KR20030074584A - 발현 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 숙주 세포에서 1종 이상의 단백질을 발현하기 위한 신규 조절 요소 및 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 숙주 세포에서 항체와 같은 1종 이상의 단백질을 발현하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 숙주 세포에서 단백질의 발현을 위한 본 발명의 신규 조절 요소 및 벡터를 이용한다. 숙주 세포는 제약 단백질, 항체, 스크리닝 분석법에 사용하기 위한 및 고용량 스크리닝에 직접 사용하기 위한 단백질의 변이체 등을 비롯한 다양한 단백질 생성물을 생산하기 위해 사용된다.

Description

발현 벡터 {Expression Vectors}
박테리아 숙주에서 재조합 단백질을 발현하기 위한 방법은 널리 알려져 있으며, 재조합 생성물의 사용 및 정제에 있어서의 편의를 제공한다. 그러나, 진핵 단백질의 발현을 위한 이들 시스템의 이용은 대체로 불용성 및 적당한 전사후 및 번역후 프로세싱 (processing)의 결여라는 문제점에 의해 제한된다 (본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,721,121호 참조). 따라서, 진핵 단백질의 발현에는 일반적으로 진핵 발현 시스템이 이용된다. 특히, 제약 생명공학 산업은 주로 포유동물 세포에서의 재조합 단백질 생산에 의존한다. 재조합적으로 생산된 이들 단백질은 다수의 질환 및 증상의 치료에 필수적이다. 많은 경우, 이들 단백질에 대한 시장 규모는 1년에 10억 달러를 초과한다. 포유동물 세포에서 재조합적으로 발현되는 단백질의 예에는 에리트로포이에틴, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ 및 인슐린이 포함된다. 또한, 재조합 항체는 대체로 치료제로서 사용된다. 재조합적으로 생산된 단백질, 특히 항체의 임상 적용은 대체로 고도로 정제된 다량의 단백질을 필요로 한다. 단백질은 일반적으로 포유동물 세포 배양액 또는 형질전환 (transgenic) 동물에서 생산된다.
관심 유전자를 포유동물 세포에 전달하기 위한 벡터는 널리 입수 가능하며, 여기에는 플라스미드, 레트로바이러스 벡터 및 아데노바이러스 벡터가 포함된다. 레트로바이러스 벡터는 포유동물 세포로 유전자를 전달하기 위한 비히클로서 널리 사용되는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Vile and Russell, British Medical Bulletin, 51:12 [1995]] 참조). 그러나, 재조합체 단백질의 발현을 위해 포유동물 세포주를 만드는 현행의 방법에는 여러가지 단점이 있다 (예를 들어, 문헌 [Mielke et al., Biochem. 35:2239-52 [1996]] 참조). 에피좀 시스템은 재조합 단백질의 높은 발현 수준을 가능하게 하지만, 대체로 짧은 시간 동안만 안정하다 (예를 들어, 문헌 [Klehr and Bode, Mol. Genet. (Life Sci. Adv.) 7:47-52 [1988]] 참조). 통합된 외인성 유전자를 함유하는 포유동물 세포주는 다소 더 안정하지만, 외인성 유전자가 단지 몇 카피수로 존재하거나 심지어 1 카피수로 존재하는 경우에만 안정하다는 증거가 늘어나고 있다. 벡터는 대체로 불안정하여 시간에 따라 단백질 발현의 수준이 감소된다.
전체 생산 수율에 기초하여, 동물에서의 재조합 단백질 발현은 세포 배양액에서의 발현에 비해 수율이 더 높다 (예를 들어, 문헌 [Werner et al., Arzneimittelforshcung, 48:870 [1998]], [Pollock et al., J. Immunol. Methods, 231:147 [1999]] 참조). 그러나, 형질전환 동물에서의 발현은 형질전환 동물의 생성 방법, 생산성 및 순도의 변화, 및 동물의 수명에 의해 제한된다.
따라서, 해당 분야의 지속적인 노력에도 불구하고, 숙주 세포에서 1종 이상의 단백질을 높은 수준으로 연속 발현하기 위한 벡터가 당업계에 필요한 실정이다.
<발명의 개요>
본 발명은 숙주 세포에서 1종 이상의 단백질을 발현하기 위한 신규 조절 요소 및 벡터에 관한 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 제1 포유동물 α-락트알부민 프로모터로부터 유래한 일부분 이상과 제2 포유동물 α-락트알부민 프로모터로부터 유래한 일부분 이상을 포함하는 하이브리드 α-락트알부민 프로모터를 제공한다. 본 발명이 어느 특정 α-락트알부민 프로모터로부터 유래한 부분으로 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 소, 인간, 양, 염소 및 뮤린 α-락트알부민 프로모터 등을 비롯한 다양한 α-락트알부민 프로모터로부터 유래한 부분들이 고려된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1 및 낮은 엄격 조건 하에서 서열 1과 혼성화 가능한 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하는데, 여기서 핵산은 적어도 2종의 포유동물 공급원으로부터 유래하고 유세포 (mammary) 특이적 유전자 발현을 일으키는 서열들을 함유한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 하이브리드 소/인간 알파 락트알부민 (αLA) 프로모터/인핸서 (즉, 서열 1)를 코딩하는 핵산 서열, 및 낮은 내지 고도의 엄격 조건 하에서 하이브리드 소/인간 α-LA 프로모터와 혼성화 가능한 서열들을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이들 서열은 형질전환 동물의 유선에서 외인성 유전자의 발현을 유도한다. 몇몇 실시양태에서, 혼성화 가능한 서열은 인간 및 소의 요소들을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 하이브리드 소/인간 α-LA 프로모터의 핵산 서열을 함유하는 벡터를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 하이브리드 소/인간 α-LA 프로모터를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 돌연변이체 RNA 배출 요소 (PPE 요소; 서열 2)를 코딩하는 핵산, 및 돌연변이체 PPE 요소와 혼성화 가능한 서열들을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 돌연변이체 PPE 요소와 혼성화 가능한 서열들은 야생형 PPE 요소의 핵산 잔기 4, 112, 131 및 238에 상응하는 위치 중 적어도 하나에서 돌연변이화된 ATG 서열을 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 이들 서열은 이들이 작동 가능하게 연결된 RNA의 핵으로부터의 배출을 증진시킨다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 PPE 요소의 핵산 서열을 함유하는 벡터를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 PPE 요소를 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 IRES 코딩 서열 및 신호 펩티드 코딩 서열을 코딩하는 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 IRES 및 신호 펩티드 코딩 서열은 서로 인접하고 있다. 몇몇 실시양태에서, IRES/신호 펩티드 서열은 서열 3 또는 서열 12, 및 낮은 엄격 조건 하에서 이들 서열과 혼성화 가능한 서열들을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이들 서열은 리보솜과 상호작용하여 이들이 작동 가능하게 연결된 단백질이 분비되게끔 한다. 본 발명이 어느 특정 신호 서열 펩티드에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 본 발명에서 다양한 신호 펩티드가 유용한 것으로 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 신호 펩티드 서열은 알파-카제인, 인간 성장 호르몬 또는 α-락트알부민 신호 펩티드 서열로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 IRES/신호 펩티드 서열의 핵산 서열을 함유하는 벡터를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 IRES/신호 펩티드 서열을 함유하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 관심 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 이 방법은 숙주 세포, 및 소/인간 하이브리드 α-락트알부민 프로모터에 작동 가능하게 연결된 1종 이상의 외인성 유전자를 함유하는 벡터를 제공하고; 외인성 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에서 벡터를 숙주 세포에 도입하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 벡터는 돌연변이체 RNA 배출 요소를 더 함유한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 2종 이상의 외인성 유전자를 함유한다. 또다른 실시양태에서, 2종 이상의 외인성 유전자는 내부 리보솜 유입 부위/소 α-락트알부민 신호 펩티드에 의해 분리되어 폴리시스트론성 (polycistronic)으로 배열된다.
또한, 본 발명은 폴리시스트론 서열 중 적어도 2종의 단백질을 발현하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 단백질들은 무관한 것이며, 다른 실시양태에서는 단백질들이 다수의 서브유닛으로 구성된 단백질의 서브유닛들이다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포, 및 제1 면역글로불린쇄를 코딩하는 제1 외인성 유전자와 제2 면역글로불린쇄를 코딩하는 제2 외인성 유전자를 포함하는 벡터를 제공하고; 제1 및 제2 외인성 유전자에 의해 코딩되는 제1 면역글로불린쇄 및 제2 면역글로불린쇄가 발현되도록 하는 조건 하에서 벡터를 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는, 면역글로불린을 생산하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 제1 면역글로불린쇄는 면역글로불린 경쇄 (예를 들어, λ 또는 κ)이고, 제2 면역글로불린쇄는 면역글로불린 중쇄 (예를 들어, γ, α, μ, δ 또는 ε)이다. 다른 실시양태에서, 제1 면역글로불린쇄는 면역글로불린 중쇄 (예를 들어, γ, α, μ, δ 또는 ε)이고, 제2 면역글로불린쇄는 면역글로불린 경쇄 (예를 들어, λ 또는 κ)이다. 몇몇 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 다른 실시양태에서, 벡터는 소 α-락트알부민 신호 펩티드를 더 함유한다. 또다른 실시양태에서, 벡터는 소/인간 하이브리드 α-락트알부민 프로모터를 더 함유한다. 또다른 실시양태에서, 제1 면역글로불린쇄 및 제2 면역글로불린쇄는 약 0.9 대 1.1 내지 1 대 1의 비율로 발현된다. 또한, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 면역글로불린을 제공한다. 본 발명이 어느 특정 벡터의 사용에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 플라스미드 및 레트로바이러스 벡터 등을 비롯한 다양한 벡터가 본 발명에서 유용한 것으로 고려된다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 슈도형 (pseudotyped)이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 IRES에 의해 작동 가능하게 연결된 신호 단백질 및 관심 단백질을 포함하는 폴리시스트론 서열을 코딩하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공하는 단계, 및 상기 숙주 세포를 신호 단백질 및 관심 단백질이 생산되는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 관심 단백질 발현의 간접적 검출 방법을 제공하며, 이때, 신호 단백질의 존재가 관심 단백질의 존재를 지시한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 관심 단백질의 발현으로 제한되지 않는다. 실제로, G-단백질-커플링된 수용체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 관심 단백질들의 발현이 고려된다. 본 발명은 임의의 특정 신호 단백질의 사용으로 제한되지 않는다. 실제로, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 녹색 형광 단백질 및 루시퍼라제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 신호 단백질들의 사용이 고려된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 신호 단백질 및 관심 단백질의 발현은 동일한 프로모터에 의해 구동되며 상기 신호 단백질 및 관심 단백질은 1개의 전사 단위로서 전사된다.
본 발명은 숙주 세포에서 1종 이상의 단백질을 발현하기 위한 신규 조절 요소 및 벡터에 관한 것이다.
도 1은 변성 조건하에 수행하고 항-인간 IgG (Fc) 및 항-인간 IgG (카파)로 프로빙 (probing)한 15％ SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블럿이다.
도 2는 시간에 따른 MN14 발현량의 그래프이다.
도 3은 비-변성 조건하에 수행하고 항-인간 IgG (Fc) 및 항-인간 IgG (카파)로 프로빙한 15％ SDS-PAGE의 웨스턴 블럿이다.
도 4는 하이브리드 인간-소 알파-락트알부민 프로모터의 서열 (서열 1)이다.
도 5는 돌연변이된 PPE 서열의 서열 (서열 2)이다.
도 6은 IRES-신호 펩티드 서열의 서열 (서열 3)이다.
도 7A 및 도 7B는 CMV MN14 벡터의 서열 (서열 4)이다.
도 8A 및 도 8B는 CMV LL2 벡터의 서열 (서열 5)이다.
도 9A 내지 도 9C는 MMTV MN14 벡터의 서열 (서열 6)이다.
도 10A 내지 도 10D는 알파-락트알부민 MN14 벡터의 서열 (서열 7)이다.
도 11A 내지 도 11C는 알파-락트알부민 Bot 벡터의 서열 (서열 8)이다.
도 12A 및 도 12B는 LSRNL 벡터의 서열 (서열 9)이다.
도 13A 및 도 13B는 알파-락트알부민 cc49IL2 벡터의 서열 (서열 10)이다.
도 14A 내지 도 14C는 알파-락트알부민 YP 벡터의 서열 (서열 11)이다.
도 15는 IRES-카제인 신호 펩티드 서열의 서열 (서열 12)이다.
도 16A 내지 도 16C는 LNBOTDC 벡터의 서열 (서열 13)이다.
도 17A 내지 도 17D는 G-단백질-커플링된 수용체 및 항체 경쇄를 발현하는 레트로바이러스 벡터의 서열이다.
정의
본 발명의 이해를 돕기 하기 위해서, 여러가지 용어들을 하기에서 정의하였다.
본원에서 사용된 바와 같이 "숙주 세포"라는 용어는 시험관내 또는 생체내 위치한 임의의 진핵 세포 (예를 들면, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포 및 곤충 세포)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "세포 배양"이라는 용어는 세포의 임의의 시험관내 배양을 지칭한다. 이 용어에는, 난모세포 및 배아 등을 비롯하여 시험관내에서 유지되는 연속 세포주 (예를 들면, 불멸 표현형을 갖는 세포주), 초대 세포 배양, 유한 (finite) 세포주 (예를 들면, 형질전환되지 않은 세포) 및 임의의 다른 세포 집단 등이 속한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "벡터"라는 용어는 적당한 조절 요소와 결합된경우 복제될 수 있고 세포들 사이에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전적 요소, 예를 들어 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 염색체, 바이러스, 비리온 (virion) 등을 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클 뿐 아니라 바이러스 벡터까지도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "통합 벡터"라는 용어는 핵산 (예를 들면, 염색체)으로의 통합 또는 삽입이 인테그라제를 통해 수행되는 벡터를 지칭한다. "통합 벡터"의 예로는 레트로바이러스 벡터, 트랜스포손 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "통합된"이라는 용어는 숙주 세포의 게놈 (즉, 염색체)로 안정하게 삽입된 벡터를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "감염다중도" 또는 "MOI"라는 용어는 숙주 세포의 형질감염 또는 형질도입 동안 사용된 통합 벡터 : 숙주 세포의 비율을 지칭한다. 예를 들면, 1,000,000개의 벡터를 사용하여 100,000개의 숙주 세포를 형질도입시킨 경우의 감염다중도는 10이다. 이 용어의 사용은 형질도입을 포함하는 사건으로 제한되지 않으며, 리포펙션법, 미세주입법, 인산칼슘 침전법 및 전기천공법 등의 방법을 통해 벡터를 숙주에 도입하는 것도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "게놈"이라는 용어는 유기체의 유전 물질 (예를 들면, 염색체)을 지칭한다.
"관심 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 임의의 뉴클레오티드 서열 (예를 들면, RNA 또는 DNA)을 지칭하며, 당업자는 이의 조작을 임의의 이유 (예를 들면, 질환 치료, 성능 개선, 숙주 세포 내 관심 단백질의 발현, 리보자임의 발현 등)에 바람직한 것으로 간주할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열로는 구조적 유전자 (예를 들면, 리포터 유전자, 선별 마커 유전자, 종양유전자, 약물 내성 유전자, 성장 인자 등)의 코딩 서열 및 mRNA 또는 단백질 생성물을 코딩하지 않는 비코딩 조절 서열 (예를 들면, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종료 서열, 인핸서 서열 등) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "관심 단백질"이라는 용어는 관심 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "신호 단백질"이라는 용어는 관심 단백질과 함께 동시발현되며 적합한 분석을 통해 검출될 경우에는 상기 관심 단백질의 발현에 대한 간접적인 증거를 제공하는 단백질을 지칭한다. 본 발명에 유용한 신호 단백질의 예로는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제, 녹색 형광 단백질 및 루시퍼라제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "외인성 유전자"라는 용어는 천연적으로는 숙주 유기체 또는 세포에 존재하지 않는 유전자 또는 인공적으로 숙주 유기체 또는 세포에 도입된 유전자를 지칭한다.
"유전자"라는 용어는 폴리펩티드 또는 전구체 (예를 들면, 프로인슐린) 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들면, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 전장 코딩 서열 또는 이의 임의의 일부가 원하는 활성 또는 기능적 특성 (예를 들면, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 도입 등)을 보유하는 한, 폴리펩티드는 상기 전장 서열 또는 단편으로 코딩될 수 있다. 상기 용어는 또한 구조적 유전자의 코딩 영역도 포함하며, 5' 또는 3' 말단 모두에서 약 1 kb 이상의 거리를 두고 코딩 영역에 인접하게 위치한 서열도 포함하여, 유전자는 전장 mRNA의 길이에 상응한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열은 5' 비번역 서열이라 지칭된다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA상에 존재하는 서열은 3' 비번역 서열이라 지칭된다. "유전자"라는 용어는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개입 영역" 또는 "개입 서열"이라 일컬어지는 비-코딩 서열이 끼여있는 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자 단편이며, 인트론은 인핸서 등의 조절 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 전사체 또는 1차 전사체로부터 제거되거나 "스플라이싱"되기 때문에, 인트론은 운반 RNA (mRNA) 전사체에는 존재하지 않는다. mRNA는 번역되는 동안 초기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 순서를 규정하는 기능을 한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "유전자 발현"이라는 용어는 유전자 내 코딩된 유전적 정보가 유전자 "전사"를 통해 (즉, RNA 중합효소 작용을 통해) RNA (예를 들면, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 전환되고, 단백질을 코딩하는 유전자인 경우에는 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로 전환되는 과정을 지칭한다. 유전자 발현은 상기 과정 중 많은 단계에서 조절될 수 있다. "상향조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 생성물 (즉, RNA 또는 단백질)의 생산량을 증가시키는 조절을 지칭하며, "하향-조절" 또는 "억제"는 상기 생산량을 감소시키는 조절을 지칭한다. 상향조절 또는 하향-조절에 관여하는 분자 (예를 들면, 전사 인자)는 종종 각각 "활성자" 및 "레프레서"라 일컬어진다.
본원에서 "아미노산 서열"이 천연 발생 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하여 언급되는 경우, "폴리펩티드" 또는 "단백질" 등에서와 같이 "아미노산 서열" 등의 용어는 언급된 단백질 분자와 관련된 완전한 천연 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열만을 제한적으로 의미하는 것이 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이 "-을 코딩하는 핵산 분자", "-을 코딩하는 DNA 서열", "-을 코딩하는 DNA", "-을 코딩하는 RNA 서열" 및 "-을 코딩하는 RNA"라는 용어는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산의 가닥에 따른 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 순서가 폴리펩티드 (단백질)쇄에서의 아미노산 순서를 결정한다. 따라서, DNA 또는 RNA 서열이 아미노산 서열을 코딩한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "변이체"라는 용어가 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 이는 부분적으로 상동성인 핵산에 의해 코딩되어 상기 단백질의 아미노산 서열이 다양해지는 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "변이체"라는 용어는 상동성 유전자에 의해 코딩되며 단백질 기능이 변화되지 않는 보존적 및 비-보존적 아미노산 치환된 단백질을 포함할 뿐 아니라, 상동성 유전자에 의해 코딩되며 단백질 기능이 감소 (예를 들면, 널 (null) 돌연변이)되거나 단백질 기능이 증가되는 아미노산 치환된 단백질까지도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "상보적" 또는 "상보성"이라는 용어는 염기쌍 규칙에 따른 폴리뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드들의 서열)와 관련하여 사용된다. 예를 들면, 서열 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"에 상보적이다. 상보성은 단지 몇개의 핵산 염기만이 염기쌍 규칙에 부합되는 "부분적" 상보성일 수 있다. 또는, 핵산들 사이에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수도 있다. 핵산 가닥들 사이의 상보성 정도는 혼성화 효율 및 강도에 유의한 효과를 미친다. 이는 특히 증폭 반응 뿐 아니라 핵산들 사이의 결합에 의존하는 검출 방법에서도 중요하다.
"상동성" 및 "동일성(％)"이라는 용어가 핵산과 관련하여 사용된 경우, 이는 상보성 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 (즉, 부분적 동일성) 또는 완전한 상동성 (즉, 완전한 동일성)이 있을 수 있다. 부분적으로 상보적인 서열은 완전하게 상보적인 서열과 표적 핵산 서열의 혼성화를 적어도 부분적 억제하는 서열이며, "실질적으로 상동성"이라는 기능적 용어를 사용하여 지칭된다. 완전하게 상보적인 서열과 표적 서열과의 혼성화 억제는 혼성화 분석 (서던 또는 노던 블럿, 용액 혼성화 등)을 통해 낮은 엄격 조건하에서 조사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브 (즉, 다른 관심 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드)는 낮은 엄격 조건하에서 완전하게 상동성인 서열과 표적 서열의 결합 (즉, 혼성화)을 경쟁하고 억제할 것이다. 이는 낮은 엄격 조건이 이러한 비-특이적 결합을 허용한다고 말하는 것은 아니며, 낮은 엄격 조건은 2개 서열들의 서로에 대한 결합이 특이적 (즉, 선택적) 상호작용일 것을 요구한다. 비-특이적 결합의 부재는 부분적 상보성조차도 없는 (예를 들면, 동일성이 약 30％ 미만임) 제2 표적을 사용하여 시험할 수 있으며, 비-특이적 결합이 없다면, 프로브는 제2 비-상보적 표적에혼성화하지 않을 것이다.
