ITRM950667A1 - Composizione e metodo per conferire resistenza cellulare alla superinfezione con hiv - Google Patents

Abstract

E' descritta una composizione per conferire resistenza cellulare alla superinfezione da HIV, che comprende un vettore retrovirale comprendente un genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente, in quantità sufficiente da ottenere una integrazione stabile di detto genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente in almeno alcuni dei genomi nucleari di cellule bersaglio e l'espressione di detto genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente in dette cellule bersaglio. La composizione può essere utilizzata per trasformare cellule ex vivo, o direttamente somministrata ad individui come medicamento per il trattamento antiHIV.

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: “Composizione e metodo per conferire resistenza cellulare alla superinfezione con HIV”,

La presente invenzione concerne una composizione e un metodo per conferire resistenza cellulare alia superinfezione con HIV.

Più in particolare l’invenzione concerne una composizione e un metodo per conferire resistenza a cellule umane, in particolare cellule T, alla superinfezione con un virus, in particolare un retrovirus, più in particolare il virus dell'immunodeficienza umana (HIV).

Sono state proposte diverse strategie sperimentali per bloccare la replicazione in vivo di HIV. La maggior parte di esse sono basate su approcci immunoterapeutici o chemioterapeutici, in cui il meccanismo di azione anti-HIV è ben noto. Tuttavia, nessuno degli approcci immunoterapeutici e chemioterapeutici proposti fino ad ora risulta efficace per una terapia risolutiva anti-HIV.

Un approccio sperimentale anti-HIV alternativo, sviluppato recentemente, ha reso resistenti alla replicazione di HIV cellule bersaglio, inducendo una immunizzazione intracellulare (Baltimore, Nature 335:395-396 (1988)). L'inibizione della superinfezione di HIV è stata dimostrata in: cellule che esprimono proteine di HIV dominanti in trans (Malim et al., J. Exp. Med.

176:1197-1201 (1992); Green et al., Celi 58:215-223 (1989); Modesti et al., New Bici. 3:759-768 (1991); Trono et al., Celi 59:113-120 (1989), Lisziewicz et al., Annual Meeting, Laboratory of Tumor Celi Biology, Gene Therapy (1993); Buchschacher et al., Hum. Gene Thep. 3:391-397 (1992), Stevenson et al., Celi 8383; 483-486 (1989); Liu et al., Gene Therapy 1:32-37 (1994)); ribozimi diretti contro il genoma di HIV (Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994); Lorentzen et al., Virus Genes 5:17-23 (1991); Sioud et al., PNAS USA 88: 7303-7307 (1991); Weerasinghe et al., J. Virol. 65:5531-5534 (1991); Yamada et al., Gene Therapy 1:38-45 (1994)); sequenze in grado di inibire per spiazzamento te normali funzioni dei geni tat/rev (Sultenger et al, Celi 63:601-608 (1990); Sultenger et al., J. Virai. 65:6811-6816 (1991); Smith et al., UCLA/UCI AIDS SymposiunrGene Therapy Approaches to Treatment of HIV Infection (1993)); RNA antisenso (Rhodes et al., J: Gen. Virol.

71:1965-1974 (1990); Rhodes et al., AIDS 5: 145-151 (1991), Sczakiel et al., J. Virol. 65:468-472 (1991); Joshi et al., J. Virai. 65:5524-5530 (1991), Chatteriee et al., Science 258:1485-1488 (1992)). Inoltre, una efficace immunizzazione intracellulare anti-HIV è stata ottenuta per trasfezione in cellule suscettibili ad HIV di DNA codificante per un anticorpo a singola catena anti-gp160 (Marasco et ai., PNAS USA 90:7889-7893 (1993)) o per un monoclonale con una regione variabile a singola catena anti-rev (Duan et al., 1994 Annual Meeting, Laboratory of Tumor Celi Bioiogy, SepL 25-Oct. 1, 1994, Md USA).

I metodi della tecnica anteriore, tuttavia, presentano diversi svantaggi. Parecchi dei metodi menzionati sono inutilizzabili in quanto i composti anti-HIV, in grado di agire ad un unico stadio della replicazione di HiV, inducono la comparsa dì mutanti virali resistenti. Questo è un evento biologico molto comune, in considerazione della alta frequenza di mutazione di HIV, come dimostrato, per esempio, da ceppi HIV resistenti a composti chimici antiretrovirali (come AZT, ddl), isolati da pazienti con AIDS, trattati con tali farmaci. Di conseguenza, diversi ricercatori stanno tentando di sintetizzare reagenti anti-HIV in grado di agire a diversi stadi del ciclo vitale del virus. Inoltre, alcuni dei metodi descritti sono dannosi per le cellule ospiti, o difficili da applicare in maniera efficace nei protocolli dinici.

La presente invenzione supera gli svantaggi dei metodi descritti. Gli autori dell'invenzione hanno infatti messo a punto un metodo per conferire resistenza di cellule umane, in particolare cellule T, alla superinfezione di HIV, a seguito di una integrazione stabile in almeno alcuni dei genomi nudeari delle cellule stesse, di un variante genomico di HIV-1 non infettivo, non producente. Per conferire resistenza alta superinfezione da HIV a cellule umane, in particolare a cellule T, la presente invenzione fornisce una composizione da utilizzarsi per la immunizzazione intracellulare da HIV, nella terapia dell'AIDS. L’invenzione offre parecchi vantaggi, compresa la facilità di somministrazione, l'assenza di reversione spontanea dei varianti non difettivi di HIV-1, da un fenotipo non producente ad un fenotipo producente, e il conferimento efficace alla resistenza alla superinfezione.

Evidenze ottenute in esperimenti in vitro indicano che l'espressione della variante di HIV F12 non difettiva, non producente, preferita dall’invenzione, potrebbe inibire diversi passaggi del ciclo vitale superìnfettante di HIV selvatico. Infatti gli autori dell’invenzione hanno dimostrato un blocco della replicazione del virus HIV selvatico, prima o dopo la sua retrotrascrizione, a seconda delle cellule saggiate esprimenti HIV F12. Inoltre, in tutte le cellule con II genoma di HIV F12, non si è osservato alcun blocco o modifica delie funzioni cellulari fisiologiche.

