JP2003500050A

JP2003500050A - 改善されたベクターの選択方法

Info

Publication number: JP2003500050A
Application number: JP2000620071A
Authority: JP
Inventors: キングズマン，アラン・ジョン; スリングスビー，ジェイソン; ヤップ，メルヴィン
Original assignee: オックスフォードバイオメディカ（ユーケイ）リミテッド
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-22
Publication date: 2003-01-07
Also published as: GB0122062D0; GB2363607A; NZ515477A; EP1183382A2; CN1353764A; IL145308A0; KR20020008406A; WO2000071693A3; US20020119562A1; CA2365564A1; AU4936500A; WO2000071693A2

Abstract

(57)【要約】（ａ）パッケージングシグナルを含むレトロウイルスゲノムに１つ以上の無作為の突然変異を導入するステップと、（ｂ）突然変異を誘発されたレトロウイルスゲノムを、レトロウイルスゲノムのパッケージングに必要なウイルスポリペプチドを発現する宿主細胞に導入するステップと、（ｃ）細胞中のレトロウイルスパッケージング効率が、突然変異のないパッケージングシグナルを含むレトロウイルスゲノムと比較して、改善されているかどうかを決定するステップと、（ｄ）パッケージング効率を改善したウイルスゲノムを選択するステップとを含む改善されたパッケージング効率を有する改善されたレトロウイルスゲノムの選択に関する方法が提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の分野］本発明は、レトロウイルスベクターのパッケージング効率（ｐａｃｋａｇｉｎ
ｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の改善方法に関する。

【０００２】［発明の背景］レトロウイルスベクターは、遺伝子を細胞内に運ぶ手段として、現在広く利用
されている。レトロウイルスベクターの普及は、安全かつ簡単に作製でき、レト
ロウィルスベクターがターゲット細胞（ｔａｒｇｅｔｃｅｌｌ）のゲノムに導
入する遺伝子の安定な組み込みを仲介するという事実に基づいている。これによ
って、運ばれた遺伝子の長期的発現が可能となる（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９７）
。

【０００３】レトロウイルスの産生効率は極めて低い。典型的には、レトロウイルス株の内
、感染性の粒子は１０％に満たない。満たない理由は、残りの粒子がウイルスゲ
ノムを持っていないからである。野生型ウイルスにおいて、ｇａｇ／ｇａｇ−ｐ
ｏｌ遺伝子産物は、同様にパッケージングされている全長ＲＮＡ転写物から翻訳
される。パッケージング効率が低いことに関する仮説として、パッケージング過
程と翻訳が競合関係にあるとされている（ＳｏｎｓｔｅｇａｒｄａｎｄＨａ
ｃｋｅｔｔ１９９６）。これは、パッケージングのシグナルが、リボソーム結
合部位に近接していることによる。ｇａｇ蛋白質がパッケージングシグナルに結
合すると、リボソームの結合が妨害され、ｇａｇ蛋白質自身の翻訳が阻害される
。展開の過程で、より強力なパッケージングシグナルは、ｇａｇ蛋白質により強
力に結合し、その産生を制限するため、選択されなかった。

【０００４】しかし、レトロウイルスベクターの産生時に、ｇａｇ／ｇａｇ−ｐｏｌ成分と
ゲノム成分が、別の発現カセットに分離された（Ｓｏｎｅｏｋａｅｔａｌ．
，１９９５）ため、パッケージング過程と翻訳過程が分離された。そこで、ｇ
ａｇ／ｇａｇ−ｐｏｌの産生を妨げずに、高いパッケージング効率でウイルスゲ
ノムを発現できることが理論的に可能である。

【０００５】改善された新しいレトロウイルス配列を得るための従来の試みは、複製能を持
つウイルスを連続継代培養するか（ＴａｐｌｉｔｚａｎｄＣｏｆｆｉｎ，１
９９７）、あるいはｉｎｖｉｔｒｏ選択法（Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，１
９９６；Ｂｅｒｇｌｕｎｄｅｔａｌ．，１９９７）によるものであった
。ウイルスの連続継代培養は長時間を要する。ｉｎｖｉｔｒｏ選択に関しては
、多くのパラメータを最適化する必要がある。これらには、突然変異誘発と選択
を実行するために必要な条件が含まれる。さらに、無作為突然変異のライブラリ
のサイズに左右され、それは突然変異を誘発されたＤＮＡのクローニングの成功
にも左右されることを意味する。

【０００６】さらに、新しいレトロウイルス配列を産生するためのこれらの従来の試みの中
で、その本来の効率を超える様にレトロウイルスパッケージング効率を改善する
ことに焦点を合わせたものは皆無であった。

【０００７】［発明の概要］我々は、一過性感染系（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ
ｙｓｔｅｍ）を用いて、ウイルス成分の化学量論がレトロウイルス産生に及ぼす
効果を検討し、それらの粒子全てを確実にゲノムＲＮＡで満たすことにより、殆
ど全粒子が感染性を有するウイルス株を産生できることを発見した。我々の結果
から、これが、ｅｎｖおよびゲノムよりもｇａｇ／ｇａｇ−ｐｏｌの比率が低い
構成物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を利用することにより達成できることが明らかに
された。

【０００８】従って、本発明はレトロウイルスパッケージングの効率を高める方法を提供し
、この方法は、プロデューサー細胞において、少なくとも、レトロウイルスｇａ
ｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、レトロウイルス
エンベロープポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、レトロウイル
スゲノムをコードする第三のヌクレオチド配列を発現することから成り、この場
合第一のヌクレオチド配列対第二のヌクレオチド配列対第三のヌクレオチド配列
の比は、ｘ：ｙ：ｚで、ｘは１未満、ｙとｚは１である。換言すれば、第一のヌ
クレオチド配列対第二のヌクレオチド対第三のヌクレオチド配列の比は、１：１
：１未満である。

【０００９】好ましくは、レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする第一の
ヌクレオチド配列対第二および第三のヌクレオチド比は、０．８：１：１または
０．５：１：１、より好ましくは、０．２：１：１未満である。

【００１０】好ましくは、産生されるレトロウイルス粒子総数に対する感染性レトロウイル
ス数の割合は、１５％以上、より好ましくは、２５％以上または５０％以上であ
る。

