DE69232438T2

DE69232438T2 - Interne ribosom eintrittsstellen enthaltene retrovirale vektoren

Info

Publication number: DE69232438T2
Application number: DE69232438T
Authority: DE
Inventors: W. French Anderson; Larry Couture; Richard A. Morgan
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-08-07
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 2002-10-10
Anticipated expiration: 2012-08-07
Also published as: ES2173082T3; WO1993003143A1; DE69232438D1; JP3378962B2; DK0598029T3; EP0598029A4; CA2114416C; CA2114416A1; ATE213779T1; JPH06509713A; EP0598029B1; EP0598029A1

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines retroviralen Vektors, der zur Expression von multiplen Proteintranslationsereignissen von einer einzelnen polycistronischen mRNA ohne der Verwendung von internen Promotorelementen fähig ist.
Retrovirale Vektoren sind brauchbare Agenzien zur Vermittlung des retroviral-vermittelten Gentransfers in eukaryontische Zellen. Solche Vektoren werden im allgemeinen so konstruiert, daß die Mehrzahl an Sequenzen, die für die Strukturgene des Virus kodieren, deletiert und durch die Gene von Interesse ersetzt werden.
Diese neuen Gene werden in das provirale Rückgrad auf mehrere allgemeine Arten eingesetzt. Die geradlinigsten Konstruktionen sind die, worin die Strukturgene des Retrovirus durch ein einzelnes Gen ersetzt werden, das dann unter der Kontrolle der viralen Regulationssequenzen innerhalb der langen terminalen Wiederholung (LTR) transkribiert wird. Es wurden auch retrovirale Vektoren konstruiert, die mehr als ein Gen in die Zielzellen einführen können. Gewöhnlich befindet sich in solchen Vektoren ein Gen unter der regulatorischen Kontrolle der viralen LTR, während das zweite Gen entweder von einer gespleißten Information (1,2) exprimiert wird oder unter der Regulation des eigenen, internen Promotors liegt.
Es wurden Anstrengungen unternommen, um die virale Komponente des viralen Rückgrads zu minimieren, vor allem in der Bemühung, die Wahrscheinlichkeit für die Rekombination zwischen dem Vektor und dem Verpackungs-defekten Helfervirus innerhalb der Verpackungszellen zu verringern. Es ist ein Verpackungsdefektes Helfervirus notwendig, um die Strukturgene eines Retrovirus bereitzustellen, die aus dem Vektor selbst deletiert wurden.
Die Gentherapie oder die Arzneimittelabgabe über einen Gentransfer umfaßt die Erzeugung von spezialisierten Vektoren, wobei jeder Vektor nur auf eine bestimmte Erkrankung anwendbar ist. Daher ist es erwünscht, daß ein Vektorklonierungssystem erhältlich ist, das konsistent die erforderlichen Sicherheitsmerkmale aufrechterhält und eine maximale Flexibilität im Vektordesign erlaubt. Geringe Veränderungen in der Genposition oder in der spezifischen Kombination der regulatorischen Sequenzen des Gens von Interesses können zu deutlichen Unterschieden im Vektortiter oder der Art führen, auf die transferierte Gene in Zielzellen funktionieren.
Das derzeitige Vektordesign erfordert die Verwendung von internen Promotorelementen in einem retroviralen Vektor, um eine interne mRNA zu initiieren. Daher wäre es, wenn mehrere Gene in einem retroviralen Vektor gewünscht wären, notwendig, mehrere Promotorelemente innerhalb eines retroviralen Vektors zu haben. Ein potentielles Problem mit retroviralen Vektoren, die multiple Transkriptionseinheiten enthalten ist, daß es beobachtet wurde, daß falls die Selektion für ein Gen angewendet wird, die Expression des anderen Gens reduziert wird oder vollständig verloren geht. Dies wird Promotorsuppression genannt (3, 4).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen retroviralen Expressionsvektor, der umfaßt eine erste DNA Sequenz, die für ein erstes zu exprimierendes Protein kodiert und eine zweite DNA Sequenz, die für ein zweites zu exprimierendes Protein kodiert. Der Vektor umfaßt eine erste Promotorsequenz zur Expression von mRNA sowohl von der ersten als auch zweiten DNA Sequenz und eine interne Ribosomeneintrittsstelle zwischen der ersten und der zweiten DNA Sequenz. Die Promotorsequenz, die erste DNA Sequenz, die interne Ribosomeneintrittsstelle und die zweite DNA Sequenz sind in diesem retroviralen Vektor so operativ verbunden, daß eine polycistronische mRNA gebildet wird und eine Expression der ersten und zweiten unabhängigen Proteine von dieser mRNA stattfindet, die durch die Promotorsequenz exprimiert wird.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liefert den oben beschriebenen retroviralen Vetor, worin die interne Ribosomeneintrittstelle von einem Picornavirus ist.
Die Genexpression in der Familie der Picornaviridae läuft normalerweise so ab, daß das 5'-Ende der mRNA pUp... ist und sie lange untranslatierte Signalsequenzen besitzen (5-6). Eine Analyse der Picornaviren zeigt, daß sie fähig sind, die Standardribosomenauswahlverfahren der Translation zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu beginnen (8-11). Interne Ribosomeneintrittstellen (IRES) wurden in den langen 5'-untranslatierten Regionen der Picornaviren indentifiziert, die aus ihrer viralen Umgebung entfernt werden können und an damit nicht in Zusammenhang stehende Gene unter Bildung von polycistronischen mRNAs gebunden werden können (8, 10, 12).
