitio de unión del cebador del ARNt (-PBS), las secuencias reguladoras en 3’ requeridas para transcripción inversa (+PBS)) y las LTR virales. Las LTR contienen secuencias requeridas para la asociación del ARN genómico viral, las funciones de transcriptasa inversa y de integrasa y las secuencias implicadas en dirigir la expresión del ARN genómico que se va a empaquetar en partículas virales. Por motivos de seguridad, muchos vectores retrovirales recombinantes carecen de copias funcionales de los genes que son esenciales para la replicación viral (estos genes esenciales se delecionan o inactivan); por tanto, se dice que el virus resultante tiene una replicación defectuosa.
En segundo lugar, tras la construcción del vector recombinante se introduce el ADN del vector en una línea celular de empaquetamiento. Las líneas celulares de empaquetamiento proporcionan proteínas requeridas en trans para el empaquetamiento del ARN genómico viral en partículas virales que tienen el abanico de huéspedes deseado (es decir, las proteínas gag, pol y env codificadas por el virus). El abanico de huéspedes está controlado, en parte, por el tipo de producto génico de la cubierta expresado sobre la superficie de la partícula viral. Las líneas celulares de empaquetamiento pueden expresar productos génicos de la cubierta ecotróficos, anfotrópicos o xenotrópicos. Como alternativa, la línea celular de empaquetamiento puede carecer de secuencias que codifican una proteína de la cubierta viral (env). En este caso, la línea celular de empaquetamiento empaquetará el genoma viral en partículas que carecen de una proteína asociada con la membrana (p. ej., una proteína env). Con el fin de producir partículas virales que contienen una proteína asociada a la membrana que permitirá la entrada del virus en una célula, la línea celular de empaquetamiento que contiene las secuencias retrovirales se transfecciona con secuencias que codifican una proteína asociada con la membrana (p. ej., la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV)).
La célula de empaquetamiento transfeccionada producirá después partículas virales que contienen la proteína asociada a la membrana expresada por la línea celular de empaquetamiento transfeccionada; se dice que estas partículas virales que contienen ARN genómico viral derivado de un virus encapsidado por las proteínas de la cubierta de otro virus son partículas virales seudotipadas.
Los vectores retrovirales de la presente divulgación se pueden modificar después para incluir secuencias reguladoras adicionales. Como se ha descrito anteriormente, los vectores retrovirales de la presente invención incluyen los siguientes elementos en asociación funcional: a) una LTR en 5’; b) una señal de empaquetamiento; c) una LTR en 3’ y d) un ácido nucleico que codifica una proteína de interés localizada entre las LTR en 5’ y 3’. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de interés puede estar dispuesto en orientación opuesta a la LTR ej 5’ cuando se desea la transcripción desde un promotor interno. Los promotores internos adecuados incluyen, entre otros, el promotor de la alfa-lactoalbúmina, el promotor del CMV (humano o de mono) y el promotor de la timidina quinasa.
En otras realizaciones, cuando se desea la secreción de la proteína de interés, los vectores se modifican incluyendo una secuencia del péptido señal en asociación funcional con la proteína de interés. Los expertos en la técnica conocen las secuencias de varios péptidos señal adecuados, incluyendo, entre otras, las derivadas del activador de plasminógeno tisular; la hormona de crecimiento humana, lactoferrina, alfa-caseína y alfa-lactoalbúmina.
En otras realizaciones, los vectores se modifican incorporando un elemento de exportación de ARN (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5,914,267; 6,136,597; y 5,686,120; y el documento WO99/14310) en 3’ o en 5’ de la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de interés. Se contempla que el uso de elementos de exportación de ARN permite niveles altos de expresión de la proteína de interés sin incorporar señales de corte y empalme o intrones en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés.
En otras realizaciones más, el vector comprende además al menos una secuencia del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Se dispone de secuencias de varios IRES adecuados, incluidas, entre otras, las derivadas del virus de la enfermedad pie-boca (FDV), el virus de la encefalomiocarditis y el poliovirus. La secuencia del IRES se puede interponer entre dos unidades transcripcionales (p. ej., ácidos nucleicos que codifican diferentes proteínas de interés
o subunidades de una proteína de múltiples subunidades tal como un anticuerpo) para formar una secuencia policistrónica de modo que las dos unidades transcripcionales se transcriben a partir del mismo promotor.
Los vectores retrovirales de la presente divulgación pueden también comprender adicionalmente un marcador seleccionable que permite la selección de células transformadas. Se puede usar una serie de marcadores seleccionables, incluidos, entre otros, el gen de la aminoglicósido 3’ transferasa bacteriana (también denominado el gen neo) que confiere resistencia al fármaco G418 en células de mamífero, el gen de la higromicina G fosfotransferasa (hyg) bacteriana que confiere resistencia al antibiótico higromicina y el gen de la xantina-guanina fosforibosiltransferasa bacteriana (también denominado el gen gpt) que confiere la capacidad para crecer en presencia de ácido micofenólico. En algunas realizaciones, el gen del marcador seleccionable se proporciona como parte de la secuencia policistrónica que también codifica la proteína de interés.
En otras realizaciones adicionales, los vectores retrovirales pueden comprender elementos de recombinación reconocidos por un sistema de recombinación (p. ej., los sistemas cre/loxP o flp recombinasa, véase,, por ejemplo, Hoess y col., Nucleic Acids Res 14: 2287-2300 [1986], O'Gorman y col., Science 251:1351-55 [1991], van Deursen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7376-80 [1995], y la patente de EE.UU. Nº 6,025,192). Tras la integración de los vectores en el genoma de la célula huésped, la célula huésped se puede transfeccionar de forma transitoria (p. ej., mediante electroporación, lipofección o microinyección) con una enzima recombinasa (p. ej., recombinasa Cre) o una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima recombinasa y una o más secuencias de ácido nucleico que codifica una proteína de interés flanqueada por las secuencias reconocidas por la enzima de recombinación de modo que la secuencia de ácido nucleico se inserta en el vector integrado.
Los vectores virales, incluidos los vectores retrovirales, proporcionan un medio más eficiente de transferir genes a las células en comparación con otras técnicas, tales como co-precipitación fosfato cálcico-AND o transfección mediada por DEAE-dextrano, electroporación o microinyección de ácidos nucleicos. Se cree que la eficiencia de la transferencia viral se debe, en parte, al hecho de que la transferencia de ácido nucleico es un proceso mediado por receptor (es decir, el virus se une a una proteína receptora específica sobre la superficie de la célula que se va a infectar). Además, una vez dentro de una célula, el ácido nucleico transferido con virus se integra de un modo controlado en contraste con la integración de ácidos nucleicos no transferidos viralmente; los ácidos nucleicos transferidos por otros medios tales como co-precipitación en fosfato cálcico-ADN se someten a reordenación y degradación.
Los vectores retrovirales recombinantes más usados derivan del virus de la leucemia murina de Moloney anfotrópico (MoMLV) (véase, por ejemplo, Miller y Baltimore Mol. Cell. Biol. 6:2895 [1986]). El sistema MoMLV tiene varias ventajas: 1) este retrovirus específico puede infectar a muchos tipos celulares diferentes, 2) se dispone de líneas celulares de empaquetamiento establecidas para la producción de partículas virales recombinantes de MoMLV y 3) los genes transferidos se integran de forma permanente en el cromosoma celular diana. Los sistemas del vector MoMLV establecidos comprenden un vector de ADN que contiene una porción pequeña de la secuencia retroviral (p. ej., la repetición terminal larga viral o “LTR” y la señal de empaquetamiento o “psi”) y una línea celular de empaquetamiento. El gen que se va a transferir se inserta en el vector de ADN. Las secuencias virales presentes en el vector de ADN proporcionan las señales necesarias para la inserción o empaquetamiento del ARN del vector en la partícula viral y para la expresión de gen insertado. La línea celular de empaquetamiento proporciona las proteínas requeridas para el ensamblaje de las partículas (Markowitz y col., J. Virol. 62:1120 [1988]).
A pesar de estas ventajas, los vectores retrovirales existentes basados en MoMLV están limitados por varios problemas intrínsecos: 1) no infectan las células que no están en división (Miller y col., Mol. Cell. Biol. 10:4239 [1990]), excepto, quizá, los oocitos; 2)
producen títulos bajos del virus recombinante (Miller y Rosman, BioTechniques 7: 980 [1980] y Miller, Nature 357: 455 [1990]); y 3) infectan ciertos tipos de células (p. ej., linfocitos humanos) con una eficiencia baja (Adams y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8981 [1992]). Los bajos títulos asociados con vectores basados en MoMLV se han atribuido, al menos en parte, a la inestabilidad de la proteína de la cubierta codificada por el virus. La concentración
de las reservas de retrovirus por medios físicos (p. ej., ultracentrifugación y ultrafiltración) conduce a una pérdida intensa de virus infecciosos.
El bajo título y la infección ineficiente de ciertos tipos de células por vectores a base de MoMLV se han superado mediante el uso de vectores retrovirales seudotipados que contienen la proteína G del VSV como la proteína asociada a la membrana. Al contrario que las proteínas de la cubierta retroviral que se unen a un receptor proteico de la superficie celular específico para poder entrar en una célula, la proteína G del VSV interacciona con un componente fosfolipídico de la membrana plasmática (Mastromarino y col., J. Gen. Virol. 68:2359 [1977]). Dado que la entrada del VSV en una célula no depende de la presencia de receptores proteicos específicos, el VSV tiene un abanico de huéspedes extremadamente amplio. Los vectores retrovirales seudotipados que llevan la proteína G del VSV tienen un abanico de huéspedes alterados características del VSV (es decir, pueden infectar a casi todas las especies de células de vertebrados, invertebrados y de insectos). Es importante el hecho de que los vectores retrovirales seudotipados asociados a proteína G del VSV se pueden concentrar por 2.000 veces o más mediante ultracentrifugación sin una pérdida significativa de infectividad (Burns y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 [1993]).
La presente divulgación no está limitada al uso de la proteína G del VSV cuando se usa una proteína G viral como la proteína heteróloga asociada a la membrana dentro de una partícula viral (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5,512,421). Las proteínas G de los virus en el género Vesiculovirus distintos al VSV, tal como los virus Piry y Chandipura, que son altamente homólogas a la proteína G del VSV y, como la proteína G del VSV, contienen ácido palmítico unido covalentemente (Brun y col. Intervirol. 38:274 [1995] y Masters y col., Virol. 171:285 (1990]). Por tanto, la proteína G de los virus Piry y Chandipura se puede usar en lugar de la proteína G del VSV para el seudotipado de las partículas virales. Además, las proteínas G del VSV de los virus dentro del género de virus Lyssa, tales como los virus de la rabia y Mokola, muestran un elevado grado de conservación (secuencia de aminoácidos así como la conservación funcional) con las proteínas G del VSV. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína G del virus Mokola funciona de un modo similar a la proteína G del VSV (es decir, para mediar en la fusión con la membrana) y, por tanto, se puede usar en lugar de la proteína G del VSV para el seudotipado de las partículas virales (Mebatsion y col., J. Virol. 69:1444 [1995]). Las partículas virales se pueden seudotipar usando la proteína G de los virus Piry, Chandipura o Mokola, como se ha descrito en el Ejemplo 1, con la excepción de que se usa un plásmido que contiene secuencias que codifican la proteína G de Piry, Chandipura o Mokola bajo el control transcripcional de un elemento promotor adecuado (p. ej., el promotor intermedio-temprano del CMV; existen numerosos vectores de expresión que contienen el promotor IE del CMV, tal como los vectores pcDNA3.1 (Invitrogen)) en lugar de pHCMV-G. Se pueden usar secuencias que codifican otras proteínas G derivadas de otros miembros de la familia Rhabdoviridae; en la base de datos GenBank existen secuencias que codifican numerosas proteínas G de rabdovirus.
La mayoría de los retrovirus se puede transferir o integrar una forma lineal bicatenaria del virus (el provirus) en el genoma de la célula receptora únicamente si la célula receptora está en ciclación (es decir, en división) en el momento de la infección. Los retrovirus que se ha demostrado que infectan exclusivamente a las células en división,
o con más eficiencia, incluyen el MLV, el virus de la necrosis del bazo, el virus del sarcoma de Rous y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH; aunque el VIH infecta a las células en división con mayor eficiencia, el VIH puede infectar a las células que no están en división).
Se ha demostrado que la integración del ADN del virus MLV depende de la progresión de la célula huésped a través de la mitosis y se ha postulado que la dependencia de la mitosis refleja un requisito de la degradación de la cubierta nuclear con el fin de que el complejo de integración viral entre en el núcleo (Roe y col., EMBO J. 12:2099 [1993]) No obstante, dado que la integración no se produce en las células detenidas en la metafase, la degradación de la cubierta nuclear solo puede no ser suficiente para permitir la integración viral; puede haber requisitos adicionales, tales como el estado de condensación del ADN genómico (Roe y col., ant.).
B. Vectores lentivirales
La presente divulgación también contempla el uso de vectores lentivirales para generar líneas celulares en un número de copias alto. Los lentivirus (p. ej., virus de la anemia infecciosa equina, virus de la encefalitis-artritis caprina, virus de la inmunodeficiencia humana) son una subfamilia de los retrovirus que pueden integrarse en las células que no están en división. El genoma lentiviral y el ADN proviral tienen tres genes que se encuentran en todos los retrovirus. gag, pol y env, que están flanqueados por dos secuencias LTR. El gen de gaf codifica las proteínas estructurales internas (p. ej., proteínas de la matriz, la cápside y la nucleocápside); el gen pol codifica las proteínas transcriptasa inversa, proteasa e integrasa; y el gen pol codifica las glicoproteínas de la cubierta viral. Las LTR en 5’ y 3’ controlan la transcripción y la poliadenilación de los ARN virales. Los genes adicionales en el genoma lentiviral incluyen los genes de vif, vpr, tat, rev, vpu, nef y vpx.
En la técnica se conocen diversos vectores lentivirales y líneas celulares de empaquetamiento y encuentran utilidad en la presente divulgación (véase, p. ej., las patentes de EE.UU. Nº 5,994,136 y 6,013,516). Además, la proteína G del VSV también se ha usado para seudotipar vectores retrovirales basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Naldini y col., Science 272:263 [1996]). Por tanto, la proteína G del VSV se puede usar para generar diversos vectores retrovirales seudotipados y no está limitada a vectores basados en MoMLV. Los vectores
lentivirales también se pueden modificar tal como se ha descrito en lo que antecede para contener varias secuencias reguladoras (p. ej., secuencias del péptido señal, elementos de exportación de ARN e IRES). Después de producir los vectores lentivirales, se pueden usar para transfeccionar células huésped como se ha descrito en lo que antecede para los vectores retrovirales.
C. Transfección a multiplicidades de infección altas
Una vez que se han producido los vectores de integración (p. ej., los vectores retrovirales) que codifican una proteína de interés, pueden usarse para transfeccionar o transducir células huésped (ejemplos de los cuales se describen en lo que antecede en la Sección I). Preferentemente, las células huésped se transfeccionan o transducen con vectores de integración a una multiplicidad de infección suficiente para dar lugar a la integración de al menos 1, y preferentemente al menos 2 o más, vectores retrovirales. En algunos otros casos se pueden usar multiplicidades de infección de 10 a 1.000.000, de modo que los genomas de las células huésped infectadas contienen de 2 a 100 copias de los vectores integrados y, preferentemente, de 5 a 50 copias de los vectores integrados. En otros casos se usa una multiplicidad de infección de 10 a 10.000. Cuando se usan vectores retrovirales no seudotipados para infección, las células huésped se incuban con el medio de cultivo de las células productoras retrovirales que contienen el título deseado (es decir, unidades formadoras de colonias, UFC) de vectores infecciosos. Cuando se usan vectores retrovirales seudotipados, los vectores se concentran hasta el título adecuado mediante ultracentrifugación y después se añaden al cultivo de la célula huésped. Como alternativa, los vectores concentrados se pueden diluir en un medio de cultivo adecuado para el tipo de célula. Adicionalmente, cuando se desea la expresión de más de una proteína de interés por la célula huésped, las células huésped se pueden transfeccionar con múltiples vectores, en los que cada uno de ellos contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de interés diferente.
En cada caso, las células huésped se exponen al medio que contiene los vectores retrovirales infecciosos durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la infección y la posterior integración de los vectores. En general, la cantidad de medio usada para recubrir las células deberá mantenerse a un volumen lo más pequeño posible de modo que se estimula la cantidad máxima de acontecimientos de integración por célula. Como norma general, el número de unidades formadoras de colonias (ufc) por mililitro deberá ser de aproximadamente 105 a 107 ufc/ml en función del número de acontecimientos de integración deseados.
La presente divulgación no está limitada a ningún mecanismo de acción concreto. De hecho, no es necesario conocer el mecanismo de acción para la práctica de la presente invención. No obstante, se sabe que la tasa de difusión de los vectores es muy limitada (véase, p. ej., la patente de EE.UU. Nº 5.866.400). Por tanto, cabe esperar que la tasa de integración real será menor (y en algunos casos mucho menor) que la multiplicidad de infección. Aplicando las ecuaciones de la patente de EE.UU. Nº 5.866.400, un título de 106 ufc/ml tiene una separación media vector-vector de 1 micrómetro. El tiempo de difusión de un vector de MMLV a través de 100 micrómetros es de aproximadamente 20 minutos. De acuerdo con esto, el vector puede viajar aproximadamente 300 micrómetros en una hora. Si se siembran 1.000 células en un matraz T25, las células se separan 2,5 mm de media. Usando estos valores, cabría esperar que solo 56 partículas virales contacten con una célula dada en una hora. La siguiente Tabla proporciona la tasa de contacto esperada para un número dado de células en un matraz T25 con un título de vector concreto. No obstante, como se muestra más adelante en los ejemplos, el número real de integraciones obtenidas es mucho menor de lo que se puede predecir con estas ecuaciones.
Frecuencia de contacto del vector como función del tiempo y separación celular
Título del vector
Células/Matraz T25 MOI Contactos/hora
106
1000 1.000 56
106
100 10.000 <56
105
1000 100 5.6
104
1000 10 0.6
En consecuencia, se contempla que la tasa de integración real depende no solo de la multiplicidad de infección sino también del tiempo de contacto (es decir, la longitud de tiempo que las células huésped están expuestas al vector infeccioso), la confluencia o geometría de las células huésped que se están transfeccionando y el volumen de medio en el que están contenidos los vectores. Se contempla que estas condiciones se pueden variar, como se indica en el presente documento, para producir líneas de células huésped que contienen múltiples copias integradas de vectores de integración. Como se depuesta en los Ejemplos 8 y 9, la MOI se puede variar manteniendo el número de células constante y variando las UFC (Ejemplo 9) o manteniendo las UFC constantes y variando el número de células (Ejemplo 8).
