DE4439662C2 - Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von Phosphotyrosinphosphatasen und zur Identifizierung von Effektoren davon - Google Patents
Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von Phosphotyrosinphosphatasen und zur Identifizierung von Effektoren davonInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivi
tätsbestimmung von Proteintyrosinphosphatasen und zur Identifi
zierung von Effektoren davon.
Die Phosphorylierung von zellulären Proteinen an Tyrosinresten
ist ein allgemeines Grundprinzip zur Regulation bzw. Steuerung
von zellulären Vorgängen und Zuständen. Von besonderer Bedeu
tung ist dieser Mechanismus beispielsweise bei der Signalüber
tragung in Zellen sowie bei der Regulation von Zellprolifera
tion und -differenzierung (Ullrich und Schlessinger (1990)).
Proteine, die als Antwort auf ein bestimmtes Signal spezifisch
phosphoryliert werden, umfassen sowohl Proteine an der Zell
oberfläche, wie etwa Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, Hormone
etc., wie auch intrazelluläre Proteine.
Die "Einstellung" des Phosphorylierungsspiegels erfolgt durch
Proteintyrosinkinasen (PTK) und ihre erst in den letzten Jahren
genauer charakterisierten Gegenspieler, die Proteintyrosinphos
phatasen (PTPasen) (Charbonneau und Tonks (1992); Pot und Dixon
(1992)).
Aufgrund der Bedeutung der Proteinphosphorylierung an Tyrosin
resten bei Zellproliferation und -differenzierung wird diesen
beiden Enzymklassen ein großes Interesse entgegengebracht. Die
Bestimmung der Aktivität spezifischer PTK und PTPasen in vivo
erlaubt z. B. wertvolle Rückschlüsse auf die Beteiligung der
Proteintyrosinphosphorylierung an pathologischen Prolifera
tionsprozessen, und natürliche und synthetische Effektoren
beider Enzymklassen sind Wirkstoffe mit hoher potentieller
medizinischer Relevanz für die Beeinflussung derartiger
Vorgänge.
Übliche, aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur
Bestimmung von Enzymaktivitäten oder zur Identifizierung von
Effektoren davon umfassen die Identifizierung und Isolierung
des jeweiligen Enzyms und in vitro Untersuchungen. Ein bekann
tes Werkzeug zur Untersuchung der Funktionsweise von durch
Phosphorylierung regulierten Molekülen, wie beispielsweise
Rezeptoren stellen selektive Proteinkinaseinhibitoren dar.
Tapley et al. (1992) beschreiben beispielsweise den
Serin/Threonin Proteinkinaseinhibitor K252a. Dieser inhibiert
selektiv die Neurotrophinrezeptoren trk, trkB und trkC, wogegen
andere Tyrosin Proteinkinasen, wie etwa Rezeptoren für EGF und
PDGF von K252a unbeeinflußt bleiben. Ohmichi et al. (1992)
beschreiben auch K252a und Staurosporin, das in selber Weise
die Phosphorylierung der genannten Neurotrophinrezeptoren
selektiv inhibiert.
Die Identifizierung spezifischer PTPasen, beispielsweise der
PTPasen für den PDGF-Rezeptor oder den NGF-Rezeptor, ist jedoch
schwierig und bisher nicht gelungen. Deshalb kann gegenwärtig
kein Testsystem für diese PTPasen aufgebaut werden, das auf
isolierten Enzymen beruht. Weiterhin wird die Spezifität der
PTPasen offenbar in hohem Maße durch die räumliche Nachbar
schaft zu den zugeordneten Substraten in der Zelle bedingt. Die
Isolation der PTPasen führt zumindest partiell zum Verlust
derartiger Spezifitäten und somit würden Untersuchungen an
isolierten PTPasen möglicherweise ein falsches Bild liefern. In
analoger Weise ist auch die Spezifität von Effektoren häufig im
zellulären Kontext anders als in isolierten Systemen.