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen die funktionsfähige Verknüpfung von IRES Elementen der Picornaviren mit verschiedenen Genen und die Insertion dieser IRES-Genfusionen in retrovirale Vektoren, die unter Bildung der funktionellen Genprodukte translatiert werden. Diese Picornavirus IRES Vektoren erlauben die Herstellung von mehreren Proteinen von einem einzelnen Vektor ohne alternierendes Spleißen oder mehrfachen Transkriptionseinheiten und eliminieren so das Potential der Promotorsupression. Zusätzlich können die Kupplung oder Translation von zwei (oder mehreren) unterschiedlichen Proteinen signifikante Anwendungen in der humanen Gentertherapie haben, wo die Expression von multiplen heterologen Proteinen oder distinkten Untereinheiten eines multimeren Proteins in einer gegebenen Zelle erforderlich ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: EMC CAT Vektor. Oben in der Figur ist ein Diagramm des EMC/CAT Vektors G1N2ECt und des Kontrollvektors CAT LHCtSN gezeigt. Unten sind die Autoradiogramme der CAT Enzymanalyse gezeigt (1 h Inkubation). Die Spur 1 zeigt Produktionszellen, die mit pTM1-CAT transfiziert sind, die Spur 2 zeigt mit G1N2ECt transfizierte Produktionszeilen, die Spur 3 zeigt mit LHCtSN transfizierte Produktionszellen, die Spur 4 zeigt mit G1N2ECt transduzierte NIH/3T3 Zellen und die Spur 5 zeigt mit LHCtSN transduzierte NIH/3T3 Zellen.
Fig. 2: EMC β-GAL Vektor. Oben in der Figur ist die Darstellung des EMC/β-gal Vektors G1N2EBg und des Kontroll-β-Gal-Vektors GlN2SvBg gezeigt. Darunter sind Mikroskopphotographien von in situ gefärbten Produktionszellinien gezeigt, die mit den angegebenen Vektoren transfiziert wurden.
Fig. 3: ADA EMC Vektor. Oben in der Figur ist eine Darstellung des EMC/ADA Vektors G1NaEA und des Kontroll-ADA-Vektors SAX gezeigt. In der Darstellung A ist eine Stärkegelanalyse für die ADA Enzymaktivität, wobei gleiche Mengen der Gesamtzellysate für jede Probe verwendet wurden, und die Lage der ADA Enzyme des Menschen (Hu) und der Maus (Mo) gezeigt. Die Spur 1 zeigt SAX Produktionszellen, die Spur 2 zeigt G1NaEA Produktionszellen, die Spur 3 zeigt NIH/3T3 Zellen, die Spur 4 zeigt mit SAX transduzierte 3T3 Zellen und die Spur 5 zeigt mit G1NaEA transduzierte 3T3 Zellen. Die Darstellung B ist eine Northern Blot Analyse mittels 20 ug Gesamtzell RNA mit den angegebenen Sonden, wobei ADA auf den Spuren 1 und 2 gezeigt ist und NEO auf den Spuren 3 und 4. Die Proben sind folgende: Auf den Spuren 1 und 3 ist RNA aus SAX Produktionszellen, auf den Spuren 2 und 4 RNA aus G1NaEA Produktionszellen. Die Transkripte stammen von den LTR oder den SV40 Promotoren, wie dies angegeben ist.
Fig. 4: sCD4-ADA-NEO Dreifachgenvektor. Oben in der Figur ist eine Darstellung des LSCEASN (sCD4, ADA und NEO) Dreifachgenvektors gezeigt. Unten sind die Ergebnisse der ADA Stärkegelanalyse aus 12 G418R Produktionszellklonen (Nummern 1-12, H = Humankontrolle, M = Mauskontrolle) und die Mengen an sCD4 gezeigt, die im Kulturmedium gebildet wurden, wie dies durch ELISA gemessen wurde.
Fig. 5: NEO-ADA-CAT Dreifachgenvektor. Oben in der Figur ist eine Darstellung des LNEASCt Dreifachgenvektors (NEO, ADA und CAT) gezeigt. Die Darstellung A ist ein Autoradiogramm der resultierenden CAT Aktivität aus 12 G418R Produktionszellklonen (Nummer 1-12) und der bei den NIH/3T3 Zellen mit G418R CFU/ml gemessene Titer, der aus den Produktionszellen erhalten wurde. Die Darstellung B ist eine ADA Stärkegelanalyse aus den 12 Produktionszellklonen (Nummern 1-12), C = NIH/3T3 Zellen, wobei die ADA Banden von Menschen (Hu) und der Maus (Mo) angegeben sind.
Fig. 6: Expression in Dreifachgen-transduzierten Zellen. Die Darstellung A ist ein resultierendes Autoradiogramm der CAT Enzymanalyse von 12 NIH/3T3 Zellpopulationen, die transduziert und mit dem Überstand aus 12 Produktionszellklonen in Fig. 5 ausgewählt wurden. Die Darstellung B ist eine ADA Stärkegelanalyse aus 9 NIH/3T3 Zellpopulationen, die transduziert und mit dem Überstand aus 9 Produktionszellklonen ausgewählt wurden, die in Fig. 5 verwendet wurden. Die Kontroll-3T3 Zellen sind in Spur C die Position der ADA Banden vom Menschen (Hu) und der Maus (Mo) sind angegeben, wobei alle ADA Banden vom Menschen im ursprünglichen nassen Gel leicht sichtbar waren.
Fig. 7: Polio IRES Vektor. Oben in der Figur sind Darstellungen der CAT Konstrukte gezeigt, die in diesem Experiment getestet wurden. Darunter ist ein Autoradiogramm der CAT Enzymanalyse (1 h Inkubation) aus G418R Produktionszellinien gezeigt, die transfiziert sind in Spur 1 mit LNPCt, in Spur 2 mit G1NECt, in Spur 3 mit LCtSN und in Spur 4 mit G1NaNECt.