En algunas realizaciones, tras la transfección o transducción, se deja que las células se multipliquen y, después, se someten a digestión con tripsina y se vuelven a sembrar en placas. Después se seleccionan las colonias individuales para proporcionar líneas celulares seleccionadas clonalmente. En otras realizaciones más, las líneas celulares seleccionadas clonalmente se someten a detección selectiva mediante transferencia Southern o ensayo INVADER
para verificar que se ha producido el número deseado de acontecimientos de integración. También se contempla que la selección clonal permite la identificación de líneas celulares productoras de proteínas superiores. En otras realizaciones, las células no se seleccionan clonalmente tras la transfección.
En algunas realizaciones, las células huésped se transfeccionan con vectores que codifican diferentes proteínas de interés. Los vectores que codifican diferentes proteínas de interés se pueden usar para transfeccionar las células al mismo tiempo (p. ej., las células huésped se exponen a vectores que contienen una solución que codifican diferentes proteínas de interés) o la transfección puede ser en serie (p. ej., las células huésped se transfeccionan primero con un vector que codifica una primera proteína de interés, se deja pasar un periodo de tiempo y las células huésped se transfeccionan después con un vector que codifica una segunda proteína de interés).
En algunas otras realizaciones, las células huésped se transfeccionan con un vector de integración que codifica una primera proteína de interés, se seleccionan líneas celulares de alta expresión que contienen múltiples copias integradas del vector de integración (p. ej., seleccionadas clonalmente) y la línea celular seleccionada se transfecciona con un vector de integración que codifica una segunda proteína de interés. Este proceso se puede repetir para introducir múltiples proteínas de interés. En algunas realizaciones, las multiplicidades de infección se pueden manipular (p. ej., aumentar o disminuir) para aumentar o disminuir la expresión de la proteína de interés. Asimismo, los diferentes promotores se pueden usar para variar la expresión de las proteínas de interés. Se contempla que estos procedimientos de transfección se puedan usar para construir líneas de células huésped que contienen toda una vía metabólica exógena o para proporcionar células huésped con una mayor capacidad para procesar proteínas (p. ej., las células huésped se pueden proporcionar con enzimas necesarias para modificación postraduccional).
En otras realizaciones más, las líneas celulares se transfeccionan en serie con vectores que codifican el mismo gen. En algunas otras realizaciones, las células huésped se transfeccionan (p. ej., a una MOI de aproximadamente 10 a 100.000, preferentemente de 100 a 10.000) con un vector de integración que codifica una proteína de interés, se seleccionan líneas celulares que contienen una o múltiples copias integradas del vector de integración o expresan niveles elevados de la proteína deseada (p. ej., seleccionadas clonalmente) y la línea celular seleccionada se vuelve a transfeccionar con el vector (p. ej., a una MOI de 10 a 100.000, preferentemente de 100 a 10.000). En algunas realizaciones, se identifican y seleccionan líneas celulares que comprenden al menos dos copias integradas del vector. Este proceso se puede repetir múltiples veces hasta obtener el nivel deseado de expresión proteica y también pueden repetirse para introducir vectores que codifican múltiples proteínas de interés. Inesperadamente, la transfección en serie con el mismo gen tiene como resultado incrementos de la producción de proteínas a partir de las células resultantes que no son meramente aditivos.
III. Usos de las células huésped transfeccionadas
Las células huésped transfeccionadas a una multiplicidad de infección alta se pueden usar con varios fines. En primer lugar, las células huésped encuentran utilidad en la producción de proteínas para fines farmacéuticos, industriales, diagnósticos y de otros tipos. En segundo lugar, las células huésped que expresan una proteína o proteínas concretas encuentran utilidad en ensayos de detección selectiva (p. ej., detección selectiva de alto rendimiento). En tercer lugar, las células huésped encuentran utilidad en la producción de múltiples variantes de proteínas, seguido del análisis de la actividad de las variantes proteicas. Cada uno de estos usos se explica con más detalle a continuación.
A. Producción de proteínas
Se contempla que las células huésped de la presente divulgación encuentran utilidad en la producción de proteínas para usos farmacéuticos, industriales, diagnósticos y de otros tipos. La presente divulgación no está limitada a la producción de ninguna proteína concreta. De hecho, se contempla la producción de una amplia variedad de proteínas, incluidas, entre otras, eritropoyetina, alfa-interferón, inhibidor de la alfa-1 proteinasa, angiogenina, antitrombina III, beta-ácido descarboxilasa, hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento bovina, hormona de crecimiento porcina, seroalbúmina humana, interferón beta, fosfatasa alcalina de intestino de ternero, regulador transmembrana de la fibrosis quística, factor VIII, factor IX, factor X, insulina, lactoferrina, activador del plasminógeno tisular, proteína básica de la mielina, insulina, proinsulina, prolactina, antígeno de la hepatitis B, inmunoglobulinas, anticuerpo monoclonal Ig CTLA4, anticuerpo monoclonal Tag 72, proteína de unión a antígeno de cadena sencilla Tag 72, proteína C, citocinas y sus receptores, incluidos, por ejemplo, factores de necrosis tumoral alfa y beta, sus receptores y sus derivados; renina; factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratifoidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factor de von Willebrand; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; uroquinasa; bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; encefalinasa; proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa); un seroalbúmina tal como la sustancia de inhibición mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; beta-lactamasa; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento neural tal como NGF-beta; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tales
como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor transformante de crecimiento (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-31, TGF^2, TGF-33, TGF^4, o TGF-35; factor I y II de crecimiento similar a la insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8, y CD-19; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), p. ej., IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; factor acelerante del deterioro; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la cubierta del SIDA; proteínas transportadoras; receptores de localización; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; proteínas quiméricas tales como inmunoadhesinas, y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente. Las secuencias de ácido nucleico proteicas para estas proteínas están disponibles en las bases de datos públicas, tales como GenBank.
En algunas realizaciones, las células huésped expresan más de una proteína exógena. Por ejemplo, las células huésped pueden ser vectores transfeccionados que codifican diferentes proteínas de interés (p. ej., cotransfección o infección a una multiplicidad de infección de 1.000 con un vector que codifica una primera proteína de interés y un segundo vector que codifica una segunda proteína de interés o transfección o infección en serie), de modo que la célula huésped contiene al menos una copia integrada de un primer vector que codifica una primera proteína de interés y al menos una copia integrada del segundo vector de integración que codifica una segunda proteína de interés.
En otras realizaciones se expresa más de una proteína organizando los ácidos nucleicos que codifican las diferentes proteínas de interés en una secuencia policistrónica (p. ej., secuencias bicistrónicas o tricistrónicas). Esta organización es especialmente útil cuando se desee la expresión de las diferentes proteínas de interés en aproximadamente una proporción molar de 1:1 (p. ej., expresión de las cadenas ligera y pesada de una molécula de anticuerpo).
EN otras realizaciones más, las ribozimas se expresan en las células huésped. Se contempla que la ribozima se puede usar para regular por disminución la expresión de un gen concreto o usar junto con desplazamientos génicos tales como TET, ecdisona, potenciador de glucocorticoide etc., para proporcionar células huésped con varios fenotipos.
Las células huésped transfeccionadas se cultivan de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. En la técnica se conocen bien condiciones de cultivo adecuadas para células de mamífero (véase, por ejemplo, J. Immunol. Methods (1983)56:221-234 [1983], Animal Cell Culture: A Practical Approach 2ª edición, Rickwood, D. y Hames, B.D. eds., Oxford University Press, New York [1992]).
Los cultivos de células huésped de la presente divulgación se preparan en un medio adecuado para la célula concreta que se esté cultivando. Los medios disponibles comercialmente, tal como medio F10 de Ham (Sigma, St. Louis, MO), medio mínimo esencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma), son ejemplos de soluciones nutritivas. En las patentes de EE.UU. Nº 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 5,122,469; 4,560,655 y los documentos WO 90/03430 y WO 87/00195 también se describen medios adecuados. Cualquiera de estos medios se pueden suplementar en caso necesario con suero, hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o el factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), lípidos (tales como ácidos linoleico u otros ácidos grasos) y sus vehículos adecuados, y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también se puede incluir a concentraciones adecuadas que conocerían los expertos en la técnica. Para cultivos de células de mamífero, la osmolalidad del medio de cultivo es, generalmente, de aproximadamente 290-330 mOsm.
La presente divulgación también contempla el uso de diversos sistemas de cultivo (p. ej., placas petri, placas de 96 pocillos; frascos giratorios y biorreactores) para las células huésped transfeccionadas. Por ejemplo, las células huésped transfeccionadas se pueden cultivar en un sistema de perfusión. El cultivo de perfusión se refiere a proporcionar un flujo continuo de medio de cultivo a través de un cultivo mantenido a una densidad celular elevada. Las células se suspenden y no requieren un soporte sólido para continuar el crecimiento. En general se deben suministrar nutrientes frescos de forma continua con eliminación concomitante de los metabolitos tóxicos e, idealmente, eliminación selectiva de células muertas. Los procedimientos de filtración, atrapamiento y microencapsulación son todos ellos adecuados para refrescar el medio de cultivo a velocidades suficientes.
Como otro ejemplo, en algunas realizaciones se puede emplear un procedimiento de cultivo de alimentación discontinua. En el cultivo discontinuo preferid, las células huésped de mamífero y el medio de cultivo se suministran en un vaso de cultivo inicialmente y se introducen nutrientes de cultivo adicionales, de forma continua o en incrementos pequeños, al cultivo durante el cultivo con o sin recolección periódica de células y/o productos antes de la finalización del cultivo. El cultivo discontinuo puede incluir, por ejemplo, un cultivo discontinuo semicontinuo, en el que, periódicamente, el cultivo entero (incluidas las células y medio) se retira y se sustituye por medio fresco. El cultivo discontinuo se distingue del cultivo discontinuo simple en que todos los componentes para cultivo celular
(incluidas las células y todos los nutrientes del cultivo) se suministran al vaso de cultivo al principio del proceso de cultivo. El cultivo discontinuo se puede distinguir además del cultivo por perfusión en que el sobrenadante no se extrae del vaso de cultivo durante el proceso (en el cultivo por perfusión, las células se conservan en el cultivo mediante, por ejemplo, filtración, encapsulación, anclaje a microtransportadores etc. y el medio de cultivo se introduce de forma continua o intermitente y se retira del vaso de cultivo). En algunas realizaciones particularmente preferidas, los cultivos discontinuos se realizan en frascos giratorios.
Además, las células del cultivo se pueden propagar de acuerdo con cualquier esquema o rutina que puede ser adecuada para la célula huésped concreta y el plan de producción concreto contemplado. Por tanto, la presente divulgación contempla un procedimiento de cultivo de una sola etapa o de múltiples etapas. En un cultivo de una sola etapa, las células huésped se inoculan en un ambiente de cultivo y los procesos de la presente invención se emplean durante una única fase de producción del cultivo celular. Como alternativa se concibe un cultivo de múltiples etapas. En el cultivo de múltiples etapas, las células se pueden cultivar en una serie de etapas o fases. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en una primera etapa o cultivo en fase de crecimiento en el que las células, posiblemente obtenidas del almacenamiento, se inoculan en un medio adecuado para estimular el crecimiento y una viabilidad alta. Las células se pueden mantener en la fase de crecimiento durante un periodo de tiempo adecuado mediante la adición de medio fresco al cultivo de células huésped.
Las condiciones de cultivo celular discontinuo o continuo potencian el crecimiento de las células de mamífero en la fase de crecimiento del cultivo celular. En la fase de crecimiento, las células crecen en condiciones y durante un periodo de tiempo que se maximiza para el crecimiento. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto (dO2) y similares, son las usadas con la célula huésped concreta y serán evidentes para el experto en la técnica. En general, el pH se ajusta hasta un nivel entre aproximadamente 6,5 y 7,5 usando un ácido
(p. ej., CO2) o una base (p. ej., Na2CO3 o NaOH). Un intervalo de temperatura adecuada para cultivar las células de mamífero, tales como células CHO, está entre aproximadamente 30 º a 38 ºC y una dO2 adecuada está entre 5-90 % de saturación de aire.
Tras la fase de producción del polipéptido, el polipéptido de interés se recupera del medio de cultivo usando técnicas que están bien establecidas en la técnica. La proteína de interés se recupera, preferentemente, del medio de cultivo como un polipéptido secretado (p. ej., la secreción de la proteína de interés está dirigida por una secuencia de péptido señal), aunque también se puede recuperar de los lisados de las células huésped. Como una primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar los residuos celulares particulados. Después, el polipéptido se purifica a partir de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, siendo los procedimientos siguientes ejemplos de procedimientos de purificación adecuados. fraccionamiento en columnas de intercambio iónico o inmunoafinidad; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico, por ejemplo DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación en sulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo Sephadex G-75, columnas de Sefarosa A para eliminación de contaminantes tales como IgG. Un inhibidor de proteasa, tales como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación. Adicionalmente, la proteína de interés se puede condensar en el marco con una secuencia marcadora que permite la purificación de la proteína de interés. Ejemplos no limitantes de secuencias marcadores incluyen un marcador de hexahistidina que puede suministrar un vector, preferentemente un vector pQE-9 y un marcador de hemaglutinina (HA). El marcador HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (véase, p. ej., Wilson y col., Cell, 37:767 [1984]). Un experto en la técnica apreciará que los procedimientos de purificación adecuados para el polipéptido de interés pueden requerir modificación para justificar los cambios en la naturaleza del polipéptido tras la expresión en cultivo celular recombinante.
Las células huésped de la presente divulgación también son útiles para expresar receptores acoplados a proteína G (GPCR) y otras proteínas transmembrana. Se contempla que cuando se expresan estas proteínas, se insertan correctamente en la membrana en su conformación nativa. Por tanto, los GPCR y otras proteínas transmembrana se pueden purificar como parte de una fracción de membrana o purificar a partir de las membranas mediante procedimientos conocidos en la técnica.
Además, los vectores de la presente divulgación son útiles para la coexpresión de una proteína de interés para la cual no hay ensayo o para la cual los ensayos son difíciles. En este sistema, una proteína de interés y una proteína señal están dispuestas en una secuencia policistrónica. Preferentemente, una secuencia IRES separa la proteína señal y la proteína de interés (p. ej., un GPCR) y los genes que codifican la proteína señal y la proteína de interés se expresan como una única unidad transcripcional. La presente divulgación no está limitada a ninguna proteína señal concreta. De hecho, se contempla el uso de diversas proteínas señal para las que existen ensayos fáciles. Estas proteínas señal incluyen, entre otras, la proteína fluorescente verde, la luciferasa, la beta-galactosidasa y las cadenas pesadas o ligeras de anticuerpos- Se contempla que cuando la proteína señal y la proteína de interés se coexpresan a partir de una secuencia policistrónica, la presencia de la proteína señal es indicativa de la presencia de la proteína de interés. En consecuencia, en algunas realizaciones más, la presente divulgación proporciona procedimientos de detectar indirectamente la expresión de una proteína de interés que comprende proporcionar una célula huésped transfeccionada con un vector que codifica una secuencia policistrónica, en los que la secuencia policistrónica comprende una proteína señal y una proteína de interés unidas funcionalmente por una IRES, y cultivar las células huésped en condiciones tales que se producen la proteína señal y la proteína de interés, en los que la presencia de la proteína señal indica la presencia de la proteína de interés.
B. Detección selectiva de la actividad de compuestos
La presente divulgación contempla el uso de líneas celulares de alto número de copias para la detección selectiva de compuestos según su actividad y, en particular, para la detección selectiva de alto rendimiento de compuestos de bibliotecas combinatorias (p. ej., bibliotecas que contienen más de 104 compuestos). Las líneas celulares de alto número de copias de la presente divulgación se pueden usar en diversos procedimientos de detección selectiva. En algunas realizaciones, las células se pueden usar en ensayos de segundo mensajero que monitorizan la transducción de señal tras la activación de receptores de superficie celular. En otras realizaciones, las células se pueden usar en ensayos de gen indicador que monitorizan las respuestas celulares a nivel de transcripción/traducción. En otras realizaciones más, las células se pueden usar en ensayos de proliferación celular para monitorizar la respuesta de crecimiento global/no crecimiento de las células a estímulos externos.
En los ensayos de segundo mensajero, las células huésped se transfeccionan preferentemente como se ha descrito en lo que antecede con vectores que codifican los receptores de superficie celular, canales iónicos, receptores citoplasmáticos u otras proteínas implicadas en la transducción de seña (p. ej., proteínas G, proteínas quinasas o proteína fosfatasas) (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nº 5,670,113; 5,807,689; 5,876,946; y 6,027,875). Después, las células huésped se tratan con un compuesto o pluralidad de compuestos (p. ej., de una biblioteca combinatoria) y se analiza la presencia o ausencia de una respuesta. Se contempla que al menos algunos de los compuestos de la biblioteca combinatoria pueden servir como agonistas, antagonistas, activadores o inhibidores de la proteína o proteínas codificadas por los vectores. También se contempla que al menos algunos de los compuestos de la biblioteca combinatoria pueden servir como agonistas, antagonistas, activadores o inhibidores de la proteína que actúa antes o después de la proteína codificada por el vector en una vía de transducción de señal.
Por ejemplo, se sabe que el agonista acoplado a los receptores transmembrana está funcionalmente unido a la modulación de varios elementos promotor/potenciador bien caracterizados (p. ej., AP1, elemento de respuesta al AMPc (CRE), elemento de respuesta al suero (SER) y el factor nuclear de las células T activadas (NF-AT)). Tras la activación de un receptor de acoplamiento a Gas se estimula a adenilato ciclasa, produciendo mayores concentraciones de AMPc intracelular, estimulación de la proteína quinasa A, fosforilación de la proteína de unión a CRE (CREB) e inducción de promotores con elementos CRE. Los receptores de acoplamiento a Gas pierden actividad CRE mediante inhibición de los mismos componentes de la transducción de señal. Gaq y algunos pares y estimulan la fosfolipasa C (PLC) y la generación de inositol trifosfato (IP3) y de diacilglicerol (DAG). Un flujo transitorio en el calcio intracelular estimula la inducción de calcineurina y NA-FT, así como la quinasa dependiente de calmodulina (CaM) y CREB. Mayores concentraciones de DAG estimulan la proteína quinasa C (PKC) y la esfingomielinasa ácida endosomal/lisosomal (aSMasa); aunque la vía de la aSMasa es dominante, ambas inducen la degradación del inhibidor de NFKBIKB, así como la activación de NFKB. En una vía alternativa, un receptor tal como el receptor del factor de crecimiento se activa y recluta Sos en la membrana plasmática, que tiene como resultado la estimulación de Ras, que, a su vez, recluta la serina/treonina quinasa Raf para la membrana plasmática. Una vez activada, la Raf fosforila la MEK quinasa, que fosforila y activa la MAPK y el vector de transcripción ELK. ELK dirige la transcripción desde los promotores con elementos SER, que conduce la síntesis de los factores de transcripción Fos y Jun, de modo que se forma un complejo de factor de transcripción capaz de activar los sitios AP1. Se contempla que las proteínas que forman las vías descritas, así como otros receptores, quinasas, fosfatasas y proteínas de unión a ácido nucleico, son dianas para los compuestos de la biblioteca combinatoria, así como candidatos para la expresión en las células huésped de la presente invención.