Weiterhin sind aus dem Stand der Technik Verfahren bekannt, die
es erlauben, die Aktivität spezifischer PTPasen in situ zu
bestimmen, wobei diese Verfahren die Möglichkeit voraussetzen,
das jeweilige Substrat für die spezifischen PTK und PTPasen zu
isolieren und den Phosphotyrosingehalt dieses Substrats zu
analysieren. Derartige Verfahren umfassen bei Verwendung von ³²P
die Zugabe von nicht-radioaktivem ATP zum Ansatz und die
anschließende Verfolgung der Phosphorylierung/Dephosphorylie
rung des Substrats (Swarup et al. (1982); Böhmer et al. (1993);
Faure et al. (1992)) oder die Hemmung der PTK durch Chelatoren,
wie etwa EDTA, der für die Kinasereaktion essentiellen divalen
ten Kationen und Verfolgung des Phosphotyrosingehalts. Ein
Nachteil dieser bekannten Systeme besteht in ihrer geringen
Spezifität, da bei ihnen alle Tyrosinkinasen in einer Testprobe
ohne Unterschied getroffen werden, wodurch Rückschlüsse auf
eine spezifische Wirkung unmöglich gemacht werden. Ein weiterer
wesentlicher Nachteil ist auch darin zu sehen, daß weder
Chelatoren noch ATP rasch in Zellen permeieren können, so daß
die Anwendung dieser Verfahren somit die vorherige Zellper
meabilisierung oder Lyse der Zellen voraussetzt (Mooney und
Bordwell (1992)). Infolgedessen sind diese Verfahren ungeeig
net, die in vivo Aktivität von spezifischen PTPasen in einer
intakten Zelle korrekt zu bestimmen.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein
Verfahren zur Messung spezifischer PTPase-Aktivitäten bereit zu
stellen, das die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile
mindestens teilweise vermeidet und das an einer intakten Zelle
durchführbar ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung
der Aktivität einer spezifischen Proteintyrosinphosphatase
(PTPase) in intakten Zellen, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß man
- (a) intakte Zellen, in denen ein Substrat der zu bestimmenden PTPase enthalten ist, mit mindestens einer Substanz, welche ein selektiver Inhibitor einer das Substrat phosphorylierenden Proteintyrosinkinase (PTK) ist, in die intakte Zelle eindringen und selektiv die Phosphorylierung des Substrats inhibieren kann, in einer wirksamen Konzen tration inkubiert,
- (b) nach einer gegebenen Inkubationsdauer den Phosphorylie rungsgrad des Substrats mißt und
- (c) aus dem gemessenen Phosphorylierungsgrad des Substrats die Aktivität der spezifischen PTPase bestimmt.
Die Inhibierung der Substratphosphorylierung durch die Substanz
kann durch unterschiedliche Wirkungsweisen hervorgerufen
werden, wie etwa durch Wechselwirkung mit der Phosphorylie
rungsstelle des Substrats oder durch Wechselwirkung mit einer
spezifischen Proteintyrosinkinase. Im folgenden wird die
Wirkung der Substanz, welche ein selektiver Inhibitor einer das
Substrat phosphorylierenden Proteintyrosinkinase (PTK) ist,
einfach als Inhibition der spezifischen PTK bezeichnet. Es ist
jedoch beabsichtigt, daß andere Wirkungsweisen ebenfalls von
der vorliegenden Erfindung umfaßt werden.
Durch die Hemmung der PTK wird in vivo die fortlaufende
Phosphorylierung der spezifischen Substrate unterbunden und auf
diese Weise die Wirkung der diese Substrate dephosphorylieren
den spezifischen PTPasen sichtbar gemacht. Ein wesentlicher
Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren besteht darin, daß die
Substratphosphorylierung selektiv inhibiert wird, wodurch
Nebenwirkungen, die bei Verwendung der bisher üblichen unselek
tiven Hemmstoffe unvermeidlich waren, auf ein Minimum reduziert
werden. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Systemen
besteht darin, daß die spezifischen PTK-Inhibitoren rasch in
intakte Zellen permeieren können. Eine Zellpermeabilisierung
ist dabei nicht erforderlich und somit wird die in vivo
Situation mit Ausnahme der spezifisch blockierten PTK intakt
belassen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
Zellen, die das Substrat exprimieren, für einen vorgegebenen
Zeitraum mit mindestens einem spezifischen PTK-Inhibitor
inkubiert. Danach werden die Zellen vorzugsweise aufgeschlossen
und der Phosphorylierungsgrad des Substrats bestimmt. Vorzugs
weise wird vor Schritt (a) eine Stimulierung der Substratphos
phorylierung durchgeführt. Zur Bestimmung der in vivo Aktivität
von PTPasen werden vorzugsweise mindestens zwei Messungen nach
unterschiedlichen Inkubationszeiträumen durchgeführt, um den
Zeitverlauf der Substratdephosphorylierung zu ermitteln, d. h.