Detallierte Beschreibung der Erfindung

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung einen retroviralen Vektor bereitzustellen, der zur Expression von multiplen Genen von einer einzigen mRNA unter Verwendung von internen Ribosomeneintrittstellen fähig ist. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung einen retroviralen Expressionsvektor bereitzustellen, der zur Expression von mehreren Proteinen von einem Wirtsgenom fähig ist.
Der retrovirale Expressionsvektor umfaßt eine erste DNA Sequenz, die für die Expression eines ersten Proteins kodiert und eine zweite DNA Sequenz, die für die Expression eines zweiten Proteins kodiert. Der Vektor umfaßt auch eine erste Promotorsequenz zur Expression von mRNA sowohl von der ersten als auch zweiten DNA Sequenz und eine interne Picornavirusribosomeneintrittstelle zwischen der ersten und der zweiten DNA Sequenz. Alle diese Elemente (die Promotorsequenz, die erste DNA Sequenz, die interne Ribosomeneintrittstelle und die zweite DNA Sequenz) sind funktionsfähig mit dem retroviralen Vektor verbunden, um eine polycistronische mRNA und die Expression der ersten und zweiten unabhängigen Proteine von der mRNA zu bilden, die vom Promotor exprimiert wird.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liefert den oben beschriebenen retroviralen Expressionsvektor, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle von einem Picornavirus stammt. Eine Ausführungsform dieses Expressionsvektors ist die, worin die IRES des Picornavirus vom Encephalomyocarditisvirus stammt und dies vorzugsweise die Nukleotide 163 bis 746 des Encephalomyocarditisvirus sind.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung liefert einen Expressionsvektor, worin die Picornavirus IRES vom Poliovirus stammt und vorzugsweise die Nukleotide 28 bis 640 des Poliovirus umfaßt.
Der retrovirale Vektor der vorliegenden Erfindung kann auch den ersten Promotor bereitstellen, der aus den LTR Sequenzen von einem retroviralen Genom bestehen kann.
Zusätzlich liefert die vorliegende Erfindung eine eukaryontische Zelle, vorzugsweise eine tierische Zelle, vor allem eine humane Zelle, die genetisch unter Verwendung des obigen retroviralen Vektors verändert wurde. Repräsentative Beispiele für solche humanen Zellen sind unter anderem Hepatozyten, Endothelzellen, Knochenmarkszellen, Fibroblasten usw.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines retroviralen Vektors, der zur Bildung einer polycistronischen mRNA und zur Expression von mindestens zwei unabhängigen Proteinen fähig ist. Das Verfahren umfaßt das operative Verbinden einer ersten DNA Sequenz, die für ein erstes zu exprimierendes Protein kodiert, einer zweiten DNA Sequenz, die für ein zweites zu exprimierendes Protein kodiert, einer ersten Promotorsequenz zur Expression der mRNA sowohl der ersten als auch der zweiten DNA Sequenz und einer internen Ribosomeneintrittsstelle des Picornavirus zwischen der ersten und der zweiten DNA Sequenz in einem retroviralen Expressionsvektor.
Eine Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Ziels liefert die Herstellung eines wie oben angegebenen retroviralen Vektors, worin der Promotor aus den LTR Sequenzen eines Retrovirusgenoms besteht.
Das oben beschriebene Verfahren liefert eine interne Ribosomeneintrittsstelle, die von einem Picornavirus stammt. Beispiele für solche Picornaviren sind unter anderem Encephalomyocarditisvirus, vorzugsweise die Nukleotide 163-746, Poliovirus, vorzugsweise die Nukleotide 28-640 und Maul- und Klauenseuchevirus, vorzugsweise die Nukleotide 369-804.
Zusätzlich liefert das oben beschriebene Verfahren eine tierische Zelle, die genetisch mittels des durch das obige Verfahren hergestellten retroviralen Vektors verändert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der retrovirale Expressionsvektor zumindest eine DNA Sequenz, die für die Expression eines therapeutischen Proteins kodiert. Der Ausdruck therapeutisches Protein wird in seiner breitesten Bedeutung verwendet und meint jedes Protein oder Material, das einen nützlichen Effekt für den Wirt aufweist. Das therapeutische Protein kann in Form von einem oder mehreren Proteinen vorliegen. Als repräsentative Beispiele können erwähnt werden: Lösliches CD-4, Faktor VIII, Faktor IX, von Willebrand Faktor, TPA, Urokinase, Hirudin, die Interferone, Tumornekrosefaktor, die Interleukine, hämatopoetische Wachstumsfaktoren (G-CSF, GM-CSF, IL3, Erythropoetin), Antikörper, Glucocerebrosidase, Adenosindiaminose (ADA), Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), β-Galaktosidase (β-Gal), Phenylalaninlrydroxylase, humanes Wachstumshormon, Insulin usw. Die Auswahl einer geeigneten DNA Sequenz für ein therapeutisches Protein sollte durch die Beschreibung hierin innerhalb des Wissens eines Fachmanns liegen.
Es können viele retrovirale Vektoren konstruiert werden, die die Elemente des hierin beanspruchten Retrovirusvektors enthalten. Beispiele für solche retroviralen Vektoren sind die folgenden: Moloney Leukämievirus, Milznekrosevirus und Vektoren, die von Retroviren stammen, wie Rous Sarcomavirus und Harvey Sarcomavirus. Spezifische Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert werden können, sind in den späteren Beispielen beschrieben.
Bender et al., J. Virol. 61: 1639-1649 (1987) beschreiben eine Reihe an Vektoren auf der Basis des N2 Vektors (Armentano et al., J. Virol. 61: 1647-1650), die eine Reihe an Deletionen und Substitutionen aufweisen, um die Homologie zwischen dem Vektor und den Verpackungssystemen auf ein absolutes Minimum zu reduzieren. Die Veränderungen haben auch die Wahrscheinlichkeit verringert, daß die viralen Proteine exprimiert werden würden. Im ersten dieser Vektoren, nämlich LNL-XHC, befindet sich ein durch ortsspezische Mutagenese verändertes natürliches ATG Startcodon von gag zu TAG, wobei die ungewollte Proteinsynthese von diesem Punkt eliminiert wird.
Im Moloney Mausleukämievirus (MoMuLV) existiert 5' zum authentischen gag-Start ein offener Leserahmen, der die Expression eines weiteren glycosylierten Proteins erlaubt (pPrgag). Das Moloney Maussarcomvirus (Mo- MuSV) weist Veränderungen in dieser 5'-Region einschließlich einer Leserahmenverschiebung und eines Verlusts der Glycosylierungsstellen auf, die die potentielle Expression des Aminoterminus von ppr80gag verhindern. Daher wird der Vektor LNL6 hergestellt, der sowohl das veränderte ATG von LNL-XHC und den 5'-Teil des MoMuSV enthält. Die 5'-Struktur der LN Vektorserie eliminiert so die Möglichkeit der Expression der retroviralen Leserahmen mit anschließender Produktion der viralen Antigene in genetisch transduzierten Zielzellen. Bei einer schließlichen Veränderung zur Reduktion der Überlappung mit dem Verpackungsdefekten Helfervirus hat Miller zusätzliche env Sequenzen eliminiert, die dem 3'-LTR im LN Vektor (15) vorangehen.
Hierin wird beschrieben, daß Picornavirus IRES Elemente an verschiedene Gene gebunden werden können und daß die Gen-IRES Fusionen, wenn sie in retrovirale Vektoren inseriert werden, unter Bildung von funktionellen Genprodukten translatiert werden. Diese IRES Vektoren erlauben es, mehrere Proteine von einem einzelnen Vektor ohne alternierendes Spleißen oder multiplen Transkriptionseinheiten herzustellen und somit das Potential für eine Promotorsupression zu eliminieren. Darüberhinaus kann die Kupplung der Translation von zwei (oder mehreren) unterschiedlichen Proteinen signifikante Anwendungen in der humanen Gentherapie haben, wo ein multimeres Protein erforderlich ist.
Zusätzlich können Vektoren, die mehrere IRES-Genfusionen im selben Konstrukt enthalten, unter Verwendung von Kombinationen der EMC und Poliovirus IRES Elemente konstruiert werden.
Bei multiplen IRES Konstrukten würde ein einziges Transkriptionsereignis eine polycistronische mRNA erzeugen, die unter Bildung von multiplen Proteinen translatiert werden könnte ohne einen internen Promotor zu verwenden.
Obwohl der retrovirale Vektor vorzugsweise für therapeutische Zwecke im Bereich des Gentransfers oder der Gentherapie beim Menschen verwendet wird, kann der Vektor auch zur Transduktion von Zellen für in vitro Anwendungen verwendet werden, das heißt zur Herstellung von zwei unterschiedlichen Proteinen in eukaryontischen Zellen.
Die Kupplung von unabhängigen Proteintranslationen kann mehrere Vorteile bei Situationen in der humanen Gentherapie haben, bei denen mehrere Proteine erforderlich sind. Ein Beispiel für eine solche Situation umfaßt die Veränderung von Zellen zur Expression heterologer Proteine, die bei einer gegebenen Aufgabe effizienter sind (beispielsweise die Verringerung der Thrombogenität mit Kombinationen aus TPA mit UPA). Es kann ferner vorteilhaft sein, die Produktion eines potentiell physiologisch gefährlichen Proteins an die eines bedingt lethalen Proteins für die Zelle zu kuppeln (beispielsweise Tumornekrosefaktor mit Thymidinkinase des Herpes virus).
Die folgenden Beispiele sollen weiter erläutern, daß die ribosomalen Eintrittstellen zur Bildung von Expressionsvektoren verwendet werden können, die zur Expression von multiplen Genen fähig sind, jedoch ist es nicht beabsichtigt, den Schutzumfang der Erfindung hierdurch zu beschränken.

