DE69729481T2

DE69729481T2 - Induzierbares expressionssystem zur erzeugung von verpackungszelllinien für pseudotypisierte retrovirale vektoren

Info

Publication number: DE69729481T2
Application number: DE69729481T
Authority: DE
Inventors: Jiing-Kuan Yee; Theodore Friedmann; Shin-Tai Chen
Original assignee: University of California; University of California Berkeley; City of Hope
Current assignee: University of California; University of California Berkeley; City of Hope
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2017-07-30
Also published as: EP0960116A4; EP0960116B1; US6432705B1; US6133027A; WO1998005754A2; ATE268822T1; WO1998005754A3; EP0960116A2; DE69729481D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet von rekombinanten retroviralen Teilchen für eine Anwendung beim Gentransfer, z. B. für eine Anwendung bei der Gentherapie.
Hintergrund der Erfindung
Bei Retroviren handelt es sich um behüllte RNA-Viren, die nach einer Infektion einer Wirtszelle eine reverse Transkription ihrer RNA-Genome in ein DNA-Intermediat oder Provirus vornehmen. Der Provirus kann stabil in die zelluläre DNA des Wirts integriert werden. Genprodukte, die durch den Provirus codiert werden, werden anschließend von der Wirtszelle exprimiert, um retrovirale Virionen zu produzieren, wodurch das Virus repliziert wird. Da das retrovirale Genom manipuliert werden kann, um exogene Nukleotidsequenz(en) von Interesse für eine Expression in einer Zielzelle zu enthalten, sind retrovirale Vektoren wichtige Hilfsmittel für einen stabilen Gentransfer in Säugerzellen. Viele vorgeschlagene Gentherapieanwendungen verwenden retrovirale Vektoren, um die Fähigkeit dieser natürlich infektiösen Mittel zum Transfer und effizienter Exprimierung rekombinanter Nukleotidsequenzen in empfänglichen Zielzellen auszunutzen (siehe z. B. Miller 1992 Nature 357: 455–460; Miller Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1–24). Bei den retroviralen Vektoren, die für eine Verwendung in solchen Anwendungen geeignet sind, handelt es sich im allgemeinen um defekte retrovirale Vektoren, die fähig sind, die Zielzelle zu infizieren, ihre RNA-Genome revers zu transkribieren, und die revers transkribierte DNA in das Zielzellengenom zu integrieren, jedoch nicht fähig sind, innerhalb der Zielzelle zu replizieren, um infektiöse retrovirale Teilchen zu produzieren (z. B. weist das in die Zielzelle transferierte retrovirale Genom einen gag-Defekt auf, das Gen, das für Virionenstrukturproteine codiert, und/oder einen pol-Defekt, das Gen, das für die reverse Transkriptase codiert).
Die Verwendung von retroviralen Vektoren ist unter vielen Gesichtspunkten eingeschränkt. Wenngleich Retroviren schnell-teilende Zellen wirksam infizieren und stabil in deren Genom integriert werden können, ist z. B. die retrovirale Integration in das Genom von nicht-teilenden oder langsam-teilenden Zellen ineffizient (Springett et al. 1989 J. Virol. 63: 3865–3869; Miller et al. 1990 Mol. Cell. Biol. 10: 4239–4242; Roe et al. 1993 EMBO J. 12: 2099–2108). Die meisten Verpackungssysteme ergeben nur niedrige Vektortiter, und die Fragilität von retroviralen Vektorteilchen erschwert die Reinigung und Konzentrierung (Paul et al. 1993 Hum. Gene Therap. 4: 609–615). Schließlich dringen Retroviren durch Bindung von retroviralen Hüllglycoproteinen (codiert durch das env-Gen) an spezifische Zielzellen-Oberflächenrezeptoren in die Zielzellen ein. Diese Hüllprotein-Zelloberflächenrezeptor-Wechselwirkung ist oft Spezies-spezifisch, und in einigen Fällen sogar gewebespezifisch. Ferner kann das Ausmaß der Expression des Zelloberflächenrezeptors auf den Zielzellen unter den Zielzellen stark variieren. Demzufolge weisen Retroviren im allgemeinen eine beschränkte Wirtsauswahl (host range) auf (Kavanaugh et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 7071–7075; Hopkins 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8759–8760).
Eine Strategie sowohl zur Ausdehnung der retroviralen Wirtszellenauswahl als auch zur Erhöhung der strukturellen Stabilität der retroviralen Virionen umfasst die Herstellung von pseudotypisierten (pseudotyped) retroviralen viralen Vektoren. Pseudotypisierte retrovirale Vektoren, die bei der Transformation von Zielzellen geeignet sind, sind im allgemeinen aus retroviralen Virionenstrukturproteinen (z. B. gag-Proteine), einem rekombinanten RNA-Genom enthaltend die Nukleotidsequenz von Interesse, dem pol-Protein für die reverse Transkription der in dem Virion enthaltenen rekombinanten RNA und einem nicht-retroviralen Hüllprotein oder einem Hüllprotein aus einem anderen Retrovirus aufgebaut. Das rekombinante RNA-Genom weist im allgemeinen einen Replikationsdefekt auf (replication defective), d. h. einen Defekt in den pol- und/oder gag-Genen, um die Herstellung von infektiösen Retroviren nach dem Transfer der Nukleotidsequenz von Interesse in die Zielzelle zu vermeiden. Das Hüllprotein des pseudotypisierten Retrovirus ist im allgemeinen derart gewählt, um eine größere Wirtsauswahl bereitzustellen oder ein selektives Targeting von zu infizierenden Zellen bereitzustellen.
Das Hüllprotein von Vesicular Stomatitis Virus (VSV), bezeichnet als VSV G, ist ein wichtiger Kandidat für eine Anwendung bei der Herstellung von pseudotypisierten retroviralen Vektoren. VSV G kann eine Vielzahl von Zelltypen aus einem breiten Bereich von Säuger- und Nichtsäuger-Spezies, einschließlich Menschen, Hamster, Insekten, Fisch und Fröschen, mit einer größeren Effizienz als traditionelle amphotrophe retroviralen Vektoren infizieren. Die mutmaßlichen Rezeptoren) für VSV umfassen Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und/oder GM3 Gangliosid (Mastromarino et al., 1987 J. Gen. Virol. 68: 2359–2369; Conti, et al., 1988 Arch. Virol. 99: 261–269), die alle ubiquitär und reichlich vorhandene Komponenten der Plasmamembranen sind. VSV G pseudotypisierte retrovirale Vektoren weisen eine verstärkte strukturelle Stabilität auf, die eine Konzentrierung auf Titer von mehr als 10⁹/ml mittels Ultrazentrifugation ermöglicht (Emi et al., 1991 J. Virol. 65: 1202–1207; Yee et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9564–9568; Burns et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033–8037; Lin et al. 1994 Science 265: 666–669). Bei Expression in Verpackungszellen (packaging cells) bildet VSV G wirksam pseudotypisierte Virionen, wobei das Genom und die Kernbestandteile von Retroviren wie z. B. murinen Leukämievirus abgeleitet sind (murine leukemia virus, MuL V). Verpackungszelllinien, die die retroviralen Gag- und Pol-Gene und das VSV G Hüllprotein exprimieren, produzieren pseudotypisierte retrovirale Teilchen, die die retroviralen Gag und Pol-Proteine in einer VSV G-haltigen Hülle eingeschlossen aufweisen (siehe 1), was zur Herstellung von Virionen führt, deren Infektiosität durch anti-VSV G Antikörper blockiert wird (Emi et al. 1991 supra; Yee et al. 1994 supra). Diese Eigenschaften von VSV G pseudotypisierten Virionen verbreitern nicht nur den Anwendungsbereich von retroviralen Vektoren für genetische Studien in zuvor unzugänglichen Spezies, sondern erleichtern auch effizientere präklinische und klinische Studien über das Potential für die Humangentherapie.
Jedoch ist die Herstellung von VSV G pseudotypisierten retroviralen Virionen auf einige Schwierigkeiten gestoßen. Zum einen ist VSV G cytotoxisch. Eine hohe Expression von VSV G in Säugerzellen führt zur Bildung von Syncytia und zum Zelltod, was die Bereitstellung von stabilen Zelllinien, die VSV G exprimieren, erschwert (Yee et al. 1994 supra; Burns et al. 1993 supra). Pseudotypisierte VSV G Virionen wurden über eine transiente Expression des VSV G Gens nach DNA-Transfektion von 293GP-Zellen, die die Gag und Pol-Komponenten von MuL V exprimieren, produziert, wobei Vektorpräparationen mit Titern von 10⁵ bis 10⁶/ml erhalten wurden (Yee et al. 1994 supra). Jedoch ist die Generierung von VSV G pseudotypisierten Virionen mittels transienter VSV G Expression mühsam, arbeitsintensiv und wahrscheinlich nicht zu klinischen Anwendungen führend, bei denen reproduzierbare, zertifizierte Vektorpräparationen erforderlich sind.
Es sind mehrere induzierbare Promotorsysteme beschrieben worden, einschließlich jener, die durch Schwermetalle (Mayo et al. 1982 Cell 29: 99–108), RU-486 (ein Progesteron-Antagonist) (Wang et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180–8184), Steroide (Mader und White, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603–5607) und Tetracycline (Gossen und Bujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551; USPN 5,464,758) kontrolliert werden. Jedoch sind Schwermetalle für Zellen toxisch, was die Verwendung dieses induzierbaren Promotorsystems beeinträchtigt. Der induzierbare Promotor des RU-486-Systems wird in Abwesenheit von RU-486 signifikant exprimiert und wird nur 10- bis 20-mal höher in Gegenwart von RU-486 induziert (Wang et al. 1994), wodurch dieses System für die Expression von VSV G zur Herstellung von pseudotypisierten retroviralen Virionen nicht erstrebenswert ist.
Das Tetracyclin-induzierbare System von Gossen und Bujard wurde zur Regulierung der induzierbaren Expression von mehreren Genen verwendet (Gossen und Bujard 1992, supra; Furth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9302–9306; Howe et al. 19951. Biol. Chem. 270: 14168–14174; Resnitzky et al. 1994 Mol. Cell. Biol. 14: 1669–1679; Shockett et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522–6526). Dieses System verwendet einen chimären Transkriptionsfaktor, als tTA bezeichnet, zusammengesetzt aus dem Repressor von Escherichia coli (E. coli) Tetracyclin-Resistenz-Operon (tetR) und der Aktivierungsdomäne (Carboxyl-terminale Domäne) des Virionenproteins 16 (VP16) von Herpes Simplex Virus (HSV) (Triezenberg et al. 1988 Genes Dev. 2: 718–729). Das Gen von Interesse wird abwärts von einem minimalen Cytomegalovirus (CMV) 1A-Promotor angeordnet, abgeleitet von den Immediate Early CMV-Genen, verbunden mit multiplen Kopien von tetO, der Bindungsstelle für den Tetracyclin-Repressor tetR. In Abwesenheit von Tetracyclin bindet der tetR-Teil des Transaktivators an die tetO-Sequenzen des Promotors und der VP16-Teil erleichtert die Transkription. In Gegenwart von Tetracyclin bindet das Tetracyclin an den tetR-Teil von tTA, das wiederum die Bindung des tetR-Teils an die tetO-Sequenz(en) des Promotors verhindert, wodurch die Transkription inhibiert wird. Da selbst geringe Konzentrationen von Tetracyclin ausreichen, um die tTA-Funktion zu blockieren, und da die meisten Säugerzellen Tetracyclin tolerieren können, stellt dieses System einen straff regulierten Ein-Aus-Schalter für die Genexpression dar, der durch Variieren der Tetracyclinkonzentration, der die Zellen ausgesetzt sind, gesteuert werden kann. Jedoch ist die Etablierung von Zelllinien, die große Mengen des Tetracyclin-Transaktivators (tTA) stabil exprimieren, schwierig, da die VP16-Aktivierungs-Domäne die allgemeine zelluläre Transkription vermindert oder "unterdrückt" ("squelches"), wenn sie in großen Mengen in Säugerzellen exprimiert wird (Gossen und Bujard 1992 supra; Gossen und Bujard 1992, supra; Shockett et al. 1995 supra; Gill et al. 1988 Nature 334: 721–724; Ptashne et al. 1990 Nature 346: 329–331). Folglich ist das tTA-induzierbare Expressionssystem für die Herstellung von VSV G pseudotypisierten retroviralen Vektoren nichterstrebenswert.
Es besteht ein dringendes Bedürfnis im Stand der Technik nach einem induzierbaren Expressionssystem, das für die Herstellung von cytotoxischen Genprodukten geeignet ist, wie z. B. VSV G, und für die Herstellung von VSV G pseudotypisierten retroviralen geeignet ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet Zubereitungen und Verfahren für die induzierbare Expression eines Polypeptids, insbesondere eines normalerweise für die eukaryotische Wirtszelle, in der es exprimiert werden soll, cytotoxischen Polypeptids. Eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid von Interesse codiert, ist funktionstüchtig an einen induzierbaren Promotor verknüpft (z. B. ein Promotor bestehend aus einem minimalen Promotor verknüpft an multiple Kopien von tetO, der Bindungsstelle für den Tetracyclin-Repressor (tetR) von dem Escherichia coli Tetracyclin-Resistenz-Operon Tn10). Die Expression von dem induzierbaren Promotor wird mittels einem multi-chimären Transaktivierungsfaktor reguliert, bestehend aus einer ersten Liganden-Bindungsdomäne, die die Transkription negativ reguliert (z. B. ein prokaryotisches Tetracyclin-Repressor-Polypeptid), einer Transkriptionsaktivierungs-Domäne und einer zweiten Liganden-Bindungsdomäne, die die Transkriptionsaktivierungsfunktion des Transaktivators positiv reguliert (z. B. eine Liganden-Bindungsdomäne eines Steroidrezeptors, bevorzugt eines Östrogen-Rezeptors (ER)). Die Transkription der Nukleotidsequenz unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors wird durch den multi-chimären Transaktivator aktiviert, wenn sowohl der Ligand, der an die erste Liganden-Bindungsdomäne (z. B. Tetracyclin) abwesend ist und der Ligand, der an die zweite Liganden-Bindungsdomäne (z. B. ein Steroid) bindet, anwesend ist. Dieses induzierbare Expressionssystem ist besonders bei der Expression von cytotoxischem Protein VSV G für die Herstellung von pseudotypisierten retroviralen Vektoren geeignet.
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Systems für die induzierbare Expression eines Polypeptids in einer eukaryotischen Zelle, insbesondere eines Polypeptids, das für die Wirtszelle cytotoxisch ist, wenn es in normalen bis hohen Levels exprimiert wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Systems zur induzierbaren Expression eines Polypeptids, das einen Transaktivierungsfaktor verwendet, der die allgemeine zelluläre Transkription nicht signifikant beeinflusst.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines induzierbaren Expressionssystems, das zur Erzeugung von Verpackungszelllinien eingesetzt werden kann, die hohe Titer von VSV G pseudotypisierten retroviralen Vektoren ergeben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung von VSV G pseudotypisierten retroviralen Vektoren mit einer verbreiterten Wirtsauswahl, um die Transformation von Spezies einschließlich Nichtsäuger-Spezies, die zuvor nicht zur Verfügung standen, unter Verwendung von konventionellen Transformationstechniken zu ermöglichen.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass jede beliebige Nukleotidsequenz durch Verwendung des induzierbaren Expressionssystems gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert werden kann.
Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die Transkriptionsaktivierungsfunktion des Transaktivierungsfaktors bis zur Aussetzung gegenüber einem Steroid (oder einem Analogon davon) im wesentlichen inaktiv ist, wodurch eine mögliche Beeinträchtigung der allgemeinen zellulären Transkription vermindert wird.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Aktivierung des induzierbaren Expressionssystems zwei unabhängige Signale erfordert (d. h. die Abwesenheit von Tetracyclin und die Gegenwart von Östrogen), wodurch die Häufigkeit von ungewünschter Transkriptionsaktivierung (z. B. Transkriptionsaktivierung der Sequenz in funktionstüchtiger Verknüpfung an den induzierbaren Promotor unter anderen Bedingungen als die Abwesenheit von Tetracyclin und die Gegenwart von Steroid) reduziert wird.
Diese und weitere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann beim Lesen der Einzelheiten der Vektoren, Zelllinien und Methodologie, im folgenden ausführlich beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Darstellung der allgemeinen Schritte bei der Herstellung von VSV G pseudotypisierten retroviralen Vektoren. Der retrovirale Vektor (
) wird verwendet, um eine Zelle zu infizieren, und ein Klon mit dem integrierten retroviralen Vektor wird für die anschließende Herstellung des VSV G pseudotypisierten Virus gewählt. Die Virionen (o) sind aufgrund der Abwesenheit von Hüllprotein auf der Zelloberfläche nicht infektiös. Der VSV G pseudotypisierte Virus wird durch Einführen einer VSV G codierenden Sequenz in den Klon und transienter Expression von VSV G erzeugt. Infektiöser VSV G pseudotypisierter Virus (O) wird 24 bis 96 Stunden nach der Transfektion gesammelt.
Die 2A, 2B und 2C sind schematische Darstellungen des induzierbaren Expressionssystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 ist eine schematische Darstellung der Herstellung von tTAER, einem beispielhaften multi-chimären Transaktivator gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die 4A–4C sind schematische Darstellung der Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des multi-chimären Transaktivators tTAER.