En algunas realizaciones, los ensayos de segundo mensajero miden las señales fluorescentes de moléculas indicadoras que responden a cambios intracelulares (p. ej., concentración de Ca2+, potencial de membrana, pH, IP3, AMPc, liberación de ácido araquidónico) debido a la estimulación de los receptores de membrana y canales iónicos
(p. ej., canales iónicos dependientes de ligando; véase Denyer y col., Drug Discov. Today 3:323-32 [1998]; y Gonzales y col.., Drug. Discov. Today 4:431-39 [1999]). Ejemplos de moléculas indicadoras incluyen, entre otras, sistemas FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) (p. ej., Cuo-lípidos y oxonoles, EDAN/DABCYL), indicadores sensibles a calcio (p. ej., Fluo-3, FURA 2, INDO 1 y FLUO3/AM, BAPTA AM), indicadores sensibles a cloruro (p. ej., SPQ, SPA), indicadores sensibles a potasio (p. ej., PBFI), indicadores sensibles a sodio (p. ej., SBFI) e indicadores sensibles a pH (p. ej., BCECF).
En general, las células huésped se cargan con el indicador antes de la exposición al compuesto. Las respuestas de las células huésped al tratamiento con los compuestos se pueden detectar mediante procedimientos conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, microscopia de fluorescencia, microscopia confocal (p. ej., sistemas FCS), citometría de flujo, dispositivos microfluídicos, sistemas FLIPR (véase, por ejemplo, Schroeder y Neagle, J. Biomol. Screening 1:75-80 [1996]), y sistemas de lectura de placas. En algunas realizaciones, la respuesta (p. ej., incremento de la intensidad de la fluorescencia) producida por el compuesto de actividad desconocida se compara con la respuesta generada por un agonista conocido y se expresa como un porcentaje de la respuesta máxima del agonista conocido. La respuesta máxima producida por un agonista conocido se define como una respuesta de 100 %. Asimismo, la respuesta máxima registrada tras la adición de un agonista a una muestra que contiene un antagonista conocido o de ensayo es detectablemente menor que la respuesta del 100 %.
Las células también son útiles en ensayos génicos indicadores. Los ensayos génicos indicadores implican el uso de células huésped transfeccionadas con vectores que codifican un ácido nucleico que comprende elementos de control
de la transcripción de un gen diana (es decir, un gen que controla la expresión biológica y la función de una enfermedad diana) sometidas a corte y empalme a una secuencia de codificación para un gen indicador. Por tanto, la activación del gen diana tiene como resultado la activación del producto génico indicador. Ejemplos de genes indicadores que encuentran utilidad en la presente divulgación incluyen, entre otros, cloranfenicol transferasa, fosfatasa alcalina, luciferasas de luciérnaga y bacterianas, beta-galactosidasa, beta-lactamasa y proteína fluorescente verde. La producción de estas proteínas, con la excepción de la proteína fluorescente verde, se detecta mediante el uso de productos quimioluminiscentes, colorimétricos, bioluminiscentes de sustratos específicos (p. ej., X-gal y luciferina). Las comparaciones entre compuestos de actividades conocidas y desconocidas se pueden realizar como se ha descrito en lo que antecede.
C. Comparación de la actividad proteica variante
La presente divulgación también contempla el uso de células huésped con un número alto de copias para producir variantes de proteínas de modo que se puede comparar la actividad de las variantes. En algunas realizaciones, las variantes difieren en un polimorfismo nucleotídico único (SNP) que da lugar a una diferencia en un solo aminoácido. En otras realizaciones, las variantes contienen múltiples sustituciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, la actividad de las proteínas variantes se analiza in vivo o en extractos celulares. En otras realizaciones, las proteínas se purifican y analizan in vitro. También se contempla que en algunas realizaciones, las proteínas variantes se condensan a una secuencia que permite la fácil purificación (p. ej., una secuencia marcadora de his) o a un gen indicador (p. ej., la proteína fluorescente verde). La actividad de las proteínas se puede analizar mediante procedimientos adecuados conocidos en la técnica (p. ej., conversión de un sustrato en un producto). En algunas realizaciones se determina la actividad de una proteína salvaje y la actividad de las versiones variantes de las proteínas salvajes se expresan como un porcentaje de la actividad de la proteína salvaje. Además, la actividad intracelular de las proteínas variantes se puede comparar construyendo una pluralidad de líneas de células huésped, cada una de las cuales expresa una variante diferente de la proteína salvaje. La actividad de las proteínas variantes
(p. ej., variantes de proteínas implicadas en las vías de transducción de señal) puede compararse después usando los sistemas indicadores para los ensayos de segundo mensajero descritos anteriormente. Por tanto, en algunas realizaciones, se compara la respuesta directa o indirecta (p. ej., mediante activación cadena abajo o cadena arriba de la vía de transducción de señal) de las proteínas variantes a la estimulación o unión por agonistas o antagonistas. En algunas realizaciones se determina la respuesta de una proteína salvaje y las respuestas de versiones variantes de las proteínas salvajes se expresan como un porcentaje de la respuesta de la proteína salvaje.
SECCIÓN EXPERIMENTAL
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar ciertas realizaciones y aspectos de la presente divulgación e invención.
En las divulgación experimental, se aplican las siguientes abreviaturas: M (molar); mM (milimolar); 1M (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); mmol (milimoles); 1mol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); 1g (microgramos); pg (picogramos); l (litros); ml (mililitros); 1l (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); 1m (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grados centígra dos); AMP (adenosina 5'-monofosfato); BSA (seroalbúmina bovina); ADNc (ADN copia o complementario); CS (suero de ternera; ADN (ácido desoxirribonucleico); ADNss (ADN monocatenario); ADNds (ADN bicatenario); dNTP (desoxirribonucleótido trifosfato); LH (hormona luteinizante); NIH (National Institutes of Health, Besthesda, MD); ARN (ácido ribonucleico); PBS (solución salina tamponada con fosfato); g (gravedad); DO (densidad óptica); HEPES (ácido N-[2-Hidroxietil]piperazina-N-[2-etanosulfónico]); HBS (solución salina tamponada con HEPES); PBS (solución salina tamponada con fosfato); SDS (dodecilsulfato sódico); Tris-HCl (tris[Hidroximetil]aminometano-clorhidrato); Klenow (fragmento (Klenow) I de la ADN polimerasa); rpm (revoluciones por minuto); EGTA (etilenglicol-bis-aminoetiléter) ácido N, N, N', N'-tetraacético); EDTA (ácido etilendiaminotetracético); bla ( -lactamasa o gen de resistencia a ampicilina); ORI (origen de replicación plasmídico); lace (represor lac); X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-galactósido); ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD); GIBCO/BRL (GIBCO/BRL, Grand Island, NY); Perkin-Elmer (Perkin- Elmer, Norwalk, CT); y Sigma (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).
Ejemplo 1
Construcción del vector
El Ejemplo siguiente describe la construcción de vectores usados en los experimentos siguientes.
A. MN14 de CMV
El vector MN14 de CMV (SEC ID Nº 4; el anticuerpo MN14 se describe en la patente de EE.UU. Nº 5,874,540) comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’: promotor del CMV; péptido señal de la cadena pesada de MN14, cadena pesada del anticuerpo MN14; IRES del virus de la encefalomiocarditis; péptido señal de la α-lactoalbúmina bovina; cadena ligera del anticuerpo MN14; y LTR en 3’ de MoMuLV. Además de las secuencias descritas en la SEC ID Nº 4, el vector MN14 de CMV comprende además una LTR 5’ de MoMuLV, una señal de empaquetamiento vital extendida de MoMuLV y un gen de la neomicina fosfotransferasa (estos elementos adicionales se proporcionan en la SEC ID Nº 7; la LTR 5’ deriva del virus del sarcoma murino de Moloney en cada una de las construcciones descritas en el presente documento, pero se convierte en la LTR 5’ de MoMuLV cuando
se ha integrado).
Esta construcción usa la LTR 5’ de MoMuLV para controlar la producción del gen de la neomicina fosfotransferasa. La expresión del anticuerpo MN14 está controlada por el promotor del CMV. El gen de la cadena pesada y el gen de la cadena ligera de MN14 están unidos por una secuencia IRES. El promotor de CMV dirige la producción de un ARNm que contiene el gen de la cadena pesada y el gen de la cadena ligera unidos por el IRES. Los ribosomas se unen al ARN, en el sitio CAP y en la secuencia del IRES. Esto Permite que se produzca la proteína de cadena ligera y pesada a partir de un único ARNm. La expresión del ARN de la LTR, así como del promotor del CMV, se termina y poliadenila en la LTR 3'. La construcción se clonó mediante procedimientos similares como se describe en la sección B más adelante.
La secuencia IRES (SEC ID Nº 3) comprende una fusión del IRES del plásmido pLXIN (Clontech) y el péptido señal de la a-lactoalbúmina bovina. El ATG inicial del péptido señal se unió al IRES para permitir la iniciación de la traducción más eficiente a partir del IRES. El extremo 3’ del péptido señal proporciona un sitio de clonación múltiple que permite una unión fácil de cualquier proteína de interés para crear una proteína de fusión con el péptido señal. La secuencia IRES puede servir como potenciador de la traducción, así como para crear un segundo sitio de inicio de la traducción que permita producir dos proteínas a partir de un único ARNm.
El péptido señal de la a-lactoalbúmina bovina-IRES se construyó del siguiente modo. La porción del plásmido pLXIN (Clontech, Palo Alto, CA) que contiene el IRES de ECMV se amplificó mediante PCR usando los cebadores siguientes.
Cebador 1 (SEC ID Nº 35):
5' GATCCACTAGTAACGGCCGCCAGAATTCGC 3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 36):
5' CAGAGAGACAAAGGAGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG 3'
El cebador 2 se une a una cola correspondiente al inicio de la región de codificación del péptido señal de la alactoalbúmina bovina a la secuencia IRES. Además, el segundo codón de triplete del péptido señal de la alactoalbúmina se mutó desde ATG a GCC para permitir una traducción eficiente de la secuencia IRES. Esta mutación tiene como resultado un cambio de metionina a alanina en la secuencia proteica. Esta mutación se realizó porque el IRES prefiere una alanina como segundo aminoácido en la cadena proteica. El producto de la PCR del IRES resultante contiene un sitio EcoRI en el extremo 5’ del fragmento (justo cadena abajo del Cebador 1 anterior).
Después, el péptido señal de la a-lactoalbúmina que contiene la secuencia se amplificó mediante PCR a partir de la construcción vectorial del péptido señal de la a-LA usando los dejadores siguientes:
Cebador 3 (SEC ID Nº 14):
5' CTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCTCCTTTGTCTCTCTG 3'
Cebador 4 (SEC ID Nº 15):
5' TTCGCGAGCTCGAGATCTAGATATCCCATG 3'
El cebador 3 se une a una cola correspondiente al extremo 3’ de la secuencia del IRES a la región de codificación del péptido señal de la a-lactoalbúmina. Como se ha indicado en lo que antecede, el segundo codón de triplete del péptido señal de la a-lactoalbúmina bovina se mutó para permitir una traducción eficiente de la secuencia IRES. El fragmento resultante de la PCR del péptido señal contiene los sitios NaeI, NcoI, EcoRV, XbaI, BglII y XhoI en el extremo 3’.
Después de amplificar individualmente el IRES y el péptido señal usando los cebadores mostrados anteriormente. Los dos productos de la reacción se mezclaron y se realizó una PCR usando el cebador 1 y el cebador 4. El producto resultante de esta reacción es un fragmento de corte y empalme que contiene el IRES unido al péptido señal de la a-lactoalbúmina de longitud completa. El ATG que codifica el inicio del péptido señal se coloca en la misma localización que el ATG que codifica el inicio del gen de la neomicina fosfotransferasa encontrado en el vector pLXIN. El fragmento también contiene el sitio EcoRI en el extremo 5’ y los sitios NaeI, NcoI, EcoRV, XbaI, BglII y XhoI en el extremo 3’.
El fragmento de PCR del péptido señal de la α-lactoalbúmina/IRES sometido a corte y empalme se digirió con EcoRI y XhoI. La construcción del vector del péptido señal de la a-LA también se digirió con EcoRI y XhoI. Estos dos fragmentos se ligaron para dar la construcción Pires.
La porción del péptido señal de α-lactoalbúmina/IRES del vector pIRES se secuenció y se encontró que contenía mutaciones en el extremo 5’ del IRES. Estas mutaciones se producen en una tira larga de C y se encontraron en todos los clones que se aislaron.
Para reparar este problema, el ADN de pLXIN se digirió con EcoRI y BsmFI. Se aisló la banda de 500 pb correspondiente a una porción de la secuencia del IRES. La construcción del péptido señal de la α
lactoalbúmina/IRES mutada también se digirió con EcoRI y BsmFI, y se retiró el fragmento del IRES mutado. El fragmento del IRES de pLXIN se sustituyó después por el fragmento del IRES de la construcción del péptido señal de la α-lactoalbúmina/IRES mutada. La porción del péptido señal de la α-LA/IRES del plásmido resultante se verificó después mediante secuenciación del ADN.
La construcción resultante se encontró que tenía una serie de diferencias en la secuencia cuando se comparó con la secuencia pLXIN esperada obtenida de Clontech. Los autores también secuenciaron la porción del IRES de pLXIN adquirido de Clontech para verificar su secuencia. Las diferencias con respecto a la secuencia esperada también parecen estar presentes en el plásmido pLXIN que los autores obtuvieron de Clontech. Se identificaron cuatro diferencias en la secuencia:
347 pb T - era G en la secuencia de pLXIN
786-788 pb ACG- era GC en la secuencia de LXIN
B. LL2 de CMV
La construcción LL2 de CMV (SEC ID Nº 5; el anticuerpo LL2 se describe en la patente de EE.UU. Nº 6.187.287) comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’: promotor del CMV en 5’ (Clonetech), péptido señal de la cadena pesada de LL2, cadena pesada del anticuerpo LL2; IRES del virus de la encefalomiocarditis; péptido señal de la α-LA bovina; cadena ligera del anticuerpo LL2; y LTR en 3’ de MoMuLV. Además de la secuencia descrita en la SEC ID Nº 5, el vector LL2 de CMV comprende además una LTR 5’ de MoMuLV, una señal de empaquetamiento extendida de MoMuLV y un gen de la neomicina fosfotransferasa (estos elementos adicionales se proporcionan en la SEC ID Nº 7).
Esta construcción usa la LTR 5’ de MoMuLV para controlar la producción del gen de la neomicina fosfotransferasa. La expresión del anticuerpo LL2 está controlada por el promotor del CMV (Clontech). El gen de la cadena pesada y el gen de la cadena ligera de LL2 están unidos por una secuencia IRES. El promotor de CMV dirige la producción de un ARNm que contiene el gen de la cadena pesada y el gen de la cadena ligera unidos por el IRES. Los ribosomas se unen al ARN, en el sitio CAP y en la secuencia del IRES. Esto Permite que se produzca la proteína de cadena ligera y pesada a partir de un único ARNm. La expresión del ARN de la LTR, así como del promotor del CMV, se termina y poliadenila en la LTR 3'.
La secuencia IRES (SEC ID Nº 3) comprende una fusión del IRES del plásmido pLXIN (Clontech) y el péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina. El ATG inicial del péptido señal se unió al IRES para permitir la iniciación de la traducción más eficiente a partir del IRES. El extremo 3’ del péptido señal proporciona un sitio de clonación múltiple que permite una unión fácil de cualquier proteína de interés para crear una proteína de fusión con el péptido señal. La secuencia IRES puede servir como potenciador de la traducción, así como para crear un segundo sitio de inicio de la traducción que permita producir dos proteínas a partir de un único ARNm.
El gen de la cadena ligera de LL2 se unió al péptido señal de la α-lactoalbúmina IRES del siguiente modo. La cadena ligera de LL2 se amplificó mediante PCR a partir del vector pCRLL2 usando los cebadores siguientes.
Cebador 1 (SEC ID Nº 16):
5' CTACAGGTGTCCACGTCGACATCCAGCTGACCCAG 3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 17):
5' CTGCAGAATAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'
Estos cebadores añaden un sitio HincII justo al principio de la región de codificación para la cadena ligera de LL2 maduro. La digestión de producto de la PCR con HincII da un fragmento de extremo romo que comienza con el GAC inicial que codifica el LL2 maduro en el extremo 5’- El cebador 2 añade un sitio BglII en el extremo 3’ del gen justo después del codón de terminación. El producto resultante de la PCR se digirió con HuncII y BglII y se clonó directamente en el plásmido con péptido señal-IRES que se digirió con NaeI y BglII.
La secuencia Kozak del gen de la cadena pesada de LL2 se modificó después. El vector pCRMN14HC se digirió con XhoI y AvrII para eliminar un fragmento de aproximadamente 400 pb. Después se usó PCR para amplificar la misma porción de la construcción de la cadena pesada de LL2 que se eliminó mediante digestión con XhoI-AvrII. Esta amplificación también mutó el extremo 5’ del gen para añadir al clon una secuencia Kozak mejor. La secuencia Kozak se modificó para simular la secuencia Kozak de IgG típica. Los cebadores para la PCR se muestran a continuación.
Cebador 1 (SEC ID Nº 18):
5'CAGTGTGATCTCGAGAATTCAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT 3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 19):
5'AGGCTGTATTGGTGGATTCGTCT 3'
El producto de la PCR se digirió con XhoI y AvrII y se volvió a insertar en la estructura plasmídica digerida anteriormente.
