KR20030032993A - 다수의 통합 벡터를 함유하는 숙주 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 숙주 세포에서의 단백질 생산에 관한 것이며, 더욱 특히 통합 벡터의 통합된 카피를 다수 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명에 사용하기 적합한 통합 벡터로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 트란스포손 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등이 있다. 본 발명은 통합 벡터를 높은 감염 다중도로 사용하여 숙주 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 숙주 세포는 제약 단백질의 생산, 스크리닝 분석에 사용하기 위한 단백질들의 변이체 생산 및 고처리량 스크리닝에 직접 사용하는데 유용하다.

Description

다수의 통합 벡터를 함유하는 숙주 세포 {Host Cells Containing Multiple Integrating Vectors}
제약 생명공학 산업은 포유동물 세포에서의 재조합 단백질 생산을 기초로 한다. 이들 단백질은 많은 질환 및 상태의 치료에 필수적이다. 많은 경우, 이들 단백질의 시판량은 연간 10억 달러를 넘는다. 포유동물 세포에서 재조합적으로 생산되는 단백질들의 예로는 에리트로포에틴, 인자 VIII, 인자 IX 및 인슐린 등이 있다. 이들 중 많은 단백질들이 원핵 세포에서 발현시키는 것 보다 포유동물 세포에서 발현시키는 것이 더욱 바람직한데, 이는 올바른 번역후 변형 (예를 들면, 글리코실화 또는 실화 (silation); 예를 들어 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,721,121호 참조)이 필요하기 때문이다.
재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 여러 방법들이 공지되어 있다. 가장 기본적인 방법에서는 이종 단백질 및 적당한 조절 영역을 코딩하는 유전자를 함유하는 핵산 구조물을 숙주 세포에 도입하여 통합되도록 한다. 도입 방법으로는 인산칼슘 침전법, 미세주입법, 리포펙션법 및 전기천공법 등이 있다. 다른 방법에서는 선택 계획안을 사용하여 도입된 핵산 구조물을 증폭시킨다. 이들 방법에서, 세포에 증폭가능한 선택 마커를 코딩하는 유전자 및 이종 단백질을 코딩하는 유전자를 동시형질감염시킨다 (예를 들어 문헌 [Schroder and Friedl, Biotech. Bioeng. 53 (6):547-59 (1997)] 참조). 초기 형질전환체를 선택한 후에 배양 배지 중 선택 작용제 (예를 들면, 디히드로폴레이트 리덕타제)를 단계별로 증가시켜 형질감염된 유전자를 증폭시킨다. 몇몇 경우에는 이러한 방법에 의해 외인성 유전자가 수백배 증폭될 수 있다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시키는 다른 방법은 에피솜 벡터 (예를 들면, 플라스미드)로 형질감염시키는 것이다.
재조합 단백질들을 발현시키기 위한 포유동물 세포주를 제조하는 현행 방법들은 여러 결점이 있다 (예를 들어 문헌 [Mielke et al., Biochem. 35:2239-52 (1996)] 참조). 에피솜 시스템은 재조합 단백질이 높은 수준으로 발현될 수 있게 하지만, 종종 단기간 동안에만 안정하다 (예를 들어 문헌 [Klehr and Bode, Mol. Genet. (Life Sci. Adv.) 7:47-52 (1988)] 참조). 통합된 외인성 유전자를 함유하는 포유동물 세포주가 약간 더 안정하지만, 외인성 유전자의 카피가 겨우 몇개 또는 1개만이 존재해야만 안정하다는 증거가 늘고 있다.
표준 형질감염 기술은 숙주 세포의 게놈으로 트랜스진의 카피가 다수 도입되는 것을 선호한다. 다수의 트랜스진 통합은 많은 경우에서 내재적으로 불안정하다는 것이 입증된 바 있다. 이러한 내재적 불안정성은, 특히 트랜스진이 전사되는 경우 (예를 들어 문헌 [McBurney et al., Somatic Cell Molec. Genet. 20:529-40(1994)] 참조)에 상동성 재조합에 의한 코딩 서열의 손실을 촉진하는 특징적인 헤드-대-테일 (head-to-tail) 방식의 통합에 기인하는 것일 수 있다. 또한, 숙주 세포는 다수의 카피 통합 사건에 대해 지시된 후성(後成) 방어 메카니즘을 갖는다. 식물에서, 이러한 메카니즘은 "공동억제 (cosuppression)"이라 일컬어진 바 있다 (예를 들어 문헌 [Allen et al., Plant Cell 5:603-13 (1993)]). 실제로, 발현 수준이 카피수와 역관계에 있다는 것은 특이한 것이 아니다. 이러한 관찰은 다수 카피의 외인성 유전자가 메틸화 (예를 들어 문헌 [Mehtali et al., Gene 91:179-84 (1990)] 참조) 및 이후의 돌연변이유발 (예를 들어 문헌 [Kricker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1075-79 (1992)]에 의해 불활성화되거나 또는 이질염색질 형성 (예를 들어 문헌 [Dorer and Henikoff, Cell 77:993-1002 (1994)] 참조)에 의해 침묵화된다는 발견과 일치하는 것이다.
따라서, 당업계에는 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 제조하기 위한 개선된 방법이 요구된다. 상기 숙주 세포는 더 오랜 기간 동안 안정하고 트랜스진에 의해 코딩되는 단백질을 높은 수준으로 발현하는 것이 바람직할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 숙주 세포에서의 단백질 생산에 관한 것이며, 더욱 특히 통합 벡터의 통합된 카피를 다수 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 특정 수의 통합 벡터로 형질감염된 숙주 세포로 제한되지 않는다. 실제로, 통합 벡터를 광범위한 수로 함유하는 숙주 세포가 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 통합된 통합 벡터를 바람직하게는 약 2개 이상 함유하는 게놈을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 상기 게놈은 바람직하게는 통합된 통합 벡터를 3개 이상 포함하고, 가장 바람직하게는 통합된 통합 벡터를 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상 또는 50개 이상 포함한다.
본 발명은 1종의 관심 단백질 (즉, 외인성 단백질)을 코딩하는 벡터를 함유하는 숙주 세포로 제한되지 않는다. 실제로, 숙주 세포를 여러가지 관심 단백질들을 코딩하는 벡터로 형질감염시킬 것이 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 통합 벡터는 2종 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자는 폴리시스트론 서열로 배열된다. 몇몇 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자는 내부 리보솜 결합 부위에 의해 분리되어 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자는 폴리시스트론 서열로 배열된다. 추가의 실시양태에서, 상기 2종의 외인성 유전자는 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자 중 하나는 선택가능한 마커이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 제1 외인성 유전자를 포함하는 제1 통합 벡터의 통합된 카피를 2개 이상 포함하고 제2 외인성 유전자를 포함하는 제2 통합 벡터 또는 다른 벡터의 통합된 카피를 1개 이상 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 제1 외인성 유전자를 포함하는 제1 통합 벡터의 통합된 카피를 10개 이상 포함하고 제2 외인성 유전자를 포함하는 제2 통합 벡터 또는 다른 벡터의 통합된 카피를 1개 이상 포함한다.
몇몇 바람직한 실시양태에서, 통합 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 본 발명은 특정 프로모터를 함유하는 벡터로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 프로모터들이 고려된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 알파-락트알부민 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스의 장쇄 말단 반복서열로 구성된 군에서 선택된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 통합 벡터는 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 분비 신호를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 통합 벡터는 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 RNA 배출 (export) 요소를 추가로 포함한다.
본 발명은 특정 통합 벡터로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 통합 벡터들이 고려된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 통합 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 트란스포손 벡터로 구성된 군에서 선택된다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 슈도형 (pseudotyped) 레트로바이러스 벡터이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 슈도형 레트로바이러스 벡터는 G 당단백질을 포함한다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 특정 G 당단백질로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 G 당단백질들이 고려된다. 몇몇 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 G 당단백질은 수포성 구내염 바이러스, 피리 바이러스, 칸디푸라 바이러스, 카르프 바이러스의 스프링 바이러스혈증 (Spring viremia) 및 모콜라 바이러스 G 당단백질로 구성된 군에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 장쇄 말단 반복서열을 포함한다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 특정 LTR로 제한되지 않는다. 실제로, MoMLV, MoMuSV 및 MMTV의 장쇄 말단 반복서열 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 LTR들이 고려된다.
다른 실시양태에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 슈도형이다. 몇몇 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 G 당단백질을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 G 당단백질은 수포성 구내염 바이러스, 피리 바이러스, 칸디푸라 바이러스, 카르프 바이러스의 스프링 바이러스혈증 및 모콜라 바이러스의 G 당단백질로 구성된 군에서 선택된다. 다른 실시양태에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 HIV 및 말 감염성 빈혈 바이러스의 장쇄 말단 반복서열로 구성된 군에서 선택된 장쇄 말단 반복서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 통합 벡터는 트란스포손 벡터이다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 상기 트란스포손 벡터는 TnS, Tn7 및 Tn1O 트란스포손 벡터로부터 선택된다.
본 발명은 특정 숙주 세포로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 숙주 세포들이 고려된다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포를 시험관내 배양한다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 차이니스 햄스터 난소 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 소 유방 상피 세포로부터 선택된다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 단일 클론에서 (clonally) 유래한 것이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 단일 클론에서 유래한 것이 아니다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 10 계대 초과 동안 안정하다. 다른 실시양태에서, 상기 게놈은 50 계대 초과 동안 안정하며; 다른 실시양태에서, 상기 게놈은 100 계대 초과 동안 안정하다.다른 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 배아 간세포, 난모세포 또는 배자(胚子)일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 통합된 벡터는 선별하지 않아도 (in the absence of selection) 안정하다.
본 발명은 특정 관심 단백질을 코딩하는 벡터로 제한되지 않는다. 실제로, 외인성 유전자들에 의해 코딩되는 다양한 관심 단백질들을 코딩하는 벡터들이 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 관심 단백질은 B형 간염 바이러스 표면 항원, MN14 항체, LL2 항체, 보툴리눔 (botulinum) 독소 항체 및 cc49IL2로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 관심 단백질을 코딩하는 유전자는 인트론이 없으며; 다른 실시양태에서, 관심 단백질을 코딩하는 유전자는 인트론을 1개 이상 포함한다.
또한, 본 발명은 1) a) 게놈을 포함하는 숙주 세포 및 b) 복수개의 통합 벡터를 제공하는 단계, 및 2) 상기 숙주 세포를 2개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포의 형질감염 또는 형질도입 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조건은 숙주 세포를 감염 다중도 10 초과로 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조건은 숙주 세포를 감염 다중도 약 10 내지 1,000,000으로 접촉시키는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 조건은 숙주 세포를 감염 다중도 약 100 내지 10,000으로 접촉시키는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 조건은 숙주 세포를 감염 다중도 약 100 내지 1,000으로 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 방법은 숙주 세포를 각각이 상이한 외인성 유전자를 포함하는 2종 이상의 통합 벡터로 형질감염시키는 단계를 추가로포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조건은 숙주 세포를 적어도 제1 형질감염 또는 형질도입 단계에서 관심 단백질을 코딩하는 벡터로 형질감염 또는 형질도입시킨 후에 별도의 형질감염 또는 형질도입 단계에서 재형질감염 또는 재형질도입시키는 것을 포함한다.
추가로, 본 발명은 1) 관심 단백질을 코딩하며 프로모터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자를 포함하는 1종 이상의 통합 벡터의 통합된 카피를 2개 이상 포함하는 게놈을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 2) 상기 숙주 세포를 상기 관심 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 관심 단백질의 생산 방법을 제공한다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 통합 벡터는 상기 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 3) 상기 관심 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명은 임의의 특정 배양 시스템으로 제한되지 않는다. 실제로, 롤러병 배양, 관류 배양, 배치식 공급 (batch fed) 배양 및 페트리 디쉬 배양 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 배양 시스템들이 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포주는 단일 클론에서 선택된 것이며; 다른 실시양태에서, 상기 세포는 단일 클론에서 선택된 것이 아니다.
본 발명의 방법은 통합된 통합 벡터를 임의의 특정 수로 함유하는 숙주 세포로 제한되지 않는다. 실제로, 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 통합 벡터의 통합된 카피를 3개 초과로 포함하고; 다른 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 통합 벡터의 통합된 카피를 4개 초과로 포함하고; 다른 실시양태에서, 숙주 세포의게놈은 통합 벡터의 통합된 카피를 5개 초과로 포함하고; 추가의 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 통합 벡터의 통합된 카피를 7개 초과로 포함하며; 추가의 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 통합 벡터의 통합된 카피를 10개 초과로 포함한다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 통합 벡터의 통합된 카피를 약 2개 내지 20개 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 통합 벡터의 통합된 카피를 약 3개 내지 10개 포함한다.
본 발명의 방법은 임의의 특정 통합 벡터로 제한되지 않는다. 실제로, 다양한 통합 벡터들의 사용이 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 통합 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 슈도형 레트로바이러스 벡터이다. 다른 실시양태에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본 발명의 방법은 임의의 특정 숙주 세포의 사용으로 제한되지 않는다. 실제로, 차이니스 햄스터 난소 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, 소 유방 상피 세포, 난모세포, 배자, 간세포 및 배아 간세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 세포들의 사용이 고려된다.
본 발명의 방법은 숙주 세포로부터 임의의 특정 양의 외인성 단백질 (즉, 관심 단백질) 생산으로 제한되지 않는다. 실제로, 본 발명의 방법에 의해 다양한 발현 수준이 허용될 수 있다고 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포의 1개 세포 당 관심 단백질의 1일 합성량은 약 1 pg 초과이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포의 1개 세포 당 관심 단백질의 1일 합성량은 약 10 pg 초과이다. 추가의 실시양태에서, 숙주 세포의 1개 세포 당 관심 단백질의 1일 합성량은 약 50 pg 초과이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1) a) 관심 단백질을 코딩하며 프로모터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자를 포함하는 1종 이상의 통합 벡터의 통합된 카피를 2개 이상 포함하는 게놈을 포함하는 숙주 세포 및 b) 1종 이상의 시험 화합물을 제공하는 단계, 2) 상기 숙주 세포를 상기 관심 단백질이 발현되는 조건하에 배양하는 단계, 3) 상기 숙주 세포에 상기 1종 이상의 시험 화합물을 처리하는 단계, 및 4) 상기 시험 화합물에 대한 숙주 세포의 반응 여부를 분석하는 단계를 포함하는, 화합물들의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 상기 외인성 유전자는 리포터 단백질, 막 수용체 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포질 수용체 단백질, 이온 채널 단백질, 신호 도입 단백질, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제 및 종양유전자에 의해 코딩되는 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 코딩한다.
추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 리포터 유전자를 추가로 포함한다. 몇몇 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 및 베타-락타마제로 구성된 군에서 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 분석 단계는 리포터 유전자로부터의 신호 검출 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포의 게놈은 각각이 상이한 외인성 유전자를 포함하는 2종 이상의 통합 벡터를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1) a) 제1 관심 단백질을 코딩하는 제1 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 통합 벡터를 포함하는제1 숙주 세포 및 b) 적어도, 상기 제1 관심 단백질의 변이체인 제2 관심 단백질을 코딩하는 제2 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 통합 벡터를 포함하는 제2 숙주 세포를 제공하는 단계, 2) 상기 숙주 세포를 상기 제1 및 제2 관심 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계, 및 3) 상기 제1 및 제2 관심 단백질의 활성을 비교하는 단계를 포함하는, 단백질들의 활성 비교 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 외인성 유전자는 막 수용체 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포질 수용체 단백질, 이온 채널 단백질, 신호 도입 단백질, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, 세포 주기 단백질 및 종양유전자에 의해 코딩되는 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 코딩한다. 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 관심 단백질은 1개의 아미노산이 상이하다. 추가의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 관심 단백질의 동일성은 95％ 초과, 바람직하게는 90％ 초과, 가장 바람직하게는 80％ 초과이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1) a) 1종 이상의 통합된 외인성 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 숙주 세포 및 b) 복수개의 통합 벡터를 제공하는 단계, 및 2) 상기 숙주 세포를 2개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 통합된 외인성 유전자는 통합 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 단일 클론에서 선택된 것이다. 별법의 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 단일 클론에서 선택된 것이 아니다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 IRES에 의해 작동가능하게 연결된 신호 단백질 및 관심 단백질을 포함하는 폴리시스트론 서열을 코딩하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 상기 숙주 세포를 신호 단백질 및 관심 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 관심 단백질 발현의 간접적 검출 방법을 제공하며, 이때, 신호 단백질의 존재가 관심 단백질의 존재를 지시한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 관심 단백질의 발현으로 제한되지 않는다. 실제로, G-단백질-커플링된 수용체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 관심 단백질들의 발현이 고려된다. 본 발명은 임의의 특정 신호 단백질의 사용으로 제한되지 않는다. 실제로, 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 녹색 형광 단백질 및 루시퍼라제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 신호 단백질들의 사용이 고려된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 신호 단백질 및 관심 단백질의 발현은 동일한 프로모터에 의해 구동되며 상기 신호 단백질 및 관심 단백질은 1개의 전사 단위로서 전사된다.
본 발명은 숙주 세포에서의 단백질 생산에 관한 것이며, 더욱 특히 통합 벡터의 통합된 카피를 다수 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.
도 1은 변성 조건하에 운행하고 항-인간 IgG (Fc) 및 항-인간 IgG (카파)로 프로빙 (probing)한 15％ SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블럿이다.
도 2는 시간에 따른 MN14 발현량의 그래프이다.
도 3은 비-변성 조건하에 운행하고 항-인간 IgG (Fc) 및 항-인간 IgG (카파)로 프로빙한 15％ SDS-PAGE의 웨스턴 블럿이다.
도 4는 하이브리드 인간-소 알파-락트알부민 프로모터의 서열 (서열 1)이다.
도 5는 돌연변이된 PPE 서열의 서열 (서열 2)이다.
도 6은 IRES-신호 펩티드 서열의 서열 (서열 3)이다.
도 7A 및 도 7B는 CMV MN14 벡터의 서열 (서열 4)이다.
도 8A 및 도 8B는 CMV LL2 벡터의 서열 (서열 5)이다.
도 9A 내지 도 9C는 MMTV MN14 벡터의 서열 (서열 6)이다.
도 10A 내지 도 10D는 알파-락트알부민 MN14 벡터의 서열 (서열 7)이다.
도 11A 내지 도 11C는 알파-락트알부민 Bot 벡터의 서열 (서열 8)이다.
도 12A 및 도 12B는 LSRNL 벡터의 서열 (서열 9)이다.
도 13A 및 도 13B는 알파-락트알부민 cc49IL2 벡터의 서열 (서열 10)이다.
도 14A 내지 도 14C는 알파-락트알부민 YP 벡터의 서열 (서열 11)이다.
도 15는 IRES-카제인 신호 펩티드 서열의 서열 (서열 12)이다.
도 16A 내지 도 16C는 LNBOTDC 벡터의 서열 (서열 13)이다.
도 17은 CMV 프로모터 세포주에서 INVADER 분석 유전자 비율을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 18은 α-락트알부민 프로모터 세포주에서 INVADER 분석 유전자 비율을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 19A 내지 도 19D는 G-단백질-커플링된 수용체 및 항체 경쇄를 발현하는 레트로바이러스 벡터의 서열이다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 하기 위해서, 여러가지 용어들을 하기에서 정의하였다.
본원에서 사용된 바와 같이 "숙주 세포"라는 용어는 시험관내 또는 생체내 위치한 임의의 진핵 세포 (예를 들면, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "세포 배양"이라는 용어는 세포의 임의의 시험관내 배양을 지칭한다. 이 용어에는, 난모세포 및 배자 등을 비롯하여 시험관내에서 유지되는 연속 세포주 (예를 들면, 불멸 표현형을 갖는 세포주), 초대 세포 배양, 유한 (finite) 세포주 (예를 들면, 형질전환되지 않은 세포) 및 임의의 다른 세포 집단 등이 속한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "벡터"라는 용어는 적당한 조절 요소와 결합된 경우 복제될 수 있고 세포들 사이에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전적 요소, 예를 들어 플라스미드, 파지, 트란스포손, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 (virion) 등을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클 뿐 아니라 바이러스 벡터까지도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "통합 벡터"라는 용어는 핵산 (예를 들면, 염색체)으로의 통합 또는 삽입이 인테그라제를 통해 수행되는 벡터를 지칭한다. "통합 벡터"의 예로는 레트로바이러스 벡터, 트란스포손 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "통합된"이라는 용어는 숙주 세포의 게놈 (즉, 염색체)로 안정하게 삽입된 벡터를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "감염 다중도" 또는 "MOI"라는 용어는 숙주 세포의 형질감염 또는 형질도입 동안 사용된 통합 벡터 : 숙주 세포의 비율을 지칭한다. 예를 들면, 1,000,000개의 벡터를 사용하여 100,000개의 숙주 세포를 형질도입시킨 경우의 감염 다중도는 10이다. 이 용어의 사용은 형질도입을 포함하는 사건으로 제한되지 않으며, 리포펙션법, 마이크로 주입법, 인산칼슘 침전법 및 전기천공법 등의 방법을 통해 벡터를 숙주에 도입하는 것도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "게놈"이라는 용어는 유기체의 유전 물질 (예를 들면, 염색체)을 지칭한다.
"관심 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 임의의 뉴클레오티드 서열 (예를 들면, RNA 또는 DNA)을 지칭하며, 당업자는 이의 조작을 임의의 이유 (예를 들면, 질환 치료, 성능 개선, 숙주 세포 내 관심 단백질의 발현, 리보자임의 발현 등)에 바람직한 것으로 간주할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열로는 구조적 유전자 (예를 들면, 리포터 유전자, 선택 마커 유전자, 종양유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 등)의 코딩 서열 및 mRNA 또는 단백질 생성물을 코딩하지 않는 비코딩 조절 서열 (예를 들면, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종료 서열, 인핸서 서열 등) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "관심 단백질"이라는 용어는 관심 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "신호 단백질"이라는 용어는 관심 단백질과 함께 동시발현되며 적합한 분석을 통해 검출될 경우에는 상기 관심 단백질의 발현에 대한 간접적인 증거를 제공하는 단백질을 지칭한다. 본 발명에 유용한 신호 단백질의 예로는 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 녹색 형광 단백질 및 루시퍼라제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "외인성 유전자"라는 용어는 천연적으로는 숙주 유기체 또는 세포에 존재하지 않는 유전자 또는 인공적으로 숙주 유기체 또는 세포에 도입된 유전자를 지칭한다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 또는 전구체 (예를 들면, 프로인슐린) 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들면, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 전장 코딩 서열 또는 이의 임의의 일부가 원하는 활성 또는 기능적 특성 (예를 들면, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 도입 등)을 보유하는 한, 폴리펩티드는 상기 전장 서열 또는 단편으로 코딩될 수 있다. 상기 용어는 또한 구조적 유전자의 코딩 영역도 포함하며, 5' 또는 3' 말단 모두에서 약 1 kb 이상의 거리를 두고 코딩 영역에 인접하게 위치한 서열도 포함하여, 유전자는 전장 mRNA의 길이에 상응한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열은 5' 비번역 서열이라 지칭된다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열은 3' 비번역 서열이라 지칭된다. "유전자"라는 용어는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개입 영역" 또는 "개입 서열"이라 일컬어지는 비-코딩 서열이 끼여있는 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자 절편이며, 인트론은 인핸서 등의 조절 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 전사체 또는 1차 전사체로부터 제거되거나 "스플라이싱"되기 때문에, 인트론은 운반 RNA (mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. 번역되는 동안 mRNA는 배출 직후의 폴리펩티드에서 아미노산 서열 또는 순서를 구체화하는 기능을 한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "유전자 발현"이라는 용어는 유전자 내 코딩된 유전적 정보가 유전자 "전사"를 통해 (즉, RNA 중합효소 작용을 통해) RNA (예를 들면, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 전환되고, 단백질을 코딩하는 유전자인 경우에는 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환되는 과정을 지칭한다. 유전자 발현은 상기 과정 중 많은 단계에서 조절될 수 있다. "상향조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 생성물 (즉, RNA 또는 단백질)의 생산량을 증가시키는 조절을 지칭하며, "하향-조절" 또는 "억제"는 상기 생산량을 감소시키는 조절을 지칭한다. 상향조절 또는 하향-조절에 관여하는 분자 (예를 들면, 전사 인자)는 종종 각각 "활성자" 및 "레프레서"라 일컬어진다.
본원에서 "아미노산 서열"이 천연 발생 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하여 언급되는 경우, "폴리펩티드" 또는 "단백질" 등에서와 같이 "아미노산 서열" 등의 용어는 언급된 단백질 분자와 관련된 완전한 천연 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열만을 제한적으로 의미하는 것이 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이 "-을 코딩하는 핵산 분자", "-을 코딩하는 DNA 서열", "-을 코딩하는 DNA", "-을 코딩하는 RNA 서열" 및 "-을 코딩하는 RNA"라는 용어는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 가닥에 따른 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서가 폴리펩티드 (단백질)쇄에서의 아미노산 순서를 결정한다. 따라서, DNA 또는 RNA 서열이 아미노산 서열을 코딩한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "변이체"라는 용어가 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 이는 부분적으로 상동성인 핵산에 의해 코딩되어 상기 단백질의 아미노산 서열이 다양해지는 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "변이체"라는 용어는 상동성 유전자에 의해 코딩되며 단백질 기능이 변화되지 않는 보존적 및 비-보존적 아미노산 치환된 단백질을 포함할 뿐 아니라, 상동성 유전자에 의해 코딩되며 단백질 기능이 감소 (예를 들면, 널 (null) 돌연변이)되거나 단백질 기능이 증가되는 아미노산 치환된 단백질까지도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "상보적" 또는 "상보성"이라는 용어는 염기쌍 규칙에 따른 폴리뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드들의 서열)와 관련하여 사용된다. 예를 들면, 서열 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"에 상보적이다. 상보성은 단지 몇개의 핵산 염기만이 염기쌍 규칙에 부합되는 "부분적" 상보성일 수 있다. 또는, 핵산들 사이에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수도 있다. 핵산 가닥들 사이의 상보성 정도는 혼성화 효율 및 강도에 유의한 효과를 미친다. 이는 특히 증폭 반응 뿐 아니라 핵산들 사이의 결합에 의존하는 검출 방법에서도 중요하다.
"상동성" 및 "동일성(％)"이라는 용어가 핵산과 관련하여 사용된 경우, 이는 상보성 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 (즉, 부분적 동일성) 또는 완전한 상동성 (즉, 완전한 동일성)이 있을 수 있다. 부분적으로 상보적인 서열은 완전하게 상보적인 서열과 표적 핵산 서열의 혼성화를 적어도 부분적 억제하는 서열이며, "실질적으로 상동성"이라는 기능적 용어를 사용하여 지칭된다. 완전하게 상보적인 서열과 표적 서열과의 혼성화 억제는 혼성화 분석 (서던 또는 노던 블럿, 용액 혼성화 등)을 통해 저 엄격 조건하에서 조사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브 (즉, 다른 관심 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드)는 저 엄격 조건하에서 완전하게 상동성인 서열과 표적 서열의 결합 (즉, 혼성화)을 경쟁하고 억제할 것이다. 이는 저 엄격 조건이 이러한 비-특이적 결합을 허용한다고 말하는 것은 아니며, 저 엄격 조건은 2개 서열들의 서로에 대한 결합이 특이적 (즉, 선택적) 상호작용일 것을 요구한다. 비-특이적 결합의 부재는 부분적 상보성조차도 없는 (예를 들면, 동일성이 약 30％ 미만임) 제2 표적을 사용하여 시험할 수 있으며, 비-특이적 결합이 없다면, 프로브는 제2 비-상보적 표적에 혼성화하지 않을 것이다.
당업자라면, 저 엄격 조건에 해당하는 수많은 동등한 조건을 사용할 수 있음을 알 것이다: 프로브의 길이 및 성질 (DNA, RNA, 염기 조성) 등의 인자 및 표적의 성질 (DNA, RNA, 염기 조성, 용액 중 존재하는지 또는 고정화되어 존재하는지의 여부 등) 및 염의 농도 및 기타 성분들 (예를 들면, 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재)을 고려하여, 혼성화 용액을 변화시켜 상기한 조건과 상이하지만 동등한 저 엄격 혼성화 조건을 생성할 수 있다. 또한, 당업자라면, 고 엄격 조건하에서 혼성화를 촉진하는 조건 (예를 들면, 혼성화 온도의 증가 및(또는) 세척 단계, 혼성화 용액 중 포름아미드의 사용 등)을 알 것이다.
cDNA 또는 게놈 클론과 같은 이중 가닥 핵산 서열과 관련하여 "실질적으로상동성"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 상기 기재한 바와 같은 저 엄격 조건하에서 이중 가닥 핵산 서열의 한쪽 가닥 또는 양 가닥 모두와 혼성화할 수 있는 임의의 프로브를 지칭한다.
단일 가닥 핵산 서열과 관련하여 "실질적으로 상동성"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 상기 기재한 바와 같은 저 엄격 조건하에서 단일 가닥 핵산 서열과 혼성화할 수 있는 임의의 프로브 (즉, 상기 단일 가닥 핵산 서열의 상보체임)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "혼성화"라는 용어는 상보적 핵산들의 쌍형성과 관련하여 사용된다. 혼성화 및 혼성화 강도 (즉, 핵산들 사이의 결합 강도)는 핵산들 사이의 상보성 정도, 사용된 조건의 엄격성, 형성된 하이브리드의 Tm및 핵산 내 G : C 비율과 같은 인자에 의해 영향을 받는다. 구조 내에 상보적 핵산들의 쌍을 함유하는 단일 분자는 "자가-혼성화되었다"고 일컬어진다.
본원에서 사용된 바와 같이 "Tm"이라는 용어는 핵산의 "용융 온도"와 관련하여 사용된다. 용융 온도는 이중 가닥 핵산 분자들의 집단 중 절반이 단일 가닥으로 해리되는 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 식은 당업계에 공지되어 있다. 표준 참고문헌에 지시되어 있는 바와 같이, 간단한 Tm값 추정치는 다음의 식으로 계산될 수 있다: Tm= 81.5 + 0.41((G + C)의 비율(％)) (이때, 핵산은 1 M NaCl 수용액 중에 존재함) (예를 들어 문헌 [Anderson and Young, Quantitative FilterHybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)] 참조). 다른 참고문헌은 Tm계산에 구조적 특징 뿐 아니라 서열 특징까지도 고려한 더욱 복잡한 계산식을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "엄격성"이라는 용어는 핵산 혼성화가 수행되는 온도, 이온 강도 및 유기 용매 등의 다른 화합물들의 존재 여부 조건과 관련하여 사용된다. "고 엄격" 조건에서는 상보적 염기 서열의 빈도가 높은 핵산 단편들 사이에서만 핵산 염기쌍 형성이 일어날 것이다. 따라서, "약한" 또는 "저" 엄격 조건은 통상적으로 상보적 서열의 빈도가 덜한 유전적으로 다양한 유기체들로부터 유래된 핵산에 종종 요구된다.