당업자라면, 낮은 엄격 조건에 해당하는 수많은 동등한 조건을 이용할 수 있음을 알 것이다: 프로브의 길이 및 성질 (DNA, RNA, 염기 조성) 등의 인자 및 표적의 성질 (DNA, RNA, 염기 조성, 용액 중 존재하는지 또는 고정화되어 존재하는지의 여부 등) 및 염의 농도 및 기타 성분들 (예를 들면, 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존재 또는 부재)을 고려하여, 혼성화 용액을 변화시켜 상기한 조건과 상이하지만 동등한 낮은 엄격도의 혼성화 조건을 생성할 수 있다. 또한, 당업자라면, 고도의 엄격 조건하에서 혼성화를 촉진하는 조건 (예를 들면, 혼성화 온도의 증가 및(또는) 세척 단계, 혼성화 용액 중 포름아미드의 사용 등)을 알 것이다.
cDNA 또는 게놈 클론과 같은 이중 가닥 핵산 서열과 관련하여 "실질적으로 상동성"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 상기 기재한 바와 같은 낮은 엄격 조건하에서 이중 가닥 핵산 서열의 한쪽 가닥 또는 양 가닥 모두와 혼성화할 수 있는 임의의 프로브를 지칭한다.
단일 가닥 핵산 서열과 관련하여 "실질적으로 상동성"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 상기 기재한 바와 같은 낮은 엄격 조건하에서 단일 가닥 핵산 서열과 혼성화할 수 있는 임의의 프로브 (즉, 상기 단일 가닥 핵산 서열의 상보체임)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "혼성화"라는 용어는 상보적 핵산들의 쌍형성과 관련하여 사용된다. 혼성화 및 혼성화 강도 (즉, 핵산들 사이의 결합 강도)는 핵산들 사이의 상보성 정도, 사용된 조건의 엄격성, 형성된 하이브리드의 Tm및 핵산 내 G : C 비율과 같은 인자에 의해 영향을 받는다. 구조 내에 상보적 핵산들의 쌍을 함유하는 단일 분자는 "자가-혼성화되었다"고 일컬어진다.
본원에서 사용된 바와 같이 "Tm"이라는 용어는 핵산의 "용융 온도"와 관련하여 사용된다. 용융 온도는 이중 가닥 핵산 분자들의 집단 중 절반이 단일 가닥으로 해리되는 온도이다. 핵산의 Tm을 계산하는 식은 당업계에 공지되어 있다. 표준 참고문헌에 지시되어 있는 바와 같이, 간단한 Tm값 추정치는 다음의 식으로 계산될 수 있다: Tm= 81.5 + 0.41((G + C)의 비율(％)) (이때, 핵산은 1 M NaCl 수용액 중에 존재함) (예를 들어 문헌 [Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)] 참조). 다른 참고문헌은 Tm계산에 구조적 특징 뿐 아니라 서열 특징까지도 고려한 더욱 복잡한 계산식을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "엄격성"이라는 용어는 핵산 혼성화가 수행되는 온도, 이온 강도 및 유기 용매 등의 다른 화합물들의 존재 여부 조건과 관련하여 사용된다. "고도의 엄격" 조건에서는 상보적 염기 서열의 빈도가 높은 핵산 단편들 사이에서만 핵산 염기쌍 형성이 일어날 것이다. 따라서, "약한" 또는 "저" 엄격 조건은 통상적으로 상보적 서열의 빈도가 덜한 유전적으로 다양한 유기체들로부터 유래된 핵산에 종종 요구된다.
"고도의 엄격 조건"이 핵산 혼성화와 관련하여 사용될 때, 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브를 사용하는 경우에는 42℃에서 5 ×SSPE (43.8 g/L NaCl, 6.9 g/L NaH2PO4·H2O 및 1.85 g/L EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.5％ SDS, 5 ×덴하르트 (Denhardt's) 시약 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서 결합 또는 혼성화시킨 후에, 42℃에서 0.1 ×SSPE, 1.0％ SDS를 포함하는 용액으로 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.
"중간 엄격 조건"이 핵산 혼성화와 관련하여 사용될 때, 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브를 사용하는 경우에는 42℃에서 5 ×SSPE (43.8 g/L NaCl, 6.9 g/L NaH2PO4·H2O 및 1.85 g/L EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.5％ SDS, 5 ×덴하르트 시약 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서 결합 또는 혼성화시킨 후에, 42℃에서 1.0 ×SSPE, 1.0％ SDS를 포함하는 용액으로 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.
"낮은 엄격 조건"은 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브를 사용하는 경우에는 42℃에서 5 ×SSPE (43.8 g/L NaCl, 6.9 g/L NaH2PO4·H2O 및 1.85 g/L EDTA, NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정함), 0.1％ SDS, 5 ×덴하르트 시약 (50 ×덴하르트는 500 mL 당 5 g 피콜 (Ficoll) (400형, 파르마샤 (Pharamcia) 제품), 5 g BSA (분획 V; 시그마 (Sigma) 제품)을 함유함) 및 100 ㎍/mL 변성된 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서 결합 또는 혼성화시킨 후에, 42℃에서 5 ×SSPE, 0.1％ SDS를 포함하는 용액으로 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.
한 유전자는 1차 RNA 전사체의 차별적 스플라이싱을 통해 생성된 다수의 RNA 종을 생산할 수 있다. 동일한 유전자의 스플라이싱 변이체인 cDNA는 서열 동일성 또는 완전한 상동성 영역 (2가지 cDNA 모두에 동일한 엑손 또는 동일한 엑손의 일부가 존재함을 나타냄) 및 완전한 비-동일성 영역 (예를 들어, cDNA 1에는 엑손 "A"가 존재하는 대신, cDNA 2는 "B"를 함유함을 나타냄)을 함유할 것이다. 상기 2가지 cDNA들이 서열 동일성 영역을 함유하기 때문에, 이들은 둘다 2가지 cDNA 모두에서 발견되는 서열을 함유하는 유전자 전체 또는 유전자의 일부로부터 유래된 프로브와 혼성화될 것이므로, 상기 2가지 스플라이싱 변이체는 이러한 프로브 및 서로에게 실질적으로 상동성이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "작동 가능한 조합물로", "작동 가능한 순서로" 및 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 주어진 유전자의 전사 및(또는) 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생산되는 방식으로 핵산 서열들이 연결되었음을 지칭한다. 또한, 상기 용어는 기능적 단백질이 생상되는 방식으로 아미노산 서열들이 연결되었음을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "선별 가능한 마커"라는 용어는 달리 필수적인 영양분이라 할만한 것이 없는 배지 중에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 효소 활성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 효모 세포의 경우에는HIS3유전자)를 지칭한다. 또한, 선별 가능한 마커는 상기 선별 가능한 마커를 발현하는 세포에게 항생제 또는 약물에 대한 내성을 부여할 수 있다. 선별 가능한 마커는 "우세 (dominant)"할 수 있다: 우세한 선별 가능한 마커는 임의의 진핵 세포주에서 검출될 수 있는 효소 활성을 코딩한다. 우세한 선별 가능한 마커의 예로는 포유동물 세포에서 약물 G418에 대한 내성을 부여하는 박테리아 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제 유전자 (neo유전자라고 지칭되기도 함), 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 박테리아 하이그로마이신 G 포스포트랜스퍼라제 유전자 (hyg) 및 마이코페놀산의 존재하에서의 성장능을 부여하는 박테리아 크산틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자 (gpt유전자라고 지칭되기도 함) 등이 있다. 사용에 우세하지 않은 다른 선별 가능한 마커는 관련 효소 활성이 없는 세포주와 함께 사용되어야 한다. 우세하지 않은 선별 가능한 마커의 에로는 tk-세포주와 함께 사용되는 티미딘 키나제 (tk) 유전자, CAD-결핍 세포와 함께 사용되는 CAD 유전자 및hprt -세포주와 함께 사용되는 포유동물 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (hprt) 유전자 등이 있다. 포유동물 세포주에서의 선별 가능한 마커 사용에 관해 살펴보기 위해서는, 문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 16.9-16.15]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "조절 요소"라는 용어는 핵산 서열 발현의 몇몇 측면을 조절하는 유전적 요소를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 이와 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 전사 개시를 용이하게 하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소로는 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종료 신호, RNA 배출 요소, 내부 리보솜 결합 부위 등 (하기에서 정의됨)이 있다.
진핵동물의 전사 조절 신호는 "프로모터" 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호작용하는 짧은 배열의 DNA 서열로 구성된다 [Maniatis et al., Science 236:1237 (1987)]. 프로모터 및 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유동물 세포 등을 비롯한 다양한 진핵세포 공급원 및 바이러스 유전자에서 단리되었다 (원핵세포에서도 유사한 조절 요소, 즉, 프로모터가 발견됨). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 관심 단백질 발현에 사용될 세포 유형에 따라 달라진다. 몇몇 진핵세포 프로모터 및 인핸서는 숙주 범위가 넓은 반면, 다른 것들은 제한된 서브세트의 세포 유형들에서만 기능한다 (살펴보기 위해서는, 문헌 [Voss et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986)] 및 [Maniais et al., 상기 문헌] 참조). 예를 들면, SV40 초기 유전자 인핸서는 많은 포유동물 종으로부터의 광범위하게 다양한 세포 유형에서 매우 활성이며 포유동물 세포 내 단백질 발현에 광범위하게 사용된다 [Dijkema et al., EMBO J. 4:761 (1985)]. 넓은 범위의 포유동물 세포 유형에서 활성인 프로모터/인핸서 요소의 다른 2개 예는 인간 신장 인자 1α 유전자 [Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264:5791 (1989)], [Kim et al., Gene 91:217 (1990)] 및 [Mizushima and Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 (1990)] 및 라우스 육종 바이러스 [German et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)) 및 인간 사이토메갈로바이러스 [Boshart et al., Cell 41:521 (1985)]의 장쇄 말단 반복서열로부터의 요소이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "프로모터/인핸서"라는 용어는 프로모터 기능 및 인핸서 기능 (즉, 프로모터 요소 및 인핸서 요소에 의해 제공되는 기능, 이들 기능에 관한 논의를 위해서는 상기를 참조함) 모두를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 단편을 의미한다. 예를 들면, 레트로바이러스의 장쇄 말단 반복서열은 프로모터 기능 및 인핸서 기능을 모두 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성"이거나, 또는 "이종"일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈 내에서 주어진 유전자와 천연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종" 인핸서/프로모터는 유전자 조작 (즉, 클로닝 및 재조합 등의 분자생물학 기술)을 통해 유전자 근위에 위치된 것으로서, 상기 유전자의 전사는 연결된 인핸서/프로모터에 의한 지시를 받는다.
조절 요소는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. "조직 특이적"이라는 용어가 조절 요소에 적용되는 경우, 이는 특정 유형의 조직 (예를 들면, 간)에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 상이한 유형의 조직 (예를 들면, 폐)에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 상대적인 발현 부재시에 지시할 수 있는 조절 요소를 지칭한다.
예를 들어, 조절 요소의 조직 특이성은 리포터 유전자를 프로모터 서열 (조직-특이적이 아님)에 작동 가능하게 연결하고 조절 요소에 작동 가능하게 연결하여 리포터 구조물을 생성하고, 상기 리포터 구조물을 동물의 게놈에 도입하여 리포터 구조물이 생성된 트랜스제닉 동물의 모든 조직으로 통합되도록 하고, 상기 트랜스제닉 동물의 상이한 조직에서 리포터 유전자의 발현을 검출 (예를 들면, 리포터 유전에 의해 코딩되는 mRNA, 단백질 또는 단백질 활성 검출)함으로써 평가할 수 있다. 1종 이상의 조직에서의 리포터 유전자 발현량이 다른 조직에서 상기 리포터유전자의 발현 수준 보다 상대적으로 더 높게 검출되는 것은 상기 조절 요소가 발현 수준이 더 높게 검출된 조직에 "특이적"임을 나타낸다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이 "조직-특이적" (예를 들면, 간-특이적)이라는 용어는 절대적인 발현 특이성을 요구하지 않는 상대적인 용어이다. 즉, "조직-특이적"이라는 용어는 어떠한 조직에서는 극단적으로 높은 수준으로 발현되고, 다른 조직에서는 발현되지 않을 것을 요구하지 않는다. 어떤 조직에서의 발현이 다른 조직에서의 발현보다 더 높은 것으로 충분하다. 반대로, "엄격한" 또는 "절대적인" 조직-특이적 발현은 하나의 조직 유형 (예를 들면, 간)에서만 발현되며 다른 조직에서는 검출가능한 발현이 없음을 지시하는 의미이다.
조절 요소에 적용되는 "세포 유형 특이적"이라는 용어는 특정 유형의 세포에서 동일한 조직 내 상이한 유형의 세포에서 동일한 관심 뉴클레오티드 서열의 상대적인 발현 부재시에 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적인 발현을 지시할 수 있는 조절 요소를 지칭한다. "세포 유형 특이적"이라는 용어가 조절 요소에 적용되는 경우, 이는 또한 하나의 조직 내 영역에서 관심 뉴클레오티드 서열의 선택적인 발현을 촉진할 수 있는 조절 요소를 의미한다.
조절 요소의 세포 유형 특이성은 당업계에 공지된 방법 (예를 들면, 면역조직화학적 염색법 및(또는) 노던 블럿 분석법)을 사용하여 평가될 수 있다. 간단하게 말하자면, 면역조직화학적 염색을 위해서 조직 절편을 파라핀에 묻고, 파라핀 절편을 조절 요소에 의해 발현이 조절되는 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 생성물에 특이적인 1차 항체와 반응시킨다. 1차 항체에 특이적인표지된 (예를 들면, 퍼옥시다제 접합된) 2차 항체를 사용하면, 절단된 조직에의 결합 및 현미경검사법을 통해 검출되는 특이적 결합 (예를 들면, 아비딘바이오틴과의 결합)이 가능하다. 간단하게 말하자면, 노던 블럿 분석의 경우에는 RNA를 세포로부터 단리하여 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 RNA를 크기별로 분획화한 후에 상기 RNA를 겔로부터 고체 지지체 (예를 들면, 니트로셀룰로스막 또는 나일론막)로 이동시킨다. 이어서, 고정화된 RNA를 표지된 올리고데옥시리보뉴클레오티드 프로브 또는 DNA 프로브로 프로빙하여 사용된 프로브에 상보적인 RNA 종을 검출한다. 노던 블럿은 분자 생물학자의 표준 도구이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "프로모터", "프로모터 요소" 또는 "프로모터 서열"이라는 용어는 관심 뉴클레오티드 서열에 라이게이션시킨, 관심 뉴클레오티드 서열의 mRNA로의 전사를 조절할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 전형적으로, 프로모터는 이에 의해 mRNA로의 전사가 조절되는 관심 뉴클레오티드 서열의 5' (즉, 상류)에 위치하며 (그러나, 반드시 그래야 하는 것은 아님), RNA 중합효소 및 전사 개시를 위한 다른 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다.
프로모터는 구성적 (constitutive) 또는 조절가능한 프로모터일 수 있다. "구성적"이라는 용어가 프로모터와 관련하여 사용되는 경우, 이는 상기 프로모터가 자극 (예를 들면, 열 충격, 화학물질 등)이 없어도 이와 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있음을 의미한다. 반대로, "조절가능한" 프로모터는 자극 (예를 들면, 열 충격, 화학물질 등)의 존재하에 이와 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 자극이 없는 경우와 상이하게 지시할 수 있는 프로모터이다.
발현 벡터상의 "스플라이싱 신호"의 존재는 종종 재조합 전사체를 더 높은 수준으로 발현하게 한다. 스플라이싱 신호는 1차 RNA 전사체로부터의 인트론 제거를 매개하며, 스플라이싱 공여 부위 및 수용 부위로 구성된다 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) pp. 16.7-16.8]. 통상적으로 사용되는 스플라이싱 공여 부위 및 수용 부위는 SV40의 16S RNA로부터의 스플라이싱 접합부이다.
진핵 세포 내에서 재조합 DNA 서열의 효율적 발현에는 효율적 전사 종료 신호 및 생성된 전사체의 폴리아데닐화를 지시하는 신호의 발현이 요구된다. 전사 종료 신호는 통상적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견되며, 수백개의 뉴클레오티드 길이이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "polyA 부위" 또는 "polyA 서열"이라는 용어는 전사 종료 및 초기 RNA 전사체의 폴리아데닐화를 모두 지시하는 DNA 서열을 의미한다. polyA 테일 (tail)이 없는 전사체는 불안정하고 신속하게 분해되기 때문에 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 발현 벡터에서 사용되는 polyA 신호는 "이종" 또는 "내인성"일 수 있다. 내인성 polyA 신호는 게놈 내 주어진 유전자 코딩 영역의 3' 말단에서 천연적으로 발견된다. 이종 polyA 신호는 한 유전자에서 단리하여 다른 유전자의 3'에 위치시킨 것이다. 통상적으로 사용되는 이종 polyA 신호는 SV40 polyA 신호이다. SV40 polyA 신호는 237 bp Bam-HI/Bc/I 제한 단편상에 있으며, 전사 종료 및 폴리아데닐화 모두를 지시한다 [Sambrook, 상기 문헌, at 16.6-16.7].
진핵 발현 벡터는 "바이러스 레플리콘" 또는 "바이러스 복제 기점"을 함유할 수도 있다. 바이러스 레플리콘은 적당한 복제 인자를 발현하는 숙주 세포에서 벡터의 염색체외 복제를 허용하는 바이러스 DNA 서열이다. SV40 또는 폴리오마 바이러스 복제 기점을 함유하는 벡터는 적당한 바이러스 T 항원을 발현하는 세포에서 높은 "카피수" (104개 이하의 카피/세포)로 복제된다. 소 유두종바이러스 또는 엡스테인-바르 바이러스로부터의 레플리콘을 함유하는 벡터는 "낮은 카피수" (약 100개 카피/세포)로 염색체외 복제된다. 그러나, 발현 벡터를 임의의 특정 바이러스 복제 기점에 제한하려는 의도는 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이 "장쇄 말단 반복서열" 또는 "LTR"이라는 용어는 레트로바이러스 게놈의 U3 영역 5' 및 3'에 위치하거나 그로부터 단리한 전사 조절 요소를 지칭한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 장쇄 말단 반복서열은 레트로바이러스 벡터에서 조절 요소로서 사용할 수 있고, 또는 레트로바이러스 게놈으로부터 단리하여 다른 유형의 벡터에서의 발현 조절에 사용할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "분비 신호"라는 용어는 재조합 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된 경우에 상기 재조합 폴리펩티드를 분비시킬 수 있는 신호 펩티드를 코딩하는 임의의 DNA 서열을 지칭한다. 통상적으로, 상기 신호 펩티드는 약 15 내지 30개의 연속적인 소수성 아미노산 잔기를 포함한다 (예를 들어 문헌 [Zwizinski et al., J. Biol. Chem. 255 (16):7973-77 (1980), Gray et al., Gene 39 (2):247-54 (1985)] 및 [Martial et al., Science 205:602-607 (1979)] 참조).이러한 분비 신호 서열은 조직-특이적 발현을 위해 표적화된 세포 유형으로부터 분비되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 유래한 것이 바람직하다 (예를 들면, 유방의 분비 세포에서 발현되어 분비된 우유 단백질). 그러나, 분비형 DNA 서열은 이러한 서열로 제한되지 않는다. 많은 세포 유형 및 유기체로부터 분비되는 단백질로부터의 분비형 DNA 서열도 사용할 수 있다 (예를 들면, t-PA, 혈청 알부민, 락토페린 및 성장 호르몬을 위한 분비 신호 및 효모, 섬유상 진균 및 박테리아 등으로부터 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 세균 유전자로부터의 분비 신호).
본원에서 사용된 바와 같이 "RNA 배출 요소" 또는 "프리 (pre)-mRNA 프로세싱 인핸서 (PPE)"라는 용어는 핵으로부터의 RNA 배출을 증진시키는 3' 및 5' 시스-작용 (cis-acting) 전사후 조절 요소를 지칭한다. "PPE"요소로는 Mertz 서열 (미국 특허 제5,914,267호 및 동 제5,686,120호에 기재되어 있음, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨) 및 마못 (woodchcuk) mRNA 프로세싱 인핸서 (WPRE; W099/14310 및 미국 특허 제6,136,597호, 상기 문헌 각각은 본원에 참고로 도입됨) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "폴리시스트론"이라는 용어는 여러가지 폴리펩티드쇄를 코딩하는 mRNA를 지칭한다 (예를 들어 WO 93/03143, WO88/05486 및 유럽 특허 제117058호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨). 마찬가지로, "폴리시스트론 서열로 배열된"이라는 용어는 1개의 mRNA에 2가지 상이한 폴리펩티드쇄를 코딩하는 유전자가 배열되어 있음을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "내부 리보솜 결합 부위" 또는 "IRES"라는 용어는 폴리시스트론 유전자 사이에 위치하여 디시스트론 mRNA 번역의 내부 개시에 의해 제2 유전자로부터 발현 생성물의 생산이 시작되는 것을 허용하는 서열을 지칭한다. 내부 리보솜 결합 부위의 예로는 구제역 바이러스 (FDV), 뇌심근염 바이러스, 소아마비바이러스 및 RDV로부터 유래된 것 등이 있으나 이에 제한되지 않는다 [Scheper et al., Biochem. 76:801-809 (1994)], [Meyer et al., J. Virol. 69:2819-2824 (1995)], [Jang et al., 1988, J. Virol. 62:2636-2643 (1998)], [Haller et al., J. Virol. 66:5075-5086 (1995)]. IRES들이 혼입된 벡터는 당업계에 공지된 바와 같이 조립될 수 있다. 예를 들면, 폴리시스트론 서열을 함유하는 레트로바이러스 벡터에는 다음의 요소들이 작동 가능하게 결합되어 있을 수 있다: 뉴클레오티드 폴리링커, 관심 유전자, 내부 리보솜 결합 부위 및 포유동물 선별 가능한 마커 또는 다른 관심 유전자. 폴리시스트론 카세트는 레트로바이러스 벡터 내에서 5' LTR 및 3' LTR 사이에서 5' LTR 프로모터로부터 폴리시스트론 메세지 카세트가 전사되도록 하는 곳에 위치시킨다. 또한, 폴리시스트론 메세지 카세트의 전사는 용도에 따라 바람직할 수 있는 내부 프로모터 (예를 들면, 사이토메갈로바이러스 프로모터) 또는 유도가능한 프로모터에 의해 유도될 수도 있다. 폴리시스트론 메세지 카세트는 폴리링커 내에서 작동되게 결합된 cDNA 또는 게놈 DNA (gDNA) 서열을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 포유동물 선별 가능한 마커를 폴리시스트론 메세지 카세트 포유동물 선별 가능한 마커로서 이용할 수 있다. 이러한 포유동물 선별 가능한 마커는 당업자에게 공지되어 있으며 카나마이신/G418, 하이그로마이신 B 또는 마이코페놀산 내성 마커 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "레트로바이러스"라는 용어는 세포에 침입할 수 있고 (즉, 입자는 숙주 세포의 표면에 결합할 수 있고, 숙주 세포의 세포질로의 바이러스 입자 침입을 용이하게 할 수 있는 외피 단백질 또는 바이러스 G 당단백질 등의 막-결합 단백질을 함유함), 레트로바이러스 게놈을 숙주 세포의 게놈 내로 통합 (이중 가닥 프로바이러스 (provirus)로서 통합시킴)시킬 수 있는 레트로바이러스 입자를 지칭한다. "레트로바이러스"라는 용어는 온코바이러스아과 (예를 들면, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMOLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스 (MoMSV), 및 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 스푸마바이러스아과, 및 렌티바이러스아과 (예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 말 감염 빈혈 바이러스 및 카프린 관절염-뇌염 바이러스 (Caprine arthritis-encephalitis virus); 예를 들어, 미국 특허 제5,994,136호 및 동 제6,013,516호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "레트로바이러스 벡터"라는 용어는 관심 유전자를 발현하도록 변형된 레트로바이러스를 지칭한다. 레트로바이러스 벡터를 사용하여 바이러스 감염 과정을 활용함으로써 유전자를 숙주 세포에 효율적으로 전달할 수 있다. 레트로바이러스 게놈으로 클로닝된 (즉, 분자생물학 기술을 사용하여 삽입된) 외래 또는 이종 유전자는 레트로바이러스에 의한 감염에 감수성이 있는 숙주 세포에 효율적으로 전달될 수 있다. 공지된 유전자 조작을 통해, 레트로바이러스 게놈의 복제 능력을 파괴할 수 있다. 생성된 복제-결핍 벡터를 사용하여 새로운유전 물질을 세포에 도입할 수 있으나 이들은 복제될 수는 없다. 헬퍼 바이러스 또는 패키징 세포주를 사용하여 벡터 입자 조립 및 세포로부터의 방출이 가능해 질 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 1종 이상의 관심 유전자를 코딩하는 핵산 서열 (즉, 폴리시스트론 핵산 서열은 여러가지 관심 유전자를 코딩할 수 있음), 5'레트로바이러스 장쇄 말단 반복서열 (5' LTR) 및 3' 레트로바이러스 장쇄 말단 반복서열 (3' LTR)을 함유하는 복제-결핍 레트로바이러스 게놈을 포함한다.