“HIV" è qui utilizzato per designare tutti i virus implicati come agenti della sindrome di immunodeficienza acquisita (AIDS) o del complesso correlato con AIDS (ARC), così come HIV, per esempio HIV-1 e HlV-2. Per "superinfezione" si intende ciò che ò noto agii esperti del settore, cioè la capacità di un virus di infettare una cellula già infettata da un altro virus. Per "resistenza” si intende la capacità di resistere alla superinfezione da parte di un virus, in particolare di un retrovirus, in maniera specifica HIV. Per “non difettivo” si intende che il genoma è completo, per “non producente” si intende che le particelle virali non sono prodotte.

La presente invenzione fornisce una composizione che comprende un vettore retrovirale comprendente un genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente, in quantità sufficiente da ottenere una integrazione stabile di detto genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente in almeno alcuni dei genomi nucleari di cellule bersaglio e l'espressione di detto genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente in dette cellule bersaglio, per conferire resistenza a cellule, in particolare a cellule T, alla superinfezione con HIV.

Preferibilmente, la variante genomica di HIV non difettiva non producente si integra in almeno circa l'1% dei genomi nucleari delle cellule. Più preferibilmente, la variante genomica di HIV non difettiva non producente si integra in circa dall'1% a circa il 10% dei genomi nucleari delle cellule. Preferibilmente, il genoma della variante di HIV non difettiva non producente è quello di HIV F12. E’ ulteriormente preferito che la 3'LTR del genoma di HIV F12 sia deleta prima dell’inserzione nel vettore retrovirale e che il genoma da inserire nel vettore retrovirale sia inserito nell’orientamento antisenso. Un vettore retrovirale derivato dal virus della leucemia mulina di Moloney è preferito per la composizione dell’invenzione

In un ulteriore aspetto dell’invenzione è fornito l’uso di un vettore retrovirale comprendente un genoma da una variante di HIV non difettiva, non producente in quantità sufficienti da ottenere una integrazione stabile della variante di HIV non difettiva non producente in almeno alcuni dei genomi nucleari di cellule messe a contatto con tale vettore e l’espressione in dette cellule di detta variante di HIV non difettiva non producente.

Preferibilmente, la variante genomica di HIV non difettiva, non producente si integra in almeno circa l’1% dei genomi nucleari delle cellule. Più preferibilmente, la variante di HIV non difettiva non producente si integra in circa dall’1% a circa il 10% dei genomi nucleari delle cellule. Preferibilmente il genoma delta variante di HIV non difettivo non producente è quello di HIV F12. E’ preferito che il 3'LTR del genoma di HIV F12 sia deleto prima dell'inserimento nel vettore retrovirale e che il genoma sia inserito nel vettore retroviraie nell'orientamento antisenso. Un vettore retrovirale derivato dal virus deila leucemia murina di Moloney è preferito per l’uso in questo metodo.

Alternativamente, la presente invenzione fornisce l'uso di una composizione che comprende un vettore retrovirale comprendente un genoma di una variante di HIV non difettiva, non producente da utilizzarsi per la produzione di un medicamento per il trattamento dell’AIDS.

Un metodo applicativo del l’invenzione è quello di conferire resistenza alla superinfezione da HIV a cellule umane, a mezzo di rimozione delle cellule da un individuo, la messa a contatto delle cellule rimosse con la composizione dell’invenzione in quantità sufficienti da effettuare una integrazione stabile e l'espressione della variante non difettiva, non producente di HIV in almeno alcuni dei genomi nucleari delle cellule, e la reintroduzione delle cellule trattate nell'individuo da cui le cellule erano state rimosse. I metodi ex vivo sono descritti, per esempio, in Ferrari G. et.al., Science 251:1363, 1991.

Sebbene qualsiasi genoma di una variante di HIV non difettiva, non praducente possa essere utilizzato nel presente metodo inventivo, il genoma dalla variante HIV-F12 è quello preferito.

La variante genomica HIV F12, la cui sequenza e caratterizzazione è descritta in Carlini et al. J. Virai Diseases 1:40-55 (1992), qui incorporata per intero, è caratterizzata da più di 50 mutazioni, la maggior parte delle quali nei geni gag, poi, e vif, che non sono presenti in altri ceppi HIV-1. Il meccanismo di resistenza alla superinfezione non è noto, ed è possibile che la resistenza sia causata dall’espressione di un singolo prodotto genico negativo dominante in trans o, più plausibilmente, dalla espressione concomitante di più di uno di tali prodotti. Lo scambio di frammenti omologhi tra la variante genomica HIV F12 e un clone molecolare infettivo di HIV-1, denominato pNL4-3 (Dr. M. Martin, AIDS Research and Reference Program, AIDS program, NIAID, NIH), seguita da trasfezione in cellule umane sensibili a HIV, indica che è necessario sostituire almeno 6 kb del genoma di HIV, tra i siti di restrizione Bel I e Xho I, e fornire i geni poi, vif, vpr, vpu, tat, rev, e env, per invertire il fenotipo F12 da non producente a producente. In accordo, il rìschio di reversione spontanea della variante MIV F12, da deficiente per la replicazione a competente per la replicazione, è apprezzabilmente basso. Questo rìschio è ulteriormente ridotto dall'assenza, nei costrutti preferiti della variante HIV F12, dell’intera regione 3’LTR e della maggior parte del gene nef, entrambi necessari per la replicazione. Una popolazione cellulare che esprima in maniera omogenea i! genoma HIV F12 blocca qualsiasi HIV competente per la replicazione contaminante, per l'azione interferente dello stesso HIV F12; ciò è consistente con l'evidenza che, in cellule HeLa CD4<+ >che esprimono HIV F12, superinfettate con HIV-1, non si osserva alcun rilascio di HIV-1 infettivo, dopo più di 3 mesi di co-coltura con cellule CEMss.

L’inattivazione dei geni F12, da sola e in qualsiasi altra possibile combinazione, per mutagenesi, per inserimento di un codone di stop prematuro, o per delezione, seguita dalla trasfezione dei mutanti risultanti in cellule umane permissive per HIV, può essere effettuata per determinare le mutazioni in grado di conferire resistenza alla superinfezione. Alternativamente, qualsiasi mutazione singola nel genoma F12 può essere revertita a selvatica e i prodotti risultanti trasfettati in cellule umane permissive per HIV. Tali metodi dovrebbero permettere l'identificazione dei geni responsabili per il meccanismo di interferenza e solo quei geni potrebbero essere mutati in altri genomi di HIV, rendendo così possibile l’uso di altri genomi di HIV.