man wiederholt Schritt (b) vorzugsweise mindestens einmal. Um
eine Verfälschung des Meßergebnisses zu vermeiden, ist es zuvor
normalerweise notwendig, das Substrat von anderen störenden
Bestandteilen abzutrennen. Verfahren dazu sind dem Fachmann
bekannt und umfassen z. B. Immunpräzipitation und dgl. Die
Bestimmung des Phosphorylierungsgrads des Substrats kann durch
in der Technik bekannte Verfahren, beispielsweise durch
Verwendung von Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern erfolgen.
Als Zellen eignen sich im Prinzip alle prokaryontischen und
eukaryontischen Zellen, die das Substrat exprimieren, wobei
aufgrund der medizinischen Relevanz Säugerzellen und ins
besondere Humanzellen bevorzugt sind. Aus Gründen der ein
facheren Handhabbarkeit werden im allgemeinen herkömmliche
Zellinien, wie etwa Swiss 3T3- oder PC12-Zellen, verwendet.
Zur Verbesserung der Meßgenauigkeit ist es im allgemeinen
bevorzugt, sicherzustellen, daß das Substrat für die getestete
PTPase in einer im wesentlichen phosphorylierten Form vorliegt.
In den Fällen, bei denen das Substrat erst infolge eines
bestimmten Signals phosphoryliert wird, ist es üblicherweise
bevorzugt, die Wirkung dieses Signals auszulösen. Beispiels
weise kann bei Oberflächenrezeptoren, die erst nach Bindung
eines Liganden durch die spezifischen PTK phosphoryliert
werden, vor Zugabe des PTK-Inhibitors eine Inkubation mit dem
jeweiligen Liganden durchgeführt werden. In anderen Fällen kann
es auch bevorzugt sein, eine Präinkubation mit Inhibitor,
gefolgt von Stimulierung durch Liganden durchzuführen, ins
besondere wenn ein lediglich qualitatives Ergebnis durch
Vergleich mit einer Kontrollbestimmung in Abwesenheit von
Inhibitor angestrebt wird. In nochmals anderen Fällen kann es
bevorzugt sein, keine Stimulation durchzuführen, z. B. wenn eine
geeignete Phosphorylierung des Substrats bereits durch einen
bestimmten Typ der verwendeten Zelle gegeben ist.
Als selektiver PTK-Inhibitor kann jede Substanz in einer
wirksamen Konzentration verwendet werden, die die Phosphorylie
rung des Substrats bzw. eine spezifische PTK des Substrats
selektiv hemmt und die in intakte Zellen eindringen kann. Unter
einer wirksamen Konzentration wird diejenige Konzentration
verstanden, bei der eine mindestens weitgehende Inaktivierung
der spezifischen Substratphosphorylierung erreicht wird und
gleichzeitig keine Nebenwirkungen beobachtet werden, die das
Meßergebnis beeinträchtigen oder/und für die Zellen toxisch
sind. Im allgemeinen werden Konzentrationen im Bereich von etwa
0,1 bis 100 µM (M bedeutet im folgenden mol l-1) verwendet. Die Auswahl der Inhibitorsubstanz
erfolgt auf Basis des Substrats bzw. der zu inhibierenden PTK.