"슈도형 레트로바이러스 벡터"라는 용어는 이종 막 단백질을 함유하는 레트로바이러스 벡터를 지칭한다. "막-결합 단백질"이라는 용어는 바이러스 입자를 둘러싼 막과 결합된 단백질 (예를 들면, VSV, 피리, 샨디푸라 및 모콜라와 같은 랍도바이러스과의 바이러스 외피 당단백질 또는 바이러스의 G-단백질)을 지칭하며, 이들 막-결합 단백질은 바이러스 입자의 숙주 세포 침입을 매개한다. 레트로바이러스 외피 단백질 또는 막-결합 단백질이 숙주 세포의 원형질막의 인지질 성분과 상호작용할 수 있는 경우 또는 G-단백질이 랍도바이러스과의 구성원으로부터 유래된 경우에서와 같이, 막-결합 단백질은 세포 표면 단백질 수용체와 결합할 수 있다.
"이종 막-결합 단백질"이라는 용어는 상기 벡터 입자의 뉴클레오캡시드 단백질이 동일한 바이러스 클래스 또는 과의 구성원이 아닌 바이러스에서 유래한 것인 막-결합 단백질을 지칭한다. "바이러스 클래스 또는 과"는 국제 바이러스 분류 위원회 (International Committee on Taxonomy of Viruses)에 의해 결정된 클래스 또는 과의 분류학상 순위를 지칭한다.
"랍도바이러스과"라는 용어는 인간을 비롯한 동물 및 식물을 감염시키며 외피가 있는 RNA 바이러스과를 지칭한다. 랍도바이러스과는 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 코칼 바이러스, 피리 바이러스, 칸디푸라 바이러스, 및 카르프 바이러스의 스프링 바이러스혈증 (카르프 바이러스의 스프링 바이러스혈증을 코딩하는 서열은 진뱅크 (GenBank) 수탁 번호 U18101로 이용가능함) 등을 비롯한 수포성바이러스 (Vesiculovirus) 속을 포함한다. 수포성바이러스 속의 바이러스들의 G-단백질은 외부로 돌출된 동종삼량체 스파이크 (spike) 당단백질 복합체를 형성하는, 바이러스에 의해 코딩되는 인테그랄 막 단백질로서 수용체 결합 및 막 융합에 필요하다. 수포성바이러스 속의 바이러스들의 G-단백질은 팔미트산 (C16) 잔기에 공유결합을 통해 결합되어 있다. 수포성바이러스의 G-단백질들의 아미노산 서열은 꽤 잘 보존되어 있다. 예를 들면, 피리 바이러스 G-단백질은 VSV G-단백질 (인디애나, 뉴저지, 오르세이, 산 주안 등을 비롯한 여러 균주의 VSV가 공지되어 있으며, 이들의 G-단백질들은 상동성이 높음)과 약 38％ 동일성 및 약 55％ 유사성을 공유한다. 칸디푸라 바이러스 G-단백질 및 VSV G-단백질은 약 37％ 동일성 및 52％ 유사성을 공유한다. 수포성바이러스 G-단백질들의 높은 보존성 (아미노산 서열) 및 관련된 기능적 특징 (예를 들면, 바이러스와 숙주 세포의 결합 및 합포체 형성 등을 포함하는 막의 융합)이 주어진 경우, 슈도형 바이러스 입자를 위해 VSV G-단백질 대신 비-VSV 수포성바이러스의 G-단백질을 사용할 수 있다. 리사 바이러스 (랍도바이러스과의 다른 속)의 G-단백질 역시 VSV G-단백질과의 보존도가 상당하며 유사한 방식으로 기능 (예를 들면, 막 융합의 매개)하므로, 슈도형 바이러스 입자를 위해VSV G-단백질 대신 사용될 수 있다. 리사 바이러스로는 모콜라 바이러스 및 광견병 바이러스 (여러 균주의 광견병 바이러스가 공지되어 있으며 이들의 G-단백질이 클로닝 및 서열분석되어 있음) 등이 있다. 모콜라 바이러스 G-단백질은 VSV G-단백질과 스트레치 상동성 (특히 세포외 도메인 및 막횡단 도메인에 걸쳐 존재함)을 공유하며, VSV G-단백질과 약 31％ 동일성 및 48％ 유사성을 나타낸다. 바람직한 G-단백질은 VSV G-단백질과 25％ 이상의 동일성, 바람직하게는 30％ 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 35％ 이상의 동일성을 공유한다. 뉴저지 균주로부터의 VSV G-단백질 (상기 G-단백질의 서열은 진뱅크 수탁 번호 M27165 및 M21557로 제공됨)이 기준 VSV G-단백질로서 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이 "렌티바이러스 벡터"라는 용어는 비분열 세포로 통합될 수 있는 렌티바이러스과 (예를 들면, 인간 면역결핍 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스, 말 감염성 빈혈 바이러스 및 카프린 관절염-뇌염 바이러스)로부터 유래한 레트로바이러스 벡터를 지칭한다 (예를 들어 미국 특허 제5,994,136호 및 동 제6,013,516호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨).
"슈도형 렌티바이러스 벡터"라는 용어는 이종 막 단백질 (예를 들면, VSV, 피리, 샨디푸라 및 모콜라와 같은 랍도바이러스과의 바이러스 외피 당단백질 또는 바이러스의 G-단백질)을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "트랜스포손"이라는 용어는 게놈 내 한 위치에서 다른 위치로 이동하거나 전위할 수 있는 전위 가능한 요소 (예를 들면, Tn5, Tn7 및 Tn1O)를 지칭한다. 통상적으로, 전위는 트랜스포자제에 의해 조절된다. 본원에서 사용된 바와 같이 "트랜스포손 벡터"라는 용어는 트랜스포손의 말단부에 인접한 관심 핵산을 코딩하는 벡터를 지칭한다. 트랜스포손 벡터의 예는 미국 특허 제6,027,722호, 동 제5,958,775호, 동 제5,968,785호 동 제5,965,443호 및 동 제5,719,055호 (상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터"라는 용어는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 등을 비롯하여 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. AAV 벡터는 온전하거나 부분적인, 바람직하게는rep및(또는)cap유전자에서 1개 이상의 AAV 야생형 유전자가 결실되어 있을 수 있으나 기능적 인접 ITR 서열은 보유하고 있다.
당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 AAV 벡터가 양 말단 (5' 및 3')에 기능적 AAV ITR이 인접한 1개 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 제조할 수 있다. 본 발명의 실행시에, AAV 벡터는 1개 이상의 AAV ITR 및 이종 뉴클레오티드 서열의 상류에 위치한 적합한 프로모터 서열 및 이종 서열의 하류에 위치한 1개 이상의 AAV ITR을 포함할 수 있다. "재조합 AAV 벡터 플라스미드"는 플라스미드를 포함하는 재조합 AAV 벡터의 한 유형을 지칭한다. 통상적으로, AAV 벡터의 경우에는 선택된 이종 뉴클레오티드 서열에 5' 및 3' ITR이 인접하고 있다.
또한, AAV 벡터는 폴리아데닐화 부위와 같은 전사 서열 뿐 아니라 선별 가능한 마커 또는 리포터 유전자, 인핸서 서열 및 전사를 유도할 수 있는 기타의 조절 요소까지도 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 상기에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "AAV 비리온"이라는 용어는 완전한 바이러스 입자를 지칭한다. AAV 비리온는 야생형 AAV 바이러스 입자 (AAV 캡시드, 즉, 단백질 코트와 결합된 단일 가닥의 선형 AAV 핵산 게놈을 포함함)이거나, 또는 재조합 AAV 바이러스 입자 (하기 기재함)일 수 있다. 이와 관련하여, 단일 가닥 AAV 핵산 분자 (통상적으로 정의되는 바와 같은 센스/코딩 가닥 또는 안티센스/안티코딩 가닥)는 AAV 비리온으로 패키지될 수 있으며, 센스 및 안티센스 가닥 둘다 동등하게 감염성이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "재조합 AAV 비리온" 또는 "rAAV"라는 용어는 5' 및 3'가 AAV ITR에 인접한 이종 뉴클레오티드 서열을 캡시드화 (즉, 단백질 코트로 둘러쌈)한 AAV 단백질 쉘로 구성된 복제-결핍 감염성 바이러스로 정의된다. 재조합 AAV 비리온을 제조하기 위한 수많은 기술이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,173,414호, WO92/01070, WO93/03769, [Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)], [Vincent et al., Vaccines 90 (1990) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)], [Carter, Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 (1992)], [Muzyczka, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992)], [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Shelling and Smith, Gene Therapy 1:165-169 (1994)] 및 [Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867-1875 (1994)] 참조, 상기 모든 문헌이 본원에 참고로 도입됨).
AAV 벡터 (및 실제로는 본원에 기재한 임의의 벡터)에 사용하기 적합한 뉴클레오티드 서열은 임의의 기능적으로 관련된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터는 표적 세포 게놈에서 결핍되거나 없어진 단백질을 코딩하거나 원하는 생물학적 또는 치료 효과 (예를 들면, 항-바이러스 기능)를 갖는 비천연 단백질을 코딩하는 임의의 원하는 유전자를 포함하거나, 안티센스 또는 리보자임 기능을 갖는 분자에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 적합한 유전자는 AIDS, 암, 신경계 질환, 심혈관계 질환, 콜레스테롤과잉혈증; 다양한 혈액 장애, 예를 들어 다양한 빈혈, 지중해빈혈 및 혈우병 등; 유전적 결함, 예를 들어 낭성 섬유증, 고세병, 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍증, 기종(氣腫) 등과 같은 장애를 포함하는 염증성 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환의 치료에 사용되는 것을 포함한다. 암 및 바이러스 질환에 대한 안티센스 요법에 유용한 수많은 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, mRNA의 번역 개시 부위 (AUG 코돈) 주변의 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드)가 당업계에 기재되어 있다 (예를 들어 문헌 [Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4313-4317 (1991)], [Uhlmann et al., Chem. Rev. 90:543-584 (1990)], [Helene et al., Biochim. Biophys. Acta. 1049:99-125 (1990)], [Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079-7083 (1989)] 및 [Heikkila et al., Nature 328:445-449 (1987)] 참조). 적합한 리보자임에 관한 논의를 위해서는, 예를 들어 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Cech et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:17479-17482] 및 미국 특허 제5,225,347호를 참조한다.
"아데노-관련 바이러스 도립된 말단 반복서열" 또는 "AAV ITR"이란, AAV 게놈 각 말단에서 발견되는 당업계에서 인지되는 회문구조 영역을 의미하며, 이들은 바이러스를 위한 DNA 복제 기점 및 패키징 신호로서 함께 시스로 (in cis) 기능한다. 본 발명에 사용하기 위해서는, 인접 AAV ITR을 1개 이상의 선택된 이종 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3'에 위치시켜,rep코딩 영역 또는 Rep 발현 생성물과 함께 선택된 서열이 표적 세포의 게놈 내로 통합될 수 있도록 한다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 AAV-2 서열의 경우에 대해 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)], [Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Snipe, eds.] 참조). 본원에서 사용된 바와 같이 "AAV ITR"은 도시된 야생형 뉴클레오티드 서열을 가질 필요는 없으나, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환 등에 의해 변경될 수 있다. 추가로, AAV ITR은 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 선택된 이종 뉴클레오티드 서열에 인접한 5' 및 3' ITR은 이들이 의도된 바와 같이 기능하는 한, 즉,rep유전자가 존재 (동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 존재함)하거나 Rep 발현 생성물이 표적 세포에 존재할 때 결합된 이종 서열이 표적 세포 게놈으로 통합되도록 하는 한은 반드시 동일한 AAV 혈청형로부터 유래한 것이거나 단리한 것일 필요는 없다.
본원에서 사용된 바와 같이 "시험관내"라는 용어는 인공적인 환경 및 인공적인 환경에서 일어나는 과정 또는 반응을 지칭한다. 시험관내 환경은 시험관 및 세포 배양물로 구성될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. "생체내"라는 용어는 천연 환경 (예를 들면, 동물 또는 세포) 및 천연 환경에서 일어나는 과정 또는 반응을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "단일 클론에서 유래한"이라는 용어는 1개의 세포에서 유래한 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "단일 클론에서 유래한 것이 아닌"이라는 용어는 1개 초과의 세포에서 유래한 세포주를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "계대 배양"이라는 용어는 특정 밀도 또는 콘플루언시 (예를 들면, 70％ 또는 80％ 콘플루언시)까지 성장시킨 세포 배양물을 희석한 후에 세포를 희석하여 원하는 특정 밀도 또는 콘플루언시로 다시 성장시키는 과정 (예를 들면, 다시 플레이팅하거나 새로운 롤러병에서의 세포 배양을 수립함)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "안정한"이라는 용어가 게놈과 관련하여 사용된 경우, 이는 한 세대에서 다음 세대로 또는 특정 세포주의 경우에는 한 계대에서 다음 계대로 게놈의 정보 내용을 안정하게 유지한다는 것을 지칭한다. 따라서, 게놈 내에서 큰 변화 (예를 들면, 유전자가 결실되거나 염색체 전위가 일어남)가 일어나지 않는다면, 그 게놈은 안정하다고 간주된다. "안정한"이라는 용어는 점 돌연변이 등과 같이 게놈에 발생할 수 있는 미세한 변화를 제외하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "반응"이라는 용어가 분석법과 관련하여 사용된 경우, 이는 검출가능한 신호의 생성 (예를 들면, 리포터 단백질의 축적, 이온 농도 증가, 검출가능한 화학적 생성물의 축적 등)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "막 수용체 단백질"이라는 용어는 리간드 (예를 들면, 호르몬 또는 신경전달물질)와 결합하는 막 스패닝 (spanning) 단백질을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 단백질 인산화는 세포가 세포 외부로부터 핵으로의 조절 신호를 보유하는 단백질을 선택적으로 변형시키기 위해 사용하는 통상적인 조절 메카니즘이다. 이러한 생화학적 변형을 수행하는 단백질은 단백질 키나제로 공지된 효소군이다. 이들은 인산화를 위해 표적으로 하는 기질 잔기에 따라 추가로 정의될 수 있다. 단백질 키나제의 한 군은 표적 단백질을 티로신 잔기에서 선택적으로 인산화하는 티로신 키나제 (TK)이다. 몇몇 티로신 키나제는 막-결합 수용체 (RTK)이고, 리간드에 의해 활성화된 후에는 자가인산화될 수 있을 뿐 아니라 기질을 변형시킬 수도 있다. 리간드 자극에 의한 순차적 인산화의 개시는 이펙터 (effector), 예를 들어, 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 등의 작용을 기초로 하는 패러다임이다. 이들 리간드에 대한 수용체는 티로신 키나제이며, 리간드 (호르몬, 성장 인자)와 표적 세포의 결합 및 1개 이상의 생화학적 경로의 활성화를 통한 세포로의 신호 전달 사이의 접속부를 제공한다. 수용체 티로신 키나제로의 리간드 결합은 이의 내재적 효소 활성을 활성화시킨다 (예를 들어 문헌 [Ullrich and Schlessinger, Cell 61:203-212 (1990)] 참조). 또한, 티로신 키나제는 세포질의 비-수용체형 효소일 수도 있고, 신호 도입 경로의 하류 성분으로서 작용할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "신호 도입 단백질"이라는 용어는 리간드와 막 수용체 단백질의 결합 또는 또는 몇몇 다른 자극에 의해 활성화되거나 달리 효과를 받는 단백질을 지칭한다. 신호 도입 단백질의 예로는 아데닐 사이클라제, 포스포리파제 C 및 G-단백질 등이 있다. 많은 막 수용체 단백질들이 G-단백질에 커플링되어 있다 (즉, G-단백질-커플링된 수용체 (GPCR); 살펴보기 위해서는, 문헌 [Neer, 1995, Cell 80:249-257 (1995)] 참조). 전형적으로, GPCR은 7개의 막횡단 도메인을 함유한다. 추정되는 GPCR은 공지된 GPCR과의 서열 상동성에 기초하여 확인할 수 있다.
GPCR은 리간드가 GPCR의 세포외 부분에 결합한 후에 세포 막을 통한 신호 도입을 매개한다. GPCR의 세포내 부분은 G-단백질과 상호작용하여 세포 외부에서 세포 내부로의 신호 도입을 조정한다. 따라서, GPCR은 G-단백질과 "커플링"되어 있다고 일컬어진다. G-단백질은 GTP와 결합하고 이를 가수분해하는 α 서브유닛 및 이량체 βγ서브유닛의 3개의 폴리펩티드 서브유닛으로 구성된다. 기본적으로, 불활성 상태의 G-단백질은 α 서브유닛 및 βγ서브유닛의 이종삼량체로 존재한다. G-단백질이 불활성인 경우, G-단백질의 α 서브유닛에는 구아노신 디포스페이트 (GDP)가 결합된다. GPCR에 리간드가 결합되거나 GPCR이 리간드에 의해 활성화되는 경우, GPCR은 G-단백질 이종삼량체와 결합하여 GDP에 대한 Gα서브유닛의 친화성을 감소시킨다. 활성 상태에서, G 서브유닛은 GDP를 구아닌 트리포스페이트 (GTP)로 교체하고, 활성 Gα서브유닛은 수용체 및 이량체 βγ서브유닛 모두로부터 해리된다. 해리된 활성 Gα서브유닛은 세포 내 G-단백질 신호전달 경로의 "하류"에 있는 이펙터에 신호를 도입한다. 사실, 활성 G 서브유닛은 G-단백질의 내인성 GTPase 활성에 의해 불활성 상태로 복귀되어 GDP 및 이량체 βγ서브유닛과 결합한다.
다양한 Gα 서브유닛을 코딩하는 20종 초과의 유전자 등을 비롯하여 이종삼량체 G-단백질 족의 수많은 구성원들이 클로닝되어 있다. 다양한 G 서브유닛들은아미노산 서열 및 기능적 상동성에 기초하여 4가지 족으로 분류된다. 이들 4가지 족은 기능에 따라 Gαs, Gαi, Gαq, Gα12로 일컬어진다. 기능적으로, 이들 4가지 족은 이들이 활성화시키는 세포내 신호전달 경로 이들과 커플링된 GPCR이 상이하다.