【００１１】本発明は、上記の本発明の方法により産生されるレトロウイルス粒子から成る
組成物も提供し、またｅｎｖとゲノムよりもｇａｇ／ｇａｇ−ｐｏｌの比率が低
い構成物を発現することからレトロウイルスパッケージング効率が高いプロデュ
ーサー細胞も提供する。

【００１２】感染性粒子の比率を高める別の方法は、パッケージングシグナルを修飾するこ
とにより、パッケージング効率を改善することであろう。しかし、現在までの所
は、天然のウイルスパッケージングシグナルを同定し、天然のウィルスパッケー
ジングシグナルをレトロウイルスベクターに組み込む試みがなされただけである
（ＡｄａｍａｎｄＭｉｌｌｅｒ，１９８８）。この様なベクターは、野生型
の効率でパッケージングされるだけである。

【００１３】従って、我々は、パッケージング効率が改善されたベクターゲノムを選択する
生体内方法を開発した。これは、無作為の突然変異がその配列に導入されたＥｐ
ｉｃｕｒｉａｎｃｏｌｉの突然変異誘発株と、パッケージング効率を高める様
に選択された哺乳動物細胞間をレトロウイルスを往復させることが含まれる（図
２）。

【００１４】パッケージング効率を高めると感染性粒子をより多く含むウイルス株が得られ
る。これによって、終点力価（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔｔｉｔｒｅ）が高くなる。
さらに、トランスダクション効率も改善される。なぜならば、本来ならばターゲ
ット細胞レセプターへの結合を妨害する欠損粒子が少なくなるからである。

【００１５】我々が記述する生体内選択方法は、迅速かつ簡単に実行できる。哺乳動物およ
び細菌細胞由来のＤＮＡの抽出および導入だけをすればよい。これらは非常に特
徴が明らかにされ、最適化されたステップである。

【００１６】従って、本発明は、（ａ）パッケージングシグナルを含むレトロウイルスゲノムに１つ以上の無作為
の突然変異を導入するステップと、（ｂ）突然変異を誘発されたレトロウイルスゲノムを、レトロウイルスゲノムの
パッケージングに必要なウイルスポリペプチドを発現する宿主細胞に導入するス
テップと、（ｃ）細胞中のレトロウイルスパッケージング効率が、突然変異のないパッケー
ジングシグナルを含むレトロウイルスゲノムと比較して、改善されているかどう
かを決定するステップと、（ｄ）パッケージング効率を改善したウイルスゲノムを選択するステップとを含
む改善されたパッケージング効率を有する改善されたレトロウイルスゲノムの選
択方法も提供する。

【００１７】好ましくは、本方法は、（ｅ）パッケージングシグナルの配列を同定するため
に、ウイルスゲノムの全てまたは一部の配列を決定するステップをさらに含むこ
とができる。

【００１８】好ましくは、ステップ（ａ）は、レトロウイルスゲノムに無作為突然変異を導
入する細菌株において実施される。特定の好ましい細菌株は、Ｅｐｉｃｕｒｉａ
ｎｃｏｌｉの突然変異誘発株である。

【００１９】好ましくは、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）の宿主細胞は、哺乳動物細
胞である。特定の好ましい実施例において、宿主細胞は、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ
）のうちの少なくともひとつを含む。（ｉ）レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする第一のヌクレオ
チド配列と、（ｉｉ）レトロウイルスエンベロープポリペプチドをコードする第二のヌクレオ
チド配列と、（ｉｉｉ）突然変異のないパッケージングシグナルを含むレトロウイルスゲノム
をコードする第三のヌクレオチドとを少なくとも含み、ここで、第三のヌクレオチドは選択マーカーを欠失した核
酸ベクターの一部として存在し、第三のヌクレオチドを含むベクターと、突然変
異を引き起こされたレトロウイルスゲノムを含むベクターとの比は、２：１より
大きく、好ましくは５：１以上である。

【００２０】産生されるレトロウイルス粒子の総数に対する感染性レトロウイルス粒子数の
比率として測定されるパッケージング効率は、好ましくは２５％以上、より好ま
しくは５０％以上である。ウイルス株における感染性レトロウイルス粒子数（す
なわち力価）は、公知の技術、例えば、哺乳動物細胞への形質導入により測定で
きる。レトロウイルス粒子の総数は、例えば、逆転写分析により測定できる。

【００２１】本発明は、本発明の選択方法により得られるレトロウイルスゲノムも提供する
。好ましくは、レトロウイルスゲノムは、産生されたレトロウイルスゲノム総数
に対する感染性レトロウイルス粒子数の比率が２５％以上、より好ましくは、５
０％以上である。

【００２２】レトロウイルスゲノムのパッケージングシグナルは、改善されたレトロウイル
スゲノムから、あるいは決定されたその配列からクローニングされ、改善された
レトロウイルスゲノムの産生に利用するためのパッケージングシグナルの合成に
利用される。従って、本発明は、本発明の方法により選択されるレトロウイルス
ゲノムから入手可能なレトロウイルスパッケージングシグナルも提供する。

【００２３】本発明はさらに、レトロウイルスゲノムの一部である時に測定されると、パッ
ケージング効率が少なくとも１５％、好ましくは、少なくとも２０％、２５％、
３５％、または５０％である、天然でないレトロウイルスパッケージングシグナ
ルも提供する。

【００２４】本発明の更なる一面において、本発明は本発明のレトロウイルスパッケージン
グシグナルを含む核酸と、本発明のレトロウイルスパッケージングシグナルを含
むレトロウイルスベクターを提供する。

【００２５】本発明は、本発明のレトロウイルスゲノム、レトロウイルスパッケージングシ
グナルまたはレトロウイルスベクターを含むプロデューサー細胞も提供する。

【００２６】本発明は、本発明の方法により産生される、および／または本発明の方法によ
り入手される改善されたレトロウイルスゲノムを使用して産生される感染性レト
ロウイルス粒子を含む組成物も提供する。この様な組成物は、例えば、治療に利
用される。

【００２７】［発明の詳細な説明］一般的に、本明細書に記述されている技術は、本技術において公知であり、特
に、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅ
ｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９５），ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．を参照するのがよい。

