JP2002506641A - レトロウイルスパッケージング細胞系 - Google Patents

レトロウイルスパッケージング細胞系

Info

Publication number
JP2002506641A
JP2002506641A JP2000536843A JP2000536843A JP2002506641A JP 2002506641 A JP2002506641 A JP 2002506641A JP 2000536843 A JP2000536843 A JP 2000536843A JP 2000536843 A JP2000536843 A JP 2000536843A JP 2002506641 A JP2002506641 A JP 2002506641A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
cells
acid sequence
viral
cell line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000536843A
Other languages
English (en)
Inventor
ヴァーマ，インダー，エム．
カフリ，タル
ブッシュマン，フレデリック
ハンセン，マーク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Salk Institute for Biological Studies
Original Assignee
Salk Institute for Biological Studies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Salk Institute for Biological Studies filed Critical Salk Institute for Biological Studies
Publication of JP2002506641A publication Critical patent/JP2002506641A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、パッケージング細胞系と、それから作製された組換えレンチウイルスまたはレトロウイルス、特に偽型のレトロウイルス粒子を提供する。本発明のパッケージング細胞系は、本明細書に記載の方法によりエンベロープタンパク質を誘導可能に発現することによって作られる。さらに、ウイルス核酸の標的（例えば、宿主）核酸への組込みに影響を及ぼす化合物のスクリーニングアッセイが開示される。このような化合物はウイルスインテグラーゼに対するその効果に基づいて同定される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、全般的には遺伝子送達に使用するための組換えレトロウイルス粒子
の分野、そしてより具体的には、レトロウイルス粒子を産生するためのパッケー
ジング細胞系に関する。
【０００２】発明の背景 レトロウイルスは、宿主細胞の感染後、そのRNAゲノムをDNA中間体またはプロ
ウイルスに逆転写するエンベロープRNAウイルスである。RNAゲノムを含有し、RN
A依存性DNAポリメラーゼを産生するウイルスは全てレトロウイルスファミリーに
含まれる。該ファミリーは３つのサブファミリー：（1）すべての腫瘍レトロウ イルス、および密接な関係を有するいくつかの非腫瘍ウイルスを含む、オンコウ
イルス亜科（Oncovirinae）；（2）ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびビスナウ イルスなどの「スローレトロウイルス」であるレンチウイルス亜科（Lentivirin
ae）；並びに(3)通常どんな臨床上の疾患も引き起こさずに持続的な感染を誘発 する、「泡沫状の」レトロウイルスである、スプマウイルス亜科(Spumavirinae)
に分けられる。レトロウイルスは、該ウイルスゲノムによってコードされる少な
くとも3つのタイプのタンパク質、すなわちgagタンパク質（群抗原内部構造タン
パク質）、polタンパク質（RNA依存性DNAポリメラーゼならびにプロテアーゼお よびインテグラーゼタンパク質）、およびenvタンパク質（ウイルス性エンベロ ープタンパク質またはタンパク質群）を含有する。gag、polおよびenvタンパク 質をコードしている遺伝子に加えて、レトロウイルスには、ゲノムは、２つの長
い末端反復(Long terminal repeat；LTR)配列を、１つはウイルスの5'末端にも う１つは3'末端に含む。これらの5'および3'LTRはウイルスmRNAの転写およびポ リアデニル化を促進し、宿主の細胞性DNAへのウイルスゲノムの組込みに関与す る。
【０００３】 プロウイルスは、宿主の細胞性DNA中に安定に組み込まれ得る。続いて、プロ ウイルスによってコードされる遺伝子産物は、宿主細胞によって発現され、レト
ロウイルスビリオンを産生し、そうしてウイルスを複製する。標的細胞内で発現
させるための目的の外因性ヌクレオチド配列を含ませるようにレトロウイルスゲ
ノムを操作することができるので、レトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞へ
の安定な遺伝子導入のための重要なツールである。提案された多くの遺伝子治療
の応用で、感受性の標的細胞内に組換えヌクレオチド配列を導入して効率的に発
現させる、これら天然の感染病原因子の能力の利点を得るために、レトロウイル
スを使用する。このような応用において使用するために好適なレトロウイルスベ
クターは一般的に、標的細胞への感染、RNAゲノムの逆転写、および逆転写され たDNAの標的細胞ゲノムへの組込みをする能力があるが、標的細胞内で複製して 感染性のレトロウイルス粒子を産生する能力はない、欠陥レトロウイルスベクタ
ーである（たとえば、標的細胞に導入されたレトロウイルスゲノムはgagおよび ／またはpolで欠陥がある。Coffin, J.,「RNA腫瘍ウイルス（RNA Tumor Viruses
）」Weiss, R.ら（編）、Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 2,pp. 36-7
3, 1985を参照されたい）。
【０００４】 レトロウイルスベクターおよびパッケージング細胞(ヘルパー細胞；helper ce
ll)は、複製する感染性ウイルスを産生する危険なく、組換え核酸分子を哺乳動 物細胞に導入するために開発されてきた。この方法論は2つの構成要素、レトロ ウイルスベクターおよびパッケージング細胞を使用する。レトロウイルスベクタ
ーは、長い末端反復配列(LTR)、導入すべき外来DNA、およびパッケージング配列
を含む。このレトロウイルスベクターは、単独では複製しない。なぜなら、構造
タンパク質およびエンベロープタンパク質をコードする遺伝子が該ベクター内に
含まれていないからである。該パッケージング細胞は、gag、polおよびenvタン パク質をコードする遺伝子を含有するが、パッケージングシグナルを含有しない
ので、細胞は単独では空のウイルス粒子しか形成することができない。この方法
を用いて、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入し、ウイルスを
産生することができる細胞を作製する。該細胞は、レトロウイルスベクターDNA のみを含むウイルス粒子を作製し、そのため安全であると考えられている。
【０００５】 レトロウイルスベクターの使用は多くの態様において制限される。例えばレト
ロウイルスは、急速に分裂する細胞のゲノム中には、効率的に感染し、安定に組
み込むことができるが、分裂しない細胞またはゆっくり分裂する細胞のゲノム中
へのレトロウイルスの組込みは非効率的である（Springettら、1989 J. Virol.
63:3865-3869; Millerら、1990 Mol. Cell. Biol. 10:4239-4242; Roeら、1993
EMBO J. 12:2099-2108）。ほとんどのパッケージング系は中程度のベクター力価
しか示さず、レトロウイルスベクター粒子のもろさにより精製および濃縮が複雑
になる（Paulら、1993 Hum. Gene Therap.4:609-615）。最後に、レトロウイル
スは、レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質(env遺伝子によりコードされ
る)の特定の標的細胞表面受容体への結合によって標的細胞に侵入する。このエ ンベロープタンパク質−細胞表面受容体相互作用は、しばしば種特異的であり、
ある場合には組織特異的でさえある。さらに、標的細胞における細胞表面受容体
の発現レベルは、標的細胞間で大幅に異なり得る。その結果、レトロウイルスは
通常、宿主域が制限される（Kavanaughら、1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:7071-7075；Hopkins 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8759-8760）。
【０００６】 レトロウイルスの宿主細胞域を広げるため、およびレトロウイルスビリオンの
構造的安定性を増大させるための一つの方法には、偽型レトロウイルス性ウイル
スベクターの産生が含まれる。標的細胞の形質転換において有用な偽型レトロウ
イルスベクターは一般的に、レトロウイルスのビリオン構造タンパク質（例えば
、gagタンパク質）、目的のヌクレオチド配列を含む組換えRNAゲノム、ビリオン
に含有される組換えRNAを逆転写するためのpolタンパク質、および非レトロウイ
ルス性エンベロープタンパク質または別のレトロウイルス由来のエンベロープタ
ンパク質からなる。該組換えRNAゲノムは通常、複製における欠陥、例えば、pol
および／またはgag遺伝子の欠陥を有し、これは目的のヌクレオチド配列の標的 細胞への導入に続く感染性レトロウイルスの産生を阻害する。偽型レトロウイル
スのエンベロープタンパク質は標準的には、幅広い宿主域を提供するように、ま
たは感染させようとする細胞に対する選択的な標的性を示すように選択する。
【０００７】発明の概要 本発明は、パッケージング細胞系、およびそれから産生された組換えレトロウ
イルス粒子、特に偽型レトロウイルス粒子を提供する。典型的なパッケージング
細胞系は、293 HeLa細胞、Cf2Th細胞、D17細胞、MDCK細胞、またはBHK細胞、最 も好ましくは293細胞に由来する。レトロウイルス粒子は、目的のエンベロープ タンパク質（例えば、レトロウイルスエンベロープまたは水疱性口内炎ウイルス
（VSV G）のエンベロープタンパク質）を誘導的に発現することによって産生さ れる。エンベロープタンパク質の誘導的な発現は、エンベロープタンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列を誘導性プロモーター（例えば、大腸菌のテトラサイ
クリン耐性オペロンTn10のテトラサイクリンリプレッサー(tetR)に対する結合部
位である、tetOの少なくとも１つのコピーに連結された最小プロモーターからな
るプロモーター）に機能的に連結させることによって達成される。誘導性プロモ
ーターからの発現は、該誘導性プロモーターからの転写を負に調節する第1のリ ガンド結合ドメイン（例えば、原核生物のテトラサイクリンリプレッサーポリペ
プチド(tetR)）から構成されるトランス活性化因子によって調節される。誘導性
プロモーターの制御下におけるエンベロープをコードするヌクレオチド配列の転
写は、テトラサイクリンが存在しない場合はトランスアクチベーターによって活
性化される。
【０００８】 本発明の主要な目的は、レトロウイルス粒子、特に偽型レトロウイルス粒子を
従来のパッケージング細胞系よりもより効率的に（例えば、より高い力価で）産
生するパッケージング細胞系を提供することである。本発明のパッケージング細
胞系は、第1の誘導性プロモーターに機能的に連結されたHIVゲノム（ここでHIV ゲノムはシス作動性エレメントと自己複製と、機能性Envタンパク質の発現とに 欠陥がある）を有する第1のポリヌクレオチド、第2の誘導性プロモーターに機能
的に連結された機能性異種Envタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド、
ならびに第1および第2の誘導性プロモーターからの転写を制御する調節可能な転
写アクチベーターをコードする第3のポリヌクレオチド、によって特徴付けられ る。
【０００９】 本発明の別の目的は、in vitroおよびin vivo両方での標的細胞の形質転換に おいて有用な組換えレトロウイルスベクター、特に偽型レトロウイルスベクター
を提供することである。
【００１０】 本発明の有利な点は、細胞のゲノム中に安定に組み込まれたエンベロープをコ
ードするヌクレオチド配列（該配列は誘導的に発現され得、そうして、一方では
宿主細胞(例えばVSV G)に有毒なエンベロープタンパク質を発現する能力のある パッケージング細胞系の産生を可能にする）を含むパッケージング細胞系を産生
できることである。本発明の別の有利な点は、該パッケージング細胞系が、複製
する能力を有するレトロウイルスを産生する可能性がないことである。
【００１１】 別の実施形態においては、本発明はパッケージング細胞系を産生するための方
法を提供する。該方法は、i) 第1の誘導性プロモーターに機能的に連結されたHI
Vゲノム（ここでHIVゲノムはシス作動性エレメントと自己複製と、機能性Envタ ンパク質の発現とに欠陥がある）を有する第1のポリヌクレオチド；ii)第2の 誘
導性プロモーターに機能的に連結された機能性異種Envタンパク質をコードする 第2のポリヌクレオチド、ならびにiii)第1および第2の誘導性プロモーターから の転写を制御する、調節可能な転写アクチベーターをコードする第3のポリヌク レオチド、を用いて適当な細胞をトランスフェクトすること、並びに上記のトラ
ンスフェクトした細胞を、該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
を含有する細胞についてスクリーニング可能な条件下で培養することを含む。好
ましくは、該細胞を抗生物質耐性遺伝子のような、選択マーカーをコードするポ
リヌクレオチドで共トランスフェクトする。
【００１２】 別の実施形態においては、本発明は、標的核酸配列を固相支持体に可逆的に固
定し、ウイルス核酸配列の標的核酸配列への組込みを可能にする条件下でおよび
十分な時間にわたり、該標的核酸をウイルス核酸配列を含有するウイルス組込み
前複合体（PIC）と接触させ、そして、組み込まれたウイルス核酸配列を検出す ることによって、標的の核酸配列に組み込まれたウイルス核酸配列を検出する方
法を提供する。
【００１３】 さらに別の実施形態において、本発明は、ウイルス組込み前複合体(PIC)内に 含まれるウイルスインテグラ−ゼ活性を検出する方法を提供する。該方法は、標
的核酸配列を固相支持体に可逆的に固定すること、ウイルス核酸配列の標的核酸
配列への組込みを可能にする条件下でおよび十分な時間にわたり、標的核酸配列
をウイルス核酸配列を含むウイルス組込み前複合体（PIC）に接触させること、 並びに組み込まれたウイルス核酸配列を検出することを含む。標的核酸配列中の
ウイルス核酸配列の存在は、インテグラ−ゼ活性を示す。
【００１４】 さらなる実施形態において、本発明は組込み前複合体(PIC)に含まれるウイル スインテグラ−ゼ活性に影響を及ぼす化合物の同定方法を提供する。該方法は、
標的核酸配列を固相支持体に可逆的に固定すること、ウイルス核酸配列の標的核
酸配列への組込みを可能にする条件下でおよび十分な時間にわたり、標的核酸配
列をウイルス核酸配列およびインテグラ−ゼ活性に影響を及ぼすと推測される試
験化合物を含むウイルス組込み前複合体（PIC）に接触させること、ならびに組 み込まれたウイルス核酸配列を検出することを含む。標的核酸配列中に組み込ま
れたウイルス核酸配列の量は、該化合物がインテグラ−ゼ活性に及ぼす影響を示
す。
【００１５】 これらまたは他の本発明の目的、有利な点および特徴は、以下にさらに十分に
記載したベクター、細胞系および方法論の詳細を読むことで当業者には明らかと
なるであろう。
【００１６】好ましい実施形態の説明 本発明の誘導性発現系以前は、VSV Gの偽型であるレトロウイルスベクターの ためのパッケージング細胞系を産生するための誘導性発現系および構築物の使用
、ベクター粒子、ならびにそれに関連するパッケージング細胞系が記載され、本
発明が、当然多様であり得るのものとして記載された特定の方法論、プロトコル
、細胞系、レトロウイルス、ベクター、構築物および試薬に限定されないことが
理解されよう。また、本明細書で使用した専門用語は、特定の実施形態のみを記
載する目的のものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範
囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されよう。
【００１７】 本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数の形態「一つ
の（a）」、「および」、および「該」は、文脈が明らかにそうでないと述べて いない限りは複数の指示物を含むことに注意されなければならない。従って、例
えば「一つのパッケージング細胞（a packaging cell）」という言及はこのよう
な細胞の複数を含み、「該レトロウイルスベクター」という言及は、1以上のベ クターおよび当業者に公知のその等価物ならびにその他を含む。
【００１８】 別に定義されていなければ、本明細書中で使用されるすべての技術用語および
科学用語は、本発明が属する当業者に共通に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に記載されたものと類似または等価である、どんな方法、装置および材
料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法
、装置および材料をここに記載する。
【００１９】 本明細書に記載した発明に関連して使用し得る、刊行物に記載された細胞系、
ベクターおよび方法論を記載および開示する目的のために、本明細書で記載した
すべての刊行物を参照により本明細書に組み入れる。上記および本文を通じて検
討された刊行物は、もっぱら本出願の出願日に先んじた開示であるため、提供さ
