ES2220994T3 - Composicion y procedimiento para impartir resistividad a las celulas frente a sobreinfecciones por vih. - Google Patents
Composicion y procedimiento para impartir resistividad a las celulas frente a sobreinfecciones por vih.Info
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Abstract
UNA COMPOSICION QUE COMPRENDE UN VECTOR RETROVIRICO QUE CONSTA DE UN GENOMA DE UNA VARIANTE DE VIH NO DEFECTIVO Y NO PRODUCTOR EN CANTIDAD NECESARIA PARA EFECTUAR LA INTEGRACION ESTABLE DEL GENOMA VARIANTE DEL VIH NO DEFECTIVO Y NO PRODUCTOR EN AL MENOS ALGUNO DE LOS GENOMAS NUCLEARES DE LAS CELULAS HUMANAS Y LA EXPRESION EN ELLAS DE LA VARIANTE DEL VIH NO DEFECTIVO Y NO PRODUCTOR, A FIN DE CONFERIRLES RESISTENCIA A LA SOBREINFECCION POR VIH.
Description
Composición y procedimiento para impartir
resistividad a las células frente a sobreinfecciones por VIH.
La presente invención trata de una composición y
de un procedimiento para impartir resistividad frente a las
sobreinfecciones por VIH.
Más en particular, la invención trata de una
composición y de un procedimiento para conferir resistencia a las
células humanas, en particular a los linfocitos T, frente a
sobreinfecciones por retrovirus, específicamente el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH).
Se han propuesto numerosas estrategias
experimentales que aspiraban a inhibir la replicación del virus
VIH
in vivo. Hasta ahora, la mayoría se basaban en enfoques inmunoterapéuticos o quimioterapéuticos en los que se conoce el mecanismo de acción anti-VIH. Sin embargo, ninguno de los enfoques inmunoterapéuticos y quimioterapéuticos propuestos hasta ahora ha demostrado ser una terapia resolutiva anti-VIH eficaz.
in vivo. Hasta ahora, la mayoría se basaban en enfoques inmunoterapéuticos o quimioterapéuticos en los que se conoce el mecanismo de acción anti-VIH. Sin embargo, ninguno de los enfoques inmunoterapéuticos y quimioterapéuticos propuestos hasta ahora ha demostrado ser una terapia resolutiva anti-VIH eficaz.
El objetivo de un diseño experimental alternativo
anti-VIH desarrollado más recientemente era hacer
que la célula diana fuera resistente a la replicación del VIH
mediante la inducción de una inmunización intracelular (Baltimore,
Nature 335: 395-396 (1988)). La inhibición del VIH
superinfeccioso se demostró, de hecho, en células que expresaban las
proteínas trans-dominio del VIH (Malim y col., J.
Exp. Med. 176: 1197-1201 (1992); Green y col., Cell
58:
215-223 (1989); Modesti y col., New Biol. 3: 759-768 (1991); Trono y col., Cell 59: 113-120 (1989), Lisziewicz y col., Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, Gene Theraphy (1993); Buchschacher y col., Hum. Gene Ther. 3: 391-397 (1992); Stevenson y col., Cell 83: 483-486 (1989); y Liu y col., Gene Theraphy 1: 32-37 (1994)), ribozimas dirigidas al genoma del VIH (Yu y col., Gene Theraphy 1: 13-26 (1994); Lorentzen y col., Virus Genes 5: 17-23 (1991); Sioud y col. PNAS USA 88: 7303-7307 (1991); Weerasinghe y col., J. Virol. 65: 5531-5534 (1991); y Yamada y col. Gene Theraphy 1: 38-45 (1994)), señuelos tat/rev (Sullenger y col., Cell 63: 601608 (1990); Sullenger y col., J. Virol. 65: 6811-6816 (1991); y Smith y col., UCLA/UCI AIDS Symposium: Gene Theraphy Approaches to Treatment of HIV Infection (1993)), o ARN antisentido (Rhodes y col., J. Gen. Virol. 71: 1965-1974 (1990); Rhodes y col, AIDS 5: 145-151 (1991), Sczakiel y col., J. Virol. 65: 468-472 (1991); Joshi y col., J. Virol. 65: 5524-5530 (1991) y Chatterjee y col., Science 258: 1485-1488 (1992)). Además, se consiguió una inmunización intracelular anti-VIH aficaz transfectando células susceptibles a VIH con ADN que codificaba bien para un anticuerpo de cadena simple anti-gp160 (Marasco y col., PNAS USA 90: 7889-7893 (1993) o bien para la región variable de cadena simple monoclonal anti-rev (Duan y col., resumen del 1994 Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, 25 de sept.-1 de oct. de 1994, MD, EE.UU.).
215-223 (1989); Modesti y col., New Biol. 3: 759-768 (1991); Trono y col., Cell 59: 113-120 (1989), Lisziewicz y col., Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, Gene Theraphy (1993); Buchschacher y col., Hum. Gene Ther. 3: 391-397 (1992); Stevenson y col., Cell 83: 483-486 (1989); y Liu y col., Gene Theraphy 1: 32-37 (1994)), ribozimas dirigidas al genoma del VIH (Yu y col., Gene Theraphy 1: 13-26 (1994); Lorentzen y col., Virus Genes 5: 17-23 (1991); Sioud y col. PNAS USA 88: 7303-7307 (1991); Weerasinghe y col., J. Virol. 65: 5531-5534 (1991); y Yamada y col. Gene Theraphy 1: 38-45 (1994)), señuelos tat/rev (Sullenger y col., Cell 63: 601608 (1990); Sullenger y col., J. Virol. 65: 6811-6816 (1991); y Smith y col., UCLA/UCI AIDS Symposium: Gene Theraphy Approaches to Treatment of HIV Infection (1993)), o ARN antisentido (Rhodes y col., J. Gen. Virol. 71: 1965-1974 (1990); Rhodes y col, AIDS 5: 145-151 (1991), Sczakiel y col., J. Virol. 65: 468-472 (1991); Joshi y col., J. Virol. 65: 5524-5530 (1991) y Chatterjee y col., Science 258: 1485-1488 (1992)). Además, se consiguió una inmunización intracelular anti-VIH aficaz transfectando células susceptibles a VIH con ADN que codificaba bien para un anticuerpo de cadena simple anti-gp160 (Marasco y col., PNAS USA 90: 7889-7893 (1993) o bien para la región variable de cadena simple monoclonal anti-rev (Duan y col., resumen del 1994 Annual Meeting, Laboratory of Tumor Cell Biology, 25 de sept.-1 de oct. de 1994, MD, EE.UU.).
Los procedimientos de la técnica anterior tenían,
sin embargo, los siguientes inconvenientes. Muchos de los
procedimientos mencionados anteriormente no funcionaban
adecuadamente en la práctica debido al hecho de que los compuestos
anti-VIH capaces de dirigirse a una única etapa de
la replicación del VIH podrían fácilmente provocar la aparición de
mutantes del VIH resistentes. Este es un evento biológico muy común,
considerando la extraordinaria capacidad del VIH de mutar, según
demuestran, por ejemplo, las cepas del VIH resistentes a compuestos
químicos antirretrovíricos (es decir, AZT, ddl) aisladas de
pacientes con SIDA tratados con dichos medicamentos.
Consecuentemente, muchos investigadores están intentando sintetizar
reactivos anti-VIH capaces de dirigirse a diferentes
etapas del ciclo de vida del VIH. Además, se ha demostrado que
algunos de los procedimientos descritos son perjudiciales para las
células hospedadoras o difíciles de ser aplicables de forma eficaz
en protocolos clínicos.
La presente invención pretende superar los
inconvenientes de los procedimientos anteriormente descritos. Los
autores de la invención han establecido un procedimiento para
conferir resistividad a las células humanas, en particular a los
linfocitos T, frente a la sobreinfección por VIH, subsiguiente a la
integración estable de una variante genómica del VIH no infecciosa y
no productora en al menos algunos de los genomas nucleares
celulares. Para conferir resistividad a las células humanas frente a
la sobreinfección por VIH, la presente invención proporciona una
composición para ser usada para la inmunización intracelular frente
al VIH durante el tratamiento del SIDA. La invención tiene muchas
ventajas, incluyendo una forma de administración fácil, la ausencia
de una reversión espontánea de variantes no defectuosas del VIH
desde un fenotipo no productor hacia uno productor y la capacidad de
conferir una buena resistencia frente a sobreinfecciones.