【００２８】レトロウイルス本発明の方法による突然変異を誘発されたレトロウイルスゲノムと、感染性レ
トロウイルスの産生に使用されるレトロウイルスは、適切なレトロウイルスのい
ずれからも入手可能である。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。具
体例は以下の通りである。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ
）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、
ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニー
マウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ
ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンマウ
ス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）
およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃ
ｏｆｆｉｎｅｔａｌ．，１９９７，“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ編
：ＪＭＣｏｆｆｉｎ，ＳＭＨｕｇｈｅｓ，ＨＥＶａｒｍｕｓｐｐ
７５８−７６３に記載されている。

【００２９】幾つかのレトロウイルスのゲノム構造に関する詳細が、本技術において明らか
にされている。例として、ＨＩＶおよびＭｏ−ＭＬＶに関する詳細が、ＮＣＢＩ
Ｇｅｎｂａｎｋに記載されている（ゲノムの受託番号は、それぞれＡＦ０３３
８１９とＡＦ０３３８１１）。

【００３０】レンチウイルス群はさらに、“霊長類”と“非霊長類”に分けることができる
。霊長類レンチウイルスの例として、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の
原因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）とサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）
がある。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ“スローウイルス”ビス
ナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）と、関連するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡ
ＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ
）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。

【００３１】レンチウイルス科とその他の種類のレトロウイルスの違いは、レンチウイルス
が分裂細胞と非分裂細胞の両者を感染させる能力がある転写物である（Ｌｅｗｉ
ｓｅｔａｌ１９９２ＥＭＢＯ．Ｊ１１：３０５３−３０５８；Ｌ
ｅｗｉｓａｎｄＥｍｅｒｍａｎ１９９４Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：
５１０−５１６）。これに反して、ＭＬＶの様なレトロウイルスは、例えば、筋
肉、脳、肺、肝組織を構成する非分裂細胞を感染させることはできない。

【００３２】本発明の方法により最適化できる好ましいベクターは、組み換えレトロウイル
スベクター、特に組み換えレンチウイルスベクター、特に最小レンチウイルスベ
クターであり、これに関する説明は、ＷＯ９９／３２６４６号およびＷＯ９８／
１７８１５号に開示されている。

【００３３】レトロウイルスゲノムの基本的構造は、５’ＬＴＲ（長末端反復）と３’ＬＴ
Ｒであり、その間または内側にゲノムのパッケージングを可能にするパッケージ
ングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノム内への組み込みを可能にす
る組み込み部位、ウイルス粒子の組立に必要なポリペプチドであるパッケージン
グ成分をコードするｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が配置されている。より
複雑なレトロウイルスは、組み込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写物を感染され
たターゲット細胞の核から細胞質への効率的な輸送を可能にする、ＨＩＶにおけ
るｒｅｖ配列およびＰＲＥ配列の様な更なる特徴を有する。

【００３４】プロウイルスにおいては、これらの遺伝子は長末端反復（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ
ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる領域により両端を挟まれている。
ＬＴＲは、プロウイルスの組み込み、転写に関与している。ＬＴＲは、エンハン
サー−プロモーター配列の役割も果たし、ウイルス遺伝子の発現を調節すること
ができる。レトロウイルスＲＮＡのカプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ
：包膜）は、ウイルスゲノム５’末端に位置するｐｓｉ配列によって起こる。

【００３５】ＬＴＲ配列そのものは、全く同一の配列で、Ｕ３、Ｒ、Ｕ５と呼ばれる３つの
成分に分けられる。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に独特の配列から得られる。Ｒは、
ＲＮＡの両端で反復される配列から得られ、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に独特の配
列から得られる。３つの成分の大きさは、レトロウイルスによって大きく異なる
場合がある。

【００３６】欠損レトロウイルスベクター（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ
ｖｅｃｔｏｒ）において、ゲノムｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しないか、
機能していない。ＲＮＡ両端のＲ領域は反復配列である。Ｕ５およびＵ３はそれ
ぞれ、ＲＮＡゲノムの５’末端と３’末端に独特の配列である。

【００３７】典型的な遺伝子治療用レトロウイルスベクターにおいて、複製に必須の１つ以
上のｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ蛋白質コーディング領域の少なくとも一部を、
ウイルスから除去できる。これによって、レトロウイルスベクターの複製能は欠
失する。除去された部分は、治療用産物をコードするヌクレオチド配列の様な目
的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏ
ｆｉｎｔｅｒｅｓｔ）によって置換され、そのゲノムを宿主ゲノムに組み込む
ことができるウイルスが産生される。しかし、この場合修飾されたウイルスゲノ
ムは構造蛋白質が欠損しているため、それ自身増殖することはできない。宿主ゲ
ノムに組み込まれると、ＮＯＩが発現され、例えば、治療および／または診断が
可能となる。従って、ＮＯＩを目的部位に移入するには、典型的には、ＮＯＩを
組み換えウイルスベクターに組み込み、修飾されたウイルスベクターをビリオン
コートの中にパッケージングし、ターゲット細胞またはターゲット細胞集団の様
な目的部位にトランスダクション（形質導入）させることにより達成される。

【００３８】従って、本発明において使用する最小レトロウイルスゲノムは、（５’）Ｒ−
Ｕ５−１つ以上の第一のヌクレオチド配列−Ｕ３−Ｒ（３’）から成る。しかし
、宿主細胞／パッケージング細胞内でレトロウイルスゲノムを産生するために使
用されるプラスミドベクターは、宿主細胞／パッケージング細胞においてゲノム
の転写を命令するために、レトロウイルスゲノムに機能する様に結合された転写
調節配列も含む。これらの調節配列は、転写されるレトロウイルス配列に関係す
る天然の配列、すなわち、５’Ｕ３領域であるか、またはＣＭＶプロモーター等
の別のウイルスプロモーターの様な異種プロモーターである。

【００３９】幾つかのレトロウイルスゲノムは、効率的なウイルス産生のために更なる配列
が必要である。例えば、ＨＩＶの場合、好ましくは、ｒｅｖ配列およびＲＲＥ配
列が含まれる。しかし、ｒｅｖ配列およびＲＲＥ配列の必要性は、コドンの最適
化により減じる、あるいは除外することができる。