PTK-Inhibitoren sind aus dem Stand der Technik bekannt
(Levitzky (1992); Burke (1992)). Die in der Beschreibung
erwähnten bzw. in den Beispielen der vorliegenden Erfindung
verwendeten Substanzen umfassen z. B. die Chinoxalinderivate
AG1295, AG1296 sowie das Staurosporinderivat K252a mit den
folgenden Strukturformeln:
Die spezifische PTK, die bei Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens selektiv gehemmt wird, stellt nicht notwendigerweise
ein eigenständiges Enzym dar. Die PTK kann beispielsweise ein
mit dem Substrat assoziiertes Protein sein oder auch eine
Untereinheit des Substrats, so daß die Phosphorylierung eine
Autophosphorylierung ist.
Das Substrat der zu bestimmenden PTPase kann ein beliebiges
zelluläres Protein sein und es ist lediglich wichtig, daß
dieses Protein von spezifischen PTK phosphoryliert und von
spezifischen PTPasen dephosphoryliert wird. Derartige Substrate
umfassen beispielsweise intrazelluläre Proteine, wie Kernpro
teine, oder membranassoziierte Proteine, ebenso wie membran
ständige Proteine z. B. an der Zelloberfläche. Es wurde festge
stellt, daß als Substrat für das erfindungsgemäße Verfahren
Zelloberflächenrezeptoren, wie z. B. Rezeptoren für einen
Wachstumsfaktor, etwa NGF-Rezeptor, PDGF-Rezeptor, KIT/SCF-Rezeptor,
KD-Rezeptor, EGF-Rezeptor und Insulinrezeptor,
hervorragend geeignet sind.
Eine geeignete Kombination von Protein und PTK-Inhibitor umfaßt
beispielsweise die Verwendung von PDGF-Rezeptor als Substrat
und PTK-Inhibitor AG 1295 und/oder AG 1296. Diese Kombination
eignet sich somit zum Bestimmen der Aktivität von PTPasen, die
auf den PDGF-Rezeptor wirken bzw. zum Auffinden von Effektoren
dieser PTPasen. Eine andere bevorzugte Kombination umfaßt einen
NGF-Rezeptor und K252a als PTK-Inhibitor, wodurch die Aktivität
der auf einen NGF-Rezeptor wirkenden PTPasen bzw. Effektoren
davon ermittelt werden können.
In einer besonderen Ausführungsform erlaubt das Verfahren der
vorliegenden Erfindung die Identifizierung von Effektoren der
spezifischen PTPase. Dazu wird die Aktivität der spezifischen
PTPase gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt und
zusätzlich eine Bestimmung in Gegenwart einer Testsubstanz
durchgeführt. Durch Vergleich der Phosphorylierungsgrade des
Substrats mit und ohne Testsubstanz kann die Wirkung der
Testsubstanz auf die Aktivität der spezifischen PTPase er
mittelt werden.
Derartige Effektoren sind aufgrund ihrer potentiellen Fähig
keit, pathologische Proliferations- und Differenzierungs
prozesse zu beeinflussen, in hohem Maße medizinisch relevant.
Es wird beispielsweise angenommen, daß PDGF eine Schlüsselrolle
für unerwünschte Hyperproliferationen in bestimmten Tumoren,
bei Arteriosklerose, Arthritis und Fibrosen zukommt (Heldin und
Westermark (1991); Ross, (1993); Rubin et al. (1988); Shaw et
al. (1991)). Aktivatoren der diesen Signalweg negativ regulie
renden PDGF-Rezeptor PTPasen können als spezifische Cytostatika
zur Beeinflussung dieser pathologischen Prozesse eingesetzt
werden. NGF und verwandte neurotrophe Faktoren spielen eine
entscheidende Rolle für die neuronale Differenzierung (Snider
(1994)). Eine ungenügende Aktivität dieser differenzierungs
induzierenden Regulation ist wahrscheinlich die Grundlage
verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen (Barinaga
(1994)). Inhibitoren der den NGF-Signalweg negativ regulieren
den PTPasen sind potentiell neurotrophe Wirkstoffe und können
zur Behandlung derartiger Erkrankungen eingesetzt werden. Eine
ähnliche Situation existiert im Falle des nicht-insulinabhängi
gen Diabetes mellitus (NIDDM), dem eine Unterfunktion des
Insulin-Rezeptors zugrunde liegt (Goldstein (1992)). Inhibito
ren der auf den Insulin-Rezeptor gerichteten PTPase(n) haben
eine Insulin-mimetische Funktion in Tiermodellen, jedoch sind
bisher nur relativ toxische und unspezifische derartige
Substanzen bekannt. Bei Verfügbarkeit spezifischer Inhibitoren
für die Insulin-Rezeptor PTK kann das erfindungsgemäße Ver
fahren auch zur Auffindung von spezifischen Inhibitoren der
Insulin-Rezeptor PTPasen und damit selektiver Insulin-Mimetika
genutzt werden.