"고 엄격 조건"이 핵산 혼성화와 관련하여 사용될 때, 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브를 사용하는 경우에는 42℃에서 5 ×SSPE (43.8 g/L NaCl, 6.9 g/L NaH2PO4·H2O 및 1.85 g/L EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.5％ SDS, 5 ×덴하르트 (Denhardt's) 시약 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서 결합 또는 혼성화시킨 후에, 42℃에서 0.1 ×SSPE, 1.0％ SDS를 포함하는 용액으로 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.
"중간 엄격 조건"이 핵산 혼성화와 관련하여 사용될 때, 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브를 사용하는 경우에는 42℃에서 5 ×SSPE (43.8 g/L NaCl, 6.9 g/L NaH2PO4·H2O 및 1.85 g/L EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.5％ SDS, 5 ×덴하르트 시약 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서결합 또는 혼성화시킨 후에, 42℃에서 1.0 ×SSPE, 1.0％ SDS를 포함하는 용액으로 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.
"저 엄격 조건"은 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브를 사용하는 경우에는 42℃에서 5 ×SSPE (43.8 g/L NaCl, 6.9 g/L NaH2PO4·H2O 및 1.85 g/L EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.1％ SDS, 5 ×덴하르트 시약 (50 ×덴하르트는 500 mL 당 5 g 피콜 (Ficoll) (400형, 파르마샤 (Pharamcia) 제품), 5 g BSA (분획 V; 시그마 (Sigma) 제품)을 함유함) 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서 결합 또는 혼성화시킨 후에, 42℃에서 5 ×SSPE, 0.1％ SDS를 포함하는 용액으로 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.
한 유전자는 1차 RNA 전사체의 차별적 스플라이싱을 통해 생성된 다수의 RNA 종을 생산할 수 있다. 동일한 유전자의 스플라이싱 변이체인 cDNA는 서열 동일성 또는 완전한 상동성 영역 (2가지 cDNA 모두에 동일한 엑손 또는 동일한 엑손의 일부가 존재함을 나타냄) 및 완전한 비-동일성 영역 (예를 들어, cDNA 1에는 엑손 "A"가 존재하는 대신, cDNA 2는 "B"를 함유함을 나타냄)을 함유할 것이다. 상기 2가지 cDNA들이 서열 동일성 영역을 함유하기 때문에, 이들은 둘다 2가지 cDNA 모두에서 발견되는 서열을 함유하는 유전자 전체 또는 유전자의 일부로부터 유래된 프로브와 혼성화될 것이므로, 상기 2가지 스플라이싱 변이체는 이러한 프로브 및 서로에게 실질적으로 상동성이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "작동가능한 조합물로", "작동가능한 순서로" 및"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 주어진 유전자의 전사 및(또는) 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생산되는 방식으로 핵산 서열들이 연결되었음을 지칭한다. 또한, 상기 용어는 기능적 단백질이 생상되는 방식으로 아미노산 서열들이 연결되었음을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "선택가능한 마커"라는 용어는 달리 필수적인 영양분이라 할만한 것이 없는 배지 중에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 효소 활성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 효모 세포의 경우에는HIS3유전자)를 지칭한다. 또한, 선택가능한 마커는 상기 선택가능한 마커를 발현하는 세포에게 항생제 또는 약물에 대한 내성을 부여할 수 있다. 선택가능한 마커는 "우세 (dominant)"할 수 있다: 우세한 선택가능한 마커는 임의의 진핵 세포주에서 검출될 수 있는 효소 활성을 코딩한다. 우세한 선택가능한 마커의 예로는 포유동물 세포에서 약물 G418에 대한 내성을 부여하는 박테리아 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo유전자라고 지칭되기도 함), 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 박테리아 하이그로마이신 G 포스포트랜스퍼라제 유전자 (hyg) 및 마이코페놀산의 존재하에서의 성장능을 부여하는 박테리아 크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자 (gpt유전자라고 지칭되기도 함) 등이 있다. 사용에 우세하지 않은 다른 선택가능한 마커는 관련 효소 활성이 없는 세포주와 함께 사용되어야 한다. 우세하지 않은 선택가능한 마커의 에로는 tk-세포주와 함께 사용되는 티미딘 키나제 (tk) 유전자, CAD-결핍 세포와 함께 사용되는 CAD 유전자 및hprt -세포주와함께 사용되는 포유동물 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (hprt) 유전자 등이 있다. 포유동물 세포주에서의 선택가능한 마커 사용에 관해 살펴보기 위해서는, 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 16.9-16.15]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "조절 요소"라는 용어는 핵산 서열 발현의 몇몇 측면을 조절하는 유전적 요소를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 이와 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소로는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종료 신호, RNA 배출 요소, 내부 리보솜 결합 부위 등 (하기에서 정의됨)이 있다.
진핵동물의 전사 조절 신호는 "프로모터" 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호작용하는 짧은 배열의 DNA 서열로 구성된다 [Maniatis et al., Science 236:1237 (1987)]. 프로모터 및 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유동물 세포 등을 비롯한 다양한 진핵세포 공급원 및 바이러스 유전자에서 단리되었다 (원핵세포에서도 유사한 조절 요소, 즉, 프로모터가 발견됨). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 관심 단백질 발현에 사용될 세포 유형에 따라 달라진다. 몇몇 진핵세포 프로모터 및 인핸서는 숙주 범위가 넓은 반면, 다른 것들은 제한된 서브세트의 세포 유형들에서만 기능한다 (살펴보기 위해서는, 문헌 [Voss et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986)] 및 [Maniais et al., 상기 문헌] 참조). 예를 들면, SV40 초기 유전자 인핸서는 많은포유동물 종으로부터의 광범위하게 다양한 세포 유형에서 매우 활성이며 포유동물 세포 내 단백질 발현에 광범위하게 사용된다 [Dijkema et al., EMBO J. 4:761 (1985)]. 넓은 범위의 포유동물 세포 유형에서 활성인 프로모터/인핸서 요소의 다른 2개 예는 인간 신장 인자 1α 유전자 [Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264:5791 (1989)], [Kim et al., Gene 91:217 (1990)] 및 [Mizushima and Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 (1990)] 및 라우스 육종 바이러스 [German et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)) 및 인간 사이토메갈로바이러스 [Boshart et al., Cell 41:521 (1985)]의 장쇄 말단 반복서열로부터의 요소이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "프로모터/인핸서"라는 용어는 프로모터 기능 및 인핸서 기능 (즉, 프로모터 요소 및 인핸서 요소에 의해 제공되는 기능, 이들 기능에 관한 논의를 위해서는 상기를 참조함) 모두를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 절편을 의미한다. 예를 들면, 레트로바이러스의 장쇄 말단 반복서열은 프로모터 기능 및 인핸서 기능을 모두 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성"이거나 또는 "이종"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈 내에서 주어진 유전자와 천연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종" 인핸서/프로모터는 유전자 조작 (즉, 클로닝 및 재조합 등의 분자생물학 기술)을 통해 유전자 근위에 위치된 것으로서, 상기 유전자의 전사는 연결된 인핸서/프로모터에 의한 지시를 받는다.
조절 요소는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. "조직 특이적"이라는 용어가 조절 요소에 적용되는 경우, 이는 특정 유형의 조직 (예를 들면, 간)에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 상이한 유형의 조직 (예를 들면, 폐)에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 상대적인 발현 부재시에 지시할 수 있는 조절 요소를 지칭한다.
예를 들어, 조절 요소의 조직 특이성은 리포터 유전자를 프로모터 서열 (조직-특이적이 아님)에 작동가능하게 연결하고 조절 요소에 작동가능하게 연결하여 리포터 구조물을 제조하고, 상기 리포터 구조물을 동물의 게놈에 도입하여 리포터 구조물이 생성된 트랜스제닉 동물의 모든 조직으로 통합되도록 하고, 상기 트랜스제닉 동물의 상이한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 검출 (예를 들면, 리포터 유전에 의해 코딩되는 mRNA, 단백질 또는 단백질 활성 검출)함으로써 평가할 수 있다. 1종 이상의 조직에서의 리포터 유전자 발현량이 다른 조직에서 상기 리포터 유전자의 발현 수준 보다 상대적으로 더 높게 검출되는 것은 상기 조절 요소가 발현 수준이 더 높게 검출된 조직에 "특이적"임을 나타낸다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이 "조직-특이적" (예를 들면, 간-특이적)이라는 용어는 절대적인 발현 특이성을 요구하지 않는 상대적인 용어이다. 즉, "조직-특이적"이라는 용어는 어떠한 조직에서는 극단적으로 높은 수준으로 발현되고, 다른 조직에서는 발현되지 않을 것을 요구하지 않는다. 어떤 조직에서의 발현이 다른 조직에서의 발현보다 더 높은 것으로 충분하다. 반대로, "엄격한" 또는 "절대적인" 조직-특이적 발현은 하나의 조직 유형 (예를 들면, 간)에서만 발현되며 다른 조직에서는 검출가능한 발현이 없음을 지시하는 의미이다.
조절 요소에 적용되는 "세포 유형 특이적"이라는 용어는 특정 유형의 세포에서 동일한 조직 내 상이한 유형의 세포에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 상대적인 발현 부재시에 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적인 발현을 지시할 수 있는 조절 요소를 지칭한다. "세포 유형 특이적"이라는 용어가 조절 요소에 적용되는 경우, 이는 또한 하나의 조직 내 영역에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적인 발현을 촉진할 수 있는 조절 요소를 의미한다.
조절 요소의 세포 유형 특이성은 당업계에 공지된 방법 (예를 들면, 면역조직화학적 염색법 및(또는) 노던 블럿 분석법)을 사용하여 평가될 수 있다. 간단하게 말하자면, 면역조직화학적 염색을 위해서 조직 절편을 파라핀에 묻고, 파라핀 절편을 조절 요소에 의해 발현이 조절되는 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 생성물에 특이적인 1차 항체와 반응시킨다. 1차 항체에 특이적인 표지된 (예를 들면, 퍼옥시다제 접합된) 2차 항체를 사용하면, 절단된 조직에의 결합 및 현미경검사법을 통해 검출되는 특이적 결합 (예를 들면, 아비딘바이오틴과의 결합)이 가능하다. 간단하게 말하자면, 노던 블럿 분석의 경우에는 RNA를 세포로부터 단리하여 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 RNA를 크기별로 분획화한 후에 상기 RNA를 겔로부터 고체 지지체 (예를 들면, 니트로셀룰로스막 또는 나일론막)로 이동시킨다. 이어서, 고정화된 RNA를 표지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 프로브 또는 DNA 프로브로 프로빙하여 사용된 프로브에 상보적인 RNA 종을 검출한다. 노던 블럿은 분자 생물학자의 표준 도구이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "프로모터", "프로모터 요소" 또는 "프로모터 서열"이라는 용어는 관심 뉴클레오티드 서열에 라이게이션시킨, 관심 뉴클레오티드서열의 mRNA로의 전사를 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, 프로모터는 이에 의해 mRNA로의 전사가 조절되는 관심 뉴클레오티드 서열의 5' (즉, 상류)에 위치하며 (그러나, 반드시 그래야 하는 것은 아님), RNA 중합효소 및 전사 개시를 위한 다른 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다.
프로모터는 구성적 (constitutive) 또는 조절가능한 프로모터일 수 있다. "구성적"이라는 용어가 프로모터와 관련하여 사용되는 경우, 이는 상기 프로모터가 자극 (예를 들면, 열 충격, 화학물질 등)이 없어도 이와 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있음을 의미한다. 반대로, "조절가능한" 프로모터는 자극 (예를 들면, 열 충격, 화학물질 등)의 존재하에 이와 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 자극이 없는 경우와 상이하게 지시할 수 있는 프로모터이다.
발현 벡터상의 "스플라이싱 신호"의 존재는 종종 재조합 전사체를 더 높은 수준으로 발현하게 한다. 스플라이싱 신호는 1차 RNA 전사체로부터의 인트론 제거를 매개하며, 스플라이싱 공여 부위 및 수용 부위로 구성된다 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 16.7-16.8]. 통상적으로 사용되는 스플라이싱 공여 부위 및 수용 부위는 SV40의 16S RNA로부터의 스플라이싱 접합부이다.
진핵 세포 내에서 재조합 DNA 서열의 효율적 발현에는 효율적 전사 종료 신호 및 생성된 전사체의 폴리아데닐화를 지시하는 신호의 발현이 요구된다. 전사 종료 신호는 통상적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견되며, 수백개의 뉴클레오티드 길이이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "polyA 부위" 또는 "polyA 서열"이라는 용어는 전사 종료 및 배출 직후의 RNA 전사체의 폴리아데닐화를 모두 지시하는 DNA 서열을 의미한다. polyA 테일 (tail)이 없는 전사체는 불안정하고 신속하게 분해되기 때문에 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 발현 벡터에서 사용되는 polyA 신호는 "이종" 또는 "내인성"일 수 있다. 내인성 polyA 신호는 게놈 내 주어진 유전자 코딩 영역의 3' 말단에서 천연적으로 발견된다. 이종 polyA 신호는 한 유전자에서 단리하여 다른 유전자의 3'에 위치시킨 것이다. 통상적으로 사용되는 이종 polyA 신호는 SV40 polyA 신호이다. SV40 polyA 신호는 237 bp Bam-HI/Bc/I 제한 단편상에 있으며, 전사 종료 및 폴리아데닐화 모두를 지시한다 [Sambrook, 상기 문헌, at 16.6-16.7].
진핵 발현 벡터는 "바이러스 레플리콘" 또는 "바이러스 복제 기점"을 함유할 수도 있다. 바이러스 레플리콘은 적당한 복제 인자를 발현하는 숙주 세포에서 벡터의 염색체외 복제를 허용하는 바이러스 DNA 서열이다. SV40 또는 폴리오마 바이러스 복제 기점을 함유하는 벡터는 적당한 바이러스 T 항원을 발현하는 세포에서 높은 "카피수" (104개 이하의 카피/세포)로 복제된다. 소 유두종바이러스 또는 엡스테인-바르 바이러스로부터의 레플리콘을 함유하는 벡터는 "낮은 카피수" (약 100개 카피/세포)로 염색체외 복제된다. 그러나, 발현 벡터를 임의의 특정 바이러스 복제 기점에 제한하려는 의도는 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이 "장쇄 말단 반복서열" 또는 "LTR"이라는 용어는 레트로바이러스 게놈의 U3 영역 5' 및 3'에 위치하거나 그로부터 단리한 전사 조절요소를 지칭한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 장쇄 말단 반복서열은 레트로바이러스 벡터에서 조절 요소로서 사용할 수 있고, 또는 레트로바이러스 게놈으로부터 단리하여 다른 유형의 벡터에서의 발현 조절에 사용할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "분비 신호"라는 용어는 재조합 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 경우에 상기 재조합 폴리펩티드를 분비시킬 수 있는 신호 펩티드를 코딩하는 임의의 DNA 서열을 지칭한다. 통상적으로, 상기 신호 펩티드는 약 15 내지 30개의 연속적인 소수성 아미노산 잔기를 포함한다 (예를 들어 문헌 [Zwizinski et al., J. Biol. Chem. 255 (16):7973-77 (1980), Gray et al., Gene 39 (2):247-54 (1985)] 및 [Martial et al., Science 205:602-607 (1979)] 참조). 이러한 분비 신호 서열은 조직-특이적 발현을 위해 표적화된 세포 유형으로부터 분비되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 유래한 것이 바람직하다 (예를 들면, 유방의 분비 세포에서 발현되어 분비된 우유 단백질). 그러나, 분비형 DNA 서열은 이러한 서열로 제한되지 않는다. 많은 세포 유형 및 유기체로부터 분비되는 단백질로부터의 분비형 DNA 서열도 사용할 수 있다 (예를 들면, t-PA, 혈청 알부민, 락토페린 및 성장 호르몬을 위한 분비 신호 및 효모, 섬유상 진균 및 박테리아 등으로부터 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 세균 유전자로부터의 분비 신호).
본원에서 사용된 바와 같이 "RNA 배출 요소" 또는 "프리 (pre)-mRNA 프로세싱 인핸서 (PPE)"라는 용어는 핵으로부터의 RNA 배출을 증대시키는 3' 및 5' 시스-작용 (cis-acting) 전사후 조절 요소를 지칭한다. "PPE"요소로는 Mertz 서열 (미국 특허 제5,914,267호 및 동 제5,686,120호에 기재되어 있음, 상기 문헌 모두가본원에 참고로 도입됨) 및 마못 (woodchcuk) mRNA 프로세싱 인핸서 (WPRE; W099/14310 및 미국 특허 제6,136,597호, 상기 문헌 각각은 본원에 참고로 도입됨) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "폴리시스트론"이라는 용어는 여러가지 폴리펩티드쇄를 코딩하는 mRNA를 지칭한다 (예를 들어 WO 93/03143, WO88/05486 및 유럽 특허 제117058호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨). 마찬가지로, "폴리시스트론 서열로 배열된"이라는 용어는 1개의 mRNA에 2가지 상이한 폴리펩티드쇄를 코딩하는 유전자가 배열되어 있음을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "내부 리보솜 결합 부위" 또는 "IRES"라는 용어는 폴리시스트론 유전자 사이에 위치하여 디시스트론 mRNA 번역의 내부 개시에 의해 제2 유전자로부터 발현 생성물의 생산이 시작되는 것을 허용하는 서열을 지칭한다. 내부 리보솜 결합 부위의 예로는 구제역 바이러스 (FDV), 뇌심근염 바이러스, 소아마비바이러스 및 RDV로부터 유래된 것 등이 있으나 이에 제한되지 않는다 ([Scheper et al., Biochem. 76:801-809 (1994)], [Meyer et al., J. Virol. 69:2819-2824 (1995)], [Jang et al., 1988, J. Virol. 62:2636-2643 (1998)], [Haller et al., J. Virol. 66:5075-5086 (1995)]). IRES들이 혼입된 벡터는 당업계에 공지된 바와 같이 조립될 수 있다. 예를 들면, 폴리시스트론 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터에는 다음의 요소들이 작동가능하게 결합되어 있을 수 있다: 뉴클레오티드 폴리링커, 관심 유전자, 내부 리보솜 결합 부위 및 포유동물 선택가능한 마커 또는 다른 관심 유전자. 폴리시스트론 카세트는 레트로바이러스 벡터 내에서 5' LTR 및 3' LTR 사이에서 5' LTR 프로모터로부터 폴리시스트론 메세지 카세트가 전사되도록 하는 곳에 위치시킨다. 또한, 폴리시스트론 메세지 카세트의 전사는 용도에 따라 바람직할 수 있는 내부 프로모터 (예를 들면, 사이토메갈로바이러스 프로모터) 또는 유도가능한 프로모터에 의해 구동될 수도 있다. 폴리시스트론 메세지 카세트는 폴리링커 내에서 작동되게 결합된 cDNA 또는 게놈 DNA (gDNA) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 포유동물 선택가능한 마커를 폴리시스트론 메세지 카세트 포유동물 선택가능한 마커로서 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 선택가능한 마커는 당업자에게 공지되어 있으며 카나마이신/G418, 하이그로마이신 B 또는 마이코페놀산 내성 마커 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "레트로바이러스"라는 용어는 세포를 진입시킬 수 있고 (즉, 입자는 숙주 세포의 표면에 결합할 수 있고, 숙주 세포의 세포질로의 바이러스 입자 진입을 용이하게 할 수 있는 외피 단백질 또는 바이러스 G 당단백질 등의 막-결합 단백질을 함유함), 레트로바이러스 게놈을 숙주 세포의 게놈 내로 통합 (이중 가닥 프로바이러스 (provirus)로서 통합시킴)시킬 수 있는 레트로바이러스 입자를 지칭한다. "레트로바이러스"라는 용어는 온코바이러스아과 (예를 들면, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMOLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스 (MoMSV) 및 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 스푸마바이러스아과 및 렌티바이러스아과 (예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 말 감염 빈혈 바이러스 및 카프린 관절염-뇌염 바이러스 (Caprine arthritis-encephalitis virus); 예를들어, 미국 특허 제5,994,136호 및 동 제6,013,516호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "레트로바이러스 벡터"라는 용어는 관심 유전자를 발현하도록 변형된 레트로바이러스를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터를 사용하여 바이러스 감염 과정을 활용함으로써 유전자를 숙주 세포에 효율적으로 전달할 수 있다. 레트로바이러스 게놈으로 클로닝된 (즉, 분자생물학 기술을 사용하여 삽입된) 외래 또는 이종 유전자는 레트로바이러스에 의한 감염에 감수성이 있는 숙주 세포에 효율적으로 전달될 수 있다. 공지된 유전자 조작을 통해, 레트로바이러스 게놈의 복제 능력을 파괴할 수 있다. 생성된 복제-결함 벡터를 사용하여 새로운 유전 물질을 세포에 도입할 수 있으나 이들은 복제될 수는 없다. 헬퍼 바이러스 또는 패키징 세포주를 사용하여 벡터 입자 조립 및 세포로부터의 방출이 가능해 질 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 1종 이상의 관심 유전자를 코딩하는 핵산 서열 (즉, 폴리시스트론 핵산 서열은 여러가지 관심 유전자를 코딩할 수 있음), 5'레트로바이러스 장쇄 말단 반복서열 (5' LTR) 및 3' 레트로바이러스 장쇄 말단 반복서열 (3' LTR)을 함유하는 복제-결함 레트로바이러스 게놈을 포함한다.
"슈도형 레트로바이러스 벡터"라는 용어는 이종 막 단백질을 함유하는 레트로바이러스 벡터를 지칭한다. "막-결합 단백질"이라는 용어는 바이러스 입자를 둘러싼 막과 결합된 단백질 (예를 들면, VSV, 피리, 샨디푸라 및 모콜라와 같은 랍도바이러스과의 바이러스 외피 당단백질 또는 바이러스의 G-단백질)을 지칭하며, 이들 막-결합 단백질은 바이러스 입자의 숙주 세포 진입을 매개한다. 레트로바이러스 외피 단백질 또는 막-결합 단백질이 숙주 세포의 원형질막의 인지질 성분과 상호작용할 수 있는 경우 또는 G-단백질이 랍도바이러스과의 구성원으로부터 유래된 경우에서와 같이, 막-결합 단백질은 세포 표면 단백질 수용체와 결합할 수 있다.
"이종 막-결합 단백질"이라는 용어는 상기 벡터 입자의 뉴클레오캡시드 단백질이 동일한 바이러스 클래스 또는 과의 구성원이 아닌 바이러스에서 유래한 것인 막-결합 단백질을 지칭한다. "바이러스 클래스 또는 과"는 국제 바이러스 분류 위원회 (International Committee on Taxonomy of Viruses)에 의해 결정된 클래스 또는 과의 분류학상 순위를 지칭한다.
"랍도바이러스과"라는 용어는 인간을 비롯한 동물 및 식물을 감염시키며 외피가 있는 RNA 바이러스과를 지칭한다. 랍도바이러스과는 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 코칼 바이러스, 피리 바이러스, 칸디푸라 바이러스 및 카르프 바이러스의 스프링 바이러스혈증 (카르프 바이러스의 스프링 바이러스혈증을 코딩하는 서열은 진뱅크 (GenBank) 수탁 번호 U18101로 이용가능함) 등을 비롯한 수포성바이러스 (Vesiculovirus) 속을 포함한다. 수포성바이러스 속의 바이러스들의 G-단백질은 외부로 돌출된 동종삼량체 스파이크 (spike) 당단백질 복합체를 형성하는, 바이러스에 의해 코딩되는 인테그랄 막 단백질로서 수용체 결합 및 막 융합에 필요하다. 수포성바이러스 속의 바이러스들의 G-단백질은 팔미트산 (C16) 잔기에 공유결합을 통해 결합되어 있다. 수포성바이러스의 G-단백질들의 아미노산 서열은 꽤 잘 보존되어 있다. 예를 들면, 피리 바이러스 G-단백질은 VSV G-단백질 (인디애나, 뉴저지, 오르세이, 산 주안 등을 비롯한 여러 균주의 VSV가 공지되어 있으며, 이들의 G-단백질들은 상동성이 높음)과 약 38％ 동일성 및 약 55％ 유사성을 공유한다. 칸디푸라 바이러스 G-단백질 및 VSV G-단백질은 약 37％ 동일성 및 52％ 유사성을 공유한다. 수포성바이러스 G-단백질들의 높은 보존성 (아미노산 서열) 및 관련된 기능적 특징 (예를 들면, 바이러스와 숙주 세포의 결합 및 합포체 형성 등을 포함하는 막의 융합)이 주어진 경우, 슈도형 바이러스 입자를 위해 VSV G-단백질 대신 비-VSV 수포성바이러스의 G-단백질을 사용할 수 있다. 리사 바이러스 (랍도바이러스과의 다른 속)의 G-단백질 역시 VSV G-단백질과의 보존도가 상당하며 유사한 방식으로 기능 (예를 들면, 막 융합의 매개)하므로, 슈도형 바이러스 입자를 위해 VSV G-단백질 대신 사용될 수 있다. 리사 바이러스로는 모콜라 바이러스 및 광견병 바이러스 (여러 균주의 광견병 바이러스가 공지되어 있으며 이들의 G-단백질이 클로닝 및 서열결정되어 있음) 등이 있다. 모콜라 바이러스 G-단백질은 VSV G-단백질과 스트레치 상동성 (특히 세포외 도메인 및 막횡단 도메인에 걸쳐 존재함)을 공유하며, VSV G-단백질과 약 31％ 동일성 및 48％ 유사성을 나타낸다. 바람직한 G-단백질은 VSV G-단백질과 25％ 이상의 동일성, 바람직하게는 30％ 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 35％ 이상의 동일성을 공유한다. 뉴저지 균주로부터의 VSV G-단백질 (상기 G-단백질의 서열은 진뱅크 수탁 번호 M27165 및 M21557로 제공됨)이 기준 VSV G-단백질로서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "렌티바이러스 벡터"라는 용어는 비분열 세포로 통합될 수 있는 렌티바이러스과 (예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스 및 카프린 관절염-뇌염 바이러스)로부터 유래한 레트로바이러스 벡터를 지칭한다 (예를 들어 미국 특허 제5,994,136호 및 동 제6,013,516호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨).
"슈도형 렌티바이러스 벡터"라는 용어는 이종 막 단백질 (예를 들면, VSV, 피리, 샨디푸라 및 모콜라와 같은 랍도바이러스과의 바이러스 외피 당단백질 또는 바이러스의 G-단백질)을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "트란스포손"이라는 용어는 게놈 내 한 위치에서 다른 위치로 이동하거나 전위할 수 있는 전위가능한 요소 (예를 들면, Tn5, Tn7 및 Tn1O)를 지칭한다. 통상적으로, 전위는 트란스포사제에 의해 조절된다. 본원에서 사용된 바와 같이 "트란스포손 벡터"라는 용어는 트란스포손의 말단부에 의해 플랭킹 (flanking)되어 있는 관심 핵산을 코딩하는 벡터를 지칭한다. 트란스포손 벡터의 예는 미국 특허 제6,027,722호, 동 제5,958,775호, 동 제5,968,785호 동 제5,965,443호 및 동 제5,719,055호 (상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터"라는 용어는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 등을 비롯하여 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. AAV 벡터는 온전하거나 부분적인, 바람직하게는rep및(또는)cap유전자에서 1개 이상의 AAV 야생형 유전자가 결실되어 있을 수 있으나 기능적 플랭킹 ITR 서열은 보유한다.
당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 AAV 벡터가 양 말단 (5' 및 3')에기능적 AAV ITR이 플랭킹되어 있는 1개 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 제조할 수 있다. 본 발명의 실행시에, AAV 벡터는 1개 이상의 AAV ITR 및 이종 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치한 적합한 프로모터 서열 및 이종 서열의 하류에 위치한 1개 이상의 AAV ITR을 포함할 수 있다. "재조합 AAV 벡터 플라스미드"는 플라스미드를 포함하는 재조합 AAV 벡터의 한 유형을 지칭한다. 통상적으로, AAV 벡터의 경우에는 선택된 이종 뉴클레오티드 서열에 5' 및 3' ITR이 플랭킹되어 있다.
또한, AAV 벡터는 폴리아데닐화 부위와 같은 전사 서열 뿐 아니라 선택가능한 마커 또는 리포터 유전자, 인핸서 서열 및 전사를 유도할 수 있는 기타의 조절 요소까지도 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 상기에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "AAV 비리온"이라는 용어는 완전한 바이러스 입자를 지칭한다. AAV 비리온는 야생형 AAV 바이러스 입자 (AAV 캡시드, 즉, 단백질 코트와 결합된 단일 가닥의 선형 AAV 핵산 게놈을 포함함)이거나 또는 재조합 AAV 바이러스 입자 (하기 기재함)일 수 있다. 이와 관련하여, 단일 가닥 AAV 핵산 분자 (통상적으로 정의되는 바와 같은 센스/코딩 가닥 또는 안티센스/안티코딩 가닥)는 AAV 비리온으로 패키지될 수 있으며, 센스 및 안티센스 가닥 둘다 동등하게 감염성이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "재조합 AAV 비리온" 또는 "rAAV"라는 용어는 5' 및 3'가 AAV ITR에 의해 플랭킹되어 있는 이종 뉴클레오티드 서열을 캡시드화 (즉, 단백질 코트로 둘러쌈)한 AAV 단백질 쉘로 구성된 복제-결함 감염성 바이러스로 정의된다. 재조합 AAV 비리온을 제조하기 위한 수많은 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,173,414호, WO92/01070, WO93/03769, [Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)], [Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)], [Carter, Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 (1992)], [Muzyczka, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992)], [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)], [Shelling and Smith, Gene Therapy 1:165-169 (1994)] 및 [Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867-1875 (1994)] 참조, 상기 모든 문헌이 본원에 참고로 도입됨).