れる。本明細書中で、本発明者らが先発明の利益によってこのような開示に先立
つものであると言う資格を有しないという承認として解釈されるものは何もない
。
【００２０】定義 「誘導性発現系」とは、トランスアクチベーターをコードするヌクレオチド配
列、トランスアクチベーターによって転写を活性化され得る誘導性プロモーター
、および誘導性プロモーターに機能的に連結された目的のヌクレオチド配列を含
む、構築物および構築物の組み合わせを意味する。例えば、本発明の典型的な誘
導性発現系は、テトラサイクリンオペロン調節可能トランスアクチベーター(tTA
)をコードするヌクレオチド配列および少なくとも1つのtetO配列に機能的に連結
された最小プロモーターから構成される誘導性プロモーターに機能的に連結され
た目的のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】 「トランスアクチベーター」、「トランス活性化因子」または「転写アクチベ
ーター」とは、プロモーターからの転写を促進するポリペプチドを意味する。プ
ロモーターが誘導性プロモーターである場合は、トランスアクチベーターは特定
の転写シグナルまたは転写シグナルのセットに応答して転写を活性化する。例え
ば、本発明の誘導性発現系においては、tTAがテトラサイクリンに結合しないと きは、tTAが誘導性tetOプロモーターからの転写を促進するトランスアクチベー ターである。
【００２２】 「テトラサイクリンリプレッサータンパク質」、「テトラサイクリンリプレッ
サーポリペプチド」「tetRポリペプチド」および「tetRタンパク質」は、本明細
書中で相互交換可能に使用され、1)テトラサイクリンおよび／またはテトラサイ
クリン誘導体への特異的な結合、並びに2)tetRポリペプチドがテトラサイクリン
またはテトラサイクリン類似体に結合していないときのtetO配列への特異的な結
合、の両方を示すポリペプチドを意味する。「tetRポリペプチド」は、自然に生
じる（すなわち、天然の）tetRポリペプチド配列およびその機能性誘導体を含む
ことを意味する。
【００２３】 「転写活性化ドメイン」とは、プロモーターからの転写活性化を促進するポリ
ペプチド配列を意味する。「転写活性化ドメイン」は自然に生じる転写因子なら
びにその機能性誘導体のアミノ酸配列に由来する転写活性化ドメインを含む。
【００２４】 「エンベロープタンパク質」とは、1)レトロウイルスのエンベロープに組み込
まれ得るポリペプチド、2)標的細胞に結合し、該ポリペプチドが被包するRNAウ イルスによって標的細胞の感染を促進するポリペプチド、を意味する。「エンベ
ロープタンパク質」は自然に生じる（すなわち天然の）エンベロープタンパク質
およびその機能性誘導体であって、1)本発明に従って偽型レトロウイルスビリオ
ンを形成することができ、そして2)所望の機能的特性を示す（例えば、所望の標
的細胞のウイルス感染を促進する、および／または異なる若しくは追加の生物学
的活性を示す）ものを含むことを意味する。一般的に、本発明における目的のエ
ンベロープタンパク質は、レトロウイルスゲノム、レトロウイルスPol、レトロ ウイルスGagおよびその他必須のレトロウイルス構成要素と組み合わさって、レ トロウイルス粒子を形成し得るどんなウイルス性エンベロープタンパク質をも含
む。このようなエンベロープタンパク質は、任意の好適なレトロウイルス（例え
ば、両種指向性、他種指向性、同種指向性または多向性のレトロウイルス）に由
来するレトロウイルス性エンベロープタンパク質、ならびに偽型レトロウイルス
ビリオン（例えばVSV G）を形成し得る非レトロウイルス性エンベロープタンパ ク質も含む。特に重要なエンベロープタンパク質として、限定するものではない
が、水疱性口内炎ウイルス（VSV G）、HTLV-1、テナガザル白血病ウイルス（GAL
V）、Sindaiウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ラブドウ イルスおよび狂犬病ウイルスのエンベロープタンパク質が含まれる。
【００２５】 「ポリペプチドの機能性誘導体」とは、自然に生じるポリペプチドと比較して
付加、欠失、置換、またはその他のアミノ酸配列の改変の効果によって変更され
ている、自然に生じるポリペプチドに由来するアミノ酸配列を意味する。本明細
書中で意図する「機能性誘導体」は、自然に生じるポリペプチドの、本発明の実
施にとって必須の特徴を示す。例えば、「tetRの機能性誘導体」とは、tetRに由
来するポリペプチドであって、1)テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似
体の結合並びに2)テトラサイクリンまたはその類似体に結合したときにtTAによ る転写活性化を阻害する能力、の両方を保持するものを意味する。
【００２６】 「プロモーター」とは、機能的に連結されているDNA配列の転写を指令するの に十分な最小DNA配列を意味する。用語「プロモーター」はまた、細胞型に特異 的な発現、組織特異的な発現について制御可能であるかまたは外因的なシグナル
もしくは因子によって誘導可能である、プロモーター依存性の遺伝子発現に十分
なプロモーター要素（このような要素は自然に生じる遺伝子の5'または3'領域に
位置し得る）を包含することをも意味する。
【００２７】 「誘導性プロモーター」とは、転写アクチベーターに結合すると転写的に活性
となり、次に特定の条件下で、例えば、転写アクチベーターの誘導性プロモータ
ーへの結合に作用するおよび／または転写アクチベターそのものの機能に作用す
る、特定の化学シグナルまたは化学シグナルの組み合わせの存在下で、活性化さ
れるプロモーターを意味する。例えば、本発明の転写アクチベーターtTAは、テ トラサイクリンが存在しない時、すなわちテトラサイクリンがtTAに結合してい ないとき、対応する誘導性プロモーターから転写を誘導する。
【００２８】 「構築物」とは、特定のヌクレオチド配列を発現させる目的で作製された、ま
たは他の組換えヌクレオチド配列の構築において使用する、組換えヌクレオチド
配列、一般的には組換えDNA分子を意味する。一般的に、「構築物」は本明細書 中で組換えDNA分子について言うために使用される。
【００２９】 「機能的に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写アクチベータータン
パク質）が調節配列に結合する場合に、遺伝子発現が可能となるように、DNA配 列および調節配列が連結されていることを意味する。
【００３０】 「機能的に挿入された」とは、目的のヌクレオチド配列が、導入された目的の
ヌクレオチド配列の転写および翻訳を指令するヌクレオチド配列に隣接して配置
されていることを意味する（すなわち、例えば目的のDNAによってコードされる ポリペプチドなどの産生を促進する）。
【００３１】 「パッケージング細胞系」とは、欠陥レトロウイルスベクターを、一般的に組
織培養培地1mLあたり103個のビリオンより大きい力価でパッケージングする能力
について選択されたパッケージング細胞系であって、組織培養培地1mLあたり10 個以下のヘルパーウイルスビリオンを有し、欠陥レトロウイルスをパッケージン
グする能力を失うことなく組織培養培地中で継代する能力のあるパッケージング
細胞系を意味する。
【００３２】 「形質転換」とは、新たなDNA（すなわち該細胞に対し外来性のDNA）の組込み
に続いて細胞に誘導される、永続性のまたは一過性の遺伝的変化、好ましくは永
続性の遺伝的変化を意味する。該細胞が哺乳動物細胞である場合は、永続性の遺
伝的変化は、一般的に、該細胞のゲノム中へのDNAの導入によって達成される。
【００３３】 「標的細胞」とは、本発明の方法および組成物を用いて形質転換される細胞を
意味する。標的細胞を非選択的または選択的に形質転換するように形質転換を設
計することができる。一般に、本明細書で用いる標的細胞は、本発明によるVSV
G偽型レトロウイルスベクターに感染し得る真核細胞を意味する。
【００３４】 「形質転換細胞」とは、組換えDNA技術によって、目的(例えば、治療的細胞産
物をコードする核酸)の遺伝子産物（例えば、RNAおよび／またはタンパク質）を
コードするDNA分子を導入された細胞（またはその祖先）を意味する。
【００３５】 「目的のヌクレオチド配列」または「目的のDNA」とは、宿主細胞における発 現（例えば、該標的細胞におけるタンパク質または他の生体分子（例えば、治療
的細胞産物）の産生）に望ましいタンパク質または他の分子をコードする任意の
ヌクレオチドまたはDNA配列を意味する。一般的には、目的のヌクレオチド配列 は、その発現にとって必要な他の配列（例えば、プロモーター）に機能し得る形
で連結される。一般に、本発明の組換えレトロウイルス粒子のゲノムに存在する
目的のヌクレオチド配列は、任意の目的の遺伝子産物、通常は治療的遺伝子産物
をコードし、組換えレトロウイルス粒子を用いて、in vivoにおいて（例えば、 ヒトにおける遺伝子療法の適用において）細胞を形質転換する。
【００３６】 「治療的遺伝子産物」とは、標的細胞において発現されたとき、所望の治療効
果、例えば、該標的細胞ゲノムにおける遺伝的欠陥の修復（例えば、相補性によ
る）、所望の生物学的活性を有するポリペプチドの発現、および／またはアンチ
センス療法（例えば、該標的細胞ゲノムにおける内因性遺伝子または異種遺伝子
の発現の調節）のためのRNA分子の発現をもたらすポリペプチド、RNA分子または
他の遺伝子産物を意味する。
【００３７】 「被験体」または「患者」とは、細胞形質転換または遺伝子療法が望まれる任
意の被験体を意味し、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、マウス、
昆虫、ウマ、ニワトリ、および本明細書に記載されたVSV Gを含むエンベロープ または他のエンベロープを有するウイルスベクターに感染し得る細胞を有する任
意の他の属または種が含まれる。
【００３８】 「トランスジェニック生物」とは、その細胞の一部に染色体外因子として存在
するか、またはその生殖細胞系DNA中に安定的に組込まれた、非内因性の（すな わち、異種の）核酸配列を有する、ヒトでない生物（例えば、単細胞生物（例え
ば、酵母）、哺乳動物、非哺乳動物（例えば、線虫またはショウジョウバエ））
を意味する。
【００３９】 「トランスジェニック動物」とは、その細胞の一部に染色体外因子として存在
するか、またはその生殖細胞系DNA中に安定的に組込まれた（すなわち、その細 胞のほとんどまたは全てのゲノム配列において）、非内因性の（すなわち、異種
の）核酸配列を有する、ヒトでない動物、通常は哺乳動物を意味する。例えば、
宿主動物の胚細胞または胚性幹細胞の遺伝子操作により、かかるトランスジェニ
ック動物の生殖細胞系中に異種核酸を導入する。
【００４０】 「ウイルスベクター」とは、目的のヌクレオチド配列による標的細胞の形質転
換を達成する組換えウイルス粒子を意味する。
【００４１】 「ビリオン」、「ウイルス粒子」、または「レトロウイルス粒子」とは、RNA ゲノム、Polタンパク質（感染後のRNAゲノムの逆転写のためのもの）、Gagタン パク質（ヌクレオキャプシドに存在する構造タンパク質）、およびエンベロープ
タンパク質から最小限に構成される単一のウイルスを意味する。本明細書で用い
る、レトロウイルス粒子のRNAゲノムは、通常は組換えRNAゲノムであり、例えば
、天然のレトロウイルスゲノムに対して外因性のRNA配列を含有し、および／ま たは内因性レトロウイルス配列に欠陥を有する（例えば、pol、gag、および／ま
たはenvに欠陥を有し、本明細書で用いるように、通常は３つの遺伝子の全てに 欠陥を有する）。
【００４２】 「偽型ウイルス粒子」または「偽型レトロウイルス粒子」とは、該RNAゲノム を誘導するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を有する
ウイルス粒子を意味する。該エンベロープタンパク質は、該RNAゲノムを誘導す るレトロウイルスとは異なる種のレトロウイルスまたは非レトロウイルス（例え
ば、水疱性口内炎ウイルス（VSV））に由来するものであり得る。好ましくは、 偽型レトロウイルス粒子のエンベロープタンパク質は、VSV Gである。
【００４３】 「VSV G」または「VSV Gエンベロープタンパク質」とは、水疱性口内炎ウイル
ス（VSV）のエンベロープタンパク質、またはそれから誘導されたポリペプチド 、または異種ポリペプチド配列に融合されたVSV Gポリペプチド配列を有する組 換え融合ポリペプチド、を意味する。組換え融合ポリペプチドのVSV G由来ポリ ペプチドは、偽型レトロウイルス粒子のウイルスエンベロープ中に含有させるこ
とができ、所望の標的細胞（例えば、様々な所望の真核細胞、または目的の特定
の標的細胞）に対する感染性を保持している。
【００４４】 「VSV G偽型ウイルス」、「VSV G偽型レトロウイルス」、「VSV G偽型ウイル ス粒子」、または「VSV G偽型レトロウイルス粒子」とは、例えば、内因性レト ロウイルスエンベロープと共に、またはそれに実質的に置換された、エンベロー
プタンパク質VSV Gを有するレトロウイルスを意味する。VSV Gは、VSV Gがエン ベロープ中に存在するエンベロープタンパク質の約50％、より好ましくは約75％
、さらに好ましくは約90％〜約95％、さらにより好ましくは約95％以上、最も好
ましくは100％に相当するか、またはVSV Gが偽型ウイルス粒子中に存在する実質
的に唯一のエンベロープタンパク質であるようにVSV G偽型ウイルスエンベロー プ中に存在するのが好ましい。
【００４５】 ここで、本発明をさらに詳細に説明する。
【００４６】パッケージング細胞系およびトランスアクチベーター 第１の実施形態においては、本発明は、第１の誘導性プロモーターに機能し得
る形で連結されたHIVゲノムを有する第１のポリヌクレオチド（該HIVゲノムは、
シス作動性エレメント、自己複製、および機能的Envタンパク質の発現に欠陥を 有する）、第２の誘導性プロモーターに機能し得る形で連結された機能的な異種
Envタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに第１および第２ の誘導性プロモーターからの転写を制御する調節可能な転写アクチベーターをコ
ードする第３のポリヌクレオチドを含むパッケージング細胞系を提供する。
【００４７】 第１のポリヌクレオチドは、自己複製できず、gagおよびpolをコードするがen
vはコードせず、パッケージングシグナルまたは末端反復配列（LTR）を含まない
、HIVゲノムを含有する。第２のポリヌクレオチドは、上記の定義の如く、異種E
nvまたは「エンベロープタンパク質」をコードする。
【００４８】 第３のポリヌクレオチドは、調節可能な転写アクチベーター、またはトランス
アクチベーターをコードし、第１および第２の誘導性プロモーターからの転写を
制御し、上記の第１および第２のポリヌクレオチドの発現を調節する。
【００４９】 好ましい実施形態においては、第１、第２および第３のポリヌクレオチドは、
ベクター中に含有される。これらのポリヌクレオチドは、１種以上のベクター、
好ましくはプラスミドベクター中に含有され得る。本発明の例示のパッケージン
グ細胞系において、第１のポリヌクレオチドはpPTKと呼ぶ第１のプラスミドベク
ター中に含有され、第２のポリヌクレオチドはpBIGFVGと呼ぶ第２のプラスミド ベクター中に含有される。第２のベクターは、VSVエンベロープ、ならびに指示 マーカーとしてのグリーン蛍光タンパク質を含有する。調節可能な転写アクチベ
ーターをコードする第３のポリヌクレオチドは、pcDNAneo中でCMVプロモーター （BglII/BamHI断片）を置換してphCMVnを創出するtetR結合部位の７個の直列コ ピーに連結された最小限のCMV極初期遺伝子プロモーターを含有するものとして 本明細書に例示される。本明細書で考察するように、本発明において使用するた
めの他のウイルスエンベロープおよび他の指示マーカーは、当業者に公知であろ
う。
【００５０】 本発明の１態様においては、例えば、レトロウイルス補助タンパク質をコード
する１つ以上のポリヌクレオチドが、第１または第２のポリヌクレオチド構築物
の一部として含まれる。補助タンパク質としては、vpr、vif、nef、vpx、tat、r
ev、およびvpuが挙げられる。
【００５１】 好ましくは、転写アクチベーター、またはトランスアクチベーターは、宿主細
胞のトランスアクチベーターの発現において通常の細胞転写に有意な副作用をも
たらさずに真核細胞中で高レベルで発現され得る。すなわち、該発現は、誘導性
プロモーターのトランスアクチベーションを容易にするのに十分であるが、該細
胞にとって有害ではない（例えば、細胞に対して毒性を有さない）。「高レベル
」は、ウェスタンブロットによるトランスアクチベーターの検出を可能にする発
現レベルであり得る。該トランスアクチベーターは、限定されるものではないが
、ヒト、サル、マウス、ハムスター、ウシ、昆虫、魚、およびカエル細胞などの
哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞を含む種々の細胞型において発現され得るの
が好ましい。
【００５２】 該トランスアクチベーターは、in vivoでもin vitroでも発現させることがで き、該トランスアクチベーターの発現は、該トランスアクチベーターをコードす
るヌクレオチド配列が機能し得る形で連結されたプロモーターの選択により制御
することができる。例えば、該プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導
性プロモーターであり得る。かかるプロモーターの例としては、ヒトサイトメガ
ロウイルスプロモーターIE(Boshartら、1985、Cell 41:521-530)、HSV-Tk(McKni
ghtら、1984、Cell 37:253-262)などの偏在性発現プロモーター、およびβ‐ア クチンプロモーター(例えば、Ngら、Mol. Cell Biol.、1985、5:2720-2732によ り記載されたヒトβ‐アクチンプロモーター)が挙げられる。
【００５３】 該トランスアクチベーターのプロモーターは、所望の組織細胞型におけるトラ
ンスアクチベーターの転写を優先的に容易にする細胞型特異的または組織特異的
プロモーターであり得る。細胞型特異的および／または組織特異的プロモーター
の例としては、アルブミン（肝臓特異的；Pinkertら、1987、Genes Dev.1:268-2
77）などのプロモーター、リンパ球特異的プロモーター(Calameら、1988、Adv.