【００４０】コドンの最適化によりコドン利用が改善される。例として、ウイルス成分のコ
ーディング配列を変更すると、レトロウイルスベクター粒子産生のためのプロデ
ューサー細胞の役割を果たす哺乳動物細胞またはその他の細胞において、コドン
利用のための配列が改善され得る。ＨＩＶおよびその他のレンチウイルスを含む
多くのウイルスは、多数の稀なコドンを利用しており、これらを一般的に利用さ
れる哺乳動物コドンに対応する様に変化させることにより、哺乳動物プロデュー
サー細胞におけるパッケージング成分の発現増加が達成できる。コドン利用に関
する表は、哺乳動物細胞とその他の種々の生物体に関して本技術において公知で
ある。

【００４１】レトロウイルスベクターは、コドンを最適化されたｇａｇとコドンを最適化さ
れたｐｏｌまたはコドンを最適化されたｅｎｖを利用して産生できる。

【００４２】補助遺伝子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙｇｅｎｅ）は、レトロウイルスの複製と感
染性の種々の側面を調節できる副蛋白質をコードする。これらの蛋白質は、Ｃｏ
ｆｆｉｎらの６章および７章に論じられている。レンチウイルスベクターの補助
蛋白質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎ）の具体例として、ｔａｔ、ｒｅ
ｖ、ｎｅｆ、ｖｐｕ、ｖｉｆ、ｖｐｘが含まれるが、これらに限定されない。
本発明において有用なレンチウイルスベクターの一例は、ｒｅｖ以外全てを除去
されたものである。

【００４３】一旦、レトロウイルスベクターが、プロウイルスＤＮＡとしてそのターゲット
細胞のゲノムに組み込まれると、目的のヌクレオチド配列が発現されなくてはな
らない。レトロウイルスにおいて、プロモーターは、プロウイルスの５’ＬＴＲ
Ｕ３領域に位置する。レトロウイルスベクターにおいて、治療用遺伝子の発現
を引き起こすプロモーターは、５’Ｕ３領域の天然のレトロウイルスプロモータ
ーでも、ベクターの中に作製される代替プロモーターでもよい。代替プロモータ
ーは、レトロウイルス本来の５’Ｕ３プロモーターと物理的に置換することも、
ＬＴＲの間等のベクターゲノム内の別の場所に組み込むことも可能である。

【００４４】この様に、ＮＯＩも、ターゲット細胞においてＮＯＩの転写が可能となる様に
、転写調節配列に機能できる様に結合される。調節配列は、典型的には、哺乳動
物細胞において活性を示す。例えば、調節配列は、天然ウイルスプロモーターま
たはＣＭＶプロモーター等のウイルスプロモーターでも、あるいは哺乳動物プロ
モーターでもよい。治療されるウイルスが一次感染する特定の細胞型または組織
型において優先的に活性を示すプロモーターを利用するのが特に好ましい。従っ
て、一実施例において、組織特異的調節配列が利用される。１つ以上の第一のヌ
クレオチド配列の発現を引き起こす調節配列は、構成的プロモーターまたは調節
的プロモーターである。別の特に好ましい調節構成物（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）として、ＷＯ９９／１５６８４に記述されている様な低酸
素反応性要素があり、その内容は引用することにより本明細書の一部を成すこと
とする。

【００４５】典型的には、複製欠損レトロウイルスベクターは、例えば、その後の形質導入
に適した力価のレトロウイルスベクターを作製するために、パッケージング細胞
系またはヘルパー細胞系と、組み換えベクターとの組み合わせを利用することに
より増殖される。すなわち、３つのパッケージング蛋白質を途中で提供すること
ができる。

【００４６】プロデューサー細胞レトロウイルスプロデューサー細胞は、感染性組み換えレトロウイルスの産生
に必要な要素全てを含む。これらの要素は、細胞内に永久的に存在するか（例え
ば、細胞ゲノムに組み込まれて、すなわちエピソーム型で）、および／または例
えば、トランスフェクションにより一過性に供給される。

【００４７】対照的に、パッケージング細胞は、レトロウイルスＤＮＡのパッケージングに
必要な１つ以上のウイルス成分を発現するが、ｐｓｉを欠失している。パッケー
ジング細胞は、典型的には、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅ
ｎｖ遺伝子の内１つ以上を含む。従って、パッケージング細胞系は、レトロウイ
ルスＤＮＡのパッケージングに必要な構造蛋白質を産生するが、ｐｓｉ領域を欠
失しているため、カプシド形成（ｅｎｃａｓｉｄａｔｉｏｎ：包膜）は不可能で
ある。しかし、ｐｓｉ領域と典型的に目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む
欠損ウイルスゲノムを有する組み換えベクターがパッケージング細胞系に導入さ
れる場合には、ヘルパー蛋白質がｐｓｉ−ポジティブ組み換えベクターをパッケ
ージングし、組み換えウイルス株を産生することが可能である。このウイルス株
は、細胞を形質導入し、ターゲット細胞のゲノムにＮＯＩを導入するため利用で
きる。スプライスドナーの上流からｇａｇ開始コドンにわたる更なる配列を含む
ｐｓｉプラスと呼ばれるｐｓｉパッケージングシグナルを利用するのが好ましい
。なぜならば、これはウイルス力価を高めることが明らかにされているからであ
る。

【００４８】ゲノムがウイルス蛋白質の作製に必要な全遺伝子を欠失している組み換えウイ
ルスは、形質導入は１回限りで、増殖はできない。ターゲット細胞の形質導入が
１回しかできないこれらのウイルスベクターは、複製欠損ベクターとして知られ
ている。従って、有害な可能性があるレトロウイルスを産生せずに、宿主／ター
ゲット細胞ゲノムの中にＮＯＩが導入される。利用可能なパッケージング細胞系
の要約は、Ｃｏｆｆｉｎｅｔａｌ．，１９９７に記載されている。

【００４９】好ましくは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖウイルスコーディング領域が、パッ
ケージング細胞系の中に独立してトランスフェクションされる、別々の発現プラ
スミドによって運ばれるパッケージング細胞系が利用される。しばしば３本プラ
スミドトランスフェクション法（Ｓｏｎｅｏｋａｅｔａｌ．，１９９５）と
呼ばれるこの戦略は、複製能を有するウイルス産生の可能性を減じる。なぜなら
ば、３つの組み換えイベントが野生型ウイルス産生に必要とされるからである。
組み換えは相同性により大きく促進されるので、ベクターのゲノムとヘルパー間
の相同性の減少または消失によっても、複製能を持つヘルパーウイルス産生の問
題を解消することもできる。