Sebbene qualsiasi vettore retrovirale sia utilizzabile o possa essere reso utilizzabile per l’uso nel presente metodo inventivo, un vettore retrovirale che permetta l’espressione del genoma F12 a livelli sufficientemente alti per ottenere una interferenza virale, cioè la resistenza alla superinfezione, è preferito. Inoltre, il vettore retrovirale dovrebbe esprìmere un gene di selezione, preferìbilmente per la resistenza all’antibiotico G418. Esempi di vettori retrovirali comprendono N2, pLj, LXSN e NSV. Il vettore retrovirale che è preferito per l’uso nella presente invenzione è N2. I vettori derivati dal virus della leucemia murina di Moloney (MoMLV) (Dr. E. Gilboa, Sloan-Ketterìng Institute for Cancer Research, New York, NY) sono preferiti.

Dovrebbero essere prese delle misure per evitare qualsiasi instabilità causata dalla presenza di due sequenze identiche, ripetute, per esempio gli 5’ e 3’LTR, nel vettore. Un metodo preferito comprende la delezione del 3'LTR, che contiene parte del gene nef, del genoma di HIV F12 prima dell’inserimento nel vettore retrovirale.

Dovrebbero essere prese anche misure per evitare qualsiasi interferenza trascrìzionale, così come quella che può risultare tra le LTR di F12 e del vettore retrovirale. Una misura preferita comprende l’inserimento del genoma di F12, in particolare il genoma di F12 da cui sono state delete 3’LTR, nel vettore retrovirale in un orientamento antisenso.

Secondo l'invenzione, la composizione comprendente un vettore retrovirale comprendente un genoma di una variante di HIV non difettiva, non producente come già descritto può essere somministrata direttamente ad un individuo. I modi di somministrazione sono noti agli esperti nel settore. A prescindere dalla composizione e dal metodo di somministrazione utilizzato, il vettore retrovirale ricombinante dovrebbe essere somministrato in quantità sufficienti da ottenere una integrazione stabile e l'espressione della variante genomica di HIV non difettiva, non producente, in almeno alcuni dei genomi nucleari delle cellule dell’uomo (Ferrari et al., Science 25:1363 (1991); Ferrari et al., Blood 80:1120 (1992), e Mavilio et al., Blood 83:1988 (1994); Bomeo et ai., Human Gene Therapy 4:513 (1993)).

Il vettore retrovirale comprendente la variante genomica di HIV non difettiva, non producente può essere formulato in una composizione appropriata per mettere lo stesso a contatto con cellule in vitro, o in composizioni farmaceutiche appropriate per la somministrazione in vivo, con appropriati vettori o diluenti, che possono essere ulteriormente accettabili per via farmaceutica. Quando appropriato, i vettori possono essere formulati nella preparazione in forme solide, semisolide, liquide o gassose, così come supposte, iniezioni, inalanti e aerosol, nei metodi abituali rispetto alla loro via di somministrazione. Mezzi noti nel settore possono essere utilizzati per prevenire il rilascio e l’assorbimento della composizione fino a che raggiunga le cellule desiderate o per assicurare un rilascio nel tempo della composizione. Una forma farmaceuticamente accettabile dovrebbe essere utilizzata che non renda inefficace la composizione. In forme di dosaggio farmaceutico, le composizioni possono essere utilizzate da sole o in associazione appropriata, così come in combinazione con altri composti attivi farmaceuticamente.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione possono essere somministrate in modi diversi. L'esperto del settore riconoscerà che, sebbene più di una via di somministrazione possa essere utilizzata, una particolare via può fornire un risultato più immediato e più efficace. Le somministrazioni locale o sistemica possono essere ottenute per applicazione o instillazione della composizione in cavità corporee, inalazione o insufflazione di un aerosol, o per introduzione parenterale, comprendente le somministrazioni intramuscolare, endovena, peritoneale, subcutanea, intradermica e topica.

Le composizioni della presente invenzione possono essere fomite in forme dì singolo dosaggio, in cui ciascun dosaggio, per esempio un cucchiaino da caffè, una compressa, una soluzione, o una supposta, contiene una quantità predeterminata della composizione, da sola o in combinazione appropriata con altri agenti attivi. Il termine torma di singolo dosaggio<D >come qui utilizzato si riferisce a unità fisicamente discrete utilizzabili come dosaggi unitari per suggetti umani e animali, ciascuna unità contenente una quantità predeterminata della composizione della presente invenzione, da sola o in combinazione con altri agenti attivi, calcolata in quantità sufficiente da produrre l’effetto desiderato, in associazione con un diluente accettabile farmaceuticamente, un vettore o un veicolo, quando appropriati. Le specificazioni per unità di dosaggio dipendono dalle particolari farmacodinamiche dei particolare individuo da trattare.

In accordo, un vettore retrovirale ricombinante che comprende una variante genomica di HIV-1 non difettiva, non producente può essere somministrato all’uomo, utilizzando qualsiasi delle vie di somministrazione menzionate, o vie alternative note agli esperti nel settore e appropriate per una particolare applicazione. La quantità di vettore somministrata dovrebbe essere sufficiente per ottenere una integrazione stabile della variante genomica di HIV non difettivo, non producente, in almeno alcuni dei genomi nucleari delle cellule umane e l'espressione in queste della variante genomica di HIV non difettiva, non producente. L’ integrazione può essere monitorata, per esempio, utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR), in congiunzione con il sequenziamento o con ibridazioni Southern.

La composizione dell'invenzione può essere utilizzata per effettuare una immunizzazione intracellulare in modo da prevenire o, almeno, inibire sostanzialmente l’infezione iniziale di HIV in un individuo a rischio per tale infezione. Può anche essere utilizzata nel trattamento terapeutico di un individuo HIV<+ >bloccando, o almeno, rallentando il diffondersi dell'Infezione e prevenendo o, almeno, ritardando l’insorgenza di AIDS o ARC. A questo scopo, la composizione può essere utilizzata in combinazione con altri antiretrovirali, in particolare anti-HIV, a condizione che questi ultimi non interferiscano in maniera negativa con la capacità della variante genomica di HIV non difettiva, non producente, di integrarsi stabilmente in almeno alcuni dei genomi nucleari delle cellule umane ed esprimersi in queste. Dovrebbe essere notato che la composizione dell’invenzione ha anche una utilità in vitro. Per esempio, può essere utilizzata per studiare, a prescindere da altri aspetti che concernono l'interferenza indotta da HIV F12 (per esempio nel modello di topo SCID in vivo o in cellule cronicamente infettate con HIV), gli effetti di proteine codificate da HIV sulla fisiologia di cellule ex vivo (per esempio linfociti da sangue periferico, monociti, astrociti) in assenza di replicazione virale.