AAV 벡터 (및 실제로는 본원에 기재한 임의의 벡터)에 사용하기 적합한 뉴클레오티드 서열은 임의의 기능적으로 관련된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터는 표적 세포 게놈에서 결핍되거나 없어진 단백질을 코딩하거나 원하는 생물학적 또는 치료 효과 (예를 들면, 항-바이러스 기능)를 갖는 비천연 단백질을 코딩하는 임의의 원하는 유전자를 포함하거나, 안티센스 또는 리보자임 기능을 갖는 분자에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 유전자는 AIDS, 암, 신경계 질환, 심혈관계 질환, 콜레스테롤과잉혈증; 다양한 혈액 장애, 예를 들어 다양한 빈혈, 지중해빈혈 및 혈우병 등; 유전적 결함, 예를 들어 낭성 섬유증, 고세병, 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍증, 기종(氣腫) 등과 같은 장애를 포함하는 염증성 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환의 치료에 사용되는 것을 포함한다. 암 및 바이러스 질환에 대한 안티센스 요법에 유용한 수많은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, mRNA의 번역 개시 부위 (AUG 코돈) 주변의 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드)가 당업계에 기재되어 있다 (예를 들어 문헌 [Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317 (1991)], [Uhlmann et al., Chem. Rev. 90:543-584 (1990)], [Helene et al., Biochim. Biophys. Acta. 1049:99-125 (1990)], [Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083 (1989)] 및 [Heikkila et al., Nature 328:445-449 (1987)] 참조). 적합한 리보자임에 관한 논의를 위해서는, 예를 들어 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Cech et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17479-17482] 및 미국 특허 제5,225,347호를 참조한다.
"아데노-관련 바이러스 도립된 말단 반복서열" 또는 "AAV ITR"이란, AAV 게놈 각 말단에서 발견되는 당업계에서 인지되는 회문구조 영역을 의미하며, 이들은 바이러스를 위한 DNA 복제 기점 및 패키징 신호로서 함께 시스로 (in cis) 기능한다. 본 발명에 사용하기 위해서는, 플랭킹 AAV ITR을 1개 이상의 선택된 이종 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3'에 위치시켜,rep코딩 영역 또는 Rep 발현 생성물과 함께 선택된 서열이 표적 세포의 게놈 내로 통합될 수 있도록 한다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 AAV-2 서열의 경우에 대해 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)], [Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Snipe, eds.] 참조). 본원에서 사용된 바와 같이 "AAV ITR"은 도시된 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없으나, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환 등에 의해 변경될 수 있다. 추가로, AAV ITR은 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 선택된 이종 뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 5' 및 3' ITR은 이들이 의도된 바와 같이 기능하는 한, 즉,rep유전자가 존재 (동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재함)하거나 Rep 발현 생성물이 표적 세포에 존재할 때 결합된 이종 서열이 표적 세포 게놈으로 통합되도록 하는 한은 반드시 동일한 AAV 혈청형로부터 유래한 것이거나 단리한 것일 필요는 없다.
본원에서 사용된 바와 같이 "시험관내"라는 용어는 인공적인 환경 및 인공적인 환경에서 일어나는 과정 또는 반응을 지칭한다. 시험관내 환경은 시험관 및 세포 배양물로 구성될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. "생체내"라는 용어는 천연 환경 (예를 들면, 동물 또는 세포) 및 천연 환경에서 일어나는 과정 또는 반응을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "단일 클론에서 유래한"이라는 용어는 1개의 세포에서 유래한 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "단일 클론에서 유래한 것이 아닌"이라는 용어는 1개 초과의 세포에서 유래한 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "계대 배양"이라는 용어는 특정 밀도 또는 조밀성 (예를 들면, 70％ 또는 80％ 조밀성)까지 성장시킨 세포 배양물을 희석한 후에 세포를 희석하여 원하는 특정 밀도 또는 조밀성으로 다시 성장시키는 과정 (예를 들면, 다시 플레이팅하거나 새로운 롤러병에서의 세포 배양을 수립함)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "안정한"이라는 용어가 게놈과 관련하여 사용된 경우, 이는 한 세대에서 다음 세대로 또는 특정 세포주의 경우에는 한 계대에서 다음 계대로 게놈의 정보 내용을 안정하게 유지한다는 것을 지칭한다. 따라서, 게놈 내에서 큰 변화 (예를 들면, 유전자가 결실되거나 염색체 전위가 일어남)가 일어나지 않는다면, 그 게놈은 안정하다고 간주된다. "안정한"이라는 용어는 점 돌연변이 등과 같이 게놈에 발생할 수 있는 미세한 변화를 제외하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "반응"이라는 용어가 분석법과 관련하여 사용된 경우, 이는 검출가능한 신호의 생성 (예를 들면, 리포터 단백질의 축적, 이온 농도 증가, 검출가능한 화학적 생성물의 축적 등)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "막 수용체 단백질"이라는 용어는 리간드 (예를 들면, 호르몬 또는 신경전달물질)와 결합하는 막 스패닝 (spanning) 단백질을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 단백질 인산화는 세포가 세포 외부로부터 핵으로의 조절 신호를 보유하는 단백질을 선택적으로 변형시키기 위해 사용하는 통상적인 조절 메카니즘이다. 이러한 생화학적 변형을 수행하는 단백질은 단백질 키나제로 공지된 효소군이다. 이들은 인산화를 위해 표적으로 하는 기질 잔기에 따라 추가로 정의될 수 있다. 단백질 키나제의 한 군은 표적 단백질을 티로신 잔기에서 선택적으로 인산화하는 티로신 키나제 (TK)이다. 몇몇 티로신 키나제는 막-결합 수용체 (RTK)이고, 리간드에 의해 활성화된 후에는 자가인산화될 수 있을 뿐 아니라 기질을 변형시킬 수도 있다. 리간드 자극에 의한 순차적 인산화의 개시는 이펙터 (effector), 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 등의 작용을 기초로 하는 패러다임이다. 이들 리간드에 대한 수용체는 티로신 키나제이며, 리간드 (호르몬, 성장 인자)와표적 세포의 결합 및 1개 이상의 생화학적 경로의 활성화를 통한 세포로의 신호 전달 사이의 접속부를 제공한다. 수용체 티로신 키나제로의 리간드 결합은 이의 내재적 효소 활성을 활성화시킨다 (예를 들어 문헌 [Ullrich and Schlessinger, Cell 61:203-212 (1990)] 참조). 또한, 티로신 키나제는 세포질의 비-수용체형 효소일 수도 있고, 신호 도입 경로의 하류 성분으로서 작용할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "신호 도입 단백질"이라는 용어는 리간드와 막 수용체 단백질의 결합 또는 또는 몇몇 다른 자극에 의해 활성화되거나 달리 효과를 받는 단백질을 지칭한다. 신호 도입 단백질의 예로는 아데닐 사이클라제, 포스포리파제 C 및 G-단백질 등이 있다. 많은 막 수용체 단백질들이 G-단백질에 커플링되어 있다 (즉, G-단백질-커플링된 수용체 (GPCR); 살펴보기 위해서는, 문헌 [Neer, 1995, Cell 80:249-257 (1995)] 참조). 전형적으로, GPCR은 7개의 막횡단 도메인을 함유한다. 추정되는 GPCR은 공지된 GPCR과의 서열 상동성에 기초하여 확인할 수 있다.
GPCR은 리간드가 GPCR의 세포외 부분에 결합한 후에 세포 막을 통한 신호 도입을 매개한다. GPCR의 세포내 부분은 G-단백질과 상호작용하여 세포 외부에서 세포 내부로의 신호 도입을 조정한다. 따라서, GPCR은 G-단백질과 "커플링"되어 있다고 일컬어진다. G-단백질은 GTP와 결합하고 이를 가수분해하는 α 서브유닛 및 이량체 βγ서브유닛의 3개의 폴리펩티드 서브유닛으로 구성된다. 기본적으로, 불활성 상태의 G-단백질은 α 서브유닛 및 βγ서브유닛의 이종삼량체로 존재한다. G-단백질이 불활성인 경우, G-단백질의 α 서브유닛에는 구아노신 디포스페이트(GDP)가 결합된다. GPCR에 리간드가 결합되거나 GPCR이 리간드에 의해 활성화되는 경우, GPCR은 G-단백질 이종삼량체와 결합하여 GDP에 대한 Gα서브유닛의 친화성을 감소시킨다. 활성 상태에서, G 서브유닛은 GDP를 구아닌 트리포스페이트 (GTP)로 교체하고, 활성 Gα서브유닛은 수용체 및 이량체 βγ서브유닛 모두로부터 해리된다. 해리된 활성 Gα서브유닛은 세포 내 G-단백질 신호전달 경로의 "하류"에 있는 이펙터에 신호를 도입한다. 사실, 활성 G 서브유닛은 G-단백질의 내인성 GTPase 활성에 의해 불활성 상태로 복귀되어 GDP 및 이량체 βγ서브유닛과 결합한다.
다양한 Gα 서브유닛을 코딩하는 20종 초과의 유전자 등을 비롯하여 이종삼량체 G-단백질 족의 수많은 구성원들이 클로닝되어 있다. 다양한 G 서브유닛들은 아미노산 서열 및 기능적 상동성에 기초하여 4가지 족으로 분류된다. 이들 4가지 족은 기능에 따라 Gαs, Gαi, Gαq, Gα12로 일컬어진다. 기능적으로, 이들 4가지 족은 이들이 활성화시키는 세포내 신호전달 경로 이들과 커플링된 GPCR이 상이하다.
예를 들면, 특정 GPCR은 통상적으로 Gαs와 커플링되고 이들 GPCR은 상기 Gαs를 통해 아데닐릴 사이클라제 활성을 자극시킨다. 다른 GPCR은 통상적으로 GGαq와 커플링되고 이들 GPCR은 상기 GGαq를 통해 포스포리파제 C의 β이소형 (isoform) (즉, PLCβ [Stermweis and Smrcka, Trends in Biochem. Sci. 17:502-506 (1992)]) 등과 같은 포스포리파제 C (PLC)를 활성화시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "핵산 결합 단백질"이라는 용어는 핵산에 결합하는 단백질, 특히, 유전자로부터의 전사를 증가 (즉, 활성자 또는 전사 인자) 또는 감소 (즉, 억제자)시키는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "이온 채널 단백질"이라는 용어는 세포 막을 통해 이온이 들어오고 나가는 것을 조절하는 단백질을 지칭한다. 이온 채널 단백질의 예로는 Na+-K+ATPase 펌프, Ca2+펌프 및 K+누출 채널 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "단백질 키나제"라는 용어는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 포스페이트기의 단백질 내 아미노산 측쇄로의 이동을 촉매하는 단백질을 지칭한다. 키나제는 가장 커다란 공지된 효소 거대족이며 이들의 표적 단백질은 광범위하게 다양하다. 키나제는 티로신 잔기를 인산화하는 단백질 티로신 키나제 (PTK)와 세린 및(또는) 트레오닌 잔기를 인산화하는 단백질 세린/트레오닌 키나제 (STK)로 분류될 수 있다. 몇몇 키나제는 세린/트레오닌 및 티로신 잔기 모두에 대한 이중 특이성을 갖는다. 거의 모든 키나제는 보존된 250 내지 300개의 아미노산으로 구성된 촉매 도메인을 함유한다. 이 도메인은 11개의 서브도메인으로 더 분할될 수 있다. N-말단 서브도메인 I 내지 IV는 ATP 공여 분자와 결합하여 방향을 잡는 2-엽 (lobe) 구조로 폴딩되고, 서브도메인 V는 상기 2개의 엽을 스패닝한다. C-말단 서브도메인 VI 내지 XI은 단백질 기질과 결합하고 ATP의 감마-포스페이트를 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기의 히드록실기에 전달한다. 11개 서브도메인 각각은 저마다 특징적인 특이적 촉매 잔기 또는 아미노산 모티프를 함유한다. 예를 들면, 서브도메인 I은 8-아미노산 글리신-풍부 ATP 결합 컨센서스 모티프를 함유하고, 서브도메인 II는 최대 촉매 활성에 필요한 핵심적인 라이신 잔기를 함유하며, 서브도메인 VI 내지 IX는 고도로 보존된 촉매 코어를 포함한다. 또한, STK 및 PTK는 서브도메인 VI 및 VIII에 히드록시아미노산 특이성을 부여할 수 있는 독특한 서열 모티프를 함유한다. 몇몇 STK 및 PTK는 두 족 모두의 구조적 특징을 보유한다. 또한, 키나제는 키나제 도메인에 플랭킹되어 있거나 키나제 도메인 내부에 존재하는 추가의 아미노산 서열, 통상적으로 5 내지 100개 잔기에 의해 분류될 수도 있다.
막횡단형이 아닌 PTK는 원형질막 수용체의 세포질 도메인과 신호전달 복합체를 형성한다. 막횡단형이 아닌 PTK를 거쳐 신호를 전달하는 수용체로는 사이토킨, 호르몬에 대한 수용체 및 항원-특이적 림프구 수용체 등이 있다. 많은 PTK가 처음에는 PTK 활성화가 더이상 정상적인 세포내 조절을 받지 않게 된 암세포에서 종양유전자 생성물로서 확인되었다. 사실, 공지된 종양유전자의 약 1/3이 PTK를 코딩한다. 추가로, 세포의 형질전환 (종양발생)은 종종 티로신 인산화 활성 증가를 수반한다 (예를 들어 문헌 [Carbonneau, H. and Tonks, Annu. Rev. Cell Biol. 8:463-93 (1992)] 참조). 따라서, PTK 활성 조절은 몇가지 유형의 암을 조절하는 중요한 전략일 수 있다.
단백질 키나제의 예로는 cAMP-의존성 단백질 키나제, 단백질 키나제 C 및 사이클린-의존성 단백질 키나제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어 미국 특허 제6,034,228호, 동 제6,030,822호, 동 제6,030,788호, 동 제6,020,306호, 동제6,013,455호, 동 제6,013,464호 및 동 제6,015,807호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨).
본원에서 사용된 바와 같이 "단백질 포스파타제"라는 용어는 단백질의 포스페이트기를 제거하는 단백질을 지칭한다. 단백질 포스파타제는 통상적으로 수용체형 단백질 및 비-수용체형 단백질의 2개 군으로 분류된다. 대부분의 수용체형 단백질 티로신 포스파타제는 2개의 보존된 촉매 도메인을 함유하며, 이들 도메인 각각은 240개 아미노산 잔기로 구성된 절편을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Saito et al., Cell Growth and Diff. 2:59-65 (1991)] 참조). 수용체 단백질 티로신 포스파타제는 이의 세포외 도메인의 아미노산 서열 다양성을 기초로 더욱 세분될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Krueger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7417-7421 (1992)] 참조). 단백질 포스파타제의 예로는 cdc25 a, b 및 c, PTP20, PTP1D 및 PTPλ등이 있으나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어 미국 특허 제5,976,853호, 동 제5,994,074호, 동 제6,004,791호, 동 제5,981,251호, 동 제5,976,852호, 동 제5,958,719호, 동 제5,955,592호 및 동 제5,952,212호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨).
본원에서 사용된 바와 같이 "종양유전자에 의해 코딩되는 단백질"이라는 용어는 직접 또는 간접적으로 숙주 세포의 종양성 형질전환을 초래하는 단백질을 지칭한다. 종양유전자의 예로는src, fps, fes, fgr, ros, H-ras, abl, ski, erbA, erbB, fms, fos, mos, sis, myc, myb, rel, kit, raf, K-ras및ets등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "이뮤노글로불린"이라는 용어는 특이적 항원에 결합하는 단백질을 지칭한다. 이뮤노글로불린으로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 및 하기 클래스의 이뮤노글로불린 등이 있으나 이에 제한되지 않는다: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE 및 분비된 이뮤노글로불린 (sIg). 이뮤노글로불린은 통상적으로 2개의 동일한 중쇄 (γ, α, μ, δ 또는 ε) 및 2개의 경쇄 (κ 또는 λ)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "항원 결합 단백질"이라는 용어는 특이적 항원에 결합하는 단백질을 지칭한다. "항원 결합 단백질"로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 및 Fab 발현 라이브러리 및 단쇄 항체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 폴리클로날 항체를 제조한다. 항체 제조를 위해서, 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물에 원하는 에피토프에 상응하는 펩티드를 주사하여 이를 면역화할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 펩티드를 면역원성 담체 (예를 들면, 디프테리아 톡소이드, 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))와 접합시킨다. 숙주 종에 따라 프로인트 (Freund's) (완전 및 불완전 프로인트), 미네랄 겔, 예를 들어 수산화 알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트, 예를 들어 BCG (칼메트 게랑 간균) 및 코리네박테리움 파르붐 등의 다양한 아쥬반트를 사용하여 면역 반응을 증가시킨다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 배양된 연속 세포주에 의한 항체 분자 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 이들 기술로는 쾰러 (Koehler) 및 밀스타인 (Milstein)이 최초로 개발한 하이브리도마 기술 [Koehler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)] 뿐 아니라 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Kozbor et al. Immunol. Today 4:72 (1983)] 및 인간 모노클로날 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)] 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
원한다면, 본 발명에 따라서 단쇄 항체 생산을 위해 기재된 기술 (본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,946,778호)을 변형하여 특이적 단쇄 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시양태에서는 Fab 발현 라이브러리를 제조하기 위한 당업계에 공지된 기술 [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]을 사용하여, 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 수월하게 확인할 수 있다.
항체 분자의 이디오타입 (항원 결합 영역)을 함유하는 항체 단편은 공지된 기술을 통해 생성될 수 있다. 이러한 단편의 예로는 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편, F(ab')2 단편의 이황 결합을 환원시켜 생성될 수 있는 Fab' 단편 및 항체 분자에 펩신 및 환원제를 처리하여 생성될 수있는 Fab 단편 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
항원 결합 단백질을 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 방법으로 단리할 수 있다. 항체 생산시에, 당업계에 공지된 기술 (예를 들면, 방사선면역분석법, ELISA (효소-결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사 분석법, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석법, 계내 (in situ) 면역분석법 (예를 들어 콜로이드성 금, 효소 또는 방사선 동위원소 표지 사용), 웨스턴 블럿, 침전 반응, 응집 분석법 (예를 들면, 겔 응집 분석법, 혈구 응집소 분석법 등), 보체 고정 분석법, 면역형광 분석법, 단백질 A 분석법 및 면역전기영동 분석법 등)을 통해 원하는 항체에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "리포터 유전자"라는 용어는 분석될 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제 (예를 들어 문헌 [deWet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987)] 및 미국 특허 제6,074,859호, 동 제5,976,796호, 동 제5,674,713호 및 동 제5,618,682호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨), 녹색 형광 단백질 (예를 들면, 진뱅크 수탁 번호 U43284; 수많은 GFP 변이체가 미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래버러토리스 (CLONTECH Laboratories)에 의해 시판됨), 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이 퍼옥시다제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "정제된"이라는 용어는 이들의 천연 환경에서 취해져서 단리되거나 분리된 핵산 또는 아미노산 서열의 분자를 지칭한다. 따라서, "단리된 핵산 서열"은 정제된 핵산 서열이다. "실질적으로 정제된" 분자는 이들과천연적으로 회합되어 있던 다른 성분들이 60％ 이상, 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상 유리된 것이다.
"시험 화합물"이라는 용어는 질환, 질병, 병 또는 신체 기능의 장애의 치료 및(또는) 예방에 유용하다고 고려되거나 또는 샘플의 생리적 상태 또는 세포 상태를 달리 변경한다고 고려되는 임의의 화학물질, 의약품, 약물 등을 지칭한다. 시험 화합물은 공지된 치료 화합물 및 잠재적 치료 화합물 모두를 포함한다. 시험 화합물이 치료적인지 여부는 본 발명의 스크리닝 방법을 사용한 스크리닝을 통해 결정할 수 있다. "공지된 치료 화합물"은 이러한 치료 또는 예방에 효과적인 것으로 밝혀진 바 있는 (예를 들면, 동물 시험 또는 인간에 대한 선행 투여 경험을 통해) 치료 화합물을 지칭한다.
본 발명은 숙주 세포에서의 단백질 생산에 관한 것이며, 더욱 특히 통합 벡터의 통합된 카피를 다수 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 통합 벡터 (즉, 인테그라제 또는 트란스포사제를 통해 통합되는 벡터)를 사용하여 관심 유전자를 코딩하는 핵산을 많은 카피수로 함유하는 세포주를 제조한다. 형질감염된 게놈을 많은 카피수로 함유하는 세포는 계대가 반복되는 동안 (예를 들면, 10 계대 이상, 바람직하게는 50 계대 이상, 가장 바람직하게는 100 계대 이상) 안정하다. 추가로, 본 발명의 숙주 세포는 단백질을 높은 수준 (예를 들면, 1 pg/세포/일 초과, 바람직하게는 10 pg/세포/일 초과, 더욱 바람직하게는 50 pg/세포/일 초과, 가장 바람직하게는 100 pg/세포/일 초과)으로 생산할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포의 게놈 안정성 및 높은 발현 수준은 세포 배양에 관한 기존의 방법에 비해 명백한 잇점을 제공한다. 예를 들면, 유전자의 카피를 다수 함유하는 포유동물 세포주는 내재적으로 불안정하다고 당업계에 공지되어 있다. 실제로, 이러한 불안정성은 포유동물 세포주를 고처리량 스크리닝 분석 등을 비롯한 다양한 목적에 사용하고자 하는 연구가들이 직면하는 문제점이다 (예를 들어 문헌 [Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1 (3):384-91 (1997)] 참조).
본 발명을 특정 작용 메카니즘에 제한하려는 의도는 없다. 실제로, 본 발명을 발명하고 사용하는데 있어서 메카니즘에 대한 이해는 필요없다. 그러나, 본 발명의 숙주 세포의 높은 게놈 안정성 및 높은 단백질 발현 수준은 통합 벡터 (예를 들면, 레트로바이러스 벡터)의 독특한 특성에 기인하는 것이라 여겨진다. 예를 들면, 많은 유기체의 배선에서 레트로바이러스는 유전되는 요소임이 공지되어 있다. 실제로, 포유동물 게놈의 무려 5 내지 10％가 역전사를 통해 구성된 요소들로 구성될 수 있으며, 이는 높은 수준의 안정성을 지시하는 것이다. 마찬가지로, 이러한 유형의 많은 벡터들이 게놈 내 활성 (예를 들면, DNase I 과민성 부위) 전사 부위를 표적으로 한다.
많은 연구들이 레트로바이러스 및 트란스포손 통합의 결실 효과에 집중되어 왔다. 게놈의 활성 영역을 표적화하는 특성으로 인해 프로모터 트랩 계획안 (promoter trap scheme) 및 포화 돌연변이유발시에 레트로바이러스 벡터 및 트란스포손 벡터를 사용했다 (예를 들어 미국 특허 제5,627,058호 및 동 제5,922,601호 참조, 이들 모두가 본원에 참고로 도입됨). 프로모터 트랩 계획안에서는 세포를프로모터없는 리포터 벡터로 감염시킨다. 프로모터없는 벡터가 프로모터의 하류 (즉, 유전자)에 통합되는 경우, 상기 벡터에 의해 코딩되는 리포터 유전자가 활성화된다. 이어서, 프로모터를 클로닝하고 추가의 특징을 규명할 수 있다.
알 수 있는 바와 같이, 이들 계획안은 내인성 유전자의 파괴에 의존한다. 따라서, 통합 벡터를 통상적으로 유전자 파괴를 유발할 것이라 여겨지던 높은 감염 다중도로 사용하는 본 발명의 방법을 통해 관심 단백질을 대량으로 발현하는 안정한 세포주가 개발되었다는 것은 놀라운 일이다. 이들 세포주의 개발을 하기에 더욱 완전하게 기재한다. 이를 다음과 같이 나누어 기재하였다: I) 숙주 세포, II) 벡터 및 형질감염 방법 및 III) 형질감염된 숙주 세포의 용도.
I. 숙주 세포
본 발명은 통합 벡터를 사용한 다양한 숙주 세포의 형질감염을 고려한다. 수많은 포유동물 숙주 세포주가 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이들 숙주 세포는 하기에 더욱 상세하게 기재한 바와 같이 적당한 영양분 및 성장 인자를 함유하는 배지 중에서 단층 배양 또는 현탁 배양되는 경우에 성장 및 생존이 가능하다. 전형적으로, 상기 세포는 다량의 특정 관심 단백질을 발현하여 배양 배지로 분비할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 예로는 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO-K1, ATCC CC1-61); 소 유방 상피 세포 (ATCC CRL 10274; 소 유방 상피 세포); SV40으로 형질감염된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양으로 성장시키기 위해 서브클로닝한 293 또는 293 세포, 예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 (canine) 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 래트 섬유아세포 (208F 세포); MDBK 세포 (소 신장 세포); 및 인간 간암 세포주 (Hep G2) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 포유동물 세포주 뿐 아니라 통합 벡터를 낮거나 높은 감염 다중도로 사용한 식물 원형질체의 형질감염도 고려한다. 예를 들면, 본 발명은 1개 이상의 통합된 통합 벡터, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 가장 바람직하게는 슈도형 레트로바이러스 벡터를 포함하는 식물 세포 또는 온전한 식물을 고려한다. 또한, 원형질체로부터의 재생에 의해 생산될 수 있는 모든 식물 (예를 들면, 솔라눔 (Solanum), 니코티아나 (Nicotiana), 브라시아 (Brassica), 베타 (Beta), 피숨 (Pisum), 파셀로우스 (Phaseolus), 글리신 (Glycine), 헬리안터스 (Helianthus), 알륨 (Allium), 아베나 (Avena), 호르듐 (Hordeum), 오리재 (Oryzae), 세타리아 (Setaria), 세칼 (Secale), 소르검 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum), 제아 (Zea), 무사 (Musa), 코코스 (Cocos), 신도니아 (Cydonia), 피루스 (Pyrus), 말루스 (Malus), 포에닉스 (Phoenix), 엘래이스 (Elaeis), 루부스 (Rubus), 프라가리아(Fragaria), 프루누스 (Prunus), 아라키스 (Arachis), 파니쿰 (Panicum), 사카룸 (Saccharum), 코피아 (Coffea), 카멜리아 (Camellia), 아나나스 (Ananas), 비티스 (Vitis) 또는 시트루스 (Citrus) 속의 경작 식물들)도 본 발명에 따른 방법을 사용하여 형질감염시킬 수 있다. 통상적으로, 원형질체는 통상의 방법 (예를 들어 미국 특허 제4,743,548호, 동 제4,677,066호, 동 제5,149,645호 및 동 제5,508,184호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨)에 따라 제조된다. 식물 조직을 삼투압이 적당하며 (예를 들면, 당 폴리올을 3 내지 8 중량％ 함유) 1종 이상의 다당류 히드롤라제 (예를 들면, 펙티나제, 셀룰라제 등)를 함유하는 적당한 배지 중에 분산시키고 충분한 시간 동안 세포벽 분해를 진행시켜 원형질체를 수득할 수 있다. 여과 후에, 원심분리를 통해 원형질체를 단리할 수 있으며, 단리한 다음에는 이후의 처리 또는 사용을 위해 이를 재현탁시킬 수 있다. 당업계에 공지된 방법 (예를 들어 문헌 [Evans et al., Handbook of Plant Cell Culture, 1:124-176, MacMillan Publishing Co., New York (1983)], [Binding, Plant Protoplasts, p.21-37, CRC Press, Boca Raton (1985)] 및 [Potrykus and Shillito, Methods in Enzymology, Vol. 118, Plant Molecular Biology, A. and H. Weissbach eds., Academic Press, Orlando (1986)] 참조)을 통해, 배양물 중에 유지된 원형질체를 온전한 식물로 재생시킨다.
또한, 본 발명은 양서류 및 곤충 숙주 세포주를 사용할 것을 고려한다. 적합한 곤충 숙주 세포주의 예로는 모기 세포주 (예를 들면, ATCC CRL-1660) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 적합한 양서류 숙주 세포주의 예로는 두꺼비 세포주(예를 들면, ATCC CCL-102) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
II. 벡터 및 형질감염 방법
본 발명에 따라서, 상기 기재한 바와 같은 숙주 세포 내로 통합 벡터를 형질도입 또는 형질감염시킬 수 있다. 통합 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 트란스포손 벡터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 이들 벡터의 고안, 생산 및 용도를 하기에 기재한다.
A. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스 (레트로바이러스과)는 다음의 3개의 군으로 분류된다: 스푸마바이러스 (예를 들면, 인간 거품형성 (foamy) 바이러스); 렌티바이러스 (예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스 및 양 비스나 바이러스) 및 온코바이러스 (예를 들면, MLV, 라우스 육종 바이러스).
레트로바이러스 벡터는 외피가 있는 (즉, 숙주 세포로부터 유래한 지질 이중층 막으로 둘러싸임) 단일 가닥 RNA 바이러스로, 동물 세포를 감염시킨다. 레트로바이러스가 세포를 감염시킨 경우, 이의 RNA 게놈은 이중 가닥의 선형 DNA 형태로 전환된다 (즉, 역전사됨). 이후, 바이러스의 DNA 형태는 프로바이러스로서 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 프로바이러스는 추가의 바이러스 게놈 및 바이러스 mRNA 생산을 위한 주형으로서 기능한다. 감염된 세포의 표면으로부터 2개 카피의 게놈 RNA를 함유하는 성숙 바이러스 입자가 만들어진다. 상기 바이러스 입자는, 바이러스 외피 당단백질 (막-결합 단백질이라고 지칭되기도 함)을 함유하는 숙주세포 유래의 지질 이중층 막에 의해 둘러싸인 바이러스 캡시드 (바이러스gag유전자 생성물을 함유함) 내에 게놈 RNA, 역전사효소 및 다른pol유전자 생성물을 포함한다.
수많은 레트로바이러스의 게놈 구성은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 레트로바이러스 게놈의 개조를 가능하게 한다. 전형적으로, 관심 유전자를 보유하는 재조합 레트로바이러스 벡터는 2 단계로 제조한다.
먼저, 관심 유전자를 이의 효율적 발현에 필요한 서열들 (바이러스의 장쇄 말단 반복서열 (LTR) 또는 내부 프로모터/인핸서에 의해 제공될 수 있는 프로모터 및(또는) 인핸서 요소 및 관련 스플라이싱 신호를 포함함), 감염성 비리온 내로 바이러스 RNA의 효율적인 패키징에 필요한 서열들 (예를 들어, 패키징 신호 (Psi), tRNA 프라이머 결합 부위 (-PBS), 역전사에 필요한 3' 조절 서열들 (+PBS)) 및 바이러스 LRT을 함유하는 레트로바이러스 벡터 내로 삽입한다. LTR은 바이러스 게놈 RNA, 역전사효소 및 인테그라제 기능의 결합에 필요한 서열들 및 바이러스 입자 내로 패키징될 게놈 RNA의 발현 지시에 관여하는 서열들을 함유한다. 안전성의 이유로, 많은 재조합 레트로바이러스 벡터는 바이러스의 복제에 필수적인 유전자의 기능적 카피가 결여되어 있다 (이들 필수 유전자가 결실되거나 무능화됨). 따라서, 생성된 바이러스는 "복제-결함"이라고 일컬어진다.