Identifizierte Effektoren können als Aktivatoren bzw. Inhibito
ren spezifischer PTPasen verwendet werden. Es wurde z. B.
festgestellt, daß bestimmte Ionophore die Aktivität von
spezifischen PTPasen selektiv beeinflussen können. Derartige
Ionophore sind natürliche oder
synthetische Stoffe, die einen Ionentransport, wie etwa von Na⁺,
K⁺, Ca2+ und Mg2+ durch Membranen bewirken. Als Ionophore sind
sowohl Kanalbildner als auch mobile Carrier bekannt, es wird
jedoch davon ausgegangen, daß eine selektive Wirkung im
wesentlichen durch die mobilen Carrier vermittelt wird. Als
Effektor kann ein Ionophor verwendet werden, das zweiwertige
Ionen und insbesondere Ca2+ und/oder Mg2+ transportiert, wie z. B.
das Ionophor A 23187, 5-(Methylamino)-2-[[3,9,11-trimethyl-8-
[1-methyl-2-oxo-(1H-pyrrol-2-yl)ethyl)-1,7-dioxaspiro[5,5)un
dec-2-yl]methyl]-4-benoxazolcarbonsäure
oder Derivate davon (Debono et al. (1981)). A23187 wirkt als
Aktivator von PTPasen, die spezifisch PDGF-Rezeptor dephospho
rylieren. Die Wirkung von A 23187 ist in Beispiel 3 gezeigt.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Beeinflussung der
Wirkung von PTPasen in intakten Zellen kann als Wirkstoff ein
Ionophor und gegebenenfalls übliche pharmazeutische Hilfs-,
Verdünnungs- und Trägermittel enthalten.
Der Wirkstoff ist dabei in einer Menge vorhanden, die die
erwünschte Hemmung der spezifischen PTPase verursacht und im
wesentlichen keine toxischen Nebenwirkungen hervorruft. Obwohl
die Dosierung vom jeweiligen Wirkstoff abhängig ist, kann im
allgemeinen davon ausgegangen werden, daß eine wirksame Menge
etwa 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht beträgt. Die pharmazeu
tische Zusammensetzung wird durch ein geeignetes Verfahren
verabreicht. Derartige Verabreichungsformen sind dem Fachmann
bekannt, wie beispielsweise orale, subkutane, intravenöse,
intramuskuläre Verabreichung und dgl. Der Wirkstoff ist in der
Zusammensetzung in einer Form enthalten, die einen Transport
zum Zielgewebe erlaubt. Derartige Formen umfassen in Abhängig
keit vom Wirkstoff und der Verabreichungsform beispielsweise
wäßrige oder ölige Lösungen, Liposomen, Depotpräparate und
dgl.
Der Wirkstoff der pharmazeutischen Zusammensetzung kann ein
Ionophor sein, das Mg2+ und/oder Ca2+ transportiert und die
pharmazeutische Zusammensetzung enthält das Ca-Ionophor A23187
zur Aktivierung von gegen PDGF-Rezeptor gerichteter
PTPase-Aktivität.
Die folgenden Beispiele erläutern in Verbindung mit den
Abbildungen das erfindungsgemäße Verfahren weiter.
Abb. 1 zeigt die Hemmung der PDGF-Rezeptor PTK durch AG 1296,
Abb. 2 zeigt die Aktivität der PDGF-Rezeptor-PTPasen bei
Verwendung von AG 1296,
Abb. 3 zeigt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens in Swiss 3T3 Zellen,
Abb. 4 zeigt eine graphische Auswertung des Versuchs von Abb.