La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi specifici, illustrativi ma non limitativi, in cui si farà riferimento alle seguenti figure in cui:

la figura 1 è un diagramma schematico dei costrutti senso (s) e antisenso (as) nef e nef<+ >N2/HIV F12 descritti nell'esempio 1;

la figura 2 è un diagramma schematico delle regioni del genoma N2/HIV F12 nef (as) coperte dalle sonde utilizzate nell’esempio 4;

la figura 3 è un diagramma schematico degli RNA attesi trascrìtti in cellule trasfettate con N2/HIV F12 nef (s) e (as);

le figure 4I-III sono ibridazioni Southern di DNA genomico digerito con Xho I (a) o Eco RI (b) da cellule infettate neo<r >e di DNA genomico digerito con Eco RI (c) da cloni cellulari trasdotti stabilmente nef (as);

le figure 5a e 5b sono grafici di intensità di fluorescenza, rispettivamente dei cloni 2 e 12 delle cellule PA317 che esprimono F12 nef (as);

le figure 6a-d sono analisi per FACS della presenza di proteina gag intracitoplasmatica di HIV F12 in cellule CEMss neo<r >dopo cocoltivazione con il clone 2 PA317 (figura 6c) o con il clone 12 PA317 (figura 6d). Cellule CEMss non infettate (figura 6a) e cellule HUT-78/F12 sono controlli negativi e positivi, rispettivamente. Sono anche mostrate le percentuali delle cellule positive;

le figure 7a e 7b sono ibridazioni Southern di DNA genomico digerito con enzimi di restrizione di cellule CEMss neo<r >trasdotte per cocoltivazione con i cloni 2 o 12 di PA317 “producenti” e ibridizzate con sonde genomiche di HIV F12 e neo, rispettivamente;

la figura 8 è una ibridazione Southern di DNA genomico digerito con Hind III da cellule CEMss neo<r >e HUT-78 trasdotte per cocoltivazione con i cloni 2 o 12 di PA317 ed ibridato con la sonda neo;

le figure 9a-d sono ibridazioni Northern di RNA poliA+ da cellule F12 (colonna 1), cellule CEMss parentali (colonna 2), clone 40 di cellule CEMss trasdotto con N2/HIV F12 nef (as) (colonna 3), ibridizzato con una sonda di intera lunghezza di HIV F12 (figura 9a), HIV F12 U3 LTR (figura 9b), HIV F12 nef (figura 9c), e HIV F12 env (figura 9d), doè sonde specifiche per HIV F12;

le figure 10a-d sono ibridazioni Northern di RNA poliA+ da cellule F12 (colonna 1), cellule CEMss trasdotte con un vettore retrovirale pU con doppio promotore (colonna 2, Korman et al., PNAS USA 84:2150-2154 (1987)), clone 40 di cellule CEMss trasdotte con N2/HIV F12 nef (as), ibridizzato con neo (figura 10a), U3-MLV (figura 10b), R/U5-MLV (figura 10c), e -MLV (figura 10d), sonde specifiche per N2;

la figura 11 è il risultato di un saggio RIPA con cloni CEMss trasdotti con N2/HIV F12 nef (as) effettuati con una miscela di sieri HIV* o HIV;

le figure 12a-c sono grafici di intensità di fluorescenza che rappresentano una analisi FACS di cellule HUT78-F12 trattate con anti-gag HIV (figura 12a, controllo positivo), PBL non infettati (figura 12b, controllo negativo), e PBL freschi umani 5 giorni dopo la fine della cocoltivazione con il clone 12 PA317 (figura 12c);

la figura 13 è un grafico di cpm/ml del sovranatante di coltura in funzione del giorno post-infezione (p.i.) e l'inserto è un grafico della percentuale della vitalità di cellule in funzione dei giorni p.i per i cloni trasdotti CEMss rappresentativi N2/HIV F12 nef (as), cioè 15, 40 e 41 superinfettati con 5x10<3 >TCID50/10<8 >cellule;

la figura 14 è un grafico di cpm/ml del sovranatante di coltura in funzione dei giorni postinfezione (p.i.) e l'inserto è un grafico della percentuale della vitalità cellulare in funzione dei giorni p.i. per cloni trasdotti CEMss N2/HIV F12 nef (as), cioè 15, 40 e 41, superinfettati con 10<5 >TCID50/IO<8 >cellule.

Tutti gli enzimi sono utilizzati secondo ie istruzioni delle case produttrici. Il ceppo di E.coli XL-1 Blue è stato utilizzato per amplificare i plasmidi basati su pUC, mentre i( ceppo di E.coli JM 109 è stato utilizzato per amplificare i plasmidi basati su pBR. Le trasformazioni batteriche sono effettuate secondo i protocolli della Bio-Rad (Richmond, CA) per elettroporazione. I titoli delle preparazioni di retrovirus anfotropiche sono saggiati come unità formanti colonie (cfu/ml su cellule NiH 3T3 come già descritto (Federico et al., J. Gen. Virai. 74:2099-2110 (1993)). I ceppi HTLV-lllB e NL4-3 di HIV sono ottenuti dai sovranatanti di cellule CEMss infettate in maniera acuta. I titoli di HIV, che vanno da 1 a 3 x10<6 >TCIDso/ml sono misurati osservando il numero di sincizi formati su cellule C8166 5 giorni dopo l’infezione con preparazioni di virus diluite serialmente come descritto da Federico et al. (1995), vedi sopra. Il rilascio di HIV dopo superi nfezione è monitorato per saggio di trascrittasi inversa (RT) (Rossi et al., Ann. NY Acad. Sci.511:390-400 (1987)).

Esempio 1 Costruzione di costrutti retrovirali senso e antisenso N2/HIV F12 nef e N2/HIV F12 nef<+>.