Después, al gen de la cadena ligera se añadió la secuencia Kozak “buena”. La construcción del gen de la cadena pesada de LL2 con la Kozak “buena” se digirió con EcoRI y se aisló el gen de la cadena pesada que contenía el fragmento. La construcción del gen de la cadena ligera de LL2 con el péptido señal de la a-LA/IRES también se digirió con EcoRI. Después se clonó el gen de la cadena pesada en el sitio EcoRI de la construcción de la cadena ligera IRES. Esto Tuvo como resultado la introducción del gen de la cadena pesada en el extremo 5' de la secuencia del IRES.
A continuación se añadió un sitio de clonación múltiple en el plásmido de estructura retroviral LNCX. El plásmido LNCX se digirió con HindIII y ClaI. Se produjeron dos cebadores oligonucleotídicos y se hibridaron para crear un sitio de clonación múltiple en el ADN bicatenario. Los cebadores siguientes se hibridaron:
Cebador 1 (SEC ID Nº 20):
5'AGCTTCTCGAGTTAACAGATCTAGGCCTCCTAGGTCGACAT3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 21): 5'
CGATGTCGACCTAGGAGGCCTAGATCTGTTAACTCGAGA 3'
Después de hibridar, el sitio de clonación múltiple se ligó en LNCX para crear LNC-MCS.
Después, el fragmento génico bicatenario se ligó en la construcción génica de estructura retroviral. La construcción del gen bicatenario creado anteriormente se digirió con SalI y BglII y se aisló el fragmento de doble cadena. El plásmido de expresión retroviral LNC-MCS se digirió con XhoI y BrlII. Después, el fragmento bicatenario se clonó en la estructura de expresión retroviral LNC-MCS retroviral.
Después se corrigió un problema de corte y empalme del ARN en la construcción. La construcción se digirió con NsiI. A continuación, el fragmento resultante se digirió parcialmente con EcoRI. Los fragmentos resultantes de la digestión parcial con un tamaño de aproximadamente 9.300 pares de bases de tamaño y se purificaron en gel. Se creó un ligador para mutar el sitio donante de corte y empalme en el extremo 3’ del gen de la cadena pesada del LL2. El ligador se creó de nuevo hibridando dos cebadores oligonucleotídicos para formar el ligador de ADN bicatenario. Los dos cebadores usados para crear el ligador se muestran más adelante.
Cebador 1 (SEC ID Nº 22):
5'CGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGA AATGAAAGCCG 3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 23):
5'AATTCGGCTITCATTTCCCGGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGT AGTGG
Tras la hibridación se sustituyó al ligador por el fragmento NsiI/EcoRI original que se eliminó durante la digestión parcial.
C. MN14 de MMTV
La construcción MN14 de CMV (SEC ID Nº 6 comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’:
promotor del MMTV en 5'; secuenciade PPE con mutaci6n doble; cadenapesada del anticuerpo MN14; IRES delvirus de la encefalomiocarditis; peptido senal de la α-LA bovina; cadena ligera del anticuerpo MN14; secuencia WPRE y LTR en 3' de MoMuLV. Además de las secuencias descritas en la SEC ID Nº 6, el vector MN14 de MMTV comprende además una LTR de MoMuLV, una señal de empaquetamiento extendida de MoMuLV-, el gen de la neomicina fosfotransferasa localizado en 5’ del promotor de MMTV (estos elementos adicionales se proporcionan en la SEC ID Nº 7).
Esta construcción usa la LTR 5’ de MoMuLV para controlar la producción del gen de la neomicina fosfotransferasa. La expresión del anticuerpo MN14 está controlada por el promotor del MMTV (Pharmacia). El gen de la cadena pesada y elgende lacadena ligerade MN14estanunidos por una secuencia IRES/delpeptidosenalde α-LA bovina (SEC ID NO 3). El promotor de MMTV dirige la producción de un ARNm que contiene el gen de la cadena pesada y el gen de la cadena ligera unidos por el IRES/del péptido señal de α-LA bovina. Los ribosomas se unen al ARN, en el sitio CAP y en la secuencia del IRES/del péptido señal de α-LA bovina. Esto permite que se produzca la proteína de cadena ligera y pesada a partir de un único ARNm. Además, hay dos elementos genéticos contenidos dentro del ARNm para ayudar a la exportación del ARNm desde el núcleo al citoplasma y ayudar en la poliadenilación del ARNm. La secuencia de PPE está contenida entre el sitio CAP del ARN y el inicio de la región de codificación de la proteína MN14, la WPRE está contenida entre el extremo de la región de codificación de la proteína MN14 y el sitio de poliadenilación. La expresión del ARNm de la LTR, así como del promotor del MMTV se termina y se poliadenila en la LTR 3'.
Las secuencias ATG dentro del elemento PPE (SEC ID Nº 2) se mutaron para prevenir el posible inicio no deseado de la traducción. Se usaron dos copias de esta secuencia mutada en una disposición cabeza-cola. Esta secuencia se coloca justo cadena abajo del promotor y cadena arriba de la secuencia Kozak y la región de codificación del péptido señal. La WPRE se aísla del virus de la hepatitis de la marmota y también ayuda a la exportación del ARNm desde el núcleo y crea estabilidad en el ARNm. Si esta secuencia se incluye en la región 3’ no traducida del ARN, el nivel de expresión proteica a partir de este ARN aumenta hasta 10 veces.
D. a-LA MN14
La construcción α-LA de MN14 (SEC ID Nº 7) comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’: LTR en 5’ de MoMulV, la señal de empaquetamiento viral extendida de MoMuLV, el gen de la neomicina fosfotransferasa, el promotor híbrido de alga-lactoalbúmina bovina/humana, elemento de PPE con doble mutación, péptido señal de la cadena pesada de MN14, cadena pesada el anticuerpo MN14, IRES del virus de la encefalomiocarditis/péptido señal de la α-LA bovina, cadena ligera del anticuerpo MN14, secuencia WPRE y LTR en 3’ de MoMuLV.
Esta construcción usa la LTR 5’ de MoMuLV para controlar la producción del gen de la neomicina fosfotransferasa. La expresión del anticuerpo MN14 está controlada por el promotor de la α-LA (SEC ID Nº 1). El gen de la cadena pesada y el gen de la cadena ligera de MN14 están unidos por una secuencia IRES/del péptido señal de α-LA bovina (SEC ID Nº 3). El promotor de α-LA dirige la producción de un ARNm que contiene el gen de la cadena pesada y el gen de la cadena ligera unidos por el IRES. Los ribosomas se unen al ARN, en el sitio CAP y en la secuencia del IRES. Esto permite que se produzca la proteína de cadena ligera y pesada a partir de un único ARNm.
Además, hay dos elementos genéticos contenidos dentro del ARNm para ayudar a la exportación del ARNm desde el núcleo al citoplasma y ayudar en la poliadenilación del ARNm. La secuencia de PPE mutada (SEC ID Nº 2) está contenida entre el sitio CAP del ARN y el inicio de la región de codificación proteica de MN14. Las secuencias ATG dentro del elemento PPE (SEC ID Nº 2) se mutaron para prevenir el posible inicio no deseado de la traducción. Se usaron dos copias de esta secuencia mutada en una disposición cabeza-cola. Esta secuencia se coloca justo cadena abajo del promotor y cadena arriba de la secuencia Kozak y la región de codificación del péptido señal. La WPRE se aisló del virus de la hepatitis de la marmota y también ayuda a la exportación del ARNm desde el núcleot y crea estabilidad en el ARNm. Si esta secuencia se incluye en la región 3’ no traducida del ARN, el nivel de expresión proteica a partir de este ARN aumenta hasta 10 veces. La WPRE está contenida entre el extremo del sitio de codificación de la proteína MN14 y el sitio de poliadenilación. La expresión del ARNm de la LTR, así como del promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana se termina y se poliadenila en la LTR 3'.
El promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana (SEC ID Nº 1) es un elemento promotor/potenciador modular derivado de las secuencias del promotor de la alfa-lactoalbúmina bovina. La porción humana del promotor es de -15 respecto al punto de inicio de la transcripción (tsp) a -600 respecto al tsp. Después, la porción bovina se une al extremo de la porción humana y corresponde a -550 a -2000 respecto al tsp. El híbrido se desarrolló para eliminar las señales de poliadenilación que estaban presentes en el promotor bovino y dificultan la producción del ARN retroviral. También se desarrolló para contener elementos de control genético que están presentes en el gen humano, pero no el bovino.
Para la construcción del promotor de la α-lactoalbúmina humana/bovina se aisló el ADN genómico humano y se purificó. Una porci6n del promotor de la α-lactoalbúmina humana se amplificó mediante PCR usando los siguientes dos cebadores:
Cebador 1 (SEC ID Nº 24):
5'AAAGCATATGTTCTGGGCCTTGTTACATGGCTGGATTGGTT 3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 25)
5' TGAATTCGGCGCCCCCAAGAACCTGAAATGGAAGCATCACTCAGTTTCATATAT 3’
Estos dos cebadores crearon un sitio NdeI en el extremo 5’ del fragmento de PCR y un sitio EcoRI en el extremo 3’ del fragmento de PCR.
Se realizó una digestión doble del fragmento de PCR humano creado usando los cebadores anteriores con las enzimas de restricción NdeI y EcoRI. También se realizó una digestión doble del plásmido pKBaP-1 con NdeI y EcoRI. El plasmido pKBaP-1 contiene la región flanqueante en 5’ de α-lactoalbúmina unida a un sitio de clonación múltiple. Este plasmido permite la uni6n de varios genes del promotor de la α-lactoalbúmina bovina.
Posteriormente, el fragmento humano se lig6/sustituy6 por el fragmento bovino del promotor que se elimin6 del plasmido pKBaP-1 durante la digestión doble. El plásmido resultante se confirmó mediante secuenciación del ADN que era un híbrido de las regiones promotora/reguladora de la α-lactoalbúmina bovina y humana.
La unión del gen de la cadena ligera de MMN14 al péptido señal de la α-lactoalbúmina-IRES se realizó del siguiente modo. La cadena ligera de MN14 se amplificó mediante PCR a partir del vector pCRMN14LC usando los cebadores siguientes.
Cebador 1 (SEC ID Nº 26): 5' CTACAGGTGTCCACGTCGACATCCAGCTGACCCAG 3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 27): 5' CTGCAGAATAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'
Estos cebadores añaden un sitio HincII justo al principio de la región de codificación para la cadena ligera del MN14 maduro. La digestión de producto de la PCR con HincII da un fragmento de extremo romo que comienza con el GAC
inicial que codifica el MN14 maduro en el extremo 5’. El cebador 2 añade un sitio BglII en el extremo 3’ del gen justo después del codón de terminación. El producto resultante de la PCR se digirió con HincII y BglII y se clonó directamente en el plásmido con péptido señal-IRES que se digirió con NaeI y BglII.
Después, el vector pCRMN14HC se digirió con XhoI y NruI para eliminar un fragmento de aproximadamente 500 pb. Después se usó PCR para amplificar la misma porción de la construcción de la cadena pesada de MN14 que se eliminó mediante digestión con XhoI-NruI. Esta amplificación también mutó el extremo 5’ del gen para añadir al clon una secuencia Kozak mejor. La secuencia Kozak se modificó para simular la secuencia Kozak de IgG típica. Los cebadores para la PCR se muestran a continuación.
Cebador 1 (SEC ID Nº 28):
5'CAGTGTGATCTCGAGAATTCAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 29):
5'GTGTCTTCGGGTCTCAGGCTGT 3'
El producto de la PCR se digirió con XhoI y NruI y se volvió a insertar en la estructura plasmídica digerida anteriormente.
La construcción del gen de la cadena pesada de MN14 con la Kozak “buena” se digirió con EcoRI y se aisló el gen de la cadena pesada que contenía el fragmento. La construcción del gen de la cadena ligera de MN14 con el péptido señal de la a-Lactoalbúmina/IRES también se digirió con EcoRI. Después se clonó el gen de la cadena pesada en el sitio EcoRI de la construcción de la cadena ligera IRES. Esto Tuvo como resultado la introducción del gen de la cadena pesada en el extremo 5' de la secuencia del IRES.
A continuación se añadió un sitio de clonación múltiple en la estructura plasmídica retroviral LNCX. El plásmido LNCX se digirió con HindIII y ClaI. Se produjeron dos cebadores oligonucleotídicos y se hibridaron para crear un sitio de clonación múltiple en el ADN bicatenario. Los cebadores siguientes se hibridaron:
Cebador 1 (SEC ID Nº 30):
5' AGCTTCTCGAGTTAACAGATCTAGGCCTCCTAGGTCGACAT 3'
Cebador 2 (SEC ID Nº 31):
5' CGATGTCGACCTAGGAGGCCTAGATCTGTTAACTCGAGA 3'
Después de hibridar, el sitio de clonación múltiple se ligó en LNCX para crear LNC-MCS.
Después, el fragmento génico bicatenario se insertó en la construcción génica de la estructura retroviral. La construcción del gen bicatenario creado en la etapa 3 se digirió con SalI y BglII y se aisló el fragmento que contenía la doble cadena. El plásmido de expresión retroviral LNC-MCS se digirió con XhoI y BglII. Después, el fragmento bicatenario se clonó en la estructura de expresión retroviral LNC-MCS retroviral.
Después se reparó un problema de corte y empalme del ARN en la construcción. La construcción se digirió con NsiI. A continuación, el fragmento resultante se digirió parcialmente con EcoRI. Los fragmentos resultantes de la digestión parcial con un tamaño de aproximadamente 9.300 pares de bases de tamaño y se purificaron en gel. Se creó un ligador para mutar el sitio donante de corte y empalme en el extremo 3’ del gen de la cadena pesada del MN14. El ligador se creó de nuevo hibridando dos cebadores oligonucleotídicos para formar el ligador de ADN bicatenario. Los dos cebadores usados para crear el ligador se muestran más adelante.
Cebador 1 (SEC ID Nº 32):
Cebador 2 (SEC ID Nº 33):
Tras la hibridación se sustituyó al ligador por el fragmento NsiI/EcoRI original que se eliminó durante la digestión parcial.
Después, el fragmento bicatenario mutado se insertó en la estructura retroviral de expresión de α-lactoalbúmina LN α-LA-Mertz-MCS. La construcción génica producida anteriormente se digirió con BamHI y BglII y se aisló el fragmento que contenía el gen de doble cadena mutado. El plásmido de estructura retroviral expresión retroviral α-LA-Mertz-MCS de LN se digirió con BglII. Después, el fragmento BamHI/BglII se insertó en el plásmido de estructura retroviral.
A continuación se insertó un elemento WPRE en la construcción génica. El plásmido BluescriptII SK+ WPRE-B11 se digirió con BaraHI y HincII para extraer el elemento WPRE y se aisló el elemento. El vector creado anteriormente se digirió con BglII y HpaI. El fragmento WPRE se ligó en los sitios BglII y HpaI para crear la construcción génica final.
E. a-LA Bot
La construcción a-LA Bot (SEC ID Nº 8, anticuerpo frente a la toxina botulínica) comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’: promotor híbrido de alfa-lactoalbúmina bovina/humana, elemento PPE mutado, péptido señal cc49, cadena ligera del anticuerpo frente a la toxina botulínica, IRES del virus de la encefalomiocarditis/péptido señal de la α-LA bovina, cadena pesada del anticuerpo frente a la toxina botulínica, secuencia WPRE y LTR 3’ de MoMuLV. Además, el vector del anticuerpo frente a la toxina botulínica con α-LA comprende además una LTR en 5’ de MoMuLV, una señal de empaquetamiento vitral extendida de MoMuLV y un gen de la neomicina fosfotransferasa (estos elementos adicionales se proporcionan en la SEC ID Nº 7).
Esta construcción usa la LTR 5’ de MoMuLV para controlar la producción del gen de la neomicina fosfotransferasa. La expresión del anticuerpo frente a la toxina botulínica está controlada por el promotor híbrido de α-LA. El gen de la cadena ligera y el gen de la cadena ligera del anticuerpo frente a la toxina botulínica están unidos por una secuencia IRES/del péptido señal de α-LA bovina. El promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana dirige la producción de un ARNm que contiene el gen de la cadena ligera y el gen de la cadena pesada unidos por el IRES. Los ribosomas se unen al ARN en el sitio CAP y en la secuencia del IRES. Esto permite que se produzca la proteína de cadena ligera y pesada a partir de un único ARNm.
Además, hay dos elementos genéticos contenidos dentro del ARNm para ayudar a la exportación del ARNm desde el núcleo al citoplasma y ayudar en la poliadenilación del ARNm. La secuencia de PPE mutada (SEC ID Nº 2) está contenida entre el sitio CAP del ARN y el inicio de la región de codificación proteica de MN14. Las secuencias ATG dentro del elemento PPE (SEC ID Nº 2) se mutaron para prevenir el posible inicio no deseado de la traducción. Se usaron dos copias de esta secuencia mutada en una disposición cabeza-cola. Esta secuencia se colocó justo cadena abajo del promotor y cadena arriba de la secuencia Kozak y la región de codificación del péptido señal. La WPRE se aisló del virus de la hepatitis de la marmota y también ayuda a la exportación del ARNm desde el núcleot y crea estabilidad en el ARNm. Si esta secuencia se incluye en la región 3’ no traducida del ARN, el nivel de expresión proteica a partir de este ARN aumenta hasta 10 veces. La WPRE está contenida entre el extremo del sitio de codificación de la proteína MN14 y el sitio de poliadenilación. La expresión del ARNm de la LTR, así como del promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/human se termina y se poliadenila en la LTR 3'.
El promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana (SEC ID Nº 1) es un elemento promotor/potenciador modular derivado de las secuencias del promotor de la alfa-lactoalbúmina humana y bovina. La porción humana del promotor es de +15 respecto al punto de inicio de la transcripción a -600 respecto al tsp. Después, la porción bovina se une al extremo de la porción humana y corresponde a -550 a -2000 respecto al tsp. El híbrido se desarrolló para eliminar las señales de poliadenilación que estaban presentes en el promotor bovino y dificultan la producción del ARN retroviral. También se desarrolló para contener elementos de control genético que están presentes en el gen humano, pero no el bovino. Asimismo, la construcción contiene elementos control presentes en la secuencia bovina pero no en la humana.
F. LSRNL
La construcción LSRNL(SEC ID Nº 9) comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’: LTR en 5' de MoMuLV, señal de empaquetamiento viral de MoMuLV; antígeno de superficie de la hepatitis B; promotor del RSV; gen de la neomicina fosfotransferasa; y LTR en 3' de MoMuLV.