5 ist eine schematische Darstellung der Konstrukte pCMV-tTAER, phyg-CMV-tTAER, pTetO-G-1, pTetO-G-2, pLTK-FIX und pLZRNL. Die gepunkteten Boxen stellen den Promotor des CMV Immediate Early Gens dar. Die schraffierten Boxen stellen den HSV TK Promotor dar. tTAER, das Gen, das für tTAER codiert; hygR, das Gen, das für Hygromycin-B-Phosphortransferase codiert; purR, das Gen, das für Puromycin-N-Acetyltransferase codiert; neoR, das Neomycin-Phosphotransferase-Gen; tetO, der Minimum-CMV-Immediate-Early-Gen-Promotor verknüpft an sieben Tandem-Kopien der tetR-Bindungsstelle; VSV-G, das Gen, das für VSV-G codiert; LTR, die lange terminale Wiederholung (long terminal repeat) von MoMLV; FIX, der Hund-Faktor IX cDNA; po, die interne Ribosomen-Eingangsstelle vom Poliovirus. Pfeile zeigen die ungefähren Lokalisierungen der Transkriptions-Initiationsstellen und die Richtung der Transkription an. Die Figur ist nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
6 ist eine schematische Darstellung der Konstrukte pTetO-CAT, pTEPN, pTEPN-CAT und pTEPN-G. tetO steht für einen minimalen CMV-Immediate-Early-Gen-Promotor verknüpft an sieben Tandem-Kopien der tetR-Bindungsstelle; CAT, das bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen; LTR, die lange terminale Wiederholung von MoMLV; tTAER, das Gen, das für tTAER codiert; PO, die interne Ribosomen-Eingangsstelle vom Poliovirus; neo, das Gen, das für die Neomycin-Phosphotransferase codiert; G, das VSV G-Gen. Pfeile über den LTRs zeigen die ungefähren Positionen der Transkriptions-Initiationsstellen; die Plasmid-Karten sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
7 ist ein Graph, der die induzierbare Expression des lux-Gens durch den multichimären Transaktiviator tTAER zeigt.
8 ist ein Graph, der die induzierbare Expression der CAT-Aktivität, reguliert durch den multi-chimären Transaktivator tTAER, darstellt.
9 ist ein Set von vier Graphen, die die Durchfluss-cytometrische Analyse der induzierbaren Zelloberflächen-VSV G-Expression in gepoolten LTK-FIX Virus-infizierten 293GP/tTAER/G-Klonen darstellen.
10 ist ein Set von zwei Graphen, die den Zeitverlauf der Herstellung von VSV G-pseudotypisierten Virus mittels Zellen des 293GP/tTAER/G-Klons 21 und Zellen des 293GP/tTAER/G-Klons 13 über einen Zeitraum von jeweils 16 Tagen und 8 Tagen darstellen. Die Zellen wurden in DMEM allein (Raute), DMEM plus Tetracyclin (Kreis), DMEM plus 17β-Östradiol (Quadrat) für den angegebenen Zeitraum inkubiert. Die horizontalen und vertikalen Achsen messen jeweils die Fluoreszenz-Intensität und die Anzahl an Zellen.
11 ist ein Graph, der die induzierbare CAT-Expression in stabilen tTAER-exprimierenden HT1080-Zellen, die das pTetO-CAT-Konstrukt enthalten, darstellt. Dunkel gepunktete Balken, mit Tetracyclin, ohne 17β-Östradiol (+Tc, –Est); hell gepunktete Balken, kein Tetracyclin, kein 17β-Östradiol (–Tc, –Est); gefüllte Kästchen, mit 17β-Östradiol, kein Tetracyclin (–Tc, +Est); offene Kästchen, mit Tetracyclin und 17β-Östradiol (+Tc, +Est).
12 ist ein Graph, der die induzierbare CAT-Expression in TEPN-CAT Virusinfizierten HT1080-Zellen darstellt. Dunkel gepunktete Balken, mit Tetracyclin, ohne 17β-Östradiol (+Tc, –Est); hell gepunktete Balken, kein Tetracyclin, kein 17β-Östradiol (–Tc, –Est), gefüllte Kästchen, mit 17β-Östradiol, kein Tetracyclin (+Est, –Tc); offene Kästchen, mit Tetracyclin und 17β-Östradiol (+Tc, +Est).
13 ist ein Set von 6 Graphen, die die Durchfluss-cytometrische Analyse der induzierbaren Zelloberflächen-VSV-G-Expression in TEPN-G Virus-infizierten HT1080-Zellen darstellen. Die horizontalen und vertikalen Achsen messen jeweils die Fluoreszenz-Intensität und die Anzahl an Zellen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Vor der Beschreibung des vorliegenden induzierbaren Expressionssystems, der Verwendung des induzierbaren Expressionssystems zur Generierung von Verpackungs-Zelllinien für retrovirale Vektoren pseudotypisiert mit VSV G sowie der Konstrukte, Vektorteilchen, und Verpackungs-Zelllinien, die damit in Verbindung stehen, soll angemerkt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die konkret beschriebenen Methodologien, Protokolle, Zelllinien, Retroviren, Vektoren, Konstrukte und Reagenzien beschränkt ist, die selbstverständlich variieren können. Es ist auch davon auszugehen, dass die Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendete Terminologie nur dem Zweck der Beschreibung von besonderen Ausführungsformen dient, und nicht den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung beschränken soll, der nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt wird.
Es ist festzuhalten, dass im Rahmen der Verwendung in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen, die Singular-Formen "ein", "eine" und "der/die/das" auch Plural-Bezüge umfassen, sofern nicht der Kontext deutlich das Gegenteil angibt. Beispielsweise umfasst die Bezugnahme auf "eine Verpackungszelle" eine Vielzahl von solchen Zellen und die Bezugnahme auf "der retrovirale Vektor" umfasst die Bezugnahme auf einen oder mehrere Vektoren und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, und so weiter.
Sofern nicht anders angegeben, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und der Ansprüche verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie üblicherweise vom Fachmann auf dem Fachgebiet der vorliegenden Erfindung verstanden, auf. Auch wenn beliebige Verfahren, Geräte und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu den in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen sind, bei der Durchführung oder der Prüfung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden im folgenden die bevorzugten Methoden, Geräte und Materialien beschrieben.
Alle im Rahmen der vorliegenden Beschreibung zitierten Veröffentlichungen werden durch Inbezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen, zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung der Zelllinien, Vektoren und Methodologien, die in den Veröffentlichungen beschrieben sind, und die im Zusammenhang mit der vorliegend beschriebenen Erfindung eingesetzt werden können. Die vorstehend und innerhalb des gesamten Textes besprochenen Veröffentlichungen werden ausschließlich für deren Offenbarung vor dem Anmeldungstag der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. In der vorliegenden Beschreibung ist keine Angabe als ein Zugeständnis, dass die Erfinder nicht berechtigt wären, die Offenbarung aufgrund der Vor-Erfindung vorzudatieren, auszulegen.
Definitionen
Unter "induzierbares Expressionssystem" wird ein Konstrukt oder eine Kombination von Konstrukten verstanden, umfassend eine Nukleotidsequenz codierend für einen multi-chimären Transaktivator, einen induzierbaren Promotor, der durch den multichimären Transaktivator transkriptions-aktiviert werden kann, und eine Nukleotidsequenz von Interesse, in funktionstüchtiger Verknüpfung an den induzierbaren Promotor. Ein beispielhaftes induzierbares Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst zum Beispiel eine Nukleotidsequenz, codierend für tTAER, und eine Nukleotidsequenz von Interesse in funktionstüchtiger Verknüpfung an einen induzierbaren Promotor, aufgebaut aus einem Minimal-Promotor funktionstüchtig verknüpft an wenigstens eine tetO-Sequenz.
Unter "Transaktivator", "Transaktivierungsfaktor" oder "Transkriptions-Aktivator" wird ein Polypeptid verstanden, das die Transkription von einem Promotor erleichtert. Wenn der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, aktiviert der Transaktivator die Transkription in Antwort auf ein spezifisches Transkriptionssignal oder Set von Transkriptionssignalen. Zum Beispiel ist in dem induzierbaren Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung tTAER ein Transaktivator, der die Transkription von dem induzierbaren tetO-Promotor erleichtert, wenn tTAER nicht an Tetracyclin gebunden und an Östrogen gebunden ist.
Unter "multi-chimärer Transaktivator" wird ein Transaktivator verstanden, zusammengesetzt aus einem Fusions-Protein, abgeleitet von wenigstens drei unterschiedlichen Polypeptiden. Im allgemeinen ist der multi-chimäre Transaktivator gemäß der vorliegenden Erfindung zusammengesetzt aus: 1) einer ersten Liganden-Bindungs- Domäne, wobei die Bindung eines ersten Liganden an die erste Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptions-Aktivierung durch den multi-chimären Transaktivator negativ beeinflusst (negatively affects transcriptional activation – NAT-Domäne); 2) eine Transkriptions-Aktivierungs-Domäne, im allgemeinen von einem eukaryotischen Transkriptions-Aktivator abgeleitet; und 3) eine zweite Liganden-Bindungs-Domäne, wobei die Bindung eines zweiten Liganden an die zweite Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptions-Aktivierung durch den multi-chimären Transaktivator positiv beeinflusst (positively affects transcriptional activation – PAT-Domäne). Bevorzugt handelt es sich bei der NAT-Domäne um ein prokaryotisches Tetracyclin-Repressor-Polypeptid und bei der PAT-Domäne um eine Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors. Bevorzugt ist die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne die Carboxylterminale Domäne von Virion-Protein 16 (VP16) vom Herpes Simplex Virus (HSV).
Unter "tTAER" wird ein multi-chimärer Transaktivator verstanden, aufgebaut aus einem tetR-Polypeptid, als Aktivierungs-Domäne von VP16, und einer Liganden-Bindungs-Domäne eines Östrogenrezeptors.
"Tetracyclin-Repressor-Protein", "Tetracyclin-Repressor-Polypeptid", "tetR-Polypeptid" und "tetR-Protein" werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wahlweise eingesetzt und stehen für ein Polypeptid, das sowohl 1) eine spezifische Bindung an Tetracyclin und/oder Tetracyclinderivate, und 2) eine spezifische Bindung an tetO-Sequenzen aufweist, wenn das tetR-Polypeptid nicht an Tetracyclin oder ein Tetracyclin-Analogon gebunden ist. "TetR-Polypeptid" ist so zu verstehen, dass es eine natürlich vorkommende (d. h. native) tetR-Polypeptidsequenz und funktionelle Derivate davon umfasst.
Unter "Transkriptions-Aktivierungs-Domäne" wird eine Polypeptidsequenz verstanden, die die Transkriptions-Aktivierung aus einem Promotor erleichtert. "Transkriptions-Aktivierungs-Domäne" umfasst Transkriptions-Aktivierungs-Domänen, die von der natürlich auftretenden Aminosäuresequenz eines Transkriptionsfaktors abgeleitet sind wie auch funktionelle Derivate davon.
Unter "Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors" wird ein Polypeptid verstanden, das 1) eine spezifische Bindung an ein Steroid und/oder ein Steroid-Analogon aufweist, und 2) bei Vorliegen in einem multi-chimären Transaktivator und bei Bindung an ein Steroid oder ein Steroid-Analogon, erleichtert der multi-chimäre Transaktivator die Transkription von einem Promotor. "Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors" soll natürlich vorkommende (d. h. native) Steroidrezeptor-Liganden-Bindungs-Domänen und funktionelle Derivate davon umfassen.
Unter "Hüllprotein" wird ein Polypeptid verstanden, das 1) in eine Hülle eines Retrovirus inkorporiert werden kann, und 2) Ziel-Zellen binden kann und die Infektion der Ziel-Zelle durch den RNA-Virus, den es verpackt, erleichtern kann. "Hüllprotein" soll natürlich vorkommende (d. h. native) Hüllproteine und funktionelle Derivate davon umfassen.
Unter "funktionelles Derivat eines Polypeptids" wird eine Aminosäuresequenz verstanden, abgeleitet von einem natürlich auftretenden Polypeptid, die im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden Polypeptid aufgrund von Addition, Deletion, Substitution oder einer anderen Modifikation der Aminosäuresequenz verändert ist. "Funktionelle Derivate", wie sie im Rahmen der vorliegenden Beschreibung vorgesehen sind, besitzen die Eigenschaften der natürlich auftretenden Polypeptide, die für die Durchführung der Erfindung wesentlich sind. So bedeutet zum Beispiel ein "funktionelles Derivat von tetR" ein Polypeptid, abgeleitet von tetR, das sowohl 1) die Tetracyclin- oder Tetracyclin-Analogon-Bindung und 2) die Fähigkeit zur Inhibierung der Transkriptions-Aktivierung mittels tTAER, wenn an Tetracyclin oder an ein Analogon gebunden, beibehält. Unter "funktionelles Derivat von einer VP16-Transkriptions-Aktivierungs-Domäne" wird ein Polypeptid verstanden, abgeleitet von einer VP16-Transkriptions-Aktivierungs-Domäne, die die Transkription von dem Promotor erleichtern kann. Unter "funktionelles Derivat von einer Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors" wird ein Polypeptid verstanden, abgeleitet von einer Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors, das sowohl 1) die Steroid- oder Steroid-Analogon-Bindung und 2) die Fähigkeit zur Erleichterung der Transkription durch einen multi-chimären Transaktivator, wenn an ein Steroid- oder ein Steroid-Analogon gebunden, beibehält. Verfahren zur Herstellung von funktionellen Derivaten (z. B. unter Verwendung von rekombinanten DNA-Methodologien, chemischen Modifikationen von Aminosäureresten und weiteren Techniken) sind im Stand der Technik bekannt.
Unter "Promotor" wird eine minimale DNA-Sequenz verstanden, die ausreicht, die Transkription einer DNA-Sequenz zu dirigieren, an die es funktionstüchtig verknüpft ist. "Promotor" soll auch jene Promotor-Elemente umfassen, die ausreichen für Promotor-abhängige Gen-Expression, steuerbar für Zelltyp-spezifische Expression, Gewebe-spezifische Expression oder induzierbar durch externe Signale oder Mittel; solche Elemente können in den 5'- oder 3'-Regionen des natürlich vorkommenden Gens angeordnet sein.
Unter "induzierbarer Promotor" ist ein Promotor zu verstehen, der transkriptionell aktiv ist, wenn er an einen Transkriptions-Aktivator gebunden ist, der wiederum unter einem spezifischen Set von Bedingungen aktiviert wird, z. B. in Gegenwart einer besonderen Kombination von chemischen Signalen, die die Bindung des Transkriptions-Aktivators an den induzierbaren Promotor beeinflussen und/oder die Funktion des Transkriptions-Aktivators selbst beeinflussen. Der Transkriptions-Aktivator gemäß der vorliegenden Erfindung, tTAER, zum Beispiel induziert die Transkription von dem korrespondierenden induzierbaren Promotor, wenn Östrogen (oder ein Analogon davon) vorliegt und wenn Tetracyclin abwesend ist, d. h. Tetracyclin nicht an tTAER gebunden ist.
Unter "Konstrukt" ist eine rekombinante Nukleotidsequenz zu verstehen, im allgemeinen ein rekombinantes DNA-Molekül, das für den Zweck der Expression einer spezifischen Nukleotidsequenz bzw. -sequenzen erzeugt worden ist, oder bei der Konstruktion von weiteren rekombinanten Nukleotidsequenzen eingesetzt werden soll. Im allgemeinen bezieht sich "Konstrukt" im Rahmen der vorliegenden Beschreibung auf ein rekombinantes DNA-Molekül.
"Funktionstüchtig verknüpft" (operably linked) bedeutet, dass eine DNA-Sequenz und eine Regulationssequenz bzw. -sequenzen derart verknüpft sind, dass sie die Gen-Expression ermöglichen, wenn die geeigneten Moleküle (d. h. Transkriptions-Aktivierungs-Proteine) an die Regulationssequenz bzw. -sequenzen gebunden sind.
"Funktionstüchtig insertiert" (operatively inserted) bedeutet, dass eine Nukleotidsequenz von Interesse benachbart zu einer Nukleotidsequenz angeordnet ist, die die Transkription und Translation der eingeführten Nukleotidsequenz von Interesse dirigiert (d. h. die Herstellung von zum Beispiel einem Polypeptid, codiert durch eine DNA von Interesse, erleichtert).
Unter "Transformation" ist eine permanente oder transiente genetische Veränderung zu verstehen, bevorzugt eine permanente genetische Veränderung, induziert in eine Zelle nach Inkorporierung von neuer DNA (d. h. DNA, die für die Zelle exogen ist).
Wenn es sich bei der Zelle um eine Säugerzelle handelt, wird im allgemeinen durch Einführung der DNA in das Genom der Zelle eine permanente genetische Veränderung erzielt.
Unter "Ziel-Zelle" wird eine Zelle (Zellen) verstanden, die unter Verwendung der Verfahren und Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden soll bzw. sollen. Die Transformation kann ausgestaltet sein, um die Ziel-Zelle(n) nicht-selektiv oder selektiv zu transformieren. Im allgemeinen wird unter einer Ziel-Zelle, wie sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, eine eukaryotische Zelle verstanden, die durch einen VSV G-pseudotypisierten retroviralen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert werden kann.
Unter "transformierte Zelle" wird eine Zelle verstanden, in die (oder in deren Vorläufer) mittels rekombinanter DNA-Techniken ein DNA-Molekül eingeführt worden ist, das für ein Gen-Produkt (z. B. RNA und/oder Protein) von Interesse codiert (z. B. Nukleinsäure, die für ein therapeutisches zelluläres Produkt codiert).
Unter "Nukleotidsequenz von Interesse" oder "DNA von Interesse" wird eine beliebige Nukleotid- oder DNA-Sequenz verstanden, die für ein Protein oder ein weiteres Molekül codiert, das für eine Expression in einer Ziel-Zelle wünschenswert ist (d. h. zur Produktion des Proteins oder eines anderen biologischen Moleküls (z. B. ein therapeutisches zelluläres Produkt) in der Ziel-Zelle). Die Nukleotidsequenz von Interesse ist funktionstüchtig verknüpft an weitere Sequenzen, die für deren Expression erforderlich sind, z. B. einem Promotor.
Unter "therapeutisches Gen-Produkt" wird ein Polypeptid, RNA-Molekül oder anderes Gen-Produkt verstanden, das bei Expression in einer Ziel-Zelle eine gewünschte therapeutische Wirkung aufweist, z. B. die Reparatur eines genetischen Defekts in dem Zielzellen-Genom (z. B. durch Komplementierung), Expression eines Polypeptids mit einer gewünschten biologischen Aktivität, und/oder Expression eines RNA-Moleküls für Antisense-Therapie (z. B. Regulierung der Expression eines endogenen oder heterologen Gens in dem Ziel-Zellen-Genom).
Unter "Subjekt" oder "Patient" wird ein beliebiges Subjekt verstanden, für den eine Zell-Transformation oder Gen-Therapie gewünscht wird, einschließlich Menschen, Rinder, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Kaninchen, Mäuse, Insekten, Pferde, Hühner und beliebige weitere Arten oder Spezies mit Zellen, die mit einem viralen Vektor mit einer Hülle enthaltend VSV G infiziert werden können.