3,
Abb. 5 zeigt die Hemmung der NGF-Rezeptor PTK durch K252a,
Abb. 6 zeigt eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens in PC12-Zellen.
Swiss 3T3 Fibroblasten (Maus) exprimieren PDGFα und
PDGFβ-Rezeptoren auf der Zelloberfläche (Hosang et al. (1989)). Die
Stimulation der Zellen mit PDGF führt zu einer raschen Auto
phosphorylierung dieser Rezeptoren an Tyrosinresten. Diese
Autophosphorylierung ist in Immunoblots mit Anti-Phosphotyro
sin-Antikörpern nach Immunpräzipitation der Rezeptoren und in
unfraktionierten Zell-Lysaten nachweisbar. Die autophosphory
lierten Rezeptoren werden durch PDGF-Rezeptor-gerichtete
PTPase(n) rasch dephosphoryliert (Bohmer et al. (1993)). Die
Identität der zellulären PTPasen, die diese Reaktion katalysie
ren, ist nicht bekannt. Ein hochspezifischer Inhibitor für die
PDGF-Rezeptor PTK (AG 1296) hemmt deren Aktivität bereits nach
sehr kurzer Behandlung der Zellen (2 min) vollständig (Abb. 1).
In isolierten Membranen von Swiss 3T3-Zellen beeinflußt der
Inhibitor die in den Membranen enthaltenen PTPase(n) für den
autophosphorylierten PDGF-Rezeptor in ihrer Aktivität nicht
(Abb. 2). Wird der Inhibitor Zellen nach Aktivierung der
PDGF-Rezeptor PTK zugesetzt, kann die Dephosphorylierung des
PDGF-Rezeptors zeitabhängig verfolgt werden (Abb. 3).
Konfluente, ruhende Swiss 3T3-Zellen wurden in serumfreiem
Zellkulturmedium ohne Zusätze (Bahn 1, 2) oder mit dem
PDGF-Rezeptor PTK Inhibitor AG 1296 (Endkonzentration 50 µM) (Bahn
3-6) für verschiedene Zeiten, wie angegeben, inkubiert. Dann
erfolgte die Zugabe von humanem rekombinantem PDGF-BB (Endkon
zentration 100 ng/ml) (Bahn 2-6) oder des entsprechenden
Lösungsmittels (Bahn 1) und weitere Inkubation für 5 min. Nach
Standardverfahren wurde dann ein Zellextrakt hergestellt und
vergleichbare Mengen des Extrakts wurden mittels SDS-PAGE und
Immunoblotting mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern analysiert.
Die PDGF-induzierte Autophosphorylierung des Rezeptors wird
bereits durch Inkubation der Zellen für 2 min mit AG 1296
vollständig unterdrückt.
Isolierte Swiss 3T3-Zellmembranen (10 µg Protein per Bahn)
wurden mit PDGF (2 µg/ml) für 20 min auf Eis behandelt. Durch
Zusatz von 3 mM (Endkonzentration) ATP erfolgte dann die
Autophosphorylierung der aktivierten PDGF-Rezeptor PTK. Die
Kinase-Reaktion wurde durch Zugabe von 10 mM EDTA gehemmt.
Gleichzeitig wurde AG 1296 (50 µM) (B) oder das entsprechende
Lösungsmittel (DMSO) (A) zugesetzt. Direkt nach Zusatz der
Agenzien (0 min) oder nach 30 min Inkubation wurden der
Phosphotyrosingehalt des PDGF-Rezeptors analog wie in Abb. 1
beschrieben gemessen. Das stark abgeschwächte Signal nach 30
min ist auf die dephosphorylierende Wirkung der PTPase(n)
zurückzuführen. AG 1296 beeinflußt diese Dephosphorylierung
nicht.