예를 들면, 특정 GPCR은 통상적으로 Gαs와 커플링되고 이들 GPCR은 상기 Gαs를 통해 아데닐릴 사이클라제 활성을 자극시킨다. 다른 GPCR은 통상적으로 GGαq와 커플링되고 이들 GPCR은 상기 GGαq를 통해 포스포리파제 C의 β이소형 (isoform) (즉, PLCβ [Stermweis and Smrcka, Trends in Biochem. Sci. 17:502-506 (1992)]) 등과 같은 포스포리파제 C (PLC)를 활성화시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "면역글로불린"이라는 용어는 특이적 항원에 결합하는 단백질을 지칭한다. 면역글로불린으로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 및 하기 클래스의 면역글로불린 등이 있으나 이에 제한되지 않는다: IgG, IgA, IgM, IgD, IbE 및 분비된 면역글로불린 (sIg). 면역글로불린은 통상적으로 2개의 동일한 중쇄 (γ, α, μ, δ 또는 ε) 및 2개의 경쇄 (κ 또는 λ)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "항원 결합 단백질"이라는 용어는 특이적 항원에 결합하는 단백질을 지칭한다. "항원 결합 단백질"로는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라 및 인간화 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 및 Fab 발현 라이브러리 및 단쇄 항체 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 폴리클로날 항체를 제조한다. 항체 제조를 위해서, 토끼, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물에 원하는 에피토프에 상응하는 펩티드를 주사하여 이를 면역화할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 펩티드를 면역원성 담체 (예를 들면, 디프테리아 톡소이드, 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH))와 접합시킨다. 숙주 종에 따라 프로인트 (Freund's) (완전 및 불완전 프로인트), 미네랄 겔, 예를 들어 수산화 알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트, 예를 들어 BCG (칼메트 게랑 간균) 및 코리네박테리움 파르붐 등의 다양한 아쥬반트를 사용하여 면역 반응을 증가시킨다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 배양된 연속 세포주에 의한 항체 분자 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 이들 기술로는 쾰러 (Koehler) 및 밀스타인 (Milstein)이 최초로 개발한 하이브리도마 기술 [Koehler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)] 뿐 아니라 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Kozbor et al. Immunol. Today 4:72 (1983)] 및 인간 모노클로날 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)] 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
원한다면, 본 발명에 따라서 단쇄 항체 생산을 위해 기재된 기술 (본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,946,778호)을 변형하여 특이적 단쇄 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 추가의 실시양태에서는 Fab 발현 라이브러리를 제조하기 위한 당업계에 공지된 기술 [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]을 사용하여, 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 수월하게 확인할 수 있다.
항체 분자의 이디오타입 (항원 결합 영역)을 함유하는 항체 단편은 공지된 기술을 통해 생성될 수 있다. 이러한 단편의 예로는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편, F(ab')2 단편의 이황 결합을 환원시켜 생성될 수 있는 Fab' 단편 및 항체 분자에 펩신 및 환원제를 처리하여 생성될 수있는 Fab 단편 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
항원 결합 단백질을 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 방법으로 단리할 수 있다. 항체 생산시에, 당업계에 공지된 기술 (예를 들면, 방사선면역분석법, ELISA (효소-결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역방사 분석법, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 분석법, 계내 (in situ) 면역분석법 (예를 들어 콜로이드성 금, 효소 또는 방사선 동위원소 표지 사용), 웨스턴 블럿, 침전 반응, 응집 분석법 (예를 들면, 겔 응집 분석법, 혈구 응집소 분석법 등), 보체 고정 분석법, 면역형광 분석법, 단백질 A 분석법 및 면역전기영동 분석법 등)을 통해 원하는 항체에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 "리포터 유전자"라는 용어는 분석될 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제 (예를들어 문헌 [deWet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987)] 및 미국 특허 제6,074,859호, 동 제5,976,796호, 동 제5,674,713호 및 동 제5,618,682호 참조, 상기 문헌 모두가 본원에 참고로 도입됨), 녹색 형광 단백질 (예를 들면, 진뱅크 수탁 번호 U43284; 수많은 GFP 변이체가 미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론테크 래버러토리스 (CLONTECH Laboratories)에 의해 시판됨), 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이 퍼옥시다제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이 "정제된"이라는 용어는 이들의 천연 환경에서 취해져서 단리되거나 분리된 핵산 또는 아미노산 서열의 분자를 지칭한다. 따라서, "단리된 핵산 서열"은 정제된 핵산 서열이다. "실질적으로 정제된" 분자는 이들과 천연적으로 회합되어 있던 다른 성분들이 60％ 이상, 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상 유리된 것이다.
본 발명은 벡터의 발현에 사용하기 위한 신규 조절 서열을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 신규 조절 요소를 함유하는 레트로바이러스 발현 벡터를 제공한다. 또한, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 관심 단백질을 발현하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 다수의 서브유닛으로 구성된 단백질 (예를 들어, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄, 또는 여포 자극 호르몬의 서브유닛들)의 쇄 2가지를 거의 동일한 비율로 발현하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본 발명의 신규 조절 서열 및 벡터를 이용하여 선행 기술의문제점을 해결한다.
I. 레트로바이러스 발현 벡터의 성분
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 작동 가능하게 연결된 a) 5' LTR; b) 패키징 신호; c) 3' LTR; 및 d) 5' LTR과 3' LTR 사이에 위치한 관심 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또한, 몇몇 바람직한 실시양태에서는 하기 기재된 것 등을 비롯한 신규 조성물이 관심 단백질의 발현, 분비 및 정제를 보조하기 위하여 발현 벡터에 포함된다. 하기 신규 요소들은 아래에 보다 상세히 설명된다: 소/인간 하이브리드 알파-락트알부민 (α-LA) 프로모터 (A), 돌연변이체 RNA 배출 요소 (B), 및 내부 리보솜 유입 부위 (C).
A. 소/인간 하이브리드 알파 락트알부민 프로모터
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 하이브리드 α-락트알부민 (α-LA) 프로모터를 제공한다. 하이브리드 프로모터는 2종 이상의 임의 포유동물 α-락트알부민 프로모터들의 부분으로부터 제조될 수 있는 것으로 고려된다 (예를 들어, 인간, 소, 염소, 양, 토끼 또는 마우스 α-락트알부민 프로모터; 예를 들어 젠뱅크 승인번호 AF124257, AF123893, AX067504; 문헌 [Soulier et al., Transgenic Res. 8(1):23-31 (1999)], [McKee et al., Nat. Biotech. 16(7):647-51 (1998)], [Lubon et al., Biochem. J. 256(2):391-6 (1988)], 및 미국 특허 제5,530,177호 참조). 몇몇 실시양태에서, 하이브리드에 기여하는 1종 이상의 프로모터의 부분은 길이가 50 뉴클레오티드 이상이고, 바람직한 실시양태에서는 하이브리드에 기여하는 1종 이상의 프로모터 부분의 길이가 100 뉴클레오티드이며, 특히 바람직한 실시양태에서는 하이브리드에 기여하는 1종 이상의 프로모터 부분의 길이가 500 뉴클레오티드로, 하이브리드에 기여하는 1종 이상의 다른 프로모터의 부분의 길이가 유사하거나 더 길다. 일단 하이브리드 프로모터가 제조되면, 이 프로모터를 베타-갈락토시다제, 녹색 형광 단백질 또는 루시퍼라제와 같은 리포터 유전자와 작동 가능하게 연결시키고, 결과의 구조물을 포함하는 형질전환 마우스 또는 소와 같은 형질전환 동물을 생성하고, 생성된 형질전환 동물의 다양한 조직을 분석하여 하이브리드 프로모터로부터의 발현 특이성을 측정함으로써 프로모터의 기능을 분석할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 하이브리드 프로모터로부터의 발현은 실질적으로 유선에, 특히 유방 상피 세포에 특이적이며, 다른 조직에서는 발현되지 않거나 단지 미량으로 발현된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 하이브리드 프로모터는 소/인간 하이브리드 α-락트알부민 (α-LA) 프로모터 (서열 1)이다. 이 프로모터의 인간 부분은 인간 게놈 DNA로부터 유래하였으며, 전사 개시부에 대해 +15 위치에서 전사 개시부에 대해 -600 위치까지의 염기를 함유한다. 소 부분은 인간 부분의 말단에 부착되며, 전사 개시부에 대해 -550 위치에서 -2000 위치에 해당한다.
본 발명에서 바람직하게 사용되는 하이브리드 프로모터는 내부 폴리-아데닐화 신호를 함유하는 인간 프로모터의 영역을 사용한다. 내부 폴리-아데닐화 신호는 돌연변이에 의해 제거되었다. 돌연변이는 2012번째 염기에서 유발되었으며, A가 T로 변한 것이다. 본 발명이 어느 특정 작용 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 폴리-아데닐화 신호를 제거하면 미성숙 mRNA 종결 문제점을 제거하여 레트로바이러스 RNA 생성을 개선시키는 것으로 고려된다. 또한, 부가의 인핸서 영역이 인간에는 존재하지만, 소의 서열에는 존재하지 않는 것으로 고려된다. 하이브리드 프로모터는 이들 부가 서열을 이용하여 제조되었다. 이와 유사하게, 하이브리드 프로모터는 인간 프로모터에서 발견될 수도 있고 발견되지 않을 수도 있는 소의 요소를 함유한다.
B. RNA 배출 요소
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 RNA 배출 요소 (프리-mRNA 프로세싱 요소 (PPE), Mertz 서열 또는 WPRE; 예를 들어, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,914,267호 및 5,686,120호와 PCT 공개 WO99/14310호 참조)를 포함한다. 본 발명이 어느 특정 작용 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, RNA 배출 요소를 사용하면 관심 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 스플라이스 신호 또는 인트론을 혼입시키지 않고 관심 단백질의 높은 발현 수준이 가능해지거나 용이해지는 것으로 고려된다.
몇몇 실시양태에서는 돌연변이화된 PPE 요소가 사용된다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, PPE 서열은 돌연변이화되어 내부 ATG 서열이 제거된다. 본 발명이 어느 특정 작용 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 내부 개시 서열을 제거하면 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하는 것으로 고려된다. 돌연변이화된 PPE 서열을 사용하는 몇몇 실시양태에서, 서열 2의 염기 4, 112, 131 및 238이 G에서 T로 변하였다. 모든 경우, 이들 변화는 ATG 개시 코돈이 ATT 코돈으로 돌연변이화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 돌연변이화된 PPE 서열은 관심 유전자를 코딩하는 mRNA의 5' 비번역 영역 (UTR)에 위치한다. 다른 실시양태에서, 돌연변이화된 PPE 서열은 관심 유전자를 코딩하는 mRNA의 3' URT에 위치한다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 링커에 의해 분리된 2개의 돌연변이화 PPE 서열이 헤드 투 테일 (head to tail) 배열로 위치한다 (예를 들어, 서열 2 참조). 2 카피의 서열이 mRNA 배출에 보다 극적인 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 다른 실시양태에서, 2 내지 20 카피의 돌연변이화 PPE 서열이 관심 유전자를 코딩하는 mRNA에 위치한다.
상기 서열들의 기능성 변이체는, 변이체 서열을 벡터 중의 시험 유전자에 작동 가능하게 연결시키고, 숙주 세포를 상기 벡터로 형질감염시키고, 시험 유전자의 발현에 대해 숙주 세포를 분석함으로써 용이하게 확인한다. 적합한 시험유전자, 숙주 세포 및 벡터는 실시예에 기재되어 있다.
C. 내부 리보솜 유입 부위
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)/신호 펩티드 서열 (예를 들어, 서열 3 및 12)을 포함한다. 본 발명에서는 다양한 신호 서열이 다양한 IRES 서열과 융합될 수 있음을 고려하고 있다. 적합한 신호 서열에는 α-락트알부민, 카제인, 조직 플라스미노겐 활성자, 혈청 알부민 및 락토페린으로부터의 신호 서열이 포함된다 (예를 들어 문헌 [Zwizinski et al., J. Biol. Chem. 255(16):7973-77 [1980]], [Gray et al., Gene 39(2):247-54 [1985]] 및 [Martialet al., Science 205:602-607 [1979]] 참조). 그러한 분비 신호 서열은 바람직하게는 조직 특이적 발현을 위해 표적화된 세포형으로부터 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 유래한다 (예를 들어, 분비성 유세포에서의 발현 및 분비를 위한 분비 모유 단백질). 적합한 IRES 서열에는 발 및 구강 질환 바이러스 (FDV), 뇌심근염 바이러스, 폴리오바이러스 및 RDV로부터 유래한 것들이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (Scheper et al., Biochem. 76:801-809 [1994]; Meyer et al., J. Virol. 69:2819-2824 [1995]; Jang et al., 1988, J. Virol. 62:2636-2643 [1998]; Haller et al., J. Virol. 66:5075-5086 [1995]). 기능성 IRES/신호 펩티드 서열은, 2개의 유전자 서열을 상기 서열 및 적당한 프로모터와 작동 가능하게 연결시키고, 이 구조물로 숙주 세포를 형질감염시키고, 2개의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생산에 대해 숙주 세포를 분석함으로써 확인할 수 있다. 적합한 유전자, 벡터 구조물, 및 그러한 스크리닝을 위한 숙주 세포는 실시예에 제공된다. 바람직한 실시양태에서, IRES 및 신호 펩티드에 대한 코딩 서열은, 개재 코딩 서열없이 (즉, 몇몇 경우에는 비코딩 서열에 의해 분리될 수 있음) 서로 인접해 있다.
본 발명이 어느 특정 작용 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. IRES는 유전자의 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 함으로써, 2개의 관심 유전자가 동일한 구조물에서 발현되도록 한다. 소 α-락트알부민 신호 펩티드 또는 카제인 신호 펩티드는 발현된 단백질 생성물의 세포외 분비를 유발한다.
몇몇 실시양태에서, 신호 펩티드의 최초 ATG는 IRES로부터의 가장 효율적인번역이 가능하도록 IRES에 부착되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 신호 펩티드의 두번째 코돈이 ATG에서 GCC로 돌연변이화되어, α-락트알부민 신호 펩티드의 두번째 아미노산을 메티오닌에서 알라닌으로 변화시킨다. 본 발명이 어느 특정 작용 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 이 돌연변이는 IRES에 의한 보다 효율적인 번역 개시를 용이하게 하는 것으로 고려된다. 몇몇 실시양태에서, (IRES)/신호 펩티드는 벡터에서 2개의 관심 유전자 사이에 삽입된다. 이러한 실시양태에서, (IRES)/신호 펩티드는 제2 번역 개시부를 생성하여 2개의 폴리펩티드가 동일한 발현 벡터에서 발현되도록 한다. 즉, 2가지 상이한 폴리펩티드 (예를 들어, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄)를 코딩하는 단일 전사체가 생성된다.
몇몇 실시양태에서, 신호 펩티드는 α-락트알부민으로부터 유래한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 내부 리보솜 유입 부위 (IRES)와 변형된 소 α-S1 카제인 신호 펩티드의 융합 단백질 (서열 12)을 포함한다. 본 발명이 어느 특정 작용 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. IRES는 유전자의 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 함으로써, 2개의 관심 유전자가 동일한 구조물에서 발현되도록 한다. 소 α-S1 카제인 신호 펩티드는 발현된 단백질 생성물의 분비를 유발한다.
몇몇 실시양태에서, 소 α-S1 카제인 신호 펩티드의 두번째 코돈이 AAA에서 GCC로 돌연변이화된다. 이 돌연변이는 신호 펩티드의 두번째 코돈을 알라닌에서 리신으로 변화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 신호 펩티드의 세번째 코돈이 CTT에서TTG로 돌연변이화되어, 아미노산이 치환되지 않은 채로 변화된다. 본 발명이 어느 특정 작용 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 이 돌연변이는 IRES에 의한 보다 효율적인 번역 개시를 가능하게 하는 것으로 고려된다.
II. 레트로바이러스 발현 벡터
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 레트로바이러스 발현 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 (레트로바이러스과)는 일반적으로 3개의 군으로 분류된다: 스푸마바이러스 (spumavirus; 예를 들어, 인간 거품형성 바이러스), 렌티바이러스 (lentivirus; 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 및 양 비스나 (visna) 바이러스), 및 온코바이러스 (oncovirus; 예를 들어, MLV 및 라우스 육종 바이러스).
레트로바이러스 벡터는 외피가 있는 (즉, 숙주 세포로부터 유래한 지질 이중층 막으로 둘러싸임) 단일 가닥 RNA 바이러스로, 동물 세포를 감염시킨다. 레트로바이러스가 세포를 감염시킬 때, 바이러스의 RNA 게놈은 이중 가닥의 선형 DNA 형태로 전환된다 (즉, 역전사됨). 바이러스의 DNA 형태는 그 후에 프로바이러스 (provirus)로서 숙주 세포의 게놈 내로 통합된다. 프로바이러스는 부가의 바이러스 게놈 및 바이러스 mRNA의 생성을 위한 주형으로서 작용한다. 2 카피수의 게놈 RNA를 함유하는 성숙 바이러스 입자가 감염된 세포의 표면으로부터 만들어진다. 바이러스 입자는, 바이러스 외피 당단백질 (또한 막-결합 단백질로도 언급됨)을 함유하는 숙주 세포 유래의 지질 이중층 막에 의해 둘러싸인 바이러스 캡시드 (바이러스gag유전자 생성물을 함유함) 내에 게놈 RNA, 역전사효소 및 다른pol유전자 생성물을 포함한다.
다수 레트로바이러스의 게놈 구성은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 레트로바이러스 게놈의 개조를 가능하게 한다. 관심 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스 벡터는 통상 2단계로 제조한다.
우선, 관심 유전자를 관심 유전자의 효율적인 발현에 필요한 서열들 (바이러스의 장쇄 말단 반복서열 (LTR) 또는 내부 프로모터/인핸서에 의해 제공될 수 있는 프로모터 및(또는) 인핸서 요소 및 관련 스플라이싱 신호를 포함함), 감염성 비리온 (virion) 내로 바이러스 RNA의 효율적인 패키징에 필요한 서열들 (예를 들어, 패키징 신호 (Psi), tRNA 프라이머 결합 부위 (-PBS), 역전사에 필요한 3' 조절 서열들 (+PBS)), 및 바이러스 LRT을 함유하는 레트로바이러스 벡터 내로 삽입한다. LTR은 바이러스 게놈 RNA, 역전사효소 및 인테그라제 기능의 결합에 필요한 서열들, 및 바이러스 입자 내로 패키징될 게놈 RNA의 발현 유도에 관여하는 서열들을 함유한다. 안전성의 이유로, 다수의 재조합 레트로바이러스 벡터는 바이러스의 복제에 필요한 유전자의 기능적 카피가 결여되어 있다 (이들 필수 유전자가 결실되거나 무능화됨). 따라서, 결과의 바이러스는 "복제 결함"이라 불리운다.
다음으로, 재조합 벡터의 제조 이후에, 이 벡터 DNA를 패키징 세포주 내로 도입한다. 패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA의 원하는 숙주 범위를 갖는 바이러스 입자 내로의 패키징에 트랜스로 필요한 바이러스 단백질 (즉, 바이러스-코딩 gag, pol 및 env 단백질)을 제공한다. 숙주 범위는 바이러스 입자의 표면에 발현된 외피 유전자 생성물의 유형에 의해 부분적으로 조절된다. 패키징 세포주는 외생의 (ectotrophic), 양생의 (amphotropic) 또는 이종의 (xenotropic) 외피 유전자 생성물을 발현한다. 별법으로, 패키징 세포주는 바이러스 외피 (env) 단백질을 코딩하는 서열이 결여될 수 있다. 이 경우, 패키징 세포주는 막-결합 단백질 (예를 들어, env 단백질)이 결여된 입자 내로 바이러스 게놈을 패키징시킬 것이다. 막에 결합한 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생성하여 바이러스를 세포 내로 유입시키기 위해, 레트로바이러스 서열을 함유하는 패키징 세포주는 통상 막-결합 단백질 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스 (VSV)의 G 단백질)을 코딩하는 서열들로 형질감염된다. 형질감염된 패키징 세포주는 그 후에 형질감염된 세포주에 의해 발현되는 막-결합 단백질을 함유하는 바이러스 입자를 생성할 것이다. 다른 바이러스의 외피 단백질에 의해 둘러싸인 특정 바이러스로부터 유래한 바이러스 게놈 RNA를 함유하는 이들 바이러스 입자는 "슈도형 바이러스 입자"라 불리운다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 부가의 조절 서열들을 포함하도록 더 변형될 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 작동 가능하게 연결된 a) 5' LTR; b) 패키징 신호; c) 3' LTR; 및 d) 5' LTR과 3' LTR 사이에 위치하는 관심 유전자를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 내부 프로모터로부터의 전사가 바람직할 때, 관심 핵산은 5' LTR과 반대 방향으로 배열될 수 있다. 적합한 내부 프로모터에는 알파-락트알부민 프로모터, CMV 프로모터 및 티미딘 키나아제 프로모터가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 관심 단백질의 분비가 바람직한 경우, 벡터는 관심 단백질과 작동 가능하게 연결된 신호 펩티드 서열을 포함하도록 변형된다. 몇몇 적합한 신호 펩티드의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로는 조직 플라스미노겐 활성자, 인간 성장 호르몬, 락토페린, 알파 S1-카제인 및 알파-락트알부민으로부터 유래한 것이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 벡터는 RNA 배출 요소, PPE 요소 및 IRES/소 α-락트알부민 신호 서열 등을 비롯하여 상기 설명한 요소들 중 하나 이상을 혼입함으로써 변형된다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 형질전환된 세포의 선별을 용이하게 해주는 선별 가능한 마커를 더 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 다수의 선별 가능한 마커가 본 발명에서 유용하며, 여기에는 포유동물 세포에서 약물 G418에 대한 내성을 부여하는 박테리아 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제 유전자 (또한 "neo유전자"로도 언급됨), 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 박테리아 하이그로마이신 G 포스포트랜스퍼라제 (hyg) 유전자, 및 마이코페놀산의 존재시에 성장능을 부여하는 박테리아 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자 (또한 "gpt유전자"로도 언급됨) 등이 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 선별 가능한 미커 유전자는, 또한 관심 단백질을 코딩하는 폴리시스트론 서열의 일부로서 제공된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 재조합 시스템 (예를 들어, cre/loxP 또는 flp 리콤비나제 시스템; 본원에 참고로 도입된 문헌 [Hoess et al., Nucleic Acids Res., 14:2287 [1986]], [O'Gorman et al., Science251:1351 [1991]], [van Deursen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7376 [1995]], 및 미국 특허 제6,025,192호 참조)에 의해 인식되는 재조합 요소들을 포함할 수 있다. 벡터가 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 후, 숙주 세포는 재조합 효소 (예를 들어, Cre 리콤비나제) 또는 리콤비나제 효소를 코딩하는 핵산 서열, 및 관심 핵산 서열이 통합된 벡터 내로 삽입되도록 재조합 효소에 의해 인식되는 서열과 인접한 관심 단백질을 코딩하는 1종 이상의 핵산 서열에 의해 일시적으로 형질감염 (예를 들어, 전기천공법, 리포펙션법 또는 미세주입법에 의해)될 수 있다.