【００５０】安定なトランスフェクションされたパッケージング細胞系に代わり、一過性に
トランスフェクションされた細胞系が使用される。有利には、ベクター作製中、
ベクター産生量を測定するために一過性トランスフェクションを利用できる。こ
の観点から、一過性トランスフェクションは、安定なベクター産生細胞系の作製
に長時間を要せず、ベクターまたはレトロウイルスパッケージング成分が細胞に
毒性を有する場合にも利用できる。レトロウイルスベクターの作製に典型的に利
用される成分には、ｇａｇ／ｐｏｌ蛋白質をコードするプラスミド、ｅｎｖ蛋白
質をコードするプラスミド、ＮＯＩを含むプラスミドが含まれる。ベクター産生
には、他の必要な成分を含む細胞内への１つ以上のこれらの成分の一過性トラン
スフェクションが関与する。ベクターが、細胞サイクルの阻害剤またはアポトシ
スを誘導する遺伝子の様な、毒性遺伝子または宿主細胞の複製を障害する遺伝子
をコードする場合には、安定したベクター産生細胞系を作製することが困難な場
合があるが、一過性トランスフェクションを用いて、細胞死滅前にベクターを産
生することができる。また、細胞系は、安定なベクター産生細胞系から得られる
レベルに匹敵するベクター力価レベルを産生する一過性トランスフェクションを
用いる細胞系が開発されている。

【００５１】プロデューサー細胞は、感染性レトロウイルス産生に必要な残りのウイルス成
分全てをパッケージング細胞の中に導入することにより、パッケージング細胞か
ら産生するか、あるいは感染性レトロウイルス産生に必要な全ての成分を、２９
３Ｔ細胞の様な非パッケージング細胞の中に導入することにより産生できる。

【００５２】プロデューサー細胞／パッケージング細胞は、適切な細胞型のいずれでもよい
。最も一般的には、哺乳動物プロデューサー細胞が使用されるが、昆虫細胞の様
なその他の細胞も除外されない。明らかに、プロデューサー細胞はｅｎｖおよび
ｇａｇ、ｐｏｌｍＲＮＡを効率的に翻訳できる必要がある。多くの適切なプ
ロデューサー／パッケージング細胞系が、本技術において公知である。本技術に
精通する者は、例えば、パッケージング成分をコードするヌクレオチドを細胞系
に安定して導入することにより、適切なパッケージング細胞系を作製することも
可能である。

【００５３】実験および実用の両者において、高力価のウイルス標本を使用することが極め
て望ましい。ウイルス力価を高める技術には、上記の様にｐｓｉプラスパッケー
ジングシグナルを利用し、ウイルス株を濃縮することが含まれる。さらに、水泡
性口内炎ウイルスから得られるＧ蛋白質の様な異なるエンベロープ蛋白質の使用
により、１ｍｌあたり１０⁹の濃度まで力価が改善された。しかし、典型的には
、エンベロープ蛋白質は、治療したいウイルスに感染している細胞を優先的にウ
イルス粒子が感染する様に、選択される。例えば、ＨＩＶ感染を治療するために
ＨＩＶベクターが利用されている場合には、使用されるｅｎｖ蛋白質はＨＩＶｅ
ｎｖ蛋白質である。

【００５４】レトロウイルスゲノムの突然変異誘発ｉｎｖｉｔｒｏ展開は最近大いに注目されている。これは、ＤＮＡ配列に無
作為突然変異を導入し、続いて選択処置を行い、これによって改善された機能ま
たは新しい機能を有する遺伝子を産生する（Ｊｏｙｃｅ，１９９２）。この技
術の強みは、遺伝子を変化または改善するために、遺伝子がどの様に機能するか
を理解する必要がないという事実にある。必要なことは、高頻度でＤＮＡ配列に
無作為突然変異を生じ、所望の変化を選択する手順だけである。無作為突然変異
を生じる幾つかの方法がある。これらには、誤りがちなＰＣＲ（Ｂｅａｕｄｒｙ
ａｎｄＪｏｙｃｅ，１９９２）、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ
，１９９４）、より最近ではＥｐｉｃｕｒｉａｎｃｏｌｉの突然変異誘発株
の形質転換（Ｂｏｒｎｓｃｈｅｕｅｒｅｔａｌ．，１９９８）がある。突
然変異を引き起こすその他の方法が本技術において公知である（例えば、電離放
射線または化学突然変異誘発物質の使用）。本発明に関連して、Ｅｐｉｃｕｒｉ
ａｎｃｏｌｉの突然変異誘発株がレトロウイルスゲノムに突然変異を導入す
る様に、突然変異誘発細菌株を利用することが好ましい。

【００５５】一般的に、レトロウイルスゲノムは核酸ベクターの成分として存在する。突然
変異誘発が、生体内で宿主細胞において起こる場合、核酸ベクターは、宿主細胞
と適合する様に選択される。シャトルベクター、すなわち１種類以上の宿主（細
菌および哺乳動物細胞の様な）において増殖できるベクターを利用するのが特に
好ましい。これによって、突然変異誘発を例えば細菌株において起こし、次いで
標準技術を用いて、哺乳動物細胞に導入する前に、クローニングを全く行わずに
、突然変異を誘発されたベクターが抽出され、精製される。

【００５６】この様に、レトロウイルスゲノムに行う第一段階は、突然変異誘発である。好
ましい実施例において、これはレトロウイルスゲノムをＸＬ１−Ｒｅｄ細胞（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）の様なＥｐｉｃｕｒｉａｎｃｏｌｉ細胞内に形質転換す
ることにより達成される。次に、得られた突然変異体のプールを、大規模プラス
ミド分離プロトコールの様な標準技術を用いて抽出する。