Material und Methoden

(A) Molekulare Konstrukte

Alle verwendeten molekularen Konstruktionstechniken entsprechen Standardbedingungen, wie sie vorher beschrieben wurden (25). G1N2ECt und G1N2EBg Vektoren werden jeweils aus den T7 RNA Polymeraseexpressionsplasmiden pOS6 und pOS8 hergestellt (13, 14) (B. Moss, National Institute of Health, Bethesda, MD). pOS6 wird durch Ligation des 0,8 kb NcoI-BamHI Fragments von pT7EMCAt (13) (B. Mos, National Institutes of Health, Bethesda, MD) in die NcoI - BamHI Schnittstellen des pTMI Vektors (26) konstruiert (Bernard Moss, National Institutes of Health, Bethesda, MD). pOS8 wird durch einen EcoRI Verdau, eine Klenow-Auffüllung und eine Selbstligation, gefolgt von einem BamHI Verdau und einer Ligation mit dem 3,0 kb BamHI Fragment von p11Xβ konstruiert (Bernard Moss, National Institutes of Health, Bethesda). ClaI und BspMII werden zum Herausschneiden der T7-EMC/CAT und T7-EMC/β-gal Expressionskassetten verwendet. Die entstehenden Fragmente werden durch Klenow-Auffüllung stumpfendig gemacht und in die mit Hindill geschnittene und mit Klenow aufgefüllte Schnittstelle von pG1N2ECt unter Bildung von pG1NECt und pG1N2EBg ligiert. Um einen EMC/ADA Vektor zu konstruieren wird EMC IRES aus pTM1 mittels Polymerasekettenreaktion (PCR, 30 Zyklen: 92ºC für 2 Minuten, 56ºC für 2 Minuten und 37ºC für 3 Minuten) und einer Amplifikation/Restriktionsenzymstelleneinfügung (jeweils 1 uM der Oligonukleotidprimer 5'-AACGGTTTCCCTCGAGCGGGATCA-3' plus 5'-TTTGTTAGCAGCCGGATCGT-3' in 100 ul, worin 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gelatine, jeweils 200 uM dNTP und 2,5 E TAQ DNA Polymerase enthalten ist) unter Bildung eines Fragments mit XhoI Enden isoliert, das in die XhoI Schnittstelle von Blueskript 11 SK+ (Stratagene, La Jolla CA) unter Bildung von pEMC-F kloniert wird. Es wird ähnlich eine PCR (30 Zyklen: 92ºC für 2 Minuten, 56ºC für 2 Minuten und 37ºC für 3 Minuten) verwendet (jeweils 1 uM der Oligoinukleotidprimer 5'-TGCGAGACCATGGGACAGACGCCC-3' plus 5'-CGGAAGTGTGATCACC- TAGGCGAC-3' in 100 ul, worin 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gelatine, jeweils 200 uM dNTP und 2,5 E TAQ DNA Polymerase enthalten ist), um ein Fragment herzustellen, das das ADA Gen enthält, wobei der retrovirale SAX Vektor als Template verwendet wird (20) (W. French Anderson, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Das ADA Fragment wird mit NcoI plus XbaI verdaut und in die entsprechenden Stellen in pEMC-F unter Bildung von pEMCADA kloniert. Das EMC/ADA Fragment wird durch einen XbaI Verdau und eine Klenowauffüllung plus XhoI Verdau herausgeschnitten und mit dem Apal geschittenen/T4 DNA Polymerase aufgefüllten und XhoI geschnittenen retroviralen Vektor pG1Na unter Bildung von pG1NaEA ligiert. Die Ausgangsvektoren für die Dreifachgenkonstrukte, nämlich LSCSN und LNSvCt werden durch die Insertion des Gens für lösliches CD4 und des CAT Gens in die EcoRI plus XhoI (für CD4) oder Hindill (für CAT) Schnittstellen jeweils von LXSN und LNSC hergestellt (15) (A. Dusty Miller, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA). Das EMCADA Fragment wird aus pECADA durch XbaI Verdau und Klenowauffüllung plus XhoI Verdau herausgeschnitten und in das mit BamhI geschnittene/Klenow-aufgefüllte plus XhoI geschnittene LSCSN unter Bildung von LSCEASN ligiert. Zur Herstellung von LNEASCt wird pEMCADA, das mit XhoI und XbaI verdaut wurde, mit Klenow aufgefüllt und mit dem BacnHI-geschnittenen/Klenow aufgefüllten LNSvCt ligiert. Der Polio IRES Vektor wird durch PCR Amplifilkation/Restriktionsschnittstelleneinfügung (jeweils 1 uM der Oligonukleotidprimer 5'-CCCAGATCTCCACGTGGCGGC-3' plus 5'-ACCGGAAGGCCTATCCAATTC-3' in 100 gl, worin 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Gelatine, jeweils 200 uM dNTP und 2,5 E TAQ DNA Polymerase enthalten ist) mittels pPV16 als Template konstruiert (7) (Bernhard Moss, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Die PCR erzeugt ein Fragment mit BglII und StuI Enden, das in den BamHI und StuI geschnittenen LNSvCt unter Bildung von LNPCt ligiert wird. Der Vektor G1NECt ist zu G1N2Ect ähnlich, enthält aber ein leicht unterschiedliches NEO Gen. Der Vektor G1NaNECt wird durch einen NcoI Verdau/Klenow-Auffüllung plus einem XhoI Verdau von pTM1, gefolgt von der Ligation in den mit BamHI-geschnittenen/mit Klenow-aufgefüllten plus XhoI geschnittenen pG1Na konstruiert. LCtSN und LHCtSN werden durch die Ligalion eines HindIII- geschnittenen/mit Klenow aufgefüllten CAT Fragments in die HpaI Schnittstelle von jeweils LXSN und LHXSN konstruiert (der LHXSN Vektor ist derselbe, wie LXSN, aber mit einer substituierten U3 Region aus dem Harvey Maussarcomavirus (Larry Couture, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Die Herstellung der Vektoren pG1N2, pG1Na und pG1N2SvBg ist in WO 91/10728 von M. Eglitis et al beschrieben.