Il DNA provirale di intera lunghezza HIV F12 era clonato da una libreria genomica da cellule HUT-78/F12 (Carlini et al., J. Virai Diseases 1:40-55 (1992)). li vettore retrovirale N2 era fornito da E. Gilboa (Keller et al., Nature 318:149 (1985)). Quattro differenti costrutti N2/HIV F12 erano ottenuti come mostrato nella figura 1. La figura 1 è un diagramma schematico dei costrutti senso (s) e antisenso(as) nef e nef<+ >N2/F112-HIV, che comprendono le posizioni relative dei LTR 5' e 3’, rispettivamente, i siti degli enzimi di restrizione, il gene marcatore della resistenza alla neomicina (neo), e la posizione delia sequenza nucleotidica AACCAA (SEQ ID NO: 1) all’interno del 5’ LTR. Il simbolo 7/” è utilizzato per indicare che le mappe dei costrutti presentati sono accorciate allo scopo di illustrare le regioni di interesse. N2/HIV F12 nef rappresenta i costrutti in cui il genoma di HIV F12 era inserito nel sito Xhol di N2 nello stesso senso o nel senso opposto dell’orientamento della trascrizione, dopo rimozione di parte del gene nef. N2/HIV F12 nef<+ >rappresenta il costrutto in cui il genoma di HIV F12 era inserito nel sito Xhol di N2 nello stesso orientamento trascrizionale o in quello opposto dopo rimozione di parte del 3'LTR e degli elementi regolatori negativi (NRE) del 5’LTR.

Per evitare una poliadenilazione prematura del RNA trascritto dal N25’LTR nei costrutti senso la sequenza consensus AATAAA (SEQ ID NO: 2) del 5’LTR di F12HIV era mutagenizzata in AACCAA (SEQ ID NO:1). La mutagenesi era ottenuta utilizzando un oligoinnesco degenerato (5’GGCAAGCTTGGTTGAGGCTTAAGCAGT3’, SEQ ID NO:3). che comprende sia la sequenza consensus AATAAA (SEQ ID NO:2) e il sito adiacente di restrizione Hind III nell’orientamento inverso e un secondo innesco che si sovrappone con il sito Sma I nell’elica opposta della regione 5’LTR U3 (5’ ATGGATGACCCGGGGAGAAGAGAAAA 3’, SEQ ID NO:4). Una PCR su DNA era ottenuta per amplificare un ng di pUC19 in cui la 5’LTR di HIV F12 era subclonata. Il prodotto del DNA-PCR era digerito con Sma l/Hind III e inserito in un plasmide pUC19/HIV F125’LTR che manca sia del sito Hind III del polilinker di pUC, attraverso una ligazione del plasmide pUC10 digerito con Hindlii/Mindll, dopo conversione dei terminali sporgenti al 5’ di Hind III e il reinserimento del 5'LTR di HIV F12, e di parte del frammento Sma l/Hind III del 5’LTR non mutata. Il successo della mutagenesi veniva monitorato per sequenziamento in accordo con Sanger (Sequenase kit, UBS, Cleveland, OH).

I costrutti N2/HIV F12 nef erano ottenuti digerendo l'intero provirus HIV F12 (Carlini et al, vedi sopra) con Tha I, che riconosce un singolo sito nelle sequenze leader di HIV F12, e con Sma I, che taglia la regione U3 di entrambe le LTR. Il genoma HIV F12 digerito con Tha l/Sma I era poi ligato con pUC19/HIV F12 5’LTR mutagenizzato, che era già digerito con Kpn I, reso non coesivo con la DNA polimerasi di T4 (BBR, Mannheim, Germania) e defosforilato. Un sito Xho I veniva aggiunto al sito unico Xba I (nt 1) del genoma di HIV F12 per permettere l'inserimento del genoma HIV F12 nel sito di clonaggio Xho I di N2. Poi, dopo digestione con Xho I, il frammento di DNA che comprende il genoma di HIV F12 dai nucleotidi 1 ai nucleotidi 8930 veniva inserito nel sito Xho I del vettore N2 ed entrambi i costrutti senso e antisenso venivano recuperati.

I costrutti N2/HIV F12 nef erano ottenuti digerendo la regione di polilinker di pUC del HIV F12 5’LTR mutagenizzato, che veniva subclonato come descritto (Carlini et al, vedi sopra), con Ava I, che taglia il 5’LTR ai nucleotidi 232 e 295, e Eco RI, per generare un frammento Ava l-Eco RI per il reinserimento in un vettore pUC19 digerito con Ava l-Eco RI. In accordo, il 5’LTR risultante mancava dei nucleotidi 1-295 della regione U3, che corrisponde alia maggior parte degli elementi regolatori negativi (NRE) (Lu et al., J. Virai. 64:5226-5229 (1990)). Il costrutto 5’LTR veniva poi digerito con Xba I e Kpn 1, reso non coesivo al terminale Kpn I, e inserito in un pUC19 digerito con Xba l-Bss Hll (Sac l*Sac I) del genoma di HIV F12 (Carlini et al., vedi sopra), che era reso non coesivo al terminale Bss Hll (Bss Hll e Tha I riconoscono siti unici adiacenti nella sequenza di iniziazione). I siti Not I erano creati adiacenti a Xba l (nt 1) e Aat II (570 nucleotidi a vaile del HIV F12-LTR troncato in Sac I nel vettore pUC19) per permettere l’inserimento del genoma HIV F12 nef<+ >nel vettore N2. Un sito aggiuntivo Not I era poi aggiunto al sito di clonaggio N2. La ligazione Not I - Not I di N2 con il genoma HIV F12 modificato (come già descritto) generava sia i costrutti senso che antisenso nef.

Esempio 2 Colture cellulari e metodi di trasfezione

Le cellule CEMss, HUT-78, H9/HTLVme e C8166 erano mantenute in terreno RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS). Le cellule HeLa, NIH 3T3, GP+E86 (Markowitz et al., J. Virol. 62:1120-1124 (1988)) e PA317 (Millet et al., Mol. Celi. Biol. 6:2895-2902 (1986)) erano mantenute in terreno minimo modificato da Dulbecco (MEM) supplementato con 10% FCS. Le cellule CEMss e HUT-78 erano cresciute in presenza di 1 mg/ml di G418 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, 50% di attività) per la selezione, mentre per l'impaccamento e le cellule NIH 3T3 erano cresciute in presenza di 0.5 mg/ml di G418, con la selezione che iniziava 48 ore dopo i cicli di infezione.