Immunol. 43:235-275)、特に、T細胞受容体のプロモーター(Winotoら、1989、EM
BO J. 8:729-733)および免疫グロブリンのプロモーター(Banerjiら、1983、Cell
33:729-740;QueenおよびBaltimore、同掲、741-748)、神経細胞特異的プロモー
ター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrneら、1989、Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlunchら、1985、
Science 230:912-916)、または乳腺特異的プロモーター(乳清プロモーター、米 国特許第4,873,316号および欧州特許出願公開第264,166号)が挙げられる。トラ ンスアクチベーターの発現のためのプロモーターはまた、マウスのホメオボック
スプロモーター(Kesselら、1990、Science 249:374-379)またはα‐フェトプロ テインプロモーター(Campesら、1989、Genes Dev. 3:537-546)などの発生的に調
節されるプロモーターでもあり得る。該プロモーターを、トランスアクチベータ
ーの組込み部位依存性発現を可能にする制御領域と組み合わせて用いることがで
きる(Grosveldら、1987、Cell 51:975-985)。該プロモーターは、各細胞型にお いて構成的であるのが好ましい。好ましくは、該プロモーターは、CMVプロモー ターであり、より好ましくは、CMV極初期遺伝子プロモーターである。
【００５４】 好ましくは、該トランスアクチベーターは、天然のtetRポリペプチドまたはte
tRの機能的誘導体である。何故なら、tetRは、lacRまたはGAL4がそれぞれの配列
に結合するよりも大きな親和性で、その特定のDNA配列(tetO)に結合するからで ある。例えば、tetRは、lacRがIPTGを複合体化する(Ka=106M-1;The Operon中のB
arkleyおよびBourgeios、MillerおよびRezinkoff編、Cold Spring Harbor Lab. 、Cold Spring Horbor、N.Y.、1980、pp.177-220)よりも強固に(Ka=109M-1; Tak
ahashiら、J. Mol. Biol. 187:341-348(1986))テトラサイクリンに結合する。従
って、非常に低い、非毒性的な濃度のテトラサイクリンでも効率的に機能する。
「tetRの機能的誘導体」とは、1)テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似
体の結合、および2)tetRドメインが該誘導性プロモーター内のtetO配列に結合す
るのを妨げることによって、該誘導性プロモーターからの転写を阻害する能力、
を共に保持するtetRから誘導されるポリペプチドを意味する。TetRをコードする
ヌクレオチド配列を、Postelら、1984、Nucl. Acids Res. 2:4849-4863に従って
取得することができ、参照として本明細書に組み込むものとする。本発明におい
て有用な他のtetR配列、およびこれらの受容体の各結合部位は、(Watersら、198
3、Nucl. Acids Res. 11:6089-6105; Postleら、前掲; Ungerら、1984、Gene 31
:103-108; Ungerら、1984、Nucl. Acids Res. 12:7693-7703; Tovarら、1988、M
ol. Gen. Genet. 215:76-80)に記載されている。比較および概要のためには、Hi
llenおよびWissmann のProtein-Nucleic Acid Interaction（タンパク質−核酸 相互作用）、Molecular and Structural Biologyにおけるトピックス、Saenger およびHeinemann（編）、Macmillan、London、第10巻、pp.143-162(1989)を参照
されたい。
【００５５】 テトラサイクリン類似体は、テトラサイクリンに密接に関連し、少なくとも約
106M-1のKaでtet受容体に結合する多くの化合物のうちの任意の１つであり得る(
例えば、デオキシサイクリン)。好ましくは、該テトラサイクリン類似体は、約1
09M-1以上の親和性、例えば、約1011M-1の親和性で結合する。かかるテトラサイ
クリン類似体の例としては、限定されるものではないが、HlavkaおよびBoother の「テトラサイクリン」、IN:Handbook of Experimental Pharmacology 78, R.K
. Blackwoodら（編）、Springer-Verlag, Berlin-New York, 1985; Mitschef,「
テトラサイクリン抗生物質の化学」、Medicinal Research 9, Dekker, New York
, 1978; Noyee Development Corporation,「テトラサイクリンの製造方法」、Ch
emical Process Reviews, Park Ridge, N.J.,第2巻、1969; Evans,「テトラサイ
クリンの技術」、Biochemical Reference Series 1, Quadrangle Press, New Yo
rk, 1968;Dowling,「テトラサイクリン」、Antibiotics Monographs 第3号, Med
ical Encyclopedia, New York, 1955、が挙げられる。テトラサイクリン類似体 に関して、これらの各々は参照として本明細書に組み入れられるものとする。
【００５６】誘導性プロモーター 一般に、本発明の誘導性発現系においてトランスアクチベーターと結合させて
用いる誘導性プロモーターは、転写が、トランスアクチベーターのレベルにより
調節され得る任意のプロモーターである。
【００５７】 例えば、トランスアクチベーターがtetRポリペプチドである場合、該誘導性プ
ロモーターは、少なくとも１つのtetO配列、好ましくは少なくとも２つ以上の直
列に繰り返したtetO配列、より好ましくは少なくとも５つ以上の直列に繰り返し
たtetO配列、さらに好ましくは少なくとも７つ以上の直列に繰り返したtetO配列
、を含む最小プロモーターであるのが好ましい。該誘導性プロモーターの最小プ
ロモーター部分を、任意の所望のプロモーターから誘導することができ、該誘導
性発現系を用いるtet細胞系によって選択する。細胞が哺乳動物細胞である場合 、好ましい最小プロモーターは、CMVから誘導されたものであり、好ましくはCMV
極初期遺伝子1Aから誘導されたものである。さらに、エクジソン誘導性プロモー
ター(Invitrogen Inc., San Diego, CA.)またはlacZ誘導性プロモーターなどの 他の誘導性プロモーターも用いることができる。
【００５８】 好ましくは、該誘導性プロモーターは、少なくとも１つのtetオペレーター(te
tO)配列に機能し得る形で連結された最小プロモーターである。該tetO配列は、 例えば、HillenおよびWissmann、1989、前掲、に従って取得することができる。
tetOの説明および配列に関して、上記文献は、参照として本明細書に組み入れら
れるものとする。本発明の実施において用いることができる他のtetO配列は、以
下の文献から取得することができる。すなわち、Watersら、1983、前掲; Postle
ら、1984、前掲: Ungerら、1984、前掲; Ungerら、1984、前掲;Tovarら、1988、
前掲、である。比較および概要のためには、HillenおよびWissmann、1989、前掲
を参照されたい。上記文献の開示は全て参照として本明細書に組み入れられるも
のとする。１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のコピーのte
tオペレーター配列を用いることができる。複数コピーのtetオペレーター配列は
、これらのtetO含有プロモーターからの発現を制御する能力に対する相乗効果を
もたらすので、より多数のコピーのtetOを有するプロモーターは、該プロモータ
ーからの転写の様々なトランスアクチベーター調節を可能にする。tetO配列を含
有するテトラサイクリン調節性プロモーターの調節は、米国特許第5,464,758号 、ならびにGossenおよびBrujand、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-
5551で考察されており、その各々は参照として本明細書に組み入れられるものと
する。
【００５９】構築物 誘導性発現系の基本的構成要素、例えば、目的のヌクレオチド配列に機能しう
る形で連結されたトランスアクチベーターおよび誘導性プロモーターをコードす
るヌクレオチド配列は、単一の「構築物」もしくはベクター、または別の構築物
内に含まれ得る。該構築物を、当業界で公知の種々の構築物および／または市販
のもののうちの任意のものから誘導することができ、原核細胞、真核細胞、また
は、好ましくは原核細胞と真核細胞の双方において複製可能にすることができる
。
【００６０】 上記の構成要素に加えて、該構築物は、選択可能マーカー、例えば、抗生物質
耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、ヒグロマイシン、G418）、β−ガラクトシ
ダーゼ、または、該構築物を含有する細胞の選択のために用いることができる他
の遺伝子産物、として役立つことができる遺伝子をコードするヌクレオチド配列
をさらに含有することができる。該構築物は、エンハンサー、イントロン、ある
いは、トランスアクチベーターの発現、および／または、適当な場合、誘導性プ
ロモーターに機能し得る形で連結された目的のヌクレオチド配列の発現を容易に
する他の配列などの他の発現を容易にする配列をさらに含有することができる。
さらに、グリーン蛍光タンパク質(GFP)などのインジケーターは、本発明の構築 物において有用である。
【００６１】宿主細胞への誘導性発現系の導入 別の実施形態においては、本発明は、パッケージング細胞系の製造方法を提供
する。該方法は、本明細書に記載の如く、適当な細胞を、第１の誘導性プロモー
ターに機能し得る形で連結されたHIVゲノム(該HIVゲノムは、シス作動性エレメ ント、自己複製、および機能的Envタンパク質の発現に欠陥を有する)を有する第
１のポリヌクレオチド、第２の誘導性プロモーターに機能し得る形で連結された
機能的異種Envタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、ならびに第１ および第２の誘導性プロモーターからの転写を制御する調節可能な転写アクチベ
ーターをコードする第３のポリヌクレオチドでトランスフェクトし、該トランス
フェクトされた細胞を、該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を含
有する細胞のスクリーニングを可能にする条件下で培養することを含む。
【００６２】 本発明の誘導性発現系および必須レトロウイルス成分（例えば、GagおよびPol
）を発現するヌクレオチド配列により安定的に形質転換することができ、十分な
レベルの必須レトロウイルス成分を発現し、本発明による組換えレトロウイルス
ベクターの産生のための所望のエンベロープタンパク質を誘導的に発現する任意
の真核細胞系を用いて、本発明によるパッケージング細胞系を作製することがで
きる。適当な宿主細胞としては、哺乳動物（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、
ウマ、およびげっ歯類）および非哺乳動物起源（例えば、昆虫類、爬虫類、魚類
、および鳥類）の双方の細胞が挙げられる。該パッケージング細胞を、in vitro
で細胞培養することもできるし、in vivoで生物内に存在させることもできる。
【００６３】 好ましくは、該パッケージング細胞は、in vitroの細胞培養中に存在し、様々
な適用（例えば、遺伝子療法における臨床適用のため）のためのレトロウイルス
ベクター調製物の産生に有用な適当な力価をもたらすような組換えレトロウイル
スベクターの大量生産を可能にする様式で培養することができる。ウイルスの大
規模生産が望ましい場合、パッケージング細胞を誘導する宿主細胞は、容易に培
養でき、長期間の培養において安定であり(例えば、健康な細胞は、数日間〜数 週間または数ヶ月間、相対的に高い細胞密度を維持することができ、一定のレト
ロウイルスベクター力価の確実な産生および／またはレトロウイルス粒子の遺伝
的組成物の均一性に影響する有意な遺伝的変化を全く受けない)、ならびに細胞 培養物からのウイルスの容易な単離(例えば、細胞培養上清を採取および濃縮し て、許容されるウイルス力価の粗レトロウイルス粒子調製物を得る)を可能にす るのが好ましい。
【００６４】 本明細書に例示されるように、該誘導性発現系は、別の組換えポリヌクレオチ
ド配列(例えば、トランスアクチベーターをコードするもの、および該誘導性プ ロモーターの制御下で目的の遺伝子産物をコードするもの)として宿主細胞中に 導入される。該誘導性発現系をコードするヌクレオチド配列の宿主細胞への導入
は、当業界で公知の方法(例えば、Sambrookら、1987、Molecular Cloning: A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Horbor, New York を参照されたい)により、in vitroでもin vivoでも達成することができる。好ま
しい実施形態においては、該誘導性発現系は、レトロウイルスベクターによる感
染によって宿主細胞中に導入され、所望のエンベロープタンパク質をコードする
ポリヌクレオチド配列に機能し得る形で連結されたトランスアクチベーターおよ
び／または誘導性プロモーターをコードするポリヌクレオチド配列、ならびに該
誘導性発現系をコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞ゲノム中に安定的
に組み込まれる。
【００６５】誘導性発現系を用いるパッケージング細胞系 本発明の誘導性発現系を用いて、組換え偽型レトロウイルスベクターの産生に
おいて有用なパッケージング細胞系を作製する。該パッケージング細胞系は、目
的のDNA配列の標的細胞への導入に用いるのに適している。偽型レトロウイルス 粒子は、ウイルスRNAゲノムを誘導するウイルス以外のウイルスから誘導される エンベロープタンパク質を有するレトロウイルス粒子である。該エンベロープタ
ンパク質は、RNAゲノムを誘導するレトロウイルスとは異なる種のレトロウイル スに由来するもの、または非レトロウイルス(例えば、水疱性口内炎ウイルス(VS
V))に由来するものであり得る。通常、該偽型レンチウイルスまたはレトロウイ ルスベクターは、欠陥を有している。すなわち、該レトロウイルスベクターは、
遺伝的に変化させて、ウイルスの複製を不可能にした天然のウイルスから誘導さ
れる。一度、ウイルスがその遺伝物質を標的細胞に送達すれば、該ウイルスは、
細胞中に、好ましくは、安定的に染色体に組み込まれる配列として、組換えヌク
レオチド配列を導入するが、導入されたレトロウイルス配列の発現に際してさら
なる感染性ウイルスを生成しない。あるいは、目的のヌクレオチド配列を含むレ
トロウイルスベクターは弱まる、すなわち、感染した宿主において有意な病理ま
たは病状を引き起こさない(すなわち、該ウイルスは、非病原性であるか、また は軽い症状のみを引き起こす)。
【００６６】 従って、本発明の別の実施形態においては、組換えレトロウイルスの製造方法
は、本明細書に記載のパッケージング細胞系を、パッケージングシグナル、外因
性非HIVポリヌクレオチド、RNA輸送シグナル、およびレンチウイルスLTR配列を コードするポリヌクレオチドを含有するレンチウイルスベクター(例えば、レト ロウイルスベクター)でトランスフェクトすることを含む。好ましいRNA輸送シグ
ナルは、Rev応答エレメントである。
【００６７】 該外因性非HIVポリヌクレオチドは、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、神 経栄養因子、および免疫調節剤を含むポリペプチドをコードする。かかるポリペ
プチドは、本発明の方法により製造された組換えレンチウイルスを用いる遺伝子
療法に有用であり、そうしたポリペプチドとしては、限定されるものではないが
、インターロイキン１〜１５、インターフェロン、および特にγインターフェロ
ン(γ‐IFN)、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(G
M-CSF)、ならびに神経成長因子(NGF)が挙げられる。
【００６８】 偽型レンチウイルスまたはレトロウイルス粒子は、欠陥を有する組換えレンチ
ウイルス、またはより具体的には、レトロウイルスのゲノムを、パッケージング
細胞中に導入することにより(例えば、欠陥を有するレトロウイルス粒子を用い た感染、または標的細胞にDNAを導入するための他の手段(例えば、従来の形質転
換技術)によって)、製造することができる。欠陥を有するレトロウイルスゲノム
は、末端反復配列、形質転換される目的の外因性ヌクレオチド配列、およびパッ
ケージング配列(φ)を最小限に含む。一般に、該パッケージング細胞は、レトロ
ウイルスの複製、組込み、およびキャプシド化にとって必須であるレトロウイル
ス成分を失っており、また、所望のエンベロープタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を発現する。しかし、該パッケージング細胞は、レトロウイルス粒子
の産生にとって必須である全ての成分を有していない。パッケージング細胞にお
いて失われているウイルス成分をコードするヌクレオチド配列は、該パッケージ
ング細胞ゲノム中に安定的に組み込まれ、および／または共感染するヘルパーウ
イルスにより提供され得る。
【００６９】 レトロウイルス成分およびレンチウイルスまたはレトロウイルスRNAゲノムを コードするヌクレオチド配列は、所望のレンチまたはレトロウイルス(例えば、 マウス、サル、鳥類、またはヒトレトロウイルス)から誘導することができる。 遺伝子治療の適用のために開発された欠陥を有するレトロウイルスの多くは、マ