Zellkultur und Vektorherstellung

Es werden Produktionszellinien mit retroviralem Vektor durch das Mikro-Ping-Pong Verfahren hergestellt (16, 17). Kurz gesagt werden 50 ug DNA zur Transfektion (über Calciumphosphatcopräzipitation) eines Gemisches der ecotropen Verpackungszellinie GP+E-86 (23) Arthur Banks, Columbia University, New York, N.Y.) und der amphotrophen Verpackungszellnien PA317 (24) (A. D. Miller, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA) verwendet. Die Verpackungszelliniengemische werden für mindestens eine Woche in Kultur gehalten, um die Vektoramplifikation zu erlauben. Eine Selektion auf Vektorintegration wird durch das Wachstum in Gegenwart des Neomycinanalogons G418 (400 ug/ml Wirkstoffkonzentration) erhalten. Es werden rekombinante retrovirale Vektorpräparationen durch Ernten des Zellkultunnediums von konfluenten 100 mm Gewebekulturschalen nach einer 24 Stunden Inkubation in 10 ml frischem Kulturmedium (Dulbeccos modified Eagle's Medium, das 10% fetales Rinderserum enthält) präpariert. Zellfreie Überstände werden durch Filtration durch 0,22 um Filtereinheiten gewonnen und bei -70ºC bis zur Verwendung gelagert. Eine Transduktion von Maus MIH/3T3 Zellen wird durch eine Inkubation mit rekombinantem viralem Überstand, der 8 ug/ml Polybren enthält, bei 37ºC für 2 Stunden ausgeführt, wonach eine Entfernung des Virus-enthaltenden Mediums und ein Austausch mit frischem Kulturmedium erfolgt. Transduzierte Zellpopulationen werden durch Wachstum in G418 (400 ug/ml) für 10-14 Tage selektiert. Man erhält Zellklone mittels Klonierungsringen nach einer limitierenden Verdünnung. Es werden Genexpressionstests für das CAT Enzym ausgeführt, indem man zuerst die Zellen (bei 4ºC) in 0,25 M Tris-HCl (pH 7,5)/0,1% NP-40 lysiert, auf Trockeneis einfriert, bei 37ºC (5 min) auftaut, auf 60ºC (15 min) erhitzt und den Zelldebris durch Zentrifugation entfernt (schnellste Geschwindigkeit, Eppendorf Mikrofuge, 4ºC, 5 min). Nach der Normalisierung auf gleiche Proteinmengen (Bio-Rad Proteintest) werden die Zellextrakte mit Acetyl-Coenzym A und ¹&sup4;C-Chloramphenicol gemischt und bei 37ºC für 1-4 Stunden inkubiert, wie dies nötig ist, um im linearen Bereich der CAT Aktivität zu bleiben. Chloramphenicol und acetylierte Produkte werden mit Ethylacetat extrahiert und auf Dünnschichtchromatographieplatten aufgetragen. Die Chromatogramme werden in 95% CHCl&sub3; und 5% Methanol gefahren. Die Bildgebung wird durch Autoradiographie und einer Quantifizierung durch direkte beta-Partikelzählung der DC Platten auf einem Betascope 603 Gerät erhalten. Die in situ Färbung für β-Galaktosidase und Tests werden wie beschrieben ausgeführt (1 Einheit an β-Gal = die Menge an Enzym, die 1 umol o-NPG zu o-Nitrophenollmin bei 30ºC pH = 7,5) (18) hydrolysiert. Northern Blot Analysen werden auf Formaldehydagarosegelen mittels RNA ausgeführt, die mit RNazol extrahiert wird (CINNA Biotex, Freindswood, TX). Die ADA Tests werden auf Stärkegelen wie beschrieben ausgeführt (19). Die löslichen CD 4 Spiegel werden mittels eines CD4/gp120 Bindungs-ELISA gemessen (American Biotechnologies, Cambridge, MA).