Unter "transgener Organismus" wird ein nicht-humaner Organismus (z. B. Einzeller-Organismen (z. B. Hefe), Säuger, Nicht-Säuger (z. B. Nematode oder Drosophila)) mit einer nicht-endogenen (d. h. heterologen) Nukleinsäuresequenz verstanden, die als extrachromosomales Element in einem Teil der Zellen oder stabil in der Keimbahn-DNA vorliegt.
Unter "transgenes Tier" wird ein nicht-menschliches Tier verstanden, im allgemeinen ein Säugetier mit einer nicht-endogenen (d. h. heterologen) Nukleinsäuresequenz, die als extrachromosomales Element in einem Teil der Zellen oder stabil in der Keimbahn-DNA integriert vorliegt (d. h. der genomischen Sequenz der meisten oder der gesamten Zellen). Heterologe Nukleinsäure wird mittels genetischer Manipulation von zum Beispiel Embryonen oder embryonalen Stammzellen des Wirtstiers in die Keimbahn solcher transgener Tiere eingeführt.
Unter "viraler Vektor" wird ein rekombinantes virales Teilchen verstanden, das die Transformation einer Ziel-Zelle mit einer Nukleotidsequenz von Interesse durchführt.
Unter "Virion", "virales Teilchen" oder "retrovirales Teilchen" wird ein einzelner Virus verstanden, mindestens aus einem RNA-Genom, einem Pol-Protein (für die reverse Transkription des RNA-Genoms nach Infektion), einem Gag-Protein (Strukturprotein, das in dem Nukleocapsid vorliegt) und einem Hüllenprotein aufgebaut. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung ist das RNA-Genom des retroviralen Teilchens im allgemeinen ein rekombinantes RNA-Genom, d. h. es enthält eine RNA-Sequenz, die exogen zu dem nativen retroviralen Genom ist und/oder einen Defekt in einer endogenen retroviralen Sequenz aufweist (z. B. fehlerhaft in pol, gag und/oder env ist, und bei Anwendung in der vorliegenden Beschreibung weist es im allgemeinen einen Defekt in allen drei Genen auf).
Unter "pseudo-typisiertes virales Teilchen" oder "pseudo-typisiertes retrovirales Teilchen" versteht man ein virales Teilchen mit einem Hüllprotein, das von einem anderen Virus als dem Virus, von dem das RNA-Genom abgeleitet ist, stammt. Das Hüllprotein kann von einem Retrovirus einer anderen Art als der Retrovirus sein, von dem das RNA-Genom stammt, oder von einem nicht-retroviralen Virus sein (z. B. Vesikular Stomatitis Virus (VSV)). Bevorzugt handelt es sich bei dem Hüllprotein des pseudo-typisierten retroviralen Teilchens um VSV G.
Unter "VSV G" oder "VSV G-Hüllprotein" wird das Hüllprotein von Vesicular Stomatitis Virus (VSV) oder ein davon abgeleitetes Polypeptid oder ein rekombinantes Fusions-Polypeptid, bei dem eine VSV G-Polypeptidsequenz an eine heterologe Polypeptidsequenz fusioniert ist, verstanden, wobei das VSV G-abgeleitete Polypeptid vom rekombinanten Fusions-Polypeptid in einer viralen Hülle eines pseudo-typisierten retroviralen Teilchens enthalten sein kann und die Infektiosität für eine ausgewählte Ziel-Zelle beibehält (z. B. eine Auswahl von erwünschten eukaryotischen Zellen oder einer spezifischen Ziel-Zelle von Interesse).
Unter "VSV G-pseudotypisierter Virus", (VSV 6 pseudotyped virus) "VSV G-pseudotypisierter Retrovirus", "VSV G-pseudotypisiertes virales Teilchen" oder "VSV G-pseudotypisiertes retrovirales Teilchen" wird ein Retrovirus mit einem Hüllprotein VSV G verstanden, entweder in Kombination mit oder im wesentlichen statt der endogenen retroviralen Hülle. Bevorzugt ist VSV G in der VSV G-pseudotypisierten viralen Hülle in einer solchen Menge vorhanden, dass VSV G etwa 50% der Hüllproteine, die in der Hülle vorliegen, darstellt, noch bevorzugter etwa 75%, und ganz besonders bevorzugt etwa 90% bis 95%, noch bevorzugter mehr als etwa 95%, am bevorzugtesten etwa 100% oder derart, dass VSV G im wesentlichen das einzige Hüllprotein darstellt, das in der pseudotypisierten viralen Teilchenhülle vorliegt.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlich beschrieben.
Überblick über das induzierbare Expressionssystem gemäß der Erfindung
Die 2A–2C stellen eine schematische Darstellung der Hauptkomponenten des induzierbaren Expressionssystems gemäß der vorliegenden Erfindung dar. Das induzierbare Expressionssystem umfasst wenigstens zwei Hauptkomponenten: 1) einen multi-chimären Transaktivator, und 2) einen induzierbaren Promotor, wobei die Transkription von dem induzierbaren Promotor durch den multi-chimären Transaktivator erleichtert wird (2C). Der multi-chimäre Transaktivator ist ein Fusions-Protein, zumindest aufgebaut aus: 1) einer ersten Liganden-Bindungs-Domäne, die bei Bindung des Liganden die Transkriptions-Aktivierung durch den multi-chimären Transaktivator negativ beeinflusst (im folgenden als die Bindungs-Domäne bezeichnet, die die Transkription negativ beeinflusst, oder NAT-Domäne), 2) einer Transkriptions-Aktivierungs-Domäne (TAD), im allgemeinen von einem eukaryotischen Transkriptions-Aktivator abgeleitet, und 3) einer zweiten Liganden-Bindungs-Domäne, die bei Bindung an den entsprechenden Liganden die Transkriptions-Aktivierung durch den multi-chimären Transaktivator positiv beeinflusst (im folgenden als die Bindungs-Domäne bezeichnet, die die Transkription positiv beeinflusst oder PAT-Domäne). Die Domänen des multi-chimären Transaktivators sind bevorzugt geordnet vom N-Terminus zum C-Terminus NAT-TAD-PAT, auch wenn die Domänen anders angeordnet sein können (z. B. vom N-Terminus zum C-Terminus, PAT-TAD-NAT).
Im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die NAT-Domäne der Repressor des Escherichia coli (E. coli)-Tetracyclin-Resistenz-Operons (tetT), die TAD-Domäne ist die Aktivierungs-Domäne (Carboxyl-terminale Domäne) vom Virionprotein 16 (VP16) von Herpes Simplex Virus (HSV) (Triezenberg et al., 1988, Genes Dev. 2: 718–729), und die PAT-Domäne ist der Liganden-Bindungs-Teil eines Steroid-Rezeptors, bevorzugt ein Liganden-Bindungs-Teil eines ÖstrogenRezeptors (ER), eines Glucocorticoid-Rezeptors (GR), eines Mineralcorticoid-Rezeptors (MR), eines Androgen-Rezeptors (AR), oder eines Progesteron-Rezeptors (PR), insbesondere ein Östrogen-Rezeptor. Die relativen Positionen von tetR, VP16, ER und tetO induzierbarer Promotor in der bevorzugten Ausführungsform des induzierbaren Expressionssystems sind in der 2C dargestellt.
Im allgemeinen, wie beispielhaft in der 2 angegeben, wird die Transkription von dem induzierbaren Promotor nur aktiviert, wenn sowohl die ER-Domäne (PAT-Domäne) an Östrogen (ein PAT-Ligand) gebunden und die tetR-Domäne (NAT-Domäne) nicht an Tetracyclin (ein NAT-Ligand) gebunden ist (2B). Wenn der Ligand an die NAT-Domäne gebunden ist oder die PAT-Domäne ohne Ligand ist, kann der multi-chimäre Transaktivator die Transkription von dem induzierbaren Promotor nicht signifikant erleichtern (2A).
Gemäß einer Ausführungsform ist das induzierbare Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut aus: 1) einem multi-chimären Transaktivator, tTAER, der ein Fusionsprotein ist, aufgebaut aus (bevorzugt vom N-Terminus zum C-Terminus) dem E. coli tetR-Polypeptid, der Transkriptions-Aktivierungs-Domäne von HSV VP16, und der Liganden-Bindungs-Domäne von dem Östrogen-Rezeptor (ER); und 2) einem minimalen Promotor abgeleitet von dem Immediate Early Gen von CMV funktionstüchtig verknüpft an sieben Tandem-Kopien von tetO, das wiederum an eine Nukleotidsequenz von Interesse funktionstüchtig verknüpft sein kann. Wenn Östrogen an dem ER-Teil von tTAER gebunden ist, erleichtert tTAER die Expression von dem tetO-induzierbaren Promotor durch die Bindung von der tetR-Domäne an eine tetO-Sequenz bzw. -Sequenzen des induzierbaren Promotors, wodurch der VP16-Domäne die Erleichterung der Transkriptions-Aktivierung ermöglicht wird. tTAER führt zu keiner signifikanten Veränderung der Transkription aus dem tetO-induzierbaren Promotor in Abwesenheit von Östrogen. Die Transkriptions-Aktivierung des tetO-induzierbaren Promotors durch tTAER ist in Gegenwart von Tetracyclin inhibiert, das an den tetR-Teil von tTAER bindet. Diese Ausführungsform wird im folgenden ausführlich beschrieben. Wenn die PAT-Domäne des multi-chimären Transaktivators an einen PAT-Liganden gebunden ist und die NAT-Domäne nicht an einen NAT-Liganden gebunden ist, ist die Transkription von dem induzierbaren Promotor etwa 10-fach bis etwa 50-fach erhöht, bevorzugt von etwa 40-fach bis 90-fach, noch bevorzugter von etwa 40-fach bis 100-fach, und kann 200-fach oder mehr in Bezug auf die Transkription in Gegenwart des NAT-Liganden betragen. Die Transkription von dem induzierbaren Promotor ist etwa 2-fach bis etwa 4-fach, bevorzugt etwa 3-fach bis 10-fach höher, wenn der Transaktivator durch den PAT-Liganden gebunden ist, als wenn der Transaktivator von sowohl dem NAT-Liganden als auch dem PAT-Liganden gebunden ist, oder wenn der Transaktivator durch keinen Liganden gebunden ist.
Bevorzugt kann der multi-chimäre Transaktivator in hohen Niveaus in einer eukaryotischen Zelle exprimiert werden, ohne die allgemeine zelluläre Transkription in der Wirtszelle signifikant nachteilig zu beeinflussen, d. h. ohne den "Unterdrückungseffekt", der mit einer hohen Expressionsstärke von weiteren Transaktivator-Proteinen assoziiert ist (z. B. tTA des Tetracyclin-induzierbaren Systems von Gossen und Bujard, siehe oben). Unter "hohen Niveaus" wird eine Menge an Expression des multichimären Transaktivators verstanden, die ausreicht, die Transaktivierung des induzierbaren Promotors zu erleichtern, aber nicht für die Zelle schädlich ist (d. h. nicht-toxisch für die Zelle). "Hohe Niveaus" kann eine Expressionsstärke sein, die die Detektion des Transaktivators mittels Western-Blot von etwa 10⁶ Zellen oder weniger ermöglicht. Der multi-chimäre Transaktivator kann vorzugsweise in einer breiten Vielfalt von Zelltypen exprimiert werden, einschließlich Säugerzellen und Nicht-Säugerzellen wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Menschen-, Affen-, Mäuse-, Hamster-, Rinder-, Insekten-, Fisch- und Froschzellen.
Der multi-chimäre Transaktivator kann entweder in vivo oder in vitro exprimiert werden, und die Expression des Transaktivators kann durch Selektion des Promotors gesteuert werden, an den die Nukleotidsequenz, die für den Transaktivator codiert, funktionstüchtig verknüpft wird. Zum Beispiel kann es sich bei dem Promotor um einen konstitutiven Promotor oder einen induzierbaren Promotor handeln. Beispiele für solche Promotoren umfassen den humanen Cytomegalovirus-Promotor IE (Boshart et al., 1985, Cell, 41: 521–530), ubiquitär exprimierende Promotoren wie zum Beispiel HSV-Tk (McKnight et al., 1984, Cell, 37: 253–262) und β-Actin-Promotoren (z. B. der humane β-Actin-Promotor wie von Ng et al., Mol. Cell Biol., 1985, 5: 2720–2732 beschrieben).
Bei dem Promotor des multi-chimären Transaktivators kann es sich um einen Zelltyp-spezifischen oder Gewebe-spezifischen Promotor handeln, der bevorzugt die Transkription des Transaktivators in einer gewünschten Zelle eines Gewebetyps erleichtert. Beispielhafte Zelltyp-spezifische und/oder Gewebe-spezifische Promotoren umfassen Promotoren wie zum Beispiel Albumin (Leber-spezifisch; Pinkert et al., 1987, Genes Dev., 1: 268–277), Lymphoid-spezifische Promotoren (Calame et al., 1988, Adv. Immunol. 43: 235–275); insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto et al., 1989, EMBO J. 8: 729–733) und Immunglobuline (Banerji et al., 1983, Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore, ebenda, 741–748), Neuronen-spezifische Promotoren (z. B. der Neurofilament-Promotor; Byrne et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5473–5477), Pankreas-spezifische Promotoren (Edlunch et al., 1985, Science, 230: 912–916) oder Brustdrüsen-spezifische Promotoren (Milchmolken-Promotor, US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 264 166). Promotoren für die Expression des multi-chimären Transaktivators können auch entwicklungsgesteuerte Promotoren wie zum Beispiel die murinen Homeobox-Promotoren (Kessel et al., 1990, Science, 249: 374–379) oder der α-Fetoprotein-Promotor (Campes et al., 1989, Genes Dev., 3: 537–546) sein. Der Promotor kann in Kombination mit Kontrollregionen verwendet werden, was eine Integrationsstellen-unabhängige Expression des Transaktivators ermöglicht (Grosveld et al., 1987, Cell, 51: 975–985). Bevorzugt ist der Promotor in den jeweiligen Zelltypen konstitutiv. Bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um einen CMV-Promotor, noch bevorzugter um einen CMV Immediate Early Gen-Promotor.
Liganden-Bindungs-Domäne für die Inhibierung der Transkription durch den multichimären Transaktivator
Die Liganden-Bindungs-Domäne, die die Transkription aus dem induzierbaren Promotor negativ beeinflusst (NAT-Domäne des Transaktivators), kann von einem beliebigen Polypeptid abgeleitet sein, das die Transkription von einem Promotor inhibiert, wenn an einen spezifischen Liganden gebunden. Bei Bindung an ihren spezifischen Liganden inhibiert die NAT-Domäne bevorzugt die Transkription durch Verhindern der Bindung des multi-chimären Transaktivators an eine spezifische Nukleotidsequenz innerhalb eines Promotors, noch bevorzugter handelt es sich bei der spezifischen Sequenz, an die der multi-chimäre Transaktivator bindet, um die Transkription zu erleichtern (wenn die NAT-Domäne nicht an ihren Liganden gebunden ist) um eine Sequenz, die einfach in einen gewünschten Promotor inkorporiert werden kann, um die Transkriptions-Regulation des Promotors durch die multi-chimäre Transaktivator-Bindung zu erleichtern.
Bei der NAT-Domäne kann es sich zum Beispiel um ein Repressor-Protein handeln, das an eine spezifische DNA-Sequenz in einer NAT-Liganden-abhängigen Weise bindet. Wenn der NAT-Ligand nicht vorliegt, bindet folglich die NAT-Domäne an die spezifische Nukleotidsequenz in dem induzierbaren Promotor, wodurch es der Transkriptions-Aktivierungs-Domäne (TAD) des multi-chimären Transaktivators ermöglicht wird, die Transkription von dem induzierbaren Promotor zu erleichtern. Bevorzugt ist die Bindung der NAT-Domäne an die spezifische Nukleotidsequenz relativ stark, d. h. mit einer Bindungs-Konstante (k_a) von wenigstens 10⁵ M^–1, bevorzugt wenigstens etwa 10⁶ M^–1, noch bevorzugter wenigstens etwa 10⁸ M^–1 bis 10⁹ M^–1, und kann bei 10⁹ M^–1 oder mehr liegen. Wenn der NAT-Ligand anwesend ist, bindet der NAT-Ligand an die NAT-Domäne, wodurch verhindert wird, dass die NAT-Domäne an die spezifische Nukleotidsequenz in dem induzierbaren Promotor bindet, wodurch die multi-chimäre Transaktivierungs-vermittelte Transkriptions-Aktivierung inhibiert wird. Beispielhafte NAT-Domänen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den Repressor (tetR) des prokaryotischen Tetracyclin-Resistenz-Operons, den lac-Repressor von weiteren prokaryotischen Lactose-Operons, GAL4 des Galactose-Operons (Conner et al., 1993, Virol. 195: 569, die jun- und creb-Transaktivatoren aus Säugetieren (Yin et al., 1995, J. Virol. 69: 6209–6218) und in Pflanzen gefundene Transaktivatoren (Wilde et al., 1994, Plant Mol. Biol., 24: 38).
Bevorzugt ist die NAT-Domäne des multi-chimären Transaktivators ein natives tetR-Polypeptid oder ein funktionelles Derivat von tetR, da tetR seine spezifische DNA-Sequenz (tetO) mit höherer Affinität als entweder LacR oder GAL4 ihre jeweiligen Sequenzen binden. Zum Beispiel bindet tetR Tetracyclin sehr viel stärker (k_a ~ 10⁹ M^–1; Takahashi et al., J. Mol. Biol., 187: 341–348 (1986) als lacR an IPTG komplexiert (k_a ~ 10⁶ M^–1; Barkley & Bourgeios in The Operon, Miller & Rezinkoff, hrg. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N. Y., 1980, S. 177–220). Folglich wirken sehr geringe, nicht-toxische Konzentrationen von Tetracyclin auf effiziente Art und Weise. Unter "funktionelles Derivat von tetR" wird ein Polypeptid verstanden, das von tetR abgeleitet ist, das sowohl 1) die Tetracyclin- oder Tetracyclin-Analogon-Bindung und 2) die Fähigkeit zur Inhibierung der Transkription von dem induzierbaren Promotor durch Verhindern der Bindung der tetR-Domäne an tetO-Sequenzen innerhalb des induzierbaren Promotors beibehält. Die für tetR codierende Nukleotidsequenz kann nach Postle et al., 1984, Nucl. Acids Res. 2: 4849–4863, durch Inbezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen, erhalten werden. Weitere tetR-Sequenzen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, und die jeweiligen Bindungsstellen für diese Repressoren sind in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben (Waters et al., 1983, Nucl. Acids Res. 11: 6089–6105; Postle et al., wie oben; Unger et al., 1984, Gene. 31: 103–108; Unger et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 7693–7703; Tovar et al., 1988, Mol. Gen. Genet., 215: 76–80); für einen Vergleich und Überblick siehe Hillen und Wissmann in Protein-Nuclein Acid Interaction, Topics in Molecular and Structural Biology, Saenger und Heinemann (hrg.), Macmillan, London, Bd. 10, S. 143–162 (1989)).