다음으로, 재조합 벡터를 제조한 후에 상기 벡터 DNA를 패키징 세포주 내로 도입한다. 패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA를 원하는 숙주 범위를 갖는 바이러스 입자 내로 패키징하는데 필요한 단백질 (즉, 바이러스에 의해 코딩되는 gag, pol 및 env 단백질)을 트랜스로 (in trans) 제공한다. 숙주 범위는 부분적으로는 바이러스 입자의 표면에서 발현된 외피 유전자 생성물의 유형에 따라 달라진다. 패키징 세포주는 외생의 (ectotrophic), 양생의 (amphotropic) 또는 이종의 (xenotropic) 외피 유전자 생성물을 발현할 수 있다. 별법으로, 패키징 세포주는 바이러스 외피 (env) 단백질을 코딩하는 서열이 결여되어 있을 수 있다. 이러한 경우, 상기 패키징 세포주는 막-결합 단백질 (예를 들어, env 단백질)이 결여된 입자 내로 바이러스 게놈을 패키징시킬 것이다. 막-결합 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생성하여 바이러스를 세포 내로 진입시키기 위해서는 레트로바이러스 서열을 함유하는 패키징 세포주를 막-결합 단백질 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스 (VSV)의 G 단백질)을 코딩하는 서열들로 형질감염시킨다. 이후에, 형질감염된 패키징 세포주는 이에 의해 발현되는 막-결합 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생산할 것이다. 어떤 바이러스로부터 유래한 바이러스 게놈 RNA를 함유하는 바이러스 입자로서 상기 RNA가 다른 바이러스의 외피 단백질에 의해 캡슐화되어 있는 경우, 이들 바이러스 입자를 "슈도형 바이러스 입자"라고 일컫는다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 추가의 조절 서열들을 포함하도록 더 변형시킬 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 작동가능하게 연결된 a) 5' LTR; b) 패키징 신호; c) 3' LTR; 및 d) 5' LTR과 3' LTR 사이에 위치한, 관심 유전자를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 내부 프로모터로부터의 전사를 원하는 경우, 관심 핵산은 5' LTR과 반대 방향으로 배열될 수 있다. 적합한 내부 프로모터로는 알파-락트알부민 프로모터, CMV 프로모터 (인간 또는 유인원) 및 티미딘 키나아제 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 관심 단백질의 분비를 원하는 경우, 벡터가 관심 단백질과 작동가능하게 연결된 신호 펩티드 서열을 포함하도록 변형시킨다. 조직 플라스미노겐 활성자, 인간 성장 호르몬, 락토페린, 알파-카제인 및 알파-락트알부민으로부터 유래한 서열 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러가지 적합한 신호 펩티드 서열이 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 관심 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 3' 또는 5'에 RNA 배출 요소 (예를 들어 미국 특허 제5,914,267;호, 동 제6,136,597호 및 동 제5,686,120호 및 W099/14310 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨)를 혼입함으로써 벡터를 변형시킨다. RNA 배출 요소를 사용함으로써, 관심 단백질을 코딩하는 핵산 서열 내에 스플라이싱 신호 또는 인트론을 혼입하지 않고도 관심 단백질을 높은 수준으로 발현할 수 있다고 고려된다.
다른 실시양태에서, 상기 벡터는 1개 이상의 내부 리보솜 결합 부위 (IRES) 서열을 추가로 포함한다. 구제역 바이러스 (FDV), 뇌심근염 바이러스 및 소아마비바이러스로부터 유래한 IRES 서열 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 적합한 IRES 서열들이 이용가능하다. IRES 서열은 2개의 전사 단위 (예를 들면, 상이한 관심 단백질들을 코딩하는 핵산 또는 항체 등과 같이 다수의 서브유닛으로 구성된 단백질의 서브유닛) 사이에 위치시켜 폴리시스트론 서열을 형성하도록 함으로써,상기 2개의 전사 단위가 동일한 프로모터로부터 전사되도록 할 수 있다.
또한, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 형질전환된 세포의 선별을 용이하게 해주는 선택가능한 마커를 추가로 포함할 수도 있다. 포유동물 세포에서 약물 G418에 대한 내성을 부여하는 박테리아 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo유전자라고 지칭되기도 함), 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 박테리아 하이그로마이신 G 포스포트랜스퍼라제 (hyg) 유전자 및 마이코페놀산의 존재하에서의 성장능을 부여하는 박테리아 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자 (또한gpt유전자라고 지칭되기도 함) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 수많은 선택가능한 마커를 본 발명에 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 선택가능한 미커 유전자는 관심 단백질도 코딩하는 폴리시스트론 서열의 일부로서 제공된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 재조합 시스템 (예를 들어, cre/loxP 또는 flp 리콤비나제 시스템; 예를 들어 문헌 [Hoess et al., Nucleic Acids Res., 14:2287 (1986)], [O'Gorman et al., Science 251:1351 (1991)], [van Deursen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7376 (1995)] 및 미국 특허 제6,025,192호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨)에 의해 인식되는 재조합 요소들을 포함할 수 있다. 벡터가 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 후, 상기 숙주 세포는 재조합 효소 (예를 들어, Cre 리콤비나제) 또는 재조합 효소를 코딩하는 핵산 서열 및 재조합 효소에 의해 인식되는 서열이 플랭킹되어 있는 관심 단백질을 코딩하는 1종 이상의 핵산 서열에 의해 일시적으로 형질감염 (예를들어, 전기천공법, 리포펙션법 또는 미세주입법에 의한 형질감염)되어 관심 핵산 서열이 통합된 벡터 내로 삽입되도록 할 수 있다.
재조합 레트로바이러스 벡터 등을 비롯한 바이러스 벡터는, 인산칼슘-DNA 동시침전법 또는 DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 전기천공법 또는 핵산의 미세주입법 등과 같은 다른 기술에 비해 세포 내로 유전자를 전달하는 보다 효율적인 수단을 제공한다. 바이러스 전달의 효율은 부분적으로 핵산의 전달이 수용체-매개의 과정 (즉, 바이러스가 감염될 세포의 표면상에 있는 특이적 수용체 단백질과 결합함)이라는 사실 때문인 것으로 여겨진다. 또한, 일단 핵산이 바이러스에 의해 세포 내로 전달된 후에는 상기 핵산이 제어된 방식으로 통합되며, 이는 바이러스에 의해 전달된 것이 아닌 핵산의 통합과는 대조적이다. 인산칼슘-DNA 동시침전법 등과 같은 다른 수단에 의해 전달된 핵산은 재배열 및 분해된다.
가장 통상적으로 사용되는 재조합 레트로바이러스 벡터는 양생의 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV)로부터 유래된 벡터이다 (예를 들어 문헌 [Miller and Baltimore Mol. Cell. Biol. 6:2895 (1986)] 참조). MoMLV 시스템에는 여러 잇점이 있다: 1) 이러한 특이적 레트로바이러스는 많은 상이한 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 2) 수립된 패키징 세포주들을 재조합 MoMLV 바이러스 입자의 생산에 사용할 수 있으며, 3) 전달된 유전자는 표적 세포 염색체에 영구적으로 통합된다. 수립된 MoMLV 벡터 시스템은 레트로바이러스 서열의 일부 (예를 들면, 바이러스의 장쇄 말단 반복서열 또는 "LTR" 및 패키징 또는 "psi"신호)를 함유하는 DNA 벡터 및 패키징 세포주를 포함한다. 전달될 유전자는 DNA 벡터로 삽입된다. DNA 벡터상에존재하는 바이러스 서열은 벡터 RNA가 바이러스 입자로 삽입 또는 패키징되는데 필요한 신호 및 삽입된 유전자의 발현에 필요한 신호를 제공한다. 패키징 세포주는 입자 조립에 요구되는 단백질을 제공한다 [Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988)].
이러한 잇점들에도 불구하고, MoMLV 기재의 기존의 레트로바이러스 벡터들은 여러 내재적 문제점에 대한 한계가 있었다: 1) 이들은 아마도 난모세포를 제외한 비분열 세포를 감염시킬 수 없고 [Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990)], 2) 이들은 재조합 바이러스를 낮은 역가로 생산하며 ([Miller and Rosman, BioTechniques 7:980 (1980)], [Miller, Nature 357:455 (1990)]), 3) 이들은 특정 세포 유형 (예를 들면, 인간 림프구)을 낮은 효율로 감염시킨다 [Adams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8981 (1992)]. MoMLV-기재의 벡터와 관련된 낮은 역가는 적어도 부분적으로는 바이러스에 의해 코딩되는 외피 단백질의 불안정성에 기인한다. 물리적 수단 (예를 들면, 초원심분리 및 한외여과)에 의한 레트로바이러스 스톡의 농축으로 감염성 바이러스가 심각하게 손실된다.
MoMLV-기재의 벡터에 의한 낮은 역가 및 특정 세포 유형의 비효율적 감염은 막-결합 단백질로서 VSV의 G-단백질을 함유하는 슈도형 레트로바이러스 벡터를 사용함으로써 극복된 바 있다. 특이적 세포 표면 단백질 수용체에 결합하여 세포로 진입할 수 있는 레트로바이러스 외피 단백질과는 달리, VSV G-단백질은 원형질막의 인지질 성분과 상호작용한다 [Mastromarino et al., J. Gen. Virol. 68:2359 (1977)]. VSV가 세포로 진입하는 것은 특이적 단백질 수용체의 존재에 좌우되지않으므로, VSV의 숙주 범위는 극단적으로 넓다. VSV G-단백질을 보유하는 슈도형 레트로바이러스 벡터의 숙주 범위는 VSV에 특징적인 숙주 범위를 변경시킨 범위이다 (즉, 이들은 거의 모든 종의 척추동물, 무척추동물 및 곤충 세포를 감염시킬 수 있음). 중요한 것은, VSV G-슈도형 레트로바이러스 벡터가 초원심분리를 통해 감염성을 상당히 손실하지 않고도 2000-배 이상 농축될 수 있다는 것이다 [Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 (1993)].
바이러스 입자 내의 이종 막-결합 단백질로서 바이러스 G-단백질을 사용하는 경우, 본 발명은 VSV G-단백질의 사용으로 제한되지 않는다 (예를 들어 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,512,421호 참조). VSV가 아닌 수포성바이러스 속, 예를 들어 피리 및 칸디푸라 바이러스의 바이러스 G-단백질은 VSV G-단백질과의 상동성이 높으며, VSV G-단백질과 마찬가지로 공유결합으로 연결된 팔미트산을 함유한다 ([Brun et al. Intervirol. 38:274 (1995)] 및 [Masters et al., Virol. 171:285 (1990)]). 따라서, 슈도형 바이러스 입자를 위해 VSV G-단백질 대신 피리 및 칸디푸라 바이러스의 G-단백질을 사용할 수 있다. 또한, 리사 바이러스 속, 예를 들어 광견병 바이러스 및 모콜라 바이러스 등의 내부에 있는 바이러스의 VSV G-단백질은 VSV G-단백질과의 보존 (아미노산 서열 뿐 아니라 기능적 보존 역시) 정도가 높은 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 모콜라 바이러스 G-단백질은 VSV G-단백질과 유사한 방식으로 기능 (즉, 막 융합 매개)하는 것으로 밝혀진 바 있으므로, 슈도형 바이러스 입자를 위해 VSV G-단백질 대신 사용될 수 있다 [Mebatsion et al., J. Virol. 69:1444 (1995)]. 적합한 프로모터 요소 (예를 들면, CMV IE(Intermediate-Early) 프로모터; pcDNA3.1 벡터 (인비트로젠 (Invitrogen) 제품) 등과 같이 CMV IE 프로모터를 함유하는 수많은 발현 벡터)의 전사 조절을 받는 피리, 샨디푸라 또는 모콜라 G-단백질을 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드를 pHCMV-G 대신 사용한 경우를 제외하고는, 실시예 2에 기재한 바와 같이 피리, 샨디푸라 또는 모콜라 G-단백질을 사용하면, 바이러스 입자는 슈도형이 될 수 있다. 랍도바이러스과의 다른 구성원에서 유래된 다른 G-단백질을 코딩하는 서열을 사용할 수 있으며, 진뱅크 데이타베이스로부터 수많은 랍도바이러스 G-단백질을 코딩하는 서열이 이용가능하다.
다수의 레트로바이러스는 수용자 세포가 바이러스 감염시에 분열되고 있는 중일 경우에만 바이러스 (프로바이러스)의 이중 가닥의 선형 형태를 상기 수용자 세포의 게놈에 전달하거나 통합시킬 수 있다. 분열 세포만을 감염시키거나 또는 분열 세포를 더욱 효율적으로 감염시키는 것으로 밝혀진 바 있는 레트로바이러스로는 MLV, 양 괴사 바이러스, 라우스 육종 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV; HIV는 분열 세포를 더욱 효율적으로 감염시키기는 하지만, 비분열 세포도 감염시킬 수 있음) 등이 있다.
MLV 바이러스 DNA의 통합은 숙주 세포의 유사분열 진행 정도에 따라 달라지는 것으로 밝혀진 바 있으며, 이러한 유사분열에 대한 의존성은 바이러스 통합 복합체가 핵으로 진입하기 위해서는 핵막이 붕괴될 것이 요구된다는 것을 반영하는 것으로 추정된 바 있다 [Roe et al., EMBO J. 12:2099 (1993)]. 그러나, 중기에서 정지되어 있는 세포에서는 통합이 일어나지 않기 때문에, 핵막의 파괴만으로는 바이러스 통합에 충분하지 못할 수 있으므로, 게놈 DNA의 응축 상태 등에 대한 추가의 요구사항이 있을 수 있다 [Roe et al., 상기 문헌].
B. 렌티바이러스 벡터
또한, 본 발명은 많은 카피수의 세포주 생산에 렌티바이러스 벡터를 사용할 것을 고려한다. 렌티바이러스 (예를 들면, 말 감염성 빈혈 바이러스, 카프린 관절염-뇌염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스)는 비분열 세포 내로 통합될 수 있는 레트로바이러스의 아족 (subfamily)이다. 렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 모든 레트로바이러스에서 발견되며 2개의 LTR 서열에 의해 플랭킹되어 있는gag,pol및env의 3가지 유전자를 갖고 있다.gag유전자는 내부의 구조적 단백질 (예를 들면, 매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드 단백질)을 코딩하고,pol유전자는 역전사효소, 프로테아제 및 인테그라제 단백질을 코딩하며,env유전자는 바이러스 외피 당단백질을 코딩한다. 5' 및 3' LTR은 바이러스 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 조절한다. 렌티바이러스 게놈 내 추가의 유전자로는vif,vpr,tat,rev,vpu,nef및vpx유전자 등이 있다.
다양한 렌티바이러스 벡터 및 패키징 세포주는 당업계에 공지되어 있으며 본 발명에 사용될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,994,136호 및 동 제6,013,516호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨). 추가로, VSV G-단백질을 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 기재의 슈도형 레트로바이러스 벡터에 사용할 수도 있다 [Naldini et al., Science 272:263 (1996)]. 따라서, VSV G-단백질을 사용하여 다양한 슈도형 레트로바이러스 벡터를 제조할 수 있으며, MoMLV 기재의 벡터로 제한되지 않는다. 또한, 렌티바이러스 벡터를 상기 기재한 바와 같이 변형시켜 다양한 조절 서열 (예를 들면, 신호 펩티드 서열, RNA 배출 요소 및 IRES 서열)을 함유하도록 할 수 있다. 레트로바이러스 벡터와 관련하여 상기 기재한 바와 같이, 렌티바이러스 벡터를 생산한 후에 이들을 사용하여 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다.
C. 아데노-관련 바이러스 벡터
또한, 본 발명은 많은 카피수의 세포주 생산에 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 사용할 것을 고려한다. AAV는 데펜도바이러스 속에 속하는 인간 DNA 파르보바이러스이다. AAV 게놈은 대략 4680개 염기를 함유하는 단일 가닥의 선형 DNA 분자로 구성된다. 상기 게놈은 각 말단에서 DNA 복제 기점 및 바이러스를 위한 패키징 신호로서 시스로 기능하는 도립된 말단 반복서열 (ITR)을 포함한다. 게놈의 내부 비-반복서열은 2개의 커다란 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이들은 각각 AAVrep및cap영역으로 공지되어 있다. 이들 영역은 비리온의 복제 및 패키징에 관여하는 바이러스 단백질을 코딩한다. 4종 이상의 바이러스 단백질 족은 AAVrep영역의 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40 (각 단백질의 명백한 분자량에 따라 명명됨)으로부터 합성된다. AAVcap영역은 VP1, VP2 및 VP3을 포함하는 3종 이상의 단백질을 코딩한다 (AAV 게놈에 관한 상세한 기재를 위해서는, 문헌 [Muzyczka, Current Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129 (1992)], [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)] 참조).
AAV에 의한 생산적인 감염이 일어나도록 하기 위해서는 무관한 헬퍼 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 또는 우두 바이러스 등과의 동시감염이 요구된다. 이러한 동시감염이 없는 경우, AAV는 이의 게놈이 숙주 세포 염색체에 삽입된 채로 잠복 상태를 수립한다. 이후에 헬퍼 바이러스에 의해 감염된 후에야 상기 통합된 카피가 복제되어 감염성 바이러스 자손을 생산할 수 있게 된다. 비-슈도형 레트로바이러스와는 달리, AAV는 숙주 범위가 광범위하고, AAV가 존재하는 종에서 증식될 수 있는 헬퍼 바이러스로 동시감염된다면 임의의 종의 세포 내에서 복제될 수 있다. 따라서, 예를 들어 인간 AAV는 개의 아데노바이러스와 함께 동시감염된 개의 세포에서 복제될 수 있다. 추가로, 레트로바이러스와는 달리, AAV는 임의의 인간 또는 동물 질환과 관련이 없고, 통합된 후에 숙주 세포의 생물학적 특성을 변경시키지 않는 것으로 여겨지며, 비-분열 세포 내로 통합될 수 있다. 또한, 최근에는 AAV가 숙주 세포 게놈에 부위-특이적 통합될 수 있음이 밝혀진 바 있다.
상기에서 기재한 특성 때문에, 유전자 전달을 위한 수많은 재조합 AAV 벡터가 개발되어 왔다 (예를 들어 미국 특허 제5,173,414호, 동 제5,139,941호, WO92/01070 및 WO93/03769 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨; [Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)], [Carter, B. J., Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 (1992)], [Muzyczka, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992)], [Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801], [Shelling and Smith, Gene Therapy 1:165-169 (1994)] 및 [Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867-1875 (1994)] 참조).
재조합 AAV 비리온은 AAV 헬퍼 플라스미드 및 AAV 벡터 모두에 의해 형질감염된 적합한 숙주 세포에서 생산될 수 있다. AAV 헬퍼 플라스미드 통상적으로 AAVrep및cap코딩 영역을 포함하나 AAV ITR은 없다. 따라서, 헬퍼 플라스미드 그 자체로는 복제되거나 패키징될 수 없다. 통상적으로, AAV 벡터는 선택된 관심 유전자를 포함하며, 이의 경계면에는 바이러스 복제 및 패키징 기능을 제공하는 AAV ITR이 있다. 헬퍼 플라스미드 및 선택된 유전자를 보유하는 AAV 벡터 둘다 일시적인 형질감염을 통해 적합한 숙주 세포에 도입된다. 이후에, 형질감염된 세포를 아데노바이러스 등의 헬퍼 바이러스로 감염시켜, 헬퍼 플라스미드상에서 AAVrep및 cap 영역의 전사 및 번역을 지시하는 AAV 프로모터를 트랜스활성화시킨다. 선택된 유전자를 보유하는 재조합 AAV 비리온이 형성되고, 이는 상기 제제로부터 정제될 수 있다. 일단 AAV 벡터가 생산되면, 이들을 사용하여 숙주 세포를 원하는 감염 다중도로 형질감염시켜 많은 카피수의 숙주 세포를 생산할 수 있다 (예를 들어 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,843,742호 참조). 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, AAV 벡터를 상기 기재한 바와 같이 변형시켜 다양한 조절 서열 (예를 들면, 신호 펩티드 서열, RNA 배출 요소 및 IRES 서열)을 함유하도록 할 수 있다.
D. 트란스포손 벡터
또한, 본 발명은 많은 카피수의 세포주 생산에 트란스포손 벡터를 사용할 것을 고려한다. 트란스포손은 게놈 내 한 위치에서 다른 위치로 이동하거나 전위할 수 있는 이동성 유전적 요소이다. 게놈 내 전위는 트란스포손에 의해 코딩되는 트란스포사제 효소에 의해 조절된다. 트란스포손의 많은 예가 당업계에 공지되어 있으며, Tn5 (예를 들어, 문헌 [de la Cruz et al., J. Bact. 175:6932-38 (1993)]참조), Tn7 (예를 들어, 문헌 [Craig, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 204:27-48 (1996)] 참조) 및 Tn10 (예를 들어, 문헌 [Morisato and Kleckner, Cell 51:101-111 (1987)] 참조) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 트란스포손이 게놈 내로 통합되는 능력을 사용하여 트란스포손 벡터가 제조되어 왔다 (예를 들어 미국 특허 제5,719,055호, 동 제5,968,785호, 동 제5,958,775호 및 동 제6,027,722호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨). 트란스포손은 감염성이 없기 때문에, 트란스포손 벡터를 당업계에 공지된 방법 (예를 들면, 전기천공법, 리포펙션법 또는 미세주입법)을 통해 숙주 세포에 도입한다. 따라서, 트란스포손 벡터 : 숙주 세포의 비율을 조정하여 본 발명의 많은 카피수의 숙주 세포를 생산하도록 원하는 감염 다중도로 제공할 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 트란스포손 벡터는 통상적으로 트란스포손 삽입 서열들 사이에 위치된 관심 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또한, 몇몇 벡터는 트란스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 이들 벡터에서는, 삽입 서열들 중 하나가 트란스포사제 효소와 관심 단백질을 코딩하는 핵산 사이에 위치해 있어서, 재조합 동안 숙주 세포의 게놈으로 혼입되지 않는다. 별법으로, 적합한 방법 (예를 들면, 리포펙션법 또는 미세주입법)을 통해 트란스포사제 효소를 제공할 수 있다. 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 트란스포손 벡터를 상기 기재한 바와 같이 변형시켜 다양한 조절 서열 (예를 들면, 신호 펩티드 서열, RNA 배출 요소 및 IRES 서열)을 함유하도록 할 수 있다.
E. 감염 다중도로의 형질감염
일단, 관심 단백질을 코딩하는 통합 벡터 (예를 들면, 레트로바이러스 벡터)를 제조하면, 이들을 사용하여 숙주 세포를 형질감염 또는 형질도입시킬 수 있다 (이들의 예는 상기 <I. 숙주 세포>에 기재되어 있음). 상기 레트로바이러스 벡터가 바람직하게는, 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상 통합되기에 충분한 감염 다중도로 통합 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질감염 또는 형질도입시킨다. 몇몇 실시양태에서, 감염 다중도를 10 내지 1,000,000으로 사용하여 감염된 숙주 세포의 게놈이 통합된 벡터의 카피를 2 내지 100개, 바람직하게는 5 내지 50개 함유하도록 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 감염 다중도를 10 내지 10,000으로 사용한다. 비-슈도형 레트로바이러스 벡터를 감염에 사용하는 경우, 감염성 벡터를 원하는 역가 (즉, 콜로니 형성 단위, CFU)로 함유하는 레트로바이러스 생산자 세포로부터의 배양 배지와 함께 숙주 세포를 인큐베이션시킨다. 슈도형 레트로바이러스 벡터를 사용하는 경우, 초원심분리를 통해 상기 벡터를 적당한 역가로 농축한 후에, 숙주 세포 배양물에 첨가한다. 별법으로, 상기 농축된 벡터를 세포 유형에 적당한 배양 배지 중에 희석할 수 있다. 추가로, 숙주 세포가 1종 초과의 관심 단백질을 발현하기를 원하는 경우에는 상기 숙주 세포를 각각이 상이한 관심 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 다수의 벡터로 형질감염시킬 수 있다.
각 경우에서, 감염성 레트로바이러스 벡터를 함유하는 배지에 상기 벡터의 감염 및 이후의 통합을 허용하는 충분한 기간 동안 숙주 세포를 노출시킨다. 통상적으로, 세포를 덮을 만큼 사용되는 배지의 양은 가능한 한 적은 부피로 유지시켜, 세포 당 최대의 통합 사건이 발생할 수 있도록 해야 한다. 통상적인 지침으로서,원하는 통합 사건의 수에 따라 1 mL 당 콜로니 형성 단위 (CFU)는 약 105내지 107CFU/mL이어야 한다.
본 발명은 임의의 특정 작용 메카니즘으로 제한되지 않는다. 실제로, 본 발명을 실행하는데에는 작용 메카니즘에 대한 이해가 필요없다. 그러나, 벡터의 확산율은 매우 제한되어 있는 것으로 공지되어 있다 (확산율에 대한 논의에 관해서는 예를 들어 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,866,400호 참조). 따라서, 실제적인 통합률은 감염 다중도 보다 더 낮을 것이라고 예상된다 (몇몇 경우에는 훨씬 더 낮을 것이라 예상됨). 미국 특허 제5,866,400호의 식을 적용하면, 106CFU/mL의 역가는 평균 벡터-벡터 이격 거리가 1 미크론이다. 100 미크론에 대한 MMLV 벡터의 확산 시간은 대략 20분이다. 따라서, 벡터는 1시간 동안 대략 300 미크론을 이동할 수 있다. 1000개의 세포를 T25 플라스크에 플레이팅한 경우, 세포들은 평균적으로 2.5 mm씩 떨어져서 이격되어 있다. 이러한 값을 사용할 때, 1시간 이내에 겨우 56개의 바이러스 입자만이 주어진 세포와 접촉할 것이라 예상된다. 하기의 표는 T25 플라스크에 주어진 수의 세포에 대해 특정 벡터 역가에서 예상되는 접촉률을 제공한다. 그러나, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 수득되는 실제적인 통합수는 이러한 식에 의해 예상될 수 있는 수치 보다 훨씬 더 낮다.
시간 및 세포 이격 거리의 함수로서의 벡터 접촉 빈도
벡터 역가 세포/T25 플라스크 MOI 접촉/시간
106 1000 1,000 56
106 100 10,000 <56
105 1000 100 5.6
104 1000 10 0.6
따라서, 실제적인 통합률은 오직 감염 다중도에 따라서만 달라지는 것이 아니라, 접촉 시간 (즉, 숙주 세포가 감염성 벡터에 노출된 시간 길이), 형질감염될 숙주 세포의 조밀성 또는 기하학적 형태 및 벡터가 함유되어 있는 배지의 부피에 따라서도 달라진다고 고려된다. 이러한 조건을 본원에서 교시되는 바에 따라 변화시켜 통합 벡터의 통합된 카피를 다수 함유하는 숙주 세포주를 생산할 수 있다고 고려된다. 실시예 8 및 실시예 9에서 증명된 바와 같이, 세포수를 일정하게 유지하고 CFU를 변화시켜 MOI를 변화 (실시예 9)시키거나 또는 CFU를 일정하게 유지하고 세포수를 변화시켜 MOI를 변화 (실시예 8)시킬 수 있다. .
몇몇 실시양태에서, 형질감염 또는 형질도입 후에는 세포가 증식되도록 하고, 그 후에 트립신 처리하여 다시 플레이팅한다. 그 후에 단일 클론에서 선택된 세포주가 제공되도록 개개의 콜로니를 선택한다. 서던 블럿 또는 INVADER 분석을 통해 단일 클론에서 선택된 상기 세포주를 스크리닝하여 원하는 수의 통합 사건이 발생하였는지를 입증한다. 또한, 클론 선별을 통해 우수한 단백질 생산 세포주를 확인할 수 있다고 고려된다. 다른 실시양태에서, 상기 세포는 형질감염 후에 단일 클론에서 선택된 것이 아니다.
몇몇 실시양태에서, 숙주 세포를 상이한 관심 단백질들을 코딩하는 벡터로 형질감염시킨다. 상이한 관심 단백질들을 코딩하는 벡터로 세포를 동시에 형질감염시킬 수도 있고 (예를 들면, 숙주 세포를 상이한 관심 단백질들을 코딩하는 벡터를 함유하는 용액에 노출시킴), 또는 형질감염을 연속적으로 수행할 수도 있다 (예를 들면, 숙주 세포를 제1 관심 단백질을 코딩하는 벡터로 1차 형질감염시키고 시간이 흐른 후에, 상기 숙주 세포를 제2 관심 단백질을 코딩하는 벡터로 2차 형질감염시킴). 몇몇 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포를 제1 관심 단백질을 코딩하는 통합 벡터로 형질감염시키고, 통합 벡터의 통합된 카피를 다수 함유하는 고발현 세포주를 선택 (예를 들면, 단일 클론에서 선택함)하며, 선택된 세포주를 제2 관심 단백질을 코딩하는 통합 벡터로 형질감염시킨다. 이러한 방법을 반복하여 다수의 관심 단백질을 도입할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 감염 다중도를 조작 (예를 들면, 증가 또는 감소)하여, 관심 단백질의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 마찬가지로, 상이한 프로모터들을 사용하여 관심 단백질들의 발현을 변화시킬 수 있다. 이러한 형질감염 방법을 사용하여 전체 외인성 대사 경로를 함유하는 숙주 세포주를 제조하거나 단백질 프로세싱 능력이 증가된 숙주 세포 (예를 들면, 숙주 세포에 번역후 변형에 필요한 효소를 제공할 수 있음)를 제공하는 것이 고려된다.