Konstruktion der EMC Reportergenvektoren

Um zu bestimmen, ob die Picornavirus IRES Elemente in einem retroviralen Vektor funktionieren können, werden zwei IRES-enthaltende prokaryontische Reportergene von den Plasmiden pOS6 (CAT) und pOS8 (β-Gal) in Neo-enthaltende retrovirale Vektoren überführt. Die zwei Plasmide (pTM1-CAT/pTM1-β-Gal) verwenden die IRES von Encephalomyocarditisvirus (EMC) zur Erhöhung der Translation der mRNAs, die von einer Bakteriophagen T7 RNA Polymerasetranskriptionseinheit exprimiert werden (13, 14). Die zwei konstruierten Reportergenvektoren G1N2ECt und G1N2EBg werden dann zusammen mit den Kontrollvektor und Plasmid DNAs in die retroviralen Vektorverpackungszellinien eingeführt. Im ersten Experiment (Fig. 1) wird das Plasmid pTM1-CAT (Spur 1), G1N2ECt (Spur 2) oder LHCtSN (Spur 3) in eine PA317/GP+E-86 Cokultur transfiziert und die Zellen werden in Kultur für zwei Wochen vermehrt, um den Vektor zu vermehren. Es werden Zellysate hergestellt und es werden gleiche Proteinmengen verwendet, um die CAT Aktivitäten wie beschrieben zu testen (siehe Methoden). Die Fig. 1 zeigt deutlich eine signifikante CAT Aktivität vom G1N2ECt IRES Vektor im Vergleich zur Aktivität die durch die sehr starken chimeren LTR in LHCSN angetrieben wird. Man sieht keine Aktivität in den Kontrollzellen und die CAT Expression ist vom Vorkommen des IRES Elements abhängig (Fig. 7). Eine Quantifizierung der CAT Aktivität, die im linearen Bereich gemacht wird, zeigt, daß die G1N2ECt enthaltenden Zellen 55% der LHCtSN Aktivität bilden. Um die Möglichkeit zu evaluieren, daß EMC IRES als Promotorelement in Zusammenhang eines retroviralen Vektors fungiert, wird ein Konstrukt der EMC/CAT Fusion in der umgekehrten Orientierung hergestellt und getestet. Man sieht keine CAT Aktivität mit dem EMC/CAT Vektor mit der umgekehrten Orientierung (Daten nicht gezeigt).
Retrovirusvektor enthaltender Überstand aus G1N2ECt und LHCtSN Produktionszellen wird dann zur Transduktion der NIH/3T3 Zellen verwendet. Nach der Transduktion werden die Zellen für 5 Tage kultiviert und dann für CAT Test geerntet. Die CAT Aktivität für G1N2ECt transduzierte 3T3 Zellen (Spur 4) und für LHCtSN transduzierte 3T3 Zellen (Spur 5) ist in Fig. 1 gezeigt. Die Daten zeigen, daß der G1N2ECt IRES Vektor funktionelle retrovirale Vektorpartikel bilden kann, die produktiv transferieren und ein IRES/Reportergen in geeigneten Zielzellen exprimieren können.
Als nächstes wird ein retroviraler Vektor konstruiert, der EMC IRES an das β-Galaktosidasereportergen gebunden enthält. Der G1N2EBg Vektor wird in die Cokultur der Verpackungszelline mit pTM1-ßGal und G1N2SvBg überführt, die als Kontrollen dienen. Nach einer Kultur für zwei Wochen zur Vermehrung des Vektors werden die Produktionszellen auf β-Galaktosidaseaktivität durch einen in situ Enzymaktivitätstest getestet. Die Fig. 2 zeigt mehrere blau gefärbte Zeilen bei G1N2EBg und der den G1N2SvBg Kulturen als Positivkontrolle ohne färbende Zellen bei der pTM1-ßgal Negativkontrollkultur.
Der Überstand der Retrovirusvektor enthaltenden Produktionzelle wird dann zur Transduktion von NIH/3T3 Zellen verwendet. Die Zellen werden 5 Tage nach der Transduktion geerntet und auf β-Gal Aktivität getestet. Ein funktioneller Transfer der β-Galaktosidaseenzymaktivität auf 3T3 Zellen wird durch eine in situ Färbung (Daten nicht gezeigt) detektiert und dann durch Messen der β-gal Enzymaktivität in Zellextrakten quantifiziert, die 7,2 · 10&sup4; E/ml für G1N2EBg und 9,5 · 10&sup4; E/mg für G1N2SvBg beträgt.