Der Ligand, der an die Liganden-Bindungs-Domäne der NAT-Domäne des Transaktivators bindet, kann ein natürlicher Ligand sein, der die NAT-Domäne bindet oder ein Analogon des natürlichen Liganden. Bevorzugt ist der natürliche Ligand und/oder ein Analogon des natürlichen Liganden im wesentlichen nicht-toxisch für eukaroytische Zellen bei Konzentrationen, die für die NAT-Domänen-vermittelte Regulation des induzierbaren Promotors erforderlich sind, und kann an Tiere und/oder Menschen in diesen Konzentrationen mit wenigen oder keinen schweren Nebenwirkungen verabreicht werden.
Wenn es sich zum Beispiel bei der NAT-Domäne um tetR handelt, ist der natürliche Ligand Tetracyclin. Bei Tetracyclin-Analoga kann es sich um eine Vielzahl von Verbindungen handeln, die mit Tetracyclin eng verwandt sind und an den tet-Repressor mit einer K_a von wenigstens etwa 10⁶ M^–1 binden. Bevorzugt bindet das TetraCyclin-Analogon mit einer Affinität von etwa 10⁹ M^–1 oder mehr, z. B. bindet es mit einer Affinität von etwa 10¹¹ M^–1. Beispiele für solche TetraCyclin-Analoga umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die in den folgenden Veröffentlichungen offenbarten: Hlavka und Boother, "The Tetracyclines" in: Handbook of Experimental Pharmacology, 78, R. K. Blackwood et al., (hrg.), Springer-Verlag, Berlin-New York, 1985; Mitschef, "The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics", Medicinal Research, 9, Dekker, New York, 1978; Noyee Development Corporation, "Tetracycline Manufacturing Processes", Chemical Process Reviews, Park Ridge, N. J. 2 Vol. 1969; Evans, "The Technology of the Tetracyclines", Biochemical Reference Series 1, Quadrangle Press, New York, 1968; und Dowling, "Tetracycline", Antibiotics Monographs Nr. 3, Medical Encyclopedia, New York, 1955; jede davon wird durch Inbezugnahme im Hinblick auf die Tetracyclin-Analoga in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Liganden-Bindungs-Domäne für die Aktivierung der Transkription durch den multichimären Transaktivator
Die Liganden-Bindungs-Domäne, die die Transkription von dem induzierbaren Promotor positiv beeinflusst (PAT-Domäne des Transaktivators) kann von einem beliebigen Polypeptid abgeleitet werden, das die Transkription aus einem Promotor fördert, wenn an einen spezifischen Liganden gebunden. Wenn jedoch der Transaktivator an einen Liganden an dessen NAT-Domäne gebunden ist (z. B. Tetracyclin ist an die tetR-Domäne gebunden), inhibiert die NAT-Domäne die Transkriptions-Aktivierung durch den multi-chimären Transaktivator, selbst wenn die PAT-Domäne an einen PAT-Liganden gebunden ist.
Die PAT-Domäne kann von einem beliebigen Polypeptid abgeleitet sein, das eine Liganden-Bindungs-Domäne aufweist, die bei Bindung an Liganden das Polypeptid nicht-funktionell macht, jedoch bei Bindung an Liganden das Polypeptid funktionell macht. Beispiele für Polypeptide mit solchen Liganden-Bindungs-Domänen, die als eine PAT-Domäne in dem multi-chimären Transaktivator gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Liganden-Bindungs-Domäne von Thyroid-Rezeptoren, Retinoid-Rezeptoren und Stereoid-Rezeptoren. Bevorzugt handelt es sich bei der PAT-Domäne um eine Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroid-Rezeptors. Der Steroid-Rezeptor kann ein Rezeptor für Östrogen (ER; Eilers et al., 1989, Nature 340: 66–68); Glucocorticoid (GR; Picard et al., 1988, Cell 54: 1073–80), Mineralcorticoid (MR; Frankhauser et al., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 200: 195–201), Progesteron (PR; Mattioni et al., in: Methods in Cell Biology, Kapitel 16, 43: 335–352) oder Androgen (AR; Mattioni et al., wie oben) sein. Bevorzugt ist der Steroid-Rezeptor ein Östrogen-Rezeptor (ER). Die Isolierung der Östrogen-Bindungs-Domäne des Östrogen-Rezeptors ist beschrieben worden (Kumar et al., 1986, EMGO J. 5: 2231–2236), in die vorliegende Beschreibung durch Inbezugnahme im Hinblick auf die Isolierung der ER-Liganden-Bindungs-Domäne aufgenommen) und die Sequenz ist bestimmt worden. Bei dem Liganden, der die Liganden-Bindungs-Domäne der PAT-Domäne des Transaktivators bindet, kann es sich um einen natürlichen Liganden handeln, der an die PAT-Domäne bindet, oder um ein Analogon des natürlichen Liganden. Bevorzugt ist der natürliche Ligand und/oder das Analogon des natürlichen Liganden im wesentlichen nicht-toxisch für eukaryotische Zellen bei Konzentrationen, die für die PAT-Domänen-vermittelte Regulation des induzierbaren Promotors benötigt werden, und kann an Tiere und/oder Menschen in diesen Konzentrationen mit wenigen oder keinen schweren Nebenwirkungen verabreicht werden.
Wenn zum Beispiel die PAT-Domäne des multi-chimären Transaktivators von einer Liganden-Bindungs-Domäne eines Östrogen-Rezeptors (ER) abgeleitet ist, handelt es sich bei dem natürlichen Liganden um Östrogen. Östrogen-Analoga, die mit ER-enthaltenden Transaktivatoren eingesetzt werden können, umfassen 17β-Östradiol, 17β-Östradiol, 17α-Östradiol und weitere Östrogen- und Östradiol-Derivate, die an die Östrogen-Bindungs-Domäne des Östrogen-Rezeptors binden können.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden werden zu wollen, wird davon ausgegangen, dass wenn die PAT-Domäne eine Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroid-Rezeptors ist, dass dann die Inaktivierung der Transkriptions-Aktivierungsfunktion durch den multi-chimären Transaktivator durch einen Komplex vermittelt wird, der ein Hitzeschock-Protein 90 enthält (HSP90) (Picard et al., 1988, wie oben; Yamamoto et al., 1988, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 53: 803–811; Picard, 1993, Trends Cell Biol. 3: 278–280). HSP90 wie auch einige weitere Proteine ist mit den ungebundenen Steroid-Bindungs-Domänen von allen fünf Steroid-Rezeptoren von Wirbeltieren assoziiert (ER, GR, AR, MR und PR) (Pratt, 1990, Mol. Cell. Endocrinol., 74: C69–76; Smith et al., 1993, Mol. Endocrinol. 7: 4–11). Eine Steroid-Bindung führt zu einer Freisetzung des HSP90-Komplexes und einer Protein-Aktivierung. Die Steroid-reversible Protein-Inaktivierungsfunktion der Steroid-Bindungs-Domäne könnte über einen Mechanismus ablaufen, an dem sterische Hinderung durch den HSP90-Komplex beteiligt ist. Folglich ist jede beliebige PAT-Domäne mit einem Liganden-Bindungs-Teil, der ohne Bindung an einem Liganden an einen HSP90-enthaltenden Komplex bindet und sterisch die Transaktivierung durch den multi-chimären Transaktivator verhindert, für eine Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Transkriptions-Aktivierungs-Domäne
Die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne kann von einem beliebigen Transkriptions-Aktivator abgeleitet werden. Im allgemeinen handelt es sich bei den Transkriptions-Aktivierungs-Domänen um Polypeptidsequenzen mit besonderen Konformations- und/oder Ladungs-Eigenschaften. Zum Beispiel handelt es sich bei "acid blob"-Domänen um Transkriptions-Domänen von HSV-Transkriptions-Aktivatoren, die die Transkriptions-Aktivierung durch Wechselwirkung der stark negativ geladenen Domänen-Polypeptidsequenz mit Proteinen, die für die Transkriptions-Aktivierung wesentlich sind, erleichtern. (siehe Triezenberg et al., 1988, Genes Dev., 2: 718–729). Bevorzugt handelt es sich bei der Transkriptions-Aktivierungs-Domäne des multichimären Transaktivators um die negativ geladene C-terminale Domäne von VP16, dem Transaktivator von Herpes Simplex Virus Immediate Early Gen Expression, beschrieben in Triezenberg et al., 1988, Genes Dev., 2: 718–729, die durch Inbezugnahme im Hinblick auf die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne von VP16 in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird. Bevorzugt ist die Transkriptions-Aktivierungs-Domäne des multi-chimären Transaktivators aus den C-terminalen 130 Aminosäuren von VP16 zusammengesetzt.
Induzierbare Promotoren
Im allgemeinen handelt es sich bei dem induzierbaren Promotor, der zusammen mit dem Transaktivator in dem induzierbaren Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, um einen beliebigen Promotor, aus dem die Transkription durch den multi-chimären Transaktivator reguliert werden kann. Bevorzugt ist die Transkription von dem induzierbaren Promotor sowohl positiv als auch negativ durch den Transaktivator reguliert. Wenn zum Beispiel der Transaktivator an Liganden an dessen NAT-Domäne gebunden ist (z. B. eine tetR-Domäne), kann der Transaktivator nicht an den induzierbaren Promotor binden, und die Transkription findet nicht in signifikanter Stärke statt, selbst wenn der Transaktivator an seiner PAT-Domäne an einen Liganden gebunden ist (z. B. eine Steroid-Bindungs-Domäne), der Transaktivator bindet an den induzierbaren Promotor, um die Transkription zu erleichtern.
Die Zusammensetzung des induzierbaren Promotors hängt mit den wichtigen Komponenten des multi-chimären Transaktivators zusammen, und kann als multiple Tandem-wiederholte Kopien vorliegen. Wenn die NAT-Domäne des Transaktivators zum Beispiel ein tetR-Polypeptid ist, handelt es sich bei dem induzierbaren Promotor bevorzugt um einen minimalen Promotor enthaltend wenigstens eine tetO-Sequenz, bevorzugt wenigstens 2 oder mehr Tandem-wiederholte tetO-Sequenzen, noch bevorzugter wenigstens 5 oder mehr Tandem-wiederholte tetO-Sequenzen, ganz besonders bevorzugt wenigstens 7 Tandem-wiederholte tetO-Sequenzen oder mehr. Wenn die NAT-Domäne hingegen von lacR abgeleitet ist, enthält der induzierbare Promotor wenigstens eine laci-Sequenz. Der minimale Promotorteil des induzierbaren Promotors kann von einem beliebigen erwünschten Promotor abgeleitet sein, und ist ausgewählt aus Zelllinien, in denen das induzierbare Expressionssystem verwendet werden soll. Wenn es sich bei der Zelle um eine Säugerzelle handelt, ist ein bevorzugter minimaler Promotor von CMV abgeleitet, bevorzugt von dem CMV Immediate Early Gen 1A.
Bevorzugt handelt es sich bei dem induzierbaren Promotor um einen minimalen Promotor in funktionstüchtiger Verknüpfung an wenigstens eine tet-Operator-Sequenz (tetO). Die tetO-Sequenz kann zum Beispiel nach Hillen & Wissmann, 1989, wie oben, erhalten werden, die jeweils durch Inbezugnahme im Hinblick auf die Beschreibung und die Sequenz von tetO in die vorliegende Beschreibung aufgenommen werden. Weitere tetO-Sequenzen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können nach den folgenden Literaturstellen erhalten werden: Waters et al., 1983, wie oben; Postle et al., 1984, wie oben; Unger et al., 1984, wie oben; Unger et al., 1984, wie oben; Tovar et al., 1988, wie oben; zum Vergleich und Überblick siehe Hillen und Wissmann, 1989, wie oben, deren Offenbarungen werden durch Inbezugnahme vollständig in die vorliegende Beschreibung aufgenommen. Es können eine zwei drei vier fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn oder mehr Kopien der tet-Operator-Sequenz eingesetzt werden. Da multiple Kopien der tet-Operator-Sequenz einen synergistischen Effekt für die Fähigkeit zur Expressionskontrolle von diesen tetO enthaltenden Promotoren ergeben, ermöglichen Promotoren mit einer größeren Anzahl von tetO-Kopien einen größeren Bereich der Transaktivator-Regulation der Transkription von dem Promotor. Die Regulation von Tetracyclin-regulierbaren Promotoren enthaltend tetO-Sequenzen ist in USPN 5 464 758 und in Gossen und Brujand, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 5547–5551, besprochen, die jeweils durch Inbezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen werden.
SEQUENZ VON EINEM INDUZIERBAREN PROMOTOR
Konstrukte
Die Hauptkomponenten des induzierbaren Expressionssystems, d. h. die Nukleotidsequenz codierend für den Transaktivator und der induzierbare Promotor in funktionstüchtiger Verknüpfung mit einer Nukleotidsequenz von Interesse, können in einem einzelnen Konstrukt oder innerhalb von zwei getrennten Konstrukten enthalten sein. Das Konstrukt kann von einer Vielzahl von Konstrukten abgeleitet sein, die im Stand der Technik bekannt und/oder kommerziell erhältlich sind, und können für eine Replikation in prokaryotischen Zellen, eukaryotischen Zellen oder bevorzugt sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen befähigt sein.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Komponenten kann das Konstrukt zusätzlich eine Nukleotidsequenz enthalten, die für Gene) codiert, die als selektierbare Markierungen dienen, z. B. Antibiotika-Resistenz-Gene (z. B. Ampicillin, Hygromycin, G418), β-Galactosidase oder weitere Gen-Produkte, die für eine Selektion von Zellen, die das Konstrukt enthalten, verwendet werden können. Das Konstrukt kann zusätzlich weitere Expressions-erleichternde Sequenzen enthalten, wie zum Beispiel Verstärker, Introns oder andere Sequenzen, die die Expression des Transaktivators und/oder gegebenenfalls die Expression der Nukleotidsequenz von Interesse erleichtern, in funktionstüchtiger Verknüpfung an den induzierbaren Promotor.
Wirtszellen
Jede beliebige eukaryotische Zelllinie, die stabil mit dem induzierbaren Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert werden kann, kann eingesetzt werden, um ein gewünschtes Gen-Produkt induzierbar zu exprimieren, z. B. ein cytotoxisches Polypeptid. Geeignete Wirtszellen umfassen Zellen von sowohl Säuger-Ursprung (z. B. Mensch, Affe, Hund, Katze, Pferd und Nagetier) und Nicht-Säuger-Ursprung (z. B. Insekt, Reptil, Fisch und Vogel). Besondere beispielhafte Wirtszellen umfassen 293GP-Zellen und HT1080-Zellen. Die Wirtszellen können entweder eine in vitro-Zellkultur darstellen oder in einem Organismus in vivo vorliegen.
Bevorzugt wird das induzierbare Expressionssystem in die Zelle als eine einzelne rekombinante Nukleotidsequenz eingeführt (z. B. eher als zwei separate Sequenzen, wobei die eine für den Transaktivator codiert und die andere für das Gen-Produkt von Interesse unter Kontrolle des induzierbaren Promotors codiert). Die Einführung der Nukleotidsequenz codierend für das induzierbare Expressionssystem in Wirtszellen kann entweder in vitro oder in vivo nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden (siehe z. B. Sambrook et al., 1987, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das induzierbare Expressionssystem in die Wirtszelle durch Infektion mit einem retroviralen Vektor eingeführt, der die Nukleotidsequenz codierend für den multi-chimären Transaktivator und/oder den induzierbaren Promotor in funktionstüchtiger Verknüpfung mit der Nukleotidsequenz von Interesse enthält, und die Nukleotidsequenz codierend für das induzierbare Expressionssystem wird stabil in dem Wirtszellen-Genom integriert.
Eine Nukleotidsequenz bzw. -sequenzen codierend für das induzierbare Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um transgene Tiere für eine regulierte Expression einer Nukleotidsequenz von Interesse zu erzeugen. Solche transgene Tiere können hergestellt werden durch (1) zum Beispiel Injizieren eines Nukleotidmoleküls codierend für den multi-chimären Transaktivator und/oder einen individuellen Promotor in funktionstüchtiger Verknüpfung an die Sequenz, die für ein Gen-Produkt von Interesse codiert, in ein befruchtetes Ei. Man lässt das befruchtete Ei zu einem ausgewachsenen Tier entwickeln. Genauer gesagt werden einige Hundert DNA-Moleküle in den Vorkern eines befruchteten, einzelligen Eis injiziert. Die mikro-injizierten Eier werden anschließend in Eileiter von pseudoschwangeren Pflegemüttern transferiert und man lässt sie wachsen. Bei Verwendung dieses Verfahrens werden etwa 25% der sich entwickelnden Mäuse eine oder mehrere Kopien der mikro-injizierten DNA erben (Brinster et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4438–4442). Alternativ dazu können transgene Tiere durch Verwendung von rekombinanten ES-Zellen für die Generierung der Transgene eingesetzt werden, wie von Gossler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 9065–9069, beschrieben.
Tiere, die für den multi-chimären Transaktivator unter der Transkriptions-Kontrolle von einem der vorstehend beschriebenen Promotorsequenzen und/oder die Sequenzen unter Kontrolle dieses Regulations-Proteins transgen sind, können z. B. durch Co-Injektion der beiden Moleküle erzeugt werden. Alternativ dazu können unabhängige Tierlinien, die nur für eine der Sequenzen transgen sind, durch Züchten der beiden transgenen Tierlinien erhalten werden.
Die Expression der Nukleotidsequenz in dem induzierbaren Expressionssystem, das in der Wirtszelle vorliegt, entweder in vitro oder in vivo (z. B. in transgenen Tieren), kann durch Exponieren der Zelle gegenüber Tetracyclin (oder Analoga davon) und Östrogen (oder Analoga davon, bevorzugt 17β-Östradiol) reguliert werden. Die Expression in transgenen Tieren kann durch Verabreichen von Tetracyclin und/oder Östrogen über geeignete Mittel reguliert werden, z. B. oral, transdermal oder durch Injektion über eine parenterale, subkutane, intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Route. Die verabreichte Dosierung variiert von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich dem Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Tiers.