추가의 실시양태에서, 세포주를 동일한 유전자를 코딩하는 벡터로 연속적으로 형질감염시킨다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포를 관심 단백질을 코딩하는 통합 벡터로 형질감염 (예를 들면, MOI가 약 10 내지 100,000, 바람직하게는 100 내지 10,000임)시키고, 통합 벡터의 통합된 카피를 1개 또는 다수 함유하거나 원하는 단백질을 높은 수준으로 발현하는 세포주를 선택 (예를 들면, 단일 클론에서 선택함)하며, 선택된 세포주를 벡터로 재형질감염 (예를 들면, MOI가 약 10 내지 100,000, 바람직하게는 100 내지 10,000임)시킨다. 몇몇 실시양태에서, 벡터의 통합된 카피를 2개 이상 포함하는 세포주를 확인하고 선택한다. 이러한 방법을단백질 발현이 원하는 수준으로 얻어질 때까지 여러회 반복할 수 있으며, 또한 이러한 방법을 반복하여 다수의 관심 단백질을 코딩하는 벡터를 도입할 수도 있다. 예상과는 달리, 동일 유전자를 사용한 연속 형질감염은 생성된 세포로부터의 단백질 생산을 꽤 증가시켰다.
III. 형질감염된 숙주 세포의 용도
높은 감염 다중도로 형질감염된 숙주 세포는 다양한 목적에 사용될 수 있다. 첫째, 상기 숙주 세포는 제약, 산업, 진단 및 기타의 목적에 사용된다. 둘째, 특정 단백질(들)을 발현하는 숙주 세포는 스크리닝 분석 (예를 들면, 고처리량 스크리닝)에 사용된다. 셋째, 상기 숙주 세포는 단백질들의 다수의 변이체 생산에 사용되며, 이후에 상기 단백질 변이체들의 활성을 분석한다. 이러한 용도 각각을 하기에서 더욱 상세히 설명한다.
A. 단백질 생산
본 발명의 숙주 세포는 제약, 산업, 진단 및 기타의 목적에 사용된다고 고려된다. 본 발명은 임의의 특정 단백질 생산으로 제한되지 않는다. 실제로, 에리트로포에틴, 알파-인터페론, 알파-1 프로테이나제 억제제, 안지오게닌, 항-트롬빈 III, 베타-산 데카르복실라제, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 돼지 성장 호르몬, 인간 혈청 알부민, 베타-인터페론, 송아지 장 알칼리성 포스파타제, 낭성 섬유증 막횡단 조절자, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인슐린, 락토페린, 조직 플라스미노겐 활성자, 수초 염기성 단백질, 인슐린, 프로인슐린, 프로락틴, B형 간염 바이러스의 항원, 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체 CTLA4 Ig, 태그 (Tag) 72 모노클로날 항체, 태그 72 단쇄 항원 결합 단백질, 단백질 C, 사이토킨 및 이들의 수용체, 예를 들어 종양 괴사 인자-알파 및 베타, 이들의 수용체 및 이들의 유도체, 레닌, 성장 호르몬 유리 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지단백질, 알파-1-항-트립신, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 글루카곤, 폰 빌레브란트 인자, 심방 나트륨이뇨 인자, 폐 계면활성제, 유로키나제, 봄베신, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 엔케팔리나제, 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파), 혈청 알부민, 예를 들어 뮐러 억제 물질, 릴랙신 A-쇄, 릴랙신 B-쇄, 프로릴랙신, 마우스 생식선자극호르몬-관련 펩티드, 베타-락타마제, DNase, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마토이드 인자, 신경영양성 인자, 예를 들어 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6) 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-베타, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF, 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타, 예를 들어 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5, 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, CD 단백질, 예를 들어 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19, 골유도 인자, 면역독소, 골 형태발생 단백질 (BMP), 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF, 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10, 수퍼옥시드 디스뮤타제, T-세포 수용체, 표면 막 단백질, 쇠퇴 가속 인자, 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 외피의 일부, 수송 단백질, 귀소 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 항체, 키메라 단백질, 예를 들어 이뮤노어드헤신 및 상기한 폴리펩티드들의 임의의 단편 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 광범위하게 다양한 단백질들의 생산이 고려된다. 이들 단백질의 핵산 및 단백질 서열은 진뱅크 등의 공공 데이타베이스에서 이용가능하다.
몇몇 실시양태에서, 숙주 세포는 1종 초과의 외인성 단백질을 발현한다. 예를 들면, 숙주 세포를 상이한 관심 단백질들을 코딩하는 벡터로 형질감염 (예를 들면, 제1 관심 단백질을 코딩하는 제1 벡터 및 제2 관심 단백질을 코딩하는 제2 벡터를 감염 다중도 1000으로 사용하여 동시형질감염 또는 동시감염시키거나 연속 형질감염 또는 연속 감염시킴)시켜 상기 숙주 세포가 제1 관심 단백질을 코딩하는 제1 통합 벡터의 통합된 카피를 1개 이상 함유하고 제2 관심 단백질을 코딩하는 제2 통합 벡터의 통합된 카피를 1개 이상 함유하도록 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상이한 관심 단백질들을 코딩하는 핵산들을 폴리시스트론 서열 (예를 들면, 비시스트론 또는 트리시스트론 서열)로 배열함으로써 1종 초과의 단백질이 발현된다. 이러한 배열은 상이한 관심 단백질들이 발현되는 몰비를 약 1 : 1로 원하는 경우 (예를 들면, 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 경우)에 특히 유용하다.
추가의 실시양태에서, 숙주 세포에서 리보자임을 발현시킨다. 리보자임을 사용하여 특정 유전자의 발현을 하향-조절하거나, 리보자임을 TET, 엑디손, 글루코코르티코이드 인핸서 등의 유전자 스위치와 접합하여 사용하여 다양한 표현형의 숙주 세포를 제공할 수 있다고 고려된다.
형질감염된 숙주 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 배양된다. 포유동물 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234 (1983), Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York (1992)] 참조).
본 발명의 숙주 세포 배양물은 배양될 특정 세포에 적합한 배지 중에서 제조된다. 영양분 용액의 예로서는 함스 F10 (Ham's F10, 미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 제품), 최소 필수 배지 (Minimal Essential Medium, MEM, 시그마 제품), RPMI-1640 (시그마 제품) 및 둘베코스 변형된 이글 배지 (DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 시그마 제품) 등의 시판 배지 등이 있다. 적합한 배지는 미국 특허 제4,767,704호, 동 제4,657,866호, 동 제4,927,762호, 동 제5,122,469호, 동 제4,560,655호 및 WO90/03430 및 WO87/00195 등에도 기재되어 있으며, 이들 모두가 본원에 참고로 도입된다. 이들 배지 중 임의의 배지를 필요에 따라 혈청, 호르몬 및(또는) 기타 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화 나트륨, 칼슘염, 마그네슘염 및 인산염), 완충액 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오시드 (예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들면, 겐타마이신, 미량 원소 (통상적으로 최종 농도가 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 지질 (예를 들면, 리놀레산 또는 기타 지방산) 및 이들의 적합한 담체 및 글루코스 또는 동등한 에너지원을 사용하여 보충할 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 임의의 다른 필요한 보충물을 적당한 농도로 포함시킬 수도 있다. 포유동물 세포 배양을 위한 배양 배지의 삼투압은 통상적으로 약 290 내지 330 mOsm이다.
또한, 본 발명은 형질감염된 숙주 세포를 위해 다양한 배양 시스템 (예를 들면, 페트리 디쉬, 96-웰 플레이트, 롤러병 및 생물반응기)을 사용할 것을 고려한다. 예를 들면, 형질감염된 숙주 세포를 관류 시스템에서 배양할 수 있다. 관류 배양이란 높은 세포 밀도로 유지되는 배양물에 배양 배지의 지속적 흐름을 제공하는 것을 지칭한다. 세포를 현탁하고, 세포를 성장시킬 고체 지지체는 요구되지 않는다. 통상적으로, 독성 대사물질을 부수적으로 제거하고, 이상적으로는 죽은 세포를 선택적으로 제거하면서, 신선한 영양분을 지속적으로 공급해야 한다. 충분한 빈도의 여과, 포획 및 마이크로-캡슐화 방법 모두가 신선한 배양 환경 조성에 적합하다.
다른 예로서, 몇몇 실시양태에서는 배치식 공급 배양 방법을 사용할 수 있다. 포유동물 숙주에게 바람직한 배치식 공급 배양법에서는, 먼저 세포 및 배양 배지를 배양 용기에 공급하고, 배양 중인 배양물에 추가의 배양 영양분을 지속적으로 또는 별개의 증가물로 공급하면서, 배양 종료전에 주기적으로 세포 및(또는) 생성물을 수거하거나 수거하지 않는다. 배치식 공급 배양의 예로는 온전한 배양물 (세포 및 배지 포함)을 주기적으로 제거하고 신선한 배지로 교체하는 반-지속적 배치식 공급 배양을 들 수 있다. 배치식 공급 배양은 배양 과정을 시작할 때 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양분 포함)을 배양 용기에 공급하는 단순한 배치식 배양과 구별된다. 배치식 공급 배양은 또한 상기 과정 동안 상층액을 배양 용기로부터 제거하지 않는다는 점에서 관류 배양과도 구별된다 (관류 배양시에는, 여과, 캡슐화, 마이크로운반체로의 앵커링 (anchoring) 등을 통해 세포를 배양물 중에 유지하고, 지속적으로 또는 간헐적으로 배양 배지를 도입하고 배양 용기로부터 제거함). 몇몇 특히 바람직한 실시양태에서, 배치식 배양은 롤러병에서 수행된다.
추가로, 배양물의 세포는 특정 숙주 세포 및 특정 생산 계획에 적합할 수 있는 임의의 계획안 또는 관례에 따라 증식될 수 있다. 따라서, 본 발명은 한 단계 또는 여러 단계의 배양 방법을 고려한다. 한 단계 배양시에, 숙주 세포를 배양 환경에 접종하고, 세포 배양의 단일 생산 시기 동안 본 발명의 방법을 사용한다. 별법으로, 다단계 배양이 고려된다. 다단계 배양시에, 세포는 수많은 단계 또는 수많은 시기 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포, 가능하게는 저장해 두었던 세포를 성장 촉진에 적합하고 높은 생존력에 적합한 배지에 접종하는 제1 단계 배양 또는 성장기 배양으로 성장시킬 수 있다. 숙주 세포 배양물에 신선한 배지를 첨가함으로써, 세포를 적합한 기간 동안 성장기로 유지시킬 수 있다.
세포 배양의 성장기에 있는 포유동물 세포의 성장을 증대시킬 수 있는 배치식 공급 또는 지속적 세포 배양 조건을 고안한다. 성장기에서, 성장을 최대화시키는 조건 및 시간 동안 세포를 성장시킨다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH, 용존 산소량 (dO2) 등은 특정 숙주에 맞춰 사용하며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 통상적으로, pH는 산 (예를 들면, CO2) 또는 염기 (예를 들면, Na2CO3또는 NaOH)를사용하여 약 6.5 내지 7.5 사이의 수준으로 조정한다. CHO 세포 등의 포유동물 세포 배양에 적합한 온도 범위는 약 30 내지 38℃ 사이이며, 적합한 dO2는 5 내지 90％의 공기 포화 상태이다.
폴리펩티드 생산 시기 후에, 당업계에 수립되어 있는 기술을 사용하여 관심 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수한다. 관심 단백질은 분비된 폴리펩티드 (예를 들어, 관심 단백질의 분비는 신호 펩티드 서열에 의해 지시됨)로서 배양 배지로부터 회수하는 것이 바람직하지만, 숙주 세포 용균물로부터 회수할 수도 있다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용균물을 원심분리하여 미립자 상태의 세포 잔해를 제거한다. 이후, 폴리펩티드를 가용성 단백질 및 폴리펩티드 오염물로부터 정제하며, 적합한 정제 방법의 예는 다음과 같다: 면역친화성 또는 이온 교환 컬럼상에서의 분획화; 에탄올 침전법; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산 암모늄 침전법; 세파덱스 G-75 등을 사용한 겔 여과법; 및 IgG 등의 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼. 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF) 등의 프로테아제 억제제도 정제 동안의 단백질 가수 분해 억제에 유용할 수 있다. 추가로, 상기 관심 단백질을 관심 단백질을 정제하도록 할 수 있는 마커 서열에 프레임내 (in frame) 융합시킬 수 있다. 마커 서열의 예로는 벡터, 바람직하게는 pQE-9 벡터에 의해 제공된 것일 수 있는 헥사히스티딘 태그 및 혈구 응집소 (HA) 태그 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. HA 태그는 인플루엔자 혈구 응집소 단백질에서 유래된 에피토프에 상응한다 (예를 들면, 문헌 [Wilson et al., Cell, 37:767 (1984)] 참조). 당업자라면, 관심 폴리펩티드에 적합한 정제 방법에는 재조합 세포 배양시에 발현된 폴리펩티드의 특징 변화를 고려한 변형이 요구될 수 있음을 알 것이다.
또한, 본 발명의 숙주 세포는 G-단백질-커플링된 수용체 (GPCR) 및 다른 막횡단 단백질의 발현에도 유용하다. 이들 단백질이 발현된 경우, 이들은 이들의 천연 형태로 막에 올바르게 삽입된 것으로 고려된다. 따라서, GPCR 및 기타의 막횡단 단백질을 당업계에 공지된 방법을 통해 막 분획물의 일부로서 정제하거나 또는 막으로부터 정제할 수 있다.
추가로, 본 발명의 벡터는 분석법이 없거나 분석이 어려운 관심 단백질의 동시발현에 유용하다. 이러한 시스템에서, 관심 단백질 및 신호 단백질은 폴리시스트론 서열로 배열된다. 바람직하게는, 신호 단백질 및 관심 단백질 (예를 들면, GPCR)이 IRES 서열에 의해 분리되며, 신호 단백질 및 관심 단백질을 코딩하는 유전자는 1개의 전사 단위로서 발현된다. 본 발명은 임의의 특정 신호 단백질로 제한되지 않는다. 실제로, 수월한 분석법이 존재하는 다양한 신호 단백질을 사용할 것이 고려된다. 이들 신호 단백질로는 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 및 항체 중쇄 또는 경쇄 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 신호 단백질 및 관심 단백질이 폴리시스트론 서열로부터 동시발현되는 경우, 신호 단백질의 존재가 관심 단백질의 존재를 지시할 것이라 고려된다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 IRES에 의해 작동가능하게 연결된 신호 단백질 및 관심 단백질을 포함하는 폴리시스트론 서열을 코딩하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 상기 숙주 세포를 신호 단백질 및 관심 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 관심 단백질 발현의 간접적 검출 방법을 제공하며, 이때, 신호 단백질의 존재가 관심 단백질의 존재를 지시한다.
B. 화합물들의 활성 스크리닝
본 발명은 활성에 대한 화합물들의 스크리닝, 특히, 조합 라이브러리 (예를 들면, 104종 초과의 화합물들을 함유하는 라이브러리)로부터 화합물들의 고처리량 스크리닝하기 위한 많은 카피수의 세포주를 고려한다. 본 발명의 많은 카피수의 세포주를 다양한 스크리닝 방법에 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포를 신호 도입 후 세포-표면 수용체들의 활성화를 모니터링하는 2차 전달자 분석에 사용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 세포를 전사/번역 수준에서의 세포 반응을 모니터링하는 리포터 유전자 분석에 사용할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 세포를 외부 자극에 대한 세포의 전반적인 성장/성장 없음과 관련한 반응을 모니터링하는 세포 증식 분석에 사용할 수 있다.
2차 전달자 분석에서, 숙주 세포를 상기 기재한 바와 같이 세포 표면 수용체, 이온 채널, 세포질 수용체 또는 신호 도입에 관여하는 기타 단백질들 (예를 들면, G-단백질, 단백질 키나제 또는 단백질 포스파타제)을 코딩하는 벡터로 형질감염시키는 것이 바람직하다 (예를 들어 미국 특허 제5,670,113호, 동 제5,807,689호, 동 제5,876,946호 및 동 제6,027,875호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로도입됨). 이후에, 숙주 세포에 화합물(들) (예를 들면, 조합 라이브러리로부터의 화합물(들))을 처리하고 반응 여부를 분석한다. 조합 라이브러리의 화합물들 중 적어도 일부는 상기 벡터에 의해 코딩되는 단백질(들)의 아고니스트, 길항제, 활성화제 또는 억제제로서 기능할 수 있다고 고려된다. 또한, 조합 라이브러리의 화합물들 중 적어도 일부는 신호 도입 경로에서 상기 벡터에 의해 코딩되는 단백질의 상류 또는 하류에서 작용하는 단백질의 아고니스트, 길항제, 활성화제 또는 억제제로서 기능할 수 있다고 고려된다.
예를 들어, 막횡단 수용체와 관련된 아고니스트는 특징이 잘 규명되어 있는 여러 프로모터/인핸서 요소 (예를 들면, API, cAMP 반응 요소 (CRE), 혈청 반응 요소 (SRE) 및 활성화된 T-세포의 핵 인자 (NF-AT, Nuclear Factor of Activated T-cells))의 조정에 기능적으로 관련이 있는 것으로 공지되어 있다. Gαs커플링 수용체가 활성화된 후에, 아데닐릴 사이클라제가 자극되어 세포내 cAMP를 증가된 농도로 생산하여 단백질 키나제 A를 자극하여 CRE 결합 단백질 (CREB)을 인산화시키고, CRE 요소들이 프로모터를 유도한다. Gαi커플링 수용체는 동일한 신호 도입 성분들을 억제함으로써 CRE 활성을 감쇄시킨다. Gαq및 일부의 βγ 쌍이 포스포리파제 C (PLC)를 자극하여 이노시톨 트리포스페이트 (IP3) 및 디아실글리세롤 (DAG)이 생성된다. 세포내 칼슘의 일시적인 흐름이 칼시뉴린 및 NA-FT 뿐 아니라 칼모듈린 (CaM)-의존성 키나제 및 CREB의 유도를 촉진한다. 증가된 DAG 농도가 단백질 키나제 C (PKC) 및 엔도솜/리소좀의 산성 스핑고마이엘리나제 (aSMase)를 자극하고,aSMase 경로가 우세해지면서 NFκB 억제자 IκB의 분해를 유도할 뿐 아니라 NFκB 활성화를 유도한다. 별법의 경로에서, 성장 인자 수용체 등의 수용체가 활성화되고 Sos를 원형질막으로 동원하여 Ras가 자극되며, 이것이 세린/트레오닌 키나제 Raf를 원형질막으로 동원한다. Raf는 일단 활성화되면, MEK 키나제를 인산화하고, 이것이 MAPK 및 전사 인자 ELK를 인산화 및 활성화시킨다. ELK는 SRE 요소가 있는 프로모터로부터의 전사를 구동하여 전사 인자 Fos 및 Jun이 합성되기 때문에, AP1 부위를 활성화시킬 수 있는 전사 인자 복합체가 형성된다. 상기 기재한 경로를 구성하는 단백질 뿐 아니라 기타의 수용체, 키나제, 포스파타제 및 핵산 결합 단백질이 조합 라이브러리의 화합물들에 대한 표적일 뿐 아니라, 본 발명의 숙주 세포에서 발현시키기 위한 후보물이라고 고려된다.
몇몇 실시양태에서, 2차 전달자 분석은 막 수용체 및 이온 채널 (예를 들면, 리간드 관문 이온 채널; 문헌 [Denyer et al., Drug Discov. Today 3:323-32 (1998)], [Gonzales et al., Drug. Discov. Today 4:43139 (1999)] 참조)의 자극에 기인한 세포내 변화 (예를 들면, Ca2+농도, 막 전위, pH, IP3, cAMP, 아라키돈산 방출)에 반응한 리포터 분자들로부터의 형광 신호를 측정한다. 리포터 분자의 예로는 FRET (Florescence Resonance Energy Transfer) 시스템 (예를 들면, Cuo-지질 및 옥손올, EDAN/DABCYL), 칼슘-민감성 지시자 (예를 들면, Fluo-3, FURA 2, INDO 1 및 FLU03/AM, BAPTA AM), 염소-민감성 지시자 (예를 들면, SPQ, SPA), 칼륨-민감성 지시자 (예를 들면, PBFI), 나트륨-민감성 지시자 (예를 들면, SBFI) 및 pH-민감성 지시자 (예를 들면, BCECF) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
통상적으로, 숙주 세포에 지시자를 로딩한 후에 상기 숙주 세포를 화합물에 노출시킨다. 화합물 처리에 대한 숙주 세포의 반응은 형광 현미경검사법, 동초점 현미경검사법 (예를 들면, FCS 시스템), 유속 세포 분석법, 미세유체 디바이스, FLIPR 시스템 (예를 들어, 문헌 [Schroeder and Neagle, J. Biomol. Screening 1:75-80 (1996)) 및 플레이트-판독 시스템 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법으로 검출할 수 있다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 미지의 활성을 갖는 화합물에 의한 반응 (예를 들면, 형광 강도 증가)을 공지된 아고니스트에 의해 생성된 반응과 비교하고, 상기 공지된 아고니스트의 최대 반응에 대한 비율(％)로서 표현한다. 공지된 아고니스트에 의한 최대 반응을 100％ 반응으로 정의한다. 마찬가지로, 공지된 길항제 또는 시험 길항제를 함유하는 샘플에 아고니스트를 첨가한 후에 기록된 최대 반응은 상기 100％ 반응 보다 검출가능하게 더 낮다.
또한, 상기 세포는 리포터 유전자 분석에도 유용하다. 리포터 유전자 분석은 리포터 유전자에 대한 코딩 서열로 스플라이싱된 표적 유전자 (즉, 표적 질환의 생물학적 발병 및 기능을 조절하는 유전자)의 전사 조절 요소를 포함하는 핵산을 코딩하는 벡터로 형질감염시킨 숙주 세포의 사용을 포함한다. 따라서, 표적 유전자의 활성화는 리포터 유전자 생성물을 활성화시킨다. 본 발명에 사용할 수 있는 리포터 유전자의 예로는 클로르암페니콜 트랜스퍼라제, 알칼리성 포스파타제, 반딧불이 및 박테리아 루시퍼라제, β-갈락토시다제, β-락타마제 및 녹색 형광 단백질 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 녹색 형광 단백질을 제외한 이들 단백질의 생산은 특이적 기질 (예를 들면, X-gal 및 루시페린)의 화학발광, 비색 또는 생물발광 생성물의 사용을 통해 검출된다. 공지된 활성의 화합물과 미지의 활성의 화합물 사이의 비교는 상기 기재한 바와 같이 수행할 수 있다.
C. 변이체 단백질 활성의 비교
또한, 본 발명은 단백질들의 변이체를 생산하여 변이체들의 활성을 비교할 수 있도록 하기 위해 많은 카피수의 숙주 세포를 사용할 것을 고려한다. 몇몇 실시양태에서, 변이체는 1개의 아미노산 차이를 초래하는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)에 의해 상이하다. 다른 실시양태에서, 변이체는 다수의 아미노산 치환을 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 변이체 단백질들의 활성을 생체내 또는 세포 추출물내에서 분석한다. 다른 실시양태에서, 상기 단백질을 시험관내 정제하고 분석한다. 또한, 몇몇 실시양태에서는 변이체 단백질을 수월한 정제를 허용하는 서열 (예를 들면, his-tag 서열) 또는 리포터 유전자 (예를 들면, 녹색 형광 단백질)에 융합시키는 것이 고려된다. 단백질들의 활성은 당업계에 공지된 적당한 방법을 통해 분석할 수 있다 (예를 들면, 기질의 생성물로의 전환). 몇몇 바람직한 실시양태에서, 야생형 단백질의 활성을 결정하고, 상기 야생형 단백질들의 변이체 버전의 활성을 상기 야생형 단백질의 활성에 대한 비율(％)로서 표현한다. 추가로, 각각이 야생형 단백질의 상이한 변이체를 발현하는 복수개의 숙주 세포주를 제조함으로써 변이체 단백질들의 세포내 활성을 비교할 수 있다. 이후에, 상기 기재한 2차 전달자 분석을 위한 리포터 시스템을 사용하여 변이체 단백질들의 활성 (예를 들면, 신호 도입 경로에 관여하는 단백질들의 변이체)을 비교할 수 있다. 따라서,몇몇 실시양태에서, 아고니스트 또는 길항제에 의한 자극 또는 결합에 대한 변이체 단백질들의 직접 또는 간접적인 반응 (예를 들면, 신호 도입 경로의 하류 또는 상류 활성화를 통해)을 비교한다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 야생형 단백질의 반응을 측정하고, 야생형 단백질들의 변이체 버전의 반응을 상기 야생형 단백질의 반응에 대한 비율(％)로서 표현한다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태 및 바람직한 측면을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
하기 실험에 관한 개시 내용에서는 아래 약어들이 사용된다: M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM (마이크로몰농도); nM (나노몰농도); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); pg (피코그램); L (리터); mL (밀리리터); ㎕ (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); ℃ (섭씨); AMP (아데노신 5'-모노포스페이트); BSA (소 혈청 알부민); cDNA (카피 또는 상보성 DNA); CS (송아지 혈청); DNA (데옥시리보핵산); ssDNA (단일 가닥 DNA); dsDNA (이중 가닥 DNA); dNTP (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트); LH (황체형성 호르몬); NIH (미국 메릴랜드주 베스테다에 소재하는 미국 국립 보건원; National Institutes of Health); RNA (리보핵산); PBS (인산염 완충 염수); g (중력); OD (광학 밀도); HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]); HBS (HEPES 완충 염수); PBS (인산염 완충 염수); SDS (나트륨 도데실술페이트); Tris-HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄-하이드로클로라이드); Klenow (DNA 중합효소 I의 큰 (Klenow) 단편); rpm (분 당 회전수); EGTA (에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)N,N,N',N'-테트라아세트산); EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산); bla (β-락타마제 또는 앰피실린-내성 유전자); ORI (플라스미드 복제 기점); lacI (lac 레프레서); X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드); ATCC (미국 메릴랜드주 록크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)); GIBCO/BRL (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재); 퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer) (미국 코넥티커트주 뉴워크에 소재); 및 시그마 (Sigam) (미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴퍼니 (Sigma Chemical Company)).
실시예 1: 벡터의 제조
하기 실시예는 아래의 실험에 사용된 벡터의 제조에 관해 기재한다.
A. CMV MN14
CMV MN14 벡터 (서열 4; MN14 항체는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,874,540호에 기재되어 있음)는 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: CMV 프로모터, MN14 중쇄 신호 펩티드, MN14 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES, 소 α-락트알부민 신호 펩티드, MN14 항체 경쇄 및 MoMuLV LTR. CMV MN14 벡터는 서열 4에 기재된 서열들 뿐만 아니라 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 추가의 요소는 서열 7에 제공되어 있으며, 5' LTR은 본원에 기재된 각 구조물에서 몰로니 뮤린 육종 바이러스로부터 유래한 것이지만, 통합된 경우에는 MoMuLV 5' LTR로 전환됨)도 추가로 포함한다.
상기 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. MN14 항체의 발현은 CMV 프로모터에 의해 조절된다. MN14 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES 서열에 의해 함께 부착되어 있다. CMV 프로모터는 IRES에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생산을 지시한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질 모두가 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다. LTR 및 CMV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리아데닐화된다. 상기 구조물은 하기 <B. CMV LL2>에 기재한 바와 유사한 방법을 통해 클로닝하였다.
IRES 서열 (서열 3)은 플라스미드 pLXIN (클론테크 제품)으로부터의 IRES와 소 α-락트알부민 신호 펩티드의 융합체를 포함한다. 신호 펩티드의 최초 ATG는 IRES에 부착시켜 IRES로부터의 가장 효율적인 번역 개시를 가능하게 한다. 신호 펩티드의 3' 말단은, 임의의 관심 단백질의 부착을 수월하게 하여 신호 펩티드와의 융합 단백질을 생성하게 해주는 다중 클로닝 부위를 제공한다. IRES 서열은 번역 인핸서로서 작용할 수 있을 뿐만 아니라, 2종의 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 하는 제2의 번역 개시 부위를 생성한다.
IRES-소 α-락트알부민 신호 펩티드를 하기와 같이 제조하였다. 플라스미드 pLXIN (미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론테크 제품)에서 ECMV IRES를 함유하는 부분을 하기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다:
프라이머 1 (서열 35):
5' GATCCACTAGTAACGGCCGCCAGAATTCGC 3'
프라이머 2 (서열 36):
5' CAGAGAGACAAAGGAGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG 3'
프라이머 2는 소 α-락트알부민 신호 펩티드 코딩 영역의 출발부에 상응하는 테일을 IRES 서열에 부착시킨다. 또한, α-락트알부민 신호 펩티드의 두번째 3글자 코돈인 ATG를 GCC로 돌연변이시켜 IRES 서열로부터의 효율적인 번역을 가능하게 하였다. 이러한 돌연변이의 결과로 단백질 서열에서 메티오닌이 알라닌으로 변화되었다. 이러한 돌연변이는 IRES가 단백질쇄 중에서 두번째 아미노산으로서 알라닌을 선호하기 때문에 수행한 것이다. 생성된 IRES PCR 생성물은 단편의 5' 말단 (상기 프라이머 1의 바로 하류)에 EcoRI 부위를 함유한다.
다음으로, α-락트알부민 신호 펩티드 함유 서열을 하기 프라이머를 사용하여 α-LA 신호 펩티드 벡터 구조물로부터 PCR 증폭시켰다:
프라이머 3 (서열 14):
5' CTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCTCCTTTGTCTCTCTG 3'
프라이머 4 (서열 15):
5' TTCGCGAGCTCGAGATCTAGATATCCCATG 3'
프라이머 3은 IRES 서열의 3' 말단에 상응하는 테일을 α-락트알부민 신호 펩티드 코딩 영역에 부착시킨다. 상기 언급한 바와 같이, 소 α-락트알부민 신호 펩티드의 두번째 3글자 코돈을 돌연변이시켜 IRES 서열로부터의 효율적인 번역을가능하게 하였다. 생성된 신호 펩티드 PCR 단편은 3' 말단에 NaeI, NcoI, EcoRV, XbaI, BglII 및 XhoI 부위를 함유한다.
상기 프라이머를 사용하여 IRES 및 신호 펩티드를 개별적으로 증폭시킨 후, 2개의 반응 생성물을 혼합하고, 프라이머 1 및 프라이머 4를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 반응으로부터 생성된 생성물은 전장 α-락트알부민 신호 펩티드에 부착된 IRES를 함유하는 스플라이싱 단편이다. 신호 펩티드의 출발부를 코딩하는 ATG는 벡터 pLXIN에서 발견되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 출발부를 코딩하는 ATG와 동일한 위치에 위치시켰다. 또한, 상기 단편은 5' 말단에 EcoRI 부위를 함유하고, 3' 말단에 NaeI, NcoI, EcoRV, XbaI, BglII 및 XhoI 부위를 함유한다.