【００５７】選択典型的には、次に、突然変異を誘発されたレトロウイルスゲノムのプールは、
ゲノムをパッケージングできる宿主細胞に導入される（パッケージング細胞とプ
ロデューサー細胞の詳細は上記を参照）。パッケージングに関する競合は、宿主
細胞を宿主細胞において使用するのに適した選択マーカーを持たないベクターの
成分として存在する、突然変異を誘発されていないレトロウイルスゲノムの同時
形質移入により生じる。対照的に、突然変異を誘発されたレトロウイルスゲノム
は、選択マーカーを含むベクターの成分として存在する。好ましくは、突然変異
を誘発されていないゲノムの量は、突然変異を誘発されたゲノムの量の少なくと
も２倍、より好ましくは、少なくとも５倍である。

【００５８】宿主細胞により産生されたレトロウイルス粒子は、次に、コス細胞の様な更な
る細胞の形質導入に使用される。得られたネオマイシン耐性細胞は全て、野生型
レトロウイルスゲノムよりも効率的にパッケージングされた突然変異を誘発され
たレトロウイルスゲノムを含む。これらの細胞により産生されたレトロウイルス
粒子は、上記の様にパッキング効率を測定するために検査できる。

【００５９】選択されたレトロウイルスクローンは、分離され、任意で更なる突然変異誘発
／選択ステップに供される。また、選択されたレトロウイルスクローンは、分離
され、そのヌクレオチド配列が決定され、パッケージング効率の改善に起因する
特定の突然変異が明らかにされる。典型的には、これらはパッキングシグナル配
列の中に存在する。

【００６０】改善されたレトロウイルスゲノムは、改善されたレトロウイルスベクターの構
築の基礎として利用でき、例えば、治療遺伝子を患者に投与するために利用され
る。特に、修飾された配列は既存のレトロウイルスベクターの中にクローニング
できる。

【００６１】利用法本発明の方法を応用することにより、従来よりも、感染性ウイルス粒子をより
高率に含む組成物の作製が可能となる。

【００６２】感染性レトロウイルス粒子は、治療製品をコードする１つ以上のコーディング
配列を含むことができる。治療産物には、サイトカイン、ホルモン、抗体、免疫
グロブリン融合蛋白質、酵素、免疫共同刺激分子、アンチセンスＲＮＡ、ターゲ
ット蛋白質のトランスドミナントネガティブ突然変異体、毒素、条件毒素、抗原
、一本鎖抗体、腫瘍抑制蛋白質、成長因子が挙げられるが、これらに限定されな
い。含められると、この様なコーディング配列は適切なプロモーターに機能する
様に結合される。

【００６３】好ましくは、ウイルス粒子は、薬剤学的に許容可能な担体または希釈剤と組み
合わされ、医薬組成物が作製される。従って、本発明は、ヒトを治療する医薬組
成物も提供し、この場合組成物は治療有効量の本発明のウイルス粒子を、薬剤学
的に許容可能な担体または希釈剤、賦形剤または補助薬（アジュバント）と共に
含む。医薬組成物はヒト用または動物用がある。

【００６４】医薬品担体、賦形剤または希釈剤は、目的の投与経路と標準的医薬品の実際を
考慮して選択できる。適切な担体と希釈剤には等張食塩水、例えば、リン酸緩衝
食塩水が含まれる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、あるいは
それらに加えて、適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤、
およびウイルスがターゲット部位に侵入するのを補助または増大させるその他の
担体（例えば、脂質輸送系）のいずれを含んでもよい。

【００６５】医薬組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、頭蓋内、皮下、眼内、または経皮投
与用に処方できる。

【００６６】適切な場合には、医薬組成物は以下のいずれか１つ以上により投与できる：吸
入、座薬またはペッサリー、ローション、溶液、クリーム、軟膏または粉剤の形
態で局所的に、湿布の使用により、デンプンまたはラクトースの様な賦形剤を含
む錠剤の形態で経口で、または単独または賦形剤と混合してカプセルまたは膣座
剤として、香料または着色料を含むエリキシル、溶液または懸濁液の形態で、ま
たは例えば、陰茎海綿体内、静脈内、筋肉内または皮下投与による非経口注入も
可能である。非経口投与の場合、組成物は、滅菌水溶液の形態で使用されるのが
最良で、この場合、溶液を血液と等張にするために、例えば、十分量の塩または
単糖類の様なその他の物質も含めることができる。

【００６７】投与されるウイルスの量は、典型的には、１０³から１０¹⁰ｐｆｕで、好まし
くは、１０⁵から１０⁸ｐｆｕで、より好ましくは、１０⁶から１０⁷ｐｆｕである
。注入される場合、典型的には、薬剤学的に許容可能な適切な担体または希釈剤
中に１−１０μＬのウイルスが投与される。

【００６８】治療配列が誘導可能な調節配列の制御下にある場合、遺伝子発現を誘導するの
は治療期間中だけでよい。一旦疾患が治療されたなら、誘導剤は除去され、ＮＯ
Ｉの発現は停止される。これは、臨床的に明らかに有利である。この様な系には
、例えば、抗生物質テトラサイクリンの投与が含まれ、これは、ｔｅｔリプレッ
サー／Ｖ１６融合担体に対する効果を介して遺伝子発現を活性化する。

【００６９】本発明は、説明のみを目的とし、本発明の範囲を限定することを目的としない
以下の具体例においてさらに詳細に説明される。具体例では、図が引用されてい
る。

【００７０】［具体例］具体例１−各ウイルス成分がウイルス力価に及ぼす効果我々は、一過性トランスフェクション系を用いて、ウイルス成分の化学量論が
レトロウイルス産生に及ぼす効果を検討した。マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）
ゲノムを３つの異なるプラスミド、すなわちｇａｇ／ｇａｇ−ｐｏｌを含むプラ
スミド、ｅｎｖを含むプラスミドおよび長末端反復、パッケージングシグナル、
ｌａｃＺマーカー（ゲノム構成物）を含むプラスミドに分離した。

【００７１】まず、我々は３つのウイルス成分の全てが飽和されない条件を決定した。図１
の結果から、０．１μｇのプラスミドではいずれのウイルス成分も飽和されてい
ないことから、０．１μｇを開始時点とし、そこから各成分の量を上げていくの
が適切であることが示された。