Verpackungs-Zelllinien unter Verwendung des induzierbaren Expressionssystems
Das induzierbare Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Verpackungszellen zu erzeugen, die bei der Herstellung von rekombinanten pseudo-typisierten retroviralen Vektoren geeignet sind, die für eine Anwendung bei der Einführung einer DNA-Sequenz von Interesse in eine Ziel-Zelle und der regulierten Expression der eingeführten Nukleotidsequenz entweder in vitro oder in vivo geeignet sind. Bei pseudo-typisierten retroviralen Teilchen handelt es sich um retrovirale Teilchen, die ein Hüllprotein aufweisen, das von einem anderen Virus als dem Virus, von dem das virale RNA-Genom abgeleitet ist, abstammt. Das Hüllprotein kann von einem Retrovirus einer anderen Art als der Retrovirus, von dem das RNA-Genom abgeleitet ist, oder von einem anderen nicht-retroviralen Virus abstammen (z. B. Vesikular Stomatitis Virus (VSV)). Üblicherweise weisen die pseudotypisierten retroviralen Vektoren einen Defekt auf, d. h. der retrovirale Vektor ist von einem natürlich vorkommenden Virus abstammend, der genetisch verändert worden ist, um den Virus replikations-defekt zu machen. Sobald der Virus sein genetisches Material in eine Ziel-Zelle transferiert, bringt der Virus die rekombinante Nukleotidsequenz in die Zelle ein, bevorzugt als eine stabile chromosomal-integrierte Sequenz, erzeugt jedoch keinen zusätzlichen infektiösen Virus bei der Expression der eingeführten retroviralen Sequenz. Alternativ dazu kann der retrovirale Vektor, der die Nukleotidsequenz von Interesse enthält, abgeschwächt werden, d. h. keine signifikante Pathologie oder Morbidität in dem infizierten Wirt verursachen (d. h. der Virus ist nicht-pathogen oder verursacht nur geringe Erkrankungssymptome).
Pseudo-typisierte retrovirale Teilchen können durch Einführung eines defekten rekombinanten retroviralen Genoms in eine Verpackungszelle hergestellt werden (z. B. durch Infektion mit einem defekten retroviralen Teilchen oder mittels anderer Mittel zur Einführung von DNA in eine Ziel-Zelle (z. B. konventionellen Transformationstechniken)). Das defekte retrovirale Genom enthält mindestens die langen terminalen Wiederholungen, die exogene Nukleotidsequenz von Interesse, die transferiert werden soll, und eine Verpackungssequenz (φ). Im allgemeinen stellt die Verpackungszelle die fehlenden retroviralen Komponenten bereit, die für die retrovirale Replikation, Integration und Einkapselung essentiell sind, und exprimiert ferner eine Nukleotidsequenz, die für das gewünschte Hüllprotein codiert. Jedoch enthält die Verpackungszelle nicht alle Komponenten, die für die Produktion von retroviralen Teilchen essentiell sind. Die Nukleotidsequenz bzw. -sequenzen, die die fehlende virale Komponente bzw. Komponenten in der Verpackungszelle codieren, können entweder stabil in das Verpackungszellen-Genom integriert und/oder durch ein coinfizierendes Helfer-Virus bereitgestellt werden.
Die Nukleotidsequenzen, die für die retroviralen Komponenten und das retrovirale RNA-Genom codieren, können von einem beliebigen gewünschten Retrovirus abstammen (z. B. Maus-, Affen-, Vogel- oder Human-Retroviren). Die meisten defekten Retroviren, die für Gen-Therapieanwendungen entwickelt worden sind, sind murine Retroviren (z. B. muriner Leukämie-Virus (MuLV), Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus (MoMLV)) (siehe z. B. Miller et al., 1992, Nature, 357: 455–460; und Mulligan, 1993, Science, 260: 926–932). Im allgemeinen können die retroviralen Komponenten von einem beliebigen Retrovirus abgeleitet werden, der pseudo-typisierte retrovirale Teilchen mit dem gewünschten Hüllprotein bilden kann, z. B. VSV G. Wenn VSV G das gewünschte Hüllprotein darstellt, können die retroviralen Komponenten von MuLV, MoMLV, Vogel-Leukose-Virus (ALV), Human-Immunschwäche-Virus (HIV) oder irgendeinem anderen Retrovirus abgeleitet werden, der mit VSV G als einziges Hüllprotein oder mit VSV G und einer relativ geringen Menge eines retroviralen Hüllproteins einen pseudo-typisierten Virus bilden kann.
In einem Beispiel eines pseudo-typisierten Retrovirus, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, enthält die freie Virionen-Form eines pseudo-typisierten defekten murinen Retrovirus die strukturellen und enzymatischen Proteine des Retrovirus (einschließlich der reversen Transkriptase), zwei RNA-Kopien des retroviralen Genoms und einen Teil der Zellplasmamembran, in der das gewünschte virale Hüll-Glycoprotein eingebettet ist (z. B. VSV G). Das Genom ist in vier Hauptregionen unterteilt: die lange terminale Wiederholung (long terminal repeat – LTR), das gag-Gen, das pol-Gen und das env-Gen. Die drei Gene gag, pol und env, die zwischen den terminalen LTRs angeordnet sind, codieren jeweils für interne virale Strukturproteine und reverse Transkriptase, und das env-Gen codiert für das Hüll-Glycoprotein, das dem Virus die Infektiosität und Wirtsauswahl-Spezifizität verleiht. Bevorzugt ist das retrovirale Genom in einem oder allen dreien dieser Gene defekt. Zusätzlich kann das retrovirale Genom eine Nukleotidsequenz von Interesse enthalten, die letztendlich in eine Ziel-Zelle transferiert werden soll. Wenn das defekte, rekombinante retrovirale Genom in die Wirtszelle in seiner proviralen Form integriert wird, ist LTR an beiden Enden des proviralen Genoms gelegen, und bildet ein Composit der 5'- und 3'-Enden des RNA-Genoms. Das LTR enthält cis-agierende Elemente, die für die Initiation und Termination der Transkription notwendig sind.
Eine beispielhafte Verpackungszelle gemäß der vorliegenden Erfindung enthält Gene, codierend für Gag und Pol, wie auch das gewünschte Hüllprotein, enthält jedoch kein Verpackungssignal "φ". Somit kann eine Verpackungszelle nur leere Virion-Teilchen bilden; sobald ein retrovirales RNA-Genom (das die Nukeotidsequenz von Interesse enthält) in die Verpackungszelle eingeführt ist, kann die Verpackungszelle pseudotypisierte defekte retrovirale Teilchen produzieren. Die Verpackungszellen stellen somit die fehlenden retroviralen Komponenten bereit (d. h. die Komponenten, für die das retrovirale Genom defekt ist), die für die intransvirale Replikation notwendig sind. Verfahren zur Herstellung von Replikations-defizienten, retroviralen Genomen enthaltend eine Nukleotidsequenz von Interesse sowie Verfahren zur Erzeugung einer Verpackungszelllinie, die gag- und pol-Gene exprimiert, sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt und beispielsweise beschrieben in USPN 4 861 719; PCT-Anmeldung Nr. WO 92/05266, veröffentlicht 2. April 1992; und PCT-Anmeldung Nr. WO 92/14829, veröffentlicht 2. September 1992, die jeweils durch Inbezugnahme im Hinblick auf die Herstellung von Replikations-defizienten, retroviralen Genomen und Verpackungszelllinien, die die retroviralen Gag- und Pol-Gene exprimieren, in die vorliegende Beschreibung aufgenommen werden. Bevorzugt wird die Zelllinie 293GP verwendet, um eine Verpackungszelllinie gemäß der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Retrovirale Verpackungszelllinien können von einer beliebigen Säuger- und Nicht-Säuger-Zelle abgeleitet werden, die die retroviralen gag- und pol-Proteine exprimieren kann, und das gewünschte Hüllprotein exprimieren kann (z. B. die Expression von VSV G für mehrere Stunden bis mehrere Tage, bevorzugt wenigstens eine Woche bis zwei Wochen oder mehr, tolerieren kann).
Die pseudo-typisierten retroviralen Teilchen werden gemäß der vorliegenden Erfindung durch Einführen eines defekten rekombinanten retroviralen Genoms enthaltend eine Nukleotidsequenz von Interesse in eine Verpackungszelllinie hergestellt, die Nukleotidsequenzen codierend für 1) funktionelle retrovirale Proteine, für die das eingeführte RNA-Genom defekt ist (z. B. gag und pol) und 2) ein induzierbares Expressionssystem gemäß der Erfindung, das die Expression eines gewünschten Hüllproteins erleichtert, enthält. Das defekte, rekombinante RNA-Genom kann in die Verpackungszelllinie mittels beliebiger Mittel eingeführt werden, einschließlich der Infektion mit einem defekten viralen Teilchen oder weiteren konventionellen Mitteln zur Transformation. Bevorzugt exprimiert die Verpackungszelle ein retrovirales Gag Protein, ein retrovirales Pol-Protein und ein gewünschtes Hüllprotein, das induzierbar unter Verwendung des Systems gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert wird.
Das induzierbare Expressionssystem, das in der Verpackungszelllinie enthalten ist, ist aufgebaut aus 1) einer Nukleotidsequenz codierend für einen multi-chimären Transaktivator, und 2) einer Nukleotidsequenz bestehend aus einem induzierbaren Promotor in funktionstüchtiger Verknüpfung an eine Nukleotidsequenz codierend für das gewünschte Hüllprotein. Das induzierbare Expressionssystem kann als Einzelkonstrukt oder als multiple Konstrukte eingeführt werden.
Bevorzugt handelt es sich bei dem multi-chimären Transaktivator um ein Fusionsprotein, aufgebaut aus einer tetR-Domäne, einer Transkriptions-Aktivierungs-Domäne (bevorzugt einer Transkriptions-Aktivierungs-Domäne von VP16), und einer Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroid-Rezeptors (bevorzugt einer Liganden-Bindungs-Domäne eines Östrogen-Rezeptors). Der induzierbare Promotor ist bevorzugt ein minimaler Promotor, der von einem CMV Early Gen Promotor abgeleitet ist, der in funktionstüchtiger Verknüpfung an wenigstens eine tetO-Sequenz vorliegt, bevorzugt wenigstens 2 oder mehr Tandem-wiederholte tetO-Sequenzen, noch bevorzugter wenigstens 5 oder mehr Tandem-wiederholte tetO-Sequenzen, am bevorzugtesten wenigstens 7 Tandem-wiederholte tetO-Sequenzen oder mehr.
Die Nukleotidsequenz, die für das gewünschte Hüllprotein zur Herstellung von retroviralen Teilchen codiert, ist bevorzugt eine Nukleotidsequenz codierend für VSV G, dem Hüllprotein vom Vesicular Stomatitis Virus (VSV) oder ein funktionelles Derivat davon. Die Nukleotidsequenz codierend für VSV G ist in Rose et al., 1982, Cell, 30: 753–762 beschrieben, durch Inbezugnahme im Hinblick auf die Offenbarung des VSV G-Nukleotids und der Aminosäuresequenzen in die vorliegende Beschreibung aufgenommen. Wenn es sich bei dem gewünschten Hüllprotein um VSV G handelt, kann VSV G als einziges Hüllprotein in dem pseudo-typisierten retroviralen Virion vorliegen, oder kann in Kombination mit weiteren Hüllproteinen vorliegen (z. B. dem retroviralen Hüllprotein, das normalerweise mit dem Retrovirus, aus dem die retroviralen Komponenten eines anderen pseudotypisierten Virions abgeleitet sind, in Verbindung steht). Bevorzugt liegt VSV G in der viralen Hülle derart vor, dass VSV G etwa 50% der Hüllproteine ausmacht, die in der viralen Hülle vorliegen, bevorzugter etwa 75%, noch bevorzugter etwa 90% bis etwa 95%, noch bevorzugter mehr als 95%, am bevorzugtesten etwa 100% oder derart, dass VSV G im wesentlichen das einzige Hüllprotein in der viralen Hülle darstellt. VSV G kann ein natives (d. h. natürlich vorkommendes) VSV G darstellen oder ein funktionelles Derivat davon.
Funktionelle Derivate von VSV G umfassen, sind aber nicht beschränkt auf VSV G-abgeleitete Polypeptide, die Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Additionen und/oder chemische Modifikationen, bezogen auf das native VSV G, aufweisen. Funktionelle VSV G-Derivate umfassen somit, sind aber nicht beschränkt auf VSV G-abgeleitete Polypeptide mit einer anderen Funktion als oder zusätzlich zu der normalerweise mit nativem VSV G assoziierten Funktion. Zum Beispiel kann VSV G an ein Polypeptid fusioniert werden, das von einem Antikörper mit einer Bindungs-Affinität für ein Gewebe-spezifisches oder Zell-spezifisches Antigen abgeleitet ist. Pseudotypisierte virale Teilchen mit einem solchen VSV G-Einzelketten-Antikörper-Fusionsprotein, das in der viralen Hülle vorliegt, können bevorzugt Zellen infizieren, die auf ihrer Oberfläche das Antigen exprimieren, an das die Antikörperkette bindet. Weitere VSV G-funktionelle Derivate können ebenfalls die Wirtszellen-Auswahl des pseudotypisierten viralen Teilchens verändern und/oder weitere erwünschte Eigenschaften bereitstellen. Im allgemeinen kann jedes VSV G-funktionelle Derivat eingesetzt werden, das pseudo-typisierte retrovirale Virionen gemäß der vorliegenden Erfindung bilden kann.
Wenn die Hüllen-exprimierende Verpackungszelle Tetracyclin (oder einem Analogon davon) ausgesetzt wird, wird im wesentlichen keines oder nur sehr wenig VSV G von dem induzierbaren Promotor exprimiert. In Abwesenheit von Tetracyclin und in Gegenwart von einem Steroid oder einem Analogon davon, der den Steroid-Rezeptor-Teil des multi-chimären Transaktivators bindet, wird die Expression des Hüllproteins etwa 10-fach bis etwa 50-fach erhöht, bevorzugt von etwa 40-fach bis 90-fach, noch bevorzugter von etwa 40-fach bis etwa 100-fach, und kann bei 200-fach oder mehr im Vergleich zu der Transkription in Gegenwart von Tetracyclin liegen. Zusätzlich kann die Expression des multi-chimären Transaktivators durch eine funktionstüchtige Verknüpfung der Nukleotidsequenz codierend für den multi-chimären Transaktivator an einen regulierbaren Promotor reguliert werden. Somit kann die Verpackungszelle gemäß der vorliegenden Erfindung zwei oder mehr Levels der Expression des gewünschten Hüllproteins bereitstellen: 1) negative Regulation der Expression des Hüllproteins durch Zugabe von Tetracyclin; 2) positive Regulation durch Entfernen von Tetracyclin und Zugabe von Steroid oder einem Steroid-Analogon; und gegebenenfalls 3) regulierte Expression der Nukleotidsequenz codierend für den multichimären Transaktivator.
Die Verpackungszelllinie gemäß der vorliegenden Erfindung, befähigt für eine induzierbare Expression eines gewünschten Hüllproteins, kann eingesetzt werden, um pseudo-typisierte retrovirale Vektoren in viralen Titern (vor der Zentrifugation) von mindestens mehr als 10⁴/ml herzustellen, bevorzugt mehr als 10⁵/ml, noch bevorzugter mehr als 10⁶/ml. Die Verpackungszellen können unter Bedingungen gehalten werden, die die Produktion von infektiösen pseudo-typisierten Virionen (z. B. in Gegenwart von Steroid und in Abwesenheit von Tetracyclin) für wenigstens 4 Tage ermöglicht, bevorzugt wenigstens 8 Tage, noch bevorzugter wenigstens 12 Tage, und können für 16 Tage oder mehr aufbewahrt werden. Im allgemeinen können die VSV G-pseudo-typisierten Virus-Verpackungszelllinien gemäß der vorliegenden Erfindung 10⁴ bis 10⁶ infektiöse virale Teilchen pro ml produzieren und können infektiöse Viren für etwa 5 Tage bis etwa 16 Tage oder mehr produzieren, in Abhängigkeit von der Sensitivität der Verpackungszelle auf VSV G.
Gemäß einer Ausführungsform sind die Verpackungszellen zum Beispiel innerhalb eines transgenen Tiers für eine in vivo-Produktion von pseudo-typisierten retroviralen Teilchen vorhanden, die aus den Tieren geerntet werden können (z. B. durch Sammeln und Isolieren der pseudo-typisierten Virionen aus dem Blut der Tiere oder einer anderen Körperflüssigkeit). Die Nukleotidsequenz(en) codierend für die retroviralen Gag und Pol-Proteine und die Nukleotidsequenz(en) codierend für das induzierbare Expressionssystem können verwendet werden, um nach Verfahren aus dem Stand der Technik, die vorstehend beschrieben worden sind, transgene Tiere zu generieren. Diese Tiere können mit infektiösen, Replikations-defekten retroviralen Virionen infiziert werden, die die Nukleotidsequenz von Interesse enthalten, die dann die in-vivo-Verpackungszellen, die in dem transgenen Tier vorliegen, infizieren können, um hohe Titer von pseudo-typisierten retroviralen Vektor-Teilchen zu produzieren. Die Expression des Hüllproteins, das durch das induzierbare Expressionssystem codiert wird, kann durch Verabreichung von Tetracyclin oder Steroid an das transgene Tier reguliert werden, wie vorstehend angegeben.