Las pruebas obtenidas mediante experimentos in
vitro indican que la variante de expresión
F12-VIH no defectuosa no productora podría inhibir
diferentes etapas del ciclo de vida sobreinfeccioso del VIH natural.
De hecho, los autores de la invención han demostrado una inhibición
de la replicación del VIH natural, tanto antes como después de su
propia retrotranscripción, dependiendo de las células de expresión
del F12-VIH ensayadas. Además, no se mostraron
modificaciones ni deterioro de las funciones fisiológicas celulares
en ninguna de las células portadoras del genoma del
F12-VIH.
"VIH" se usa en la presente memoria
descriptiva para englobar todas las denominaciones pasadas y
presentes asignadas a aquellos virus implicados como agentes
causantes del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y el
complejo relacionado con el SIDA (CRS), tales como el VIH, por
ejemplo, VIH-1 y VIH-2, y HTLV, por
ejemplo, HTLV-III. Por "sobreinfección" se
entiende lo que es conocido y entendido por los expertos habituales
en la materia, es decir, la capacidad de un virus dado de infectar a
una célula ya infectada por un virus. Por "resistividad" se
entiende la capacidad de resistir a una sobreinfección por un virus,
en particular un retrovirus, específicamente el VIH. Por
"no defectuoso" se entiende que el genoma está completo, mientras que por "no productor" se entiende que no se producen partículas víricas.
"no defectuoso" se entiende que el genoma está completo, mientras que por "no productor" se entiende que no se producen partículas víricas.
La presente invención proporciona una composición
que comprende un vector recombinante retrovírico que comprende un
genoma de una variante del VIH no defectuosa y no productora,
habiéndose eliminado de dicho genoma la repetición terminal larga
(RTL) completa del extremo 3' y habiéndose insertado en una
orientación antisentido respecto a la dirección de la transcripción
del vector, en cantidad suficiente como para efectuar de forma
estable la integración de dicho genoma en al menos algunos de los
genomas nucleares de células humanas, y la expresión de dicho genoma
para conferir resistividad a las células humanas frente a una
sobreinfección por VIH.
Preferiblemente, el genoma de la variante del VIH
no defectuosa y no productora se integra en al menos el 1% de los
genomas nucleares celulares. Más preferiblemente, el genoma de la
variante del VIH no defectuosa y no productora se integra en desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10% de los genomas
nucleares celulares. Preferiblemente, el genoma de la variante del
VIH no defectuosa y no productora es el genoma F12 del VIH. Es
además preferible que el RTL 3' del genoma del
F12-VIH sea eliminado antes de la inserción en el
vector retrovírico y que el genoma sea insertado en el vector
retrovírico en orientación antisentido. Para la composición de la
invención es preferible un vector retrovírico procedente del virus
de la leucemia murina de Moloney.
Un aspecto adicional de la invención proporciona
el uso de un vector retrovírico que comprende una variante del
genoma del VIH no defectuosa y no productora, en suficiente cantidad
como para conseguir una integración estable del genoma de la
variante del VIH no defectuosa y no productora en al menos algunos
de los genomas nucleares de las células en contacto con dicho
vector, y la expresión en dichas células de dicha variante del
genoma del VIH no defectuosa y no productora.
Preferiblemente, el genoma de la variante del VIH
no defectuosa y no productora se integra en al menos el 1% de los
genomas nucleares celulares. Más preferiblemente, el genoma de la
variante del VIH no defectuosa y no productora se integra en desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10% de los genomas
nucleares celulares. Preferiblemente, el genoma de la variante del
VIH no defectuosa y no productora es el genoma F12 del VIH. Es
preferible que el RTL 3' del genoma del F12-VIH sea
eliminado antes de la inserción en el vector retrovírico y que el
genoma sea insertado en el vector retrovírico en orientación
antisentido. Para la composición de la invención es preferible un
vector retrovírico procedente del virus de la leucemia murina de
Moloney.
Alternativamente, la presente invención
proporciona el uso de una composición que comprende un vector
retrovírico, una variante del genoma del VIH no defectuosa y no
productora, para ser utilizado para la producción de un medicamento
para el tratamiento del SIDA.
Un procedimiento de aplicación de la invención es
impartir resistividad frente a sobreinfecciones por VIH a células
humanas, mediante la extracción de células de una persona, la puesta
en contacto de las células extraídas con la composición de la
invención en una cantidad suficiente como para conseguir la
integración estable y la expresión de la variante del VIH no
defectuosa y no productora en al menos algunos de los genomas
nucleares de las células, y la reintroducción de las células así
tratadas en la persona de la que se extrajeron las células. Tales
procedimientos ex vivo se describen en Ferrari, G., Rossini,
S., Giavazzi, R., Maggioni, D., Nobili, N., Soldati, M., Ungers, G.,
Mavilio, F., Gilboa, E., Bordignon, C. "An in vivo model of
somatic cell gene theraphy for human severe combined
immunodeficiency". Science 251: 1363, 1991.
Aunque, teóricamente, cualquier genoma de una
variante del VIH no defectuosa y no productora podría ser útil o
hecha útil en el presente procedimiento inventivo, el genoma del
F12-VIH (Dr. M. Federico, Laboratory of Virology,
Istituto Superiore di Sanità, Roma).
El genoma de la variante del
F12-VIH, cuya secuencia y caracterización se
describe en Carlini y col., J. Viral Disease 1:40-55
(1992) incorporada en su totalidad en el presente documento, se
caracteriza por más de 50 mutaciones, la mayoría de las cuales están
en los genes gag, pol y vif, y que no parecen estar
presentes en otras cepas del VIH-1. El mecanismo de
resistencia frente a la sobreinfección es desconocido, y es
concebible que la resistencia esté causada por la expresión del
producto de un único gen negativo trans-dominio, o,
más probablemente, por la expresión concomitante de más de uno de
dichos productos. El intercambio de fragmentos homólogos entre el
genoma de la variante del F12-VIH y un clon natural
molecular infeccioso de VIH-1 denominado
pNL4-3 (Dr. M. Martín, AIDS Research and Reference
Program, AIDS Program, NIAID, NIH), seguido de la transfección en
células humanas sensibles al VIH, indica que es necesario reemplazar
al menos 6 kb del genoma, entre los sitios de restricción Bcl I y
Xho I, que engloban los genes pol, vif, vpr, vpu, tat, rev y
env, para revertir el fenotipo del F12 de no productor a
productor. Consecuentemente, el riesgo de reversión espontánea de la
variante no defectuosa F12-VIH de replicador
deficiente a replicador competente es apreciablemente bajo. Este
riesgo se reduce adicionalmente por la ausencia de la RTL 3'
completa y la mayoría del gen nef, siendo ambos necesarios
para la replicación, en los constructos preferibles de la variante
F12-VIH. Una población celular que expresara
homogéneamente el genoma del F12-VIH inhibiría
cualquier VIH replicador competente contaminante, mediante la acción
interferente del propio F12-VIH; esto concuerda con
la evidencia de que, en células HeLa CD4+ sobreinfectadas por
VIH-1 que expresan el provirus
F12-VIH completo, no se observó la liberación de
ningún VIH-1 infeccioso durante los más de tres
meses de cocultivo continuo CEMss.
La inactivación de los genes de F12, sola o en
todas sus posibles combinaciones, bien mediante mutagénesis, por
ejemplo, la inserción de un codón de terminación prematuro, o
mediante eliminación, seguida de la transfección de los mutantes
resultantes en células humanas tolerantes al VIH, puede realizarse
para determinar qué mutación(es) permite(n) al genoma
del F12 conferir resistencia frente a la sobreinfección.
Alternativamente, cada una de las mutaciones del genoma del F12
puede revertirse al tipo natural, y los productos resultantes
transfectados a células humanas tolerantes al VIH. Tales
procedimientos permitirían la identificación del(los)
gen(es) responsable(s) del mecanismo de interferencia,
y sólo esos genes podrían ser mutados en otros genomas del VIH,
permitiendo así el uso de otros genomas del VIH en el contexto del
presente procedimiento inventivo.
Aunque, teóricamente, cualquier vector
retrovírico es adecuado o puede hacerse adecuado para su uso en el
presente procedimiento inventivo, debería usarse un vector
retroviríco que permita la expresión del genoma del F12 a unos
niveles lo suficientemente altos como para producir una
interferencia vírica, es decir, una resistencia frente a una
sobreinfección. Además, el vector retrovírico debería expresar un
gen selectivo, preferiblemente el gen que codifica para la
resistencia al antibiótico G418. Algunos ejemplos de vectores
retrovíricos incluyen N2, pLj, LXSN y NSV. El vector retrovírico
preferible para su uso en el presente procedimiento inventivo es N2.