Swiss 3T3-Zellen wurden in serumfreiem Medium mit PDGF (Abb. 3,
Bahn 2-6) oder dem entsprechenden Lösungsmittel (Abb. 3, Bahn
1) behandelt. Nach 5-minütiger Stimulation wurde AG 1296 (50
µM, Abb. 3 B) oder entsprechendes Lösungsmittel (DMSO, Abb. 3
A) zugesetzt. Zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angegeben,
wurden die entsprechend behandelten Zellen auf den Phosphotyro
singehalt des PDGF-Rezeptors geprüft. Während in den
DMSO-behandelten Zellen der Phosphotyrosingehalt des stimulierten
PDGF-Rezeptors über die Inkubationszeit etwa gleich bleibt
(Gleichgewicht von PTK- und PTPase-Reaktion) nimmt der Phospho
tyrosingehalt der Rezeptoren in den mit dem PTK-Inhibitor
behandelten Zellen kontinuierlich ab. Diese Abnahme wird durch
die Aktivität der PDGF Rezeptor-gerichteten PTPase in den
intakten Zellen bewirkt. Eine graphische Auswertung ist in Abb.
4 gezeigt.
In Kontrollexperimenten (nicht gezeigt) wurde durch Immun
präzipitation die Identität und die über den Versuchsablauf
gleichbleibende Konzentration des PDGF-Rezeptors sicherge
stellt.
Für die dargestellten Untersuchungen wurden PC12-Zellen (Ratten
Pheochromocytom-Zellen) verwendet, die NGF-Rezeptoren (Trk A)
überexprimieren (Obermeier et al. (1994)). Die Stimulation der
Zellen mit NGF führt zu einer raschen Autophosphorylierung
dieser Rezeptoren an Tyrosinresten. Diese Autophosphorylierung
ist in Immunoblots mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern nach
Immunpräzipitation der Rezeptoren nachweisbar. Die Identität
der zellulären PTPasen, die autophosphorylierte NGF-Rezeptoren
dephosphorylieren, ist nicht bekannt. Das Staurosporin-Derivat
K252a wurde als spezifischer Inhibitor für die NGF-Rezeptor PTK
sowie auch die PTK-Aktivität anderer Neurotrophin-Rezeptoren
beschrieben (Ohmichi et al. (1992); Tapley et al. (1992)). In
Analogie zu den unter Beispiel 1 beschriebenen Versuchen wurde
festgestellt, daß K252a die Aktivität von Trk-Rezeptor PTK
bereits nach kurzer Behandlung der Zellen vollständig hemmt
(Abb. 4). Wird der Inhibitor Zellen nach Aktivierung von Trk
zugesetzt, ist die sehr rasche Dephosphorylierung des
NGF-Rezeptors meßbar (Abb. 5).
In Kontrollexperimenten (nicht gezeigt) wurde die über den
Versuchsablauf gleichbleibende Konzentration des NGF-Rezeptors
sichergestellt.
TrkA überexprimierende PC12-Zellen wurden in serumfreiem
Zellkulturmedium ohne Zusätze (Bahn 1, 2) oder mit dem
NGF-Rezeptor PTK Inhibitor K252a (Endkonzentration 1 µM) (Bahn 3-6)
für verschiedene Zeiten, wie angegeben, inkubiert. Dann
erfolgte die Zugabe von NGF (Endkonzentration 150 ng/ml) (Bahn
2-6) oder des entsprechenden Lösungsmittels (Bahn 1) und
weitere Inkubation für 10 min. Nach Standardverfahren wurde
dann ein Zellextrakt hergestellt, die NGF-Rezeptoren mit einem
spezifischen Antikörper immunpräzipitiert und vergleichbare
Mengen des Immunpräzipitats wurden mittels SDS-PAGE und
Immunoblotting mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern analysiert.
Die NGF-induzierte Autophosphorylierung des Rezeptors wird
bereits durch Inkubation der Zellen für 2 min mit K252a
vollständig unterdrückt.
TrkA transfizierte PC12-Zellen wurden in serumfreiem Medium mit
NGF (Bahn 2-6) oder dem entsprechenden Lösungsmittel (Bahn 1)
behandelt. Nach 10-minütiger Stimulation wurde K252a (1 µM, B)
oder entsprechendes Lösungsmittel (DMSO, A) zugesetzt. Zu
verschiedenen Zeitpunkten, wie angegeben, wurden die ent
sprechend behandelten Zellen wie in Abb. 1 beschrieben aufgear
beitet und die NGF-Rezeptoren auf ihren Phosphotyrosingehalt
geprüft. Während in den DMSO-behandelten Zellen der Phosphoty
rosingehalt des stimulierten NGF-Rezeptors über die Inkuba
tionszeit etwa gleich bleibt (Gleichgewicht von PTK- und
PTPase-Reaktion) nimmt der Phosphotyrosingehalt des Rezeptors
in den mit dem PTK-Inhibitor behandelten Zellen drastisch ab.