Il clonaggio delle cellule era ottenuto piastrando in piastra da 96 pozzetti 0.5 cellule/pozzetto secondo il metodo di diluizione limitante (Federico et al. (1995), vedi sopra). Linfociti da sangue periferico umano (PBL), ottenuti come precedentemente descritto (Rossi et al, vedi sopra), erano stimolati con fitoemoglutinina (PHA) per 48 ore ed erano poi coltivati in RPM1 1640 suppiementato con 20% FCS e con SO U/ml di IL-2 umana ricombinante (rhlL-2, Roche, Nutley, NJ).

I monostrati di cellule erano trasfettati con il metodo di precipitazione in calcio fosfato (Wigier et al., Celi 16:758-777 (1979)). In breve, 10 g del DNA plasmidico venivano precipitati e aggiunti alle colture subconfluenti in piastre da 10 cm di diametro. Dopo 4 ore, il precipitato veniva rimosso e le cellule lavate e supplementate con terreno fresco completo. Dopo 2 giorni, i sovranatanti venivano rimossi e utilizzati come fonte di retrovirus.

Gli esperimenti di trasfezione transente erano effettuati su cellule HeLa, NIH 3T3 e PA317 utilizzando ciascuno dei quattro differenti costrutti N2/HIV F12 e la presenza intracellulare delle proteine gag di HIV F12 sulle cellule (10<5>) veniva assegnata due giorni dopo. La trasfezione cellulare con il vettore N2 da solo veniva utilizzato come controllo negativo. I risultati sono mostrati nella tabella I, che fornisce le quantità di proteina HIV F12 gag intracitoplasmatica (pg di proteina p24 HIV/10<5 >cellule) in cellule trasfettate con N2/HIV F1248 ore dopo la trasfezione e dopo selezione in G418.

segue tabella

TABELLA I

Quantità<* >di proteina gag HIV F12 citoplasmatica in cellule trasfettate N2/HIV F12.

* programmi di proteina p24 HIV in 10<5 >cellule

** media di quattro esperimenti indipendenti ± d.s.

I risultati mostrano che le modificazioni ottenute sul genoma di HIV F12 non interferiscono in maniera negativa con l’espressione de! genoma. Infatti, nessuna differenza significativa nella produzione delle proteine gag era osservata tra i quattro costrutti retrovirali paragonati ai genoma ad intera lunghezza di HIV F12 inserito nel plasmide pUC19 (Carlini et al, vedi sopra). Quantità significativamente più alte delle proteine gag erano osservate nelle cellule umane rispetto alle cellule di topo, sia 48 ore dopo la trasfezione che dopo selezione in G418, probabilmente a causa dell'attività più forte del promotore HIV negli umani piutosto che nei topi (Trono et al, EMBO 9:4155-4160 (1990)). Risultati simili erano ottenuti in cellule stabilmente trasfettate HeLa e NIH 3T3, sebbene le quantità di proteine gag erano più alte rispetto alle quantità osservate nelle cellule trasfettate in maniera transente (vedi tab. I).

Esempio 3 Generazione di particene retrovirali ricombinanti dai costruti retrovirali

I sovranatanti dalle cellule trasfettate GP+E86 e PA317 erano utilizzati per infettare monostrati subconfluenti di cellule PA317 (singolo ciclo di infezione) o CEMss (quattro cicli di infezione), rispettivamente, che erano pretrattate con 8 mg/ml di polibrene (Sygma, St. Louis, MO). Le cocoltivazioni erano effettuate per infettare sia te cellule CEMss o i PBL umani con i retrovirus anfotropici rilasciati dai cloni di cellule producenti PA317. Le cellule producenti (10<5>) erano piastrate in colture di 1 mi con cellule CEMss (10<5>) o con PBL (10<6>). Dopo 24 ore, le cellule PA317 venivano rimosse, e per eliminare completamente le cellule producenti, le piastre di coltura venivano cambiate ogni 24 ore per CEMss o ogni 12 ore per PBL. Le cellule PA317 resistenti a G418 (neo<r>) erano recuperate dopo infezione con il sovranatante da cellule trasfettate ecotropiche GP+E86. Inoltre, cellule CEMss umane neo<r >che esprimono HIV F12 derivavano dall’infezione con il sovranatante da cellule trasfettate, anfotropiche PA317.

Esempio 4 Analisi di DNA. RNA e proteine di cellule infettate

II DNA genomico era preparato con metodi standard (Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Nolon, C., ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NV (1989)). L’RNA totale era estratto con il metodo della guanidina isotiocianato (Chirgwin et al., Biochemitry 18:5294 (1979)) e la frazione poli A+ era ottenuta attraverso separazione con oligo-dT accoppiato con palline Dynal (Dynal, Oslo, Noervegia). Le ibridazioni Southern e Northern erano effettuate come descritto in (Maniatis et al., vedi sopra). Le sonde erano marcate in maniera radioattiva con <Μ>Ρ ad una attività specifica di 0.5-2x10° cpm/pg di DNA utilizzando il metodo di inneschi casuali che sono mostrati nella figura 2, che è un diagramma schematico delle regioni del genoma N2/HIV F12 nef (as) coperto dalle sonde. La sonda genomica HIV F12 era ottenuta per excissione del provirus dai costrutti N2/HIV F12 nef. Il trasposone batterico di intera lunghezza Tn5 era utilizzato come sonda neo. I DNA di HIV F12 env e nef erano ottenuti dopo clonaggio dei prodotti di amplificazione per PCR nel sito Eco RI di pUC19 utilizzando oligoinneschi di Eco RI che si sovrappongono ai codoni di inizio e di fine di ciascun gene. La sonda HIV F12 U3 LTR veniva recuperata dopo digestione con Xba l-Sma I dei HIV F12 5’LTR donato in pl)C19. Le sonde specifiche per N2 venivano recuperate dopo digestione di N2 con Nhe I e Sac I per la sonda LTR-U3, Sma I e Spe I per la sonda LTR-R/U5, e Eco RI e Spe I per la sonda sitospedfica di N2 (sito di impaccamento, vedi figura 2).