Son especialmente preferibles los vectores procedentes del virus de
la leucemia murina de Moloney (MoMLV) (Dr. E. Gilboa,
Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, Nueva
York, NY).
Deben tomarse medidas para evitar cualquier
inestabilidad provocada por la presencia de dos secuencias idénticas
repetidas, es decir, las RTL 5' y 3', en el vector. Un procedimiento
preferible implica la eliminación de la RTL 3', que contiene parte
del gen nef, del genoma del F12-VIH, antes de
la inserción en el vector retrovírico.
También deben tomarse medidas para evitar
cualquier interferencia transcripcional, tal como la que puede
surgir entre las RTL del F12 y las del vector retrovírico. Una
medida preferible implica la inserción del genoma del F12, en
particular el genoma del F12 del cual se ha eliminado la RTL 3', en
el vector retrovírico, en orientación antisentido.
Según la presente invención, la composición que
comprende un vector retrovírico que comprende el genoma de una
variante del VIH no defectuosa y no productora según se describió
anteriormente, se administra directamente a una persona. Las vías de
administración adecuadas son conocidas por los expertos habituales
en la materia. Con independencia de qué composición y procedimiento
de administración se usen, el vector retrovírico recombinante
debería administrarse en una cantidad suficiente a una persona como
para conseguir la integración y la expresión estable de un genoma de
una variante del VIH no defectuosa y no productora en al menos
algunos de los genomas nucleares de las células de la persona
(véase, por ejemplo, Ferrari y col., Science 25: 1363 (1991);
Ferrari y col., Blood 80: 1120 (1992) y Mavilio y col., Blood 83:
1988 (1994) y el protocolo establecido en Borneo y col., Human Gene
Theraphy 4: 513 (1993)).
El vector retrovírico que comprende el genoma de
una variante no defectuosa y no productora del VIH puede elaborarse
en una composición adecuada para entrar en contacto con las células
in vitro, o en composiciones farmacéuticas adecuadas para su
administración in vivo, con los vehículos o diluyentes
adecuados, que además pueden ser farmacéuticamente aceptables.
Cuando sea adecuado, los vectores pueden formularse en preparaciones
en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa, tales como
supositorios, inyecciones, inhaladores y aerosoles, en las formas
adecuadas para su respectiva vía de administración. Pueden
utilizarse los medios conocidos en la materia para evitar la
liberación y la absorción de la composición hasta que alcance las
células deseadas o para asegurar una liberación programada de la
composición. Debería emplearse una forma farmacéuticamente aceptable
que no inutilice la composición. En las formas de dosificación
farmacéuticas, las composiciones pueden usarse solas o en una
asociación adecuada, así como en combinación, con otros compuestos
farmacéuticamente activos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden administrarse a través de diferentes vías y en
diferentes lugares del cuerpo. El experto en la materia reconocerá
que, aunque puede usarse más de una vía para la administración, una
vía en particular puede proporcionar un resultado más inmediato y
más eficaz que otra. La administración local o sistémica puede
conseguirse mediante una administración que comprenda la aplicación
o la instilación de la composición en las cavidades corporales, la
inhalación o insuflación de un aerosol, o mediante la introducción
parenteral, que comprende la administración intramuscular,
intravenosa, peritoneal, subcutánea, intradérmica, así como la
administración tópica.
Las composiciones de la presente invención pueden
proporcionarse en una forma de dosificación unitaria en la que cada
unidad de dosificación, por ejemplo, una cucharilla de café, un
comprimido, una disolución o un supositorio, contiene una cantidad
predeterminada de la composición, sola o en una combinación adecuada
con otros agentes activos. El término "forma de dosificación
unitaria" según se usa en la presente memoria descriptiva se
refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis
unitarias para personas y animales, conteniendo cada unidad una
cantidad predeterminada de la composición de la presente invención,
sola o en combinación con otros agentes activos, calculada en una
cantidad suficiente para producir el efecto deseado, en asociación
con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable,
cuando sea adecuado. Las especificaciones de las formas de
dosificación unitaria dependen de la farmacodinamia particular del
individuo particular que se va a tratar.
Consecuentemente, puede administrarse a una
persona un vector retrovírico recombínante que comprende un genoma
de una variante del VIH-1 no defectuosa y no
productora usando cualquiera de las vías de administración
anteriormente mencionadas, o vías alternativas conocidas por los
expertos en la materia y adecuadas para una aplicación particular.
La cantidad de vector administrada debería ser suficiente para
efectuar una integración estable del genoma de una variante del VIH
no defectuosa y no productora en al menos algunos de los genomas
nucleares de las células en la persona, y la expresión del genoma de
una variante del VIH no defectuosa y no productora en ellas. Dicha
integración puede supervisarse, por ejemplo, evidenciando la
integración del genoma, por ejemplo, usando la reacción en cadena de
la polimerasa junto con una secuenciación o hibridaciones de
Southern.
La composición de la presente invención puede
usarse para efectuar una inmunización intracelular de forma que, se
evite, o por lo menos, se inhiba sustancialmente, la infección
inicial por VIH en un individuo en riesgo de sufrir dicha infección.
También puede usarse en el tratamiento terapéutico de un individuo
VIH+ inhibiendo, o por lo menos, disminuyendo la extensión de la
infección y evitando, o por lo menos, retrasando el establecimiento
del SIDA o del CRS. A este respecto, la composición puede usarse en
combinación con otros medicamentos antirretrovíricos, en particular
otros tratamientos anti-VIH, siempre que no afecten
negativamente a la capacidad del genoma de una variante del VIH no
defectuosa y no productora de integrarse de forma estable en al
menos algunos de los genomas nucleares de las células de la persona
y de expresarse en las mismas. Debería destacarse que la presente
composición también tiene una utilidad in vitro. Por ejemplo,
la composición podría usarse para estudiar, además de otros aspectos
adicionales relativos a la interferencia inducida por el
F12-VIH (es decir, en el modelo de ratón SCID in
vivo o en células infectadas crónicamente por VIH), los efectos
de las proteínas codificadas por el VIH sobre la fisiología de las
células ex vivo (es decir, linfocitos sanguíneos periféricos,
monocitos y astrocitos) en ausencia de la replicación vírica.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
presente invención, y no pretenden limitar su alcance. Se hará
referencia a las siguientes figuras:
la Figura 1 es un diagrama esquemático de los
constructos sentido (s) y antisentido (as) nef- y nef+
de N2/F12-VIH descritos en el Ejemplo 1;
la Figura 2 es un diagrama esquemático de las
regiones del genoma del N2/F12-VIH nef-
cubiertas por las sondas usadas en el Ejemplo 4;
la Figura 3 es un diagrama esquemático de los
ARN transcritos esperados en las células empaquetadas transfectadas
con N2/F12-VIH nef- (s) y (as);
las Figuras 4I, 4II y 4III son transferencias
Southern de ADN genómico (a) digerido con Xho I o (b) digerido con
Eco RI de poblaciones de células neo^{r} infectadas, y de
ADN genómico (c) digerido con Eco RI de clones de células
nef- (as) transducidas de forma estable;
las Figuras 5a y 5b son gráficos de recuentos a
escala completa frente a la intensidad de fluorescencia de los
clones PA317 nº 2 y 12, respectivamente, que expresan el
F12-VIH nef- (as);
las Figuras 6a-d son análisis
FACS de la presencia de proteína gag de F12-VIH
intracitoplasmática en células neo^{r} CEMss tras el
cocultivo bien con el clon nº 2 de PA317 (Fig. 6c) o bien con el
clon nº 12 de PA317 (Fig. 6d). Las células CEMss no infectadas (Fig.