Esta construcción usa la LTR 5’ de MoMuLV para controlar la producción del gen del antígeno de superficie de la hepatitis B. La expresión del gen de la neomicina fosfotransferasa está controlada por el promotor de RSV. La expresión del ARNm de la LTR, así como del promotor del RSV se termina y se poliadenila en la LTR 3'.
G. a-LA cc49IL2
La construcción a-LA cc49IL2 (SEC ID Nº 10; el anticuerpo cc49 se describe en las patentes de EE.UU. Nº 5,512,443; 5,993,813; y 5,892,019, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia) comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’: promotor híbrido de α-lactoalbúmina bovina/humana en 5’; región de codificación de cc49-IL2 y LTR en 3’ de MoMuLV. Esta construcción génica exprea una proteína de fusión del anticuerpo monocatenario cc49 unida a la interleucina 2. La expresión de la proteína de fusión está controlada por el promotor híbrido de la α-lactoalbúmina bovina/humana.
El promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana (SEC ID Nº 1) es un elemento promotor/potenciador modular derivado de las secuencias del promotor de la alfa-lactoalb·mina humana y bovina. La porción humana del promotor es de +15 respecto al punto de inicio de la transcripción a -600 respecto al tsp. Después, la porción bovina se une al extremo de la porción humana y corresponde a -550 a -2000 respecto al tsp. El híbrido se desarrolló para eliminar las señales de poliadenilación que estaban presentes en el promotor bovino y dificultan la producción del
ARN retroviral. También se desarrolló para contener elementos de control genético que están presentes en el gen humano, pero no el bovino. Asimismo, la construcción contiene elementos control presentes en la secuencia bovina pero no en la humana. La LTR en 3’ viral proporciona la secuencia de poliadenilación para el ARNm.
H. a-LA YP
La construcción α-LA YP (SEC ID Nº 11) comprende los elementos siguientes dispuestos en orden de 5’ a 3’: promotor híbrido en 5' de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana: secuencia PPE de mutación doble; péptido señal de la α-LA bovina; región de codificación de Fab de la cadena pesada del anticuerpo de Yersinia pestis; péptido señal de a-LA bovina/IRES del EMCV; región de codificación de Fab de la cadena ligera del anticuerpo de Yersinia pestis; secuencia WPRE; LTR en 3' de MoMuLV.
Esta construcci6n genica producira la expresi6n del anticuerpo de Fab de rat6n de Yersenia pestis. La expresión de la construcción génica está controlada por el promotor híbrido de α-lactoalbúmina bovina/humana. La secuencia PPE y la secuencia WPRE ayudan a transportar el ARNm desde el núcleo hasta el citoplasma. La secuencia IRES permite la traducción de los genes tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera a partir del mismo ARNm. La LTR en 3’ viral proporciona la secuencia de poliadenilación para el ARNm.
Además, hay dos elementos genéticos contenidos dentro del ARNm para ayudar a la exportación del ARNm desde el núcleo al citoplasma y ayudar en la poliadenilación del ARNm. La secuencia de PPE mutada (SEC ID Nº 2) está contenida entre el sitio CAP del ARN y el inicio de la región de codificación proteica de MN14. Las secuencias ATG dentro del elemento PPE (SEC ID Nº 2) se mutaron (bases 4, 112, 131 y 238 de la SEC ID Nº 2 se cambiaron de una G a una T) para prevenir el posible inició no deseado de la traducción. Se usaron dos copias de esta secuencia mutada en una disposición cabeza-cola. Esta secuencia se colocó justo cadena abajo del promotor y cadena arriba de la secuencia Kozak y la región de codificación del péptido señal. La WPRE se aisló del virus de la hepatitis de la marmota y también ayuda a la exportación del ARNm desde el núcleot y crea estabilidad en el ARNm. Si esta secuencia se incluye en la región 3’ no traducida del ARN, el nivel de expresión proteica a partir de este ARN aumenta hasta 10 veces. La WPRE está contenida entre el extremo del sitio de codificación de la proteína MN14 y el sitio de poliadenilación. La expresión del ARNm de la LTR, así como del promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/human se termina y se poliadenila en la LTR 3'.
El promotor híbrido de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana (SEC ID Nº 1) es un elemento promotor/potenciador modular derivado de las secuencias del promotor de la alfa-lactoalbúmina bovina. La porción humana del promotor es de +15 respecto al punto de inicio de la transcripción a -600 respecto al tsp. Después, la porción bovina se une al extremo de la porción humana y corresponde a -550 a -2000 respecto al tsp. El híbrido se desarrolló para eliminar las señales de poliadenilación que estaban presentes en el promotor bovino y dificultan la producción del ARN retroviral. También se desarrolló para contener elementos de control genético que están presentes en el gen humano, pero no el bovino. Asimismo, la construcción contiene elementos control presentes en la secuencia bovina pero no en la humana.
Ejemplo 2
Generación de líneas celulares que expresan de forma estable las proteínas gag y pol de MoMLV
Los ejemplos 2-5 describen la producción de vectores retrovirales seudotipados. En general, estos procedimientos se pueden aplicar a la producción de los vectores descritos en lo que antecede. La expresión de la proteína G de VSV fusogénica sobre la superficie de las células tienen como resultado la formación de sincitios y la muerte de la célula. Por tanto, con el fin de producir partículas retrovirales que contienen la proteína G de VSV como la proteína asociada a la membrana se efectuó un enfoque en dos etapas. En primer lugar, se generaron líneas celulares estables que expresan las proteínas gag y pol de MoMLV a niveles elevados (p. ej., células 293GPSD). La línea celular estable que expresa las proteínas gag y pol produce partículas virales no infecciosas que carecen de una proteína asociada a la membrana (p. ej., una proteína de la cubierta). Después se co-transfeccionó la línea celular estable usando precipitación en fosfato cálcico con los ADN de la proteína G de VSV y del gen del plásmido de interés. El vector seudotipado generado se usó para infectar las células 293GPSD para producir líneas celulares transformadas de forma estable. Las líneas celulares estables se pueden transfeccionar de forma transitoria con un plásmido capaz de dirigir la expresión de nivel alto de la proteína G de VSV (véase más adelante). Las células transfeccionadas de forma transitoria producen vectores retrovirales seudotipados-G de VSV que se pueden recoger de las células en un periodo de 3 a 4 días antes de que las células productoras mueran como resultado de la formación de sincitios.
La primera etapa en la producción de vectores retrovirales seudotipados-G de VSV, la generación de líneas celulares estables que expresan las proteínas gag y pol de MoMLV se describe más adelante. La línea celular 293 de riñón embrionario transformada con el adenovirus humano Ad-5 (ATCC CRL 1573) se co-transfeccionó con pCMVgag-pol y el gen que codifica fleomicina. pCMVgag-pol contiene los genes gag y pol de MoMLV bajo el control del promotor de CMV (pCMVgag-pol está disponible en la ATCC).
El ADN plasmídico se introdujo en las células 293 usando co-precipitación en fosfato cálcico (Graham y Van der Eb, Virol. 52:456 [1973]). Aproximadamente 5 x 105 células 293 se sembraron en una placa de cultivo tisular de 100 mm el día antes de añadir el coprecipitado de ADN. Los transformantes estables se seleccionaron mediante crecimiento en medio DMEM con un contenido alto de glucosa que contenía 10 % de FCS y 10 μg/ml de fleomicina (medio selectivo). Las colonias que crecieron en el medio selectivo se sometieron a detección selectiva según la actividad extracelular de transcriptasa inversa (Goff y col., J. Virol. 38:239 [1981]) y la expresión intracelular de p30gag. La presencia de expresión de p30gag se determinó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-p30 de cabra (antisuero NCO 77S000087). Se seleccionó un clon que exhibía expresión estable de los genes retrovirales. Este clon se denominó 293GPSD (293 gag-pol-San Diego). La línea celular 293GPSD, un derivado de la línea celular 293 de riñón embrionario transformada con Ad-5 humano, se cultivó en medio DMEM con un contenido alto de glucosa que contiene 10 % de FCS.
Ejemplo 3
Preparación De vectores retrovirales seudotipados portadores de la glicoproteína G de VSV
Con el fin de producir retrovirus seudotipados con la proteína G de VSV se llevaron a cabo las etapas siguientes. La línea celular 293GPSD se co-transfeccionó con el plásmido de G-VSV y el ADN plasmídico de interés. Esta cotransfección genera las partículas infecciosas usadas para infectar las células 293GPSD para genera las líneas celulares de empaquetamiento. Este ejemplo describe la producción del virus LNBOTDC seudotipado. Este procedimiento general se puede usar para producir cualquiera de los vectores descritos en el Ejemplo 1.
a) Líneas celulares y plásmidos
La línea celular de empaquetamiento, 293GPSD, se cultivó en medio MEM alfa con un contenido alto de glucosa que contiene 10 % de FCS. El título del virus seudotipado se puede determinar usando células 208F (Quade, Virol.
98:461 [1979]) o células NIH/3T3 (ATCC CRL 1658); las células 208F y NIH/3T3 se cultivan en medio DMEM con un contenido alto de glucosa que contiene 10 % de FCS.
El plásmido LNBOTDC contiene el gen que codifica BOTD bajo el control transcripcional del promotor intermediotemprano de citomegalovirus seguido del gen que codifica la neomicina fosfotransferasa (Neo) bajo el control transcripcional del promotor de LTR. El plásmido pHCMV-G contiene el gen de G de VSV bajo el control transcripcional del promotor intermedio-temprano de citomegalovirus humano (Yee y col., Meth. Cell Biol. 43:99 [1994]).
b) Producción de líneas celulares de empaquetamiento estables, vector seudotipado y titulación del vector LNBOTDC seudotipado
El ADN de LNBOTDC (SEC ID Nº 13) se co-transfeccionó con ADN de pHCMV-G en la línea 293GPSD de empaquetamiento para producir el virus LNBOTDC. El virus LNBOTDC resultante se usó después para infectar las células 293GPSD para transformar las células. El procedimiento para producir el virus LNBOTDC seudotipado se llevó a cabo tal como se ha descrito (Yee y col., Meth. Cell Biol. 43:99 [1994].
Esta es una construcción génica retroviral que, tras la creación del vector infeccioso con replicación defectuosa, producirá la inserción de la secuencia descrita anteriormente en las células de interés. Tras la inserción, las secuencias reguladoras del CMV controlan la expresión de los genes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo contra la toxina botulínica. La secuencia IRES permite la traducción de los genes tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera a partir del mismo ARNm. La LTR en 3’ viral proporciona la secuencia de poliadenilación para el ARNm.
La proteína de las cadenas tanto pesada como ligera para el anticuerpo frente a la toxina botulínica se producen a partir de este ARNm señal. Las dos proteínas asociadas para formar el anticuerpo frente a la toxina botulínica. Las proteínas las cadenas pesada y ligera parecen estar formadas en una proporción molar igual de cada una.
Brevemente, el día 1, aproximadamente 5 x 104 células 293GPSD se introdujeron en un matraz de cultivo tisular de 75 cm2. Al dia siguiente (dia 2), las células 293GPSD se transfeccionaron con 25 1g del ADN plasmídico de pLNBOTDC y 25 pg del ADN plasmídico de VSV- G usando el procedimiento estándar de co-precipitación en fosfato cálcico (Graham y Van der Eb, Virol. 52: 456 [1973]). Se puede usar un intervalo de 10 a 40 μg del ADN plasmídico. Dado que las células 293GPSD pueden necesitar más de 24 horas para unirse firmemente a las placas de cultivo tisular, las células 293GPSD se pueden introducir en matraces de 75 cm2 48 horas antes de la transfección. Las células 293GPSD transfeccionadas proporcionan el virus LNBOTDC seudotipado.
El día 3, aproximadamente 1 x 105 células 293GPSD se introdujeron en matraces de cultivo tisular de 75 cm2 24 horas antes de la recolección del virus seudotipado de las células 293GPSD transfeccionadas. El día 4, se recogió el medio de cultivo de las células 293GPSD transfeccionadas 48 después de la aplicación del pLNBOTDC y el ADN de VSV-G. El medio de cultivo se filtró a través de un filtro de 0,45 μm y se añadió polibreno hasta una concentración final de 8 1g/ml. El medio de cultivo que contenía el virus LNBOTDC se usó después para infectar las células 293GPSD del siguiente modo. Se extrajo el medio de cultivo de las células 293GPSD y se volvió a introducir con el
virus LNBOTDC que contenía el medio de cultivo. Al medio se añadió polibreno tras la adición a las células. El medio que contenía el virus se dejó en las células 293GPSD durante 24 horas. Tras el periodo de infecci6n de 16 horas (el dia 5) se extrajo el medio de las celulas 293GPSD y se sustituyó con medio fresco con 400 1g/ml de G418 (GIBCO/BRL). El medio se cambió aproximadamente cada 3 días hasta que aparecieron colonias resistentes a G418 aproximadamente dos semanas después.
Las colonias de 293 resistentes a G418 se sembraron como células únicas en placas de 96 pocillos. De sesenta a cien colonias resistentes a G418 se sometieron a detección selectiva de la expresión del anticuerpo BOTDC con el fin de identificar clones de alta producción. Los 10 clones principales en placas de 96 pocillos se transfirieron a placas de 6 pocillos y se dejaron crecer hasta la confluencia.
Los 10 clones principales se expandieron después para la detección selectiva de producción de títulos elevados. En base a la expresión proteica y la producción del título se seleccionaron 5 líneas celulares clonales. Una línea se designó el banco de células maestras y las otros 4 fueron líneas celulares de reserva. El vector seudotipado se generó del siguiente modo. Aproximadamente 1 x 106 células 293GPSD/LNBOTDC se introdujeron en un matraz de cultivo tisular de 75 cm2. Veinticuatro horas después, las células se transfeccionaron con 25 1g del ADN plasmídico de pHCMV-G usando co-precipitación en fosfato cálcico. De seis a ocho horas después se aplicó el precipitado de ADN en calcio a las células, la solución de ADN se sustituyó con medio de cultivo fresco (sin G418). Se descubrió que los tiempos de transfección más largos (durante la noche) tenían como resultado el desprendimiento de la mayoría de las células 293GPSD/LNBOTDC de la placa y, por tanto, se evitan. Las células 293GPSD/LNBOTDC transfeccionadas producen el virus LNBOTDC seudotipado.
El virus LNBOTDC seudotipado generado a partir de las células 293GPSD/LNBOTDC transfeccionadas se puede recolectar al menos una vez al día entre 24 y 96 horas después de la transfección. El título de virus más alto se generó aproximadamente 48-72 horas después de la transfección inicial de pHCMV-G. Aunque la formación de sincitios se hizo visible aproximadamente 48 horas después de la transfección en la mayoría de las células transfeccionadas, las células siguieron generando virus seudotipado durante al menos 48 horas adicionales siempre que las células permanecieran unidas a la placa de cultivo tisular. El medio de cultivo recolectado que contiene el virus LNBOTDC seudotipado con VSV-G se combinó, se filtró a través de un filtro de 0,45 μm y se almacenó a -80 ºC o se concentró inmediatamente y, después, se almacenó a -80 ºC.
El título del virus LNBOTDC seudotipado con VSV-G se determinó del siguiente modo. Aproximadamente 5 x 104 fibroblastos 208F de rata se sembraron en placas de 6 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se infectaron con diluciones en serie del medio de cultivo que contiene el virus LNBOTDC en presencia de 8 1g/ml de polibreno. Veinticuatro horas después de la infección con el virus, el medio se sustituyó con medio fresco que contiene 400 1g/ml de G418 y la selección continuó durante 14 días hasta que se pudieron visualizar colonias resistentes a G418. Normalmente, los títulos virales eran de aproximadamente de 0,5 a 5,0 x 106 unidades formadoras de colonias (ufc)/ml. El título de la reserva vírica se pudo concentrar hasta un título superior a 109 ufc/ml como se describe más adelante.
Ejemplo 4
Concentración de vectores retrovirales seudotipados
Los virus LNBOTDC seudotipados con VSV G se concentraron a un título alto mediante un ciclo de ultracentrifugación. No obstante, se pueden realizar dos ciclos para su concentración adicional. El medio de cultivo congelado recolectado como se describe en el Ejemplo 2 que contenía el virus LNBOTDC seudotipado se descongeló en un baño de agua a 37 ºC y después se transfirió a tubos de centrífuga Oakridge (tubos Oakridge de 50 ml con tapas de cierre, Nalge Nunc International) esterilizados previamente mediante autoclavado. El virus se sedimentó en un rotor JA20 (Beckman) a 48.000 x g (20.000 rpm) a 4 ºC durante 120 minutos. El medio de cultivo se extrajo después de los tubos en una campana de seguridad biológica y se aspiró el medio que quedaba en los tubos para eliminar el sobrenadante. El sedimento vírico se resuspendió en 0,5 a 1 % del volumen original del medio de cultivo DMEM. El sedimento vírico resuspendido se incubó durante la noche a 4 ºC sin movimiento. El sedimento vírico se pudo dispersar con un suave pipeteo tras la incubación durante la noche sin una pérdida significativa de virus infeccioso. El título de la reserva vírica se aumentó de forma rutinaria 100-300 veces tras una ronda de ultracentrifugación. La eficiencia de la recuperación del virus infeccioso varió entre 30 y 100 %.
La reserva vírica se sometió después a centrifugación a baja velocidad en una microfuga durante 5 minutos a 4 ºC para eliminar cualquier residuo celular visible o viriones agregados que no se resuspendieron en las condiciones anteriores. Se observó que si la reserva vírica no se va a usar para inyectar en oocitos o embriones se puede omitir esta etapa de centrifugación.
La reserva vírica se puede someter a otra ronda de ultracentrifugación para concentrar más la reserva vírica. El virus resuspendido de la primera ronda de centrifugación se combina y sedimenta mediante una segunda ronda de ultracentrifugación, que se realiza como se ha descrito anteriormente. Los títulos virales se aumentan aproximadamente 2.000 veces tras la segunda ronda de ultracentrifugación (los títulos del virus LNBOTDC seudotipado normalmente son mayores o iguales a 1 x 109 ufc/ml tras la segunda ronda de ultracentrifugación).
Los títulos de los fluidos antes y después de la centrifugación se determinaron mediante inyección de células 208F (también se pueden usar células NIH 3T3 o células epiteliales de mama bovina), seguido de la selección de colonias resistentes a G418 como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2.