Le figure 4I-III sono ibridazioni Southern di DNA genomico digerito con Xho I (a) o Eco RI (b) da una popolazione cellulare neo<r >infettata e DNA genomico digerito con Eco RI (c) da cloni cellulari stabilmente trasdotti nef (as). Nelle figure 4I e 4II, i DNA da cellule CEMss trasdotte neo<* >nef (as) e nef (s) sono mostrate nelle colonne A e B, rispettivamente, mentre il DNA dalle cellule PA317 infettate neo<+ >nef (as), nef (s), nef (as) e nef (s) sono mostrati nelle colonne C-F, rispettivamente. Nelle figure 4III, il DNA da doni cellulari PA317 nef (as) (2 e 12) e CEMss (40 e 41) è mostrato. Il DNA da cellule non infettate CEMss (C-) e da cellule H9-HTLVHB (C+) era utilizzato come controllo negativo e positivo, rispettivamente. Il DNA fagico digerito con Hind III era utilizzato come marcatore molecolare (a sinistra).

L'ibridazione Southern del DNA digerito con Xho I dalle cellule CEMss neo<r >infettate con il sovranatante dalle cellule PA317 trasfettate con N2/HIV F12 nef (as) mostrava una banda di 9 kb (figura 4, colonna A), come atteso, poiché l'intero genoma di HIV F12 viene excisso dal costrutto per digestione con Xho I, in aggiunta ad un segnale addizionale di un peso molecolare più basso, probabilmente derivato da un riarrangiamento genomico. In contrasto nessuna banda aggiuntiva era evidenziata nel pattern di DNA Xho I delle cellule PA317 neo<r >infettate con i sovranatanti dalle cellule GP+E86 trasfettate con nef (as) (figura 4M, colonna A), mentre un segnale inatteso era evidenziabile nelle cellule PA317 (figura 4M, colonna C).

Una ibridazione Southern del DNA digerito con Xho I dalle cellule CEMss neo<r >infettate con il sovranatante di cellule PA317 trasfettate con il sovranatante da N2/HIV F12 nef (s) (figura 4I, colonna B) dimostrava l’integrazione di tre diversi DNA HIV F12 specifici, molto probabilmente originanti dalle tre forme maggiori del RNA HIV F12 (cioè non processato, processato una volta e processato due volte come mostrato nella figura 3, che è un diagramma schematico degli RNA trascritti attesi in cellule trasfettate con N2/HIV F12 nef (s) e (as) (Federico et al., (1989), vedi sopra). Questi dati erano anche confermati dalla digestione con Eco RI (figura 4M, colonna B). Al contrario, nessun segnale specifico per HIV F12 era evidenziabile nel DNA genomico da cellule PA317 neo<r >infettate con il sovranatante da cellule GP+E86 nef (s) trasfettate (figura 4I, colonna D), indicando una efficienza molto bassa di trasduzione di una sequenza HIV F12 in queste cellule.

Tentativi di recuperare cellule CEMss dopo infezione con sovranatanti PA317 trasfettati con nef<+ >e selezione in G418 erano senza successo. Una analisi per ibridazione Southern del DNA digerito con Xho I da cellule PA317 neo<+ >rivelava la presenza di una banda singola nelle cellule PA317 infettate dai retrovirioni nef (s) (figura 4I, colonna E). Il peso molecolare di questo segnale (circa 3 kb) indica che solo molecole di RNA di HIV F12 processate due volte venivano impaccate nei retrovirioni ricombinanti effettivi. Al contrario, nessuna banda era evidenziata in cellule PA317 infettate con i retrovirioni nef (as) (figura 4I, colonna F).

Per assegnare la funzionalità dei costrutti N2/HIV F12 trasdotti nelle cellule per infezione retrovirale, tutte le popolazioni cellulari neo<r >venivano saggiate per accumulo intractoplasmatico delle proteine gag codificate da HIV F12. L’antigene intracellulare p24 nelle cellule infettate retrovirali veniva determinato lisando le cellule (10<5>) in 200 I di TNE (Tris-Hcl 10mM, NaCI 100mM, EDTA 1mM, ph 7.4) contenente 0.1% Triton X-100 (Sygma. St Louis, MO). Dopo 5 minuti di incubazione in ghiaccio, i tisati cellulari venivano centrifugati brevemente e i sovranatanti risultanti venivano saggiati per un saggio di cattura dell'antigene di tipo ELISA (Abbott, Chicago, IL).

Le proteine correlate con HIV venivano evidenziate per saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA, Federico et al., (1995) vedi sopra). I risultati del saggio RIPA di cloni di cellule CEMss trasdotti con N2/HIV F12 nef (as) rappresentativi effettuato con una miscela di siero HIV<+ >o HIV sono mostrate nella figura 11. I Usati dalle cellule F12 e H9/HTLVWB erano usati come controlli positivi, mentre i lisati dalle cellule CEMss trasdotte con N2 erano utilizzate come controllo negativo. I marcatori molecolari marcati con <14>C e le proteine di HIV evidenziabili nel saggio RIPA sono anche evidenziate.

In vista dei risultati descrìtti, solo le cellule che esprìmono nef erano analizzate per saggio ELISA. I risultati sono presentati nella tabella II, che fornisce le quantità di proteina gag di HIV F12 intracitoplasmatica (espressa in picogrammi di proteina gag in 10<5 >cellule neo<r>; valori medi di quattro diversi esperimenti S.D.) per cellule neo infettate con retrovirus ricombinanti N2/HIV F12 senso (s) o antisenso (as) e il numero di cloni cellulari che esprimono HIV F12 sul totale di cloni cellulari analizzati.

TABELLA II

* picogrammi di proteina gag in 10° cellule

** media di quattro esperimenti indipendenti ± s.d.

I risultati mostrano che la proteina gag HIV F12 intracitoplasmatica non era evidenziata nelle cellule PA317 neo<r >infettate dai vinoni nef (s). Sebbene livelli bassi della proteina intracitoplasmatica erano inizialmente evidenziati nelle cellule CEMss neo<r >infettate dal retrovirus antotropico nef (s), nessuna proteina intracitoplasmatica era evidnziata con i passaggi cellulari.

In contrasto, livelli più alti di proteina gag HIV F12 erano evidenziabili sia in cellule PA317 che in cellule CEMss che integrano il genoma nef (as). Questi valori positivi rimanevano stabili per un lungo perìodo di tempo, per più di un anno.

Per valutare la percentuale di cellule stabilmente esprìmenti il genoma HIV F12, le cellule PA317 neo<r >e CEMss che integrano il genoma nef sia neH’orientamento s che in quello as venivano clonate con il metodo di diluizione limitante. Come è mostrato nella tabella II, nessun clone nef (s) che esprìme HIV F12 veniva isolato sia da cellule PA317 che CEMss neo<r>, anche se queste ultime erano inizialmente positive con il saggio ELISA. In contrasto i cloni cellulari PA317 che esprimono il genoma nef (as) erano facilmente disponibili (circa 12%); inoltre, circa il 23% dei doni CEMss erano in grado di sintetizzare le proteine gag.