ウスのレトロウイルス(例えば、マウス白血病ウイルス(MuLV)、モロニーマウス 白血病ウイルス(MoMLV))である(例えば、Millerら、1992、Nature 357:455-460 およびMulligan、1993、Science 260:926-932を参照されたい)。一般に、レトロ
ウイルス成分は、所望のエンベロープタンパク質、例えば、VSV Gによって偽型 レトロウイルス粒子を形成し得る任意のレトロウイルスから誘導することができ
る。VSV Gが所望のエンベロープタンパク質である場合、レトロウイルス成分を 、MuLV、MoMLV、鳥類白血症ウイルス(ALV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ある いは、唯一のエンベロープタンパク質としてのVSV G、またはVSV Gおよび比較的
少量のレトロウイルスエンベロープタンパク質によって偽型ウイルスを形成し得
る任意の他のレトロウイルスから誘導することができる。
【００７０】 本発明に従って製造される偽型レトロウイルスの１例においては、遊離ビリオ
ン形態の偽型欠陥マウスレトロウイルスは、レトロウイルスの構造タンパク質お
よび酵素タンパク質(逆転写酵素を含む)、レトロウイルスゲノムの２個のRNAコ ピー、および所望のウイルスエンベロープ糖タンパク質(例えば、VSV G)が埋め 込まれた細胞の形質膜の一部を含有する。該ゲノムは、４つの主要な領域、すな
わち、末端反復配列(LTR)、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を構成する
。gag、pol、およびenvの３つの遺伝子は、末端のLTRの間に位置し、内部ウイル
ス構造タンパク質および逆転写酵素をそれぞれコードし、env遺伝子は、ウイル スに対する感染性および宿主の特異性をもたらすエンベロープ糖タンパク質をコ
ードする。好ましくは、該レトロウイルスゲノムは、これらの遺伝子のうちの１
つか３つ全てに欠陥を有する。さらに、該レトロウイルスゲノムは、最終的には
標的細胞中に導入される目的のヌクレオチド配列を含み得る。欠陥を有する組換
えレトロウイルスゲノムが、そのプロウイルス形態で宿主細胞中に組み込まれる
場合、該LTRは、プロウイルスゲノムの両端に位置し、RNAゲノムの5'および3'末
端の合成物である。該LTRは、転写の開始および終結にとって必要なシス作動性 エレメントを含有する。
【００７１】 本発明のパッケージング細胞の例は、GagおよびPol、ならびに所望のエンベロ
ープタンパク質をコードする遺伝子を含有するが、パッケージングシグナル「φ
」または上記のLTRは含有しない。従って、パッケージング細胞は、空のビリオ ン粒子を形成することができるのみである。一度、レトロウイルスRNAゲノム(目
的のヌクレオチド配列を含む)をパッケージング細胞中に導入すれば、該パッケ ージング細胞は、偽型欠陥レトロウイルス粒子を産生できるようになる。従って
、パッケージング細胞は、トランスでのウイルス複製に必須である、失われるレ
トロウイルス成分(すなわち、レトロウイルスゲノムに欠陥を有する成分)をもた
らす。目的のヌクレオチド配列を含む、複製に欠陥を有するレトロウイルスゲノ
ムの製造方法、ならびにgagおよびpol遺伝子を発現する細胞系の作製方法は、当
業界で公知であり、例えば、米国特許第4,861,719号、1992年4月2日に公開され た国際特許出願公開第WO 92/05266号、および1992年9月2日に公開された国際特 許出願第WO 92/14829号に記載されており、複製に欠陥を有するレトロウイルス ゲノムならびにレトロウイルスのgagおよびpol遺伝子を発現するパッケージング
細胞系の製造に関して、上記文献の各々は参照として本明細書に組み入れられる
ものとする。レトロウイルスパッケージング細胞系を、レトロウイルスGagおよ びPolタンパク質を発現でき、所望のエンベロープタンパク質を発現できる(例え
ば、数時間〜数日間、好ましくは少なくとも１週間〜２週間以上、VSV Gの発現 を寛容できる)任意の哺乳動物または非哺乳動物細胞から誘導することができる 。好ましくは、該パッケージング細胞系を誘導する細胞系は、肝細胞、ストロマ
細胞、筋細胞、線維芽細胞、および胚性幹細胞より選択される細胞である。パッ
ケージング細胞系の開発のために当業者により用いられる細胞の例としては、29
3(ATCC CCL X)、Hela(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BH
K(ATCC CCL-10)、またはCf2Th(ATCC CRL 1430)細胞が挙げられるが、最も好まし
くは293細胞であり、その各々はATCCから公に利用可能である。本発明の細胞系 の例を、SODK1293またはSODK1と呼ぶことにする。
【００７２】 本発明に従って、目的のヌクレオチド配列を含む欠陥組換えレトロウイルスゲ
ノムを、1)導入されるRNAゲノムに欠陥を有する機能的レトロウイルスタンパク 質(例えば、gagおよびpol)、および2)所望のエンベロープタンパク質の発現を容
易にする本発明の誘導性発現系、をコードするヌクレオチド配列を含むパッケー
ジング細胞系に導入することにより、偽型レトロウイルス粒子を製造する。欠陥
ウイルス粒子を用いた感染または他の従来の形質転換法を含む任意の手段によっ
て、該欠陥組換えRNAゲノムをパッケージング細胞系に導入することができる。 好ましくは、該パッケージング細胞は、レトロウイルスGagタンパク質、レトロ ウイルスPolタンパク質、および本発明の系を用いて誘導的に発現される所望の エンベロープタンパク質を発現する。該誘導性発現系を、単一の構築物または複
数の構築物として、上記のように、または実施例に記載のように導入することが
できる。
【００７３】 該誘導性プロモーターは、少なくとも１つのtetO配列、好ましくは少なくとも
２つ以上の直列に繰り返したtetO配列に機能し得る形で連結されたCMV極初期遺 伝子プロモーターから誘導された最小プロモーターであるのが好ましい。
【００７４】 レトロウイルス粒子の産生のための所望のエンベロープタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列は、Gag、Pol、および／またはRNAゲノムを誘導するウイル ス以外のウイルスから誘導されたウイルスエンベロープタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列であるのが好ましい。好ましくは、該ウイルスエンベロープタ
ンパク質は、レトロウイルス(例えば、異種栄養性レトロウイルス、多栄養性ウ イルス、環境栄養性または両栄養性ウイルス、好ましくは両栄養性ウイルス)、 あるいは非レトロウイルス、例えば、ラブドウイルス、シンダイウイルス、イン
フルエンザウイルス、シンドビスウイルス、またはヘルペスウイルスから誘導さ
れる。好ましい実施形態においては、所望のエンベロープタンパク質をコードす
るヌクレオチド配列は、水疱性口内炎ウイルス(VSV)のエンベロープタンパク質 などのラブドウイルスエンベロープGタンパク質、またはそれらの機能的誘導体 をコードする。
【００７５】 VSV Gをコードするヌクレオチド配列は、Roseら、1982、Cell 30:753-762に記
載されており、VSV Gヌクレオチドおよびアミノ酸配列の開示に関して、上記文 献は参照として本明細書に組み入れられるものとする。所望のエンベロープタン
パク質がVSV Gである場合、VSV Gは、偽型レトロウイルスビリオン中に唯一のエ
ンベロープタンパク質として存在することができ、または他のエンベロープタン
パク質(例えば、通常は、他の偽型ビリオンのレトロウイルス成分を誘導するレ トロウイルスと会合したレトロウイルスエンベロープタンパク質)と共に存在す ることができる。VSV Gは、VSV Gがウイルスエンベロープ中に存在するエンベロ
ープタンパク質の約50％、より好ましくは約75％、さらに好ましくは約90％〜約
95％、さらにより好ましくは約95％以上、最も好ましくは約100％に相当するか 、またはVSV Gがウイルスエンベロープ中に存在する実質的に唯一のエンベロー プタンパク質であるようにウイルスエンベロープ中に存在するのが好ましい。VS
V Gは、天然(すなわち、天然に存在する)のVSV G、またはその機能的誘導体であ
り得る。
【００７６】 VSV Gの機能的誘導体としては、限定されるものではないが、天然のVSV Gと比
較して、アミノ酸の置換、欠失、付加、および／または化学的修飾を有するVSV
G由来ポリペプチドが挙げられる。従って、機能的VSV G誘導体としては、限定さ
れるものではないが、通常は天然のVSV Gに会合したものとは異なる機能か、ま たはさらなる機能を有するVSV G由来ポリペプチドが挙げられる。例えば、組織 特異的または細胞特異的抗原に対する結合親和性を有する抗体から誘導されたポ
リペプチドに、VSV Gを融合させることができる。ウイルスエンベロープ中に存 在するかかるVSV G単鎖抗体融合タンパク質を有する偽型ウイルス粒子は、該抗 体鎖が結合できる抗原を表面上に発現する細胞に優先的に感染することができる
。他のVSV G機能的誘導体は、偽型ウイルス粒子の宿主範囲の変更も同様にする ことができ、および／または他の所望の性質を付与することもできる。一般に、
本発明による偽型レトロウイルスビリオンを形成できる任意のVSV G機能的誘導 体を用いることができる。
【００７７】 該エンベロープを発現するパッケージング細胞が、テトラサイクリン(または その類似体)に曝露されるとき、誘導性プロモーターから発現されるVSV Gは、実
質的にないか、または極めて少ない。テトラサイクリンの非存在下では、該エン
ベロープタンパク質の発現は、テトラサイクリンの存在下での転写に比べて、約
10倍〜約50倍、好ましくは約40倍〜約90倍、より好ましくは約40倍〜約100倍、 および200倍以上も上昇する。さらに、トランスアクチベーターをコードするヌ クレオチド配列を、調節可能なプロモーターに機能し得る形で連結することによ
り、トランスアクチベーターの発現を調節することができる。従って、本発明の
パッケージング細胞は、２つ以上のレベルの所望のエンベロープタンパク質の発
現調節を提供することができる。すなわち、1)テトラサイクリンの添加によるエ
ンベロープタンパク質の消極的発現調節、2)テトラサイクリンの除去による積極
的発現調節、および、場合によっては、3)トランスアクチベーターをコードする
ヌクレオチド配列の調節された発現、である。
【００７８】 所望のエンベロープタンパク質を誘導的に発現することができる本発明のパッ
ケージング細胞系を用いて、少なくとも104/ml以上、好ましくは105/ml以上、よ
り好ましくは106/ml以上の遠心前ウイルス力価で偽型レトロウイルスベクターを
産生させることができる。本発明の好ましいパッケージング細胞系は、少なくと
も1mlあたり105個、好ましくは1mlあたり5ｘ105個、より好ましくは1mlあたり10 6 個の感染性粒子の力価のウイルスを産生することができ、1mlあたり1ｘ107個以
上の力価のウイルスを産生することができる。好ましいパッケージング細胞系は
、少なくとも約1ウイルス粒子／細胞、好ましくは約10ウイルス粒子／細胞、よ り好ましくは約100ウイルス粒子／細胞以上のオーダーの力価のウイルスを産生 することができる。好ましいパッケージング細胞系を、単位時間あたりに産生さ
れるウイルス力価によって特徴付けることもできる。例えば、本発明の好ましい
パッケージング細胞は、1時間あたり約104感染性ウイルス粒子/ml、好ましくは1
時間あたり約105感染性ウイルス粒子/mlを産生することができ、1時間あたり約1
06感染性ウイルス粒子/mlあるいはそれ以上を産生することができる。
【００７９】 少なくとも4日間、好ましくは少なくとも7日間、より好ましくは少なくとも12
日間、および16日間以上、感染性偽型ビリオンの産生を可能にする条件下(例え ば、テトラサイクリンの非存在下で)で、該パッケージング細胞を保持すること ができる。例えば、高いウイルス産生能(例えば、約104〜106cfu/ml以上)での誘
導後に少なくとも7日間、293細胞を保持することができる。好ましくは、該パッ
ケージング細胞は、より短い期間のウイルス産生時間においてより高い力価(す なわち、より長い期間のウイルス産生にわたる、より低いウイルス力価とは反対
に)を提供する。
【００８０】 好ましくは、本発明のパッケージング細胞は、誘導後、短時間で応答する。す
なわち、該パッケージング細胞は、テトラサイクリンが培地から除去されるとき
、迅速に応答して偽型ウイルスを産生する。好ましくは、該パッケージング細胞
は、誘導後48時間以内、より好ましくは誘導後12時間〜24時間以内に検出可能な
力価のウイルスを産生する。好ましくは、本発明のパッケージング細胞は、誘導
後5日以内、好ましくは誘導後4日以内、より好ましくは誘導後3日以内、さらに 好ましくは誘導後2日以内に、少なくとも103cfu/ml、より好ましくは104cfu/ml 、さらに好ましくは105cfu/ml、最も好ましくは106cfu/ml以上の力価のウイルス
を産生し、誘導後48時間〜36時間以下以内にかかる力価のウイルスを産生しても
よい。
【００８１】 一般に、本発明の偽型パッケージング細胞系は、104〜106/mlの感染性ウイル ス粒子を産生することができ、テトラサイクリンの除去後、短時間(例えば、24 時間〜48時間)でウイルス産生をもたらし、約5日〜約16日間以上、感染性ウイル
スを産生することができる。
【００８２】 本発明のパッケージング細胞は、培養において容易に維持でき、高密度で増殖
でき、従来の技術を用いて効率的にトランスフェクトでき、ならびにウイルスエ
ンベロープの誘導性発現および偽型レトロウイルスベクターの産生を可能にする
のに必要なトランスアクチベーションおよび所望のエンベロープタンパク質のレ
ベルを許容できる細胞から誘導されるのが好ましい。エンベロープタンパク質産
生の抑制は、非常に強固である(例えば、少量のテトラサイクリンでさえ、ウイ ルスエンベロープの発現の抑制をもたらし、発現誘導に対する応答は迅速である
(例えば、テトラサイクリンの除去後、12時間〜36時間以内が好ましい))のが好 ましい。例えば、293細胞は、通常の線維芽細胞と同様に増殖し、容易に培養で き、高いDNAトランスフェクション効率を示し(例えば、通常のカルシウム−リン
酸共沈降法による)、この細胞系の遺伝子操作を非常に容易にする。遺伝子導入 １実施形態においては、該パッケージング細胞は、偽型レトロウイルス粒子の
in vivoにおける産生のためのトランスジェニック動物内に存在し、該レトロウ イルス粒子を、該動物から回収する(例えば、動物の血液または任意の他の体液 から偽型ビリオンを採取および単離することによって)ことができる。レトロウ イルスGagおよびPolタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびに誘導性
発現系をコードするヌクレオチド配列を用いて、上記のような当業者に公知の方
法によってトランスジェニック動物を作製することができる。その後、該動物を
、目的のヌクレオチド配列を含む感染性の複製不能レトロウイルスビリオンに感
染させることができ、次いで、該トランスジェニック動物中に存在する「in viv
o」のパッケージング細胞を感染させて、高力価の偽型レトロウイルスベクター 粒子を産生させることができる。テトラサイクリンを上記のトランスジェニック
動物に投与することにより、誘導性発現系によりコードされるエンベロープタン
パク質の発現を調節することができる。
【００８３】 別の実施形態においては、本発明は、外因性非HIVポリヌクレオチドをレシピ エント細胞の染色体中に導入する方法を提供する。該方法は、レシピエント細胞
を本発明の方法により作製された組換えレンチウイルスに接触させ、該外因性非
HIVポリヌクレオチドを該染色体中に組み込むことを含む。本発明のパッケージ ング細胞を用いて生成した偽型レトロウイルスベクター粒子を用いて、目的のヌ
クレオチド配列を、in vitroでもin vivoでも宿主細胞に容易に送達することが できる。例えば、遺伝子療法の適用において該偽型レトロウイルスベクター粒子
を用いて、治療的遺伝子産物をコードする配列を、被験体、例えば、哺乳動物の
被験体、好ましくはヒト被験者に送達することができる。該偽型レトロウイルス
ベクター粒子を用いて、種々の疾患モデル、動物モデル、またはin vitroモデル
を開発することもできる。本発明のレンチウイルスまたはレトロウイルスベクタ
ー粒子の送達のためのレシピエント細胞としては、内皮細胞、骨髄性細胞、骨髄
細胞、幹細胞、リンパ球、肝細胞、線維芽細胞、肺細胞、筋細胞、胚細胞、およ
び神経細胞が挙げられる。in vivoにおける形質転換を達成するためのレトロウ イルス粒子を被験体に投与する方法は、当業界で公知である(Mulligan、1993、S
cience 260:926; Anderson、1992、Science 256:808; Miller、1992、Nature 35
7:455; Crystal、1995、Science 270:404を参照されたい)。レトロウイルス粒子
を用いるin vitroにおけるトランスフェクションのための方法も、当業界で公知
である。
【００８４】 遺伝子療法に用いるために、種々の遺伝子またはDNA断片を、本発明のレトロ ウイルスベクター粒子中に組み込むことができる。遺伝子療法で用いるタンパク
質としては、種々のホルモン、増殖因子、酵素、リンホカイン、サイトカイン、
受容体などが挙げられる。
【００８５】 本発明に従って導入され得る遺伝子は、遺伝的疾患を患っている個体において
、存在しないポリペプチドをコードするもの、減少した量で産生されるもの、ま
たは突然変異した形態で産生されるものである。目的の遺伝子の他のものとして
は、代謝的欠陥を回避するように遺伝子工学的に操作されたタンパク質、あるい
は、細胞によって発現されるとき、修飾されていない細胞が生存できないか、ま
たは病原体が感染するようになるような条件下で増殖するように細胞を適合させ
るタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００８６】 タンパク質をコードする遺伝子に加えて、本発明を用いて、医学的に有用なRN
A分子をコードする核酸配列を細胞中に導入することができる。かかるRNA分子の
例としては、アンチセンス分子、およびリボザイムなどの触媒分子が挙げられる