6a) y las células HUT-78/F12 (Fig. 6b) sirvieron
como controles negativo y positivo, respectivamente. En las figuras
también se muestran los porcentajes de células positivas;
las Figuras 7a y 7b son transferencias Southern
de ADN genómico digerido con enzimas de restricción de células CEMss
neo^{r} transducidas mediante cocultivo con el clon nº 2 ó
nº 12 de PA317 "productor", e hibridado con sondas
neo^{r} y genómica de F12-VIH,
respectivamente;
la Figura 8 es una transferencia Southern de ADN
genómico digerido con Hind III de células CEMss neo^{r} y
células HUT-78 transducidas mediante cocultivo con
el clon nº 2 ó nº 12 de PA317 "productor", e hibridado con la
sonda neo;
las Figuras 9a-d son
transferencias Northern de ARN poliA+ de células F12 (carril 1), de
células CEMss parentales (carril 2) y del clon 40 de CEMss
transducido con N2/F12-VIH nef- (as) (carril
3) hibridados con el F12-VIH completo (Fig. 9a), con
la RTL U3 de F12-VIH (Fig. 9b), con el nef
de F12-VIH (Fig. 9c) y con sondas env de
F12-VIH
(Fig. 9d), es decir, sondas específicas para F12-VIH;
(Fig. 9d), es decir, sondas específicas para F12-VIH;
las Figuras 10a-d son
transferencias Northern de ARN poliA+ de células F12 (carril 1), de
células CEMss transducidas con un vector retrovírico pLj de doble
promotor (carril 2, Korman y col., PNAS USA 84:
2150-2154 (1987)), y del clon 40 de CEMss
transducido con N2/F12-VIH nef- (as) (carril
3) hibridados con sondas específicas N2 para neo (Fig. 10a),
U3-MLV (Fig. 10b), R/U5-MLV (Fig.
10c) y MLV (Fig. 10d);
la Figura 11 es el resultado de un ensayo RIPA
con clones representativos de CEMss transducidos con
N2/F12-VIH nef- (as), realizado bien con una
mezcla de VIH+ o bien con VIH-suero;
las Figuras 12a-c son gráficos
de recuentos a escala completa frente a la intensidad de
fluorescencia que representan los análisis FACS de células
HUT78-F12 tratadas con anti-gag de
VIH (Fig. 12a, control positivo), de LPS no infectados (Fig. 12b,
control negativo) y de LPS humanos recientes 5 días después de la
finalización del cocultivo con el clon nº 12 de PA317 (Fig.
12c);
la Figura 13 es un gráfico de los cpm/ml del
sobrenadante del cultivo x 10-3 frente a los días
post-infección (p.i.);
la Figura 13a es un gráfico del % de viabilidad
celular frente a los días p.i. de clones representativos de CEMss
transducidos con N2/F12-VIH nef- (as), es
decir, 15, 40 y 41, sobreinfectados con 5 x 10^{3}
TCID_{50}/10^{6} células;
la Figura 14 es un gráfico de los cpm/ml del
sobrenadante del cultivo frente a los días
post-infección (p.i.);
la Figura 14a es un gráfico del % de viabilidad
celular frente a los días p.i. de clones representativos de CEMss
transducidos con N2/F12-VIH nef- (as), es
decir, 15, 40 y 41, sobreinfectadas con 10^{5}
TCID_{50}/10^{6} células.
Todas las enzimas se usaron según las
recomendaciones del fabricante. Se usó la cepa de E. coli
XL-1 Blue para amplificar los plásmidos basados en
pUC, mientras que se usó la cepa de E. coli JM 109 para
amplificar los plásmidos basados en pBR. Las transformaciones
bacterianas se realizaron según los protocolos de
Bio-Rad (Richmont, CA) para la electroporación. Los
títulos de las preparaciones de retrovirus anfotrópicos se ensayaron
como unidades formadoras de colonias (ufc)/ml en células NIH 3T3,
según se ha descrito previamente (Federico y col., J. Gen. Virol.
74: 2099-2110 (1993)). Las cepas
HTLV-III_{B} y NL4-3 del VIH se
obtuvieron de los sobrenadantes de células CEMss infectadas de forma
aguda. Los títulos de VIH, que variaron desde 1-3 x
10^{6} TCID_{50}/ml, se midieron calificando el número de
sincitios formados en células C8166 5 días después de la infección
con preparaciones de virus diluidas seriadamente según describen
Federico y col. (1995), supra. La liberación de VIH tras la
sobreinfección se supervisó mediante un ensayo con transcriptasa
inversa (TI) (Rossi y col., Ann. NY Acad. Sci. 511:
390-400 (1987)).
El ADN provírico completo del
F12-VIH se clonó a partir de una biblioteca genómica
celular HUT-78/F12, según se ha descrito previamente
(Carlini y col., J. Viral Diseases 1: 40-55 (1992)).
El vector retrovírico N2 fue proporcionado por E. Gilboa (Keller y
col., Nature 318: 149 (1985)). Se obtuvieron cuatro constructos
diferentes N2/F12-VIH, según se muestra en la Figura
1. La Figura 1 es un diagrama esquemático de los constructos sentido
(s) y antisentido (as) nef- y nef+ de
N2/F12-VIH, incluyendo las posiciones relativas de
las repeticiones terminales largas 5' y 3', 5' RTL y 3' RTL,
respectivamente, los sitios de las enzimas de restricción, el gen
marcador de la resistencia a neomicina (neo) y la posición de
la secuencia de nucleóticos AACCAA (SEC ID Nº 1) en la RTL 5'. El
símbolo "//" se usa para indicar que los mapas del constructo
presentados están recortados para ilustrar las regiones de interés.
N2/F12-VIH nef- representa los constructos en
los que se ha insertado el genoma del F12-VIH en el
sitio Xho I del N2 en la misma orientación transcripcional, es
decir, "sentido" o (s), u opuesta, es decir, "antisentido"
o (as), tras la eliminación de parte del gen nef.
N2/F12-VIH nef+ representa los constructos en
los que se ha insertado el genoma del F12-VIH en el
sitio Xho I del N2 en la misma u opuesta orientación transcripcional
tras la eliminación de parte de la RTL 3' y los elementos
reguladores negativos (ERN) de la RTL 5'.
Para evitar una poliadenilación prematura del ARN
transcrito a partir de los constructos RTL 5' de N2 sentido, el
consenso AATAAA (SEC ID Nº 2) de la RTL 5' del
F12-VIH fue mutagenizado a AACCAA (SEC ID Nº 1). La
mutagénesis se realizó utilizando un oligocebador degenerado (5'
GGCAAGCTTGGTTGAGGCTTAAGCAGT 3', SEC ID Nº 3), que engloba
tanto al consenso AATAAA (SEC ID Nº 2) como al sitio de restricción
Hind III adyacente, en orientación "inversa", y un segundo
cebador imbricado en el sitio Sma I en la hebra opuesta de la región
U3 de la RTL 5' (5' ATGGATGACCCGGGGAGAAGAGAAAA 3', SEC ID Nº 4). Se
realizó una PCR del ADN para amplificar 1 ng de pUC19 en el que se
había subclonado la RTL 5' del F12-VIH. El producto
de la PCR del ADN se digirió con Sma I/Hind III y se insertó en la
RTL 5' de un plásmido pUC19/F12-VIH sin el sitio de
restricción Hind III del policonector pUC, mediante la unión de un
plásmido pUC10 digerido con Hind III/Hind II tras la conversión de
los extremos protuberantes 5' de Hind III y la reinserción de la RTL
5' del F12-VIH, y la parte Sma I/Hind III de la RTL
5' no mutada. El éxito de la mutagénesis se comprobó mediante
secuenciación Sanger (equipo Sequenasa, UBS, Cleveland, OH).
Los constructos N2/F12-VIH
nef- se obtuvieron digiriendo el provirus
F12-VIH completo (Carlini y col., supra) con
Tha I, que reconoce un sitio único en las secuencias líder de
F12-VIH, y Sma I, que corta la región U3 de ambas
RTL. El genoma del F12/VIH digerido con Tha I/Sma I se unió entonces
a la RTL 5' mutagenizada de pUC/F12-VIH, que fue
previamente digerida con Kpn I, cortada en extremos romos con ADN
polimerasa T4 (BBR, Mannheim, Alemania) y desfosforilada. Se añadió
un sitio Xho I en el sitio Xba I único (nt 1) del genoma del
F12-VIH para permitir la inserción del genoma del
F12-VIH en el sitio de clonación Xho I de N2.
Entonces, tras la digestión con Xho I, el fragmento de ADN que
englobaba el genoma del F12-VIH desde el nt 1 hasta
el nt 8930 se insertó en el sitio Xho I del vector N2, y se
recuperaron ambos constructos sentido y antisentido.