재조합 레트로바이러스 벡터를 비롯한 바이러스 벡터는, 핵산의 인산칼슘-DNA 동시침전법 또는 DEAE-덱스트란-매개의 형질감염, 전기천공법 또는 미세주입법과 같은 다른 기술에 비해 세포 내로 유전자를 전달하는 보다 효율적인 수단을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명이 어느 특정 메카니즘에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 메카니즘의 이해가 본 발명을 실시하는 데 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 바이러스 전달의 효율은 부분적으로 핵산의 전달이 수용체-매개의 과정 (즉, 바이러스가 표적 세포 표면의 특정 수용체 단백질에 결합함)이라는 사실 때문인 것으로 생각된다. 또한, 일단 세포 내에서는 바이러스에 의해 전달된 핵산이 제어된 방식으로 통합된다. 이는 통상적으로 재배열 및 분해되는 다른 수단 (예를 들어, 인산칼슘-DNA 동시침전법)에 의해 전달된 핵산과 대조적이다.
하기 실시예 1은 본 발명의 레트로바이러스 벡터에 대한 여러가지 예시적인 실시예를 설명한다. 그러나, 본 발명이 실시예 1에 기재된 벡터로 제한되는 것은 아니다. 실제로는, 본 발명의 신규 요소들을 함유하는 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터가 고려된다. 더욱이, 상기 설명한 요소들은 AAV 벡터, 트랜스포손 벡터, 플라스미드, 박테리아 인공 염색체 및 효모 인공 염색체와 같은 다른 벡터에서도 유용하다.
III. 단백질의 발현
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 상기 기재된 벡터 및 조절 요소는 1종 이상의 단백질 발현에 유용하다. 본 발명이 어느 특정 단백질의 발현에 제한되는 것은 아니다. 실제로는, 에리트로포이에틴, 알파-인터페론, 알파-1 단백질분해효소 억제제, 안지오제닌, 항-트롬빈 Ⅲ, 베타-산 데카르복실라제, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 돼지 성장 호르몬, 인간 혈청 알부민, 베타-인터페론, 송아지 장 알칼리성 포스파타제, 다낭성 섬유증 막횡단 조절 인자, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인슐린, 락토페린, 조직 플라스미노겐 활성자, 미엘린 기본 단백질, 인슐린, 프로인슐린, 프로락틴, B형 간염 바이러스 항원, 면역글로불린, 모노클로날 항체 CTLA4 Ig, Tag 72 모노클로날 항체, Tag 72 단일쇄 항체 결합 단백질, 단백질 C, 사이토카인 및 이들의 수용체 (예를 들어, 종양 괴사 인자 알파 및 베타), 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지질단백질, 알파-1-항-트립신, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체 호르몬, 글루카곤, 폰 빌레브란트 인자, 동맥 나트륨뇨 인자, 폐 표면활성제, 유로키나아제, 봄베신, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 엔케팔리나제, 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-알파), 혈청 알부민 (예를 들어, 뮬러리안-억제 물질), 릴렉신 A-쇄, 릴렉신 B-쇄, 프로릴렉신, 마우스 고나도트로핀-결합 펩티드, 베타-락타마제, DNase, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 인테그린, 단백질 A 또는 D, 류마티스성 인자, 신경 인자 (예를 들어, 골-유래의 신경 인자 (BDNF)), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 신경 성장 인자 (예를 들어, NGF-베타), 상피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 (TGF) (예를 들어, TGF-알파, 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-베타), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF (뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질, CD 단백질 (예를 들어, CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19), 골유도성 인자, 면역독소, 골 형태 형성 단백질 (BMP), 인터페론 (예를 들어, 인터페론-알파, -베타 및 -감마), 콜로니 자극 인자 (CSF) (예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF), 인터루킨 (IL) (예를 들어, IL-1 내지 IL-10), 수퍼옥사이드 디스뮤타아제, T-세포 수용체, 표면 막 단백질, 분해 촉진 인자, 바이러스 항원 (예를 들어, AIDS 외피의 일부), 수송 단백질, 귀소성 (homing) 수용체, 어드레신 (addressin), 항체, 키메라 단백질 (예를 들어, 면역어드헤신), 및 상기 폴리펩티드의 임의 단편 등을 비롯한 다양한 단백질의 생산이 고려된다. 당업자는 이들 단백질의 핵산 서열 및 그 상동체가 공개 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크)로부터 입수 가능함을 알 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 벡터는 1종 이상의 외인성 단백질을 발현하는 데 사용된다. 예를 들어, 숙주 세포는 상이한 관심 단백질들을 코딩하는 벡터로 형질감염 (예를 들어, 제1 관심 단백질을 코딩하는 하나의 벡터와 제2 관심 단백질을 코딩하는 두번째 벡터로 동시형질감염)될 수 있다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 단백질은 상이한 관심 단백질들을 폴리시스트론 서열 (예를 들어, 디시스트론 또는 트리시스트론 서열)로 배열함으로써 발현된다. 이 배열은 상이한 관심 단백질들을 1 대 1의 몰비로 발현하는 것이 요망되는 경우 (예를 들어, 면역글로불린 분자의 경쇄 및 중쇄 발현)에 특히 유용하다.
A. 세포 배양액에서 단백질의 발현
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 단백질은 세포 배양액에서 발현된다. 몇몇 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터가 래트 섬유아세포, 소 신장 세포 및 인간 신장 세포 등을 비롯한 포유동물 조직 배양 숙주 세포에서의 단백질 발현에 사용되며, 몇몇 바람직한 실시양태에서는 단백질이 소의 유세포에서 발현된다. 숙주 세포는 당업계 공지의 방법에 따라 배양되고, 포유동물 세포에 대한 적합한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Immunol. Methods 56:221 [1983]], [Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York [1992]] 참조).
본 발명은 다양한 숙주 세포의 통합 벡터로의 형질감염을 고려하고 있다. 다수의 포유동물 숙주 세포주가 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 이들 숙주 세포는, 하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이 적당한 영양물질 및 성장 인자를 함유하는 배지에서 단층 배양 또는 현탁 배양으로 배양되는 경우에 성장 및 생존할 수 있다. 통상, 세포는 다량의 특정 관심 단백질을 발현하여 배양 배지 내로 분비할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 예에는 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO-K1, ATCC CCl-61), 소 유방 상피 세포 (ATCC CRL 10274; 소 유방 상피 세포),SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포주 (293 또는 현탁 배양에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포; 예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]] 참조), 어린 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]), 원숭이 신장 세포 (CV1, ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1578), 인간 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포 (et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]), MRC 5 세포, FS4 세포, 래트 섬유아세포 (208F 세포), MDBK 세포 (소 신장 세포), 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
포유동물 세포주 이외에, 본 발명은 또한 식물 프로토플라스트 (protoplast)를 낮은 또는 높은 감염다중도에서 통합 벡터로 형질감염시키는 것을 고려하고 있다. 예를 들어, 본 발명은 1종 이상의 통합 벡터, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 가장 바람직하게는 슈도형 레트로바이러스 벡터를 포함하는 식물 세포 또는 전체 식물을 고려하고 있다. 프로토플라스트로부터 재생에 의해 생성될 수 있는 모든 식물도 본 발명에 따른 방법을 이용하여 형질감염될 수 있다 (예를 들어, 솔라눔 (Solanum), 니코티아나 (Nicotiana), 브라시카 (Brassica), 베타 (Beta), 피숨 (Pisum), 파세올루스 (Phaseolus), 글리신 (Glycine), 헬리안투스(Helianthus), 알리움 (Allium), 아베나 (Avena), 호르데움 (Hordeum), 오리자 (Oryzae), 세라티아 (Setaria), 세칼레 (Secale), 소르굼 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum), 제아 (Zea), 뮤사 (Musa), 코코스 (Cocos), 시도니아 (Cydornia), 피루스 (Pyrus), 말루스 (Malus), 페닉스 (Phoenix), 엘라이스 (Elaeis), 루부스 (Rubus), 프라가리아 (Fragaria), 프루누스 (Pmslus), 아라키스 (Arachis), 파니쿰 (Panicum), 사카룸 (Saccharum), 코페아 (Coffea), 카멜리아 (Camellia), 아나나스 (Ananas), 비티스 (Vitis) 또는 시트루스 (Citrus) 속의 배양 식물). 일반적으로, 프로토플라스트는 통상적인 방법 (예를 들어, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제4,743,548호, 제4,677,066호, 제5,149,645호 및 제5,508,184호)에 따라 생성된다. 식물 조직은 적당한 삼투압 (예를 들어, 3 내지 8 중량％의 당 폴리올) 및 1종 이상의 다당류 가수분해효소 (예를 들어, 펙티나제, 셀룰라제 등)를 갖는 적당한 배지 중에 분산되어, 세포벽 분해가 프로토플라스트를 생성하기에 충분한 시간 동안 진행될 수 있다. 여과 후, 프로토플라스트는 원심분리에 의해 단리될 수 있고, 그 후 처리 또는 사용을 위해 재현탁될 수 있다. 배양액 중 프로토플라스트의 전체 식물로의 재생은 당업계 공지의 방법에 의해 수행된다 (예를 들어, 문헌 [Evans et al., Handbook of Plant Cell Culture, 1: 124-176, MacMillan Publishing Co., New York [1983]], [Binding, Plant Protoplasts, p. 21-37, CRC Press, Boca Raton [1985]] 및 [Potrykus and Shillito, Methods in Enzymology, Vol. 118, Plant Molecular Biology, A. and H. Weissbach eds., Academic Press, Orlando [1986]] 참조).
또한, 본 발명은 양서류 및 곤충 숙주 세포주의 사용을 고려하고 있다. 적합한 곤충 숙주 세포주의 예에는 모기 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-1660)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 적합한 양서류 숙주 세포주에는 두꺼비 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-102)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포 배양액은 배양될 특정 세포에 적합한 배지에서 제조된다. 상업적으로 시판되는 배지, 예를 들어, Ham's F10 (Sigma, St. Louis, MO), 최소 필수 배지 (Minimal Essential Medium, MEM; Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM; Sigma)가 대표적인 영양 용액이다. 적합한 배지는 또한 미국 특허 제4,767,704호, 제4,657,866호, 제4,927,762호, 제5,122,469호, 제4,560,655호, 및 PCT 공개 WO 90/03430호 및 WO 87/00195호 (각각이 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, 젠타마이신), 미량 원소 (예를 들어, 통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 지질 (예를 들어, 리놀레산 또는 기타 지방산) 및 이들의 적합한 담체, 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물도 당업계 공지의 적당한 농도로 포함될 수 있다. 포유동물 세포 배양의 경우, 배양 배지의 삼투 농도는 일반적으로 약 290 내지 330 mOsm이다.
또한, 본 발명은 숙주 세포의 성장 및 발현을 위해 다양한 배양 시스템 (예를 들어, 페트리디쉬, 96웰 플레이트, 롤러병 및 생물반응기)의 사용을 고려하고 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 관류 시스템에서 배양될 수 있다. 관류 시스템은 높은 세포 농도로 유지되는 배양액을 통해 지속적으로 배양 배지를 흘려 공급하는 것을 나타낸다. 세포는 현탁되어 성장하기 위한 고형 지지체가 불필요할 수도 있다. 일반적으로, 신선한 영양물이 독성 대사 산물의 제거와 함께 지속적으로 공급되어야 하며, 이상적으로는 사멸 세포의 선택적 제거도 수반해야 한다. 여과, 포획 (entrapment) 및 미세캡슐화 방법 모두가 충분한 속도로 배양 환경을 새롭게 해주는 데 적합하다.
다른 실시양태에서, 공급 회분식 배양 방법이 사용된다. 바람직한 공급 회분식 배양 방법에서, 포유동물 숙주 세포 및 배양 배지를 배양 용기에 최초로 공급하고, 배양하는 동안에 배양 종결 전에 주기적으로 세포 및(또는) 생성물을 수확하거나 수확하지 않으면서 부가의 배양 영양물질을 지속적으로 또는 일정 간격으로 배양액에 공급한다. 몇몇 실시양태에서, 공급 회분식 배양은 전체 배양액 (세포 및 배지 포함)이 배양 용기에서 제거되고 신선한 배지로 대체되는 반-지속적인 공급 회분식 배양이다. 공급 회분식 배양은, 모든 세포 배양 성분 (세포 및 모든 배양 영양물질 포함)이 배양 과정의 출발 시점에서 배양 용기에 공급되는 단순한 회분식 배양과 구별된다. 또한 공급 회분식 배양은, 배양시 배양 용기로부터 상층액이 제거되지 않는 한은 관류 배양과도 구별된다 (관류 배양에 있어서, 세포는 배양액에 속박되고 (예를 들어, 여과, 캡슐화, 미세담체로의 부착 등에 의해) 배양 배지는 지속적으로 또는 단속적으로 도입되어 배양 용기로부터 제거됨).
또한, 배양액의 세포는 고려된 특정 숙주 세포 및 특정 생산 계획을 위해 적합한 임의의 계획 또는 통상적인 방법에 의해 증식시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 1단계 및 다단계의 배양 절차를 고려하고 있다. 1단계 배양에 있어서, 숙주 세포는 배양 환경에 접종되고, 본 발명의 방법이 세포 배양의 단일 생산 단계에 이용된다. 다단계 배양 절차에 있어서, 세포는 다수의 단계로 배양된다. 예를 들어, 세포를 제1 단계 또는 성장 단계 배양으로 배양할 수 있으며, 여기서 세포 (저장액으로부터 제거될 수 있음)는 성장 및 높은 생존능을 촉진하기에 적합한 배지에 접종된다. 세포는 숙주 세포 배양액에 신선한 배지를 첨가함으로써 적합한 시간 동안 성장 단계로 유지될 수 있다.
공급 회분식 또는 연속 세포 배양은 세포 배양의 성장 단계에서 포유동물 세포의 성장을 증진시키기 위해 고려된다. 성장 단계에서, 세포는 성장에 최적인 조건하에서 그리고 성장에 최적인 기간 동안 배양된다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, pH 및 용존 산소량 (dO2) 등은 특정 숙주에 사용된 것이며, 당업자에게 명백하다. 일반적으로, pH는 산 (예를 들어, CO2) 또는 염기 (예를 들어, Na2CO3또는 NaOH)약 6.5 내지 7.5로 조정된다. 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 배양에 적합한 온도 범위는 약 30 내지 38℃이며, 적합한 dO2는 5 내지 90％의 공기 포화이다.
폴리펩티드 생산 단계 이후에, 관심 폴리펩티드는 잘 확립된 기술을 이용하여 배양 배지로부터 회수된다. 관심 단백질이 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수도 있지만, 관심 단백질이 분비 폴리펩티드 (예를 들어, 관심 단백질의 분비가 단일 펩티드 서열에 의해 유도됨)로서 배양 배지로부터 회수되는 것이 바람직하다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용균액을 원심분리하여 입자성 세포 잔해를 제거한다. 그 후, 폴리펩티드는 임의의 적합한 방법을 이용하여 오염 물질인 가용성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제된다. 적합한 정제 방법에는 면역친화도 또는 이온 교환 컬럼에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환 수지 (예, DEAE)에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDA-PAGE; 황산암모늄 침전; 세파덱스 (Sephadex G-75) 등을 이용한 겔 여과; 및 단백질 A 세파로스 (Sepharose) 컬럼을 이용한 오염 물질 (예, IgG)의 제거가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 단백질분해효소 억제제 예를 들어, 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)도 정제시 단백질 분해를 억제하는 데 유용할 수 있다. 또한, 관심 단백질은 자신의 정제를 가능하게 해주는 마커 서열과 프레임에 맞게 융합될 수 있다. 마커 서열의 비제한적인 예로는 벡터 (바람직하게는 pQE-9 벡터)에 의해 공급될 수 있는 헥사히스티딘 태그, 및 헤마글루티닌 (HA) 태그가 있다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래한 에피토프에 상응한다 (예를 들어, 문헌 [Wilson et al., Cell, 37:767 [1984]] 참조). 당업자는 관심 폴리펩티드의 정제에 적합한 방법이, 재조합 세포 배양에서의 발현시 폴리펩티드의 특성 변화를 고려한 변형이 필요할 수 있음을 알 것이다.
B. 동물에서 단백질의 발현
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 관심 단백질의 발현에 이용되는 숙주 세포는 포유동물의 일부이다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 형질전환 소이다. 형질전환 소는 임의의 적합한 방법 (예를 들어, 문헌 [Chan et al., PNAS, 95:14028 [1998], 미국 특허 제5,741,957호 (본원에 참고로 도입됨), 및 문헌 [Pursel et al., Science, 244:1281 [1989]] 참조)에 의해 생성될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 단백질은 소의 유선에서 발현되어 우유로 분비된다. 단백질이 우유에서 발현되는 실시양태에서, 조직 특이적 발현 및 분비를 위한 단백질 및 신호 서열이 사용되는데, 이 방법에는 소/인간 α-락트알부민 프로모터 및 소 α-락트알부민 신호 서열 등이 포함된다. 관심 단백질은 임의의 적합한 방법을 이용하여 우유로부터 회수될 수 있으며, 이 방법에는 세포 배양액으로부터의 단백질 회수에 대해 기재된 방법 등이 포함된다.
당업자는 본 발명의 벡터가 마우스, 염소, 돼지, 조류 및 토끼 등을 비롯한 다른 형질전환 동물의 생성에도 유용함을 알 것이다 (예를 들어, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,523,226호, 제5,453,457호, 제4,873,191호, 제4,736,866호 참조).
C. 항체의 발현
본 발명의 몇몇 실시양태에서는 다수의 서브유닛으로 구성된 단백질의 각 서브유닛을 비롯한 2종 이상의 단백질 발현을 위해 단일 벡터가 사용된다. 몇몇 실시양태에서, IRES 서열에 의해 분리된 2개 이상의 면역글로불린쇄 (예를 들어, 하나의 중쇄 (γ, α, μ, δ 또는 ε) 및 하나의 경쇄 (κ 또는 λ))는 단일 전사단위로서 동일한 벡터로부터 발현된다. 본 발명이 어느 특정 벡터에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 아데노-관련 바이러스 및 아데노바이러스 등을 비롯한 다양한 벡터의 사용이 고려되고 있다. 다수의 적합한 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 상업적으로 시판되고 있다. 그러한 벡터에는 하기 벡터들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: 1) 박테리아 - pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD1O, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); 및 2) 진핵세포 - pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터도 이들이 숙주에서 복제 가능하고 생존 가능하다면 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 바람직한 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 임의의 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여 및 수용 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 인접 비-전사 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, DNA 서열은 SV40 스플라이스로부터 유래하고, 폴리아데닐화 부위가 사용되어 필요한 비-전사 유전자 요소를 제공할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 발현 벡터의 DNA 서열은 mRNA 합성을 유도하는 적당한 발현 조절 서열(들) (프로모터)와 작동 가능하게 연결되어 있다. 본 발명에 유용한 프로모터에는 LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이 (E. coli)lac또는trp프로모터, 파지 람다 PL및 PR, T3 및 T7 프로모터, 및 사이토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터, 허피스 심플렉스 바이러스 (HSV) 티미딘 키나아제 프로모터, 및 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포나 이들의 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 프로모터들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 복제 기점 및 선별 가능한 마커 (예를 들어, 진핵 세포에 대한 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이에 대한 테트라사이클린 또는 앰피실린 내성)를 포함한다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 고등 진핵생물에 의한 전사는 벡터에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가한다. 인핸서는 프로모터에 작용하여 전자를 증가시키는 약 10 내지 300 bp의 시스-작용 DNA 요소이다. 본 발명에 유용한 인핸서에는, 복제 기점의 후반부에 위치하는 100 내지 270 bp의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후반부에 위치하는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 발현 벡터는 또한 번역 개시 및 전사 종결을 위한 리보솜 결합 부위를 함유한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 벡터는 또한 발현 증폭을 위해 적당한 서열들을 포함할 수도 있다.
몇몇 바람직한 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터가 면역글로불린의 발현에사용된다. 몇몇 실시양태에서, 면역글로불린의 발현을 위한 레트로바이러스 벡터는 조절 요소를 함유한다. 본 발명의 몇몇 바람직한 실시양태에서, 2개의 면역글로불린쇄가 IRES 서열에 의해 분리된 채로 동일한 레트로바이러스 벡터 구조물에서 발현된다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 2개의 쇄는 IRES/α-LA 신호 서열에 의해 분리되어 있다. 다른 실시양태에서, 벡터는 RNA 배출 요소를 더 함유한다. 추가의 실시양태에서, RNA 배출 요소는 WPRE이다. 또다른 실시양태에서, PPE 요소는 하나 이상의 Mertz 서열이다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, PPE 요소는 돌연변이화되어 개시 신호가 제거된 것이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 PPE 요소는 링커에 의해 분리된 채로 헤드 투 테일 배열로 위치한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 벡터에 의한 면역글로불린의 발현은 프로모터에 의해 조절된다. 몇몇 실시양태에서는 발현이 CMV 프로모터에 의해 조절되고, 다른 실시양태에서는 발현이 MMTV 프로모터에 의해 조절된다. 몇몇 바람직한 실시양태에서, 발현은 하이브리드 소/인간 α-LA 프로모터에 의해 조절된다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 본 발명의 벡터에 의해 약 0.7 대 1.3의 비율로 발현된다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 약 0.8 대 1.2의 비율로 발현된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 약 0.9 대 1.1의 비율로 발현된다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 약 1 대 1의 비율로 발현된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 대부분 (예를 들어, 90％ 초과, 바람직하게는 95％ 초과, 가장 바람직하게는 약 99％ 초과)의 중쇄 및 경쇄는 1 대 1의 비율로 올바르게 어셈블리되어 기능성 (예를 들어, 항원에 결합할 수있는) 항체를 생성한다.