Konstruktion eines EMC Human-ADA Vektors

Um die Verwendung von IRES Elementen bei der Konstruktion von retroviralen Vektoren für potentielle Anwendungen in der humanen Gentherapie zu evaluieren, wird eine Fusion zwischen EMC IRES und dem Gen für die humane Adenosindesaminase (ADA) zusammengesetzt und in einen retroviralen Vektor eingesetzt. Ein DNA Fragment, das EMC IRES enthält, wird durch Polymerasekettenreaktion (PCR) Amplifikation und der Anfügung von bequemen Klonierungsstellen synthetisiert und zur Erzeugung eines Plasmids (pEMC-F) verwendet, das EMC IRES ohne flankierende T7 RNA Polymerasetranskriptionssignale enthält. Das humane ADA Gen wird dann erneut mit PCR synthetisiert und in das EMC Plasmid unter Bildung von pEMCADA kloniert. Die EMC/ADA Fusion wird aus pEMCADA ausgeschnitten und in den retroviralen Vektor G1Na unter Bildung von G1NaEA inseriert (Fig. 3).
Die DNA für den G1NaEA Vektor und den Kontroll-ADA Vektor SAX (20) wird dann zur Erzeugung von retroviralen Produktionszellinien verwendet. Es werden Produktionszell-Cokulturen für 1 Woche in Standardkulturmedium angezogen und dann auf eine stabile Vektorintegration durch eine Kultur für 2 Wochen in Gegenwart des Neomycinanalogons G418 selektiert. Die selektierten (G418R) Produktionszellpopulationen werden dann zur Erzeugung eines Vektor-enthaltenden Überstands für Titerbestimmungen verwendet und einer Genexpressionsanalyse unterzogen.
Die Fig. 3 zeigt in der Darstellung A die Ergebnisse der ADA Stärkegelanalyse mit den G1NaEA Produktionszellen (Spur 2) und den SAX Kontrollproduktionszellen (Spw 1), wobei beide Produktionszellpopulationen große Mengen an humaner ADA bilden. Eine Northern Blot Analyse (Fig. 3, Darstellung B) wird dann zur Visualisierung der RNA Transkripte der zwei Vektoren verwendet. Bei SAX sieht man ein Vollängen LTR Transkript wie auch das interne SV40 Transkript mit der ADA Sonde, während nur das Vollängentranskript mit der neo Sonde beobachtet wird (Spuren 1 und 3). Im Fall von G1NaEA wird nur ein Vollängentranskript durch Northern Blot Analyse entweder mit der ADA oder der NEO Sonde identifiziert (Spuren 2 und 4).
Der Retrovirusvektor-enthaltende Überstand aus den Produktionszellpopulationen wird dann zw Transduktion der NIH/3T3 Zellen wie auch zur Bestimmung des Titer der 3T3 Zellen verwendet. Beide Produktionszellpopulationen ergeben gute Vektortiterüberstände, wobei SAX 1,9 · 10&sup6; G418R CFU/ml und G1NaEA 1,2 · 10&sup6; G418R CFU/ml ergibt. Die G418R 3T3 Zellen werden als nächstes auf ADA Aktivität getestet. Eine ADA Stärkegelanalyse zeigt einen funktionsfähigen Transfer des humanen ADA gens in die 3T3 Zellen durch den G1NaEA IRES Vektor (Fig. 3, Darstellung A, Spur 5). In diesem Experiment bilden die mit dem SAX Kontrollvektor transduzierten 3T3 Zellen nur leicht weniger humane ADA als der IRES Vektor (Fig. 3, Darstellung A, Spur 4).

Konstruktion der Dreifachgenvektoren

Um die Vielseitigkeit der IRES Elemente bei der Konstruktion von komplexen retroviralen Vektoren zu testen wird das EMC/ADA Fusionsgen in zwei unabhängige Doppelgenvektoren unter Bildung von Dreigenvektoren inseriert. Der erste Empfängervektor LSCSN verwendet die LTR zur Förderung der Expression des anti-HIV Mittels lösliches CD4 (sCD4) (21) und einen internen SV40 Promotor der frühen Region zur Steuerung des NEO Selektionsmarkergens (21). Das EMC/A. DA Fragments wird nach dem sCD4 Translationsstopcodon und 5' des Starts des SV40 Promotors unter Bildung von LSCEASN eingeführt (Fig. 4). Die LSCEASN DNA wird in eine Cokultur der Verpackungszellinie transfiziert, die für eine Woche angezogen wird, bevor sie bei limitierender Verdünnung in G418-enthaltendem Medium passagiert wird. Zwölf G418R Produktionszellklone synthetisieren sowohl das humane ADA Enzym und bilden das sCD4 Protein (Fig. 4).
Der zweite Zweigenretrovirusvektor, der als Empfänger für das EMC/ADA Fragment verwendet wird, ist LNSCt, ein Vektor, der die LTR zur Steuerung der NEO Expression verwendet und einen internen SV40 Promotor aufweist, der die CAT Expression steuert. EMC/ADA wird 3' zum NEO Genstopcodon und stromaufwärts des SV40 Promotors unter Bildung von LNEASCt inseriert (Fig. 5). Die LNEASCt DNA wird in die Verpackungszellen transfiziert, für eine Woche kultiviert und dann werden G418R Produktionszellklone durch limitierende Verdünnung isoliert. Zwölf Produktionszellklone werden vermehrt und zur Isolierung des Vektor-enthaltenden Überstands zur Bestimmung des G418R Titers verwendet und sowohl auf CAT als auch auf ADA Genexpression getestet. Die Fig. 5 zeigt, daß alle zwölf Produktionszellklone sowohl eine CAT (Darstellung A) als auch eine humane ADA (Darstellung B) Enzymaktivität aufweisen. Der Titer von den zwölf Klonen reicht von 4 · 10&sup4; G418R CFU/ml für Klon 10 bis 4 · 10&sup6; G418R CFU/ml für Klon 4.
Der Retrovirusvektor-enthaltende Überstand aus jedem der zwölf LNEASCt Produktionszellklone wird dann zur Transduktion von NIH/3T3 Zellen verwendet. Zwölf G418R 3T3 Zellkulturen werden vermehrt und auf CAT und humane ADA Enzymaktivität gemessen. Die CAT Aktivität wird in 12 von 12 3T3 Zellkulturen (Fig. 6, Darstellung A) und die humane ADA Aktivität wird in 9 von 9 getesteten Kulturen beobachtet (Fig. 6, Darstellung B). In dieser bestimmten Transduktionsserie sind sowohl die CAT als auch die humane ADA Enzymaktiovitäten beträchtlich niedriger in 3T3 Zellen als in Produktionszellen (Fig. 5). Die Analyse der CAT Aktivität in 3T3 Zellen, die mittels des ursprünglichen Zweigenvektors LNSCt erzeugt wurden, zeigen eine ähnliche CAT Aktivität, was nahelegt, daß das bestimmte interne SV40/CAT Gen in diesem Vektor nicht sehr aktiv ist (Daten nicht gezeigt).