스플라이싱된 IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 PCR 단편을 EcoRI 및 XhoI으로 소화시켰다. 또한, α-LA 신호 펩티드 벡터 구조물도 EcoRI 및 XhoI으로 분해하였다. 이들 2개의 단편을 함께 라이게이션시켜 pIRES 구조물을 생성하였다.
pIRES 벡터의 IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 부분을 서열결정하여 IRES의 5' 말단에 돌연변이가 함유되어 있는 것을 확인하였다. 이들 돌연변이는 긴 스트레치의 C에서 발생하였으며, 단리된 모든 클론에서 발견되었다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, pLXIN DNA를 EcoRI 및 BsmFI으로 소화시켰다. IRES 서열의 일부에 상응하는 500 bp 밴드를 단리하였다. 또한, 돌연변이된 IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 구조물을 EcoRI 및 BsmFI으로 소화시켜 돌연변이된 IRES 단편을 제거하였다. 이어서, pLXIN으로부터의 IRES 단편으로 돌연변이된IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 구조물로부터의 IRES 단편을 치환하였다. 이어서, 생성된 플라스미드의 IRES/α-LA 신호 펩티드 부분은 DNA 서열결정에 의해 확인하였다.
생성된 구조물은 클론테크에서 얻은 pLXIN의 예상 서열과 비교했을 때 수많은 서열이 상이한 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 출원인은 클론테크에서 구입한 pLXIN의 IRES 부분을 서열결정하여 이의 서열을 확인하였다. 본 출원인이 클론테크에서 얻은 pLXIN 플라스미드에도 예상 서열과 상이한 점이 존재하는 것으로 여겨졌다. 하기 4개의 서열 차이를 확인하였다:
bp 347의 T - pLXIN 서열에서는 G였다.
bp 786-787의 ACG - pLXIN 서열에서는 GC였다.
B. CMV LL2
CMV LL2 (서열 5; LL2 항체는 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,187,287호에 기재되어 있음) 구조물은 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: 5' CMV 프로모터 (클론테크 제품), LL2 중쇄 신호 펩티드, LL2 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES, 소 α-LA 신호 펩티드, LL2 항체 경쇄 및 3' MoMuLV LTR. CMV LL2 벡터는 서열 5에 기재된 서열들 뿐만 아니라 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 추가의 요소는 서열 7에 제공되어 있음)도 추가로 포함한다.
상기 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. LL2 항체의 발현은 CMV 프로모터 (클론테크 제품)에 의해 조절된다. LL2 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES 서열에 의해 함께 부착되어 있다. CMV 프로모터는 IRES에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생산을 구동한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질 모두가 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다. LTR 및 CMV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리아데닐화된다.
IRES 서열 (서열 3)은 플라스미드 pLXIN (클론테크 제품)으로부터의 IRES와 소 α-락트알부민 신호 펩티드의 융합체를 포함한다. 신호 펩티드의 최초 ATG는 IRES에 부착시켜 IRES로부터의 가장 효율적인 번역 개시를 가능하게 하였다. 신호 펩티드의 3' 말단은, 임의의 관심 단백질의 부착을 수월하게 하여 신호 펩티드와의 융합 단백질을 생성하게 해주는 다중 클로닝 부위를 제공한다. IRES 서열은 번역 인핸서로서 작용할 수 있으며, 또한 2종의 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 하는 제2의 번역 개시 부위를 생성한다.
LL2 경쇄 유전자를 IRES α-락트알부민 신호 펩티드에 하기와 같이 부착시켰다. LL2 경쇄를 하기 프라이머를 사용하여 벡터 pCRLL2로부터 PCR 증폭시켰다:
프라이머 1 (서열 16):
5' CTACAGGTGTCCACGTCGACATCCAGCTGACCCAG 3'
프라이머 2 (서열 17):
5' CTGCAGAATAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'
이들 프라이머는 성숙 LL2 경쇄 코딩 영역의 출발부에 HincII 부위를 부가한다. PCR 생성물을 HincII로 소화시키면 5' 말단에서 성숙 LL2를 코딩하는 최초GAC로 출발하는 평활 (blunt) 말단 단편이 생성된다. 프라이머 2는 정지 코돈 바로 뒤쪽 유전자의 3' 말단에 BglII 부위를 부가한다. 생성된 PCR 생성물을 HincII 및 BglII로 소화시켜, NaeI 및 BglII로 소화시킨 IRES-신호 펩티드 플라스미드에 직접 클로닝하였다.
이어서, LL2 중쇄 유전자의 코작 (Kozak) 서열을 변형시켰다. 벡터 pCRMN14HC를 XhoI 및 AvrII로 소화시켜 약 400 bp의 단편을 제거하였다. 이어서, PCR을 사용하여 XhoI-AvrII 소화에 의해 제거된 LL2 중쇄 구조물의 동일한 부분을 증폭시켰다. 또한, 이러한 증폭은 유전자의 5' 말단을 돌연변이시켜 클론에 보다 양호한 코작 서열이 부가되도록 한다. 코작 서열은 전형적인 IgG 코작 서열과 유사하게 변형시켰다. PCR 프라이머는 하기와 같다:
프라이머 1 (서열 18):
5' CAGTGTGATCTCGAGAATTCAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT 3'
프라이머 2 (서열 19):
5' AGGCTGTATTGGTGGATTCGTCT 3'
PCR 생성물을 XhoI 및 AvrII로 소화시켜 그 전에 소화시켜 둔 플라스미드 주쇄에 다시 삽입하였다.
이어서, "양호한" 코작 서열을 경쇄 유전자에 부가하였다. "양호한" 코작 LL2 중쇄 유전자 구조물을 EcoRI으로 소화시키고, 중쇄 유전자 함유 단편을 단리하였다. IRES α-락트알부민 신호 펩티드 LL2 경쇄 유전자 구조물도 EcoRI으로 소화시켰다. 이어서, 중쇄 유전자를 IRES 경쇄 구조물의 EcoRI 부위에 클로닝하였다.그 결과, 중쇄 유전자가 IRES 서열의 5' 말단에 위치하였다.
그 후, 다중 클로닝 부위를 LNCX 레트로바이러스 주쇄 플라스미드에 부가하였다. LNCX 플라스미드를 HindIII 및 ClaI으로 소화시켰다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 생성하고 함께 어닐링시켜 이중 가닥 DNA 다중 클로닝 부위를 생성하였다. 하기 프라이머를 함께 어닐링시켰다:
프라이머 1 (서열 20):
5' AGCTTCTCGAGTTAACAGATCTAGGCCTCCTAGGTCGACAT 3'
프라이머 2 (서열 21):
5' CGATGTCGACCTAGGAGGCCTAGATCTGTTAACTCGAGA 3'
어닐링 후, 다중 클로닝 부위를 LNCX에 라이게이션시켜 LNC-MCS를 생성하였다.
그 후, 이중쇄 유전자 단편을 레트로바이러스 주쇄 유전자 구조물에 라이게이션시켰다. 상기 생성된 이중쇄 유전자 구조물을 SalI 및 BglII로 소화시키고, 이중쇄 함유 단편을 단리하였다. 레트로바이러스 발현 플라스미드 LNC-MCS를 XhoI 및 BglII로 소화시켰다. 이어서, 이중쇄 단편을 LNC-MCS 레트로바이러스 발현 주쇄에 클로닝하였다.
그 후, 상기 구조물의 RNA 스플라이싱 문제점을 교정하였다. 구조물을 NsiI으로 소화시켰다. 이어서, 생성된 단편을 EcoRI으로 부분 소화시켰다. 부분 소화로부터 생성된 약 9300 염기쌍 크기의 단편을 겔에서 정제하였다. 링커를 생성하여 LL2 중쇄 유전자의 3' 말단에서 스플라이스 공여 부위를 돌연변이시켰다. 2종의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함께 어닐링시켜 이중 가닥 DNA 링커를 형성함으로써 링커를 다시 생성하였다. 링커를 생성하기 위해 사용된 2종의 프라이머는 하기와 같다:
프라이머 1 (서열 22):
5' CGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGAAAGCCG 3'
프라이머 2 (서열 23):
5'AATTCGGCTTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCA 3'
어닐링 후, 부분 소화 동안 제거되었던 원래의 NsiI/EcoRI 단편을 링커로 치환하였다.
C. MMTV MN14
MMTV MN14 벡터 (서열 6)는 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: 5' MMTV 프로모터, 이중 돌연변이 PPE 서열, MN14 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES, 소 αLA 신호 펩티드, MN14 항체 경쇄, WPRE 서열 및 3' MoMuLV LTR. MMTV MN14 벡터는 서열 6에 기재된 서열들 뿐 아니라 MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호 및 MMTV 프로모터의 5'에 위치한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 추가의 요소는 서열 7에 제공됨)를 추가로 포함한다.
상기 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. MN14 항체의 발현은 MMTV 프로모터 (파르마샤 제품)에 의해 조절된다. MN14 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드서열 (서열 3)에 의해 함께 부착되어 있다. MMTV 프로모터는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생산을 구동한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질 모두가 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다. 또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. PPE 서열은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있으며, WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 MMTV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리아데닐화된다.
PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이시켜 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 이러한 돌연변이 서열의 2개 카피가 헤드-대-테일 배열로 사용되었다. 상기 서열은 프로모터의 바로 하류 및 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 상기 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 10배 이하로 증가된다.
D. α-LA MN14
α-LA MN14 벡터 (서열 7)는 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터, 이중 돌연변이PPE 요소, MN14 중쇄 신호 펩티드, MN14 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES/소 αLA 신호 펩티드, MN14 항체 경쇄, WPRE 서열 및 3' MoMuLV LTR.
상기 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. MN14 항체의 발현은 하이브리드 α-LA 프로모터 (서열 1)에 의해 조절된다. MN14 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열 (서열 3)에 의해 함께 부착되어 있다. α-LA 프로모터는 IRES에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생산을 구동한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질 모두가 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다.
또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. 돌연변이된 PPE 서열 (서열 2)은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있다. PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이시켜 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 이러한 돌연변이 서열의 2개 카피가 헤드-대-테일 배열로 사용되었다. 상기 서열은 프로모터의 바로 하류 및 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 상기 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 10배 이하로 증가한다. WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리아데닐화된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 알파-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 (modular) 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 출발 지점 (tsp)에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 이어서, 소 부분을 인간 부분의 말단에 부착시키며, 이는 tsp에 대해 -550 내지 -2000 위치에 상응한다. 상기 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생산을 방해하기 위해 개발된 것이다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다.
소/인간 α-락트알부민 프로모터의 제조를 위해, 인간 게놈 DNA를 단리 및 정제하였다. 인간 α-락트알부민 프로모터의 부분을 하기 2종의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다:
프라이머 1 (서열 24):
5' AAAGCATATGTTCTGGGCCTTGTTACATGGCTGGATTGGTT 3'
프라이머 2 (서열 25):
5' TGAATTCGGCGCCCCCAAGAACCTGAAATGGAAGCATCACTCAGTTTCATATAT 3'
이 2종의 프라이머는 PCR 단편의 5' 말단에 NdeI 부위를 생성하고, PCR 단편의 3' 말단에 EcoRI 부위를 생성하였다.
상기 프라이머를 사용하여 생성된 인간 PCR 단편을 제한효소 NdeI 및 EcoRI으로 이중 소화시켰다. 플라스미드 pKBaP-1도 NdeI 및 EcoRI으로 이중 소화시켰다. 플라스미드 pKBaP-1은 다중 클로닝 부위에 부착된 소의 α-락트알부민 5' 플랭킹 영역을 함유한다. 이 플라스미드는 다양한 유전자가 소의 α-락트알부민 프로모터에 부착되도록 해준다.
그 후, 인간 단편을 이중 소화 동안 pKBaP-1 플라스미드로부터 제거된 프로모터의 소 단편으로 라이게이션/치환하였다. 생성된 플라스미드는 DNA 서열결정에 의해 소 및 인간 α-락트알부민 프로모터/조절 영역의 하이브리드임을 확인하였다.
MN14 경쇄 유전자를 IRES α-락트알부민 신호 펩티드에 하기와 같이 부착시켰다. MN14 경쇄를 하기 프라이머를 사용하여 벡터 pCRMN14LC로부터 PCR 증폭시켰다:
프라이머 1 (서열 26):
5' CTACAGGTGTCCACGTCGACATCCAGCTGACCCAG 3'
프라이머 2 (서열 27):
5' CTGCAGAATAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'
이들 프라이머는 성숙 MN14 경쇄에 대한 코딩 영역의 출발부에 HincII 부위를 부가한다. PCR 생성물을 HincII로 소화시키면, 5' 말단에서 성숙 MN14를 코딩하는 최초 GAC로 출발하는 평활 말단 단편이 생성된다. 프라이머 2는 정지 코돈 바로 뒤쪽 유전자의 3' 말단에 BglII 부위를 부가한다. 생성된 PCR 생성물을 HincII 및 BglII로 소화시켜, NaeI 및 BglII로 소화된 IRES-신호 펩티드 플라스미드에 직접 클로닝하였다.
그 후, 벡터 pCRMN14HC를 XhoI 및 NruI으로 소화시켜 약 500 bp의 단편을 제거하였다. 이어서, PCR을 사용하여 XhoI-NruI 소화에 의해 제거된 MN14 중쇄 구조물의 동일한 부분을 증폭시켰다. 또한, 이러한 증폭은 유전자의 5' 말단을 돌연변이시켜 클론에 보다 양호한 코작 서열이 부가되도록 한다. 코작 서열은 전형적인 IgG 코작 서열과 유사하게 변형시켰다. PCR 프라이머는 하기와 같다.
프라이머 1 (서열 28):
5' CAGTGTGATCTCGAGAATTCAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT 3'
프라이머 2 (서열 29):
5' GTGTCTTCGGGTCTCAGGCTGT 3'
PCR 생성물을 XhoI 및 NruI로 소화시켜 그 전에 소화시켜 둔 플라스미드 주쇄에 다시 삽입하였다.
그 후, "양호한" 코작 MN14 중쇄 유전자 구조물을 EcoRI으로 소화시키고, 중쇄 유전자 함유 단편을 단리하였다. IRES α-락트알부민 신호 펩티드 MN14 경쇄 유전자 구조물도 EcoRI으로 소화시켰다. 이어서, 중쇄 유전자를 IRES 경쇄 구조물의 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 그 결과, 중쇄 유전자가 IRES 서열의 5' 말단에 위치하였다.
이어서, 다중 클로닝 부위를 LNCX 레트로바이러스 주쇄 플라스미드에 부가하였다. LNCX 플라스미드를 HindIII 및 ClaI으로 소화시켰다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 생성하고 함께 어닐링시켜 이중 가닥 DNA 다중 클로닝 부위를 생성하였다. 하기 프라이머를 함께 어닐링시켰다:
프라이머 1 (서열 30):
5' AGCTTCTCGAGTTAACAGATCTAGGCCTCCTAGGTCGACAT 3'
프라이머 2 (서열 31):
5' CGATGTCGACCTAGGAGGCCTAGATCTGTTAACTCGAGA 3'
어닐링 후, 다중 클로닝 부위를 LNCX에 라이게이션시켜 LNC-MCS를 생성하였다.
이어서, 이중쇄 유전자 단편을 레트로바이러스 주쇄 유전자 구조물에 삽입하였다. 단계 3에서 생성된 이중쇄 유전자 구조물을 SalI 및 BglII로 소화시키고, 이중쇄 함유 단편을 단리하였다. 레트로바이러스 발현 플라스미드 LNC-MCS를 XhoI 및 BglII로 소화시켰다. 그 후, 이중쇄 단편을 LNC-MCS 레트로바이러스 발현 주쇄에 클로닝하였다.
그 후, 구조물의 RNA 스플라이싱 문제점을 해결하였다. 구조물을 NsiI으로 소화시켰다. 이어서, 생성된 단편을 EcoRI으로 부분 소화시켰다. 부분 소화로부터 생성된 약 9300 염기쌍 크기의 단편을 겔에서 정제하였다. 링커를 생성하여 MN14 중쇄 유전자의 3' 말단에서 스플라이스 공여 부위를 돌연변이시켰다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함께 어닐링시켜 이중 가닥 DNA 링커를 형성함으로써 링커를 다시 생성하였다. 링커를 생성하기 위해 사용된 2종의 프라이머는 하기와 같다:
프라이머 1 (서열 32):
5' CGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGAAAGCCG 3'
프라이머 2 (서열 33):
5'AATTCGGCTTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCA 3'
어닐링 후, 부분 소화 동안 제거되었던 원래의 NsiI/EcoRI 단편을 링커로 치환하였다.
그 후, 돌연변이된 이중쇄 단편을 α-락트알부민 발현 레트로바이러스 주쇄 LN α-LA-Mertz-MCS에 삽입하였다. 상기 생성된 유전자 구조물을 BamHI 및 BglII로 소화시키고, 돌연변이된 이중쇄 유전자 함유 단편을 단리하였다. LN α-LA-Mertz-MCS 레트로바이러스 주쇄 플라스미드를 BglII로 소화시켰다. 이어서, BamHI/BglII 단편을 레트로바이러스 주쇄 플라스미드에 삽입하였다.
이어서, WPRE 요소를 유전자 구조물에 삽입하였다. 플라스미드 BluscriptII SK+ WPRE-B11을 BamHI 및 HincII로 소화시켜 WPRE 요소를 제거하고, 이 요소를 단리하였다. 상기 생성된 벡터를 BglII 및 HpaI으로 소화시켰다. WPRE 단편을 BglII 및 HpaI 부위에 라이게이션시켜 최종 유전자 구조물을 생성하였다.
E. α-LA Bot
α-LA Bot (서열 8, 보툴리눔 독소 항체) 구조물은 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터, 돌연변이 PPE 요소, cc49 신호 펩티드, 보툴리눔 독소 항체 경쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES/소 αLA 신호 펩티드, 보툴리눔 독소 항체 중쇄, WPRE 서열 및 3' MoMuLV LTR. 또한, α-LA 보툴리눔 독소 항체 벡터는 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 추가의 요소는서열 7에 제공됨)를 추가로 포함한다.
상기 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. 보툴리눔 독소 항체의 발현은 하이브리드 α-LA 프로모터에 의해 조절된다. 보툴리눔 독소 항체 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열에 의해 함께 부착되어 있다. 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터는 IRES에 의해 부착된 경쇄 유전자 및 중쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생산을 구동한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질 모두가 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다.
또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. 돌연변이된 PPE 서열 (서열 2)은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있다. PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이시켜 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 이러한 돌연변이 서열의 2개 카피가 헤드-대-테일 배열로 사용되었다. 상기 서열은 프로모터의 바로 하류 및 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 상기 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 10배 이하로 증가한다. WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리아데닐화된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 α-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 출발 지점에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 이어서, 소 부분을 인간 부분의 말단에 부착시키며, 이는 tsp에 대해 -550에서 -2000 위치에 상응한다. 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생산을 방해하기 위해 개발된 것이다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다. 마찬가지로, 상기 구조물은 소에는 존재하지만 인간에는 존재하지 않는 조절 요소들을 함유한다.
F. LSRNL
LSRNL (서열 9)은 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 바이러스 패키징 신호, B형 간염 바이러스 표면 항원, RSV 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 3' MoMuLV LTR.
상기 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 B형 간염 바이러스 표면 항원 유전자의 생산을 조절한다. 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 발현은 RSV 프로모터에 의해 조절된다. LTR 및 RSV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리아데닐화된다.
G. α-LA cc49IL2
α-LA cc49IL2 (서열 10; cc49 항체는 미국 특허 제5,512,443호, 제5,993,813호 및 제5,892,019호에 기재되어 있음, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨) 구조물은 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: 5' 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터, cc49-IL2 코딩 영역 및 3' MoMuLV LTR. 이 유전자 구조물은 인터루킨-2에 부착된 단쇄 항체 cc49의 융합 단백질을 발현한다. 융합 단백질의 발현은 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터에 의해 조절된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 알파-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 출발 지점에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 이어서, 소 부분을 인간 부분의 말단에 부착시키며, 이는 tsp에 대해 -550에서 -2000 위치에 상응한다. 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생산을 방해하기 위해 개발된 것이다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다. 마찬가지로, 상기 구조물은 소에는 존재하지만 인간에는 존재하지 않는 조절 요소들을 함유한다. 3' 바이러스 LRT은 mRNA에 대한 폴리아데닐화 서열을 제공한다.
H. α-LA YP
α-LA YP (서열 11) 구조물은 5'에서 3' 순서로 배열된 하기 요소들을 포함한다: 5' 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터, 이중 돌연변이 PPE 서열, 소 αLA 신호 펩티드, 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis) 항체 중쇄 Fab 코딩 영역, EMCV IRES/소 α-LA 신호 펩티드, 예르시니아 페스티스 항체 경쇄 Fab 코딩영역, WPRE 서열 및 3' MoMuLV LTR.
이 유전자 구조물은 예르시니아 페스티스 마우스 Fab 항체의 발현을 초래할 것이다. 이 유전자 구조물의 발현은 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터에 의해 조절된다. PPE 서열 및 WPRE 서열은 핵으로부터 세포질로의 mRNA 이동을 보조한다. IRES 서열은 중쇄 및 경쇄 유전자 모두가 동일한 mRNA로부터 번역되도록 한다. 3' 바이러스 LRT은 mRNA에 대한 폴리아데닐화 서열을 제공한다.
또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. 돌연변이된 PPE 서열 (서열 2)은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있다. PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이 (서열 2의 염기 4, 112, 131 및 238이 G에서 T로 변화됨)시켜 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 이러한 돌연변이 서열의 2개 카피가 헤드-대-테일 배열로 사용되었다. 상기 서열은 프로모터의 바로 하류 및 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 상기 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 10배 이하로 증가한다. WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리아데닐화된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 알파-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 출발 지점에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 이어서, 소 부분을 인간 부분의 말단에 부착시키며, 이는 tsp에 대해 -550에서 -2000 위치에 상응한다. 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생산을 방해하기 위해 개발된 것이다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다. 마찬가지로, 상기 구조물은 소에는 존재하지만 인간에는 존재하지 않는 조절 요소들을 함유한다.
실시예 2: MoMLV gag 및 pol 단백질을 안정하게 발현하는 세포주의 생선
실시예 2 내지 실시예 5는 슈도형 레트로바이러스 벡터의 제조에 관해 기재한다. 이들 방법은 통상적으로 상기 기재한 벡터의 제조에 적용될 수 있다. 세포 표면에서의 융합 생성 VSV G 단백질의 발현은 합포체 형성 및 세포 사멸을 초래한다. 따라서, 막-결합 단백질로서 VSV G 단백질을 함유하는 레트로바이러스 입자를 제조하기 위해서 2단계 접근법을 채택하였다. 먼저, MoMLV로부터의 gag 및 pol 단백질을 높은 수준으로 발현하는 안정한 세포주를 생성하였다 (예를 들어, 293GPSD세포). gag 및 pol 단백질을 발현하는 안정한 세포주는 막-결합 단백질 (예를 들어, 외피 단백질)이 결여된 비감염성 바이러스 입자를 생산한다. 이어서, 인산칼슘 침전법을 사용하여 상기 안정한 세포주를 VSV-G 및 관심 플라스미드 DNA로 동시형질감염시켰다. 생성된 슈도형 벡터를 사용하여 293GPSD세포를 감염시킴으로써안정하게 형질전환된 세포주를 생성하였다. 안정한 세포주는 VSV G 단백질의 발현을 높은 수준으로 지시할 수 있는 플라스미드로 일시적 형질감염될 수 있다 (하기 참조). 일시적으로 형질감염된 세포는 VSV G-슈도형 레트로바이러스 벡터를 생산하며, 이는 생산 세포가 합포체 형성으로 인해 사멸하기 전에 3 내지 4일에 걸쳐 세포로부터 수집될 수 있다.
VSV G-슈도형 레트로바이러스 벡터의 생성시 MoMLV gag 및 pol 단백질을 발현하는 안정한 세포주를 생성하는 제1 단계는 아래에 기재되어 있다. 인간 아데노바이러스 Ad-5-형질감염된 배아 신장 세포주 293 (ATCC CRL 1573)을 pCMVgag-pol및 플레오마이신 코딩 유전자와 동시형질감염시켰다. pCMVgag-pol은 CMV 프로모터의 조절을 받는 MoMLVgag및pol유전자를 함유한다 (pCMVgag-pol은 ATCC로부터 이용가능함).
플라스미드 DNA를 인산칼슘 동시침전법 [Graham and Van der Eb, Virol. 52:456 (1973)]을 사용하여 293 세포에 도입하였다. 대략 5 ×105개의 293 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 1일 후에 DNA 동시침전물을 첨가하였다. 안정한 형질전환체는 10％ FCS 및 10 ㎍/mL 플레오마이신을 함유하는 DMEM-고 글루코스 배지 (선택 배지)에서의 성장에 의해 선별하였다. 선택 배지에서 성장하는 콜로니를 역전사효소 활성 [Goff et al., J. Virol. 38:239 (1981)] 및 세포내 p30gag 발현에 대해 스크리닝하였다. p30gag 발현의 존재는 염소-항 p30 항체 (NCI 항혈청 77S000087)를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 측정하였다. 레트로바이러스 유전자를 안정하게 발현하는 클론을 선별하였다. 이 클론을 293GPSD(293 gag-pol-San Diego)라 명명하였다. 인간 Ad-5-형질전환된 배아 신장 세포주 293의 유도체인 293GPSD세포주를 10％ FCS를 함유하는 DMEM-고 글루코스 배지에서 배양하였다.
실시예 3: VSV의 G 당단백질을 보유하는 슈도형 레트로바이러스 벡터의 제조
VSV G 단백질 슈도형 레트로바이러스를 제조하기 위해 하기 단계들을 채택하였다. 293GPSD세포주를 VSV-G 플라스미드 및 관심 DNA 플라스미드로 동시형질감염시켰다. 이 동시형질감염은 293GPSD세포를 감염시켜 패키징 세포주 생산에 사용되는 감염성 입자를 생성한다. 본 실시예는 슈도형 LNBOTDC 바이러스의 제조에 관해 기재한다. 이러한 통상적인 방법을 사용하여 실시예 1에 기재된 임의의 벡터를 제조할 수 있다.
a) 세포주 및 플라스미드
패키징 세포주인 293GPSD를 10％ FCS를 함유하는 알파-MEM-고 글루코스 배지에서 배양하였다. 슈도형 바이러스의 역가는 208F 세포 [Quade, Virol. 98:461 (1979)] 또는 NIH/3T3 세포 (ATCC CRL 1658)를 사용하여 측정하였으며, 208F 및 NIH/3T3 세포는 10％ CS를 함유하는 DMEM-고 글루코스 배지에서 배양하였다.
플라스미드 LNBOTDC는 사이토메갈로바이러스 IE 프로모터의 전사 조절을 받는 BOTD 코딩 유전자 및 그 뒤쪽에서 LTR 프로모터의 조절을 받는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (Neo) 코딩 유전자를 함유한다. 플라스미드 pHCMV-G는 인간 사이토메갈로바이러스 IE 프로모터의 조절을 받는 VSV G 유전자를 함유한다 [Yee et al., Meth. Cell Biol. 43:99 (1994)].
b) 안정한 패키징 세포주, 슈도형 벡터의 제조 및 슈도형 LNBOTDC 벡터의 역가 측정
LNBOTDC DNA (서열 13)을 pHCMV-G DNA와 함께 패키징 세포주인 293GPSD에 동시형질감염시켜 LNBOTDC 바이러스를 제조하였다. 이어서, 생성된 LNBOTDC 바이러스를 사용하여 293GPSD세포를 감염시켜 상기 세포를 형질전환시켰다. 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 제조하는 절차를 하기와 같이 수행하였다 [Yee et al., Meth. Cell Biol. 43:99 (1994)].
레트로바이러스 유전자 구조물은 감염성 복제-결함 레트로바이러스 벡터의 생성시 상기 서열의 관심 세포로의 삽입을 초래할 것이다. 삽입된 CMV 조절 서열은 보툴리눔 독소 항체 중쇄 및 경쇄 유전자의 발현을 조절한다. IRES 서열은 중쇄 및 경쇄 유전자 둘 다가 동일한 mRNA로부터 번역되도록 한다. 3' 바이러스 LRT은 mRNA에 대한 폴리아데닐화 서열을 제공한다.
보툴리눔 독소 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 단백질 모두가 이 신호 mRNA로부터 생성된다. 이 2개의 단백질이 결합하여 보툴리눔 독소 항체를 형성한다. 또한, 중쇄 및 경쇄 단백질은 서로에 대해 동등한 몰비로 형성되는 것으로 여겨진다.
간단하게 말하자면, 제1일에 대략 5 ×104개의 293 GPSD세포를 75 cm2조직배양 플라스크에 넣었다. 그 다음날 (제2일), 293GPSD세포를 표준 인산칼슘 동시침전법 [Graham and Van der Eb, Virol. 52:456 (1973)]을 사용하여 pLNBOTDC 플라스미드 25 ㎍ 및 VSV-G 플라스미드 DNA 25 ㎍으로 형질감염시켰다. 플라스미드 DNA는 10 내지 40 ㎍ 사용할 수 있다. 293GPSD세포는 24시간이 넘게 조직 배양 플레이트에 견고하게 부착되어 있을 수 있기 때문에, 293GPSD세포를 형질감염 48시간 전에 75 cm2플라스크에 넣을 수도 있다. 형질감염된 293GPSD세포는 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 제공한다.
제3일에, 대략 1 ×105개의 293GPSD세포를 75 cm2조직 배양 플라스크에 넣고, 24시간 후에 형질감염된 293GPSD세포로부터 슈도형 바이러스를 수거하였다. 제4일에, pLNBOTDC 및 VSV-G DNA를 투여한지 48시간 후에 배양 배지를 형질감염된 293GPSD세포로부터 수거하였다. 배양 배지를 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 폴리브렌을 최종 농도 8 ㎍/mL로 첨가하였다. LNBOTDC 바이러스를 함유하는 배양 배지를 사용하여 하기와 같이 293GPSD세포를 감염시켰다. 배양 배지를 293GPSD세포로부터 제거하고, LNBOTDC 바이러스를 함유하는 배양 배지로 교체하였다. 폴리브렌을 배지에 첨가한 후에 이를 세포에 첨가하였다. 바이러스 함유 배지를 293GPSD세포 상에서 24시간 동안 방치하였다. 감염 16시간 후 (제5일), 배지를 293GPSD세포로부터 제거하고, 400 ㎍/mL의 G418 (GIBCO/BRL 제품)을 함유하는 신선한 배지로 교체하였다. 대략 2주 후에 G418-내성 콜로니가 나타날 때까지 배지를 매 3일 마다 교체하였다.