Die pseudo-typisierten retroviralen Vektor-Teilchen gemäß der vorliegenden Erfindung, die unter Verwendung der Verpackungszelllinien erzeugt worden sind, können eingesetzt werden, um den Transfer einer Nukleotidsequenz von Interesse in einer Wirtszelle entweder in vitro oder in vivo zu erleichtern. Zum Beispiel können die pseudo-typisierten retroviralen Vektor-Teilchen bei Gen-Therapieanwendungen eingesetzt werden, um eine therapeutische Gen-Produkt-codierende Sequenz in ein Subjekt zu transferieren, z. B. einem Säuger-Subjekt, bevorzugt einem humanen Subjekt. Die pseudo-typisierten retroviralen Vektor-Teilchen können auch verwendet werden, um verschiedene Erkrankungs- oder Versuchstiere oder in vitro-Modelle zu erzeugen. Die Verfahren zur Verabreichung von retroviralen Teilchen an ein Subjekt zur Durchführung einer in vivo-Transformation sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe z. B. Mulligan, 1993, Science, 260: 926; Anderson, 1992, Science, 256: 808; Miller, 1992, Nature, 357: 455; und Crystal, 1995, Science, 270: 404). Die Methoden für alle in vitro-Transformationen sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele wurden angegeben, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung der Ausführung der Erfindung bereitzustellen, und stellen keine Beschränkung des Umfangs von dem, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, dar. Man war um Genauigkeit im Hinblick auf die verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperaturen, usw.) bemüht, jedoch sollte einige experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Sofern nicht anders angegeben, stehen Teile für Gewichtsteile, das Molekulargewicht steht für gewichtsmittleres Molekulargewicht, die Temperatur ist in Centigraden angegeben, und der Druck ist Atmosphärendruck oder nahezu Atmosphärendruck.
Beispiel 1: Konstrukte zur Verwendung in dem induzierbaren Expressionssystem
Die Nukleotidsequenz codierend für den multi-chimären Transaktivator tTAER wurde durch Isolieren eines 1-Kilobasen-Paar (kb) EcoRI-BamHI DNA-Fragments, enthaltend das tTA-Gen aus dem Konstrukt pUHD15-1, erzeugt (Gossen et al., 1992, wie oben) (3). Das 1 kb EcoRI-BamHI-Fragment wurde an ein 0,95-kb BamHI-SstI DNA-Fragment ligiert, das die Östrogen-Rezeptor (ER) Liganden-Bindungs-Domäne aus pHE14 enthielt (Kumar et al., 1986, EMBO J. 5: 2231–2236) (3). Das erhaltene Konstrukt codiert für tTAER, das aufgebaut ist aus (vom N-Terminus zum C-Terminus) tetR, der Aktivierungs-Domäne von VP16, und dem ER (3). Die Nukleotid- und Aminosäure-Sequenz von tTAER sind in den 4A–4C dargestellt.
Es wurden mehrere Konstrukte hergestellt, um die Expression und Funktion von tTAER zu untersuchen, und um stabile Zelllinien, die tTAER exprimieren, herzustellen. Das Konstrukt pCMV-tTAER (5) wurde wie folgt hergestellt: Insertieren des 1,95-kb EcoRI-Fragments enthaltend das komplette tTAER-Gen in die einzige BamHI-Stelle in pCMV-Bam (Yee et al., 1994, supra); die Expression von tTAER aus dem pCMV-tTAER-Konstrukt ist unter der Kontrolle des CMV Immediate Early Gen 1A Promotors. Das Konstrukt phyg-CMV-tTAER (5), das bei der Herstellung von stabilen Zelllinien eingesetzt wird, wurde durch Isolieren eines 2,0-kb BamHI-HindIII-DNA-Fragments enthaltend das Gen, das für die Hygromycin B Phosphotransferase codiert (hygR; Gritz et al., 1983 Gene 25: 179–188) unter der Kontrolle des HSV Thymidin-Kinase (TK) Promotors aus pTK-hyg isoliert. Dieses hygR-codierende Fragment wurde an der einzigen NotI-Stelle unmittelbar aufwärts von dem CMV Immediate Early Gen Promotor in pCMV-tTAER insertiert. Das pTetO-CAT-Konstrukt (6) wurde durch Insertieren eines 1,5-kb BamHI-HpaI-DNA-Fragments enthaltend das Gen, das für die bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codiert, isoliert aus pTKCAT (Yee, J. K., 1989 Science 246: 658–661), in die einzige BamHI-Stelle von pUHG10-3 erzeugt (Furth et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9302–9306). Das pTEPN-Konstrukt (5) wurde durch Isolieren von dem 2-kb EcoRI-DNA-Fragment enthaltend das tTAER-Gen aus pCMV-tTAER und Insertieren dieses Fragments in die einzige BamHI-Stelle von pLPONL6 erzeugt (Yee et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9564–9568).
Es wurden mehrere Konstrukte mit durch tTAER induzierbaren Promotoren hergestellt, um die tTAER-Expression und Funktion zu untersuchen. Das pTetO-G-1-Konstrukt (5) wurde durch Isolieren eines 1,6-kb BamHI-DNA-Fragments enthaltend das VSV-G Gen aus pCMV-G (Yee et al., 1994, supra) und Insertieren des VSV-G-codierenden Fragments in die einzige BamHI-Stelle in pUHG10-3 (Gossen et al., 1992, supra) hergestellt (5). Das pTetO-G-2-Konstrukt (4) wurde durch Isolieren eines 2,3-kb BamHI-DNA-Fragments enthaltend das Gen codierend für Puromycin-N-Acetyltransferase (purR; Lacalle et al., 1989 Gene 79: 379–384) unter der Kontrolle des HSV TK Promotors aus pTK-pur hergestellt. Das purR-codierende Fragment wurde anschließend in die einzige BgIII-Stelle abwärts von dem VSV-G Gen in pTetO-G-1 insertiert. Das pLTK-FIX-Konstrukt (5) wurde durch Legieren eines 1,5-kb EcoRI-DNA-Fragments enthaltend den Hund-Faktor IX cDNA (FIX) aus pLNCdFIX (Roman et al., 1992 Somat. Cell Genet. 18: 247–258) an das 3'-Ende eines 0,2-kb XbaI-DNA-Fragments, das den HSV TK Promotor verknüpft an vier Kopien des BIII-Verstärkers des Tyrosin-Aminotransferase-Gens aus ptat-TKCAT (Boshart et al., 1990 Cell 61: 905–916) hergestellt. Das 3'-Ende des FIX-codierenden Fragments wurde an das 5'-Ende eines 7-kb XhoI-SalI-DNA-Fragments von LPONL (Yee et al., 1994, supra) legiert. Das pTEPN-CAT-Konstrukt (6), das sowohl das Gen codierend für tTAER als auch TetO, einen durch tTAER induzierbaren Promotor, und das 1,9-kb XhoI-XbaI-DNA-Fragment enthaltend die TetO-CAT-Kassette enthielt, wurde aus pTetO-CAT isoliert und in die einzige XhoI-Stelle unmittelbar abwärts des Gens insertiert, welches für das Neomycin-Phosphotransferase(neo)-Gen in pTEPN codiert (6). Das pTEPN-G-Plasmid (6) wurde ähnlich konstruiert durch Insertion des 2,1-kb XhoI-DNA-Fragments enthaltend die TetO-G-Kassette, isoliert aus pTetO-G-1, in die einzige XhoI-Stelle in pTEPN.
Beispiel 2: Induzierbare Expression des Luciferase-Gens unter Verwendung des tTAER-induzierbaren Expressionssystems
Die Transaktivierungs-Funktion von tTAER wurde durch Co-Transfektion von humanen 293GP-Nierenzellen (293GP-Zellen) mit pCMV-tTAER und pUHC13-3 untersucht, das das lux-Gen von Glühwürmchen unter der Kontrolle eines minimalen Promotors enthält, der an sieben Tandem-Kopien von tetO verknüpft ist (Gossen et al., 1992, wie oben). Die humane 293GP-Nierenzelllinie exprimiert die Gag- und Pol-Proteine von MoMLV und ist bereits beschrieben worden (Burns et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033–8037; PCT veröffentlichte Anmeldung Nr. WO 92/05266, veröffentlicht 2. April 1992, die jeweils durch Inbezugnahme im Hinblick auf die Herstellung von Konstrukten codierend für die Gag- und Pol-Proteine von MoMLV (insbesondere das Konstrukt pSVgp, das die Expression von MoMLV Gag- und Pol-Proteine bereitstellt) und die Erzeugung der 293GP-Zelllinie, die das pSVgp-Konstrukt enthält und von der humanen Nierenzelllinie 293 abgeleitet ist (ATCC CRL 1573), in die vorliegende Beschreibung aufgenommen werden). Die Transfektion wurde nach dem Calciumphosphat-Co-Präzipitierungsverfahren durchgeführt (Graham et al., 1973, Virology, 52: 456–467). Die 293GP-Zellen, die tTAER enthielten (293GP/tTAER) wurden in Dulbecco's modifiziertem essentiellen Medium (DMEM) enthaltend 10% fötales Kalbsserum (FCS), 1 μg/ml Tetracyclin, 1 μg/ml Puromycin und 800 μg/ml Hygromycin aufbewahrt.
Die VSV-G-Expression wurde induziert, indem das Tetracyclin-enthaltende Medium entfernt wurde, die Zellen zweimal mit DMEM mit einer mindestens 30-minütigen Inkubation in DMEM zwischen den Waschvorgängen gewaschen wurden. Die Zellen wurden anschließend in DMEM/10% FCS enthaltend 17β-Östradiol in einer Konzentration von 2 μM aufbewahrt. Die Luciferase(lux)-Aktivität wurde in Zellextrakten detektiert, die wie folgt hergestellt wurden: Die Zellen wurden drei Zyklen von Gefrieren-Auftauen in Lyse-Puffer (0,1 M Kaliumphosphat/1 mM Dithiothreitol, pH 7,8) unterworfen, gefolgt von Zentrifugation bei Raumtemperatur für 3 Minuten, um den Zell-Debris zu entfernen. Die Lux-Aktivität wurde wie von de Wet et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 725–737 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 7 dargestellt. Die Zahlen über den Balken in dem Graph stehen für die relative x-fache Induktion durch Normalisierung der lux-Aktivität von jeder Bedingung im Vergleich zu dem Tetracyclin-enthaltenden Medium, das willkürlich auf 1 gesetzt wurde. Bei den Daten handelt es sich um den Mittelwert von zwei unabhängigen Versuchen.
Die Entfernung von Tetracyclin oder die Zugabe von Tetracyclin plus 17β-Östradiol aktivierte die lux-Expression; jedoch wurde die maximale lux-Expression nur nach simultaner Entfernung von Tetracyclin und Zugabe von 17β-Östradiol beobachtet (7). Die Beobachtung, dass tTAER für die maximale Induktions-Aktivät in 293GP-Zellen 17β-Östradiol erfordert, deutet darauf hin, dass die VP16-Transaktivierungs-Funktion durch die ER-Liganden-Bindungs-Domäne von tTAER reguliert wird. Ferner wird auch der negative Effekt der VP16-Aktivierungs-Domäne auf die allgemeine zelluläre Transkription (d. h. der "Unterdrückungs"-Effekt) durch die ER-Liganden-Bindungs-Domäne in tTAER reguliert, was eine verstärkte Effizienz bei der Isolierung von tTAER-exprimierenden Zelllinien in Abwesenheit von 17β-Östradiol ermöglicht.
Im Gegensatz zu den berichteten Schwierigkeiten bei der Herstellung von stabilen Klonen, die tTA exprimieren (Shocket et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6522–6526) zeigt die relativ einfache Herstellung von stabilen Klonen, die tTAER exprimieren, in dieser Studie, dass das vorliegende System für die induzierbare Expression der tet-regulatorischen Elemente und weiterer potentiell toxischer Gen-Produkte von Vorteil ist.
Beispiel 3: Expression von tTAER aus einem retroviralen Vektor
Der bicistronische retrovirale Vektor, pTEPN, wurde mit dem tTAER-Gen gefolgt von der internen Ribosomen-Eingangsstelle, die vom Poliovirus-Genom abgeleitet ist, und dem Neomycin-Phosphotransferase-Gen (neo) konstruiert (6). Die Expression beider Gene war unter der Kontrolle der MoMLV 5'-langen terminalen Wiederholung (long terminal repeat – LTR). Die humanen HT1080-Fibrosarcoma-Zellen (ATCC CCL 121) wurden co-transfektioniert mit pTEPN und mit pTetO-CAT, enthaltend das CAT-Gen unter der Kontrolle von tetO, das aus einem minimalen Promotor des CMV Immediate Early Gens verknüpft mit sieben Tandem-Kopien der tetR-Bindungs-Stelle aufgebaut ist (6).
Die G418-resistenten NT1080-Zellen wurden routinemäßig in 1 μg/ml Tetracyclin und 800 μg/ml G418 enthaltenden Medium aufbewahrt. Das Tetracyclin wurde durch Waschen der Zellen mit einem Medium ohne Tetracyclin und Inkubieren der Zellen bei 37°C für 30 Minuten entfernt. Der Waschvorgang wurde mindestens dreimal wiederholt. Für die Induktion der Gen-Expression wurden die Zellen in Phenol-rot-freiem DMEM enthaltend 10% Aktivkohle/Dextran-behandeltes fötales Kalbsserum und 2 μM 17β-Östradiol für 72 Stunden inkubiert, bevor der Zell-Extrakt hergestellt wurde. Ungefähr 48 Stunden nach der Transfektion wurde die CAT-Aktivität nach dem Verfahren von Sleigh bestimmt (Sleigh, M. J., 1986, Anal. Biochem. 156: 251–256). Eine 100 μl-Probe der Reaktionsmischung enthielt 150 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1,6 mM Chloramphenicol, 90 μM Acetyl-Coenzym A (Pharmacia), 1 μCi [¹⁴C]-Acetyl-Coenzym A (Amersham; 60 mCi/mmol) und 10 μl des Zell-Extrakts. Die Mischung wurde bei 37°C für 60 Minuten inkubiert, und das markierte Chloramphenicol wurde durch Flüssigszintillations-Zählung nach Extraktion in der Ethylacetatphase quantifiziert. Die Protein-Konzentration wurde nach dem Verfahren von Bradford bestimmt (Bradford, M. D., 1976, Anl. Biochem., 72: 248–254). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der 8 dargestellt. Die Zahlen über den Balken in dem Graph stellen die relative x-fache Induktion durch Normalisierung der CAT-Aktivität jeder Bedingung zu jener des Tetracyclin-enthaltenden Mediums dar, das willkürlich auf 1 gesetzt wurde.
Wie in der 8 dargestellt, wurde CAT-Expression in Gegenwart von Tetracyclin allein oder Tetracyclin plus dem Östrogen-Analogon 17β-Östradiol nicht aktiviert, in Übereinstimmung mit dem Modell, dass tTAER die DNA in Gegenwart von Tetracyclin nicht binden kann. Im Gegensatz zu der Transaktivierungs-Funktion von tTA, verfehlt tTAER die Aktivierung der CAT-Expression bei der Entfernung von Tetracyclin aus dem Kulturmedium. Die CAT-Expression wurde lediglich stark aktiviert, wenn Tetracyclin entfernt und 17β-Östradiol zu dem Kulturmedium zugegeben wurde. Diese Ergebnisse zeigen erneut, dass die Transaktivierungs-Funktion von VP16 in tTAER durch die ER-Liganden-Bindungs-Domäne in cis moduliert wird, und dass die Aktivität von tTAER unter der Kontrolle von sowohl Tetracyclin als auch 17β-Östradiol ist.
Beispiel 4: Etablierung von 293GP-Zellen, die stabil tTAER exprimieren
Um stabile tTAER-exprimierende Klone herzustellen, wurden 5 × 10⁵ 293GP-Zellen, die die Gag- und Pol-Proteine von MoMLV exprimieren (Yee et al., 1994, wie oben), mit 20 μg phyg-CMV-tTAER transfiziert, enthaltend das Hygromycin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle des HSV TK-Promotors und des tTAER-Gens unter Kontrolle des CMV-Promotors (5). Dreißig Hygromycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt und expandiert.
Um die stabile tTAER-Expression zu prüfen wurden Zellen, die von diesen dreißig Klonen abgeleitet waren, mit dem tetO-lux enthaltenden Konstrukt pUHC13-3 transfiziert. Die pUHC13-3-transfizierten Zellen wurden in Gegenwart von Tetracyclin oder 17β-Östradiol gehalten, und die lux-Aktivität wurde 48 Stunden nach der Transfektion bestimmt. Alle 30 Klone reagierten auf die 17β-Östradiol-Induktion mit steigenden lux-Aktivitäten im Bereich von 2-fach bis 90-fach, im Vergleich mit jener in Tetracyclin-enthaltendem Medium. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit der Vorhersage, dass tTAER weniger toxisch als tTA ist und dass stabile Zelllinien, die tTAER exprimieren, folglich leichter etabliert werden können.
Beispiel 5: Etablierung von 293GP-Verpackungs-Zelllinien für VSV-G-pseudo-typisierte retrovirale Vektoren
Der Klon, der im Beispiel 2 die höchste Induktionsstärke der lux-Aktivität erzeugte, wurde für die Einführung von pTetO-G-2 für eine induzierbare VSV-G-Expression ausgewählt. Ungefähr 5 × 10⁵ der vorstehend beschriebenen 293GP/tTAER-Zellen wurden mit 20 μg pTetO-G-2 transfiziert (5). Ungefähr 70 Puromycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt und expandiert. Die 293GP/tTAER/G-Zellen wurden in DMEM enthaltend 10% FCS, 1 μg/ml Tetracyclin, 1 μg/ml Puromycin und 800 μg/ml Hygromycin aufbewahrt. Ungefähr ein Drittel dieser Puromycin-resistenten Klone überlebten die Serien-Passage selbst in Gegenwart von Tetracyclin nicht, wahrscheinlich aufgrund der hohen basalen Niveaus der VSV-G-Expression.
Die übrigen Puromycin-resistenten Klone wurden auf induzierbare VSV-G-Expression mittels Immunoblot-Assay gescreent. Ungefähr 1 × 10⁵ Zellen von jedem Klon wurden nach 48 Stunden Inkubation in einem Medium enthaltend entweder 1 μg/ml Tetracyclin oder 2 μM 17β-Östradiol gesammelt und die Zellen wurden in 25 μl Puffer lysiert, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% Deoxycholsäure und 0,1% SDS enthielt. Ein μl des Extrakts wurde auf eine Nylon-Membran (Micron Separation Inc.) punktförmig aufgetragen und das VSV-G-Protein wurde mittels dem ECL Western Blotting System (Amersham) mit dem I1-monoklonalen Antikörper, spezifisch für VSV G (erhalten von John Holland, University of California in San Diego), detektiert. Die 17β-Östradiol-induzierbare VSV-G-Expression konnte in 34 Klonen bestätigt werden.