。
【００８７】 当業界で公知の種々の技法によって、本発明のレトロウイルス粒子を、ex viv
oにおける遺伝子療法に用いることができる。一般に、これらの技法は、患者か ら目的の標的細胞を取り出すこと、該標的細胞をレトロウイルスベクター粒子と
共にインキュベートすること、および該形質導入された標的細胞を患者に再導入
すること、を含む。本発明のパッケージング細胞により産生されるレトロウイル
スベクター粒子の投与のための技法としては、米国特許第5,580,766号に記載の 技法が挙げられる。この特許およびその技法は、その全体が、参照として本明細
書に組み入れられるものとする。
【００８８】HIVインテグラーゼ活性の検出および調節方法 現在、HIVインテグラーゼは、利用可能でない臨床的に有用な阻害剤である唯 一のウイルス酵素である。従って、組込み前複合体(PIC)を用いるアッセイの開 発は、組込み阻害剤の同定のための重要なツールとなる。典型的には、精製イン
テグラーゼタンパク質のみを用いてスクリーニングを実施するが、かかるアッセ
イは、in vivoにおける組込みを部分的に反映しているのみである。レトロウイ ルスベクターの使用は、HIV-1 PICに関連するバイオハザードを予防し、該ベク ター細胞系は、より活発で便利なウイルス粒子源である。本発明は、相対的に高
スループットな様式でPICをスクリーニングするための方法を提供する。
【００８９】 従って、本発明は、標的核酸配列を固相支持体に可逆的に不動化することによ
って標的核酸配列中に組み込まれたウイルス核酸配列を検出し、該ウイルス核酸
配列が該標的核酸配列中に組み込まれるような条件下および十分な時間で、該標
的核酸と、ウイルス核酸配列を含む組込み前複合体(PIC)とを接触させ、および 該組み込まれたウイルス核酸配列を検出するための方法を提供する。
【００９０】 本発明はさらに、標的核酸配列を固相支持体に可逆的に不動化することによっ
てウイルス組込み前複合体(PIC)中に含まれるインテグラーゼ活性を検出し、該 ウイルス核酸配列が該標的核酸配列中に組み込まれるような条件および十分な時
間のもとで、該標的核酸と、ウイルス核酸配列を含む組込み前複合体(PIC)とを 接触させ、および該組み込まれたウイルス核酸配列を検出するための方法を提供
する。該標的核酸配列におけるウイルス核酸配列の存在は、インテグラーゼ活性
を示すものである。
【００９１】 １実施形態においては、本発明は、組込み前複合体(PIC)に含まれるウイルス インテグラーゼ活性に影響する化合物の同定方法を提供する。該方法は、標的核
酸配列を固相支持体に可逆的に不動化すること、ウイルス核酸配列が該標的核酸
配列中に組み込まれるような条件下および十分な時間で、該ウイルス核酸配列お
よびインテグラーゼ活性に影響することが疑われる試験化合物を含むウイルス組
込み前複合体(PIC)に該標的核酸を接触させること、ならびに該組み込まれたウ イルス核酸配列を検出すること、を含む。該標的核酸配列中に組み込まれたウイ
ルス核酸配列の量は、インテグラーゼ活性に対する該化合物の効果を示すもので
ある。
【００９２】 従って、本発明は、インテグラーゼ活性をモジュレートする化合物の同定方法
を提供する。該方法は、該化合物、インテグラーゼ、組み込まれる核酸、および
標的核酸を含む成分を、該成分が相互作用し、該化合物の存在下でインキュベー
トする前後に該インテグラーゼの活性に対する該化合物の効果を決定するのを可
能にするのに十分な条件下でインキュベートすることを含む。好ましくは、該イ
ンテグラーゼは、HIVインテグラーゼである。HIVインテグラーゼは、組込み前複
合体(PIC)の一部として単離することができる。HIVインテグラーゼ活性をモジュ
レートする化合物としては、ペプチド、ペプチドミメティクス、ポリペプチド、
化学的化合物、および生物学的化合物が挙げられる。本明細書で用いる用語「モ
ジュレート」とは、活性の阻害または活性の増大などのインテグラーゼ活性に影
響し得る任意の手段を包含する。実施例３に記載の方法(例えば、PCRおよびアガ
ロースゲル電気泳動に基づく方法)、または当業界で公知の他の標準的技法を用 いて、インテグラーゼの活性をアッセイすることができる。
【００９３】 インキュベーションは、試験化合物と、インテグラーゼおよび標的核酸との接
触を可能にする条件を含む。該試験化合物は、場合によっては、多数の化合物の
スクリーニングのためのコンビナトリアルライブラリーであってもよい。溶液に
おいても、または固相支持体に結合させた後でも、PCR、オリゴマー制限(Saiki ら、Bio/-Technology, 3:1008-1012, 1985)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオ チド(ASO)プローブ分析(Connerら、Proc. Acad. Sci. USA, 80:278, 1983)、オ リゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)(Landegrenら、Science, 241:10
77, 1988)などの特定のDNA配列の検出に通常適用される任意の方法によって、本
発明の方法において同定された化合物をさらに評価、検出、クローニング、配列
決定などをすることができる。DNA分析のための分子的技法は、Landegrenら、Sc
ience、242：229−237、1988に概説されている。
【００９４】 本発明の方法は、インテグラーゼに結合するか、またはインテグラーゼ発現も
しくは活性に影響する化合物を同定するためのコンビナトリアルケミストリー法
を含む。大量のHIVインテグラーゼの産生を提供することにより、HIVインテグラ
ーゼに結合し、その活性をモジュレートし、その発現に影響し、または、その活
性を模倣するリガンドまたは基質を同定することができる。
【００９５】 研究の領域は、治療方法の開発である。本明細書に記載のスクリーニングアッ
セイにより、標的生物におけるHIVインテグラーゼの機能の調節を提供する化合 物が同定される。特に興味深いのは、ヒトに対する毒性の低い化合物のためのス
クリーニングアッセイである。この目的のために、種々のアッセイを用いること
ができ、該アッセイとしては、標識in vitroタンパク質間結合アッセイ、タンパ
ク質−DNA結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のた めの免疫アッセイなどが挙げられる。また、３次元結晶構造の決定のために、精
製タンパク質を用いることもでき、該３次元結晶構造は、例えば、分子間相互作
用および転写調節のモデリングのために用いることができる。
【００９６】 本明細書において使用する場合、用語「化合物」は、HIVインテグラーゼの生 理的機能または発現を変える能力を有するいかなる分子、例えはタンパク質若し
くは医薬、をもいう。一般に、異なる化合物濃度を用いて複数のアッセイ混合物
を並列的に実施し、種々の濃度に対する応答の違いを得る。典型的には、これら
の濃度の一つが陰性対照、すなわち濃度ゼロまたは検出レベル未満として機能す
る。
【００９７】 スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、１またはそれ以上の分子
が標識に関わる場合があり、その標識は直接または間接的に検出可能なシグナル
を提供し得る。種々の標識として、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、
特異的結合分子、粒子、例えば磁気粒子等が挙げられる。特異的結合分子として
は、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及び抗ジゴキシン等の対が挙
げられる。特異的結合メンバーの場合には、通常、既知の手法に従って、相補的
なメンバーが検出を与える分子により標識される。
【００９８】 種々の他の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。この中には
、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、及び／または非特異的若しくは
バックグラウンドの相互作用を低減させるために使用される塩、中性タンパク質
、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬が含まれる。プロテアーゼ阻害
剤、ヌクレアーゼ阻害剤及び抗微生物薬等の、アッセイの効率を改良する試薬を
使用することもできる。成分の混合物は、必要な結合を提供するために、いかな
る順序でも添加される。インキュベーションは好適な温度のいずれでも実施され
、典型的には４から４０℃である。インキュベーション時間は最適な活性のため
に選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するためにも最
適化され得る。典型的には0.1から１時間の間で十分であろう。
【００９９】 本発明は、標的核酸を固相支持体に結合した基質に付け、該標的核酸をPICと 接触させることによる、ウイルスの組み込みの検出に有用な方法を提供する。標
的核酸を固相支持体にコンジュゲートさせるために有用ないかなる基質も本発明
の方法において使用できることは想像される。このようなコンジュゲーションは
好ましくは化学的コンジュゲーションである。核酸を特定の基質に付けるために
有用な化学的コンジュゲーションは、当業者に公知のいかなる方法によっても達
成できる。こうした方法としては、例えばジスルフィド架橋による核酸の基質へ
の化学的コンジュゲーションが挙げられる。上記の例において、核酸−基質複合
体は、例えばβ−メルカプトエタノール等の還元剤の添加によって崩壊させるこ
とができる。化学的コンジュゲーションの別の例には、固相支持体に付けたアミ
ノ基に共有結合した反応性５’リン酸を有する二本鎖標的核酸が挙げられる。次
いでNaOH処理を行うと、それによって５’リン酸−アミン基のコンジュゲートが
崩壊し、固定化された標的核酸−５’リン酸部分が固相支持体に結合したアミン
基から解離する。
【０１００】 固相支持物質への基質の固定化は、当業者には明らかな種々の方法を介して行
い得る。本発明の方法に有用な固相支持体は、当分野における平均的な技術者に
知られている。本明細書において使用する用語「固相支持体」は、基質の付着の
ために支持表面を提供するいかなる構造体であっても良い。本発明の方法に有用
な周知の固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラスビーズ、シリ
カアエロゲル、アガロース、セファロース、セファデックス、ニトロセルロース
、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然及び改変セルロース、ポリアク
リルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、及び微孔性ポリビニリデンジフル
オライド膜等が挙げられる。標的核酸の付着及び支持を可能とするいかなる物質
をも本発明に含め得ることは理解されよう。本明細書に記載の実施例３において
、固相支持体として９６−マルチウェルプレートが利用されている。
【０１０１】 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を制限すること
は意図していない。これらは使用され得る典型的なものであるが、当業者に公知
の他の手法も代替として使用し得る。
【０１０２】実施例 以下の実施例は、当業者に対して、本発明をいかにして実施するかについての
完全な開示及び記載を提供するために示すものであり、本発明者等が本発明とし
て認識するものの範囲を制限することを意図するものではない。使用した数値（
例えば量、温度等）に関しては、正確を期すように努めたが、いくらかの実験誤
差及び偏差は考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部、分子量は
重量平均分子量、温度は摂氏、圧力は大気圧またはその近辺である。
【０１０３】実施例１ 材料及び方法 プラスミドの構築 pSKVGは、pMDG（Naldiniら、(1996) Science 272, 263-267）由来のEcoRI VSV
-G（インディアナ血清型）をBluescript SK+（Stratagene, La Jolla, CA）のEc
oRI部位にクローニングすることによって構築した。pEGFP-N1（Clontech）からS
acI/NotI消化によってGFPコーディング断片を切り出し、Bluescript SK+のSacI/
NotI断片にライゲートしてpSKGFPを作製した。pSKGFP由来のGFPコーディング領 域を含有するPstI断片、及びpSKVG由来のVSV-Gコーディング領域を含有するNheI
/EcoRV断片を、pBI（Clontech 6152-1）のPstI及びXbaI/PvuII部位にそれぞれラ
イゲートして、pBIGFVGを作製した。
【０１０４】 tetR−結合部位の7個の縦列のコピーに連結した最小CMV中期−初期遺伝子プロ
モーターを含有するBamHI/BglII断片をpcDNAneo中のCMVプロモーター（BglII/Ba
mHI断片）と置換してphCMVnを作製した。
【０１０５】 pPTKはpDR8.2（Naldiniら、上記）由来の全HIV-1タンパク質をコードするBglI
/SacII断片をphCMVn由来のBglI（部分）/SacII断片にライゲートすることによっ
て構築した。ネオマイシン耐性遺伝子を含有するXhoI断片をptTet-Off（Clontec
h K1620-A）から欠失させてptTADnを作製し、これからテトラサイクリンレプレ ッサーのカルボキシ末端及び単純疱疹ウイルスVP16のトランス活性化ドメインを
含有する融合タンパク質を、CMVプロモーターの制御下で発現させる。
【０１０６】レンチウイルスベクターパッケージング細胞系の作製 本研究における細胞系は全て、テトラサイクリン不含有１０％ウシ胎児血清（
Clontech 8630-1）を含有するダルベッコ修飾イーグル培地中に維持した。テト ラサイクリンレプレッサー／VP16トランス活性化ドメイン融合タンパク質を発現
する安定な細胞系SODk0を作製するために、ヒト293胎児腎細胞に20mgのptTADn及
びブラストシジン耐性遺伝子を発現する1mgのpSRaBSRをリン酸カルシウム沈降法
（Naldiniら、上記）によって同時トランスフェクトした。個々の細胞コロニー を20mg/mlのブラストシジンの存在下で選択した。コロニーを、20mgのpBIGFVGの
一時的トランスフェクションによるtTA発現をスクリーニングした。４個の産生 量が最も高いコロニーの単離は、蛍光顕微鏡により測定した融合した細胞の数及
びGFP発現レベルに基づいて行った。４個のコロニーのうちいずれがベクター産 生のために最も好適であるかを決定するために、コロニーに5mgのpBIGFVG、10mg
のpPTK、及び15mgのHrcmvGFP（Miyoshiら, (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 94, 10319-10323）をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間 後、ならし培地を回収し、293細胞に対するウイルス力価を段階希釈によって決 定した。2回の実験で最も産生量が高いことが見出されたコロニー（293に対する
力価＞２×１０6I.U/ml）を、安定なレンチウイルスベクターパッケージング細 胞系作製のために選択した。
【０１０７】 レンチウイルスベクターの安定なパッケージング細胞系SODk1を、SODk0細胞に
10mgのpPTK、及び10mgのpBIGFVGをトランスフェクションすることによって作製 した。トランスフェクトした細胞を、0.7mg/mlドキシサイクリンの存在下でネオ
マイシン耐性（400mg/ml）について選択した。個々のコロニーを、ドキシサイク
リンの存在下または不存在下において、HIV-1 p24及びGFP産生及び細胞融合につ
いて以下のようにスクリーニングした。コンフルエントな１０ｃｍプレートの細
胞を、予めポリリシンを被覆したプレート中に1/4の比率で分割し。誘導した細 胞をドキシサイクリンの不存在下で培養した。細胞培地は毎日交換した。対照の
細胞は0.7mg/mlドキシサイクリンの存在下で培養した。誘導の４日後、ならし培
地中のHIV-1 p24のレベルをELISA（DuPont）によってアッセイした。VSV-G産生 のためのマーカーとしての細胞融合、及びGFP産生を蛍光顕微鏡で測定した。ド キシサイクリンの存在下におけるp24及びGFP産生がネガティブであるが、誘導に
よって最高レベルのp24産生（＞800nng/ml）及び９０％を越える緑色細胞を示す
ことが見出されたコロニーを、レンチウイルスベクターのためのパッケージング
細胞系として選択した。
【０１０８】 レンチウイルスベクター産生細胞系SODk1CGFIを、SODk1細胞にHRcmvGFPレンチ
ウイルスベクターを感染多重度２で導入することによって作製した。
【０１０９】SODk1CGFI細胞系からのベクター産生 ベクター産生能を試験するために、ドキシサイクリンの不存在下において、SO
Dk1CGFI細胞をコンフルエントな１０ｃｍプレートからポリリシンを予め被覆し たプレート中に1/4の比率で分割した。分割から24時間後、PBSで細胞を２回洗浄
し、５ｍＭの酪酸ナトリウム（sodium butyrate）を含有するドキシサイクリン 不含有培地を入れた。５ｍＭの酪酸ナトリウムを含有するドキシサイクリン不含
有培地は毎日補給した。誘導したSODk1CGFIならし培地を孔サイズが0.45mmのフ ィルターで濾過し、段階希釈物によって293細胞に対するウイルス力価を、及びp
24 ELISAによりp24濃度を、それぞれ毎日アッセイした。
【０１１０】 更にベクターを濃縮するために、酪酸ナトリウムの添加３日後にならし培地を
回収し、上記のように濾過し、50,000×ｇで２時間超遠心分離した。ペレットを
、10ｍＭ MgCl2、４種のdNTP（各0.1ｍＭ）、３ｍＭスペルミン、及び0.3ｍＭス
ペルミジンを含有するTris緩衝生理食塩水（TBS）に再懸濁し、３７℃で２時間 インキュベートした。50,000×ｇで２時間の２回目の超遠心分離の後、２mg/ml ポリブレンを含有するTBSに再懸濁した。濃縮したベクターをp24濃度についてア