G418-내성 콜로니를 96-웰에 단일 세포로서 플레이팅하였다. 60개 내지 100개의 G418-내성 콜로니를 BOTDC 항체의 발현에 대해 스크리닝하여 생산성이 높은 콜로니를 찾아냈다. 96-웰 플레이트의 상위 콜로니 10개를 6-웰 플레이트에 옮기고 조밀해질 때까지 성장시켰다.
이어서, 상위 콜로니 10개를 확장시켜 높은 역가 생산성에 대해 스크리닝하였다. 단백질 발현 및 역가 생산성에 기초하여, 5개의 클론 세포주를 선별하였다. 하나의 세포주를 주 세포 은행 (master cell bank)으로 지정하고, 다른 4개의 세포주를 예비 (backup) 세포주로 지정하였다. 슈도형 벡터를 하기와 같이 생성하였다. 대략 1 ×106개의 293GPSD/LNBOTDC 세포를 75 cm2조직 배양 플라스크에 넣었다. 24시간 후, 세포를 인산칼슘 동시침전법을 사용하여 pHCMV-G 플라스미드 DNA 25 ㎍으로 형질감염시켰다. 칼슘-DNA 침전물을 세포에 적용한지 6 내지 8시간 후, DNA 용액을 신선한 배양 배지 (G418 결여)로 대체하였다. 보다 긴 형질감염 시간 (하룻밤)은 대부분의 293GPSD/LNBOTDC 세포를 플레이트에서 떨어뜨리기 때문에 피하였다. 형질감염된 293GPSD/LNBOTDC 세포는 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 생산한다.
형질감염된 293GPSD/LNBOTDC 세포로부터 생산된 슈도형 LNBOTDC 바이러스는형질감염 후 24 내지 96시간 사이에 1일 1회 이상 수거할 수 있다. 가장 높은 바이러스 역가는 최초 pHCMV-G 형질감염 후 대략 48 내지 72시간에 생성되었다. 대부분의 형질감염 세포에서 형질감염된지 약 48시간 후에 합포체 형성이 가시화되는 한편, 세포는 이 세포가 조직 배양 플레이트에 부착된 채로 남아 있기만 하면 추가로 48시간 이상 동안 슈도형 바이러스를 계속 생산하였다. VSV G-슈도형 LNBOTDC 바이러스를 함유하는, 수집된 세포 배양물을 모아 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, -80℃에서 보관하거나 즉시 농축한 후 -80℃에 보관하였다.
이어서, VSV G-슈도형 LNBOTDC 바이러스의 역가를 하기와 같이 측정하였다. 대략 5 ×104개의 래트 208F 섬유아세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅한지 24시간 후에, 폴리브렌 8 ㎍/mL의 존재 하에 세포를 LNBOTDC 바이러스-함유 배양 배지의 연속 희석액으로 감염시켰다. 바이러스로 감염시킨지 24시간 후, 배지를 400 ㎍/mL의 G418을 함유하는 신선한 배지로 교체하고, G418-내성 콜로니가 가시화될 때까지 14일 동안 계속 선별하였다. 전형적으로, 바이러스 역가는 0.5 내지 5.0 ×106콜로니 형성 단위 (CFU)/mL이었다. 바이러스 스톡의 역가는 하기와 같이 109CFU/mL을 초과하는 역가로 농축될 수 있었다.
실시예 4: 슈도형 레트로바이러스 벡터의 농축
VSV G-슈도형 LNBOTDC 바이러스를 1회의 초원심분리에 의해 높은 역가로 농축시켰다. 그러나, 추가의 농축을 위해 초원심분리를 2회 수행할 수도 있다. 실시예 2에 기재한 바와 같이 수집되고 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 함유하는 냉동된배양 배지를 37℃ 수조에서 해동시킨 후, 미리 오토클레이빙에 의해 멸균시켜 둔 오크리지 (Oakridge) 원심분리 튜브 (밀봉 캡이 있는 50 mL 용량의 오크리지 튜브; 날지 넌크 인터내셔널 (Nalge Nunc International) 제품)로 옮겼다. 바이러스를 4℃에서 JA20 로터 (벡크만 (Beckmann) 제품)에서 120분 동안 48,000 ×g로 침강시켰다. 이어서, 생물안전성 (biosafety) 후드에서 배양 배지를 튜브로부터 제거하고, 튜브에 남아있는 배지를 흡인하여 상층액을 제거하였다. 바이러스 펠렛을 배양 배지 DMEM의 원래 부피의 0.5 내지 1％로 재현탁시켰다. 재현탁된 바이러스 펠렛을 교반하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 바이러스 펠렛은 밤새 인큐베이션 후에 피펫을 완만하게 사용하여 감염성 바이러스의 상당한 손실없이 분산시킬 수 있었다. 바이러스 스톡의 역가는 초원심분리 1회 후에 통상 100배 내지 300배 증가하였다. 감염성 바이러스의 회수 효율은 30 내지 100％ 사이로 다양하였다.
이어서, 바이러스 스톡을 저속 미세원심분리기 중 4℃에서 5분 동안 저속 원심분리하여, 임의의 가시적인 세포 잔해 또는 상기 조건하에서 재현탁되지 않은 응집된 비리온을 제거하였다. 바이러스 스톡이 난모세포 또는 배자 내로 주입하는 데 사용되지 않는다면, 이 원심분리 단계를 생략할 수 있음을 알아야 한다.
바이러스 스톡을 더욱 농축시키기 위해, 다른 횟수로 상기 바이러스 스톡을 초원심분리할 수 있다. 제1회 원심분리로부터의 재현탁시킨 바이러스를 모아, 상기와 같이 수행되는 제2회 초원심분리에 의해 펠렛화시킨다. 바이러스 역가는 제2회 초원심분리 후에 대략 2000배 증가하였다 (전형적으로, 슈도형 LNBOTDC 바이러스의 역가는 제2회의 초원심분리 후에 1×109CFU/mL 이상임).
원심분리 전 및 후의 유체에 대한 역가는 208F 세포를 감염 (NIH 3T3 또는 소 유방 상피 세포도 사용될 수 있음)시킨 후에 실시예 2에 기재된 바와 같이 G418-내성 콜로니를 선별하여 측정하였다.
실시예 5: 숙주 세포의 감염을 위한 슈도형 레트로바이러스의 제조
농축된 슈도형 레트로바이러스를 0.1 ×HBS (2.5 mM HEPES, pH 7.12, 14 mM NaCl, 75 μM Na2HPO4-H2O)에 재현탁시키고, 분취액 18 ㎕을 0.5 mL 바이알 (에펜도르프 (Eppendorf) 제품)에 넣어 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 농축된 바이러스의 역가는 농축된 바이러스 1 ㎕를 0.1 ×HBS로 10-7또는 10-8배 희석하여 측정하였다. 이어서, 희석된 바이러스 용액을 사용하여 208F 및 소 유방 상피 세포를 감염시키고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 바이러스 역가를 측정하였다.
실시예 6: 숙주 세포에 의한 MN14의 발현
본 실시예는 다수의 통합 벡터로 형질감염된 세포로부터 항체 MN14의 생산에 관해 기재한다. 슈도형 벡터를 하기 벡터에 대한 패키징 세포주로부터 제조하였다: CMV MN14, α-LA MN14 및 MMTV MN14. 래트 섬유아세포 (208F 세포), MDBK 세포 (소 신장 세포) 및 소 유방 상피 세포를 감염 다중도 1000으로 형질감염시켰다. 1000개의 세포를 T25 플라스크에 플레이팅하고, 배지 3 mL 중 106콜로니 형성 단위 (CFU)의 벡터를 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 감염 기간은 24시간이었고, 그 후에 배지를 교체하였다. 형질감염 후, 세포가 조밀해질 때까지 성장시켰다.
세포주를 T25 플라스크에서 조밀해질 때까지 성장시키고, 배지 5 mL을 매일 교체하였다. 상기 배지를 MN14 존재에 대해 매일 분석했다. 생산된 모든 MN14는 활성이였고 (인간 IgG를 검출하기 위한 ELISA로 CEA 결합 ELISA와 정확히 동일한 값을 얻음), 웨스턴 블럿은 중쇄 및 경쇄가 대략 1 : 1의 비율로 생산되는 것으로 나타났다. 또한, 비-변성 웨스턴 블럿은 항체 복합체의 대략 100％ 올바르게 형성되었음을 지시했다 (도 1 참조, 레인 1: 대조군 MN14 1.85 ng; 레인 2: 소 유방 세포주, α-LA 프로모터; 레인 3: 소 유방 세포주, CMV 프로모터; 레인 4: 소 신장 세포주, α-LA 프로모터; 레인 5: 소 신장 세포주, CMV 프로모터; 레인 6: 208 세포주, α-LA 프로모터; 레인 7: 208 세포주, CMV 프로모터).
도 2는 4가지 세포주에 대해 시간에 따른 MN14의 생산량을 나타내는 그래프이다. Y축은 배지 1 mL 당 MN14의 생산량 (ng)을 나타낸다. X축은 실험을 위한 배지 수집일을 나타낸다. 4 세트의 데이타를 그래프로 나타냈다. CMV 프로모터와 α-LA 프로모터 및 208 세포와 소 유방 세포를 비교했다. 소 유방 세포주의 발현량이 가장 높았으며, 그 다음은 208F 세포 및 MDBK 세포였다. 구조물에 관해서는, CMV 유도 구조물의 발현 수준이 가장 높았으며, 그 다음은 α-LA 유도 유전자 구조물 및 MMTV 구조물이었다. 제2주에, CMV 구조물의 1일 생산 수준은 배지 1 mL 당 4.5 ㎍ (T25 플라스크에서 22.5 mg/일)이었다. 이후의 발현 수준은, 세포가 그 후의 주간에 걸쳐 매우 밀집하여 조밀해짐에 따라 40 ㎍/일로 서서히 증가하였다. α-lac-MN14 패키징 세포주로부터의 배지 2.7 L를 친화성 크로마토그래피로 프로세싱하여 MN14의 정제 스톡을 제조하였다.
도 3은 MN14 항체의 중쇄와 경쇄를 분리하기 위해 변성 조건하에서 운행한 15％ SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블럿이다. 레인 1은 소 유방 세포주, 하이브리드 α-LA 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 2는 소 유방 세포주, CMV 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 3은 소 신장 세포주, 하이브리드 α-LA 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 4는 소 신장 세포주, CMV 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 5는 래트 섬유아세포 세포주, 하이브리드 α-LA 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 6은 래트 섬유아세포, CMV 프로모터로부터의 MN14를 나타낸다. 상기 도 1과 일치하게, 이 결과는 중쇄 및 경쇄가 대략 1 : 1의 비율로 생산됨을 나타낸다.
실시예 7: 세포 당 생산된 단백질의 정량
본 실시예는 본 발명에 따라 생산된 세포 배양물 중 세포 당 생산된 단백질량의 정량에 관해 기재한다. 다양한 세포 (208F 세포, MDBK 세포 및 소 유방 세포)를 25 cm2배양 디쉬에 1000개 세포/디쉬로 플레이팅했다. 상기 3종의 세포 유형에 3종의 상이한 벡터 (CMV-MN14, MMTV-MN14 및 α-LA-MN14)를 MOI 1000 (역가: 각각 2.8 ×106, 4.9 ×106및 4.3 ×106)로 감염시켰다. 대략 매 24시간 마다 모든 세포로부터 배지를 수집했다. 1개월 동안 배지를 수집한 후에, 208F 및 MDBK 세포는 건강 상태가 불량하고 MN14 발현량이 낮아 버렸다. 소 유방 세포를 T25 플라스크로 계대 배양하고 대략 2개월 동안 이로부터의 배지를 계속 수집하였으며, 이 동안 MN14는 계속 발현되었다. T25 플라스크에서의 2개월 후에, CMV 프로모터를 함유하는 상기 세포는 MN14를 22.5 pg/세포/일로 생산했고 α-LA 프로모터를 함유하는 세포는 2.5 pg MN14/세포/일로 생산했다.
T25 플라스크에서의 2개월 후에, 롤러병 (850 cm2)에 접종하여 생산 규모를 확장시켰으며 다수의 계대 배양 후에도 MN14 발현이 안정한지 여부를 측정했다. 2개의 롤러병에 CMV 프로모터로부터 MN14를 발현하는 소 유방 세포를 접종하고 2개의 롤러병에 α-LA 프로모터로부터 MN14를 발현하는 소 유방 세포를 접종했다. 배양물은 대략 2주 후에 조밀해졌고, 계속 MN14를 발현했다. 롤러병 발현량을 하기 표 1에 나타냈다:
실시예 8: 여러 감염 다중도에서의 형질감염
본 실시예는 여러 감염 다중도에서의 형질감염이 단백질 발현량에 미치는 효과에 관해 기재한다. 208F 래트 섬유아세포 및 소 유방 상피 세포 (BMEC)를 25 cm2플레이트에 여러 세포수/25 cm2로 플레이팅했다. CFU 수치를 일정하게 유지하고 감염될 세포수는 변화시켜, CMV MN14 벡터 또는 αLA MN14 벡터를 MOI 1, 10, 1000 및 10,000으로 세포에 감염시켰다.
감염시킨 후에, 모든 세포로부터 대략 2개월 동안 대략 매 24시간 마다 배지를 매일 바꾸고 수집했다. 소 유방 상피 세포에서 상기 2종의 벡터 모두의 결과를 하기 표 2에 나타냈다. 데이타가 없는 세포는 실험 완료 전에 감염되버린 배양물임을 지시한다. "# 세포" 줄은 실험 종결시의 세포수를 나타낸다. 이 결과는 1일 당 생산된 단백질량 및 총 축적량 둘다의 측면에서 MOI가 높을 수록 MN14 생산량이 증가한다는 것을 지시한다:
실시예 9: 여러 감염 다중도에서의 형질감염
본 실험은 다양한 MOI 값에서 CMV MN14 벡터로부터의 단백질 생산량에 관하여 기재한다. 소 유방 세포, CHO 세포 및 인간 배자 신장 세포 (293 세포)를 24-웰 플레이트 (2 cm2)에 100개 세포/2 cm2웰로 플레이팅했다. 세포를 다양한 희석률의 CMV MN14로 감염시켜 MOI 값 1, 10, 100, 1000 및 10000을 얻었다. CHO 세포는 감염시킨지 11일 이내에 모든 MOI에서 조밀해졌다. 그러나, MOI 10,000으로 감염시킨 세포는 더욱 느리게 성장했다. 소 유방 세포 및 293 세포는 더 느리게 성장했으며, 특히 가장 높은 MOI 10,000에서 더욱 느리게 성장했다. 이어서, 상기 세포를 T25 플라스크로 계대 배양하여 세포들을 분산시켰다. 세포들은 분산시킨후 1주일 이내에 조밀해졌다. 1주일 후에 배지를 수집하고 MN14 생산량에 대해 분석했다. CHO 및 인간 293 세포는 배양을 연장했을 때 양호하게 성장하지 않았다. 따라서, 이들 세포의 데이타는 수집하지 않았다. 소 유방 상피 세포에 대한 데이타를 하기 표 3에 나타냈다. 이 결과는 MOI가 높을 수록 MN14 생산량이 증가한다는 것을 지시한다:
실시예 10: 소 유방 세포에 의한 LL2 항체의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에 의한 LL2 항체의 발현에 관해 기재한다. 소 유방 세포에 벡터 CMV LL2 (7.85 ×107CFU/mL)를 MOI 1000 및 10,000으로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. MOI 10,000으로 형질감염시킨 경우에는 어떠한 세포도 생존하지 않았다. 20％ 조밀할 때, 배지 중에는 LL2 250 ng/mL이 존재했다.
실시예 11: 소 유방 세포에 의한 보툴리눔 독소 항체의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 보툴리눔 독소 항체의 발현에 관해 기재한다. 소 유방 세포를 벡터 α-LA Bot (2.2 ×102CFU/mL)로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. 100％ 조밀할 때, 배지 중에는 보툴리눔 독소 항체 6 ng/mL이 존재했다.
실시예 12: 소 유방 세포에 의한 B형 간염 바이러스 표면 항원의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBSAg)의 발현에 관해 기재한다. 소 유방 세포를 벡터 LSRNL (350 CFU/mL)로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. 100％ 조밀할 때, 배지 중에는 HBSAg 20 ng/mL이 존재했다.
실시예 13: 소 유방 세포에 의한 cc49IL2 항원 결합 단백질의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 cc49IL2의 발현에 관해 기재한다. 소 유방 세포에 벡터 cc49IL2 (3.1 ×105CFU/mL)를 MOI 1000으로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. 100％ 조밀할 때, 배지 중에는 cc49IL2 10 ㎍/mL이 존재했다.
실시예 14: 소 유방 세포에 의한 여러 단백질들의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 여러 단백질들의 발현에 관해 기재한다. MN14를 생산하는 유방 세포 (CMV-MN14 벡터로 감염됨)에 벡터 cc49IL2 (3.1 ×105CFU/mL)를 MOI 1000으로 감염시키고, 1000개 세포를 25 cm2배양 플레이트에 플레이팅했다. 100％ 조밀할 때, 상기 세포는 MN14를 2.5 ㎍/mL로 발현하고 cc49IL2를 5 ㎍/mL로 발현했다.
실시예 15: 소 유방 세포에 의한 여러 단백질들의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 여러 단백질들의 발현에 관해 기재한다. MN14를 생산하는 유방 세포 (CMV-MN14 벡터로 감염됨)를 LSNRL 벡터 (100 CFU/mL)를 MOI 1000으로 감염시키고, 1000개 세포를 25 cm2배양 플레이트에 플레이팅했다. 100％ 조밀할 때, 상기 세포는 MN14를 2.5 ㎍/mL로 발현하고 간염 바이러스 표면 항원을 150 ng/mL로 발현했다.
실시예 16: 소 유방 세포에 의한 여러 단백질들의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 여러 단백질들의 발현에 관해 기재한다. B형 간염 바이러스 표면 항원을 생산하는 유방 세포 (LSRNL 벡터로 감염됨)에 cc49IL2 벡터를 MOI 1000으로 감염시키고, 1000개 세포를 25 cm2배양 플레이트에 플레이팅했다. 100％ 조밀할 때, 상기 세포는 MN14를 2.4 ㎍/mL로 발현하고 B형 간염 바이러스 표면 항원을 13 ng/mL로 발현했다. 여러 단백질들이 상기 기재한 다른 세포주에서 발현될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 17: 소 유방 세포에서 B형 간염 바이러스 표면 항원 및 보툴리눔 독소 항체의 발현
본 실시예는 롤러병에서 형질감염된 세포의 배양에 관해 기재한다. 208F 세포 및 소 유방 세포를 25 cm2배양 디쉬에 1000개 세포/25 cm2로 플레이팅했다. 각각의 세포주에 LSRNL 또는 α-LA Bot 벡터를 MOI 1000으로 감염시켰다. 1개월 동안 배양하고 배지를 수집한 후에, 208F 세포는 성장 및 플레이팅이 불량하여 버렸다. 마찬가지로, α-LA Bot로 감염시킨 소 유방 세포는 단백질 발현량이 낮아 버렸다. LSRNL로 감염시킨 소 유방 세포를 롤러병 (850 cm2)에 접종하여 계대 배양했다. 롤러병 배양물 중에는 B형 간염 바이러스 표면 항원이 대략 20 ng/mL으로 생산되었다.
실시예 18: 단일 클론에서 선택된 세포주에서의 발현
본 실험은 단일 클론에서 선택된 세포주로부터 MN14의 발현에 관해 기재한다. 세포주를 T25 플라스크에서 조밀해질 때까지 성장시키고 배지 5 mL을 매일 수집했다. 상기 배지를 MN14 존재에 대해 매일 분석했다. 생산된 모든 MN14는 활성이었고, 웨스턴 블럿은 중쇄 및 경쇄가 거의 정확하게 1 : 1인 것으로 여겨지는 비율로 생산되었음을 지시했다. 또한, 비-변성 웨스턴 블럿은 항체 복합체의 대략 100％가 올바르게 형성되었음을 지시했다. 세포를 약 2개월 동안 배양한 후에 롤러병으로 연장시키거나 단일 세포 클론으로서 96-웰 플레이트에 플레이팅했다.
롤러병에서의 MN14 생산량을 24시간 동안 분석하여 추가로 배지를 교체한 경우의 생산량이 매주 배지를 교체한 경우에 수득되는 양 보다 증가되었는지 여부를 측정했다. 3회의 24시간을 조사했다. 850 cm2롤러병 중 CMV 프로모터 세포는 제1일에 909 ng/mL을 생산했고, 제2일에는 1160 ng/mL을 생산했으며, 제3일에는 1112ng/mL을 생산했다. α-LA 프로모터 세포는 제1일에 401 ng/mL을 생산했고, 제2일에는 477 ng/mL을 생산했으며, 제3일에는 463 ng/mL을 생산했다. 이들 값은 CMV 세포에 대해 얻은 8 내지 10 mg/mL/주 및 α-LA 세포에 대해 얻은 2 내지 3 mg/mL에 잘 상응했다. 더욱 빈번한 배지 교체가 롤러병에서의 MN14 생산량을 증가시키는 것으로 여겨지지는 않는다.
단일 세포주를 96-웰 플레이트에 수립한 후에 동일한 웰로 계대 배양하여, 세포들을 조밀해질 때까지 성장시켰다. 일단 세포가 조밀해졌으면, 이들을 24시간의 기간에 걸쳐 MN14 생산량에 대해 분석했다. CMV 세포주로부터 MN14의 클론 생산량 범위는 19 ng/mL/일 내지 5500 ng/mL/일이었다. 모든 세포 클론들의 평균 생산량은 1984 ng/mL/일이었다. α-LA 세포 클론에서도 유사한 결과를 얻었다. α-LA 세포주로부터 MN14의 클론 생산량 범위는 1 ng/mL/일 내지 2800 ng/mL/일이었다. 이들 세포 클론들의 평균 생산량은 622 ng/mL/일이었다. 이 결과를 하기 표 4에 나타냈다:
실시예 19: 삽입체 카피수의 추정
본 실시예는 감염 다중도, 유전자 카피수 및 단백질 발현량의 관계에 관해 기재한다. INVADER 분석 시스템 (미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 써드 웨이브 테크놀로지스 (Third Wave Technologies) 제품)을 사용하여 3가지 DNA 분석법을 개발했다. 이들 분석법 중 제1 분석법은 소 α-락트알부민 5' 플랭킹 영역의 일부를 검출한다. 이 분석법은 소에 특이적이며 돼지 또는 인간 α-락트알부민 유전자는 검출되지 않는다. 이 분석법은 모든 대조군 소 DNA 샘플 뿐 아니라 소 유방 상피 세포에서도 α-락트알부민 유전자 카피를 2개 검출할 것이다. 제2 분석법은 MLV바이러스로부터의 연장된 패키징 영역의 일부를 검출한다. 이 분석법은 상기 영역에 특이적이며 293 인간 세포주, 소 유방 상피 세포주 또는 소 DNA 샘플에서의 신호는 검출되지 않는다. 이론적으로, MLV로 감염되지 않은 모든 세포주 또는 다른 샘플은 신호를 내서는 안된다. 그러나, 293GP 세포주가 DNA의 연장된 패키징 영역을 생산하기 때문에, 상기 세포주는 분석이 운행되는 신호를 제공한다. 초기 분석으로부터, 293GP 세포주는 상기 분석법에 의해 검출되는 연장된 패키징 영역 서열의 카피를 2개 함유하는 것으로 여겨졌다. 제3 분석은 대조군 분석이었다. 이 분석은 소, 돼지, 인간 및 수많은 다른 종에서 동일한 인슐린-유사 성장 인자 I 유전자의 일부분을 검출한다. 이것을 모든 샘플에 대한 대조군으로 사용하여, 2개 카피의 유전자에 대해 샘플로부터 생성된 신호량을 측정했다. 시험된 모든 샘플들은 대조군 유전자 카피를 2개 함유해야 한다.
DNA 샘플은 수많은 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 그 후에, 각 샘플에 대해 2가지 분석을 수행한다. 소 α-락트알부민 분석 또는 연장된 패키징 영역 분석을 사용하여 대조군 분석을 수행한다. 샘플 및 필요한 정보의 유형은 어떤 분석법을 운행하느냐에 따라 결정될 것이다. 대조군 및 트랜스진 검출 분석 모두가 동일한 DNA 샘플상에서 정확히 동량의 DNA로 운행된다.
상기 분석으로부터 생성된 데이타는 다음과 같다 (계수 (counts)는 임의의 형광 단위를 지시함):
-연장된 패키징 영역 또는 α-락트알부민 백그라운드 (background) 계수
-연장된 패키징 영역 또는 α-락트알부민 계수
-내부 대조군 백그라운드 계수
-내부 대조군 계수
분석에 대한 알짜 계수를 계산하기 위해서, 실제적인 계수로부터 백그라운드 계수를 뺀다. 이는 대조군 및 트랜스진 검출 분석 모두에 해당된다. 일단 알짜 계수가 얻어지면, 트랜스진 검출 분석을 위한 알짜 계수 : 대조군 분석의 알짜 계수의 비율을 산출할 수 있다. 이 값은 내부 대조군 유전자 (이 경우에는, IGF-I)의 카피수와 비교한 트랜스진의 카피수를 지시한다. 트랜스진 검출 분석 및 대조군 분석이 2개의 완전히 상이한 분석이기 때문에, 이들은 정확하게 일치하지는 않는다. 이는 특정 샘플 내 트랜스진의 카피가 2개 존재하고 대조군 유전자의 카피가 2개 존재하는 경우, 정확한 1 : 1 비율을 얻을 수 없음을 의미한다. 그러나, 상기 값은 통상적으로 1 : 1 비율에 가깝다. 또한, 트랜스진에 대한 삽입 부위가 상이하여 트랜스진 분석이 삽입 위치에 따라 상이하게 거동될 수도 있다.
따라서, 상기 비율은 카피수에 대한 정확한 측정치는 아니지만, 샘플들 사이의 상대적인 카피수를 양호하게 지시한다. 상기 비율의 값이 클수록, 트랜스진의 카피수는 증가한다. 따라서, 가장 낮은 등급부터 가장 높은 등급까지 샘플들의 등급을 통해 카피수와 관련하여 샘플들을 서로와 매우 정확하게 비교할 수 있다. 표 5는 EPR 분석에 대한 실제 데이타를 제공한다:
이러한 데이타로부터, 293 세포주가 연장된 패키징 영역/트랜스진의 카피는 갖지 않음을 알 수 있다. 그러나, 293 GP 세포는 연장된 패키징 영역을 2개 카피 함유하는 것으로 여겨진다. 다른 3종의 세포주는 연장된 패키징 영역을 3개 이상의 카피 (293GP 세포의 경우에 비해 1개 이상의 추가의 카피를 함유함)로 함유하는 것으로 여겨진다.
INVADER 분석 유전자 비율 및 세포주의 단백질 생산량
소 유방 상피 세포를 CMV 구동된 MN14 구조물 또는 α-락트알부민 구동된 MN14 구조물로 감염시켰다. 상기 세포를 1000 : 1의 벡터 : 세포 비율로 감염시켰다. 상기 감염된 세포를 연장시켰다. 이러한 초기에 모은 세포 집단으로부터 α-LA 및 CMV를 함유하는 세포에 대해 클론 세포주를 수립하였다. 각 유전자 구조물마다 대략 50개의 세포주가 생산되었다. 개개의 세포들을 96-웰 플레이트에 플레이팅한 후에, 동일한-웰로 계대 배양하여 세포들이 조밀해질 때까지 성장시켰다.일단 세포주들이 조밀해지면, 이들을 24시간의 기간에 걸쳐 MN14 생산량에 대해 분석했다. CMV 세포주로부터 MN14의 클론 생산량 범위는 0 ng/mL/일 내지 5500 ng/mL/일이었다. 모든 세포 클론들의 평균 생산량은 1984 ng/mL/일이었다. α-LA 세포 클론에서도 유사한 경향이 나타났다. α-LA 세포주로부터 MN14의 클론 생산량 범위는 0 ng/mL/일 내지 2800 ng/mL/일이었다. 이들 세포 클론들의 평균 생산량은 622 ng/mL/일이었다.
이들 클론 세포주들을 추가로 분석하기 위해서, 15개의 CMV 클론 및 15개의 α-LA 클론을 선별했다. 5개는 가장 높은 수준으로 발현하는 것을 선별하였고, 5개는 낮은 수준으로 발현하는 것을 선별하였으며, 5개는 중간 수준으로 발현하는 것을 선별하였다. 이들 30개 세포주를 연장시켜 뱅킹 (bank)했다. 30개 세포주의 거의 모두에서 DNA를 단리했다. 세포주를 6-웰 플레이트로 계대 배양하여 조밀해질 때까지 성장시켰다. 일단 조밀해지면, 배지를 매 24시간 마다 교체하였고, 각 세포주로부터 2개씩의 별도 수집물을 MN14 생산량에 대해 분석했다. 이들 2개씩의 분석 결과의 평균을 내고 이 값을 사용하여 하기 표 6 및 표 7을 만들었다. 상기 세포주로부터의 DNA를 INVADER 연장된 패키징 영역 분석에 사용하여 결과를 하기에 나타냈다. 하기의 표는 세포주 번호, 상응하는 유전자 비율 및 항체 생산량을 나타낸다:
도 17 및 도 18의 그래프는 단백질 발현 및 INVADER 분석 유전자 비율 사이를 비교한 것이다. 이 결과는 INVADER 분석 유전자 비율과 단백질 생산량 사이에 직접적인 상관관계가 존재함을 지시한다. 또한, 단백질 생산량은 최대치에 도달하지 않은 것으로 여겨지며, INVADER 분석 유전자 비율이 더 높은 세포가 생산되는 경우에는 단백질 생산량이 더 높아질 것이다.