Los constructos N2/F12-VIH
nef+ se obtuvieron digiriendo la región del policonector pUC
de la RTL 5' mutagenizada del F12-VIH, que se había
subclonado según se ha descrito (Carlini y col., supra), con
Ava I, que corta la RTL 5' en los nt 232 y 295, y Eco RI, para
generar un fragmento Ava I-Eco RI para la
reinserción en un vector pUC19 digerido con Ava
I-Eco RI. Consecuentemente, la RTL 5' resultante no
tenía los nt 1-295 de la región U3, que corresponden
a la mayoría de los elementos reguladores negativos (ERN) (Lu y
col., J. Virol. 64: 5226-5229 (1990)). El constructo
RTL 5' se digirió entonces con Xba I y Kpn I, se cortó en extremos
romos en el extremo Kpn I y se insertó en el genoma del
F12-VIH digerido con Xba I-Bss HII
del pUC19 (Sac I-Sac I) (Carlini y col.,
supra), que se cortó en extremos romos en el extremo Bss HII
(Bss HII y Tha I reconocen sitios únicos adyacentes en la secuencia
líder). Se crearon sitios Not I adyacentes a los sitios Xba I (nt 1)
y Aat II (570 nt secuencia abajo del Sac I truncado de la RTL 3' del
vector pUC19 del F12-VIH), para permitir la
inserción del genoma del F12-VIH nef+ en el
vector N2. Entonces se añadió un sitio adicional Not I en el sitio
de clonación N2. La unión Not I-Not I del N2 con el
genoma del F12-VIH modificado (según se ha descrito
anteriormente) generó ambos constructos sentido y antisentido
nef+.
Se mantuvieron células CEMss,
HUT-78, H9/HTLV_{IIIB} y C8166 en medio RPMI 1640
complementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%. Se mantuvieron
células HeLa, NIH 3T3, GP+E86 (Markowitz y col., J. Virol. 62:
1120-1124 (1988)) y PA317 (Miller y col., Mol. Cell.
Biol. 6: 2895-2902 (1986)) en medio esencial
modificado mínimo de Dulbecco (MEM) complementado con SBF al 10%. Se
hicieron crecer células CEMss y HUT-78 en presencia
de
1 mg/ml de G418 (GIBCO BRL, Gaithesburg, MD, 50% de actividad) para una selección, mientras que tanto las células empaquetadas como las NIH 3T3 se hicieron crecer en presencia de 0,5 mg/ml de G418, comenzando la selección 48 h después de los ciclos de infección.
1 mg/ml de G418 (GIBCO BRL, Gaithesburg, MD, 50% de actividad) para una selección, mientras que tanto las células empaquetadas como las NIH 3T3 se hicieron crecer en presencia de 0,5 mg/ml de G418, comenzando la selección 48 h después de los ciclos de infección.
La clonación celular se realizó sembrando placas
de 96 pocillos con 0,5 células/pocillo, según el método de dilución
limitante (Federico y col., (1995), supra). Los linfocitos
sanguíneos periféricos (LSP) humanos, que se obtuvieron según se
describió previamente (Rossi y col., supra), se estimularon
con fitohemaglutinina (FHG) durante 48 h, y después se cultivaron en
RPMI 1640 complementado con SBF al 20% y 50 U/ml de
IL-2 humana recombinante
\hbox{(rhIL-2,} Roche, Nutley, NJ).
Las monocapas de células se transfectaron
mediante el método de precipitación con
calcio-fosfato (Wigler y col., Cell 16:
758-777 (1979)). En resumen, se precipitaron y
añadieron 10 g de ADN de plásmido a cultivos subconfluyentes en
placas de 10 cm de diámetro. Cuatro horas después se extrajo el
precipitado y las células se lavaron, y se les suministró medio
completo reciente. Dos días después se extrajeron los sobrenadantes
y se usaron como fuente de retrovirus.
Los experimentos de transfección transitoria se
realizaron sobre células HeLa, NIH 3T3 y PA317, utilizando cada uno
de los cuatro constructos diferentes N2/F12-VIH, y
dos días después se evaluó la presencia intracelular de proteínas
gag de F12-VIH en las células (10^{5}). La
transfección celular con el vector N2 solo se usó como control
negativo. Los resultados se muestran en la Tabla I, que proporciona
las cantidades de proteína gag de F12-VIH
intracitoplasmáticas (pg p24 proteína de VIH/10^{5} células) en
células transfectadas por N2/F12-VIH, 48 h después
de la transfección y después de la selección de G418.
Los resultados muestran que las modificaciones
realizadas sobre el genoma del F12-VIH no afectaron
negativamente a la expresión del genoma. De hecho, no se observaron
diferencias significativas en la producción de proteínas gag entre
los cuatro constructos retrovíricos comparado con el genoma completo
del F12-VIH insertado en el plásmido pUC 10 (Carlini
y col., supra). Se observaron cantidades de proteínas gag
significativamente mayores en células humanas comparado con células
de ratón, tanto 48 h tras la transfección como después de la
selección de G418, probablemente debido a la más fuerte actividad
del promotor VIH en humanos comparado con ratones (Trono y col.
\hbox{EMBO 9:} 4155-4160 (1990)). Se
obtuvieron unos resultados similares en células HeLa y NIH 3T3
transfectadas de forma estable, aunque las cantidades de proteínas
gag eran mayores comparadas con las cantidades observadas en la
células transfectadas transitoriamente (véase la Tabla I).
Se usaron los sobrenadantes de células GP+E86 y
PA317 transfectadas para infectar monocapas subconfluyentes de
células PA317 (ciclo de infección único) o CEMss (cuatro ciclos de
infección), respectivamente que se pretrataron con 8 mg/ml de
polibreno (Sygma, St. Louis, MO). Los cocultivos se realizaron para
infectar o bien células CEMss o bien LSP humanos con retrovirus
anfotrópicos liberados por clones de células PA317 productoras. Las
células productoras (10^{5}) se sembraron en cultivos de 1 ml bien
con células CEMss (10^{5}) o bien con LSP (10^{6}). Después de
24 h, se extrajeron las células PA317 y, para eliminar completamente
las células productoras, las placas de cultivo se cambiaron cada 24
h para las CEMss o cada 12 h para las LSP. Tras la infección se
recuperaron células PA317 resistentes a G418 (neo^{r}) con
el sobrenadante de células transfectadas ecotrópicas GP+E86. Además,
de la infección con el sobrenadante de las células PA317
transfectadas anfotrópicas resultaron células CMEss neor humanas que
expresaban el F12-VIH.
Se preparó ADN genómico mediante procedimientos
estándar (Maniatis y col., Molecular Cloning: A laboratory
manual, Nolon, C., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY (1989)). El ARN total se extrajo mediante el
método de la guanidina-isotiocianato (Chirgwin y
col., Biochemistry 18: 5294 (1979)) y la fracción
\hbox{poli A
+} se obtuvo mediante separación con dynabeads acopladas con
oligo-dT (Dynal, Oslo, Noruega). Se realizaron
transferencias Southern y Northern según se ha descrito (Maniatics y
col., supra). Las sondas se marcaron radioactivamente con
^{32}P a una actividad específica de 0,5-2 x
10^{9} cpm/\mug de ADN usando el método del cebador aleatorio y
se muestran en la Figura 2, que es un diagrama esquemático de las
regiones del genoma de N2/F12-VIH nef- (as)
cubierto por las sondas. La sonda genómica del
F12-VIH se obtuvo mediante excisión del provirus a
partir de los constructos N2/F12-VIH nef-. Se
uso el transposón bacteriano completo Tn5, como sonda neo. Se
obtuvieron los ADN de F12-VIH env y
nef después de clonar el ADN de los productos de
amplificación mediante PCR en el sitio Eco RI de pUC19 usando
oligocebadores con cola Eco RI imbricados con los codones de inicio
y de terminación de cada gen. La sonda RTL U3 de
F12-VIH se recuperó mediante digestión con Xba
I-Sma I de la RTL 5' del F12-VIH
clonada en el pUC19. Las sondas específicas de N2 se recuperaron
tras la digestión del N2 con Nhe I y Sac I para la sonda
RTL-U3, Sma I y \hbox{Spe I} para la
sonda RTL-R/U5, y Eco RI y Spe I para la sonda
específica del sitio N2 (sitio de empaquetamiento) (véase la Fig.
2).
Las Figuras 4I-III son
transferencias Southern de ADN genómico (a) digerido con Xho I o (b)
digerido con Eco RI de poblaciones de células neo^{r}
infectadas, y de ADN genómico (c) digerido con Eco RI de clones de
células nef- (as) transducidas de forma estable. En las
Figuras 4I y 4II, se muestran los ADN de células CEMss transducidas
a partir de neo- nef- (as) y nef- (s) en los carriles
A y B, respectivamente, mientras que los ADN de células PA317
infectadas a partir de neo^{r} nef- (as), nef- (s),
nef+ (as) y nef+ (s) se muestran en los carriles
C-F, respectivamente. En la Fig. 4III, se muestran
los ADN a partir de los clones de células PA317 (2 y 12) nef-
(as) y CEMss (40 y 41). Se usaron los ADN a partir de células
CEMss (C-) y H9-HTLV_{IIIB} (C+) como controles
negativo y positivo, respectivamente. Se usó ADN de fago digerido
con Hind III como marcador molecular (a la izquierda).