Ejemplo 5
Preparación de retrovirus seudotipado para infección de células huésped
Los retrovirus seudotipados concentrados se resuspendieron en 0,1X HBS (HEPES 2,5 mM , pH 7,12, NaCl 14 mM, Na2HPO4 75 1M -H2O) y se introdujeron alícuotas de 18 1l en viales de 0,5 ml (Eppendorf) y se almacenaron a -80°C hasta su uso. El título del vector concentrado se determinó diluyendo 1 μl del virus concentrado 10-7- o 10-8 veces con 0,1 X HBS. La solución de virus diluida se usó después para infectar 208F y células epiteliales de mama bovina y se determinaron los títulos virales como se describe en el Ejemplo 2.
Ejemplo 6
Expresión de MN14 por las células huésped
Este ejemplo describe a producción del anticuerpo MN14 de las células transfeccionadas con un número alto de vectores de integración. Se produjeron los vectores seudotipados a partir de las líneas celulares de empaquetamiento para los vectores siguientes: MN14 de MCV, α-LA de MN14 y MN14 de MMTV. Fibroblastos De rata (células 208F), células MDBK (células de riñón bovino) y células epiteliales de mama bovina se transfeccionaron a una multiplicidad de infección de 1.000. Mil células se sembraron en un matraz T25 y 106 unidades formadoras de colonias (UFC) del vector en 3 ml de medio se incubaron con las células. La duración de la infección fue 24 horas, seguido de un cambio de medio. Tras la transfección, las células se dejaron crecer y llegaron a la confluencia.
Las líneas celulares se cultivaron hasta la confluencia en matraces T25 y 5 ml de medio se cambiaron cada día. El medio se analizó diariamente para detectar la presencia de MN14. Todo el MN14 producido es activo (un ELISA para detectar igG humana dio los exactos mismos valores que el ELISA de unión a CEA) y la transferencia Western demostró que las cadenas pesada y ligera se producen a una proporción que parece ser de 1:1. Además, una transferencia Western no desnaturalizante indicó que se habían formado correctamente el 100 % de los complejos del anticuerpo (véase la Figura 1: calle 1, 85 ng de Mn14 control; calle 2, línea celular mamaria bovina, promotor de α-LA; calle 3, línea celular mamaria bovina, promotor del CMV; calle 4, línea celular de riñón bovino, promotor de α-LA; calle 5, línea celular de riñón bovino, promotor de CMV; calle 6, línea celular 208, promotor de α-LA; calle 7, línea celular 208, promotor de CMV)).
La Figura 2 es un gráfico que muestra la producción de MN14 en el tiempo para cuatro líneas celulares. El eje Y muestra la producción de MN14 en ng/ml de medio. El eje X muestra el día de recolección del medio para el experimento. En el gráfico se muestran cuatro conjuntos de datos. Las comparaciones se realizan entre el promotor de CMV y el de a-LA y entre las células 208 y las células de mama bovina. La línea celular de mama bovina exhibió la expresión más alta, seguida de las células 208F y células MDBK. Con respecto a las construcciones, la construcci6n dirigida por CMV demostr6 el nivel de expresión más alto, seguida de la construcción génica dirigida por α-LA y la construcción del MMTV. A las 2 semanas, el nivel de producción diaria de la construcción del CMV fue 4,5 1g/ml de medio (22,5 mg/día en un matraz T25). Posteriormente, el nivel de expresión aumentó lentamente a 40 1g/día, ya que las células llegaron a una confluencia muy densa durante la semana posterior. Mediante cromatografía de afinidad se procesaron 2,7 l de medio de una línea celular de empaquetamiento de α-lac de MN14 para producir una reserva purificada de MN14.
La Figura 3 es una transferencia Western de una carrera en gel de SDS-PAGE al 15 % en condiciones desnaturalizantes con el fin de separar las cadenas pesada y ligera del anticuerpo M14. La calle 1 muestra el MN14 de la línea celular mamaria bovina, promotor de α-LA; la calle 2 muestra el MN14 de la línea celular mamaria bovina, promotor del CMV; la calle 3 muestra el MN14 de la línea celular de riñón bovino, promotor híbrido de α-LA; la calle 4 muestra el MN14 de la línea celular de riñón bovino, promotor de CMV; la calle 5 muestra el MN14 de la línea celular de fibroblastos de rata, promotor híbrido de α-LA; la calle 6 muestra el MN14 de fibroblastos de rata, promotor de CMV. De acuerdo con la Figura 1 anterior, los resultados muestra que las cadenas pesada y ligera se producen en una proporción de aproximadamente 1:1.
Ejemplo 7
Cuantificación de proteína producida por célula
Este ejemplo describe la cuantificación de la cantidad de proteína producida por célula en cultivos celulares producidos de acuerdo con la invención. Varias células (células 208F, células MDBK y células de mama bovina) se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2 a 1.000 células/placa. Se usaron tres vectores diferentes para infectar los tres tipos celulares (CMV-MN14, MMTV- MN14, y a-LA-MNM) a una MOI de 1.000 (títulos: 2,8 X 106, 4,9 X 106, y 4,3 X 106, respectivamente). El medio se recolectó aproximadamente cada 24 horas de todas las células. Tras un mes de recolección de medio, se descartaron las células 208F y MDBK debido mala salud y una expresión baja de MN14.
Las células se pasaron a matraces T25 y se continuó la recolección de medio de las células de mama bovina durante aproximadamente 2 meses con expresión continua de MN14. Tras dos meses en matraces T25, las células con promotores de CMV estaban produciendo 22,5 pg/célula/día y las células con promotores de α-LA estaban produciendo 2,5 pg de MN14/célula día.
5 Tras 2 meses en matraces T25, se sembraron frascos giratorios (850 cm2) para aumentar la producción y determinar si la expresión de MN14 era estable tras múltiples pases. Dos frascos giratorios se sembraron con células de mama bovina que expresan MN14 de un promotor de CMV y dos frascos giratorios se sembraron con células de mama bovina que expresan MN14 del promotor α-LA. Los cultivos alcanzaron la confluencia tras aproximadamente dos semanas y continuaron expresando MN14. La expresión en frasco giratorio se muestra en la Tabla 1 que se expone
10 a continuación.
Tabla 1 Producción de MN14 en frascos giratorios
Línea celular
Promotor Producción de MN14/Semana (μg/ml) Producción de MN14/Semana – Total (μg/ml)
Mamaria bovina
CMV 2,6 1 - 520
Mamaria bovina
CMV 10,6 2 - 2120
Mamaria bovina
CMV 8,7 3 - 1740
Mamaria bovina
CMV 7,8 4 - 1560
Mamaria bovina
a-LA 0,272 1 - 54.4
Mamaria bovina
a-LA 2,8 2 - 560
Mamaria bovina
a-LA 2,2 3 - 440
Mamaria bovina
a-LA 2,3 4 - 460
Ejemplo 8
Transfección a varias multiplicidades de infección
Este ejemplo describe el efecto de la transfección a varias multiplicidades de infección sobre la expresión proteica. Fibroblastos de rata 208F y células epiteliales mamarias bovinas (BMEC) se sembraron en placas de 25 cm2 a
15 varios números de células/25 cm2. Las células se infectaron con el vector MN14 de CMV o el vector MN14 de a-LA a una MOI de 1, 10, 1.000 y 10.000, menteniendo el número de UFC constante y variando el número de células infectadas.
Tras la infección, el medio se cambió a diario y se recolectó aproximadamente cada 24 horas de todas las células durante aproximadamente 2 meses. Los resultados de los dos vectores en las células epiteliales mamarias bovinas
20 se muestran en la Tabla 2 a continuación. Las células sin datos indican cultivos que se infectaron antes de la finalización del experimento. La columna del “nº de células” representa el número de células al finalizar el experimento. Los resultados indican que una MOI más alta tiene como resultado una mayor producción de MN14, tanto en términos de la cantidad de proteína producida al día como de la acumulación total.
Tabla 2 MOI frente a la producción de proteínas
Línea celular
Promotor MOI % confluencia celular MN14 (ng/ml) Nº de células Producción de MN14/día (pg/célula)
BMEC
CMV 10000 100 % 4228 4,5E5 47
BMEC
CMV 1000 100 % 2832 2,0E6 7,1
BMEC
CMV 100
BMEC
CMV 10 100 % 1873 2,5E6 3,75
BMEC
CMV 1
BMEC
aLA 10000 100 % 1024 1,5E6 3,4
BMEC
aLA 1000
BMEC
aLA 100 100 % 722 1,8E6 1,9
BMEC
aLA 10 100 % 421234 2,3E6 0,925
BMEC
aLA 1 100 % 1,9E6 0,325
Ejemplo 9
Transfección a varias multiplicidades de infección
Este experimento describe la producción de proteína desde el vector de MN14 de CMV a varios valores de MOI. Células mamarias bovinas, células CHO y células de riñón embrionario humano (células 293) se sembraron en placas de 24 pocillos (2 cm2) a 100 células/pocillo de 2 cm2. Las células se infectaron a varias diluciones con MN14 de CMV para obtener valores de MOI de 1, 10, 100, 1.000 y 10.000. Las células CHP alcanzaron la confluencia a todas las MOI en los siguientes 11 días de infección. No obstante, las células infectadas a una MOI de 10.000 crecieron más lentamente. Las células mamarias bovinas y 293 crecieron más despacio, especialmente a la MOI más alta de 10.000. Las células se pasaron después a matraces T25 para dispersar las células. Tras la dispersión, las células alcanzaron la confluencia en 1 semana, se recolectó el medio tras una semana y se analizó para determinar la producción de MN14. Las células CHO y 293 humanas no exhibieron un buen crecimiento en cultivos extendidos. Por tanto, no se recolectaron datos de estas células. Los datos para las células epiteliales mamarias bovinas se muestran en la Tabla 3. Los resultados indican que la producción de MN14 aumenta cuanto mayor es la MOI.
Tabla 3 MOI frente a la producción de proteínas
Línea celular
Promotor MOI % de confluencia Producción de MN14 (ng/ml)
BMEC
CMV 10000 100 % 1312
BMEC
CMV 1000 100 % 100
BMEC
CMV 100 100 % 7,23
BMEC
CMV 10 100 % 0
BMEC
CMV 1 100 % 0
Ejemplo 10
Expresión del anticuerpo LL2 por células mamarias bovinas
Este ejemplo describe la expresión del anticuerpo LL2 por las células mamarias bovinas. Las células mamarias bovinas se infectaron con el vector CMV LL2 (7,5 x 107 UFC/ml) a MOI de 1.000 y 10.000 y se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2. Ninguna de las células sobrevivió a la transfección a la MOI de 10.000. A una confluencia del 20 % había 250 ng/ml de LL2 en el medio.
Ejemplo 11
Expresión del anticuerpo frente a la toxina botulínica por células mamarias bovinas
Este ejemplo describe la expresión del anticuerpo frente a la toxina botulínica en las células mamarias bovinas. Las células mamarias bovinas se infectaron con el vector -LA Bot (2.2 X 102 UFC/ml) y se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2. Al 100 % de confluencia había 6 ng/ml del anticuerpo frente a la toxina botulínica en el medio.
Ejemplo 12
Expresión del antígeno de superficie de la hepatitis B por células mamarias bovinas
Este ejemplo describe la expresión del de superficie de la hepatitis B (HBSAg) en las células mamarias bovinas. Las células mamarias bovinas se infectaron con el vector LSRNL (350 UFC/ml) y se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2. Al 100 % de confluencia había 20 ng/ml de HBSAg en el medio.
Ejemplo 13
Expresión de la proteína de unión al antígeno cc49IL2 por células mamarias bovinas
Este ejemplo describe la expresión de cc49IL2 en células mamarias bovinas. Las células mamarias bovinas se infectaron con el vector cc49IL2 (3,1 X 105 UFC/ml) a MOI de 1.000 y se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2. Al 100 % de confluencia había 10 μg/ml de cc49IL2 en el medio.
Ejemplo 14
Expresión de múltiples proteínas por células mamarias bovinas
Este ejemplo describe la expresión de múltiples proteínas en células mamarias bovinas. Las células mamarias productoras de MN14 (infectadas con el vector CMV-MN14) se infectaron con el vector cc49IL2 (3,1 X 105 UFC/ml) a
una MOI de 1.000 y 1.000 células se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2. A una confluencia del 100 %, las células expresaron MN14 a 2,5 1g/ml y cc49IL2 a 5 1g/ml.
Ejemplo 15
Expresión de múltiples proteínas por células mamarias bovinas
Este ejemplo describe la expresión de múltiples proteínas en células mamarias bovinas. Las células mamarias productoras de MN14 (infectadas con el vector CMV-MN14) se infectaron con el vector LSNRL (100 UFC/ml) a una MOI de 1.000 y 1.000 células se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2. A una confluencia del 100 %, las células expresaron MN14 a 2,5 1g/ml y antígeno de superficie de la hepatitis a 150 ng/ml.
Ejemplo 16
Expresión de múltiples proteínas por células mamarias bovinas
Este ejemplo describe la expresión de múltiples proteínas en células mamarias bovinas. Las células mamarias productoras de antígeno de superficie de la hepatitis B (infectadas con el vector LSRNL ) se infectaron con el vector cc49IL2 a una MOI de 1.000 y 1.000 células se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2. A una confluencia del 100 %, las células expresaron MN14 a 2,4 1g/ml y antígeno de superficie de la hepatitis a 13 ng/ml. Se entenderá que se pueden expresar múltiples proteínas en las otras líneas celulares descritas anteriormente.
Ejemplo 17
Expresión del antígeno de superficie de la hepatitis B y el anticuerpo frente a la toxina botulínica en células mamarias bovinas
Este ejemplo describe el cultivo de células transfeccionadas en cultivos de frascos rotatorios. Las células 208F y las células mamarias bovinas se sembraron en placas de cultivo de 25 cm2 a 1.000 células/25cm2. Los vectores LSRNL
o a-LA Bot se usaron para infectar cada línea celular a una MOI de 1.000. Tras un mes de cultivo y de recolección de medio se descartaron las células 208D debido al mal crecimiento y siembra. Asimismo, las celulas mamarias bovinas infectadas con a-LA Bot se descartaron debido a la baja expresión de proteínas. Las células mamarias bovinas infectadas con LSRNL se pasaron a frascos giratorios de siembra (850 cm2). En los cultivos en frascos giratorios se produjeron aproximadamente 20 ng7ml del antígeno de superficie B de la hepatitis.
Ejemplo 18
Expresión en líneas celulares seleccionadas clonalmente
Este experimento describe la expresión de MN14 en líneas celulares seleccionadas clonalmente. Las líneas celulares se cultivaron hasta la confluencia en matraces T25 y 5 ml de medio se recolectaron cada día. El medio se analizó diariamente para detectar la presencia de MN14. Todo el MN14 producido era activo y la transferencia Western indicó que las cadenas pesadas y ligeras se produjeron en una proporción que parecer ser casi exactamente de 1:1. Además, una transferencia Western no desnaturalizante indicó que aproximadamente el 100 % de los complejos del anticuerpo se habían formado correctamente. Después de estar en cultivo durante aproximadamente dos meses, las células se expandieron en frascos giratorios o se sembraron en placas como clones de una célula en placas de 96 pocillos.
La producción de MN14 en los frascos giratorios se analizó durante un periodo de 24 horas para determinar si cambios adicionales de medio aumentarían la producción sobre la obtenida con cambios semanales de medio. Se examinaron tres periodos de 24 horas. Las células con el promotor de CMV en frascos giratorios de 850 cm2 produjeron 909 ng/ml el primer día, 1160 ng/ml el segundo día y 1112 ng/ml el tercer día. Las células con el promotor de a-LA produjeron 401 ng/ml el primer día, 477 ng/ml el segundo día y 463 ng/ml el tercer día. Estos valores corresponden bien a 8-10 mg/ml/semana que se obtuvieron para las células de CMV y los 2-3 mg/ml que se obtuvieron para las células con a-LA. No parece que cambios más frecuentes de medio aumenten la producción de MN14 en frascos giratorios.
Se establecieron líneas celulares únicas en placas de 96 pocillos y se pasaron a los mismos pocillos para permitir el crecimiento de las células hasta confluencia. Una vez que las células alcanzaron la confluencias, se analizó la producción de MN14 en un periodo de 24 horas. La producción clonal de MN14 de las líneas celulares de CMV varió de 19 ng/ml/día a 5.500 ng/ml/día. La producción media de todos los clones celulares fue de 1.984 ng/ml/día. Los clones de celulas con a-LA dieron resultados similares. La producci6n clonal de MN14 de las lineas celulares de a-LA vari6 de 1 ng/ml/dia a 2.800 ng/ml/dia. La producción media de todos los clones celulares fue de 622 ng/ml/día. Los resultados se proporcionan en la Tabla 4 que se expone a continuación.
Tabla 4 Expresión en líneas celulares clonales
Número de líneas celulares clonales de CMV
Producción de MN14 (ng/ml) Número de líneas celulares clonales de alfa-lactoalbúmina Producción de MN14 (ng/ml)
22
19 27 0
6
88 29 0
29
134 12 0,7
34
151 50 8
32
221 28 55
23
343 43 57
27
423 8 81
4
536 13 154
41
682 48 159
45
685 7 186
40
696 36 228
11
1042 39 239
8
1044 51 275
5
1066 31 283
19
1104 54 311
48
1142 38 317
12
1224 21 318
26
1315 16 322
39
1418 47 322
37
1610 17 325
20
1830 37 367
21
1898 45 395
47
1918 25 431
35
1938 5 441
15
1968 20 449
3
1976 19 454
28
1976 22 503
1
2166 55 510
16
2172 14 519
17
2188 41 565
33
2238 46 566
30
2312 23 570
38
2429 1 602
2
2503 9 609
14
2564 53 610
24
2571 56 631
9
2708 2 641
42
2729 40 643
44
2971 32 653
7
3125 24 664
(continuación)
Número de líneas celulares clonales de CMV
Producción de MN14 (ng/ml) Número de líneas celulares clonales de alfa-lactoalbúmina Producción de MN14 (ng/ml)
43
3125 26 671
25
3650 52 684
46
3706 6 693
50
3947 33 758
49
4538 42 844
18
4695 10 1014
31
4919 3 1076
10
5518 44 1077
35
1469
34
1596
18
1820
30
2021
11
2585
4
2800
Ejemplo 19
Estimación del número de copias de inserción
Este ejemplo describe la relación de la multiplicidad de infección, el número de copias del gen y la expresión proteica. Se desarrollaron tres ensayos con ADN usando el sistema de ensayo INVADER (Third Wave Technologies, Madison, WI). Uno de los ensayos detecta una porción de la región flanqueante en 5’ de α-lactoalbúmina bovina. Este ensayo es específico de bovinos y no detecta el gen de α-lactoalbúmina porcino o humano. Este ensayo detectara dos copias del gen de α-lactoalbúmina en todas las muestras de ADN bovino control y también en las células epiteliales mamarias bovinas. El segundo ensayo detecta una porción de la región de empaquetamiento extendida del virus MLV. Este ensayo es específico de esta región y no detecta una señal en la línea celular humana 293, la línea de células epiteliales mamarias bovina o muestras de ADN bovino. En teoría, todas las líneas celulares y otras muestras no infectadas con MLV no deberán producir una señal. No obstante, dado que la línea celular 293GP se produjo con la región de empaquetamiento extendida de ADN, esta línea celular da una señal cuando se ejecuta el ensayo. A partir del análisis inicial parece que la línea celular 293GP contiene dos copias de la secuencia de la región de empaquetamiento extendida que se detectan con el ensayo. El ensayo final es el ensayo control. Este ensayo detecta una porción del gen del factor I de crecimiento similar a la insulina que es idéntica en ganado bovino, porcino, seres humanos una serie de otras especies. Se usa como control en cada muestra que se realiza con el fin de determinar la cantidad de señal que se genera a partir de esta muestra para un gen de dos copias. Todas las muestras que se analizan deberán contener dos copias del gen control.