본 발명의 실시예에서, 면역글로불린은 상기 설명한 벡터 및 요소들을 포함하는 숙주 세포에서 발현된다. 몇몇 실시예 (예를 들어, 실시예 6, 8 및 12 참조)에서, 실시예 1에 기재된 벡터가 사용되어 다양한 숙주 세포에서 다양한 면역글로불린을 발현한다. 일반적으로, 이 발현은 기능성의 4량체 면역글로불린을 형성한다.
D. 다른 단백질들의 발현
본 발명의 벡터는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 및 다른 막횡단 단백질의 발현에도 유용하다. 이들 단백질이 발현되는 경우, 이들은 자신의 천연 구조로 막에 올바르게 삽입되는 것으로 생각된다. 따라서, GPCR 및 다른 막횡단 단백질은 막 분획의 일부로서 정제될 수도, 또는 당업계 공지의 방법에 의해 막으로부터 정제될 수도 있다.
더욱이, 본 발명의 벡터는 분석법이 없거나 분석법이 어려운 관심 단백질의 동시 발현에 유용하다. 이 시스템에서, 관심 단백질 및 신호 단백질은 폴리시스트론 서열로 배열되어 있다. 바람직하게는, IRES 서열은 신호 단백질과 관심 단백질 (예를 들어, GPCR)을 분리하고, 신호 단백질 및 관심 단백질을 코딩하는 유전자들은 단일 전사 단위로서 발현된다. 본 발명이 어느 특정 신호 단백질에 한정되는 것은 아니다. 실제로는, 용이한 분석법이 존재하는 다양한 신호 단백질의 사용이 고려되고 있다. 이들 신호 단백질에는 녹색 형광 단백질, 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 및 항체 중쇄 또는 경쇄가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 신호단백질 및 관심 단백질이 폴리시스트론 서열로부터 동시 발현되는 경우, 신호 단백질의 존재는 관심 단백질의 존재를 나타내는 것으로 생각된다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 IRES에 의해 작동 가능하게 연결된 신호 단백질 및 관심 단백질을 포함하는 폴리시스트론 서열을 코딩하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공하고, 이 숙주 세포를 신호 단백질 및 관심 단백질이 생산되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 (신호 단백질의 존재는 관심 단백질의 존재를 나타냄), 관심 단백질의 발현을 간접적으로 검출하는 방법을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태 및 측면을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
하기 실험에 관한 개시 내용에서는 아래 약어들이 사용된다: M (몰농도); mM (밀리몰농도); μM (마이크로몰농도); nM (나노몰농도); mol (몰); mmol (밀리몰); μmol (마이크로몰); nmol (나노몰); g (그램); mg (밀리그램); ㎍ (마이크로그램); pg (피코그램); L (리터); ml (밀리리터); ㎕ (마이크로리터); cm (센티미터); mm (밀리미터); ㎛ (마이크로미터); nm (나노미터); ℃ (섭씨); AMP (아데노신 5'-모노포스페이트); BSA (소 혈청 알부민); cDNA (카피 또는 상보성 DNA); CS (송아지 혈청); DNA (데옥시리보핵산); ssDNA (단일 가닥 DNA); dsDNA (이중 가닥 DNA); dNTP (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트); LH (황체 호르몬); NIH (미국 국립 보건원; National Institutes of Health, Besthesda, MD); RNA (리보핵산); PBS (인산염 완충 염수); g (중력); OD (광학 밀도); HEPES (N-[2-α히드록시에틸]피페라진-N-[2-에탄술폰산]); HBS (HEPES 완충 염수); PBS (인산염 완충 염수); SDS (나트륨 도데실술페이트); Tris-HCl (트리스[히드록시메틸]아미노메탄-하이드로클로라이드); Klenow (DNA 중합효소 I의 큰 (Klenow) 단편); rpm (분 당 회전수); EGTA (에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산); EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산); bla (β-락타마제 또는 앰피실린-내성 유전자); ORI (플라스미드 복제 기점); lacI (lac 레프레서); X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드); ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션; American Type Culture Collection, Rockville, MD); GIBCO/BRL (GIBCO/BRL, Grand Island, NY); Perkin-Elmer (퍼킨-엘머, Norwalk, CT); 및 Sigam (시그마 케미칼 컴퍼니; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).
<실시예 1>
벡터 제조
하기 실시예는 아래의 실험에 사용된 벡터의 제조에 대해 설명한다.
A. CMV MN14
CMV MN14 벡터 (서열 4; MN14 항체는 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,874,540호에 기재됨)는 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: CMV 프로모터, MN14 중쇄 신호 펩티드, MN14 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES, 소 α-락트알부민 신호 펩티드, MN14 항체 경쇄, 및 MoMuLV LTR. 서열 4에 기재된 서열들 이외에, CMV MN14 벡터는 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호, 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 부가 요소는 서열 7에 제공되어 있으며, 5' LTR은 본원에 기재된 각 구조물에서 몰로니 뮤린 육종 바이러스로부터 유래하지만, 통합시 MoMuLV 5' LTR로 전환됨)를 더 포함한다.
이 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. MN14 항체의 발현은 CMV 프로모터에 의해 조절된다. MN14 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES 서열에 의해 함께 부착되어 있다. CMV 프로모터는 IRES에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생성을 유도한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다. LTR 및 CMV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리 아데닐화된다. 이 구조물은 하기 B 단락에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 클로닝하였다.
IRES 서열 (서열 3)은 플라스미드 pLXIN (Clontech)으로부터의 IRES와 소 α-락트알부민 신호 펩티드의 융합체를 포함한다. 신호 펩티드의 최초 ATG는 IRES에 부착되어 IRES로부터의 가장 효율적인 번역 개시를 가능하게 한다. 신호 펩티드의 3' 말단은, 임의의 관심 단백질의 부착을 용이하게 하여 신호 펩티드와의 융합 단백질을 생성하게 해주는 다중 클로닝 부위를 제공한다. IRES 서열은 번역 인핸서로서 작용할 수 있으며, 또한 2종의 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 하는 제2의 번역 개시부를 생성한다.
IRES-소 α-락트알부민 신호 펩티드는 하기와 같이 제조하였다. 플라스미드 pLXIN (Clontech, Palo Alto, CA)에서 ECMV IRES를 함유하는 부분을 하기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.
프라이머 1 (서열 35):
5' GATCCACTAGTAACGGCCGCCAGAATTCGC 3'
프라이머 2 (서열 36):
5' CAGAGAGACAAAGGAGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG 3'
프라이머 2는 소 α-락트알부민 신호 펩티드 코딩 영역에 상응하는 테일을 IRES 서열에 부착시킨다. 또한, α-락트알부민 신호 펩티드의 두번째 3글자 코돈인 ATG를 GCC로 돌연변이화시켜 IRES 서열로부터의 효율적인 번역을 가능하게 하였다. 이 돌연변이 결과, 단백질 서열에서 메티오닌이 알라닌으로 변하였다. 이 돌연변이는 IRES가 단백질쇄 중에서 두번째 아미노산으로서 알라닌을 선호하기 때문에 수행하였다. 결과의 IRES PCR 생성물은 단편의 5' 말단 (상기 프라이머 1의 바로 하류)에 EcoRI 부위를 함유한다.
다음으로, α-락트알부민 신호 펩티드 함유 서열을 하기 프라이머를 사용하여 α-LA 신호 펩티드 벡터 구조물로부터 PCR 증폭하였다.
프라이머 3 (서열 14):
5' CTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCTCCTTTGTCTCTCTG 3'
프라이머 4 (서열 15):
5' TTCGCGAGCTCGAGATCTAGATATCCCATG 3'
프라이머 3은 IRES 서열의 3' 말단에 상응하는 테일을 α-락트알부민 신호 펩티드 코딩 영역에 부착시킨다. 상기 언급한 바와 같이, 소 α-락트알부민 신호 펩티드의 두번째 3글자 코돈을 돌연변이화시켜 IRES 서열로부터의 효율적인 번역을가능하게 하였다. 결과의 신호 펩티드 PCR 단편은 3' 말단에 NaeI, NcoI, EcoRV, XbaI, BglII 및 XhoI 부위를 함유한다.
상기 프라이머를 사용하여 IRES 및 신호 펩티드를 개별적으로 증폭시킨 후, 2개의 반응 생성물을 혼합하고, 프라이머 1 및 프라이머 4를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 반응 결과의 생성물은 전장 α-락트알부민 신호 펩티드에 부착된 IRES를 함유하는 스플라이싱된 단편이다. 신호 펩티드의 개시를 코딩하는 ATG는, 벡터 pLXIN에서 발견되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 개시를 코딩하는 ATG와 동일한 위치에 놓였다. 또한, 이 단편은 5' 말단에 EcoRI 부위를 함유하고, 3' 말단에 NaeI, NcoI, EcoRV, XbaI, BglII 및 XhoI 부위를 함유한다.
스플라이싱된 IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 PCR 단편을 EcoRI 및 XhoI으로 분해하였다. α-LA 신호 펩티드 벡터 구조물도 또한 EcoRI 및 XhoI으로 분해하였다. 이들 2개의 단편을 함께 라이게이션시켜 pIRES 구조물을 수득하였다.
pIRES 벡터의 IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 부분을 서열분석하여 IRES의 5' 말단에 돌연변이를 함유하는 것을 확인하였다. 이들 돌연변이는 C가 길게 연장된 부분에서 발생하였으며, 단리된 모든 클론에서 확인되었다.
이 문제점을 복구하기 위해, pLXIN DNA를 EcoRI 및 BsmFI으로 분해하였다. IRES 서열 부분에 상응하는 500 bp의 밴드를 단리하였다. 돌연변이화된 IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 구조물을 EcoRI 및 BsmFI으로 분해하여 돌연변이화된 IRES 단편을 제거하였다. 그 후, pLXIN으로부터의 IRES 단편으로 돌연변이화된 IRES/α-락트알부민 신호 펩티드 구조물을 치환하였다. 결과의 플라스미드 중IRES/α-LA 신호 펩티드 부분은 그 후에 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
결과의 구조물은 클론테크에서 얻은 pLXIN의 예상 서열과 비교시 다수의 차이를 가지고 있었다. 본 발명자들은 또한 클론테크에서 구입한 pLXIN의 IRES 부분을 서열분석하여 그 서열을 확인하였다. 예상 서열과의 차이가 클론테크에서 얻은 pLXIN 플라스미드에도 존재하였다. 하기 4개의 서열 차이를 확인하였다:
bp 347의 T - pLXIN 서열에서는 G였다.
bp 786-787의 ACG - pLXIN 서열에서는 GC였다.
B. CMV LL2
CMV LL2 벡터 (서열 5; LL2 항체는 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제6,187,287호에 기재됨)는 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: 5' CMV 프로모터 (Clontech), LL2 중쇄 신호 펩티드, LL2 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES, 소 α-LA 신호 펩티드, LL2 항체 경쇄, 및 3' MoMuLV LTR. 서열 5에 기재된 서열들 이외에, CMV LL2 벡터는 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호, 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 부가 요소는 서열 7에 제공되어 있음)를 더 포함한다.
이 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. LL2 항체의 발현은 CMV 프로모터 (Clontech)에 의해 조절된다. LL2 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES 서열에 의해 함께 부착되어 있다. CMV 프로모터는 IRES에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생성을 유도한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는중쇄 및 경쇄 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다. LTR 및 CMV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리 아데닐화된다.
IRES 서열 (서열 3)은 플라스미드 pLXIN (Clontech)으로부터의 IRES와 소 α-락트알부민 신호 펩티드의 융합체를 포함한다. 신호 펩티드의 최초 ATG는 IRES에 부착되어 IRES로부터의 가장 효율적인 번역 개시를 가능하게 하였다. 신호 펩티드의 3' 말단은, 임의의 관심 단백질의 부착을 용이하게 하여 신호 펩티드와의 융합 단백질을 생성하게 해주는 다중 클로닝 부위를 제공한다. IRES 서열은 번역 인핸서로서 작용할 수 있으며, 또한 2종의 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 하는 제2의 번역 개시부를 생성한다.
LL2 경쇄 유전자를 IRES α-락트알부민 신호 펩티드에 하기와 같이 부착시켰다. LL2 경쇄를 하기 프라이머를 사용하여 벡터 pCRLL2로부터 PCR 증폭하였다.
프라이머 1 (서열 16):
5' CTACAGGTGTCCACGTCGACATCCAGCTGACCCAG 3'
프라이머 2 (서열 17):
5' CTGCAGAATAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'
이들 프라이머는 성숙 LL2 경쇄 코딩 영역의 시작 부위에 HincII 부위를 부가한다. PCR 생성물을 HincII로 분해하면 5' 말단에서 성숙 LL2를 코딩하는 최초 GAC로 시작하는 평활 (blunt) 말단의 단편이 수득된다. 프라이머 2는 정지 코돈 바로 뒤 유전자의 3' 말단에 BglII 부위를 부가한다. 결과의 PCR 생성물을 HincII 및 BglII로 분해하여, NaeI 및 BglII로 분해된 IRES-신호 펩티드 플라스미드에 직접 클로닝하였다.
LL2 중쇄 유전자의 코작 (Kozak) 서열은 그 후에 변형시켰다. 벡터 pCRMN14HC를 XhoI 및 AvrII로 분해하여 약 400 bp의 단편을 제거하였다. 그 후, PCR을 이용하여 XhoI-AvrII 분해에 의해 제거된 LL2 중쇄 구조물의 동일한 부분을 증폭하였다. 또한, 이 증폭은 유전자의 5' 말단을 돌연변이화시켜 클론에 보다 양호한 코작 서열을 부가하였다. 코작 서열은 전형적인 IgG 코작 서열과 유사하게 변형시켰다. PCR 프라이머는 하기와 같다.
프라이머 1 (서열 18):
5' CAGTGTGATCTCGAGAATTCAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT 3'
프라이머 2 (서열 19):
5' AGGCTGTATTGGTGGATTCGTCT 3'
PCR 생성물을 XhoI 및 AvrII로 분해하여 기존에 분해된 플라스미드 골격에 다시 삽입하였다.
그 후, "양호한" 코작 서열을 경쇄 유전자에 부가하였다. "양호한" 코작 LL2 중쇄 유전자 구조물을 EcoRI으로 분해하고, 중쇄 유전자 함유 단편을 단리하였다. IRES α-락트알부민 신호 펩티드 LL2 경쇄 유전자 구조물도 EcoRI으로 분해하였다. 그 후, 중쇄 유전자를 IRES 경쇄 구조물의 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 그 결과, 중쇄 유전자가 IRES 서열의 5' 말단에 위치하였다.
그 다음으로, 다중 클로닝 부위를 LNCX 레트로바이러스 골격 플라스미드에 부가하였다. LNCX 플라스미드를 HindIII 및 ClaI으로 분해하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 생성하고 함께 어닐링시켜 이중 가닥 DNA 다중 클로닝 부위를 생성하였다. 하기 프라이머를 함께 어닐링시켰다.
프라이머 1 (서열 20):
5' AGCTTCTCGAGTTAACAGATCTAGGCCTCCTAGGTCGACAT 3'
프라이머 2 (서열 21):
5' CGATGTCGACCTAGGAGGCCTAGATCTGTTAACTCGAGA 3'
어닐링 후, 다중 클로닝 부위를 LNCX에 라이게이션시켜 LNC-MCS를 생성하였다.
그 다음으로, 이중쇄 유전자 단편을 레트로바이러스 골격 유전자 구조물에 라이게이션시켰다. 상기 생성된 이중쇄 유전자 구조물을 SalI 및 BglII로 분해하고, 이중쇄 함유 단편을 단리하였다. 레트로바이러스 발현 플라스미드 LNC-MCS를 XhoI 및 BglII로 분해하였다. 그 후, 이중쇄 단편을 LNC-MCS 레트로바이러스 발현 골격에 클로닝하였다.
그 다음으로, 구조물의 RNA 스플라이싱 문제점을 교정하였다. 구조물을 NsiI으로 분해하였다. 그 후, 결과의 단편을 EcoRI으로 부분 분해하였다. 부분 분해로부터 얻은 약 9300 염기쌍 크기의 단편을 겔에서 정제하였다. 링커를 생성하여 LL2 중쇄 유전자의 3' 말단에서 스플라이스 공여 부위를 돌연변이화시켰다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함께 어닐링시켜 링커를 다시 생성함으로써 이중 가닥 DNA 링커를 형성하였다. 링커를 생성하기 위해 사용된 2개의 프라이머는 하기와 같다.
프라이머 1 (서열 22):
5' CGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGAAAGCCG 3'
프라이머 2 (서열 23):
5'AATTCGGCTTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCA 3'
어닐링 후, 부분 분해시 제거된 원래의 NsiI/EcoRI 단편을 링커로 치환하였다.
C. MMTV MN14
MMTV MN14 벡터 (서열 6)는 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: 5' MMTV 프로모터, 이중 돌연변이화 PPE 서열, MN14 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES, 소 αLA 신호 펩티드, MN14 항체 경쇄, WPRE 서열, 및 3' MoMuLV LTR. 서열 6에 기재된 서열들 이외에, MMTV MN14 벡터는 MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호, 및 MMTV 프로모터의 5'에 위치한 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 부가 요소는 서열 7에 제공됨)를 더 포함한다.
이 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. MN14 항체의 발현은 MMTV 프로모터 (Pharmacia)에 의해 조절된다. MN14 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열 (서열 3)에 의해 함께 부착되어 있다. MMTV 프로모터는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생성을 유도한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열에 부착된다.이는 중쇄 및 경쇄 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다. 또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리-아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. PPE 서열은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있으며, WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리-아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 MMTV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리-아데닐화된다.
PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이화되어 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 돌연변이화 서열 2 카피가 헤드 투 테일 배열로 사용되었다. 이 서열은 프로모터의 바로 하류, 그리고 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 (woodchcuk) 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 이 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 최고 10배까지 증가한다.
D. α-LA MN14
α-LA MN14 벡터 (서열 7)는 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터, 이중 돌연변이화 PPE 요소, MN14 중쇄 신호 펩티드, MN14 항체 중쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES/소 αLA 신호 펩티드, MN14 항체 경쇄, WPRE 서열, 및 3' MoMuLV LTR.
이 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. MN14 항체의 발현은 하이브리드 α-LA 프로모터 (서열 1)에 의해 조절된다. MN14 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열 (서열 3)에 의해 함께 부착되어 있다. α-LA 프로모터는 IRES에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생성을 유도한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다.
또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리-아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. PPE 서열 (서열 2)은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있다. PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이화되어 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 돌연변이화 서열 2 카피가 헤드 투 테일 배열로 사용되었다. 이 서열은 프로모터의 바로 하류, 그리고 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 이 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 최고 10배까지 증가한다. WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리-아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리-아데닐화된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 알파-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 (modular) 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 개시부 (tsp)에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 소 부분은 그 후에 인간 부분의 말단에 부착되며, tsp에 대해 -550에서 -2000 위치에 해당한다. 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리-아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생성을 방해하기 위해 개발되었다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다.
소/인간 α-락트알부민 프로모터의 제조를 위해, 인간 게놈 DNA를 단리 및 정제하였다. 인간 α-락트알부민 프로모터의 부분을 하기 2개의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다.
프라이머 1 (서열 24):
5' AAAGCATATGTTCTGGGCCTTGTTACATGGCTGGATTGGTT 3'
프라이머 2 (서열 25):
5' TGAATTCGGCGCCCCCAAGAACCTGAAATGGAAGCATCACTCAGTTTCATATAT 3'
이 2개의 프라이머는 PCR 단편의 5' 말단에 NdeI 부위를 생성하고, PCR 단편의 3' 말단에 EcoRI 부위를 생성하였다.
상기 프라이머를 사용하여 생성된 인간 PCR 단편을 제한효소 NdeI 및 EcoRI으로 이중 분해하였다. 플라스미드 pKBaP-1도 NdeI 및 EcoRI으로 이중 분해하였다. 플라스미드 pKBaP-1은 다중 클로닝 부위에 부착된 소의 α-락트알부민 5' 인접 영역을 함유한다. 이 플라스미드는 다양한 유전자가 소의 α-락트알부민 프로모터에 부착되도록 해준다.
그 후, 인간 단편을 라이게이션시켜 이중 분해시 pKBaP-1 플라스미드로부터 제거된 프로모터의 소 단편을 치환하였다. 결과의 플라스미드는 DNA 서열분석에 의해 소 및 인간 α-락트알부민 프로모터/조절 영역의 하이브리드임을 확인하였다.
MN14 경쇄 유전자를 IRES α-락트알부민 신호 펩티드에 하기와 같이 부착시켰다. MN14 경쇄를 하기 프라이머를 사용하여 벡터 pCRMN14LC로부터 PCR 증폭하였다.
프라이머 1 (서열 26):
5' CTACAGGTGTCCACGTCGACATCCAGCTGACCCAG 3'
프라이머 2 (서열 27):
5' CTGCAGAATAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'
이들 프라이머는 성숙 MN14 경쇄에 대한 코딩 영역의 개시부에 HincII 부위를 부가한다. PCR 생성물을 HincII로 분해하면, 5' 말단에서 성숙 MN14를 코딩하는 최초 GAC로 시작하는 평활 말단의 단편이 수득된다. 프라이머 2는 정지 코돈 바로 뒤 유전자의 3' 말단에 BglII 부위를 부가한다. 결과의 PCR 생성물을 HincII 및 BglII로 분해하여, NaeI 및 BglII로 분해된 IRES-신호 펩티드 플라스미드에 직접 클로닝하였다.
그 다음으로, 벡터 pCRMN14HC를 XhoI 및 NruI으로 분해하여 약 500 bp의 단편을 제거하였다. 그 후, PCR을 이용하여 XhoI-NruI 분해에 의해 제거된 MN14 중쇄 구조물의 동일한 부분을 증폭하였다. 또한, 이 증폭은 유전자의 5' 말단을 돌연변이화시켜 클론에 보다 양호한 코작 서열을 부가하였다. 코작 서열은 전형적인IgG 코작 서열과 유사하게 변형시켰다. PCR 프라이머는 하기와 같다.