ッセイし、上記のように293細胞に対する力価を測定した。
【０１１１】 ウエスタン解析を実施し、SODk1CGFI細胞におけるVSV-Gタンパク質の誘導能及
びHIV-1 Vpr産生を試験した。誘導細胞（酪酸ナトリウム添加3日後）及び非誘導
細胞（ドキシサイクリンの存在下で培養）を、68ｍＭ tris（ｐＨ6.8）、50ｍＭ
NaCl、0.5ｍＭ EDTA、0.5アプロチニン、50mg/ml PMSF、1.5％ SDS、５％グリ セロール、５％ β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液中で10分間沸騰さ せることで溶解し、タンパク質を変性させた。20ｍｇの変性タンパク質をSDS含 有12.5％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Immobilon-P膜（Millipore）上に
ブロットした。PBS中５％の脱脂粉乳、0.2％のTween20で15分間ブロッキングし た後、膜をマウスモノクローナル抗VSV-G（Sigma V-5507）またはウサギHIV-1 V
pr（国立アレルギー及び感染疾患研究所、AIDS研究及び参考試薬プログラム(Nat
ional Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Research and Ref
erence Reagent Program)、試薬3252）と共にインキュベートし、次いでヤギ抗 マウスIg HRP（pierce）またはロバ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Amer
sham）と共にそれぞれインキュベートした。タンパク質のバンドをECLキット（A
mersham）で検出した。
【０１１２】in vitroにおける非分裂細胞への形質導入 誘導したSODkCGFVGIならし培地の段階希釈を使用して、15mg/mlのアフィジコ リンの存在下で１２時間培養することによって細胞周期を停止させた（arrested
）HeLa細胞、アフィジコリンの不存在下で培養したHeLa細胞、0.1％ウシ胎児血 清中で４８時間培養することによって細胞周期を停止させたヒト胎児繊維芽細胞
、及び１０％ウシ胎児血清中で培養したヒト胎児繊維芽細胞に形質導入した。形
質導入の４８時間後、GFP陽性fociを希釈因子（dilution factor）で除した数に
よって力価を算定した。in vivoにおける末端分化非分裂細胞への形質導入
【０１１３】 成体雌Fischer344ラットを記載されているように（Naldiniら、上記）麻酔し 、３mlの濃縮ベクター（１×１０9I.U/ml）を５ｍｌのHamiltonシリンジを用い て左線条（前後、＋0.2；内外、−3.5；背腹、−4.5）中に注入した。４週間後 、動物を屠殺し、75ｍｌの生理食塩水、次に200ｍｌの４％パラホルムアルデヒ ド、及び0.2％グルタルアルデヒドを環流させた。固定した脳を30％ショ糖で飽 和させ、凍結して50ｍｍ片に切片化した。
【０１１４】 一次抗体を、10％ロバ血清及び0.3％TritonX-100を含有するTBS中にプールし 、４℃で48時間インキュベートした。
【０１１５】実施例２ ５ｍＭ酪酸ナトリウム存在下におけるドキシサイクリン除去（withdrawal）に
よるSODk1細胞の誘導により、p24ELISAによる測定でHIV-1タンパク質の産生が生
じた。HIV-1 p24は、誘導１日後から誘導６日後まで検出でき、その後有意な細 胞死を観察することができた。p24の最大レベルは800nng/mlを超え、誘導後２日
から３日で検出された。非誘導細胞ではp24は検出できなかった。
【０１１６】 GFP産生は誘導２日後から検出できた。VSV-G産生のインジケーターとしての細
胞融合は誘導３日後から観察できた。非誘導細胞においては、細胞融合及びGFP 産生はいずれも蛍光顕微鏡で検出できなかった。
【０１１７】SODk1CGFI細胞 上記のように、SODk1CGFI細胞の誘導により、p24 ELISAによる測定でHIV-1タ ンパク質の産生が生じた。HIV-1 p24は誘導後１日から６日まで測定できた。最 大p24レベル（＞1000nng/ml）は誘導後２−３日に検出できた。誘導細胞におけ るHIV-1 Vprの産生はウエスタン解析によって測定した。
【０１１８】 誘導細胞におけるVSV-Gタンパク質の産生はウエスタン解析によって測定した 。誘導された細胞によるベクター産生は、誘導後１日から６日まで検出できた。
293細胞に対する段階希釈による測定での最大力価1.5×１０6I.Uは、感染後２−
３日に得ることができた。ベクターは超遠心分離により１×１０9I.Uまで濃縮で
きた。
【０１１９】 ベクターはin vitro及びin vivoにおいて非分裂細胞に形質導入することがで きることが示された。培養した細胞周期停止細胞に対するベクター力価は分裂細
胞に対する力価と異ならなかった。成体ラット脳へのベクターの注入により、末
端まで分化した非分裂ニューロンへの形質導入が得られた（方法については、参
照により全体を組み入れるCohenら、1996, Science 272:195を参照すること）。
【０１２０】 HIV-1 p24及びVprタンパク質の産生は、非誘導細胞においてはELISAまたはウ エスタン解析ではいずれも検出できなかった。
【０１２１】 非誘導細胞において、VSV-Gタンパク質の産生はウエスタン解析によって検出 できなかった。ベクター産生は非誘導細胞では検出できなかった。
【０１２２】実施例３ 本発明は更に、上記の例に記載したような細胞系によって産生したHIVベース のベクターを使用した、in vitroにおけるレトロウイルスの組み込みのためのア
ッセイの確立に関連する。
【０１２３】 HIVベースのベクター粒子を含有する上清を、本明細書に記載したパッケージ ング細胞系から得た。パッケージング細胞系の例としては、293HeLa、Cf2Th、D1
7、MDCK、またはBHK細胞由来のものがあり、最も好ましくは293細胞由来のもの である。これらの細胞系由来のウイルス粒子を濃縮して使用し、293T標的細胞に
感染させた。次に293T細胞を溶解し、ウイルス複製中間体を回収した。（例えば
、参照により本明細書に組み込まれるFarnet及びHaseltine, PNAS 87:4164, 199
0; Ellisonら, J. Virol. 64:2711, 1990を参照すること）。「組込み前複合体 」（PIC）と名付けるこれらの中間体は、ウイルスタンパク質及び細胞タンパク 質に結合したウイルスcDNAを含有する。こうしたウイルスタンパク質の一つであ
るインテグラーゼは、ウイルスcDNAの標的DNAへの共有結合を指令する。従って 、本発明の方法はPICを利用して、添加された標的核酸へのウイルスcDNAのin vi
troでの共有結合的組み込みを果たすものである。こうした方法は、インテグラ ーゼ阻害剤の迅速なスクリーニングのため、製薬業界において有用であり、また
HIV研究において特に重要である。
【０１２４】 本明細書に記載の組み込みアッセイは96ウェルマイクロタイタープレートを利
用した。図１に示すように、反応性５’リン酸を有する線状２本鎖標的DNA（ド ットで示す）は、アミンを被覆したマイクロタイターウェルに共有結合した（図
１A）。アミン基を「Ｎ」で示す。ウェルにHIVベースの組込み前複合体（PIC） を添加した（図１B）。組み込み反応により、ウイルスcDNA（太線で示す）の３ ’末端が標的DNAに共有結合した。組み込まれなかったHIV cDNA分子は洗浄除去 した。次いでDNA鎖をNaOH変性によって放出させた（図１D）。放出された配列に
含まれる組み込まれたHIV核酸を検出し、定量した（図１E及び図２）。アミンプ
レートから放出された組み込み産物を、HIV配列に相補的なプライマーを用いてP
CRにより増幅し、アガロースゲル電気泳動を用いて検出した（図２）。５回の組
み込み反応の結果を図２に示す。標準条件、レーン１；20ｍＭ EDTA添加、レー ン２；15ｍＭ MgCl2、レーン３；0.1％ SDS、レーン４；及び0.5％ Tx-100、レ ーン５．標準条件は、150ｍＭ KCl、20ｍＭ Hepes pH7.4、５ｍＭ MgCl2、５％
DMSO、及び0.2％ BSAとした。DNAマーカーはレーンＭ、そしてHIV配列のコピー 数標準を右側に示す。
【０１２５】 以上、本発明を現時点において好ましい実施形態を参照しながら記載したが、
本発明の精神から外れることなく種々の改変をし得ることは理解されるべきであ
る。従って本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1A〜1Eは、組込み前複合体(PIC)の組込み活性を検出するために有用なアッ セイのダイアグラムを示す。図はマイクロタイタープレート形式を示す。
【図２】 図２は、アミンプレートから放出され、続いてHIV配列に相補的なプライマー を用いてPCRによって増幅された組込み産物のアガロースゲルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 10010 Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉ ｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃ ａｌｉｆｏｒｎｉａ 92037，Ｕｎｉｔｅ ｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 カフリ，タル アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州，サンディエゴ，カミノ ヒュータ 7873 (72)発明者 ブッシュマン，フレデリック アメリカ合衆国 92024 カリフォルニア 州， エンシンタス，バーグンディー ロ ード 1555 (72)発明者 ハンセン，マーク アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア 州，サンディエゴ，リナルト ストリート 2937 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA32 BA33 BA34 BA35 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 FA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ10 QQ43 QR32 QS34 4B065 AA90X AA95Y AA96Y AA97Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA45 CA46 4C084 AA13 MA05 4C087 BC83

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下のポリヌクレオチド： 第１の誘導性プロモーターに機能的に連結された、シス作動性エレメントと自
    己複製と機能性Envタンパク質の発現とに欠陥のあるHIVゲノムを有する第１のポ
    リヌクレオチド、 第２の誘導性プロモーターに機能的に連結された、機能性異種Envタンパク質 をコードする第２のポリヌクレオチド、および 第１および第２の誘導性プロモーターからの転写を制御する調節可能な転写ア
    クチベーターをコードする第３のポリヌクレオチド、 を含むパッケージング細胞系。
  2. 【請求項２】 第１、第２および第３のポリヌクレオチドがベクターからな
    る、請求項１記載のパッケージング細胞系。
  3. 【請求項３】 前記ベクターがプラスミドである、請求項２記載のパッケー
    ジング細胞系。
  4. 【請求項４】 第２のポリヌクレオチドがプラスミドpBIGFVGからなる、請 求項３記載のパッケージング細胞系。
  5. 【請求項５】 前記Envタンパク質が両種指向性宿主域を有する、請求項１ 記載のパッケージング細胞系。
  6. 【請求項６】 前記Envタンパク質が他種指向性宿主域を有する、請求項１ 記載のパッケージング細胞系。
  7. 【請求項７】 前記Envタンパク質が同種指向性宿主域を有する、請求項１ 記載のパッケージング細胞系。
  8. 【請求項８】 第２のポリヌクレオチドがウイルスのエンベロープタンパク
    質を発現し、該ウイルスがセンダイウイルス、インフルエンザウイルス、シンド
    ビスウイルス、ヘルペスウイルスおよび水泡性口内炎ウイルスからなる群より選
    択される、請求項１記載のパッケージング細胞系。
  9. 【請求項９】 第２のポリヌクレオチドが水泡性口内炎ウイルスのＧ糖タン
    パク質を発現する、請求項８記載のパッケージング細胞系。
  10. 【請求項１０】 前記細胞が肝細胞、ストロマ細胞、筋原細胞、線維芽細胞
    および胚性幹細胞からなる群より選択される、請求項１記載のパッケージング細
    胞系。
  11. 【請求項１１】 前記細胞が293細胞である、請求項10記載のパッケージン グ細胞系。
  12. 【請求項１２】 前記細胞がSODK1細胞である、請求項11記載のパッケージ ング細胞系。
  13. 【請求項１３】 前記調節可能なトランスアクチベーターがテトラサイクリ
    ンオペロン調節トランスアクチベーターである、請求項１記載のパッケージング
    細胞系。
  14. 【請求項１４】 前記誘導性プロモーターがテトラサイクリントランスアク
    チベーターまたはドキシサイクリントランスアクチベーター誘導性プロモーター
    である、請求項１記載のパッケージング細胞系。
  15. 【請求項１５】 前記誘導性プロモーターがエクジソンプロモーターである
    、請求項１記載のパッケージング細胞系。
  16. 【請求項１６】 前記誘導性プロモーターがlacZトランスアクチベータープ
    ロモーターである、請求項１記載のパッケージング細胞系。
  17. 【請求項１７】 少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む、請求項１記
    載のパッケージング細胞系。
  18. 【請求項１８】 選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項１記載
    のパッケージング細胞系。
  19. 【請求項１９】 vpr、vif、nef、vpx、tat、revおよびvpuからなる群より 選択される１以上のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１記載のパッケージ
    ング細胞系。
  20. 【請求項２０】 パッケージング細胞系の作製方法であって、 a) 適当な細胞を、 i) 第１の誘導性プロモーターに機能的に連結された、シス作動性エレメ
    ントと自己複製と機能性Envタンパク質の発現とに欠陥のあるHIVゲノムを有する
    第１のポリヌクレオチド、 ii) 第２の誘導性プロモーターに機能的に連結された、機能性異種Envタ ンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド、および iii)第１および第２の誘導性プロモーターからの転写を制御する調節可能
    な転写アクチベーターをコードする第３のポリヌクレオチド、 を用いてトランスフェクトし、 b) ステップa)でトランスフェクトした細胞を、該ポリヌクレオチドによりコ
    ードされるタンパク質を含む細胞のスクリーニングを可能にする条件下で培養す
    る、 ことを含んでなる方法。
  21. 【請求項２１】 前記細胞を、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド
    を用いて同時トランスフェクトすることをさらに含む、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項21記載
    の方法。
  23. 【請求項２３】 第１、第２および第３のポリヌクレオチドがベクターから
    なる、請求項20記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記ベクターがプラスミドである、請求項23記載の方法。
  25. 【請求項２５】 第２のポリヌクレオチドがプラスミドpBIGFVGからなる、 請求項24記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記Envタンパク質が両種指向性宿主域を有する、請求項2
    0記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記Envタンパク質が他種指向性宿主域を有する、請求項2
    0記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記Envタンパク質が同種指向性宿主域を有する、請求項2
    0記載の方法。
  29. 【請求項２９】 第２のポリヌクレオチドが水泡性口内炎ウイルスのＧ糖タ
    ンパク質を発現する、請求項20記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記細胞が293細胞である、請求項20記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記細胞がSODK1細胞である、請求項30記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記調節可能なトランスアクチベーターがテトラサイクリ
    ンオペロン調節トランスアクチベーターである、請求項20記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記誘導性プロモーターがテトラサイクリントランスアク
    チベーターまたはドキシサイクリントランスアクチベーター誘導性プロモーター
    である、請求項20記載の方法。
  34. 【請求項３４】 vpr、vif、nef、vpx、tat、revおよびvpuからなる群より 選択される１以上のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項20記載の方法。