Las muestras de ADN se pueden aislar usando una serie de procedimientos. Después se realizan dos ensayos con cada muestra, El ensayo control se realiza junto con el ensayo de α-lactoalbúmina bovina o el ensayo de la región de empaquetamiento extendida. La muestra y el tipo de información necesaria determinarán que ensayo se efectúa. Tanto el ensayo control como el de detección de transgen se efectúan con la misma muestra de ADN usando la misma cantidad exacta de ADN.
Los datos resultantes del ensayo son los siguientes (los recuentos indican unidades arbitrarias de fluorescencia):
Recuentos de fondo de la región de empaquetamiento extendida o de α-lactoalbúmina
Recuentos de la región de empaquetamiento extendida o de α-lactoalbúmina
Recuentos de fondo del control interno
Recuentos del control interno
Para determinar los recuentos netos para el ensayo se restan los recuentos de fondo de los recuentos reales. Esto se produce para el ensayo control y para el ensayo para la detección de transgenes. Una vez que se han obtenido los recuentos netos se puede producir una proporción entre los recuentos netos para el ensayo de detección de transgenes y los recuentos netos del ensayo control. Este valor es una indicación del número de copias del transgen en comparación con el número de copias del gen de control interno (en este caso IGF-I). Dado que el ensayo de detección de transgenes y el ensayo control son dos ensayos totalmente diferentes no se comportan exactamente del mismo modo. Esto significa que no se obtiene una proporción 1:1 exacta si hay dos copias del transgen y dos copias del gen control de un modo específico. No obstante, los valores están, en general, cerca de la proporción 1:1.
Asimismo, los diferentes sitios de inserción para el transgen pueden hacer que el ensayo de transgen se comporte de un modo diferente dependiendo de donde se localizan las inserciones.
Por tanto, aunque la proporción no es una medida exacta del número de copias, es una buena indicación del número de copias relativas entre muestras. Cuanto mayor es el valor de la proporción, mayor es el número de copias del transgen. Por tanto, una clasificación de las muestras desde la más baja a la más alta dará una comparación muy precisa de las muestras entre sí con respecto al número de copias. La tabla 5 proporciona datos reales para el ensayo EPR.
Tabla 5
Nº de muestra
Recuentos control Recuentos de fondo del control Recuentos netos del control Recuentos del transgen Recuentos de fondo del transgen Recuentos netos del transgen Proporción neta
293
116 44 72 46,3 46 0,3 0
293GP
112 44 68 104 46 58 0,84
1
74 40 34 88 41 47 1,38
2
64 40 24 83 41 43 1,75
3
62 44 18 144 46 98 5,57
A partir de estos datos se puede determinar que la línea celular 293 no tiene copias de la región de empaquetamiento extendida/transgen. No obstante, las células 293 GP parecen tener dos copias de la región de empaquetamiento extendida. Las otras tres líneas celulares parecen tener tres o más copias de la región de empaquetamiento extendida (una o más copias adicionales en comparación con las células 293GP).
Proporción génica en el ensayo INVADER y producción proteica en la línea celular
Las células epiteliales mamarias bovinas se infectaron con la construcción MN14 dirigida por el CMV o la construcción MN14 dirigida por α-lactoalbúmina. Las células se infectaron a una proporción entre el vector y la célula de 1.000 a 1. Las células infectadas se expandieron. Las líneas celulares clonales se establecieron para las células que contenían a-LA y CMV a partir de esta población combinada inicial de células, Se produjeron aproximadamente 50 líneas celulares para cada construcción génica. Las células individuales se colocaron en placas de 96 pocillos y después se pasaron a los mismos pocillos para permitir el crecimiento de las células hasta confluencia. Una vez que las líneas celulares alcanzaron la confluencia, se analizó la producción de MN14 en un periodo de 24 horas. La producción clonal de MN14 de las líneas celulares de CMV varió de 0 ng/ml/día a 5.500 ng/ml/día. La producción media de todos los clones celulares fue de 1.984 ng/ml/día. Los clones de células con a-LA mostraron tendencias similares. La producción clonal de MN14 de las líneas celulares de a-LA varió de 0 ng/ml/día a 2.800 ng/ml/día. La producción media de todos los clones celulares fue de 622 ng/ml/día.
Para análisis posteriores de estas líneas clonales se seleccionaron quince clones de CMV y quince clones de a-LA. Se escogieron cinco líneas de expresión más alta, cinco de expresión baja y cinco de expresión media. Estas treinta líneas celulares se expandieron y almacenaron en bancos. Se aisló el ADN de casi todas las treinta líneas celulares. Las líneas celulares se pasaron a placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta la confluencia. Una vez en la confluencia se cambió el medio cada 24 horas y se analizaron dos recolecciones distintas de cada línea celular para determinar la producción de MN14. Se realizó la media de los resultados de estos dos ensayos y estas cifras se usaron para crear las Tablas 6 y 7 que figuran a continuación. El ADN de las líneas celulares se efectuó usando el ensayo INVADER de la región de empaquetamiento extendida y los resultados se muestran a continuación. Las tablas muestran el número de línea celular, la correspondiente proporción génica y la producción de anticuerpos.
Tabla 6
Número de línea celular clonal de CMV
Gen Invader Proporción de producción de MN14 (ng/ml)
6
0,19 104
7
1,62 2874
10
2,57 11202
18
3,12 7757
19
1,62 2483
21
1,53 3922
22
0 0
29
0,23 443
31
3,45 5697
32
0,27 346
34
0,37 305
38
1,47 2708
41
1,54 5434
49
2,6 7892
50
1,56 5022
Media de todos los clones
1,48 3746
Tabla 7
Número de línea celular clonal de α-LA
Proporción génica de Invader Producción de MN14 (ng/ml)
4
4,28 3600
6
1,15 959
12
0,35 21
17
0,54 538
28
0,75 60
30
1,73 2076
31
0,74 484
34
4,04 3332
41
1,33 771
Media de todos los clones
1,66 1316
Los gráficos (Fig. 17 y 18) muestran la comparación entre la expresión proteica y la proporción génica del ensayo INVADER. Los resultados indican que hay una correlación directa entre la proporción génica del ensayo INVADER y
5 la producción proteica. También parece que la producción proteica no ha alcanzado un máximo y si se produjeron células que contienen una proporción génica del ensayo INVADER mayor se produciría una producción proteica mayor.
Proporción génica en el ensayo INVADER y múltiples infecciones de líneas celulares
Dos líneas de empaquetamiento (293GP) producidas usando los procedimientos descritos anteriormente se usaron
10 para producir el vector retroviral de replicación defectuosa. Una de las líneas celulares contiene una construcción génica retroviral que expresa el gen del anticuerpo contra la toxina botulínica del promotor del CMV (LTR-región de empaquetamiento viral extendida-Gen de Neo-Promotor del CMV-gen de la cadena ligera de Bot-IRES-gen de la cadena pesada de Bot-LTR), la otra línea celular contiene una construcción génica retroviral que expresa el gen del anticuerpo YP del promotor del CMV (LTR-región de empaquetamiento viral extendida-Gen de Neo-Promotor del
15 CMV-gen de la cadena ligera de YP-IRES-gen de la cadena pesada de YP-WPRE-LTR).
Además DE ser capaz de producir un vector retroviral de replicación defectuosa, cada una de estas líneas celulares también producen el anticuerpo contra la toxina botulínica o el anticuerpo YP.
El vector producido a partir de estas líneas celulares se usó después para reinfectar la línea celular parental. Este procedimiento se realizó con el fin de aumentar el número de inserciones génicas y de mejorar la producción de anticuerpos de estas líneas celulares. La línea celular parental de la toxina botulínica se infectó con un nuevo alícuota de vector tres días sucesivos. El título del vector usado para realizar la infección fue 1 X 108 ufc/ml. Tras la finalización de la infección final de 24 horas, se realizó la selección clonal con las células y la línea de producción proteica más alta se estableció para la producción de anticuerpo frente a la toxina botulínica. Se realizó un procedimiento similar con la línea celular parental YP. Esta línea celular también se infectó con un alícuota nuevo del vector tres días sucesivos. El título de los alícuotas del vector YP fue 1 X 104. Tras la finalización de la infección final de 24 horas, se realizó la selección clonal con las células y la línea de producción proteica más alta se estableció para la producción de YP.
Cada una de las líneas celulares parentales y de las líneas celulares de producción hijas se analizaron para determinar la proporción génica Invader usando el ensayo de la región de empaquetamiento extendida y para la producción proteica. La línea celular de producción de Bot generada usando el vector de título más alto tenía la proporción génica más alta. También tenía la producción proteica más alta, lo que de nuevo sugiere que el número de copias del en es proporcional a la producción proteica. La línea celular de producción de YP también tenía una proporción génica más alta y produjo más proteína que su línea celular parental, lo que también sugiere que el incremento de las copias génicas está directamente relacionado con incrementos de la producción proteica. Los datos se presentan en la Tabla 8.
Tabla 8
Línea celular
Proporción génica de Invader Producción de anticuerpo (Bot/YP)
Línea celular parental de Bot
1,12 4,8 mg/ml
Línea celular de producción de Bot
3,03 55 mg/ml
Línea celular parental de YP
1,32 4 mg/ml
Línea celular de producción de YP
2,04 25 mg/ml
Ejemplo 20
Transfección con vectores lentivirales
Este ejemplo describe procedimientos para la producción de vectores lentivirales y su uso para infectar células huésped a una multiplicidad de infección alta. Las partículas virales de replicación defectuosa se producen mediante cotransfección transitoria de los plásmidos descritos en la patente de EE.UU. N 6,013,516 en células renales humanas 293T. Todos los plásmidos se transforma y cultivan en las bacterias E. coli HB101 siguiendo los procedimientos estándar de biología molecular. Para la transfección de células eucarióticas, el ADN plasmídico se purifica dos veces mediante centrifugación en equilibrio en gradientes de CsCl-bromuro de etidio. Se usa un total de 40 1g de ADN para la transfección de un cultivo en una placa de 10 cm en las proporciones siguientes. 10 1g de pCMVLR8, 20 1g de pHR' y 10 1g de plásmidos env, células MLV/Ampho, MLV/Eco o VSV-G. 293T se cultivan en medio DMEM suplementado con 10 % de suero bovino fetal y antibióticos en un incubador con CO2 al 10 %. Las células se siembran a una densidad de 1.3x106/placa de 10 cm el día antes de la transfección. El medio de cultivo se cambia de 4 a 6 horas antes de la transfección. Se preparan complejos de fosfato calcico-ADN de acuerdo con el metodo de Chen y Okayama (Mol. Cell. Biol., 7:2745, 1987) y se incuban durante la noche con las células en una atmósfera de CO2 al 5 %. A la mañana siguiente se sustituye el medio y los cultivos se devuelven a CO2 al 10 %. El medio acondicionado se recoge de 48 a 60 horas después de la transfección, se eliminan los residuos celulares mediante centrifugación a velocidad baja (300xg 10 min) y se filtra a través de filtros de 0,45 μm de baja unión de proteínas.
Para concentrar las particulas de vector, el medio acondicionado combinado recolectado como se ha descrito anteriormente queda en la parte superior de un cojin de soluci6n de sacarosa al 20 % en PBS y se centrifuga en un rotor Beckman SW28 a 50.000 xg durante 90 minutos. El sedimento se resuspende mediante incubación y pipeteo suave en 1-4 ml de PBS durante 30-60 minutos, después se centrifuga a 50.000 x g durante 90 minutos en un rotor Beckman SW28. El sedimento se resuspende en un volumen minimo (20-50 1l) de PBS y se usa directamente para inyección o se almacena en alícuotas congelados a -80 ºC.
Los vectores lentivirales concentrados se titulan y se usan para transfeccionar una línea celular adecuada (p. ej., células 293, células HeLa, fibroblastos 208F de rata)) a una multiplicidad de infección a 1.000. El análisis de líneas celulares seleccionadas clonalmente que expresan la proteína exógena revelarán que una porción de las líneas
celulares seleccionadas más de dos copias integradas del vector. Estas líneas celulares producirán más de la proteína exógena que las líneas celulares que contienen solo una copia del vector integrado.
Ejemplo 21
Expresión y Ensayo de receptores acoplados a la proteína G
Este ejemplo describe la expresión de una proteína receptora acoplada a proteína G (GPCR) a partir de un vector retroviral. Este ejemplo también describe la expresión de una proteína señal de un IRES como marcador de la expresión de una proteína difícil de analizar o de una proteína que no tiene análisis, como una GPCR. La construcción génica (SEC ID Nº 34, Figura 19) comprende un receptor acoplado a proteína G seguido de la cadena ligera del anticuerpo-péptido señal-IRES clonado en el MCS de la estructura retroviral pLBCX. Brevemente, un fragmento PvuII/PvuII (3057 pb) que contiene GPCR-IRES-cadena ligera del anticuerpo se clonó en el sitio StuI de pLBCX. pLBCX contiene el promotor EM7 (T7), el gen de la blasticidina y poliA de SV40 del gen de resistencia a neomicina de pLNCX.
La construcción génica se usó para producir una célula de empaquetamiento retroviral con replicación defectuosa y esta línea celular se usó para producir el vector retroviral con replicación defectuosa. El vector producido a partir de esta línea celular se usó después para reinfectar las células 293GP (células renales embrionarias humanas). Tras la infección, las células se introdujeron en selección con blasticidina y se aislaron los clones de una célula resistentes a blasticidina. Los clones se sometieron a detección selectiva de la expresión de la cadena ligera del anticuerpo. Se seleccionaron los 12 clones principales de expresión de la cadena ligera. Estos 12 clones de expresión de la cadena ligera se sometieron después a detección selectiva de la expresión del GPCR usando un ensayo de unión a ligando. Las doce muestras también expresaron la proteína receptora. Las líneas celulares clonales y su expresión se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9
Número de clon celular
Expresión de la cadena ligera del anticuerpo Expresión de GPCR
4
+ +
8
+ +
13
+ +
19
+ +
20
+ +
22
+ +
24
+ +
27
+ +
30
+ +
45
+ +
46
+ +
50
+ +
Ejemplo 22
Infección múltiple de células 293 con vector retroviral de replicación defectuosa
Este ejemplo describe la transfección en serie múltiple de las células con vectores retrovirales. La siguiente construcción génica se usó para producir una línea celular de empaquetamiento retroviral de replicación defectuosa. 5' LTR = repetición terminal larga en 5’ del virus del sarcoma murino de Moloney. EPR = Región de empaquetamiento extendida del virus de la leucemia murina de Moloney Blast = Gen de resistencia a blasticidina. CMV = Promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano. Gen= Gen que codifica la proteína de ensayo WPRE = Elemento de transporte de ARN
3' LTR = Repetición terminal larga en 3’ del virus de la leucemia murina de Moloney.
Después, esta línea celular de empaquetamiento se usó para producir un vector retroviral de replicación defectuosa del siguiente modo. El vector se produjo a partir de células cultivadas en matraces T150 y se congeló. EL vector congelado se descongeló en cada infección. Para la infección nº 3, se usó una solución concentrada del vector para realizar la infección. Todas las demás infecciones se realizaron usando un vector no concentrado. Las infecciones se realizaron durante un periodo de aproximadamente cinco meses introduciendo 5 ml de la solución con vector/medio en un matraz T25 que contiene células 293 con un 30 % de confluencia. En la solución del vector también se introdujeron ocho mg/ml de polibreno durante la infección. La solución del vector se dejó en las células durante 24 horas y después se retiró. Después, a las células se añadió medio (DMEM con 10 % de suero bovino fetal). Las células se cultivaron hasta la confluencia total y se pasaron a un nuevo matraz T25. Después, las células se cultivaron hasta una confluencia del 30 % y se repitió el procedimiento de infección. Este proceso se repitió 12 veces y se indica en la Tabla 10 que se expone más adelante. Tras las infecciones 1, 3, 6, 9 y 12, las células restantes tras el paso se usaron para obtener una muestra de ADN. El ADN se analizó usando el ensayo INVADER para determinar una estimación del número de vectores insertados en las células tras varias veces en el procedimiento de infección. Los resultados indican que el número de vectores insertados aumenta con el tiempo, siendo el nivel más alto tras la duodécima infección. Dado que un valor de 0,5 es aproximadamente una media de una copia de inserción de vector por célula, tras doce infecciones la copia de inserción de vector media tiene que alcanzar dos. Estos datos indican que la copia media del vector por célula es poco menor que 1,5 copias por célula. Asimismo, no se produjo ningún cambio real en el número de copias del gen desde la infección nº 6 a la infección nº 9. Además, estos datos indican que la transfección realizada a una multiplicidad de infección estándar baja no introduce más de una copia del vector retroviral en las células.
Tabla 10
Línea celular o número de infección
Título del vector (UFC/ml) Proporción génica de “Invader”
293
0,053
Infección Nº 1
1,05 X 103 0,39
Infección Nº 2
1,05 X 103
Infección Nº 3
7,6 X 104 0,45
Infección Nº 4
1,05 X 103
Infección Nº 5
1,05 X 103
Infección Nº 6
1,05 X 103 0,54
Infección Nº 7
1,05 X 103
Infección Nº 8
1,05 X 103
Infección Nº 9
1,05 X 103 0,52
Infección Nº 10
1,05 X 103
Infección Nº 11
1,05 X 103
Infección Nº 12
1,05 X 103 0,69
Ejemplo 23
Producción del anticuerpo YP
Este ejemplo demuestra la producción del anticuerpo frente a Yersinia pestis por las células epiteliales mamarias bovinas y las células fibroblastos de riñón humano (células 293). Las líneas celulares se infectaron con el vector a-LA YP. Ambas líneas celulares produjeron el anticuerpo YP. Todo El anticuerpo es activo y las cadenas pesada y ligera se producen en una proporción de aproximadamente 1:1.