【００７２】次に、他の２つのプラスミドに対して、１つのプラスミドの量を上げ、ウイル
ス力価（ｖｉｒａｌｔｉｔｒｅ）を測定し、それらを同じ量の３つの全プラス
ミドを時に得られる力価と比較した。

【００７３】感染性粒子の数は形質導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞のＸ−ｇａｌ染色により測
定され、ウイルス粒子総数は逆転写酵素分析により測定された。

【００７４】表１の結果は、ゲノムが制限しており、１０倍のゲノムは力価を増加させたこ
とを示している。また、１０分の１のｇａｇ／ｇａｇ−ｐｏｌ成分を使用して、
３つの成分全て同量を用いた場合と同様の力価が達成できることも明らかにされ
た（表１）。しかし、前者のウイルス株は後者のウィルス株よりも逆転写酵素活
性が低いことから（図２のレーン５およびレーン６）、少ないｇａｇ／ｇａｇ−
ｐｏｌを用いて産生されたウイルス株が、全粒子に対して感染性粒子をより高い
比率で含んでいることが示唆された。これらの結果から、全ての粒子をゲノムＲ
ＮＡで確実に満たすことによって、全ての粒子が感染性を有するウイルス株を産
生することが可能であることが明らかにされた。

【００７５】

【表１】

【００７６】具体例２−パッケージング効率が改善されたベクターゲノムの生体内選択法我々は、パッケージング効率が改善されたベクターゲノムの生体内選択法も開
発した。本方法は、無作為の突然変異がその配列に導入されたＥｐｉｃｕｒｉａ
ｎｃｏｌｉの突然変異誘発株と哺乳動物間においてレトロウイルスを往復させ
ることが含まれており、パッケージング効率が高いものが選択される（図３）。
選択は、既存のパッケージングシグナルを含むベクターによるパッケージングに
のために競合により達成される。

【００７７】シャトルレトロウイルスベクターは、細菌ＣｏｌＥＩの複製起点をｐＬＸＳＮ
の複数のクローニング部位にクローニングすることにより作製される。細菌にお
いてカナマイシン耐性を付与するベクターを作製するために、ＳｆｉＩ−Ｒｓｒ
ＩＩ断片をｐＥＧＦＰＮ１由来のＳｆｉＩ−ＲｓｒＩＩ断片（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）により置換することにより、細菌プロモーターをネオマイシン耐性遺伝子の上
流に挿入する。得られたベクターは大腸菌細胞においてカナマイシン選択下に複
製できる。シミアンウイルス４０−大Ｔ抗原（ＳＶ４０ｌａｒｇｅ−Ｔａｎｔ
ｉｇｅｎ）を発現する哺乳動物細胞の中に形質導入されると、ネオマイシン選択
下に染色体外で複製する。ベクターを含む哺乳動物細胞（Ｍａｍｍａｌｉａｎ
ｃｅｌｌ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ＬＴＲは、ｐＭＥＬ（図４）と名付けら
れ、以下の特徴を有する。

【００７８】（１）カナマイシン／ネオマイシン耐性（大腸菌におけるカナマイシン、真核細
胞におけるＧ４１８における選択を可能にする。）（２）ＣｏｌＥ１複製起点（大腸菌における多数のコピーの複製を可能にする。
）（３）シミアンウイルス４０複製起点（コス７細胞（Ｃｅｐｋｏｅｔａｌ．
，１９８４）の様なシミアンウイルス４０−大Ｔ抗原を発現する真核細胞におい
て染色体外複製を可能にする。）

【００７９】ｐＭＥＬは、ＥｐｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉＸＬ１−Ｒｅｄ細胞（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）の中に形質転換され、その配列に無作為突然変異が導入される。
標準大規模プラスミド分離プロトコールを用いて、突然変異体のプールが抽出さ
れる。

【００８０】パッケージングに関する競合は、同量のｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、ｅｎ
ｖ発現プラスミド、ＮｅｏマイナスｐＭＥＬおよび１０分の１の突然変異を誘発
されたｐＭＥＬと共に２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクションすることにより
実行される。パッケージングされたベクターゲノムを使用して、コス細胞（ＣＯ
Ｓｃｅｌｌ）に形質導入する。次にこれらをネオマイシン耐性細胞から分離し
、ＸＬ１−Ｒｅｄ細胞の形質転換に使用する。パッケージング効率がより高いベ
クターゲノムを得るために、このプロセスを繰り返す。

【００８１】

【表２】

【００８２】シャトルベクターによる初回選択により、表２に示す結果が得られた。

【００８３】この様に、ｐＬＸＳＣＤ８存在下の力価の減少により観察される様に、パッケ
ージングに関するｐＭＥＬの競合が行われた。この選択および競合プロセスによ
り生じたベクターゲノムは、より効率的にパッケージングされている。新しい高
効率パッケージング部位は、標準組み換えＤＮＡ技術を用いて同じウイルス由来
の全てのベクターゲノムの中に作製され、より高い力価を生じるベクター系を産
生できる。

【００８４】上記明細書に言及されている全ての出版物は、引用することにより本明細書の
一部を成すこととする。本発明の範囲および精神を逸脱しない、本発明の説明さ
れている方法およびシステムの種々の変更および改変は、本技術の当業者にとっ
て明らかである。本発明は、特定の好ましい具体例と関連づけて説明されたが、
請求される本発明は、その様な特定の具体例に不当に限定されるものではない。
事実、分子生物学または関連分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施例す
るために説明されている方法の種々の改変は、特許請求の範囲内にあるものとす
る。

【００８５】［文献］

【表３】

【００８６】

【表３（つづき）】

【図面の簡単な説明】

【図１】ウイルス力価対ウイルス成分をコードするＤＮＡの量。

【図２】異なる量の３つの成分から調製されるウイルス株の逆転写酵素分析。スポット：１．０．１μｇの３つの全プラスミド；２．１μｇのｐＨＩＴ６
０、０．１μｇのｐＨＩＴ１１１とｐＨＩＴ４５６；３．１μｇのｐＨＩＴ１１
１、０．１μｇのｐＨＩＴ６０とｐＨＩＴ４５６；４．１μｇのｐＨＩＴ４５
６、０．１μｇのｐＨＩＴ６０とｐＨＩＴ１１１；５．１μｇの３つの全プラ
スミド；６．０．１μｇのｐＨＩＴ６０、１μｇのｐＨＩＴ１１１とｐＨＩＴ
４５６。逆転写酵素活性は低いが、試料６は試料５と同じ力価である。