Die induzierbare Expression des VSV-G-Gens durch 17β-Östradiol wurde durch Untersuchung der VSV-G mRNA-Expression in zwei 293GP/tTAER/G-Klonen bestätigt (Klone 13 und 21). Kurz gesagt, parenterale 293GP/tTAER-Zellen (negative Kontrolle) und Zellen von zwei 293GP/tTAER/G-Klonen (Klone 13 und 21) wurden in Gegenwart von Tetracyclin oder 17β-Östradiol gezüchtet und die gesamte RNA wurde nach dem Verfahren von Chomczynski und Sacci isoliert (Chomczynski et al., 1987, Anal. Biochem. 162: 156–159). Die mRNA wurde unter Verwendung des polyATract-mRNA-Isolationssystems (Promega) isoliert, auf einem 2,2 M Formaldehyd/1% Agarose-Gel aufgetrennt, und auf eine Nylon-Membran (Micron Separation Inc.) transferiert. Die Membran wurde mit ³²P-markierten Sonen hybridisiert, hergestellt mittels dem statistisch-geprimten DNA-Markierungs-Kit (Boehringer Mannheim). Die Sonde für VSV-G wurde von einem 1,6-kb BamHI DNA-Fragement von pCMV-G enthaltend das VSV-G-Gen abgeleitet (6) (Yee et al., 1994, wie oben). Die Sonde für β-Actin von Kaninchen stammte von einem 2-kb PstI DNA-Fragment von pUCA1 ab (Cleveland et al., 1980, Cell, 20: 95–105).
Die VSV-G mRNA im Klon 13 war in Gegenwart von Tetracyclin nur schwach detektierbar. Nach 17β-Östradiol-Induktion stieg der Level von VSV-G mRNA dramatisch an. Im Gegensatz dazu war die VSV-G mRNA im Klon 21 in Gegenwart von Tetracyclin nicht detektierbar, konnte jedoch nach 17β-Östradiol-Induktion detektiert werden.
In Übereinstimmung mit den Levels von VSV-G mRNA führte die 17β-Östradiol-Induktion von Klon 13 zu schweren cytopathischen Effekten und dem Zell-Tod innerhalb von 4 Tagen, während die Zell-Morphologie vom Klon 21 unter den gleichen Bedingungen relativ normal blieb.
Beispiel 6: Induzierbare Produktion von VSV-G pseudo-typisierten retroviralen Vektoren auf 293GP/tTAER/G-Zellen
Die Zellen, die von den in Beispiel 6 beschriebenen Klonen 13 und 21 abstammen, wurden mit einem retroviralen Vektor LTK-FIX infiziert, der sowohl den Hund-Faktor IX cDNA als auch das Neomycin-Resistenz-Gen unter Kontrolle des HSV TK-Promotors enthielt (5). Der retrovirale Vektor LTK-FIX wurde durch Transfektion von 20 μg pCMV-G in 293GP-Zellen enthaltend Plasmid pLTK-FIX erzeugt. Der Virus wurde 60 Stunden nach der DNA-Transfektion geerntet und der erhaltene Virus wurde verwendet, um den Klon 13 und 21 zu infizieren. Nach zweiwöchiger G418-Selektion wurde die G418-resistenten Kolonien gepoolt und das Level der Zell-Oberflächen-VSV-G-Expression wurde bestimmt, indem die Zellen mit dem monoklonalen anti-VSV-G-Antikörper I1 umgesetzt, mit Fluorescein-Isothiocyanatkonjugierten Ziegen-anti-Maus-Immunglobulinen (Biosource) angefärbt, und die angefärbten Zellen durch Durchfluss-Cytometrie analysiert wurden, wie bereits beschrieben (Burns et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8033–8037).
Wie in der 9 dargestellt, war die Zell-Oberflächen-Expression von VSV-G in LTK-FIX-Virus-infizierten Klon 21-Zellen in Gegenwart von Tetracyclin nicht nachweisbar und wurde nach Entfernung von Tetracyclin und der Zugabe von 17β-Östradiol induziert. Im Gegensatz dazu wurde in den LTK-FIX-Virus-infizierten Klon 13-Zellen selbst in Gegenwart von Tetracyclin ein signifikanter Level von VSV-G-Expression detektiert, und der Level von VSV-G wurde nach 17β-Östradiol-Induktion weiter gesteigert. Die Level von VSV-G auf der Oberfläche von Zellen in Gegenwart von Tetracyclin oder 17β-Östradiol sind in guter Übereinstimmung mit dem Level von VSV-G mRNA in diesen beiden Klonen unter den gleichen Bedingungen (siehe Beispiel 5).
Beispiel 7: Herstellung von VSV-G pseudo-typisierten retroviralen Teilchen enthaltenden LTK-FIX codierende RNA aus 293GP/tTAER/G-Verpackungszellen
Der pseudo-typisierte Virus wurde aus Zellen der LTK-FIX-Virus-infizierten Klone 13 und 21 durch Züchten der Zellen in Tetracyclin-enthaltendem Medium bis zu einer Konfluenz von ungefähr 90% hergestellt. Diese Zellen wurden anschließend gewaschen und das Medium wurde in ein Tetracyclin-freies Medium mit oder ohne 17β-Östradiol geändert, wie vorstehend beschrieben. Der pseudo-typisierte Virus wurde zu unterschiedlichen Zeiten gesammelt (z. B. 48 Stunden und/oder 2, 4, 6 und 8 Tage nach der Infektion) und der Titer des Virus wurde durch Selektion von infizierten 208F-Rattenzellen in G418-enthaltendem Medium bestimmt. Virus-Stocks wurden auf das Vorliegen von Replikations-kompetentem Helfer-Retrovirus (replicationcompetent helper retrovirus – RCR) getestet, zuerst durch Amplifizierung der Virus-Stocks in NIH3T3-Zellen (ATCC CCRL 1658; gezüchtet in Glukose-reichem DMEM/10% FCS) für zwei Wochen, und Untersuchen auf das Vorliegen von RCR unter Verwendung des Marker-Rescue-Assays in HT1080/LSHL-Zellen (gezüchtet in Glukosereichem DMEM/10% FCS) wie beschrieben (Yee et al., 1994, wie oben).
Der LTK-FIX-Virus, hergestellt aus den infizierten Zellen der Klone 13 und 21, wurde nach 48 Stunden Inkubation in Tetracyclin- oder 17β-Östradiol-enthaltendem Medium geerntet und die Virus-Titer wurden mittels einer Infektion von 208F-Rattenzellen wie vorstehend beschrieben bestimmt, gefolgt von der Selektion von G418-resistenten Kolonien. Wie in der Tabelle 1 dargestellt, erhöht sich die Virus-Produktion in beiden Klonen nach 17β-Östradiol-Induktion. Obwohl der Klon 13 nach Induktion signifikant mehr VSV-G exprimiert, waren die Virus-Titer, die durch die beiden Klone erzeugt wurden, ähnlich. Der Grund dafür könnte in dem cytopathischen Effekt liegen, der durch die Über-Expression von VSV-G in Klon 13-Zellen nach 17β-Östradiol-Induktion erzeugt wird (siehe nachstehend). Der Befund, dass die Klon 13-abgeleiteten Zellen ungefähr 20-fach mehr Virus als Klon 21-abgeleitete Zellen in Gegenwart von Tetracyclin erzeugen, ist in Übereinstimmung mit den höheren Basal-Levels von VSV-G, die in Klon 13-Zellen unter der nicht-induzierten Bedingung exprimiert werden (Beispiel 5 und 9).
Tabelle 1 Induzierbare Erzeugung des pseudo-typisierten LTK-FIX-Virus
Die Tatsache, dass der Klon 13 detektierbare Mengen von VSV-G in Gegenwart von Tetracyclin exprimiert und mehr als sechs Monate in Kultur aufbewahrt werden kann, deutet darauf hin, dass humane 293-Zellen niedrige Levels von VSV-G-Expression tolerieren können. Trotz der höheren Level von VSV-G-Expression in Klon 13 als in Klon 21 nach Induktion sind jedoch die Virus-Mengen, die von den beiden Klonen erzeugt werden, 48 Stunden nach 17β-Östradiol-Induktion ähnlich zueinander (Tabelle 1 und 10). Dies kann auf den cytopathischen Effekt zurückgeführt werden, der im Klon 13 nach 17β-Östradiol-Induktion beobachtet wird, ein Effekt, der möglicherweise durch den relativ hohen Level von VSV-G-Expression verursacht wird. Die Toxizität von VSV-G ist wahrscheinlich das Ergebnis von dessen Expression auf der Zell-Oberfläche, die zur Bildung von Syncytia führt. Die Level von VSV-G-Expression in den Klonen 13 und 21 korrelieren gut mit dem beobachteten Ausmaß des cytopathischen Effekts in diesen Klonen nach der 17β-Östradiol-Induktion. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass ein niedrigerer Level von VSV-G-Expression wie jener in Klon 21-Zellen den Vorteil aufweisen könnte, dass die Produzentenzellen längere Zeiträume nach der 17β-Östradiol-Induktion überleben können, wodurch mehr pseudotypisierte Viren von den Produzentenzellen (producer cells) produziert werden.
Beispiel 8: Dauer der VSV-G pseudo-typisierten retroviralen Produktion aus 293GP/tTAER/G-Verpackungszellen
Das 17β-Östradiol nicht nur die Virus-Produktion sondern auch die VSV-G-Akkumulierung in Zellen induziert, welche zwangsläufig zum Zelltod führt, ist es wichtig, die Dauer der Virus-Produktion der Produzentenzellen nach der Induktion zu bestimmen. Vom Klon 21 oder Klon 13 abstammende Zellen wurden mit dem LTK-FIX-Virus infiziert und für die G418-Resistenz ausgewählt. Die G418-resistenten Kolonien wurden gepoolt und in DMEM (Raute), DMEM plus Tetracyclin (Kreis) oder DMEM plus 17βÖstradiol (Quadrat) für den in der 10 angegebenen Zeitraum inkubiert. Das Medium der gepoolten Zellen wurde alle 48 Stunden ausgetauscht und der Titer des akkumulierten Virus wurde zum angegebenen Zeitpunkt bestimmt; mittels Infektion von 208F-Rattenzellen gefolgt von einer Selektion in G418 enthaltendem Medium.
Das Kulturmedium von gepoolten LTK-FIX-Virus-infizierten Zellen vom Klon 21 wurde über einen Zeitraum von 16 Tagen gesammelt. Wie in 10 dargestellt, blieb der Virus-Titer aus den Klon 21-Zellen bei einem niedrigen, jedoch konstanten Level in Gegenwart von Tetracyclin über den gesamten Zeitraum. Im Gegensatz dazu führte die Induktion mit 17β-Östradiol zu einer schrittweisen Zunahme der Virus-Titer in Klon 21. Bis zwei Wochen nach der 17β-Östradiol-Induktion konnte kein cytopathischer Effekt festgestellt werden, eine Verzögerung, die auf den relativ niedrigen Level von VSV-G-Expression in Klon 21-abgeleiteten Zellen zurückgeführt werden kann (Beispiel 5 und 9).
Interessanterweise stiegen die viralen Titer von 10³ cfu/ml auf 4 × 10⁶ cfu/ml über einen Zeitraum von zwei Wochen nach Entfernung von Tetracyclin in Abwesenheit von 17β-Östradiol-Induktion (10, Klon 21). Nach drei Wochen Inkubation in diesem Medium trat ein Massenzelltod auf, begleitet von einer Reduktion des Virus-Titers. Der Grund für diese dramatische Zunahme der Virus-Titer ist zur Zeit nicht bekannt. Um zu bestimmen, ob die Zunahme im Virus-Titer aufgrund des Auftretens von Helfer-Virus-Kontaminierung stattfand, wurden die Virus-Stocks, die am Tag 14 und Tag 16 nach der 17β-Östradiol-Induktion gesammelt worden waren, in NIH3T3-Zellen amplifiziert, gefolgt von einem Marken-Rescue-Assay, wie vorstehend beschrieben. Unter Verwendung dieses Assays konnte kein Helfer-Virus detektiert werden.
Ähnliche Verfahren wurden angewendet, um die Dauer der Virus-Produktion aus den gepoolten LTK-FIX-Virus-infizierten Zellen vom Klon 13 zu bestimmen (10, Klon 13). Die Virus-Titer stiegen ungefähr 100-fach zwei Tage nach der 17β-Östradiol-Induktion. Jedoch nahmen die Titer mit anhaltender Inkubation in Gegenwart von 17β-Östradiol ab, diese Abnahme wurde von einer Zunahme der Anzahl von anscheinend toten Zellen begleitet. Die Zunahme des Zelltods findet wahrscheinlich aufgrund der Akkumulierung von hohen Levels von VSV-G nach 17β-Östradiol-Induktion in diesem Klon statt. Ähnlich zu den Klon 21-abgeleiteten Zellen stiegen die Titer von Klon 13-abgeleiteten Zellen in Abwesenheit von 17β-Östradiol weiter an für bis zu 8 Tage nach Entfernung von Tetracyclin (10).
Der LTK-FIX-Virus-Titer von individuell isolierten G418-resistenten Kolonien von infizierten Klon 21-Zellen wurde ebenfalls bestimmt (Tabelle 2). Die Entfernung von Tetracyclin und die Zugabe von 17β-Östradiol für 60 Stunden führte zu einer Zunahme des Virus-Titers um mehr als 3–4 Größenordnungen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Klon 13-abgeleiteten Zellen erhalten (Ergebnisse nicht dargestellt).
Tabelle 2 Die Virus-Titer erzeugt aus unabhängig isolierten Klonen von LTK-FIX-Virusinfizierten Klon 21-Zellen
Beispiel 9: Vergleich von viralen Titern, die durch transiente Transfektionsmethoden produziert werden, mit viralen Titern, die unter Verwendung des induzierbaren Expressionssystems gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden
Unter Verwendung des TLK-FIX-Konstrukts wurde das transiente Transfektionsverfahren zur Virus-Produktion mit der Virus-Produktion verglichen, bei der die stabilen Verpackungszelllinien-Klone 13 und 21 verwendet wurden. Die transiente Transfektion wurde mittels Co-Transfektion des LTK-FIX-Konstrukts mit pCMV-G (das VSV G aus dem CMV Immediate Early Gen Promotor exprimiert) in 293GP-Zellen nach der Calciumphosphat-Copräzipitierungsmethode durchgeführt (Graham et al., 1973, Virology, 52: 456–467). Sechzehn Tage nach der Transfektion wurde der Virus geerntet. Ein nach dem transienten Transfektionsverfahren hergestellter 293GP/LTK-FIX-Klon produzierte den LTK-FIX-Virus mit einem Titer von 3 × 10⁶ cfu/ml.
Im Gegensatz dazu wurde bei Verwendung des gleichen LTK-FIX-Vektor-Konstrukts ein Virus mit einem Titer von 4 × 10⁵ cfu/ml aus einer gepoolten Population von Virusproduzierenden Klon 21-Zellen 48 Stunden nach Einführung des TLK-FIX-Konstrukts in die Klon 21-Zellen erzeugt. Dieser letztere Ansatz gemäß der vorliegenden Erfindung weist nicht nur den Vorteil auf, dass der zeitaufwendige Schritt der Identifizierung von stark-produzierenden Klonen vermieden wird, es ist wahrscheinlich, wie in anderen Retrovirus-Produktionsverfahren, dass die Isolierung von optimalen Produzenten-Klonen sogar zu höheren Virus-Titern führen würde. Somit sind die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen beschriebenen Verpackungszelllinien für eine großtechnische Produktion von Viren in klinischer Qualität geeignet, insbesondere für Studien im Bereich der Human-Gen-Therapie.
Beispiel 10: Produktion von VSV-G pseudo-typisierten retroviralen Teilchen enthaltend β-Galactosidase-codierende RNA aus 293GP/tTAER/G-Verpackungszellen
Der retrovirale Vektor pLZRNL (Yee et al., 1994, wie oben; 5), der β-Galactosidase exprimiert, wurde zur Infizierung der 293GP/tTAER/G-Klone 13 und 21 eingesetzt, um Verpackungszelllinien zu produzieren, wobei die vorstehend für die Herstellung von LTK-FIX-Virus-produzierenden Zelllinien bechriebenen Verfahren angewendet wurden. Die LZRNL-produzierenden 293GP/tTAER/G-Produzentenzelllinien von Klon 13 und Klon 21 zeigten ähnliche virale Titer wie die vorstehend beschriebenen LTK-FIX293GP/tTAER/G-Produzentenzelllinien von Klon 13 und Klon 21. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Klone 13 und 21 als Verpackungszelllinien für die Produktion von VSV-G pseudo-typisierten retroviralen Vektoren dienen können.
Beispiel 11: Herstellung von HT1080-Zellen, die tTAER stabil exprimieren
Ein infektiöser TEPN-Virus wurde durch Transfektion des pTEPN-Plasmids in 293GP-Zellen durch Verwendung von Calciumphosphat-Copräzipitierung hergestellt (Graham et al., 1973, wie oben). Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurde der infektiöse TEPN-Virus geerntet und verwendet, um HT1080-Zellen zu infiziren. Siebzehn individuelle G418-resistente HT1080-Kolonien wurden ausgewählt und expandiert. Um die tTAER-Aktivität zu untersuchen, wurde das Plasmid pTetO-CAT in diese Klone transfiziert und die CAT-Expression wurde 72 Stunden nach der Transfektion bestimmt. Wie in der 11 dargestellt, wiesen sechzehn der siebzehn G418-resistenten HT1080-Klone eine CAT-Aktivität nur dann auf, wenn Tetracyclin entfernt und Phenol-rot-freies DMEM enthaltend 10% Aktivkohle/Dextran-behandeltes fötales Kalbsserum und 2 μM 17β-Östradiol zugegeben wurde. Das Ausmaß der Induktion variierte von 3-fach bis 40-fach (ein Mittelwert von 20-fach). Die Variation in der Induktion könnte die unterschiedlichen Levels von tTAER in jedem individuellen Klon aufgrund der statistischen Retrovirus-Integration in die Wirtszellen-Chromosome widerspiegeln. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe der ER-Liganden-Bindungs-Domäne die Transaktivierungs-Funktion von tTA unter die Regulation von Östrogen stellt. Da die Mehrheit der isolierten Klone tTAER exprimieren, wird ferner die Toxizität, die mit einer stabilen tTA-Expression verbunden ist, durch die Zugabe der ER-Liganden-Bindungs-Domäne gemildert.