Konstruktion eines Polio IRES Vektors

In der nächsten Experimentenreihe wird IRES aus dem Poliovirus isoliert und zur Konstruktion eines retroviralen Vektors verwendet. Es wird eine PCR verwendet, um ein Fragment zu erzeugen, das das 600 bp IRES Element von der 5'-untranslatierten Region des Poliovirus enthält (Mahoney Stamm). Die Polio IRES wird dann 3' zum NEO Stopcodon und stromaufwärts eines CAT Reportergens zur Erzeugung von LNPCt inseriert. Dieser Vektor wird zusammen mit einem ähnlichen EMC IRES Konstrukt (G1NECt), einem LTR getriebenen CAT positiven Kontrollvektor (LCSN) und einem Vektor, der CAT aber keine IRES Sequenzen aufweist (G1NaNECt) in Cokulturen von Verpackungszellen transfiziert. Die Kulturen werden für eine Woche in Standardmedium angezogen und dann auf Vektor-enthaltende Zellen durch Wachstum in G418-enthaltendem Kulturmedium selektiert. Vollständig selektierte Kulturen werden dann geerntet und auf CAT Enzymaktivität getestet (Fig. 7). Die Daten aus Fig. 7 zeigen, daß die Polio IRES genauso (wenn nicht etwas besser) funktioniert, wie die EMC IRES. Beide IRES Vektoren sind vorzugsweise mit der CAT Aktivität vergleichbar, die durch den starken LTR Promotor gesteuert werden (LNPCt 70% und G1NECt 50% von LCtSN). Eine kleine Menge der CAT Aktivität wird im Konstrukt ohne IRES Element beobachtet (G1NaENCt). Diese begrenzte Aktivität kann durch eine Initiation an internen AUG Codons zustandekommen, wie dies vorher bei retroviralen Vektoren berichtet wurde (22) und der Mechanismus dieser schwachen Expression ist in Untersuchung.
Während die vorliegende Erfindung zusammen mit den spezifischen Ausführungsformen hiervon beschrieben wurde ist es verständlich, daß viele Alternativen, Modifikationen und Variationen für den Fachmann an Anbetracht der vorherigen Beschreibung ersichtlich sind. Demnach soll die Erfindung alle solchen Alternativen, Modifikationen und Variationen innerhalb des breitesten Umfangs und dem Verständnis der folgenden Ansprüche umfassen.
Es sind viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung in Anbetracht der obigen Beschreibungen möglich und liegen daher im Umfang der Patentansprüche, da die Erfindung anders ausgeführt werden kann, als sie beispielhaft beschrieben wurde.

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Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines retroviralen Vektors, der zur Expression von multiplen Proteintranslationsereignissen von einer polycistronischen mRNA durch die Verwendung von internen Ribosomeneintrittsstellen anstelle eines internen Promotors fähig ist.

Claims

1. Retroviraler Expressionsvektor, der zur Expression von multiplen Proteinen von einem Wirtsgenom fähig ist, der folgendes aufweist:

eine erste DNA Sequenz, die für ein erstes zu exprimierendes Protein kodiert,

eine zweite DNA Sequenz, die für ein zweites zu exprimierendes Protein kodiert,

eine erste Promotorsequenz zur Expression von mRNA sowohl von der ersten als auch zweiten DNA Sequenz und eine interne Ribosomeneintrittsstelle des Picornavirus zwischen der ersten und der zweiten DNA Sequenz, wobei die Promotorsequenz, die erste DNA Sequenz, die interne Ribosomeneintrittsstelle und die zweite DNA Sequenz in diesem retroviralen Vektor so operativ verbunden sind, daß eine polycistronische mRNA gebildet wird und eine Expression der ersten und zweiten unabhängigen Proteine von dieser mRNA stattfindet, die durch diesen Promotor exprimiert wird.

2. Retroviraler Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin der Promotor aus LTR Sequenzen aus einem retroviralen Genom besteht.

3. Retroviraler Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Picornavirus vom Encephalomyocarditisvirus stammt.

4. Retroviraler Expressionsvektor nach Anspruch 3, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Encephalomyocarditisvirus von einem Teil der 5'-untranslatierten Region des Encephalomyocarditisvirus stammt.

5. Retroviraler Expressionsvektor nach Anspruch 1, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Picornavirus von einem Poliovirus stammt.

6. Retroviraler Expressionsvektor nach Anspruch 5, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Poliovirus von einem Teil der 5'-untranslatierten Region des Poliovirus stammt.

7. Verpackungszelle, die mit dem retroviralen Expressionsvektor nach Anspruch 1 transfiziert ist.

8. Verpackungszelle, die mit dem retroviralen Expressionsvektor nach Anspruch 5 transfiziert ist.

9. Verfahren zur Konstruktion eines retroviralen Vektors, der zur Bildung einer polycistronischen mRNA fähig ist und zwei unabhängige Proteine exprimiert, gekennzeichnet durch operatives Verbinden einer ersten DNA Sequenz, die für ein erstes zu exprimierendes Protein kodiert, einer zweiten DNA Sequenz, die für ein zweites zu exprimierendes Protein kodiert, einer ersten Promotorsequenz zur Expression der mRNA sowohl der ersten als auch der zweiten DNA Sequenz und einer internen Ribosomeneintrittsstelle des Picornavirus zwischen der ersten und der zweiten DNA Sequenz in einem retroviralen Expressionsvektor.

10. Verfahren zur Konstruktion eines retroviralen Vektors nach Anspruch 9, das ferner die Schritte der Transfektion dieses retroviralen Expressionsvektors in eine Verpackungszellinie und Gewinnen dieses retroviralen Vektors umfaßt, der zur Bildung der polycistronischen mRNA und zur Expression zweier unabhängiger Proteine in den Überstand dieser transfizierten Verpackungszellinie fähig ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin der Promotor aus LTR Sequenzen eines retroviralen Genoms stammt.

12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Picornavirus vom Encephalomyocarditisvirus stammt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Encephalomyocarditisvirus von einem Teil der 5'-untranslatierten Region des Encephalomyocardidsvirus stammt.

14. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Picornavirus von einem Poliovirus stammt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die interne Ribosomeneintrittsstelle des Poliovirus von einem Teil der 5'- untranslatierten Region des Poliovirus stammt.

16. Retroviraler Vektor, der nach dem Verfahren von Anspruch 9 oder 10 erhalten werden kann.

17. Tierzelle, die mit einem retroviralen Vektor transduziert ist, der durch das Verfahren von Anspruch 9 oder 10 hergestellt wurde.

18. Humanzelle, die mit einem retroviralen Vektor transduziert ist, der durch das Verfahren von Anspruch 9 oder 10 hergestellt wurde.