【図３】パッケージング効率が高いベクターの生体内選択。

【図４】シャトルベクターｐＭＥＬのマップ。

【図５】シャトルベクターの概略図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者キングズマン，アラン・ジョンイギリス国、オーエックス４４ジーエイオックスフォード、ジ・オックスフォード・サイエンス・パーク、ロバート・ロビンソン・アヴェニュー、メダワー・センター、オックスフォード・バイオメディカ・（ユーケイ・）リミテッド (72)発明者スリングスビー，ジェイソンイギリス国、オーエックス４４ジーエイオックスフォード、ジ・オックスフォード・サイエンス・パーク、ロバート・ロビンソン・アヴェニュー、メダワー・センター、オックスフォード・バイオメディカ・（ユーケイ・）リミテッド (72)発明者ヤップ，メルヴィンイギリス国、オーエックス１３キューユーオックスフォード、サウス・パークス・ロード、オックスフォード・ユニヴァーシティ・バイオケミストリー・デパートメントＦターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA02 DA06 FA15 HA17 4B063 QA13 QQ06 QQ10 QQ43 QR32 QR39 QR75 QR79 4B065 AA26X AA97Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 NA10 NA13 ZB071 ZB111 ZB261 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA10 NA13 ZB01 ZB07 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）パッケージングシグナルを含むレトロウイルスゲノム
中に１つ以上の無作為の突然変異を導入するステップと、（ｂ）突然変異を誘発されたレトロウイルスゲノムを、レトロウイルスゲノム
のパッケージングに必要なウイルスポリペプチドを発現する宿主細胞に導入する
ステップと、（ｃ）細胞中のレトロウイルスパッケージング効率が、突然変異のないパッケ
ージングシグナルを含むレトロウイルスゲノムと比較して、改善されているかど
うかを決定するステップと、（ｄ）パッケージング効率を改善したウイルスゲノムを選択するステップとを含む、改善されたパッケージング効率を有する改善されたレトロウイルスゲ
ノムの選択方法。
【請求項２】（ｅ）パッケージングシグナルの配列を同定するために、ウ
イルスゲノムの全てまたは一部の配列を決定するステップをさらに含む請求項１
に記載の方法。
【請求項３】ステップ（ａ）は、レトロウイルスゲノムに無作為突然変異
を導入する細菌株において実施されることを特徴とする請求項１または２に記載
の方法。
【請求項４】前記細菌株は、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎｃｏｌｉの突然変異誘
発株である請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である請求項１〜４のいずれ
かに記載の方法。
【請求項６】前記宿主細胞は、（ｉ）レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする第一のヌクレ
オチド配列と、（ｉｉ）レトロウイルスエンベロープポリペプチドをコードする第二のヌクレ
オチド配列と、（ｉｉｉ）突然変異のないパッケージングシグナルを含むレトロウイルスゲノ
ムをコードする第三のヌクレオチドとを少なくとも含み、第三のヌクレオチドは選択マーカーを欠失した核酸ベクターの一部として存在
し、第三のヌクレオチドを含むベクターと、突然変異を引き起こされたレトロウ
イルスゲノムを含むベクターとの比は、２：１より大きく、好ましくは５：１よ
り大きいことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】産生されるレトロウイルス粒子の総数に対する感染性レトロ
ウイルス粒子数の比率として測定されるパッケージング効率は２５％以上である
請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られるレトロ
ウイルスゲノム。
【請求項９】産生されるレトロウイルス粒子の総数に対する感染性レトロ
ウイルス粒子数の比率として測定されるパッケージング効率は２５％以上である
ことを特徴とする請求項８に記載のレトロウイルスゲノム。
【請求項１０】請求項８または９に記載のレトロウイルスゲノムから得ら
れるレトロウイルスパッケージングシグナル。
【請求項１１】請求項１０に記載のレトロウイルスパッケージングシグナ
ルを含む核酸。
【請求項１２】請求項１０に記載のレトロウイルスパッケージングシグナ
ルを含むレトロウイルスベクター。
【請求項１３】感染性レトロウイルス粒子の産生に使用するための請求項
１２に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１４】レンチウイルスである請求項１２または１３に記載のレト
ロウイルスベクター。
【請求項１５】請求項８または９に記載のレトロウイルスゲノム、または
請求項１０に記載のレトロウイルスパッケージングシグナル、または請求項１２
、１３または１４に記載のレトロウイルスベクターを含むプロデューサー細胞。
【請求項１６】プロデューサー細胞において、レトロウイルスｇａｇ−ｐ
ｏｌポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列と、レトロウイルスエン
ベロープポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列と、レトロウイルス
ゲノムをコードする第三のヌクレオチド配列とを少なくとも発現するステップを
含み、この場合、第一のヌクレオチド配列対第二のヌクレオチドの比および第一
のヌクレオチド配列対第三のヌクレオチド配列比は、それぞれｘ：ｙおよびｘ：
ｚで、ｘは１未満、ｙおよびｚは１であることを特徴とするレトロウイルスパッ
ケージングの効率を高める方法。
【請求項１７】ｘが０．５未満であることを特徴とする請求項１６に記載
の方法。
【請求項１８】産生されるレトロウイルス粒子の総数に対する感染性レト
ロウイルス粒子数の比率として測定されるパッケージング効率は２５％以上であ
ることを特徴とする請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法により産生され
る感染性レトロウイルス粒子を含む組成物。
【請求項２０】治療用の請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】レトロウイルスｇａｇ−ｐｏｌポリペプチドをコードする
第一のヌクレオチド配列と、レトロウイルスエンベロープポリペプチドをコード
する第二のヌクレオチド配列と、レトロウイルスゲノムをコードする第三のヌク
レオチド配列とを少なくとも発現し、この場合、第一のヌクレオチド配列対第二
のヌクレオチドの比および第一のヌクレオチド配列対第三のヌクレオチド配列の
比は、それぞれｘ：ｙおよびｘ：ｚであり、ｘは１未満、ｙおよびｚは１である
ことを特徴とするプロデューサー細胞。