INVADER 분석 유전자 비율 및 여러 세포주의 감염
상기 기재한 방법으로 생산된 2가지 패키징 세포주 (293GP)를 사용하여 복제-결함 레트로바이러스 벡터를 생산했다. 세포주 중 하나는 CMV 프로모터로부터 보툴리눔 독소 항체 유전자를 발현하는 레트로바이러스 유전자 구조물 (LTR-연장된 바이러스 패키징 영역-Neo 유전자-CMV 프로모터-Bot 경쇄 유전자-IRES-Bot 중쇄 유전자-LTR)을 함유하며, 다른 세포주는 CMV 프로모터로부터 YP 항체 유전자를 발현하는 레트로바이러스 유전자 구조물 (LTR-연장된 바이러스 패키징 영역-Neo 유전자-CMV 프로모터-YP 중쇄 유전자-IRES-YP 경쇄 유전자-WPRE-LTR)을 함유하는 것이었다. 이들 세포주 각각은 복제-결함 레트로바이러스 벡터를 생산할 수 있을 뿐만 아니라 보툴리눔 독소 항체 또는 YP 항체를 생산할 수 있다.
이어서, 이들 세포주로부터 생산된 벡터로 모(母) 세포주를 재감염시켰다. 이러한 방법은 유전자 삽입체의 수를 증가시키고 이들 세포주로부터의 항체 생산을 개선시키기 위해 수행한 것이다. 보툴리눔 독소 모 세포주를 연속 3일 동안 벡터의 새로운 분취물로 감염시켰다. 감염 수행에 사용된 벡터의 역가는 1 ×108CFU/mL이었다. 최종 24시간 감염이 완료된 후에, 세포에 대한 클론 선별을 수행하고, 보툴리눔 독소 항체 생산에 대해 가장 많은 단백질을 생산하는 세포주를 수립하였다. YP 모 세포주에 대해 유사한 방법을 수행하였다. 이 세포주 역시 연속 3일 동안 벡터의 새로운 분취물로 감염시켰다. 감염 수행에 사용된 YP 벡터 분취물의 역가는 1 ×104이었다. 최종 24시간 감염이 완료된 후에, 세포에 대한 클론 선별을 수행하고, YP 생산에 대해 가장 많은 단백질을 생산하는 세포주를 수립하였다.
각각의 모 세포주 및 딸 생산 세포주를 연장된 패키징 영역 분석을 사용하여 INVADER 유전자 비율에 대해 조사하였고, 단백질 생산량을 조사하였다. 가장 높은 역가의 벡터를 사용하여 생성된 Bot 생산 세포주의 유전자 비율이 가장 높았다.또한, 이는 단백질 생산량도 가장 높아서, 유전자 카피수가 단백질 생산량에 비례한다는 것을 다시 한번 제안하였다. 또한, YP 생산 세포주도 유전자 비율이 높을 수록 이의 모 세포주 보다 더욱 많은 단백질을 생산하여, 유전자 카피수의 증가가 단백질 생산량 증가와 직접 관련이 있음을 다시 한번 제안하였다. 이 데이타를 표 8에 제시했다:
세포주 INVADER 유전자 비율 항체 생산량 (Bot/YP)
Bot 모 세포주 1.12 4.8 mg/mL
Bot 생산 세포주 3.03 55 mg/mL
YP 모 세포주 1.32 4 mg/mL
YP 생산 세포주 2.04 25 mg/mL
실시예 20: 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질감염
본 실시예는 렌티바이러스 벡터의 생산 및 숙주 세포를 감염시키는데 이들을 높은 감염 다중도로 사용하는 것에 관해 기재한다. 복제-결함 바이러스 입자는 293T 인간 신장 세포에서 미국 특허 제6,013,516호에 기재된 플라스미드의 일시적인 동시형질감염에 의해 생산된다. 표준 분자 생물학 방법에 따라, 모든 플라스미드를 형질전환시키고, 대장균 HB101 박테리아에서 성장시켰다. 진핵 세포의 형질감염을 위해서, 플라스미드 DNA를 CsCl-에티듐 브로마이드 구배 중에서의 평형 원심분리를 통해 2회 정제했다. 10 cm 디쉬 중 배양물의 형질감염에 다음과 같은 비율로 총 40 ㎍의 DNA를 사용했다: pCMVΔR8 10 ㎍, pHR 20 ㎍ 및env플라스미드 10 ㎍ (MLV/Ampho, MLV/Eco 또는 VSV-G). 293T 세포를 10％ CO2인큐베이터에서 10％ 소태아 혈청 및 항생제를 보충한 DMEM 중에서 성장시켰다. 세포를 1.3 ×106/10 cm 디쉬의 밀도로 플레이팅하고, 1일 후에 형질감염시켰다. 배양 배지를 교체하고 4 내지 6시간 후에 형질감염시켰다. 문헌 [Chen and Okayama (Mol. Cell. Biol., 7:2745, 1987)의 방법에 따라 인산칼슘-DNA 복합체를 제조하여 5％ CO2분위기에서 상기 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 다음날 아침, 배지를 교체하고 배양물을 10％ CO2에 다시 넣었다. 형질감염 48 내지 60시간 후에 조건화 배지를 수거하고, 저속 원심분리 (300 ×g, 10분)를 통해 세포 잔해를 제거하였고, 이를 0.45 ㎛의 낮은 단백질 결합 필터를 통해 여과했다.
벡터 입자를 농축하기 위해서, 상기 기재한 바와 같이 수거하여 모은 조건화 배지를 PBS 중 20％ 수크로스 용액의 완충물 최상층에 깔고, 벡크만 SW28 로터를 사용하여 50,000 ×g에서 90분 동안 원심분리했다. 펠렛을 인큐베이션하고 PBS 1 내지 4 mL 중에서 30 내지 60분 동안 피펫을 완만하게 사용하여 재현탁시킨 후에, 50,000 ×g에서 90분 동안 벡크만 SW55 로터로 다시 원심분리했다. 펠렛을 PBS의 최소 부피 (20 내지 50 ㎕) 중에 재현탁하고 이를 직접 감염에 사용하거나 또는 -80℃에 냉동된 분취물로서 저장했다.
농축된 렌티바이러스 벡터의 역가를 측정하고, 이를 사용하여 적당한 세포주 (예를 들면, 293 세포, Hela 세포, 래트 208F 섬유아세포)를 감염 다중도 1,000으로 형질감염시켰다. 외인성 단백질을 발현하며 단일 클론에서 선택된 세포주를 분석하여 선택된 세포주의 일부가 상기 벡터의 통합된 카피를 2개 초과로 함유한다는것을 밝혀냈다. 이들 세포주는 통합된 벡터의 카피를 오직 1개만 함유하는 세포주 보다 외인성 단백질을 더 많이 생산할 것이다.
실시예 21: G-단백질-커플링된 수용체의 발현 및 분석
본 실시예는 레트로바이러스 벡터로부터 G-단백질-커플링된 수용체 단백질 (GPCR) 발현에 관해 기재한다. 또한, 본 실시예는 분석하기 어려운 단백질 또는 GPCR 등과 같이 분석법이 없는 단백질의 발현에 대한 마커로서 IRES로부터의 신호 단백질 발현에 관해 기재한다. 상기 유전자 구조물 (서열 34, 도 19)은 pLBCX 레트로바이러스 주쇄의 MCS에 클로닝된 G-단백질-커플링된 수용체 다음에 IRES-신호 펩티드-항체 경쇄를 포함한다. 간단하게 말하자면, GPCR-IRES-항체 경쇄를 함유하는 PvuII/PvuII 단편 (3057 bp)을 pLBCX의 StuI 부위에 클로닝했다. pLBCX는 pLNCX로부터의 네오마이신 내성 유전자 대신 EM7 (T7) 프로모터, 블라스티시딘 유전자 및 SV40 polyA를 함유한다.
상기 유전자 구조물을 사용하여 복제-결함 레트로바이러스 패키징 세포주를 제조하고, 이 세포주를 사용하여 복제-결함 레트로바이러스 벡터를 제조했다. 이어서, 이 세포주로부터 제조한 벡터로 293GP 세포 (인간 배아 신장 세포)를 감염시켰다. 감염 후에, 상기 세포를 블라스티시딘 선별하에 두고, 단일 세포 블라스티시딘 내성 클론을 단리했다. 상기 클론들을 항체 경쇄의 발현에 대해 스크리닝했다. 경쇄 발현 클론으로 최상위 12개를 선별했다. 이어서, 리간드 결합 분석을 사용하여, 이들 경쇄 발현 클론 12개를 GPCR의 발현에 대해 스크리닝했다. 모든 12개 샘플은 역시 수용체 단백질을 발현했다. 클론 세포주 및 이들의 발현을 표 9에 나타냈다:
실시예 22: 복제-결함 레트로바이러스 벡터를 사용한 293 세포의 감염 다중도
본 실시예는 레트로바이러스 벡터를 사용한 여러회의 연속 형질감염에 관해 기재한다. 하기의 유전자 구조물을 사용하여 복제-결함 레트로바이러스 패키징 세포주를 제조했다.
5' LTR = 몰로니 뮤린 육종 바이러스 5' 장쇄 말단 반복서열
EPR = 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 연장된 패키징 영역
Blast = 블라스티시딘 내성 유전자
CMV = 인간 사이토메갈로바이러스 IE 프로모터.
유전자 = 시험 단백질을 코딩하는 유전자
WPRE = RNA 수송 요소
3' LTR = 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 3' LTR
이어서, 이 패키징 세포주를 사용하여 하기와 같이 배열된 복제-결함 레트로바이러스 벡터를 제조했다. T150 플라스크에서 성장시킨 세포로부터 벡터를 제조하여 냉동시켰다. 각각의 감염시에 상기 냉동된 벡터를 해동시켰다. 감염물 #3의 경우에는 벡터 농축 용액을 사용하여 감염을 수행했다. 모든 다른 감염은 농축되지 않은 벡터를 사용하여 수행했다. 감염은 벡터/배지 용액 5 mL을 30％ 조밀한 293 세포를 함유하는 T25 플라스크에 넣어 대략 5개월의 기간에 걸쳐 수행되었다. 또한, 감염 동안 폴리브렌 8 mg/mL도 벡터 용액에 넣었다. 상기 벡터 용액을 24시간 동안 세포상에 둔 채로 방치한 후에 제거했다. 이어서, 배지 (10％ 소태아 혈청을 함유하는 DMEM)를 상기 세포에 첨가했다. 세포가 완전히 조밀해질 때까지 성장시키고 새로운 T25 플라스크로 계대 배양했다. 이어서, 세포를 30％ 조밀해질 때까지 성장시키고, 상기 감염 방법을 반복했다. 이 방법을 12회 동안 반복하였으며, 하기 표 10에 요약했다. 1, 3, 6, 9 및 12회 감염시킨 후에는 계대 배양 후에 방치해 둔 세포를 사용하여 DNA 샘플을 수득했다. INVADER 분석을 사용하여 상기 DNA를 분석하여, 감염 절차 동안 다양한 감염 회수 후의 세포에서 벡터 삽입체 수의 추정치를 결정했다. 이 결과는 벡터 삽입체 수가 시간에 따라 증가하여 12회째의 감염 후에는 최고 수준에 도달하였음을 지시했다. 세포 당 하나의 벡터 삽입체 카피수의 대략적인 평균 값이 0.5이기 때문에, 12회 감염 후의 평균 벡터 삽입체 카피수는 2에 도달했다. 이들 데이타는 세포 당 평균 벡터 카피수가 세포 당 1.5개 카피 보다 약간 미만임을 지시한다. 또한, 감염물 #6 내지 감염물 #9에서의 유전자 카피수는 사실상 변화가 없었다. 추가로, 이들 데이타는 표준의 낮은 감염 다중도로 수행한 형질감염은 레트로바이러스 벡터의 카피를 세포에 1개 초과로 도입하는데 실패했음을 지시한다:
실시예 23: YP 항체의 생산
본 실시예는 소 유방 상피 세포 및 인간 신장 섬유아세포 세포 (293 세포)에 의한 예르시니아 페스티스 항체의 생산을 증명한다. 세포주를 α-LA YP 벡터로 감염시켰다. 두가지 세포주 모두가 YP 항체를 생산했다. 모든 항체가 활성이었으며, 중쇄 및 경쇄는 거의 1 : 1의 비율로 생산되었다.
실시예 24: 식물 원형질체의 형질도입
본 실시예는 식물 원형질체의 형질도입 방법에 관해 기재한다. 니코티아나 타바쿰 c.v. 페티트 하반나 (Nicotiana tabacumc.v. Petit Havanna)의 담배 원형질체를 담배 현탁 배양물로부터 통상의 방법에 따라 제조했다 [Potrykus and Shillito, Methods in Enzymology, vol. 118, Plant Molecular Biology, eds. A. and H. Weissbach, Academic Press, Orlando, 1986]. 6-주된 발아 (shoot) 배양물로부터 완전하게 폴딩되지 않은 잎들을 멸균 조건하에 제거하고, 다음 조성의 효소 용액으로 완전히 적셨다: 효소 용액 - H2O 70 mL; 수크로스 13 g; 마세로자임 (macerozyme) R10 1 g; 셀룰라제 2 g; "오노주까 (Onozuka)" R10 (일본 얄쿨트 코포레이션 리미티드 (Yalcult Co. Ltd.) 제품) 드리셀라제 (Drisellase) (스위스 케미쉐 파브릭 슈바이쩌할레 (Chemische Fabrik Schweizerhalle) 제품) 0.13 g; 및 2(n-모르폴린)-에탄술폰산 (MES) 0.5 mL (pH 6.0).
이어서, 잎을 1 내지 2 cm 크기의 정사각형으로 잘라내고, 상기 정사각형을 상기 언급한 효소 용액에 띄워두었다. 이들을 26℃의 온도에서 어두운 상태로 밤새 인큐베이션했다. 이어서, 이 혼합물을 완만하게 진탕시키고 소화가 완료될 때까지 30분 더 인큐베이션시켰다.
이어서, 상기 현탁액을 메쉬 폭이 100 ㎛인 강철체를 통해 여과하고 0.6 M 수크로스 (MES, pH 5.6)로 완전히 헹군 후에 10분 동안 4000 내지 5000 rpm에서 원심분리했다. 상기 원형질체를 배지 표면에 수집한 후에, 예를 들어 멸균된 주사용실린지를 사용하여 원형질체 밑에서부터 배지를 제거하였다.
상기 원형질체를 0.4 M 수크로스를 함유하는 K3배지 (수크로스 (102.96 g/L; 크실로스 (0.25 g/L); 2,4-디클로로페녹시아세트산 (0.10 mg/L); 1-나프틸아세트산 (1.00 mg/L); 6-벤질아미노퓨린 (0.20 mg/L); pH 5.8) [Potrykus and Shillito, 상기 문헌] 중에 재현탁했다.
형질전환 실험을 수행하기 위해서, 먼저 상기 원형질체를 모두 세척하고 계수한 후에 단리된 원형질체의 높은 생존율을 보장하는 W5배지 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2×2H20, 5 mM KCl, 5 mM 글루코스, pH 5.6) 중에 1 mL 당 1 내지 2.5 ×106개 세포의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 30분 동안 6 내지 8℃에서 인큐베이션시킨 후에, 상기 원형질체를 사용하여 형질도입 실험을 수행했다.
상기 원형질체를 식물 특이적 프로모터에 의해 구동되는 관심 단백질을 코딩하는 슈도형 레트로바이러스 벡터 (예를 들면, 렌티바이러스 벡터)에 노출시켰다. 벡터를 상기 기재한 바와 같이 제조하고, 이를 MOI 1,000으로 사용했다. 이어서, 상기 원형질체를 신선한 K3배지 중에 재현탁시켰다 (신선한 K3배지 10 mL 중 원형질체 용액 0.3 mL). 10 cm 직경 페트리 디쉬 중 10 mL 분획을 24℃에서 어두운 상태로 추가로 인큐베이션시켰고, 이때의 집단 밀도는 1 mL 당 4 내지 8 ×104개 원형질체였다. 3일 후에, 배양 배지를 디쉬 당 K3배지 0.3 부피부로 희석하고, 24℃ 및 인공광 3000 lux에서 4일 동안 더 인큐베이션시켰다. "비드형 (bead-type)" 배양 방법 [Shillito, et al., Plant Cell Reports, 2, 244-247 (1983)]에 따라, 총 7일 후에는 상기 원형질체로부터 발생한 클론을 50 mg/L 카나마이신을 함유하는 영양분 배지 중에 넣고 1％ 아가로스로 고형화시켜 묻고, 24℃에서 어두운 상태로 배양했다. 영양분 배지를 매 5일 마다 신선하게 제조한 동량의 동일한 영양분 용액으로 교체했다. 클론 분석은 관심 유전자가 발현되었음을 지시했다.
실시예 25: 세포주에서 벡터 삽입체의 시간 경과에 대한 안정성
LN-CMV-Bot 벡터의 유전자 삽입체를 함유하는 2종의 세포주를 네오마이신 선별이 있거나 없이, 상기 벡터 삽입체를 수많은 계대에 걸쳐 유지하는 능력에 대해 분석하였다. 제1 세포주는 삽입체 카피를 낮은 수로 함유하는 소 유방 상피 세포주였다. 제2 세포주는 벡터 삽입체 카피를 다수 함유하는 293GP 세포주였다. 실험을 시작할 때, 세포 배양물을 분할하였다. 소 유방 상피 세포의 경우에는 계대 10이었으며, 293GP 세포의 경우에는 계대 8이었다. 한 샘플은 네오마이신 유사체 G418을 함유하는 배지 중에서 연속적으로 계대 배양하였고, 다른 배양물은 임의의 항생제 없는 배지 중에서 연속적으로 계대 배양하였다. 매 3 내지 6 계대 마다 세포를 수집하고 DNA를 단리하여 INVADER 분석을 사용하여 유전자 비율을 측정했다. 세포를 T25 플라스크에서 연속적으로 성장시키고 계대 배양하였다. 이 분석 결과를 하기에 나타냈다:
이들 데이타는 G418을 처리한 세포와 항생제를 처리하지 않은 세포 사이의 유전자 비율에서 일관된 차이가 없음을 나타낸다. 이는 G418 선별이 벡터 유전자 삽입체의 안정성 유지에 필요하지 않음을 제안하는 것이다. 또한, 이들 벡터 삽입체는 시간 경과에 대해 매우 안정한 것으로 여겨진다.
본 명세에서 언급한 모든 간행물 및 특허 문헌들은 본원에 참고로 도입된다. 당업자라면, 본 발명의 범위와 사상에서 벗어나지 않고도 본 발명에서 기재한 방법 및 시스템을 다양하게 변형 및 변화킬 수 있을 것이다. 본 발명을 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 기재하였으나, 청구된 본 발명이 이러한 특정 실시양태에 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 분자 생물학, 단백질 발효, 생화학 또는 관련 분야의 전문가에게는 명백한, 본 발명의 수행을 위해 기재한 방식들의 다양한 변형법이 하기 청구의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

Claims (102)

  1. 프로모터에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 외인성 유전자를 포함하는 통합된 통합 벡터를 2개 이상 포함하는 게놈을 포함하는 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 통합 벡터가 상기 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 통합 벡터가 상기 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 RNA 안정화 요소를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 통합 벡터가 2종 이상의 외인성 유전자를 포함하는 것인 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자가 폴리시스트론 서열로 배열된 것인 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자가 1개 이상의 내부 리보솜 결합 부위에 의해 분리되어 있는 것인 숙주 세포.
  7. 제5항에 있어서, 상기 2종의 외인성 유전자가 폴리시스트론 서열로 배열된 것인 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 2종의 외인성 유전자가 이뮤노글로불린 분자의 중쇄 및 이뮤노글로불린 분자의 경쇄를 코딩하는 것인 숙주 세포.
  9. 제4항에 있어서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자 중 하나가 선택가능한 마커인 숙주 세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 통합 벡터가 레트로바이러스 벡터인 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 슈도형 (pseudotyped) 레트로바이러스 벡터인 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 슈도형 레트로바이러스 벡터가 G 당단백질을 포함하는 것인 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 G 당단백질이 수포성 구내염 바이러스, 피리 바이러스, 칸디푸라 바이러스, 카르프 바이러스의 스프링 바이러스혈증 (Spring viremia) 및 모콜라 바이러스의 G 당단백질로 구성된 군에서 선택된 것인 숙주 세포.
  14. 제10항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 MoMLV, MoMuSV 및 MMTV의 장쇄 말단 반복서열로 구성된 군에서 선택된 장쇄 말단 반복서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
  15. 제11항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 HIV 및 말 감염성 빈혈 바이러스의 장쇄 말단 반복서열로 구성된 군에서 선택된 장쇄 말단 반복서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
  17. 제1항에 있어서, 시험관내 및 생체내 배양 시스템으로 구성된 군에서 선택된 배양 시스템 중에 존재하는 것인 숙주 세포.
  18. 제1항에 있어서, 차이니스 햄스터 난소 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 소 유방 상피 세포로부터 선택된 것인 숙주 세포.
  19. 제1항에 있어서, 단일 클론에서 (clonally) 유래한 것인 숙주 세포.
  20. 제1항에 있어서, 단일 클론에서 유래한 것이 아닌 숙주 세포.
  21. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 10 계대 초과 동안 안정한 것인 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 상기 게놈이 50 계대 초과 동안 안정한 것인 숙주 세포.
  23. 제21항에 있어서, 상기 게놈이 100 계대 초과 동안 안정한 것인 숙주 세포.
  24. 제1항에 있어서, 상기 통합된 외인성 유전자가 선별하지 않아도 (in the absence of selection) 안정한 것인 숙주 세포.
  25. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 알파-락트알부민 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스의 장쇄 말단 반복서열로 구성된 군에서 선택된 것인 숙주 세포.
  26. 제1항에 있어서, 상기 1종 이상의 외인성 유전자가 항원 결합 단백질, 제약 단백질, 키나제, 포스파타제, 핵산 결합 단백질, 막 수용체 단백질, 신호 도입 단백질, 이온 채널 단백질 및 종양단백질 (oncoprotein)을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 것인 숙주 세포.
  27. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 통합된 통합 벡터를 3개 이상 포함하는 것인 숙주 세포.
  28. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 통합된 통합 벡터를 4개 이상 포함하는 것인 숙주 세포.
  29. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 통합된 통합 벡터를 5개 이상 포함하는 것인 숙주 세포.
  30. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 통합된 통합 벡터를 7개 이상 포함하는 것인 숙주 세포.
  31. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 통합된 통합 벡터를 10개 이상 포함하는 것인 숙주 세포.
  32. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 통합된 통합 벡터를 20개 이상 포함하는 것인 숙주 세포.
  33. 제1항에 있어서, 상기 게놈이 통합된 통합 벡터를 1000개 이상 포함하는 것인 숙주 세포.
  34. 제1항에 있어서, 제1 외인성 유전자를 포함하는 제1 통합 벡터의 통합된 카피를 2개 이상 추가로 포함하고 제2 외인성 유전자를 포함하는 제2 통합 벡터의 통합된 카피를 1개 이상 추가로 포함하는 숙주 세포.
  35. 제1항에 있어서, 상기 외인성 단백질을 1일 당 약 10 pg 초과로 발현하는 숙주 세포.
  36. 1) a) 게놈을 포함하는 숙주 세포 및 b) 복수개의 통합 벡터를 제공하는 단계, 및
    2) 상기 숙주 세포를 2개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 숙주 세포의 형질감염 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 조건이 숙주 세포를 감염 다중도 10 초과로 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 조건이 숙주 세포를 감염 다중도 약 10 내지 1000으로 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 숙주 세포를 3개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 것인 방법.
  40. 제36항에 있어서, 상기 숙주 세포를 4개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 것인 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 숙주 세포를 5개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 것인 방법.
  42. 제36항에 있어서, 상기 숙주 세포를 7개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 것인 방법.
  43. 제36항에 있어서, 상기 숙주 세포를 10개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 것인 방법.
  44. 제36항에 있어서, 상기 통합 벡터가 프로모터에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 외인성 유전자를 포함하는 것인 방법.
  45. 제36항에 있어서, 상기 통합 벡터가 상기 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  46. 제36항에 있어서, 상기 통합 벡터가 상기 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 RNA 안정화 요소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  47. 제36항에 있어서, 상기 통합 벡터가 2종 이상의 외인성 유전자를 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자가 폴리시스트론 서열로 배열된 것인 방법.
  49. 제36항에 있어서, 상기 통합 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 슈도형 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 G 당단백질을 포함하는 슈도형 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
  53. 제36항에 있어서, 상기 숙주 세포가 차이니스 햄스터 난소 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 소 유방 상피 세포로부터 선택된 것인 방법.
  54. 제36항에 있어서, 형질감염된 숙주 세포를 단일 클론에서 선택하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  55. 제36항에 있어서, 숙주 세포를 각각이 상이한 외인성 유전자를 포함하는 2종 이상의 통합 벡터로 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  56. 1) 관심 단백질을 코딩하며 프로모터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자를 포함하는 1종 이상의 통합 벡터의 통합된 카피를 2개 이상 포함하는 게놈을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계, 및
    2) 상기 숙주 세포를 상기 관심 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계
    를 포함하는, 관심 단백질의 생산 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 통합 벡터가 상기 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  58. 제56항에 있어서,
    3) 상기 관심 단백질을 단리하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 조건이 롤러병 배양, 관류 배양, 배치식 공급 (batch fed) 배양 및 페트리 디쉬 배양으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  60. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포의 게놈이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 3개 초과로 포함하는 것인 방법.
  61. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포의 게놈이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 4개 초과로 포함하는 것인 방법.
  62. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포의 게놈이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 5개 초과로 포함하는 것인 방법.
  63. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포의 게놈이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 7개 초과로 포함하는 것인 방법.
  64. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포의 게놈이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 10개 초과로 포함하는 것인 방법.
  65. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포의 게놈이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 약 2개 내지 20개 포함하는 것인 방법.
  66. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포의 게놈이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 약 3개 내지 10개 포함하는 것인 방법.
  67. 제56항에 있어서, 상기 통합 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 슈도형 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
  70. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포가 차이니스 햄스터 난소 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 소 유방 상피 세포로부터 선택된 것인 방법.
  71. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 관심 단백질을 1일 당 약 1 pg 초과로 합성하는 것인 방법.
  72. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 관심 단백질을 1일 당 약 10 pg 초과로 합성하는 것인 방법.
  73. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 관심 단백질을 1일 당 약 50 pg 초과로 합성하는 것인 방법.
  74. 제56항에 있어서, 상기 숙주 세포가 단일 클론에서 선택된 것인 방법.
  75. 1) a) 관심 단백질을 코딩하며 프로모터에 작동가능하게 연결된 외인성 유전자를 포함하는 1종 이상의 통합 벡터의 통합된 카피를 2개 이상 포함하는 게놈을 포함하는 숙주 세포 및 b) 1종 이상의 시험 화합물을 제공하는 단계,
    2) 상기 숙주 세포를 상기 관심 단백질이 발현되는 조건하에 배양하는 단계,
    3) 상기 숙주 세포에 상기 1종 이상의 시험 화합물을 처리하는 단계, 및
    4) 상기 시험 화합물에 대한 숙주 세포의 반응 여부를 분석하는 단계
    를 포함하는, 화합물들의 스크리닝 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 외인성 유전자가 막 수용체 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포질 수용체 단백질, 이온 채널 단백질, 신호 도입 단백질, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제 및 종양유전자에 의해 코딩되는 단백질로 구성된 군에서 선택된단백질을 코딩하는 것인 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 숙주 세포가 리포터 유전자를 추가로 포함하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제 및 베타-락타마제로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  79. 제75항에 있어서, 상기 분석 단계가 리포터 유전자로부터의 신호 검출 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  80. 제75항에 있어서, 숙주 세포의 게놈이 각각이 상이한 외인성 유전자를 포함하는 2종 이상의 통합 벡터를 포함하는 것인 방법.
  81. 제75항에 있어서, 상기 통합 벡터가 슈도형 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  82. 제75항에 있어서, 상기 숙주 세포가 차이니스 햄스터 난소 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 소 유방 상피 세포로부터 선택된 것인 방법.
  83. 1) a) 제1 관심 단백질을 코딩하는 제1 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 통합 벡터를 포함하는 제1 숙주 세포 및 b) 적어도, 상기 제1 관심 단백질의 변이체인 제2 관심 단백질을 코딩하는 제2 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 통합 벡터를 포함하는 제2 숙주 세포를 제공하는 단계,
    2) 상기 숙주 세포를 상기 제1 및 제2 관심 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계, 및
    3) 상기 제1 및 제2 관심 단백질의 활성을 비교하는 단계
    를 포함하는, 단백질들의 기능 비교 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 외인성 유전자가 막 수용체 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포질 수용체 단백질, 이온 채널 단백질, 신호 도입 단백질, 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, 세포 주기 단백질 및 종양유전자에 의해 코딩되는 단백질로 구성된 군에서 선택된 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 제1 및 제2 관심 단백질이 단일 뉴클레오티드 다형성에 의해 상이한 것인 방법.
  86. 제83항에 있어서, 상기 제1 및 제2 관심 단백질의 동일성이 95％ 초과인 것인 방법.
  87. 제83항에 있어서, 상기 제1 및 제2 관심 단백질의 동일성이 90％ 초과인 것인 방법.
  88. 제83항에 있어서, 상기 제1 및 제2 숙주 세포 각각이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 3개 초과로 포함하는 것인 방법.
  89. 제83항에 있어서, 상기 제1 및 제2 숙주 세포 각각이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 4개 초과로 포함하는 것인 방법.
  90. 제83항에 있어서, 상기 제1 및 제2 숙주 세포 각각이 상기 통합 벡터의 통합된 카피를 5개 초과로 포함하는 것인 방법.
  91. 제83항에 있어서, 상기 통합 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 슈도형 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  93. 제91항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
  94. 1) a) 1종 이상의 통합된 외인성 유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 숙주 세포 및 b) 복수개의 통합 벡터를 제공하는 단계, 및
    2) 상기 숙주 세포를 2개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 통합된 외인성 유전자가 통합 벡터를 포함하는 것인 방법.
  96. 제94항에 있어서, 상기 숙주 세포가 단일 클론에서 선택된 것인 방법.
  97. 제94항에 있어서, 상기 숙주 세포가 단일 클론에서 선택된 것이 아닌 방법.
  98. 제94항에 있어서, 상기 조건이 숙주 세포를 감염 다중도 10 초과로 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  99. 제94항에 있어서, 상기 조건이 숙주 세포를 감염 다중도 약 10 내지 1000으로 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  100. 제94항에 있어서, 상기 숙주 세포를 3개 이상의 통합 벡터가 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 조건하에 상기 복수개의 통합 벡터와 접촉시키는 것인 방법.
  101. 제94항에 있어서, 상기 통합 벡터가 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 슈도형 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
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