Beispiel 12: Produktion von tTAER und induzierbare CAT-Expression aus einem einzelnen retroviralen Vektor in HT1080-Zellen
Zusätzlich zu der tTA-Toxizität leidet das tTA-basierende induzierbare System unter der Tatsache, dass die Etablierung von Zelllinien zwei Schritte benötigt und dass nur Zelllinien mit guten Transfektions-Wirksamkeiten einfach eingesetzt werden können. Daher wurde ein induzierbares Expressionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt, so dass stabile Produzenten-Klone unter Verwendung eines einzigen retroviralen Konstrukts in einem einzigen Transfektionsschritt hergestellt werden können.
Das pTEPN-CAT-Konstrukt (6), das sowohl die TetO-CAT-Kassette (unmittelbar abwärts von dem neo-Gen in pTEPN insertiert) als auch die CMV-tTAER-Kassette enthält, wurde in 293GP-Zellen unter Verwendung der Calciumphosphat-Copräzipitierung transfiziert (Graham et al., 1973, wie oben). Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurde ein infektiöser TEPN-CAT-Virus geerntet und zur Infizierung von HT1080-Zellen eingesetzt. Zwölf G418-resistente TEPN-CAT-HT1080-Klone wurden ausgewählt und expandiert, und die CAT-Expression wurde wie vorstehend beschrieben untersucht. In zehn von zwölf TEPN-CAT-HT1080-Klonen wurde die CAT-Expression nur nach Entfernung von Tetracyclin und Zugabe von 17β-Östradiol aktiviert (12). Die Induktion der CAT-Expression variierte von 8-fach bis 27-fach (ein Mittelwert von 15-fach). Die zwei Klone, die keine 17β-Östradiol-induzierte CAT-Expression zeigten, exprimierten die CAT-Aktivität in Levels nahe zum Hintergrund unter allen Bedingungen, möglicherweise als Ergebnis der Integration des retroviralen Vektors an eine Stelle, die für eine Gen-Expression ungünstig ist, oder aufgrund von Mutationen, die in das retrovirale Genom während dem Verfahren der reversen Transkription eingeführt worden sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass das induzierbare Gen-Expressionssystem in Säugerzellen mit hohen Wirkungsgraden über einen retroviral vermittelten Gen-Transfer transduziert werden kann. Ferner kann das vollständige Östrogen-induzierbare Expressionssystem enthaltend das tTAER-Gen und das durch den induzierbaren tetO-Promotor kontrollierte Ziel-Gen in eukaryotische Zellen mit einem einzigen retroviralen Vektor transduziert werden.
Beispiel 13: Induzierbare Expression von VSV-G in HT1080-Zellen unter Verwendung des tTAER-induzierbaren Systems in einem einzigen retroviralen Vektor
Das CAT-Gen in pTEPN-CAT wurde durch das VSV-G-Gen ersetzt, um das Konstrukt pTEPN-G zu erzeugen. Infektiöse TEPN-G-retrovirale Vektoren wurden aus 293GP-Zellen, die mit pTEPN-G transfiziert worden waren, hergestellt und zur Infektion von HT1080-Zellen verwendet, wie vorstehend im Beispiel 12 beschrieben. Die induzierbare Expression von VSV-G mit 17β-Östradiol konnte in dreißig von fünfunddreißig individuell abgeleiteten G418-resistenten TEPN-G 293GP-Klonen mittels Immunoblot-Analyse wie vorstehend beschrieben bestätigt werden.
Die VSV-G-Expression an der Zelloberfläche wurde in fünf dieser dreißig Klone TEPN-G 293GP-Klone wie vorstehend beschrieben mittels Durchfluss-cytometrische Analyse bestimmt. Wie in 13 dargestellt, exprimierten alle fünf Klone zweiundsiebzig Stunden nach der Entfernung von Tetracyclin und Zugabe von 17β-Östradiol signifikante Levels von VSV-G auf der Zelloberfläche. Im Gegensatz dazu konnte keine VSV-G-Expression auf der Zelloberfläche dieser gleichen Klone detektiert werden, wenn sie in Tetracyclin-enthaltendem Medium gezüchtet wurden.
Um zu bestimmen, ob die induzierbare VSV-G-Expression auf der Zelloberfläche aufgrund einer Zunahme des Levels des Transkripts, initiiert von dem tetO enthaltenden Promotor in dem TEPN-G-Virus, auftritt, wurde der Klon 24 in Tetracyclin- oder 17β-Östradiol-enthaltendem Medium gezüchtet, und die mRNA wurde isoliert und mittels Northern-blot-Analyse analysiert. Die Northern-blot-Analyse wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt, außer dass die Probe für das VSV-G-Gen von einem 1-kb KpnI-Fragment von pTetO-G-1 abgeleitet war (5).
Sowohl das 7,1-kb retrovirale genomische Transkript, initiiert von dem 5'LTR, als auch das 2,2-kb Transkript, initiiert von dem tetO enthaltenden Promotor, wurden mit der VSV-G-Gen-Probe in Zellen detektiert, die in Tetracyclin-enthaltendem Medium gezüchtet wurden (siehe 5 für die relativen Positionen des 7,1-kb- und 2,2-kb-Transkripts). Zusätzlich wurden wenigstens drei weitere kleine Banden mit einer Größe von 6,8 kb, 6 kb und 4,5 kb festgestellt. Da die 5'-Spleiß-Donor-Stelle von MoMLV in pTEPN-G beibehalten wurde, könnten diese kleineren Transkripte von der Verwendung dieser Spleiß-Donor-Stelle und den abwärts gelegenen kryptischen Spleiß-Akzeptor-Stellen stammen.
Nach der 17β-Östradiol-Induktion stiegen die Level der 7,1-kb-genomischen Transkripte in den TEPN-G NT1080-Zellen um etwa das 4-fache, während der Level des 2,2-kb-Transkripts unter den gleichen Bedingungen ungefähr um das 28-fache anstieg (bestimmt mittels densitometrischer Analyse). Die Zelloberflächen-Expression von VSV-G nach Induktion korrelierte folglich mit einer Zunahme der Transkription des VSV-G-Gens von dem tetO enthaltenden Promotor. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zelllinien, die Gene enthalten, die für potentiell toxische Gen-Produkte codieren, mit dem induzierbaren System, das in der vorliegenden Studie beschrieben ist, einfach etabliert werden können, und dass das induzierbare System in die Wirtszelle als ein einziges Konstrukt transferiert werden kann.
Diese mRNA-Expressionsstudien zeigen, dass die Wirkung des LTR-Verstärkers auf den tetO-enthaltenden Promotor in dem TEPN-G-Konstrukt, wenn überhaupt, minimal ist. Folglich bestehen nur wenig Bedenken, dass der tetO-enthaltende Promotor in dem retroviralen Konstrukt durch den MoMLV LTR-Verstärker, der in vielen Säuger-Zelltypen wirksam ist, zufällig aktiviert werden könnte. Die minimale LTR-Verstärker-unterstützte Transkription von dem induzierbaren tetO-Promotor könnte auf der Tatsache beruhen, dass der induzierbare tetO-Promotor außer der TATA-Box keine weiteren Regulationselemente aufweist, von denen eine LTR-Verstärkeraktivierte Transkription stattfinden könnte. Eine Transkriptions-Aktivierung des tetO-enthalten-den Promotors durch tTAER könnte aufgrund der großen Nähe der tetO-Stellen zum Promotor auftreten.
Überraschenderweise stiegen die Levels von mRNA, initiiert von dem 5'LTR, nach 17β-Östradiol-Induktion. Das Vorliegen von möglichen Östrogen-ansprechenden Elementen in dem MoMLV LTR könnte den beobachteten Anstieg begründen. Alternativ dazu könnte die starke Transaktivierungs-Domäne von VP16 in tTAER die LTR-Promotor-Aktivität nach Bindung von tTAER an die tetO-Stellen verstärken.

Claims

Nukleinsäuremolekül, codierend für einen multi-chimären Transaktivator, umfassend: eine erste Liganden-Bindungs-Domäne, wobei die Bindung eines ersten Liganden an die erste Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptionsaktivierung durch den multichimären Transaktivator inhibiert; eine eukaryotische Transkriptionsaktivierungs-Domäne; und eine zweite Liganden-Bindungs-Domäne, wobei die Bindung eines zweiten Liganden an die zweite Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptionsaktivierung durch den multichimären Transaktivator erleichtert; wobei der multi-chimäre Transaktivator die Transkription von einem induzierbaren Promotor aus erleichtert, wenn die erste Liganden-Bindungs-Domäne nicht an einen ersten Liganden gebunden ist und die zweite Liganden-Bindungs-Domäne an den zweiten Liganden gebunden ist.
Nukleinsäuremolekül von Anspruch 1, wobei die eukaryotische Transkriptionsaktivierungs-Domäne eine Transkriptionsaktivierungs-Domäne von VP16 ist.
Nukleinsäuremolekül von Anspruch 1 oder 2, wobei die erste Liganden-Bindungs-Domäne eine Tetracyclin-Repressor-Polypeptiddomäne ist; und die zweite Liganden-Bindungs-Domäne eine Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors ist.
Nukleinsäuremolekül von Anspruch 3, wobei der Steroidrezeptor ein Östrogen-Rezeptor ist.
Nukleinsäuremolekül von mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, welches ferner einen induzierbaren Promotor und eine Nukleotidsequenz, codierend ein Genprodukt von Interesse, in funktionstüchtiger Verknüpfung an den induzierbaren Promotor umfasst, wobei die Transkription von dem induzierbaren Promotor und die Expression des Genprodukts von Interesse durch den multi-chimären Transaktivator reguliert wird.
Nukleinsäuremolekül von mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, welches ein DNA-Molekül ist.
Nukleinsäuremolekül von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, welches ein RNA-Molekül ist.
Virus, umfassend das RNA-Molekül von Anspruch 7.
Eukaryotische Zelle, infiziert mit dem Virus von Anspruch 8.
Multi-chimärer Transaktivator, codiert durch das Nukleinsäuremolekül von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4.
Transformierte Zelle, umfassend das Nukleinsäuremolekül von mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verfahren zum Transformieren einer eukaryotischen Zelle, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der eukaryotischen Zelle in vitro mit einem Virus gemäß Anspruch 8 umfasst.
Verfahren von Anspruch 12, wobei die Zelle innerhalb einer Gruppe von Zellen vorliegt.
Virus von Anspruch 8 zur Verwendung in einem Verfahren zum Transformieren einer eukaryotischen Zelle durch Inkontaktbringen der Zelle in vivo mit dem Virus.
Virus von Anspruch 14, wobei das RNA-Molekül des Virus ferner eine Nukleotidsequenz, codierend für einen induzierbaren Promotor, und eine Nukleotidsequenz, codierend ein Genprodukt von Interesse, in funktionstüchtiger Verknüpfung an den induzierbaren Promotor umfasst, wobei die Transkription von dem induzierbaren Promotor und die Expression des Genprodukts von Interesse durch den multi-chimären Transaktivator reguliert wird.
Virus von Anspruch 15, wobei das Genprodukt ein endogenes humanes Protein ist.
Verfahren von Anspruch 12 oder 13 oder Virus von Anspruch 14, 15 oder 16, wobei die eukaryotische Zelle eine humane Zelle ist.
Induzierbares Expressionssystem, umfassend: (a) eine erste Nukleotidsequenz, codierend für einen multi-chimären Transaktivator, umfassend: (i) eine erste Liganden-Bindungs-Domäne, wobei die Bindung eines ersten Liganden an die Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptionsaktivierung durch den multichimären Transaktivator inhibiert; (ii) eine eukaryotische Transkriptionsaktivierungs-Domäne; und (iii) eine zweite Liganden-Bindungs-Domäne, wobei die Bindung eines zweiten Liganden an die zweite Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptionsaktivierung durch den multi-chimären Transaktivator erleichtert; (b) einen induzierbaren Promotor, wobei die Transkription von dem induzierbaren Promotor aus durch den multi-chimären Transaktivator aktiviert wird; und (c) eine zweite Nukleotidsequenz, wobei die zweite Nukleotidsequenz ein Genprodukt von Interesse codiert und funktionstüchtig an den induzierbaren Promotor geknüpft ist; wobei der multi-chimäre Transaktivator die Transkription der Nukleotidsequenz von Interesse von dem induzierbaren Promotor aus erleichtert, wenn die erste Liganden-Bindungs-Domäne des Transaktivators nicht an einen ersten Liganden gebunden ist und die zweite Liganden-Bindungs-Domäne des Transaktivators an einen zweiten Liganden gebunden ist.
Induzierbares Expressionssystem von Anspruch 18, wobei die erste Liganden-Bindungs-Domäne des Transaktivators eine Tetracyclin-Repressor-Polypeptiddomäne ist und die zweite Liganden-Bindungs-Domäne des Transaktivators eine Liganden-Bindungs-Domäne des Steroidrezeptors ist.
Induzierbares Expressionssystem von Anspruch 18, wobei die eukaryotische Transkriptionsaktivierungs-Domäne des Transaktivators eine Transkriptionsaktivierungs- Domäne von VP16 ist, und der induzierbare Promotor ein minimaler eukaryotischer Promotor mit mindestens einer Tetracyclin-Operator-Sequenz ist.
Induzierbares Expressionssystem von Anspruch 19, wobei der Steroidrezeptor ein Östrogenrezeptor ist.
Induzierbares Expressionssystem von mindestens einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die Nukleotidsequenz von Interesse für VSV G codiert.
Transformierte Zelle, umfassend das induzierbare Expressionssystem von mindestens einem der Ansprüche 18 bis 22.
Eukaryotische Zelle zum Verpacken eines pseudotypisierten retroviralen Vektors, wobei die Zelle umfasst: eine stabil chromosomal integrierte erste Nukleotidsequenz, codierend für ein retrovirales Gag-Polypeptid; eine stabil chromosomal integrierte zweite Nukleotidsequenz, codierend für ein retrovirales Pol-Polypeptid; eine dritte Nukleotidsequenz, codierend für ein Hüllprotein, in funktionstüchtiger Verknüpfung an einen induzierbaren Promotor; und eine vierte Nukleotidsequenz, codierend für einen multi-chimären Transaktivator wie definiert in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 und 18 bis 21, wobei die Transkription von dem induzierbaren Promotor aus durch den multi-chimären Transaktivator aktiviert wird.
GP293-Zelle, umfassend eine Nukleotidsequenz, codierend für einen multi-chimären Transaktivator, wobei der Transaktivator (i) eine Tetracyclin-Repressor-Polypeptiddomäne; (ii) eine eukaryotische Transkriptionsaktivierungs-Domäne; und (iii) eine Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors umfasst, wobei die Bindung von Steroid oder Steroidanalog an die Steroidrezeptor-Ligandenbindungs-Domäne die Transkriptionsaktivierung des induzierbaren Promotors durch den multi-chimären Transaktivator erleichtert.
GP293-Zelle von Anspruch 25, wobei die Zelle ferner eine Hüllen-codierende Nukleotidsequenz in funktionstüchtiger Verknüpfung an einen induzierbaren Promotor umfasst.
GP293-Zelle von Anspruch 26, wobei die Hüllen-codierende Nukleotidsequenz VSV G codiert.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter retroviraler Teilchen, wobei das Verfahren umfasst: Einführen in eine eukaryotische Zelle von (a) einer ersten Nukleotidsequenz, codierend für ein retrovirales Gag-Polypeptid, (b) einer zweiten Nukleotidsequenz, codierend für ein retrovirales Pol-Polypeptid, (c) einer dritten Nukleotidsequenz, codierend für ein Hüllprotein, wobei die dritte Nukleotidsequenz funktionstüchtig an einen induzierbaren Promotor geknüpft ist, und (d) einer vierten Nukleotidsequenz, codierend für einen multi-chimären Transaktivator, wobei der Transaktivator folgendes umfasst: (i) eine erste Liganden-Bindungs-Domäne, wobei die Bindung eines ersten Liganden an die erste Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptionsaktivierung durch den multichimären Transaktivator inhibiert; (ii) eine eukaryotische Transkriptionsaktivierungs-Domäne; und (iii) eine zweite Liganden-Bindungs-Domäne, wobei die Bindung eines zweiten Liganden an die zweite Liganden-Bindungs-Domäne die Transkriptionsaktivierung durch den multi-chimären Transaktivator erleichtert; Einführen eines rekombinanten retroviralen Genoms zum Einschluß in ein pseudotypisiertes retrovirales Teilchen in die Zelle; und Aussetzen der Zelle an eine ausreichende Menge an zweitem Ligand, um den multichimären Transaktivator zu binden und die Transkription vom induzierbaren Promotor aus zu erleichtern, während die Zelle an eine Menge an erstem Ligand ausgesetzt ist, welche nicht ausreicht, um die Transkription durch den multi-chimären Transaktivator zu inhibieren; wobei die Expression der ersten und zweiten Nukleotidsequenzen zur Expression der Gag- und Pol-Proteine führt, und das Binden des zweiten Liganden an den multichimären Transaktivator die Transkription vom induzierbaren Promotor aus aktiviert, was zur Herstellung des Hüllproteins führt und was zur Verpackung des rekombinanten retroviralen Genoms und zur Herstellung pseudotypisierter retroviraler Teilchen führt.
Verfahren von Anspruch 28, wobei die erste Liganden-Bindungs-Domäne des Transaktivators eine Tetracyclin-Repressor-Polypeptiddomäne ist und die zweite Liganden-Bindungs-Domäne des Transaktivators eine Liganden-Bindungs-Domäne eines Steroidrezeptors ist.
Verfahren von Anspruch 28 oder 29, wobei die eukaryotische Transkriptionsaktivierungs-Domäne des multi-chimären Transaktivators eine Transkriptionsaktivierungs-Domäne von VP16 ist, und die Liganden-Bindungs-Steroidrezeptordomäne eine Liganden-Bindungs-Domäne eines Östrogenrezeptors ist.
Verfahren von Anspruch 28, 29 oder 30, wobei die Expression der Gag- und Pol-Proteine konstitutiv ist.
Verfahren von mindestens einem der Ansprüche 28 bis 31 oder die Zelle von Anspruch 24, wobei das Hüllprotein VSV G ist.
Nicht-menschliches, transgenes Tier mit einer transgenen Nukleotidsequenz, codierend einen multi-chimären Transaktivator, wie definiert in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4.