La transferencia Southern del ADN digerido con
Xho I a partir de células CEMss neo^{r} infectadas con el
sobrenadante de las células PA317 transfectadas con
N2/F12-VIH nef- (as) mostró una banda de 9 kb
(Fig. 4I, carril A), según se esperaba, dado que se ha escindido el
genoma completo del F12-VIH del constructo mediante
digestión con
\hbox{Xho I,} más una señal adicional a un
peso molecular inferior, probablemente procedente de una
reorganización genómica. Por el contrario, no se detectaron bandas
adicionales en el patrón del ADN Xho I de células PA317
neo^{r} infectadas con los sobrenadantes de células GP+E86
nef- (as) transfectadas (Fig. 4II, carril A), mientras que se
detectó una señal inesperada en las células PA317 (Fig. 4II, carril
C).
La transferencia Southern del ADN digerido con
Xho I a partir de células CEMss neo^{r} infectadas con el
sobrenadante de las células PA317 transfectadas con los
sobrenadantes de N2/F12-VIH nef- (s) (Fig.
4I, carril B) mostró la integración de tres ADN diferentes
específicos de F12-VIH, más probablemente
procedentes de las tres formas principales del ARN del
F12-VIH (es decir, las formas no empalmada,
empalmada simple y empalmada doble según se muestra en la Fig. 3,
que es un diagrama esquemático de los ARN transcritos esperados en
las células empaquetadas transfectadas con
N2/F12-VIH nef- (s) y (as)) (Federico y col.,
(1989), supra). Estos datos también se confirmaron mediante
digestión con Eco RI (Fig 4II, carril B). Al contrario, no se
detectaron señales específicas para F12-VIH en el
ADN genómico procedente de células PA317 neo^{r} infectadas
con el sobrenadante de células GP+E86 nef- (s) transfectadas
(Fig. 4I, carril D), indicando un muy bajo nivel de eficacia de la
transducción de una secuencia del F12-VIH es estas
células.
Los intentos de recuperar las células CEMss tras
la infección con los sobrenadantes de PA317 transfectadas con
nef+ y la selección de G418 no tuvieron éxito. El análisis
por transferencia Southern del ADN digerido con Xho I de las células
PA317 neo^{r} reveló la presencia de una banda única en las
células PA317 infectadas por los retroviriones nef+ (s) (Fig.
4I, carril E). El peso molecular de esta señal (aproximadamente 3
kb) indica que sólo se empaquetaron ARN de moléculas de
F12-VIH con empalmes dobles en los retroviriones
recombinantes infecciosos. Por el contrario, no se detectó ninguna
banda en las células PA317 infectadas con los retroviriones
nef+ (as) (Fig. 4I, carril F).
Para evaluar la funcionalidad de los constructos
N2/F12-VIH transducidos en las células mediante
infección retrovírica, todas las poblaciones de células
neo^{r} se ensayaron para comprobar la acumulación
intracitoplasmática de las proteínas gag codificadas por el
F12-VIH. Se determinó el antígeno p24 intracelular
en células infectadas retrovíricamente mediante el lisado de las
células (10^{5}) en 200 \mul de tampón TNE
(Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) que
contenía Triton X-100 (Sygma, St. Louis, MO) al
0,1%. Tras 5 min de incubación en hielo se centrifugaron los lisados
celulares brevemente y los sobrenadantes resultantes se ensayaron
mediante un ensayo de captura de antígeno ELISA (Abbott, North
Chicago, IL).
Las proteínas asociadas al VIH se detectaron
mediante un ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA, Federico y
col., (1995), supra). Los resultados del ensayo RIPA de
clones de células CEMss representativos transducidos con
N2/F12-VIH nef- (as), realizados bien con una
mezcla de VIH+ o bien con VIH-suero, se muestran en
la Figura 11. Se usaron los lisados de células F12 y
H9/HTLV_{IIIB} como controles positivos, mientras que los lisados
de células CEMss transducidas con N2 se utilizaron como control
negativo. También se destacan los marcadores moleculares marcados
con ^{14}C y proteínas del VIH detectables en el RIPA.
En vista de los resultados anteriores, sólo se
analizaron mediante ensayo ELISA las células que expresaban
nef-. Los resultados se presentan en la Tabla II, que
proporciona las cantidades de proteínas gag de
F12-VIH intracitoplasmáticas (expresadas en
picogramos de proteína gag en poblaciones de 10^{5} células
neo^{r}; valores medios de 4 experimentos diferentes D.T.)
de las células neo^{r} infectadas con retrovirus
recombinantes N2/F12-VIH sentido (s) o antisentido
(as), y el número de clones de células que expresan el
F12-VIH del total de clones de células
puntuados.
Los resultados muestran que no se detectó
proteína gag de F12-VIH intracitoplasmática en las
células PA317 neo^{r} infectadas por los viriones
nef- (s). Aunque inicialmente se detectaron bajos niveles de
proteína intracitoplasmática en las células CEMss neo^{r}
infectadas por el retrovirus anfotrópico nef- (s), no se
detectó proteína intracitoplasmática en los pases celulares.
Por el contrario, se detectaron niveles mayores
de proteínas gag del F12-VIH tanto en las células
PA317 como CEMss que integraban el genoma nef- (as). Estos
valores positivos permanecieron estables durante un largo periodo de
tiempo, es decir, durante más de 1 año.
Para evaluar el porcentaje de células que
expresan de forma estable el genoma del F12-VIH, se
clonaron las células PA317 neo^{r} y CEMss que integraban
el genoma nef- tanto en la orientación (s) como (as),
mediante el método de la dilución limitante. Según se muestra en la
Tabla II, no se aislaron clones de F12-VIH que
expresasen nef- (s) ni de las células PA317 ni de las CEMss
neo^{r}, incluso aunque esta última fuera inicialmente
positiva en el ensayo ELISA. Por el contrario, se dispuso fácilmente
de clones de células PA317 que expresaban el genoma nef- (as)
(aproximadamente el 12%); además, aproximadamente el 23% de los
clones de CEMss fueron capaces de sintetizar las proteínas gag.
Los receptores CD4 de la membrana plasmática se
detectaron por inmunofluorescencia indirecta y se analizaron
mediante un citofluorímetro, según describen Taddeo y col. (Virology
194: 441-452 (1993)). En resumen, las células
(10^{6}) se incubaron con la concentración adecuada de anticuerpos
monoclonales anti-CD4 (mAb, Ortho Diagnostic,
Raritan, NJ) en 100 \mul de salino tamponado con fosfato (PBS) que
contenía un 2,5% de SBF. Después de 1 h de incubación en hielo, las
muestras se lavaron dos veces con PBS y se incubaron adicionalmente
durante 1 h en hielo con 100 \mul de IgG de cabra
anti-ratón conjugada con isotiocianato de
fluoresceína 1:20 (Ortho Diagnostic, Raritan, NJ). Después de tres
lavados con PBS, las muestras se fijaron con una disolución al 2%
v/v de formaldehído, y se analizaron mediante un citofluorímetro
(FAC-scan, Becton-Dickinson,
Mountain View, CA).
Las proteínas del VIH intracitoplasmáticas
asociadas con las gag se detectaron por inmunofluorescencia directa.
Las células (10^{6}) se lavaron tres veces con tampón PBS
suplementado con un 2,5% de SBF, y se resuspendieron en 200 \mul
de PBS-EDTA (10 mM). Entonces se añadió una
disolución de PBS-formaldehído (2% v/v) y las
células se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 10 min.
Después de dos lavados con el tampón PBS/SBF, las células se
resuspendieron en 40 \mul de PBS-EDTA frío.
Entonces se añadieron gota a gota 400 \mul de metanol frío, y las
células se incubaron en hielo durante 10 min adicionales. Entonces
las células se lavaron tres veces y se incubaron durante 1 h a TA
con una dilución 1:50 de AcMc anti-gag de VIH
KC57-RD1 (Coulter Corp., Hialcam, FL) conjugados con
ficoeritrina (FE). Finalmente las células se lavaron tres veces con
tampón PBS-SBF y se analizaron mediante un
citofluorímetro. Como controles negativos se usaron tanto las
células no infectadas como los anticuerpos IgG1 de ratón no
específicos conjugados con FE (Coulter Corp.).