Diese Abnahme wird durch die Aktivität der NGF-Rezeptor-gerichteten
PTPase in den intakten Zellen bewirkt.
Vorbehandlung von Swiss 3T3-Zellen mit potentiellen Effektoren
der für den PDGF-Rezeptor spezifischen PTPasen beschleunigt
(PTPase-Aktivatoren) oder verlangsamt (PTPase-Inhibitoren) die
Dephosphorylierung. In Tabelle 1 ist der in dieser Weise
gemessene Effekt von den bekannten, unspezifischen PTPase-Inhibitoren
Na-Orthovanadat und Phenylarsinoxid sowie des
erfindungsgemäßen Aktivators A23187 gezeigt.
Swiss 3T3-Zellen wurden mit den in Tabelle 1 aufgeführten
Effektoren (oder entsprechenden Lösungsmitteln) behandelt. Dann
wurde die Aktivität der PDGF-Rezeptor-PTPase(n) mit dem
vorstehend beschriebenen Test analysiert. Die Immunoblots
wurden durch direkte Fluoreszenzdetektion (Imaging System G250,
Biorad) oder durch Filmexposition und Densitometrie (Image
1.04) quantifiziert. Die relative Dephosphorylierung des
PDGF-Rezeptors nach 5 min wurde in % im Vergleich zu Kontroll
experimenten ohne Effektor (100%) angegeben.
Effektor | |
Relative PDGF Rezeptor-gerichtete PTPase-Aktivität (% der Kontrolle) | |
Na-Orthovanadat (2 mM) | |
34 | |
Phenylarsinoxid (PAO) (25 µM) | 38 |
A 23187 (1 µM) | 161 |
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Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer spezifischen
Proteintyrosinphosphatase (PTPase) in intakten Zellen,
dadurch gekennzeichnet,
daß man
- (a) intakte Zellen, in denen ein Substrat der zu bestim menden PTPase enthalten ist, mit mindestens einer Substanz, welche ein selektiver Inhibitor einer das Substrat phosphorylierenden Proteintyrosinkinase (PTK) ist, in die intakte Zelle eindringen und selek tiv die Phosphorylierung des Substrats inhibieren kann, in einer wirksamen Konzentration inkubiert,
- (b) nach einer gegebenen Inkubationsdauer den Phosphory lierungsgrad des Substrats mißt und
- (c) aus dem gemessenen Phosphorylierungsgrad des Sub strats die Aktivität der spezifischen PTPase be stimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man vor Schritt (a) eine Stimulierung der
Substratphosphorylierung durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Schritt (b) mindestens einmal wiederholt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die spezifische Proteintyrosinkinase eine Untereinheit
des Substrats ist, so daß die Phosphorylierung eine
Autophosphorylierung ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Substrat einen Zelloberflächenrezeptor
verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Substrat einen Rezeptor für einen Wachstums
faktor verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Rezeptor ausgewählt wird aus NGF-Rezeptor,
PDGF-Rezeptor, KIT/SCF-Rezeptor, KD-Rezeptor, EGF-Rezeptor und
Insulin-Rezeptor.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Substrat einen PDGF-Rezeptor und als
PTK-Inhibitor AG 1295 und/oder AG 1296 verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Substrat einen NGF-Rezeptor und als
PTK-Inhibitor K252 a verwendet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3 zur Identifizie
rung von Effektoren einer spezifischen Proteintyrosinphos
phatase,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine zusätzliche Bestimmung in Gegenwart einer
Testsubstanz durchführt und aus dem Vergleich der Phospho
rylierungsgrade die Wirkung der Testsubstanz als Effektor
der PTPase ermittelt.
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