Ejemplo 24
Estabilidad de las inserciones del vector en las líneas celulares en el tiempo
Se analizó la capacidad de dos líneas celulares que contienen inserciones génicas del vector LN-CMV-Bot para mantener las inserciones del vector en una serie de pases con y sin selección de neomicina. La primera línea celular es una línea celular epitelial mamaria bovina que contiene un número bajo de copias insertadas. La segunda línea celular es una línea 293GP que contiene múltiples copias del vector insertado. Al principio del experimento se dividieron los cultivos celulares. Esto se produjo en el pase 10 para las células epiteliales mamarias bovinas y en el pase 8 para las células 293GP. Una muestra se pasó de forma continua en medio que contiene el análogo de neomicina G418, el otro cultivo se pasó de forma continua en medio sin ningún antibiótico. Cada 3-6 pases, las
células se recolectaron y el ADN se aisló para la determinación de la proporción génica usando el ensayo INVADER. Las células se cultivaron de forma continua y se pasaron en matraces T25. Los resultados de los ensayos se muestran a continuación:
Tabla 11 Línea celular de un número bajo de copias génicas
Línea celular y tratamiento
Número de pase Proporción génica de Invader
BMEC/Bot Nº 66 + G418
10 0,67
BMEC/Bot Nº 66 - G418
10 0,89
BMEC/Bot Nº 66 + G418
16 0,67
BMEC/Bot Nº 66 - G418
16 0,64
BMEC/Bot Nº 66 + G418
21 0,62
BMEC/Bot Nº 66 - G418
21 0,58
BMEC/Bot Nº 66 + G418
27 0,98
BMEC/Bot Nº 66 - G418
27 0,56
BMEC/Bot Nº 66 + G418
33 0,80
BMEC/Bot Nº 66 - G418
33 0,53
Tabla 12 Línea celular de un número alto de copias génicas
Línea celular y tratamiento
Número de pase Proporción génica de Invader
293GP/Bot Nº 23 + G418
8 3,46
293GP/Bot Nº 23 - G418
8 3,73
293GP/Bot Nº 23 + G418
14 3,28
293GP/Bot Nº 23 - G418
14 3,13
293GP/Bot Nº 23 + G418
17 3,12
293GP/Bot Nº 23 - G418
17 2,91
293GP/Bot Nº 23 + G418
22 3,6
293GP/Bot Nº 23 - G418
22 2,58
293GP/Bot Nº 23 + G418
28 2,78
293GP/Bot Nº 23 - G418
28 3,44
293GP/Bot Nº 23 + G418
36 2,6
293GP/Bot Nº 23 - G418
36 2,98
Estos datos muestran que no hay diferencias consistentes en la proporción génica entre las células tratadas con G418 y las no tratadas con antibiótico. Esto sugiere que la selección de G418 no es necesaria para mantener la estabilidad de las inserciones génicas del vector. Asimismo, estas inserciones del vector parecen ser muy estables en el tiempo.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Gala Design, Inc.
5
<120> Células huésped que contienen vectores de integración múltiple
<130> GALD023PEP02
10
<140> aún desconocido
<141>
<150> EP 01 950 645.0
<151>
15
<150> PCT/US 01/20710
<151>
<150> US 60/215.925
20
<151>
<160> 36
<170> PatentIn versión 3.5
25
<210> 1
<211> 2101
<212> ADN
<213> Artificial
30
<220>
<223> Sintético
<400> 1
35
<210> 2
<211> 245 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 2
<210> 3
<211> 680
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético
10 <400> 3
<210> 4 15 <211> 4207
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20 <223> Sintético
<400> 4
<210> 5
<211> 4210
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 5
<210> 6
<211> 5732 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 6
<210> 7
<211> 9183 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 7
<210> 8
<211> 5711 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 8
<210> 9
<211> 5130 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 9
<210> 10
<211> 4661 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 10
<210> 11
<211> 5691 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 11
<210> 12
<211> 668 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 12 <210> 13
<211> 6255 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 13
<210> 14
<211> 43
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 14 ctttgaaaaa cacgatgata atatggcctc ctttgtctct ctg 43
<210> 15
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 15 ttcgcgagct cgagatctag atatcccatg 30
<210> 16
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 16 ctacaggtgt ccacgtcgac atccagctga cccag 35
<210> 17
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 17 ctgcagaata gatctctaac actctcccct gttg 34
<210> 18
<211> 51
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 18 cagtgtgatc tcgagaattc aggacctcac catgggatgg agctgtatca t
<210> 19
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 19 aggctgtatt ggtggattcg tct 23
<210> 20
<211> 41
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 20 agcttctcga gttaacagat ctaggcctcc taggtcgaca t 41
<210> 21
<211> 39
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 21 cgatgtcgac ctaggaggcc tagatctgtt aactcgaga
<210> 22
<211> 64
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 22
<210> 23
<211> 72
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 23
<210> 24
<211> 41
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 24 aaagcatatg ttctgggcct tgttacatgg ctggattggt t 41
<210> 25
<211> 54
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 25 tgaattcggc gcccccaaga acctgaaatg gaagcatcac tcagtttcat atat 54
<210> 26
<211> 35
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 26 ctacaggtgt ccacgtcgac atccagctga cccag 35
<210> 27
<211> 34
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 27 ctgcagaata gatctctaac actctcccct gttg 34
<210> 28
<211> 51
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 28 cagtgtgatc tcgagaattc aggacctcac catgggatgg agctgtatca t 51
<210> 29
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 29 gtgtcttcgg gtctcaggct gt 22
<210> 30
<211> 41
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 30 agcttctcga gttaacagat ctaggcctcc taggtcgaca t 41
<210> 31
<211> 39
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 31 cgatgtcgac ctaggaggcc tagatctgtt aactcgaga 39
<210> 32
<211> 64
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 32
<210> 33
<211> 72
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 33
<210> 34
<211> 9511 10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético 15
<400> 34
5
<210> 35 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
10
<220> <223> Sintético <400> 35 gatccactag taacggccgc cagaattcgc 30
15
<210> 36 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial
20
<220> <223> Sintético
<400> 36 cagagagaca aaggaggcca tattatcatc gtgtttttca aag
43

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una célula huésped obtenida por selección clonal que comprende un genoma, en el que dicho genoma comprende al menos 10 copias de un vector retroviral seudotipado, en la que dicho vector retroviral comprende al menos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor interno a las repeticiones terminales largas 5’ y 3’ de dicho vector retroviral, en el que dicho gen codifica una proteína secretada, en el que dicha célula huésped se caracteriza porque sintetiza al menos 1 picogramo de dicha proteína exógena al día.
  2. 2.
    La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dichos vectores retrovirales comprenden además una secuencia de señal de secreción unida funcionalmente a dicho gen exógeno.
  3. 3.
    La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dichos vectores retrovirales comprenden además un elemento de exportación de ARN unido funcionalmente a dicho gen exógeno, y
    en la que dichos vectores retrovirales comprenden, preferentemente, al menos dos genes exógenos.
  4. 4.
    La célula huésped de la reivindicación 3, en la que uno de dichos al menos dos genes exógenos es un marcador seleccionable.
  5. 5.
    La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dicho vector retroviral comprende repeticiones terminales largas seleccionadas del grupo constituido por las repeticiones terminales largas de MoMLV, MoMuSV y MMTV, y
    en la que dicho vector retroviral es, preferentemente, un vector lentiviral.
  6. 6.
    La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dicha célula huésped se selecciona de células de ovario de hámster chino, células de riñón de cría de hámster y células epiteliales mamarias bovinas, y
    en la que el genoma es, preferentemente, estable durante más de 10 pases, preferentemente más de 50 pases o, más preferentemente, más de 100 pases.
  7. 7.
    La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dicho promotor se selecciona del grupo constituido por el promotor de alfa-lactoalbúmina, el promotor de citomegalovirus y la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney, comprendiendo preferentemente además un primer vector de integración que codifica una primera proteína de interés secretada, comprendiendo además al menos 1 copia integrada de un un segundo vector de integración que codifica una segunda proteína de interés secretada.
  8. 8.
    Un procedimiento ex vivo para transfeccionar células huésped, en el que más de 10 copias de un vector de expresión para la proteína de interés se insertan en el genoma de la célula huésped de modo que las células huésped transfeccionadas sintetizan al menos 1 picogramo por célula al día de la proteína de interés, caracterizado porque una célula huésped que comprende un genoma se pone en contacto con un vector retroviral seudotipado y que, posteriormente, se obtiene por selección clonal una célula huésped transfeccionada, en el que el vector retroviral comprende al menos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor interno en las repeticiones terminales largas retrovirales 5' y 3' y la célula huésped se selecciona del grupo constituido por células de ovario de hámster chino, células renales de cría de hámster y células epiteliales mamarias bovinas.
  9. 9.
    Una célula huésped que puede obtenerse mediante el procedimiento de la reivindicación 8.
  10. 10.
    Un procedimiento para expresar una proteína de interés, que comprende:
    1) proporcionar:
    a) una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
    2) cultivar dichas células huésped en condiciones tales que se expresa dicha proteína de interés; 3) aislar dicha proteína de interés.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho genoma de dicho huésped comprende al menos dos vectores de integración, en el que cada uno de dichos al menos dos vectores de integración comprende un gen exógeno diferente.
  12. 12.
    Un procedimiento que comprende:
    1) proporcionar:
    a) una célula huésped de mamífero que comprende un genoma, comprendiendo dicho genoma múltiples copias de un vector retroviral seudotipado que comprende un promotor unido funcionalmente a un gen exógeno que codifica una primera proteína de interés secretada, y b) segundos vectores retrovirales seudotipados que comprenden un gen exógeno que codifica una segunda proteína de interés secretada; y 2) poner en contacto dicha célula huésped de mamífero con dichos segundos vectores retrovirales, en el que al menos 10 copias de dichos segundos vectores retrovirales se insertan en el genoma de la célula huésped de mamífero, de modo que las células huésped sintetizan al menos 1 picogramo de la segunda proteína de interés al día, que se caracteriza porque una célula huésped que comprende un genoma se pone en contacto con un
    5 vector retroviral a una multiplicidad de infección superior a 100 y que, posteriormente se obtiene por selección clonal una célula huésped transfeccionada.
  13. 13.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dichas condiciones comprenden poner en contacto dicho huésped a una multiplicidad de infección de 100 a 1.000.
  14. 14.
    El procedimientos de la reivindicación 8, 10 o 12, en el que dicho vector retroviral es un vector lentiviral, y
    10 en el que dicho vector retroviral es, preferentemente, un vector retroviral seudotipado que comprende una glicoproteína G.
  15. 15. El procedimiento de la reivindicación 8, que además comprende la etapa de aislar dicha proteína de interés.
    Figura 1
    Figura 2
    Figura 3
    Figura 4 SEC ID Nº 1 Promotor híbrido de alfa-lactoalbúmina bovina-humana
    1 - 1525 Región flanqueante en 5’ de lactoalbúmina alfa bovina (-2000 a -550 desde el punto de partida de la transcripción de la alfa-lactoalbúmina bovina)
    1526 - 2056 Región flanqueante en 5’ de alfa-lactoalbúmina humana (-600 a +15 desde el punto de partida de la transcripción de la alfa-lactoalbúmina humana)
    2057 - 2101 Sitio de clonación múltiple
    Figura 5 SEC ID Nº 2 Secuencia de PPE mutada
    1-119 PPE mutada 120-126 Ligador 127-245 PPE mutada
    Figura 6 SEC ID Nº 3
    1 - 583 IRES
    584 - 640 Región de codificación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina modificada
    641 - 680 Sitio de clonación múltiple
    Figura 7a SEC ID Nº 4
    Vector MN14 de CMV
    Figura 7b
    1 -812 Promotor/potenciador del CMV 853 - 855 Codón de iniciación del péptido señal del gen de la cadena pesada del
    anticuerpo MN14 2257 - 2259 Codón de iniciación del gen de la cadena pesada del anticuerpo MN14 2271 - 2846 IRES del EMCV 2847 - 2849 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 2904 - 2906 Primer codón del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 maduro 3543 - 3544 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 3614 - 4207 3’LTR de MoMuLV
    Figura 8a SEC ID Nº 5
    Vector LL2 de CMV
    Figura 8b
    1 -812 Promotor/potenciador del CMV 852 - 854 Codón de iniciación del péptido señal del gen de la cadena pesada del
    anticuerpo LL2 2247 - 2249 Codón de terminación de la cadena pesada del anticuerpo LL2 2261 - 2836 IRES del EMCV 2837 - 2839 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 2894 - 2896 Primer codón del gen de la cadena ligera del anticuerpo LL2 maduro 3551 - 3553 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo LL2 3622 - 4210 3’LTR de MoMuLV
    Figura 9a SEC ID Nº 6
    Vector MN14 de MMTV
    Figura 9b
    1 - 1457 LTR del virus del tumor de mama de ratón 1475 - 1726 Secuencia de PPE con doble mutación
    Figura 9c
    1752 - 1754 Codón de iniciación del péptido señal de la cadena pesada de MN14 3156 - 3158 Codón de terminación de la cadena pesada de MN14 3170 - 3745 IRES del EMCV 3746 - 3748 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 3803 - 3805 Primer codón del gen de la cadena ligera del MN14 maduro 4442 - 4444 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 4487 - 5078 Secuencia WPRE 5133 - 5372 3’LTR de MoMuLV
    Figura 10a SEC ID Nº 7
    Vector MN14 de la alfa-lactoalbúmina Figura 10b Figura 10c
    Figura 10d
    1 - 658 5’ LTR de MoMuSV
    659 - 1468 Región de empaquetamiento extendida 1512 - 2306 Gen de resistencia a neomicina 2661 - 4896 Región flanqueante en 5’ de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana 5084 - 5327 Secuencia de PPE con mutación doble 6207 - 6209 Codón de iniciación del péptido señal del gen de la cadena pesada del anticuerpo
    MN14 6611 - 6613 Codón de terminación de la cadena pesada del anticuerpo MN14 6625 - 7200 IRES de EMCV 7201 - 7203 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 7258 - 7260 Primer codón del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 7897 - 7899 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 7938 - 8529 Secuencia de WPRE 8600 - 9138 3’ LTR del virus de la leucemia murina de Moloney
    Figura 11a SED ID Nº 8
    Vector Bot de alfa-lactoalbúmina Figura 11b
    Figura 11c
    1 - 2053 Región flanqueante en 5’ de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana 2093 - 2336 Secuencia de PPE con mutación doble 2387 - 2443 Región de codificación del péptido señal cc49 2444 - 3088 Región de codificación de Fab de la cadena ligera del anticuerpo Bot 3112 - 3686 IRES de EMCV 3687 - 3745 Región de codificación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 3746 - 4443 Región de codificación de Fab de la cadena pesada del anticuerpo Bot 4481 - 5072 Secuencia WPRE 5118 - 5711 3’ LTR del virus de la leucemia murina de Moloney
    Figura 12a SEC ID Nº 9 Vector LSNRL
    Figura 12b
    1 - 589 5’ LTR de MoMuSV 659 - 897 Región de empaquetamiento retroviral 1034 - 1714 Antígeno de superficie de la hepatitis B 2279 - 2595 Promotor de RSV 2951 - 3745 Gen de la neomicina fosfotransferasa 4537 - 5130 3’ LTR de MoMuLV
    Figura 13a SEC ID Nº 10
    Vector cc49IL2 de alfa-lactoalbúmina
    Figura 13b
    1 - 2055 Región flanqueante en 5’ de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana 2098 - 4011 Región de codificación de cc49-IL2 4068 - 4661 3’ LTR de MoMuLV
    Figura 14a SEC ID Nº 11
    Vector YP de alfa-lactoalbúmina Figura 14b
    Figura 14c
    1 -2053
    Región flanqueante en 5’ de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana
    2093 - 2336
    Secuencia de PPE con doble mutación
    2403 - 2459
    Región de codificación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina
    2460 - 3137
    Región de codificación del gen de Fab de la cadena pesada de Yersinia pestis
    3167 - 3742
    IRES de EMCV
    3743 - 3799
    Región de codificación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina
    3800 - 4441
    Región de codificación del gen de Fab de la cadena ligera de Yersinia pestis
    4461 - 5052
    Secuencia WPRE
    5098 - 5691
    3’ LTR del virus de la leucemia murina de Moloney
    1 - 583 IRES 584 - 628 Región de codificación del péptido señal de la caseína alfa-S1 bovina modificada 629 - 668 Sitio de clonación múltiple
    Figura 16a SEC ID Nº: 13
    Vector LNBOTDC Figura 16b
    Figura 16c
    LTR 5’ del virus del sarcoma murino de Moloney 1 - 589 Región de empaquetamiento extendida del virus de la leucemia murina de Moloney 659 - 1468 Gen de resistencia a neomicina 1512 - 2306 Promotor del CMV 2656 - 3473 Región de codificación del péptido señal de cc49 3516 - 3572 Fab 5 de la cadena ligera de Bot 3573 - 4217 IRES de EMCV (Clonetech) 4235 - 4816 Región de codificación del péptido señal de α-LA bovina modificada 4817 - 4873 Fab 5 de la cadena pesada de Bot 4874 - 5572 LTR 3’ del virus de la leucemia murina de Moloney 5662 - 6255
    Figura 19a SEC ID Nº 34
    Vector LNBOTDC Figura 19b Figura 19c
    Figura 19d
    Características:
    149 - 737 LTR 5’ del virus del sarcoma murino de Moloney
    807 - 1616 Región de empaquetamiento extendido
    1680 - 1735 Promotor EM7 (promotor del bacteriófago T7)
    1754 - 2151 Secuencia de codificación del gen de resistencia a blasticidina
    2310 - 2440 Señal y sitio de poli A de SV40
    2603 - 3420 CMV IE promotor
    3675 - 4988 Receptor acoplado a proteína G (GPCR)
    5071 - 5646 IRES
    5647 - 5703 Péptido señal de la α-lactoalbúmina bovina
    5704 - 6372 Cadena ligera del anticuerpo “humanizado”
    6553 - 7146 LTR 3’ de MoMuLV
    7683 Origen de replicación
    9302 - 8442 Secuencia de codificación de b-lactamasa
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