  35. 【請求項３５】 組換えレトロウイルスの作製方法であって、 パッケージングシグナルをコードするポリヌクレオチド、外因性非HIVポリヌ クレオチド、RNA輸送シグナルおよびレンチウイルスLTR配列を含むレンチウイル
    スベクターを用いて、請求項１記載のパッケージング細胞系をトランスフェクト
    することを含んでなる方法。
  36. 【請求項３６】 RNA輸送シグナルがRev応答エレメントである、請求項35記
    載の方法。
  37. 【請求項３７】 外因性非HIVポリヌクレオチドが増殖因子、サイトカイン 、ホルモン、神経栄養因子および免疫調節剤からなる群より選択されるポリペプ
    チドをコードする、請求項35記載の方法。
  38. 【請求項３８】 請求項35記載の方法により作製された組換えレトロウイル
    ス。
  39. 【請求項３９】 受容細胞の染色体に外因性非HIVポリヌクレオチドを導入 する方法であって、 該受容細胞に請求項35記載の方法により作製された組換えレトロウイルスを接
    触させ、該外因性非HIVポリヌクレオチドを染色体に組み込むことを含んでなる 方法。
  40. 【請求項４０】 前記受容細胞が内皮細胞、骨髄性細胞、骨髄細胞、幹細胞
    、リンパ球、肝細胞、線維芽細胞、肺細胞、筋細胞、胚性細胞および神経細胞か
    らなる群より選択される、請求項39記載の方法。
  41. 【請求項４１】 標的核酸配列に組み込まれたウイルス核酸配列を検出する
    方法であって、 a) 標的核酸配列を固相支持体に可逆的に固定し、 b) ステップa)の標的核酸に、ウイルス核酸配列を含むウイルス組込み前複合
    体(PIC)を、標的核酸配列へのウイルス核酸配列の組込みを可能にする条件下で 十分な時間にわたり接触させ、 c) 組み込まれたウイルス核酸配列を検出する、 ことを含んでなる方法。
  42. 【請求項４２】 ステップc)の前に、固定した標的核酸を放出させることを
    さらに含む、請求項41記載の方法。
  43. 【請求項４３】 ウイルス組込み前複合体(PIC)がHIV感染細胞から単離する
    、請求項41記載の方法。
  44. 【請求項４４】 標的核酸が細胞性核酸である、請求項41記載の方法。
  45. 【請求項４５】 検出をPCRで行なう、請求項41記載の方法。
  46. 【請求項４６】 ウイルスインテグラーゼ活性の検出方法であって、 a) 標的核酸配列を固相支持体に可逆的に固定し、 b) ステップa)の標的核酸に、ウイルス核酸配列およびインテグラーゼ活性を
    含むウイルス組込み前複合体(PIC)を、標的核酸配列へのウイルス核酸配列の組 込みを可能にする条件下で十分な時間にわたり接触させ、 c) 組み込まれたウイルス核酸配列を検出する、 ことを含んでなり、その際、標的核酸配列中のウイルス核酸配列の存在がインテ
    グラーゼ活性を示すものである、上記方法。
  47. 【請求項４７】 ウイルスインテグラーゼ活性がHIVインテグラーゼである 、請求項46記載の方法。
  48. 【請求項４８】 標的核酸が細胞性核酸である、請求項46記載の方法。
  49. 【請求項４９】 組込み前複合体(PIC)中に含まれるウイルスインテグラー ゼ活性を調節する化合物の同定方法であって、 a) 標的核酸配列を固相支持体に可逆的に固定し、 b) ステップa)の標的核酸に、ウイルス核酸配列を含むウイルス組込み前複合
    体(PIC)を、標的核酸配列へのウイルス核酸配列の組込みを可能にする条件下で 十分な時間にわたり接触させ、 c) ステップb)の前またはステップb)と同時に、該組込み前複合体(PIC)にイ ンテグラーゼ活性を調節すると予想される化合物を接触させ、 d) 組み込まれたウイルス核酸配列を検出する、 ことを含んでなり、その際、標的核酸配列に組み込まれたウイルス核酸配列の量
    がインテグラーゼ活性に及ぼす該化合物の効果を示すものである、上記方法。
  50. 【請求項５０】 インテグラーゼ活性に及ぼす前記化合物の効果が阻害であ
    る、請求項49記載の方法。
  51. 【請求項５１】 ウイルスインテグラーゼ活性がHIVインテグラーゼである 、請求項49記載の方法。
  52. 【請求項５２】 標的核酸が細胞性核酸である、請求項49記載の方法。
JP2000536843A 1998-03-18 1999-03-18 レトロウイルスパッケージング細胞系 Pending JP2002506641A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4408598A 1998-03-18 1998-03-18
US09/044,085 1998-03-18
US09/148,575 1998-09-03
US09/148,575 US6218181B1 (en) 1998-03-18 1998-09-03 Retroviral packaging cell line
PCT/US1999/005982 WO1999047660A1 (en) 1998-03-18 1999-03-18 Retroviral packaging cell line

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002506641A true JP2002506641A (ja) 2002-03-05

Family

ID=26721161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000536843A Pending JP2002506641A (ja) 1998-03-18 1999-03-18 レトロウイルスパッケージング細胞系

Country Status (6)

Country Link
US (2) US6218181B1 (ja)
EP (1) EP1064363A1 (ja)
JP (1) JP2002506641A (ja)
AU (1) AU3100699A (ja)
CA (1) CA2324028C (ja)
WO (1) WO1999047660A1 (ja)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5888767A (en) * 1996-11-27 1999-03-30 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of using a conditionally replicating viral vector to express a gene
US6908770B1 (en) * 1998-07-16 2005-06-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Fluid based analysis of multiple analytes by a sensor array
WO2000071678A1 (en) * 1999-05-25 2000-11-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Inducible packaging cell lines for lentivirus vectors
CA2424998A1 (en) * 2000-10-10 2002-04-18 The Regents Of The University Of California Nucleic acid integration assay
US7575924B2 (en) 2000-11-13 2009-08-18 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
US20030026791A1 (en) * 2001-03-27 2003-02-06 Laurent Humeau Conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections
WO2003012054A2 (en) 2001-08-02 2003-02-13 Institut Clayton De La Recherche Methods and compositions relating to improved lentiviral vector production systems
ATE439041T1 (de) 2001-09-13 2009-08-15 California Inst Of Techn Verfahren zur expression von kleinen antiviralen rna-molekülen innerhalb einer zelle
WO2003022228A2 (en) 2001-09-13 2003-03-20 California Institute Of Technology Method for producing transgenic birds and fish
WO2003029412A2 (en) * 2001-10-02 2003-04-10 Institut Clayton De La Recherche Restricted expression lentivial vectors
EP1468094A4 (en) * 2001-12-24 2005-01-26 Es Cell Int Pte Ltd METHOD OF TRANSDUCTING ES CELLS
AU2002351884B2 (en) * 2001-12-24 2008-09-18 Es Cell International Pte Ltd Method of transducing ES cells
DK1472286T3 (da) * 2002-02-05 2007-08-20 Geymonat Spa Produktionsmetode til rekombinant placental vækstfaktor
US8257967B2 (en) * 2002-04-26 2012-09-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and system for the detection of cardiac risk factors
JP2006503555A (ja) * 2002-06-26 2006-02-02 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド タンパク質産生方法および使用するための改変細胞
WO2004055157A2 (en) * 2002-08-13 2004-07-01 Whitley Chester B Methods of using vectors to treat metabolic disorders
WO2004048583A2 (en) * 2002-11-22 2004-06-10 Institut Clayton De La Recherche Compositions and systems for the regulation of genes
WO2004098531A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Virxsys Corporation Increased transduction using abc transporter substrates and/or inhibitors
US20050069918A1 (en) * 2003-05-29 2005-03-31 Francois Claret JAB1 as a prognostic marker and a therapeutic target for human cancer
WO2004106517A1 (en) * 2003-06-03 2004-12-09 Benitec Australia Limited Double-stranded nucleic acid
WO2005037218A2 (en) * 2003-10-17 2005-04-28 Actis Biologics, Inc. Lentiviral vector delivery of il-21 for treatment of cancer
WO2005059551A2 (en) * 2003-12-11 2005-06-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and system for the analysis of saliva using a sensor array
US20060134612A1 (en) * 2004-02-10 2006-06-22 Frederic Bushman Methods and compositions for retroviral preintegration complex-based assays
US8105849B2 (en) * 2004-02-27 2012-01-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements
US8101431B2 (en) 2004-02-27 2012-01-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements and reagent delivery systems
ATE508190T1 (de) 2004-03-05 2011-05-15 Benitec Inc Mehrfachpromotor-expressionskassetten zurgleichzeitigen zuführung von rnai-agentien
DE102004034461B4 (de) * 2004-07-16 2008-02-07 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Gentherapie solider Tumore durch retrovirale, mit Arenavirus-Glykoprotein pseudotypisierte Vektoren
US20070036740A1 (en) * 2004-10-06 2007-02-15 Reed Kenneth C Modulation of hair growth
AU2005299672A1 (en) * 2004-10-22 2006-05-04 Benitec, Inc. Therapeutic RNAi agents for treating psoriasis
SG158174A1 (en) * 2005-01-06 2010-01-29 Benitec Inc Rnai agents for maintenance of stem cells
US7803611B2 (en) 2005-02-03 2010-09-28 Benitec, Inc. RNAi expression constructs
WO2006089001A2 (en) 2005-02-16 2006-08-24 Lentigen Corporation Lentiviral vectors and their use
US8008468B2 (en) * 2005-02-16 2011-08-30 Benitec, Inc. RNAi expression constructs with liver-specific enhancer/promoter
CN101228176A (zh) * 2005-04-28 2008-07-23 贝尼泰克有限公司 用于同时递送与杂合表达模式相关的RNAi因子的多重RNAi表达盒
EP1910824A4 (en) 2005-05-31 2012-11-21 Labnow Inc METHOD AND COMPOSITIONS RELATED TO THE PREPARATION AND USE OF A WHITE BLOOD IMAGE
AU2006252406B2 (en) 2005-06-01 2012-05-17 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
EP2508867A1 (en) * 2005-06-24 2012-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Systems and methods including self-contained cartridges with detection systems and fluid delivery systems
WO2008011636A2 (en) * 2006-07-21 2008-01-24 California Institute Of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
WO2008069663A1 (en) 2006-12-07 2008-06-12 Publiekrechtelijke Rechtspersoon Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Leids Universitair Medisch Centrum Use of a varicellovirus tap-inhibitor for the induction of tumor- or virus-specific immunity against teipp
DK2147105T3 (da) 2007-05-02 2013-06-03 Merial Ltd Dna-plasmider med forbedret ekspression og stabilitet
WO2010087702A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Stichting Katholieke Universiteit TET2 gene as a marker for diagnosing a myelodysuplastic syndrome (MDS) or an acute myeloid leukemia (AML) and determining the prognosis in a subject
AU2010211428B2 (en) 2009-02-03 2015-09-03 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising said stem cells.