Los sobrenadantes de los 11 clones de PA317 que
expresaban el F12-VIH nef- (as) se titularon
como ufc/ml sobre células NIH 3T3. Los títulos retrovíricos fueron
relativamente bajos, variando entre 4,6 x 10^{2} y 4 x 10^{4}
ufc/ml, según se esperaba dado el gran tamaño del constructo
retrovírico, es decir, aproximadamente 11 kb.
El análisis del ADN de los dos clones PA317
(números 2 y 12) que producían los títulos retrovíricos más altos
indicó que el constructo retrovírico estaba completamente integrado
en el genoma del hospedador (Fig. 4III) y estaba siendo transcrito
eficazmente, según se demostró mediante un análisis de transferencia
Northern. La inmunofluorescenica directa intracitoplasmática en las
proteínas gag específicas del F12-VIH se muestra en
las Figuras 5a y 5b, que son gráficos de los recuentos a escala
completa frente a la intensidad de fluorescencia de los clones PA317
nº 2 y 12, respectivamente, que expresan el
F12-VIH nef- (as). En ambos gráficos, la
pendiente de las células PA317 tratadas con anti-gag
de VIH se toma como control negativo. Como se muestra en la Fig. 5,
ambos clones eran capaces de expresar homogéneamente el genoma del
F12-VIH.
Los clones PA317 se cocultivaron con células
CEMss y LSP humanos recientes estimulados con PHA, para transducir
el genoma del F12-VIH en células susceptibles al
VIH. Veinticuatro horas después de los cocultivos se añadió G418 a
las células CEMss, y 20 días después se obtuvo una población de
células neo^{r}. El porcentaje de células neo^{r}
que expresaban la proteína gag de F12-VIH
intracitoplásmica se evaluó mediante un análisis FACS. Los
resultados se muestran en las Figuras 6a-d, que
representan los análisis FACS de la presencia de proteína gag de
F12-VIH intracitoplasmática en células CEMss no
infectadas (control negativo, Fig. 6a), en células
HUT-78/F12 (control positivo, Fig. 6b), en células
CEMss neo^{r} tras el cocultivo con el clon nº 2 de PA317
(Fig. 6c) y células CEMss neo^{r} tras el cocultivo con el
clon nº 12 de PA317 (Fig. 6d). También se muestran los porcentajes
de células positivas para cada uno. Según se muestra en la Fig.
6a-d, aproximadamente el 35% de las células
neo^{r} expresaron el genoma del F12-VIH.
Estos datos se repitieron en las células HUT-78.
Además, 36/60 clones de células CEMss puntuaron, es decir, el 55%
expresó el genoma del F12-VIH, según se comprobó
mediante un ELISA específico para las gag del VIH.
Las transferencias Southern del ADN genómico
digerido con enzimas de restricción de las células CEMss
neo^{r} transducidas mediante cocultivo con los clones
"productores" de PA317 nº 2 y 12 se hibridaron con sondas
específicas para F12-VIH o para neo, según se
muestra en las Figuras 7a y 7b, respectivamente. El carril 1
representa el ADN de células CEMss transducidas con N2, mientras que
el carril 2 representa el ADN de células CEMss neo^{r}
transducido mediante células PA317 N2/F12-VIH
nef- (as) no clonadas, los carriles 3 y 4 representan células
CEMss neo^{r} transducidas tras el cocultivo con el clon nº
2 o el clon no 12 de PA317, respectivamente, los carriles 5 y 6
representan células HUT-78 neo^{r} tras el
cocultivo con el clon nº 2 o el clon no 12 de PA317, respectivamente
y el carril 7 representa el clon nº 12 de PA317. El ADN genómico se
digirió con la enzima de restricción indicada, y el marcador
molecular del ADN fue el mismo que en las Figs.
4I-III. Las hibridaciones indican que el genoma del
F12-VIH se integró completamente sin aparentes
reorganizaciones genómicas.
Para estimar la frecuencia de los eventos
infecciosos en células CEMss se examinó la clonalidad de las células
neo^{r}. El ADN genómico digerido con Hind III de células
CEMss neo^{r} o HUT-78 transducidas
mediante cocultivo con los clones "productores" nº 2 y 12 de
PA317 se híbridó con la sonda neo, según se muestra en la
Figura 8, que es una transferencia Southern de dichas hibridaciones.
Partiendo del lado RTL 5' de N2 del constructo
N2/F12-VIH nef- (as), el primer sitio
reconocido por la enzima Hind III reside en el gen de F12
env, aproximadamente a 3 kb del extremo RTL 5' de N2. Como
controles, se utilizaron el ADN del clon nº 12 de PA317 (positivo) y
de células CEMss parentales (negativo). El marcador del peso
molecular era el mismo que en las Figs. 4I-III. La
hibridación del ADN genómico con la sonda neo demuestra que
los cultivos de linfocitos T transducidos eran en su mayor parte
policlonales, excluyendo así la posibilidad de que aparecieran
poblaciones de células neo^{r} a partir de eventos
infecciosos inusuales.
Se aislaron y cultivaron cuarenta clones de CEMss
que integraban y expresaban el genoma del F12-VIH
nef- (as), para realizar una caracterización molecular
comparativa. El patrón Eco RI de dos clones representativos
(n^{os} 40 y 41) se muestran en la Fig. 4III. No se detectaron
diferencias significativas en los patrones del ARN o las proteínas
del VIH entre los clones de CEMss (según se comprobó mediante la
variación de los sitios de integración).
Se hibridaron ARN poliA+ con cada sonda
específica para F12-VIH, es decir, completo,
U3-RTL, nef y env, o con las sondas
mostradas en las Fig. 3, que reconoce regiones diferentes del vector
N2. Las Figuras 9a-d son transferencias Northern de
ARN poliA+ de células F12 (carril 1), de células CEMss parentales
(carril 2) y del clon 40 de CEMss transducido con
N2/F12-VIH nef- (as) (carril 3) hibridados
con el F12-VIH completo (Fig. 9a), con la RTL U3 de
F12-VIH (Fig. 9b), con el nef de
F12-VIH (Fig. 9c) y con sondas env de
F12-VIH (Fig. 9d), es decir, sondas específicas para
F12-VIH. Los pesos moleculares de las principales
especies de ARN del F12-VIH se indican a la
izquierda de las figuras. Para cada una de las transferencias
Northern mostradas en la Figura 9, se analizaron 5 \mug de ARN en
cada carril del gel usado para producir la transferencia. Los clones
de CEMss que expresaban el F12-VIH nef-
expresaron bajos niveles de los ARN de VIH doblemente empalmados, es
decir, de los mensajeros específicos para las proteínas reguladoras,
según se observa en los clones de HeLa CD4+ que expresaban el
F12-VIH (Federico y col., (1995), supra). Por
el contrario, los ARN completos y los empalmados sencillamente se
transcribieron con bastante eficacia. El doblete claramente
detectable en los pesos moleculares más altos correspondía a los dos
transcriptos completos promovidos en orientaciones opuestas por las
RTL 5' de F12-VIH y MLV. Esta observación fue
apoyada por la simple, en lugar de doble, banda a aproximadamente 11
kb detectada mediante hibridación de los mismos ARN poliA+ con una
sonda imbricada en la región U3 de la RTL del
F12-VIH, que sólo podría ser transcrita a partir de
la cadena de ADN que codificaba el vector retrovírico N2.
Las Figuras 10a-d son
transferencias Northern de ARN poliA+ de células F12 (carril 1), de
células CEMss transducidas con un vector retrovírico pLj de doble
promotor (carril 2, Korman y col., PNAS USA 84:
2150-2154 (1987)), y del clon 40 de CEMss
transducido con N2/F12-VIH nef- (as) (carril
3) hibridados con sondas específicas N2 para neo (Fig. 10a),
U3-MLV (Fig. 10b), R/US-MLV (Fig.