프라이머 1 (서열 28):
5' CAGTGTGATCTCGAGAATTCAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT 3'
프라이머 2 (서열 29):
5' GTGTCTTCGGGTCTCAGGCTGT 3'
PCR 생성물을 XhoI 및 NruI로 분해하여 기존에 분해된 플라스미드 골격에 다시 삽입하였다.
그 다음으로, "양호한" 코작 MN14 중쇄 유전자 구조물을 EcoRI으로 분해하고, 중쇄 유전자 함유 단편을 단리하였다. IRES α-락트알부민 신호 펩티드 MN14 경쇄 유전자 구조물도 EcoRI으로 분해하였다. 그 후, 중쇄 유전자를 IRES 경쇄 구조물의 EcoRI 부위에 클로닝하였다. 그 결과, 중쇄 유전자가 IRES 서열의 5' 말단에 위치하였다.
다중 클로닝 부위를 LNCX 레트로바이러스 골격 플라스미드에 부가하였다. LNCX 플라스미드를 HindIII 및 ClaI으로 분해하였다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 생성하고 함께 어닐링시켜 이중 가닥 DNA 다중 클로닝 부위를 생성하였다. 하기 프라이머를 함께 어닐링시켰다.
프라이머 1 (서열 30):
5' AGCTTCTCGAGTTAACAGATCTAGGCCTCCTAGGTCGACAT 3'
프라이머 2 (서열 31):
5' CGATGTCGACCTAGGAGGCCTAGATCTGTTAACTCGAGA 3'
어닐링 후, 다중 클로닝 부위를 LNCX에 라이게이션시켜 LNC-MCS를 생성하였다.
이중쇄 유전자 단편을 레트로바이러스 골격 유전자 구조물에 삽입하였다. 단계 3에서 생성된 이중쇄 유전자 구조물을 SalI 및 BglII로 분해하고, 이중쇄 함유 단편을 단리하였다. 레트로바이러스 발현 플라스미드 LNC-MCS를 XhoI 및 BglII로 분해하였다. 그 후, 이중쇄 단편을 LNC-MCS 레트로바이러스 발현 골격에 클로닝하였다.
그 다음으로, 구조물의 RNA 스플라이싱 문제점을 복구하였다. 구조물을 NsiI으로 분해하였다. 그 후, 결과의 단편을 EcoRI으로 부분 분해하였다. 부분 분해로부터 얻은 약 9300 염기쌍 크기의 단편을 겔에서 정제하였다. 링커를 생성하여 MN14 중쇄 유전자의 3' 말단에서 스플라이스 공여 부위를 돌연변이화시켰다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 함께 어닐링시켜 링커를 다시 생성함으로써 이중 가닥 DNA 링커를 형성하였다. 링커를 생성하기 위해 사용된 2개의 프라이머는 하기와 같다.
프라이머 1 (서열 32):
5' CGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGAAAGCCG 3'
프라이머 2 (서열 33):
5'AATTCGGCTTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTAGTGGTTGTGCAGAGCCTCGTGCA 3'
어닐링 후, 부분 분해시 제거된 원래의 NsiI/EcoRI 단편을 링커로 치환하였다.
그 다음으로, 돌연변이화된 이중쇄 단편을 α-락트알부민 발현 레트로바이러스 골격 LN α-LA-Mertz-MCS에 삽입하였다. 상기 생성된 유전자 구조물을 BamHI 및 BglII로 분해하고, 돌연변이화된 이중쇄 유전자 함유 단편을 단리하였다. LN α-LA-Mertz-MCS 레트로바이러스 골격 플라스미드를 BglII로 분해하였다. 그 후, BamHI/BglII 단편을 레트로바이러스 골격 플라스미드에 삽입하였다.
그 후, WPRE 요소를 유전자 구조물에 삽입하였다. 플라스미드 BluscriptII SK+ WPRE-B11을 BamHI 및 HincII로 분해하여 WPRE 요소를 제거하고, 이 요소를 단리하였다. 상기 생성된 벡터를 BglII 및 HpaI으로 분해하였다. WPRE 단편을 BglII 및 HpaI 부위에 라이게이션시켜 최종 유전자 구조물을 생성하였다.
E. α-LA Bot
α-LA Bot (서열 8, 보툴리눔 독소 항체)는 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터, 돌연변이화 PPE 요소, cc49 신호 펩티드, 보툴리눔 독소 항체 경쇄, 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES/소 αLA 신호 펩티드, 보툴리눔 독소 항체 중쇄, WPRE 서열, 및 3' MoMuLV LTR. 또한, α-LA 보툴리눔 독소 항체 벡터는 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 연장된 바이러스 패키징 신호, 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (이들 부가 요소는 서열 7에 제공됨)를 더 포함한다.
이 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 생산을 조절한다. 보툴리눔 독소 항체의 발현은 하이브리드 α-LA 프로모터에 의해 조절된다. 보툴리눔 독소 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자는 IRES/소 α-LA 신호 펩티드 서열에 의해 함께 부착되어 있다. 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터는 IRES에 의해 부착된 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 함유하는 mRNA의 생성을 유도한다. 리보솜은 mRNA의 CAP 부위 및 IRES 서열에 부착된다. 이는 중쇄 및 경쇄 단백질이 단일 mRNA로부터 생산되도록 한다.
또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리-아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. 돌연변이화된 PPE 서열 (서열 2)은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있다. PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이화되어 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 돌연변이화 서열 2 카피가 헤드 투 테일 배열로 사용되었다. 이 서열은 프로모터의 바로 하류, 그리고 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 이 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 최고 10배까지 증가한다. WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리-아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리-아데닐화된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 알파-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 개시부에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 소 부분은 그 후에 인간 부분의 말단에 부착되며, tsp에 대해 -550에서 -2000 위치에 해당한다. 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리-아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생성을 방해하기 위해 개발되었다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다. 이와 유사하게, 이 구조물은 소에는 존재하지만 인간에는 존재하지 않는 조절 요소들을 함유한다.
F. LSRNL
LSRNL (서열 9)은 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: 5' MoMuLV LTR, MoMuLV 바이러스 패키징 신호, B형 간염 바이러스 표면 항원, RSV 프로모터, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 및 3' MoMuLV LTR.
이 구조물은 5' MoMuLV LTR을 사용하여 B형 간염 바이러스 표면 항원 유전자의 생산을 조절한다. 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 발현은 RSV 프로모터에 의해 조절된다. LTR 및 RSV 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리 아데닐화된다.
G. α-LA cc49IL2
α-LA cc49IL2 (서열 10; cc49 항체는 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,512,443호, 제5,993,813호 및 제5,892,019호에 기재됨) 구조물은 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: 5' 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터, cc49-IL2 코딩 영역, 및 3' MoMuLV LTR. 이 유전자 구조물은 인터루킨-2에 부착된 단일쇄 항체 cc49의 융합 단백질을 발현한다. 융합 단백질의 발현은 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터에 의해 조절된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 알파-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 개시부에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 소 부분은 그 후에 인간 부분의 말단에 부착되며, tsp에 대해 -550에서 -2000 위치에 해당한다. 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리-아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생성을 방해하기 위해 개발되었다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다. 이와 유사하게, 이 구조물은 소에는 존재하지만 인간에는 존재하지 않는 조절 요소들을 함유한다. 3' 바이러스 LRT은 mRNA에 대한 폴리-아데닐화 서열을 제공한다.
H. α-LA YP
α-LA YP (서열 11) 구조물은 5'에서 3' 순서로 하기 요소들을 포함한다: 5' 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터, 이중 돌연변이화 PPE 서열, 소 αLA 신호 펩티드, 예르세니아 페스티스 (Yersenia pestis) 항체 중쇄 Fab 코딩 영역, EMCV IRES/소 α-LA 신호 펩티드, 예르세니아 페스티스 항체 경쇄 Fab 코딩 영역, WPRE 서열, 및 3' MoMuLV LTR.
이 유전자 구조물은 예르세니아 페스티스 마우스 Fab 항체의 발현을 초래할 것이다. 이 유전자 구조물의 발현은 소/인간 α-락트알부민 하이브리드 프로모터에 의해 조절된다. PPE 서열 및 WPRE 서열은 mRNA가 핵에서 세포질로 이동하는 것을 보조한다. IRES 서열은 중쇄 및 경쇄 유전자가 동일한 mRNA로부터 번역되도록 한다. 3' 바이러스 LRT은 mRNA에 대한 폴리-아데닐화 서열을 제공한다.
또한, 핵에서 세포질로의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA의 폴리-아데닐화를 보조하기 위해 mRNA 내에 함유된 2개의 유전자 요소가 존재한다. 돌연변이화된 PPE 서열 (서열 2)은 RNA CAP 부위와 MN14 단백질 코딩 영역의 출발부 사이에 함유되어 있다. PPE 요소 (서열 2) 내의 ATG 서열은 돌연변이화되어 (서열 2의 염기 4, 112, 131 및 238이 G에서 T로 변함) 원치않는 잠재적 번역 개시를 방지하였다. 돌연변이화 서열 2 카피가 헤드 투 테일 배열로 사용되었다. 이 서열은 프로모터의 바로 하류, 그리고 코작 서열과 신호 펩티드 코딩 영역의 상류에 위치한다. WPRE는 마못 간염 바이러스로부터 단리되었으며, 핵으로부터의 mRNA 배출을 보조하고 mRNA를 안정하게 해준다. 이 서열이 RNA의 3' 비번역 영역에 포함되는 경우, 이 RNA로부터의 단백질 발현 수준은 최고 10배까지 증가한다. WPRE는 MN14 단백질 코딩 영역의 말단과 폴리-아데닐화 부위 사이에 함유되어 있다. LTR 및 소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터로부터의 mRNA 발현은 3' LTR에서 종결되고 폴리-아데닐화된다.
소/인간 알파-락트알부민 하이브리드 프로모터 (서열 1)는 인간 및 소의 알파-락트알부민 프로모터 서열로부터 유래한 모듈성 프로모터/인핸서 요소이다. 이 프로모터의 인간 부분은 전사 개시부에 대해 +15 위치에서 tsp에 대해 -600 위치까지이다. 소 부분은 그 후에 인간 부분의 말단에 부착되며, tsp에 대해 -550에서 -2000 위치에 해당한다. 하이브리드는 소의 프로모터에 존재하는 폴리-아데닐화 신호를 제거하고 레트로바이러스 RNA 생성을 방해하기 위해 개발되었다. 또한, 이는 인간 유전자에는 존재하지만 소의 유전자에는 존재하지 않는 유전자 조절 요소를 함유하도록 개발되었다. 이와 유사하게, 이 구조물은 소에는 존재하지만 인간에는 존재하지 않는 조절 요소들을 함유한다.
<실시예 2>
MoMLV gag 및 pol 단백질을 안정하게 발현하는 세포주의 생성
실시예 2 내지 5는 슈도형 레트로바이러스 벡터의 제조를 설명한다. 이 방법은 일반적으로 상기 설명한 벡터의 제조에 적용 가능하다. 세포 표면에서의 융합 생성 VSV G 단백질의 발현은 합포체 (syncytium) 형성 및 세포 사멸을 초래한다. 따라서, 막-결합 단백질로서 VSV G 단백질을 함유하는 레트로바이러스 입자를 제조하기 위해서 2단계 접근법을 채택하였다. 우선, MoMLV로부터의 gag 및 pol 단백질을 높은 수준으로 발현하는 안정한 세포주를 생성하였다 (예를 들어, 293GPSD세포). gag 및 pol 단백질을 발현하는 안정한 세포주는 막-결합 단백질 (예를 들어, 외피 단백질)이 결핍된 비감염성 바이러스 입자를 생성한다. 그 후, 안정한 세포주를 인산칼슘 침전법을 이용하여 VSV-G 및 관심 플라스미드 DNA 유전자와 동시형질감염시켰다. 생성된 슈도형 벡터를 사용하여 293GPSD세포를 감염시킴으로써 안정하게 형질전환된 세포주를 생성하였다. 안정한 세포주는 VSV G 단백질의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 플라스미드로 일시적 형질감염될 수 있다 (하기 참조). 일시적으로 형질감염된 세포는 VSV G-슈도형 레트로바이러스 벡터를 생산하며, 이는 생산 세포가 합포체 형성으로 인해 사멸하기 전에 3 내지 4일에 걸쳐 세포로부터 수거할 수 있다.
VSV G-슈도형 레트로바이러스 벡터의 생성시 MoMLVgag및pol단백질을 발현하는 안정한 세포주를 생성하는 제1 단계는 아래에 기재되어 있다. 인간 아데노바이러스 Ad-5-형질감염된 배아 신장 세포주 293 (ATCC CRL 1573)을 pCMVgag-pol 및 플레오마이신 코딩 유전자와 동시형질감염시켰다. pCMV gag-pol은 CMV 프로모터의 조절을 받는 MoMLVgag및pol유전자를 함유한다 (pCMV gag-pol은 ATCC로부터 입수 가능함).
플라스미드 DNA를 인산칼슘 동시침전법 (Graham and Van der Eb, Virol. 52:456 [1973])을 이용하여 293 세포에 도입하였다. 대략 5×105개의 293 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고, 1일 후에 DNA 동시침전물을 첨가하였다. 안정한 형질전환체는 10％ FCS 및 10 ㎍/ml 플레오마이신을 함유하는 DMEM-고 글루코스 배지 (선별 배지)에서의 성장에 의해 선별하였다. 선별 배지에서 성장하는 콜로니를 역전사효소 활성 (Goff et al., J. Virol. 38:239 [1981]) 및 세포내 p30gag 발현에 대해 스크리닝하였다. p30gag 발현의 존재는 염소-항 p30 항체 (NCI 항혈청 77S000087)를 사용한 웨스턴 블럿팅에 의해 측정하였다. 레트로바이러스 유전자를 안정하게 발현하는 클론을 선별하였다. 이 클론을 293GPSD(293 gag-pol-San Diego)라 명명하였다. 인간 Ad-5-형질전환된 배아 신장 세포주 293의 유도체인 293GPSD세포주를 10％ FCS를 함유하는 DMEM-고 글루코스 배지에서 배양하였다.
<실시예 3>
VSV의 G 당단백질을 포함하는 슈도형 레트로바이러스 벡터의 제조
VSV G 단백질 슈도형 레트로바이러스를 제조하기 위해 하기 단계들을 채택하였다. 293GPSD세포주를 VSV-G 플라스미드 및 관심 DNA 플라스미드와 동시형질감염시켰다. 이 동시형질감염은 293GPSD세포를 감염시켜 패키징 세포주를 생성하는 데 사용되는 감염성 입자를 생성한다. 본 실시예는 슈도형 LNBOTDC 바이러스의 제조를 설명한다. 이러한 전반적인 방법은 실시예 1에 기재된 임의의 벡터를 제조하는 데 이용될 수 있다.
a) 세포주 및 플라스미드
패키징 세포주인 293GPSD를 10％ FCS를 함유하는 알파-MEM-고 글루코스 배지에서 배양하였다. 슈도형 바이러스의 역가 (titer)는 208F 세포 (Quade, Virol. 98:461 [1979]) 또는 NIH/3T3 세포 (ATCC CRL 1658)를 사용하여 측정하였으며, 208F 및 NIH/3T3 세포는 10％ CS를 함유하는 DMEM-고 글루코스 배지에서 배양하였다.
플라스미드 LNBOTDC는 사이토메갈로바이러스 IE 프로모터의 전사 조절을 받는 BOTD 코딩 유전자, 및 그 뒤쪽에서 LTR 프로모터의 조절을 받는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (Neo) 코딩 유전자를 함유한다. 플라스미드 pHCMV-G는 인간 사이토메갈로바이러스 IE 프로모터의 조절을 받는 VSV G 유전자를 함유한다 (Yee etal., Meth. Cell Biol. 43:99 [1994]).
b) 안정한 패키징 세포주, 슈도형 벡터의 제조 및 슈도형 LNBOTDC 벡터의 역가 측정
LNBOTDC DNA (서열 13)을 pHCMV-G DNA와 함께 패키징 세포주인 293GPSD에 동시형질감염시켜 LNBOTDC 바이러스를 제조하였다. 결과의 LNBOTDC 바이러스는 그 후에 293GPSD세포를 감염시켜 세포를 형질전환시키는 데 사용하였다. 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 제조하는 절차를 하기와 같이 수행하였다 (Yee et al., Meth. Cell Biol. 43:99 [1994]).
레트로바이러스 유전자 구조물은 감염성 복제 결함 레트로바이러스 벡터의 생성시 상기 서열의 관심 세포로의 삽입을 초래할 것이다. CMV 조절 서열은 삽입시 보툴리눔 독소 항체 중쇄 및 경쇄 유전자의 발현을 조절한다. IRES 서열은 중쇄 및 경쇄 유전자 둘 다가 동일한 mRNA로부터 번역되도록 한다. 3' 바이러스 LRT은 mRNA에 대한 폴리-아데닐화 서열을 제공한다.
보툴리눔 독소 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 단백질 둘 다가 이 신호 mRNA로부터 생성된다. 이 2개의 단백질은 결합하여 보툴리눔 독소 항체를 형성한다. 또한, 중쇄 및 경쇄 단백질은 서로에 대해 등몰 비율로 형성되는 것 같다.
요컨대, 1일째에 대략 5×104개의 293 GPSD세포를 75 cm2조직 배양 플라스크에 넣었다. 그 다음날 (2일째), 293GPSD세포를 표준 인산칼슘 동시침전법(Graham and Van der Eb, Virol. 52:456 [1973])을 이용하여 pLNBOTDC 플라스미드 25 ㎍ 및 VSV-G 플라스미드 DNA 25 ㎍으로 형질감염시켰다. 10 내지 40 ㎍의 플라스미드 DNA를 사용할 수 있다. 293GPSD세포는 24시간이 넘게 조직 배양 플레이트에 견고하게 부착될 수 있기 때문에, 293GPSD세포는 형질감염 48시간 전에 75 cm2플라스크에 넣을 수도 있다. 형질감염된 293GPSD세포는 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 제공한다.
3일째, 1×105개의 293GPSD세포를 75 cm2조직 배양 플라스크에 넣고, 24시간 후에 형질감염된 293GPSD세포로부터 슈도형 바이러스를 수확하였다. 4일째, pLNBOTDC 및 VSV-G DNA를 투여한지 48시간 후에 배양 배지를 형질감염된 293GPSD세포로부터 수확하였다. 배양 배지를 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 폴리브렌을 최종 농도 8 ㎍/ml로 첨가하였다. LNBOTDC 바이러스를 함유하는 배양 배지를 사용하여 하기와 같이 293GPSD세포를 감염시켰다. 배양 배지를 293GPSD세포로부터 제거하고, LNBOTDC 바이러스를 함유하는 배양 배지로 대체하였다. 폴리브렌을 배지에 첨가한 후에 세포에 첨가하였다. 바이러스 함유 배지를 293GPSD세포 상에서 24시간 동안 방치하였다. 감염 16시간 후 (5일째), 배지를 293GPSD세포로부터 제거하고, 400 ㎍/ml의 G418 (GIBCO/BRL)을 함유하는 신선한 배지로 대체하였다. 대략 2주 후에 G418-내성 콜로니가 나타날 때까지 배지를 3일 마다 교환하였다.
G418-내성 콜로니를 96웰에 단일 콜로니로서 플레이팅하였다. 60개 내지 100개의 G418-내성 콜로니를 BOTDC 항체의 발현에 대해 스크리닝하여 높은 생산성의 콜로니를 찾아냈다. 96웰 플레이트의 상위 콜로니 10개를 6-웰 플레이트에 옮기고 콘플루언시 (confluency) 상태로 성장하도록 배양하였다.
그 후, 상위 콜로니 10개를 확장시켜 높은 역가 생산성에 대해 스크리닝하였다. 단백질 발현 및 역가 생산성에 기초하여, 5개의 클론성 세포주를 선별하였다. 하나의 세포주를 주 세포 은행 (master cell bank)로 지정하고, 다른 4개의 세포주를 예비 (backup) 세포주로 지정하였다. 슈도형 벡터를 하기와 같이 생성하였다. 대략 1×106개의 293GPSD/LNBOTDC 세포를 75 cm2조직 배양 플라스크에 넣었다. 24시간 후, 세포를 인산칼슘 동시침전법을 이용하여 pHCMV-G 플라스미드 DNA 25 ㎍으로 형질감염시켰다. 칼슘-DNA 침전물을 세포에 투여한지 6 내지 8시간 후, DNA 용액을 신선한 배양 배지 (G418 결핍)로 대체하였다. 보다 긴 형질감염 시간 (하룻밤)은 대부분의 293GPSD/LNBOTDC 세포를 플레이트에서 떨어뜨리기 때문에 피하였다. 형질감염된 293GPSD/LNBOTDC 세포는 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 생성한다.
형질감염된 293GPSD/LNBOTDC 세포로부터 생성된 슈도형 LNBOTDC 바이러스는 형질감염 후 24 내지 96시간 사이에 1일 1회 이상 수거할 수 있다. 가장 높은 바이러스 역가는 최초 pHCMV-G 형질감염 후 대략 48 내지 72시간에 생성되었다. 대부분의 형질감염 세포에서 형질감염된지 약 48시간 후에 합포체 형성이 가시화되는 한편, 세포는 이 세포가 조직 배양 플레이트에 부착된 채로 남아 있기만 하면 추가로 48시간 이상 동안 슈도형 바이러스를 지속적으로 생성하였다. VSV G-슈도형 LNBOTDC 바이러스를 함유하는, 수거된 세포 배양액을 모아 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, -80℃에서 보관하거나 즉시 농축하여 -80℃에 보관하였다.