US9752124B2 (en) 2009-02-03 2017-09-05 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium for epithelial stem cells and organoids comprising the stem cells
EP2412800A1 (en) 2010-07-29 2012-02-01 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
EP2456786B2 (en) 2009-07-24 2017-04-19 Immune Design Corp Lentiviral vectors pseudotyped with a sindbis virus envelope glycoprotein
WO2011034421A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut Fra-1 target genes as drug targets for treating cancer
EP2305717A1 (en) 2009-09-21 2011-04-06 Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen Inhibiting TNIK for treating colon cancer
WO2011085247A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Immusoft Corporation Vectors and methods for transducing b cells
CN101935675B (zh) * 2010-01-14 2012-06-06 山东农业大学 细胞膜表达ALV-env蛋白荧光真核转基因表达质粒的构建与应用
US20110237653A1 (en) * 2010-03-28 2011-09-29 Scheiber Lane Bernard Rna vector therapy method
US20110236483A1 (en) * 2010-03-28 2011-09-29 Scheiber Lane Bernard Rna vector therapy
EP2605798A1 (en) 2010-07-12 2013-06-26 Universidad Autònoma de Barcelona Gene therapy composition for use in diabetes treatment
WO2012047093A1 (en) 2010-10-05 2012-04-12 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Treatment of the sjögren's syndrome
CN103370415B (zh) 2010-10-28 2017-05-31 本尼特生物制药有限公司 Hbv治疗
EP2465928A1 (en) 2010-12-16 2012-06-20 Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam Treatment of Th17-mediated diseases
US9567649B2 (en) 2011-04-28 2017-02-14 Jørn Erland Koch System for identification of microorganism and detection of infectious disease
GB201202516D0 (en) 2012-02-13 2012-03-28 Ucl Business Plc Materials and methods relating to packaging cell lines
US9713635B2 (en) 2012-03-30 2017-07-25 Immune Design Corp. Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles
ES2707288T3 (es) 2012-03-30 2019-04-03 Immune Design Corp Partículas de vectores lentivíricos que tienen eficiencia de transducción mejorada para células que expresan DC-SIGN
US8323662B1 (en) 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein
AU2013281328B2 (en) 2012-06-27 2017-11-23 Meiragtx Uk Ii Limited Combination for treating an inflammatory disorder
EP2852668B1 (en) 2012-07-12 2016-04-27 ProQR Therapeutics II B.V. Oligonucleotides for making a change in the sequence of a target rna molecule present in a living cell
EP2692868A1 (en) 2012-08-02 2014-02-05 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue
CA2906674C (en) 2013-03-14 2023-01-10 Immusoft Corporation Methods for in vitro memory b cell differentiation and transduction with vsv-g pseudotyped viral vectors
SG11201507510PA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Jackson Lab Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
CA2971430A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Immusoft Corporation B cells for in vivo delivery of therapeutic agents
WO2016110518A1 (en) 2015-01-07 2016-07-14 Universitat Autònoma De Barcelona Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes
MX2018002090A (es) 2015-08-24 2018-09-12 Halo Bio Rnai Therapeutics Inc Nanoparticulas de polinucleótido para modulación de expresión génica y sus usos.
SG11201803369TA (en) 2015-10-23 2018-05-30 Jackson Lab Nicotinamide for use in the treatment and prevention of ocular neurodegenerative disorder (e.g. glaucoma)
JP2018537432A (ja) 2015-11-09 2018-12-20 イミューン デザイン コーポレイション Ｉｌ−１２を発現するレンチウイルスベクターを含む組成物およびその使用法
CA3004132A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Immune Design Corp. A retroviral vector for the administration and expression of replicon rna expressing heterologous nucleic acids
WO2017123688A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 University Of Cincinnati A lentivirus packaging system comprising a synthetic positive feedback loop
KR20180111874A (ko) 2016-02-23 2018-10-11 이뮨 디자인 코포레이션 멀티게놈 레트로바이러스 벡터 제제 및 이를 생산 및 사용하는 방법 및 시스템
EP3469361A1 (en) 2016-06-10 2019-04-17 UMC Utrecht Holding B.V. Novel method for identifying deltat-cell (or gammat-cell) receptor chains or parts thereof that mediate an anti-tumour or an anti-infective response
AU2018212002A1 (en) 2017-01-30 2019-08-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant virus vectors for the treatment of glycogen storage disease
WO2018148180A2 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Immune Design Corp. Materials and methods for identifying and treating cancer patients
CN110913886A (zh) 2017-05-24 2020-03-24 巴塞罗那自治大学 包含成纤维细胞生长因子21(fgf21)编码序列的病毒表达构建体
US11725185B2 (en) 2017-12-28 2023-08-15 University Of Houston System Stem cell culture systems for columnar epithelial stem cells, and uses related thereto
EP3765601A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 Immusoft Corporation B cells genetically engineered to secrete follistatin and methods of using the same to treat follistatin-related diseases, conditions, disorders and to enhance muscle growth and strength
WO2019219979A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Umc Utrecht Holding B.V. Compositions and methods for cell targeting therapies
CN113227126A (zh) 2018-11-26 2021-08-06 巴塞罗那自治大学 成纤维细胞生长因子21(fgf21)基因治疗
JP2022534733A (ja) 2019-05-31 2022-08-03 ウニベルシダッド アウトノマ デ バルセロナ インスリン遺伝子治療
AU2021281506A1 (en) 2020-05-26 2023-02-02 Universitat Autònoma De Barcelona Fibroblast growth factor 21 (FGF21) gene therapy for central nervous system disorders
EP4203989A2 (en) 2020-09-03 2023-07-05 Rampart Bioscience, Inc. Soluble alkaline phosphatase constructs and expression vectors including a polynucleotide encoding for soluble alkaline phosphatase constructs
JP2023552531A (ja) 2020-12-10 2023-12-18 サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド 接着細胞のための懸濁モードシードトレイン開発
WO2022162067A1 (en) 2021-01-30 2022-08-04 Universitat Autònoma De Barcelona Gene therapy for monogenic diabetes
WO2022221462A1 (en) 2021-04-13 2022-10-20 Kriya Therapeutics, Inc. Vector constructs for delivery of nucleic acids encoding therapeutic vlcad or mcad and methods of using the same
EP4089171A1 (en) 2021-05-12 2022-11-16 Fundación del Sector Público Estatal Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas Carlos III (F.S.P. CNIO) Recombinant tert-encoding viral genomes and vectors
WO2022258606A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Gadeta B.V. Delta T-cell or Gamma T-cell receptor chains or parts thereof that mediate an anti-tumour or anti-infective response
AU2022312170A1 (en) 2021-07-16 2024-02-08 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Oligonucleotide for inhibiting quaking activity
WO2023212683A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Kriya Therapeutics, Inc. Insulin and glucokinase gene therapy compositions and its use for treating diabetes
WO2023227594A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Gadeta Bv Novel deltat-cell receptor chains, gammat-cell receptor chains, or parts thereof
WO2023237541A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Gadeta B.V. Delta t-cell or gamma t-cell receptor chains or parts thereof that mediate an anti-tumour or anti-infective response
WO2024013402A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Gadeta B.V. Novel soluble gamma t-cell (or soluble delta t-cell) receptor chains (or soluble gammadelta t-cell receptors) or fragments thereof that mediate an anti-tumour or an anti-infective response
WO2024052413A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Universitat Autònoma De Barcelona Beta-hexosaminidase vectors
WO2024100136A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Gadeta B.V. Novel method for obtaining gamma t-cell (or delta t-cell) receptor chains (or gamma delta t-cell receptors) or fragments thereof that mediate an anti-tumour or an anti-infective response

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591624A (en) 1988-03-21 1997-01-07 Chiron Viagene, Inc. Retroviral packaging cell lines
EP0432216A1 (en) 1988-09-01 1991-06-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges
US5665577A (en) 1989-02-06 1997-09-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
GB8923123D0 (en) 1989-10-13 1989-11-29 Connaught Lab A vaccine for human immunodeficiency virus
CA2067778A1 (en) 1989-10-16 1991-04-17 The Whitehead Institute For Biomedical Research Non-infectious hiv-1 particles and uses therefor
EP0536234A4 (en) 1990-06-20 1993-09-15 Dana Farber Cancer Institute Vectors containing hiv packaging sequences, packaging defective hiv vectors, and uses thereof
US5817491A (en) 1990-09-21 1998-10-06 The Regents Of The University Of California VSV G pseusdotyped retroviral vectors
US5470726A (en) 1991-02-22 1995-11-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retrovirus packaging and producer cell lines based on gibbon ape leukemia virus
EP0630409B1 (en) 1992-02-28 2002-11-27 Syngenix Limited Defective packaging non-oncoviral vectors based on mpmv
JPH08500005A (ja) 1992-03-27 1996-01-09 ホワイトヘッド インスティチュート フォー バイオメディカル リサーチ 非感染性ｈｉｖ粒子およびその用途
TW258789B (ja) 1992-09-28 1995-10-01 Rohm & Haas
DE69430646T2 (de) 1993-02-17 2003-01-02 Wisconsin Alumni Res Found Retroviren vom Typ "more-complex", die LTR von gemischtem Typ enthalten und deren Anwendungen
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5576201A (en) 1994-01-14 1996-11-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Retroviral vector particles for transducing non-proliferating cells
US5750396A (en) 1995-05-08 1998-05-12 St. Judes Children's Research Hospital Stable virus packaging cell lines
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999047660A9 (en) 2000-05-04
WO1999047660A1 (en) 1999-09-23
AU3100699A (en) 1999-10-11
US6727058B2 (en) 2004-04-27
US6218181B1 (en) 2001-04-17
US20010009772A1 (en) 2001-07-26
CA2324028C (en) 2008-01-08
EP1064363A1 (en) 2001-01-03
CA2324028A1 (en) 1999-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002506641A (ja) レトロウイルスパッケージング細胞系
EP0960116B1 (en) Inducible expression system useful in the generation of packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors
US5739018A (en) Packaging cell lines for pseudotyped retroviral vectors
Reiser et al. Development of multigene and regulated lentivirus vectors
WO1998005754A9 (en) Packaging cell lines containing expression constructs producing pseudotyped retroviral vectors
US6531123B1 (en) Lentiviral vectors
US8222188B2 (en) Antibody libraries
CA3076270C (en) Retroviral vectors
US11129890B1 (en) Non-integrating HIV-1 comprising mutant RT/IN proteins and the SARS-CoV-2 spike protein
WO2021218000A1 (zh) 用于逆转录病毒载体的生产细胞和包装细胞及其制备方法
US7078031B2 (en) Pseudotyped lentiviral vectors and uses thereof
US5554528A (en) Compositions and methods for inhibition of HIV production
US20050158712A1 (en) Methods for purifying viral particles for gene therapy
Kashanchi et al. Second-site long terminal repeat (LTR) revertants of replication-defective human immunodeficiency virus: effects of revertant TATA box motifs on virus infectivity, LTR-directed expression, in vitro RNA synthesis, and binding of basal transcription factors TFIID and TFIIA
Richardson et al. Intrabody-mediated knockout of the high-affinity IL-2 receptor in primary human T cells using a bicistronic lentivirus vector
Chang et al. Lentiviral vectors preparation and use
JP2003517312A (ja) ウシ免疫不全ウイルス由来ベクター
US20070042494A1 (en) Heterologous retroviral packaging system
Koo et al. Retrovirus-mediated gene transfer
CA2604824C (en) Retroviral packaging cell line
Bear Bushman et al.
US20050026288A1 (en) Inducible protein expression system
Gura et al. Verma et al.
Yang Preparation of recombinant retroviruses
JP2003500050A (ja) 改善されたベクターの選択方法