10c) y MLV (Fig. 10d). Los pesos moleculares de las principales
especies de ARN producidas en CEMss por los vectores pLj aparecen en
el lado izquierdo de las transferencias Northern. La hibridación del
ARN poliA+ con sondas específicas para el gen neo, para las regiones
U3 y R-U5 de la RTL de N2 y para el sitio N2 mostró
que los transcriptos simple y doblemente empalmados promovidos por
la RTL 5' del F12-VIH eran reconocidos por cada
sonda, indicando que estas especies de ARN eran transcritas hasta la
región U3 de la RTL 5' del MLV. La banda simple de alto peso
molecular obtenida tras la hibridación con la sonda específica para
N2, que necesariamente reconoce el transcrito de N2 promovido por la
RTL 5', indicó que el ARN no empalmado del F12-VIH
no incluía dichas secuencias, sugiriendo un evento de empalme que,
en cambio, no se produjo en los ARN del F12-VIH
simple y doblemente empalmados. No se transcribieron ARN empalmados
por parte de la RTL 5' del MLV. De hecho, no se detectó ninguna
banda de ARN adicional aparte de el doblete a 10-11
kb y los ARN del F12-VIH simple y doblemente
empalmados, que sólo se ven con más facilidad tras una
sobreexposición de la película. Consecuentemente, según se muestra
en la Fig. 9, se detectó una señal simple de alto peso molecular
mediante la hibridación del ARN de CEMss poliA+ con la sonda U3/RTL
del F12-VIH, que solamente reconoce los transcritos
promovidos por la RTL 5' de N2.
El perfil de proteína vírica producido por los
clones de CEMss transducidos con N2/F12-VIH
nef- (as) fue similar al obtenido por los clones de HeLa CD4+
transfectados por F12-VIH (Federico y col., (1995),
supra). La figura 14a es un gráfico de los cpm/ml de
sobrenadante del cultivo x 10-3 frente a los días
post-infección (p.i.), y la Figura 14b es un gráfico
del % de viabilidad celular frente a los días p.i. de clones
representativos de CEMss transducidos con N2/F12-VIH
nef- 9 (as), es decir, 15, 40 y 41, sobreinfectadas con
10^{5} TCID_{50}/10^{6} células. Las células N2 transducidas
se utilizaron como control. No se detectó ningún corte en la
glucoproteína gp 160 env, mientras que se observaron pequeñas
cantidades de proteínas gag p55 y p25, en comparación con las
células infectadas con un VIH replicador competente. Salvo para el
clon 21, no se detectó ninguna reducción significativa en la
expresión de CD4 en ninguno de los clones de CEMss que expresaban el
F12-VIH nef-, según se muestra en la Tabla
III.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El constructo N2/F12-VIH nef-
(as) también fue transducido en linfocitos sanguíneos
periféricos humanos recientes (LSP). Tras 24 h de cocultivo, se
evaluó la eficacia de la transducción ensayando los extractos
intracitoplasmáticos mediante ELISA. La proteína gag se obtuvo en
cantidades de 15 y 39 pg, respectivamente, a partir de 10^{5} LSP
5 días después de la finalización del cocultivo con los clones PA317
n^{os} 2 y 12. Consecuentemente, se estimó mediante análisis FACS
que aproximadamente el 5% de los LSP habían sido transducidos con
éxito mediante los cocultivos, según se muestra en las Figuras
12a-c. Las Figuras 12a-c son
gráficos de recuentos a escala completa frente a la intensidad de
fluorescencia que representan los análisis FACS de células
HUT78-F12 tratadas con anti-gag de
VIH (Fig. 12a, control positivo), de LPS no infectados (Fig. 12b,
control negativo) y de LPS humanos recientes 5 días después de la
finalización del cocultivo con el clon nº 12 de PA317 (Fig. 12c).
Los porcentajes de células positivas son 96%, 0,7% y 5,95%,
respectivamente. Estos datos fueron apoyados por el análisis
Southern del ADN de alto peso molecular extraído de los LSP
transducidos.
Se sobreinfectaron veinticinco clones de CEMss
con VIH-1, bien con la cepa HTLV_{IIIB} o bien con
la cepa
\hbox{NL4-3,} a una multiplicidad
de infección (m.i.) de 5 x 10^{3} ó 5 x 10^{5}
TCID_{50}/10^{6} células. El efecto citopático (e.c.) de la
sobreinfección por VIH-1 se puntuó en términos de la
formación de sincitios y la viabilidad celular. Además, se midió la
actividad de la transcriptasa inversa (TI) de los sobrenadantes.
No se detectó formación de sincitios en ninguno
de los clones de CEMss sobreinfectados por VIH. Por el contrario,
tanto las células CEMss naturales como las que integraban el vector
N2 formaron rápidamente grandes sincitios y murieron unos pocos días
después de la sobreinfección por VIH. En las Figuras 13 y 14 se
muestran las cinéticas de la actividad de la TI y de la viabilidad
celular de tres clones de CEMss representativos.
La Figura 13a es un gráfico de los cpm/ml del
sobrenadante de cultivo x 10-3 en frente a los días
post-infección (p.i.), y la Figura 13b es un gráfico
del % de viabilidad celular frente a los días p.i. de clones
representativos de CEMss transducidos con N2/F12-VIH
nef- (as), es decir, 15, 40 y 41, sobreinfectados con 5 x
10^{3} TCID_{50}/10^{6} células. Se utilizaron como control
tanto las células CEMss parentales como las transducidas con N2. La
Figura 14 es según se describió anteriormente.
Los datos muestran que la sobreinfección por VIH
no afectó significativamente al crecimiento de los clones que
expresaban el F12-VIH, incluso a las mayores m.i..
Los puntos positivos detectados en el ensayo de la TI del clon 15 a
la mayor m.i. eran representativos de unas pocas muestras positivas
de TI procedentes de 5 de los 25 clones de CEMss transducidos
sobreinfectados a la misma m.i.. Sin embargo, en los clones de CEMss
remanentes se detectaron valores de TI muy bajos o negativos, a
pesar de la m.i. usada y del número de días tras la
sobreinfección.
Así, la expresión del genoma del
F12-VIH inhibió fuertemente la replicación de un VIH
natural sobreinfeccioso, sin afectar a la exposición del receptor
CD4 de VIH. La propiedad interferente también se conservó cuando el
genoma del F12-VIH sin su gen nef se insertó
en el vector N2 y se transdujo mediante infección retrovírica
recombinante (véase, también, Federico y col., (1995),
supra).
Todas las referencias mencionadas en la presente
memoria descriptiva, incluyendo las patentes, solicitudes de
patentes, artículos periodísticos y libros, se incorporan al
presente documento como referencia en su totalidad.
Aunque esta invención se ha descrito enfatizando
una o más realizaciones preferibles, será obvio para los expertos
habituales en la materia que pueden emplearse variaciones,
incluyendo las variaciones resultantes de mejoras de la técnica, y
que la invención puede realizarse de otras formas a las
específicamente descritas en la presente memoria descriptiva.
Consecuentemente, esta invención incluye todas estas variaciones y
modificaciones englobadas dentro del espíritu y alcance de la
invención, según se define en las siguientes reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Istituto Superiore di Sanita'
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Viale Regina Elena, 299
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Roma
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Italia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 00161
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Fondazione Centro San Raffaele del Monte del Tabor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Via Olgettina 60
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Milán
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Italia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20132
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición y procedimiento para impartir resistividad a las células frente a sobreinfecciones por VIH
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Patentin Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACCAA
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATAAA
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAAGCTTG GTTGAGGCTT AAGCAGT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGATGACC CGGGGAGAAG AGAAAA
\hfill26
Claims (7)
1. Composición que comprende un vector
recombinante retrovírico que comprende un genoma de una variante del
VIH no defectuosa y no productora, eliminándose de dicho genoma la
repetición terminal larga (RTL) 3' completa e insertándose en
orientación antisentido respecto a la dirección de transcripción del
vector, en una cantidad suficiente para efectuar de forma estable la
integración de dicho genoma en al menos algunos de los genomas
nucleares de células humanas, y la expresión de dicho genoma para
conferir resistividad a las células humanas frente a una
sobreinfección por VIH.
2. Composición según la reivindicación 1 en la
que dicha variante genómica del VIH no defectuosa y no productora se
integra en al menos aproximadamente el 1% de los genomas nucleares
de células humanas.
3. Composición según la reivindicación 2 en la
que dicha variante genómica del VIH no defectuosa y no productora se
integra en desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10%
de los genomas nucleares de células humanas.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en la que dichas células humanas son
linfocitos T.
5. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en la que dicho genoma de una variante
de VIH no defectuosa y no productora es el del
F12-VIH.
6. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en la que dicho vector retrovírico es
un vector procedente del virus de la leucemia murina de Moloney.
7. Composición según la reivindicación 6 en la
que dicho vector retrovírico es el vector N2.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM950667 | 1995-10-09 | ||
| IT95RM000667A IT1276215B1 (it) | 1995-10-09 | 1995-10-09 | Composizione e metodo per conferire resistenza cellulare alla superinfezione con hiv |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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