그 후, VSV G-슈도형 LNBOTDC 바이러스의 역가를 하기와 같이 측정하였다. 대략 5×104개의 래트 208F 섬유아세포를 6웰 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후, 폴리브렌 8 ㎍/ml의 존재 하에 세포를 LNBOTDC 바이러스-함유 배양 배지의 연속 희석액으로 감염시켰다. 바이러스로 감염시킨지 24시간 후, 배지를 G418 400 ㎍/ml을 함유하는 신선한 배지로 대체하고, G418-내성 콜로니가 가시화될 때까지 14일 동안 지속적으로 선별하였다. 바이러스 역가는 통상 0.5 내지 5.0×106콜로니 형성 단위 (cfu)/ml이었다. 바이러스 원액의 역가는 하기와 같이 109cfu/ml을 초과하는 역가로 농축될 수 있었다.
<실시예 4>
슈도형 레트로바이러스 벡터의 농축
VSV G-슈도형 LNBOTDC 바이러스를 1주기의 초원심분리에 의해 높은 역가로 농축시켰다. 그러나, 추가의 농축을 위해 2주기를 수행할 수도 있다. 실시예 2에 설명한 바와 같이 수거되고 슈도형 LNBOTDC 바이러스를 함유하는 냉동 배양 배지를 37℃ 수조에서 해동시킨 후, 미리 오토클레이빙에 의해 멸균된 오크리지(Oakridge) 원심분리 튜브 (밀봉 캡이 있는 50 ml 용량의 오크리지 튜브; Nalge Nunc International)로 옮겼다. 바이러스를 JA20 로터 (Beckman) 중 4℃에서 120분 동안 48,000 xg로 침전시켰다. 그 후, 생물안전성 (biosafety) 후드에서 배양 배지를 튜브로부터 제거하고, 튜브에 남아있는 배지를 흡인하여 상층액을 제거하였다. 바이러스 펠렛을 배양 배지 DMEM의 원래 부피의 0.5 내지 1％로 재현탁시켰다. 재현탁된 바이러스 펠렛을 교반하면서 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 바이러스 펠렛은 밤새 인큐베이션 후에 감염성 바이러스의 상당한 손실없이 부드러운 피펫팅으로 분산시킬 수 있었다. 바이러스 원액의 역가는 초원심분리 1회 후에 통상 100배 내지 300배 증가하였다. 감염성 바이러스의 회수 효율은 30 내지 100％ 사이로 다양하였다.
그 후, 바이러스 원액을 미세원심분리기 중 4℃에서 5분 동안 저속 원심분리하여, 눈에 보이는 세포 잔해 또는 상기 조건하에서 재현탁되지 않은 응집 비리온을 제거하였다. 바이러스 원액이 난세포 또는 배아 내로 주입하는 데 사용되지 않는다면, 이 원심분리 단계를 생략할 수 있음을 알아야 한다.
바이러스 원액을 추가로 농축시키기 위해, 다른 횟수로 바이러스 원액을 초원심분리할 수 있다. 제1회 원심분리로부터의 재현탁된 바이러스를 모아, 상기와 같이 수행되는 제2회 초원심분리에 의해 펠렛을 형성한다. 바이러스 역가는 제2회 초원심분리 후에 대략 2000배 증가하였다 (슈도형 LNBOTDC 바이러스의 역가는 제2회의 초원심분리 후에 통상 1×109cfu/ml 이상임).
원심분리 전 및 후의 유체에 대한 역가는 208F 세포를 감염 (NIH 3T3 또는 소 유방 상피 세포도 사용될 수 있음)시킨 후에 실시예 2에 기재된 바와 같이 G418-내성 콜로니를 선별하여 측정하였다.
<실시예 5>
숙주 세포의 감염을 위한 슈도형 레트로바이러스의 제조
농축된 슈도형 레트로바이러스를 0.1X HBS (2.5 mM HEPES, pH 7.12, 14 mM NaCl, 75 μM Na2HPO4-H2O)에 재현탁시키고, 18 ㎕의 분취액을 0.5 ml 바이알 (Eppendorf)에 넣어 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 농축된 바이러스의 역가는 1 ㎕의 농축된 바이러스를 0.1X HBS를 사용하여 10-7또는 10-8배 희석하여 측정하였다. 그 후, 희석된 바이러스 용액을 사용하여 208F 및 소 유방 상피 세포를 감염시키고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 바이러스 역가를 측정하였다.
<실시예 6>
숙주 세포에 의한 MN14의 발현
본 실시예는 다수의 통합 벡터로 형질감염된 세포로부터 항체 MN14의 제조를 설명한다. 슈도형 벡터를 하기 벡터에 대한 패키징 세포주로부터 제조하였다: CMV MN14, α-LA MN14 및 MMTV MN14. 래트 섬유아세포 (208F 세포), MDBK 세포 (소 신장 세포) 및 소 유방 상피 세포를 감염다중도 (multiplicity of infection) 1000으로 형질감염시켰다. 1000개의 세포를 T25 플라스크에 플레이팅하고, 배지 3 ml 중 106개 콜로니 형성 단위 (CFU)의 벡터를 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 감염 지속시간은 24시간이었고, 그 후에 배지를 교환하였다. 형질감염 후, 세포가 성장하여 콘플루언시 상태가 되도록 배양하였다.
세포주를 T25 플라스크에서 콘플루언시 상태가 되도록 배양하고, 5 ml의 배지를 매일 교환하였다. MN14의 존재에 대해 매일 배지를 분석하였다. 생성된 모든 MN14가 활성이 있고 (인간 IgG를 검출하기 위한 ELISA로 CEA 결합 ELISA와 정확히 동일한 값을 얻음), 웨스턴 블럿팅으로 중쇄와 경쇄가 대략 1 대 1의 비율로 생성됨을 확인하였다. 또한, 비변성 웨스턴 블럿은 항체 복합체가 100％ 올바르게 형성되었음을 나타냈다 (도 1 참조, 레인 1: 85 ng의 대조군 MN14; 레인 2: 소 유방 세포주, α-LA 프로모터; 레인 3: 소 유방 세포주, CMV 프로모터; 레인 4: 소 신장 세포주, α-LA 프로모터; 레인 5: 소 신장 세포주, CMV 프로모터; 레인 6: 208 세포주, α-LA 프로모터; 레인 7: 208 세포주, CMV 프로모터).
도 2는 4가지 세포주에 대해 시간에 따른 MN14의 생산을 보여주는 그래프이다. Y축은 배지 1 ml 당 생산되는 MN14의 양 (ng)을 나타낸다. X축은 실험을 위한 배지 수거일을 나타낸다. 4 세트의 데이타가 그래프에 도시되어 있다. 비교 대상은 CMV 프로모터와 α-LA 프로모터, 및 208 세포와 소 유방 세포이다. 소 유방 세포주가 가장 높은 발현을 나타냈으며, 그 다음으로 208F 세포 및 MDBK 세포가 뒤따랐다. 구조물에 관해서는, CMV 유도 구조물이 가장 높은 발현 수준을 나타냈으며, 그 다음으로 α-LA 유도 유전자 구조물 및 MMTV 구조물이 뒤따랐다. 2주째, CMV 구조물의 1일 생산량은 배지 1 ml 당 4.5 ㎍ (T25 플라스크에서 22.5 mg/일)이었다. 그 후에 발현 수준은, 세포가 그 이후의 주간에 걸쳐 매우 조밀한 콘플루언시 상태가 됨에 따라 40 ㎍/일로 서서히 증가하였다. α-lac-MN14 패키징 세포주로부터의 배지 2.7 L를 친화도 컬럼으로 가공하여 MN14의 정제 원액을 제조하였다.
도 3은 MN14 항체의 중쇄와 경쇄를 분리하기 위해 변성 조건하에서 수행된 15％ SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블럿이다. 레인 1은 소 유방 세포주, 하이브리드 α-LA 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 2는 소 유방 세포주, CMV 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 3은 소 신장 세포주, 하이브리드 α-LA 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 4는 소 신장 세포주, CMV 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 5는 래트 섬유아세포 세포주, 하이브리드 α-LA 프로모터로부터의 MN14를 나타내고; 레인 6은 래트 섬유아세포, CMV 프로모터로부터의 MN14를 나타낸다. 상기 도 1과 일치하게, 이 결과는 중쇄 및 경쇄가 대략 1 대 1의 비율로 생산됨을 나타낸다.
<실시예 7>
세포 당 생산된 단백질의 정량
본 실시예는 본 발명에 따라 생산된 세포 배양물 중 세포 당 생산된 단백질량의 정량에 관해 기재한다. 다양한 세포 (208F 세포, MDBK 세포 및 소 유방 세포)를 25 cm2배양 디쉬에 1000개 세포/디쉬로 플레이팅했다. 상기 3종의 세포 유형에 3종의 상이한 벡터 (CMV-MN14, MMTV-MN14, 및 α-LA-MN14)를 MOI 1000 (역가: 각각 2.8 ×106, 4.9 ×106및 4.3 ×106)로 감염시켰다. 대략 매 24시간 마다 모든 세포로부터 배지를 수집했다. 1개월 동안 배지를 수집한 후에, 208F 및 MDBK 세포는 건강 상태가 불량하고 MN14 발현량이 낮아 버렸다. 소 유방 세포를 T25 플라스크로 계대 배양하고 대략 2개월 동안 이로부터의 배지를 계속 수집하였으며, 이 동안 MN14는 계속 발현되었다. T25 플라스크에서의 2개월 후에, CMV 프로모터를 함유하는 상기 세포는 MN14를 22.5 pg/세포/일로 생산했고 α-LA 프로모터를 함유하는 세포는 2.5 pg MN14/세포/일로 생산했다.
T25 플라스크에서의 2개월 후에, 롤러병 (850 cm2)에 접종하여 생산 규모를 확장시켰으며 다수의 계대 배양 후에도 MN14 발현이 안정한지 여부를 측정했다. 2개의 롤러병에 CMV 프로모터로부터 MN14를 발현하는 소 유방 세포를 접종하고 2개의 롤러병에 α-LA 프로모터로부터 MN14를 발현하는 소 유방 세포를 접종했다. 배양물은 대략 2주 후에 콘플루언시 상태가 되었고, 계속 MN14를 발현했다. 롤러병 발현량을 하기 표 1에 나타냈다:
<실시예 8>
LL2 항체의 발현
본 실시예는 소 유방 세포 및 293 인간 신장 섬유아세포에 의한 LL2 항체의 발현에 관해 기재한다. 소 유방 세포에 벡터 CMV LL2 (7.85 ×107CFU/mL)를 MOI 1000 및 10,000으로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. MOI 10,000으로 형질감염시킨 경우에는 어떠한 세포도 생존하지 않았다. 20％ 콘플루언시 상태가 될 때, 배지 중에는 LL2 250 ng/mL이 존재했다. 활성 LL2 항체가 두가지 모든 세포형에서 생산되었다. 비-변성 및 변성 웨스턴 분석은 모든 항체가 활성이 있으며, 중쇄 대 경쇄의 비율이 대략 1 대 1로 올바르게 어셈블리됨을 입증했다.
<실시예 9>
소 유방 세포에 의한 Bot 항체의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 보툴리눔 독소 항체의 발현에 관해 기재한다. 소 유방 세포를 벡터 α-LA Bot (2.2 ×102CFU/mL)로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. 100％ 콘플루언시 상태일 때, 배지 중에는 보툴리눔 독소 항체 6 ng/mL이 존재했다.
<실시예 10>
소 유방 세포에 의한 B형 간염 바이러스 표면 항원의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 B형 간염 바이러스 표면 항원의 발현에 관해기재한다. 소 유방 세포를 벡터 LSRNL (350 CFU/mL)로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. 100％ 콘플루언시 상태일 때, 배지 중에는 B형 간염 바이러스 표면 항원 20 ng/mL이 존재했다.
<실시예 11>
cc49IL2 항원 결합 단백질의 발현
본 실시예는 소 유방 세포 및 인간 신장 섬유아세포에서 cc49IL2의 발현에 관해 기재한다. 소 유방 세포에 벡터 cc49IL2 (3.1 ×105CFU/mL)를 MOI 1000으로 감염시키고, 25 cm2배양 디쉬에 플레이팅했다. 100％ 콘플루언시 상태일 때, 배지 중에는 cc49IL2 10 ㎍/mL이 존재했다. 인간 신장 섬유아세포 (293)를 α-LA cc49IL2 벡터로 감염시켰다. 이 세포에 의해 활성 cc49-IL2 융합 단백질이 발현되었다.
<실시예 12>
YP 항체의 생성
본 실시예는 소 유방 상피 세포 및 인간 신장 섬유아세포 (293 세포)에 의한 예르세니아 페스티스 항체의 생성에 관해 기재한다. 세포주를 α-LA YP 벡터로 형질감염시켰다. 2개의 세포주 모두 YP 항체를 생성했다. 모든 항체는 활성이 있었고, 중쇄 및 경쇄는 대략 1 대 1의 비율로 생성되었다.
<실시예 13>
소 유방 세포에 의한 여러 단백질들의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 여러 단백질들의 발현에 관해 기재한다. MN14를 생산하는 유방 세포 (CMV-MN14 벡터로 감염됨)에 벡터 cc49IL2 (3.1 ×105CFU/mL)를 MOI 1000으로 감염시키고, 1000개 세포를 25 cm2배양 플레이트에 플레이팅했다. 100％ 콘플루언시 상태일 때, 상기 세포는 MN14를 2.5 ㎍/mL로 발현하고 cc49IL2를 5 ㎍/mL로 발현했다.
<실시예 14>
소 유방 세포에 의한 여러 단백질들의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 여러 단백질들의 발현에 관해 기재한다. MN14를 생산하는 유방 세포 (CMV-MN14 벡터로 감염됨)를 LSNRL 벡터 (100 CFU/mL)를 MOI 1000으로 감염시키고, 1000개 세포를 25 cm2배양 플레이트에 플레이팅했다. 100％ 콘플루언시 상태일 때, 상기 세포는 MN14를 2.5 ㎍/mL로 발현하고 간염 바이러스 표면 항원을 150 ng/mL로 발현했다.
<실시예 15>
소 유방 세포에 의한 여러 단백질들의 발현
본 실시예는 소 유방 세포에서 여러 단백질들의 발현에 관해 기재한다. B형 간염 바이러스 표면 항원을 생산하는 유방 세포 (LSRNL 벡터로 감염됨)에 cc49IL2 벡터를 MOI 1000으로 감염시키고, 1000개 세포를 25 cm2배양 플레이트에 플레이팅했다. 100％ 콘플루언시 상태일 때, 상기 세포는 MN14를 2.4 ㎍/mL로 발현하고 B형 간염 바이러스 표면 항원을 13 ng/mL로 발현했다.
<실시예 16>
소 유방 세포에서 B형 간염 바이러스 표면 항원 및 Bot 항체의 발현
본 실시예는 롤러병에서 형질감염된 세포의 배양에 관해 기재한다. 208F 세포 및 소 유방 세포를 25 cm2배양 디쉬에 1000개 세포/25 cm2로 플레이팅했다. 각각의 세포주에 LSRNL 또는 α-LA Bot 벡터를 MOI 1000으로 감염시켰다. 1개월 동안 배양하고 배지를 수집한 후에, 208F 세포는 성장 및 플레이팅이 불량하여 버렸다. 마찬가지로, α-LA Bot로 감염시킨 소 유방 세포는 단백질 발현량이 낮아 버렸다. LSRNL로 감염시킨 소 유방 세포를 롤러병 (850 cm2)에 접종하여 계대 배양했다. 롤러병 배양물 중에는 B형 간염 바이러스 표면 항원이 대략 20 ng/mL으로 생산되었다.
<실시예 17>
G-결합 커플링된 수용체의 발현 및 분석
본 실시예는 레트로바이러스 벡터로부터 G-결합 커플링된 수용체 단백질 (GPCR)의 발현에 관해 기재한다. 또한, 본 실시예는 분석이 어려운 단백질이나 GPCR과 같이 분석법이 없는 단백질의 발현을 위한 마커로서 IRES로부터 신호 단백질의 발현에 관해 기재한다. 유전자 구조물 (서열 34; 도 17)은 G-단백질-커플링된 수용체와 그에 뒤따르는 IRES-신호 펩티드-항체 경쇄를, pLBCX 레트로바이러스 골격에 클로닝된 채로 포함한다. 요컨대, GPCR-IRES-항체 경쇄를 함유하는PvuII/PvuII 단편 (3057 bp)을 pLBCX의 StuI 부위에 클로닝하였다. pLBCX는 pLNCX로부터의 네오마이신 내성 유전자 대신에 EM7 (T7) 프로모터, 블라스티시딘 (Blasticidin) 유전자 및 SV40 폴리 A를 함유한다.
이 유전자 구조물을 사용하여 복제 결함 레트로바이러스 패키징 세포주를 생성하고, 이 세포주를 사용하여 복제 결함 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 이 세포주로부터 제조된 벡터를 사용하여 293GP 세포 (인간 배아 신장 세포)를 감염시켰다. 감염 후, 세포를 블라스티시딘으로 선별하여 단일 세포의 블라스티시딘 내성 클론을 단리하였다. 이 클론을 항체 경쇄 발현에 대해 스크리닝하였다. 상위 12개의 경쇄 발현 클론을 선별하였다. 이들 12개의 경쇄 발현 클론을, 리간드 결합 분석법을 이용하여 GPCR의 발현에 대해 스크리닝하였다. 모든 12개의 샘플이 수용체 단백질을 발현하였다. 이 클론성 세포주 및 그 발현은 표 2에 도시되어 있다.
세포 클론 번호 항체 경쇄 발현 GPCR 발현
4 + +
8 + +
13 + +
19 + +
20 + +
22 + +
24 + +
27 + +
30 + +
45 + +
46 + +
50 + +
상기 명세서에서 언급한 모든 문헌 및 특허는 본원에 참고로 도입된다. 본발명에서 설명된 방법 및 시스템에 대한 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시양태와 관련하여 설명되기는 했지만, 청구되는 본 발명이 그러한 특정 실시양태에 과도하게 제한되는 것으로 이해해서는 안된다. 실제로는, 분자 생물학, 단백질 발효, 생화학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한, 본 발명의 수행하기 위해 설명된 방식의 다양한 변형이 하기 청구항의 범위 내에 포함된다.

Claims (33)

  1. 서열 1, 및 낮은 엄격 조건 하에서 서열 1과 혼성화 가능한 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는, 적어도 2종의 포유동물 공급원으로부터 유래하며 유세포 (mammary) 특이적 유전자 발현을 초래하는 핵산.
  2. 제1항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터인 벡터.
  4. 제2항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 서열 2, 및 낮은 엄격 조건 하에서 서열 2와 혼성화 가능한 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하며, 상기 혼성화 가능한 서열이 서열 2의 핵산 잔기 4, 112, 131 및 238에 상응하는 위치 중 적어도 하나에서 돌연변이화된 ATG 서열을 포함하는 것인 핵산.
  6. 제5항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터인 벡터.
  8. 제6항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 1종 이상의 프리-mRNA 프로세싱 인핸서 (Pre-mRNA Processing Enhancer) 요소를 포함하는 레트로바이러스 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 프리-mRNA 프로세싱 인핸서 요소가 서열 2, 및 중간 엄격 조건 하에서 서열 2와 혼성화 가능한 서열들로부터 선택되는 것인 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 상기 프리-mRNA 프로세싱 인핸서 요소가 WPRE 요소인 벡터.
  12. IRES 코딩 서열 및 신호 펩티드 코딩 서열을 코딩하는, 상기 IRES 및 신호 펩티드 코딩 서열이 서로 인접한 것인 핵산 서열.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신호 펩티드가 알파-카제인, 인간 성장 호르몬 및 알파-락트알부민 신호 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산.
  14. 제12항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터인 벡터.
  16. 제14항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  17. a) i) 숙주 세포, 및
    ii) 소/인간 하이브리드 알파-락트알부민 프로모터에 작동 가능하게 연결된 단백질을 코딩하는 1종 이상의 외인성 유전자를 포함하는 벡터
    를 제공하고,
    b) 상기 외인성 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현이 일어나는 조건 하에 상기 벡터를 상기 숙주 세포에 도입하는 것
    을 포함하는, 관심 단백질을 생산하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 벡터가 서열 2를 포함하는 돌연변이체 RNA 배출 요소를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 벡터가 2종 이상의 외인성 유전자를 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 2종 이상의 외인성 유전자가 내부 리보솜 유입 부위 및 소 알파-락트알부민 프로모터 신호 서열에 의해 분리되어 폴리시스트론성 (polycistronic)으로 배열된 것인 방법.
  21. a) i) 숙주 세포, 및
    ii) 제1 면역글로불린쇄를 코딩하는 제1 외인성 유전자 및 제2 면역글로불린쇄를 코딩하는 제2 외인성 유전자를, 상기 제1 및 제2 유전자가 내부 리보솜 유입 부위에 의해 분리되어 있는 형태로 포함하는 벡터
    를 제공하고,
    b) 상기 제1 면역글로불린쇄 및 제2 면역글로불린쇄가 발현되는 조건 하에 상기 벡터를 상기 숙주 세포에 도입하는 것
    을 포함하는, 면역글로불린을 생산하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 제1 면역글로불린쇄와 제2 면역글로불린쇄 중 어느 하나가 면역글로불린 경쇄이고, 상기 제1 면역글로불린쇄와 제2 면역글로불린쇄 중 다른 하나가 면역글로불린 중쇄인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 중쇄가 γ, α, μ, δ 또는 ε 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 경쇄가 κ 및 λ 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 면역글로불린이 분비성 면역글로불린인 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 벡터가 소 알파-락트알부민 신호 펩티드를 더 포함하는 것인 방법.
  28. 제21항에 있어서, 상기 벡터가 소/인간 하이브리드 알파-락트알부민 프로모터를 더 포함하는 것인 방법.
  29. 제21항에 있어서, 상기 제1 항체쇄 및 제2 항체쇄가 약 0.9 대 1.1의 비율로 발현되는 것인 방법.
  30. 제21항의 방법에 의해 생산된 항체.
  31. 제21항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제21항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 슈도형 (pseudotyped) 레트로바이러스 벡터인 방법.
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