Esempio 5 Analisi FACS di separazione di cellule attivate per fluorescenza I recettori CD4 della membrana piasmatica erano evidenziati per immunofluorescenza indiretta e analizzati con un dtofluorimetro come descrìtto da Taddeo et al. (Virology 194:441-452 (1993)). In breve, le cellule (10<6>) venivano incubate con una appropriata concentrazione di un anticorpo monoclonale anti-CD4 (mAb, Ortho Diagnostic, Raritan, NJ) in 100 μΙ di tampone fosfato salino (PBS) che contiene 2.5% FCS. Dopo 1 ora di incubazione in ghiacdo i campioni erano lavati due volte in PBS e ulteriormente incubati per 1 ora in ghiacdo con 100 μΙ di una diluizione 1:20 di un siero di capra anti IgG di topo coniugate con fluoresdna isotiocianato (Ortho Diagnostic, Raritan, NJ). Dopo tre lavaggi con PBS, i campioni erano fìssatt con una soluzione ai 2% v/v di formaldeide e analizzati con un citofluorimetro (FAC-scan, Becton-Dickinson, Mountain View, CA).

Le proteine correlate con gag di HIV intracitoplasmatiche erano evidenziate per immunofiuorescenza diretta. Le cellule (10<5>) erano lavate tre volte con tampone PBS complementato con FCS 2.5% e risospese in 200 μ! di PBS-EDTA (10 mM). Una soluzione di PBS-formaldeide (2% v/v) veniva poi aggiunta e le cellule erano incubate a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti. Dopo due lavaggi con il tampone PBS-FCS, le cellule venivano risospese in 40 μΙ di PBS-EDTA freddo. Poi 400 μΙ di metanolo freddo venivano aggiunti goccia a goccia e te cellule incubate in ghiaccio per 10 minuti aggiuntivi. Le cellule venivano poi lavate tre volte e incubate per 1 ora a RT con una diluzione 1:50 di un mAb anti-gag di HIV KC57-RD1 (Coulter Corp., Hialcam, FL) accoppiato con ficoeritrina (PE). Infine, le cellule venivano lavate tre volte con tampone PBS-FCS ed analizzate da un citofluorimetro. Sia le cellule non infettate che quelle trattate con un anticorpo anti lgG1 di topo non specifici coniugati con PE erano utilizzate come controlli negativi.

I sovranatanti da 11 cloni di cellule PA317 che esprimono HIV F12 nef (as) erano titolati come cfu/ml su cellule NIH 3T3. I titoli retroviraii erano relativamente bassi, tra 4.6 x 10<2 >a 4 x 10<4 >cfu/ml, come atteso, in considerazione delle dimensioni del costretto retro virale, circa di 11 kb.

Una analisi del DNA dei due cloni PA317 (2 e 12) che producevano i più alti titoli retrovirali indicava che il costretto retrovirale era integrato pienamente net genoma ospite (figura 4lli) ed era trascritto efficientemente come dimostrato da una analisi Northern. Una immunofiuorescenza diretta intracitoplasmatica delle proteine gag specifiche HIV F12 è mostrata nelle figure 5a e 5b, che sono grafici di intensità di fluorescenza in funzione delle conte per i doni 2 e 12 delle cellule PA317 che esprimono HIV F12 nef (as), rispettivamente. In entrambi i grafia, le cellule PA317 trattate con anti gag di HIV vengono riportate come controllo negativo. Come mostrato nella figura 5, entrambi i doni erano in grado di esprimere in maniera omogenea il genoma di HIV F12.

Esempio 6 Caratterizzazione molecolare di cellule CEMss e di PBL umani trasdoti

Cloni di PA317 erano cocoltivati con cellule CEMss e con PBL umani freschi stimolati con PHA per trasdurre il genoma di HIV F12 in cellule suscettibili di HIV. 24 ore dopo le cocoltivazioni, si aggiungeva G418 alle cellule CEMss ed una popolazione cellulare neo<r >era ottenuta dopo 20 giorni. La percentuale di cellule neo<r >die esprimono la proteina gag HIV F12 intracitoplasmatica era assegnata per analisi FACS. I risultati sono mostrati nelle figure 6a-d, die rappresentano analisi FACS della presenza di proteina gag HIV F12 intracitoplasmatica in cellule CEMss non infetate (controllo negativo, figura 6a), cellule HUT-78/F12 (controllo positivo, figura 6b), cellule CEMss neo<r >dopo cocoltivazione con il done 2 di PA317 (figura 6c), e cellule CEMss neo<r >dopo cocoltivazione con il done 12 di PA317 (figura 6 d). Sono anche mostrate le percentuali di cellule positive per dascuna. Come mostrato nelle figure 6a-d, arca il 35% delle cellule neo<r >che esprimono il genoma di HIV F12. Questi dati erano replicati in cellule HUT-78. Inoltre, 36 su 60 dei doni cellulari di CEMss analizzati, cioè il 55%, esprìmevano il genoma di HIV F12 come dimostrato con un saggio specifico gag HIV ELISA.

Ibridazioni Southern di DNA genomico delle cellule CEMss neo<r >trasdotte da cocoltivazione con il clone 2 o 12 di cellule PA 317 “producenti", digerito con diversi enzimi di restrizione, era ibridato con sonde specifiche HIV F12 o neo come mostrato nelle figure 7a e 7b, rispettivamente. La colonna 1 rappresenta il DNA da cellule CEMss trasdotte con N2, mentre la colonna 2 rappresenta DNA da cellule CEMss neo<r >trasdotte con cellule PA317 N2/HIV F12 nef (as) non clonate, le colonne 3 e 4 rappresentano cellule CEMss neo<r >dopo cocoltivazione con il clone 2 o 12, rispettivamente, le colonne 5 e 6 rappresentano le cellule HUT-78 neo<r >dopo cocoltivazione con cloni 2 o 12 di cellule PA317, rispettivamente, e la colonna 7 rappresenta il clone 12 di cellule PA317. Il DNA genomico era digerito con l'enzima di restrizione indicato e il marcatore di peso molecolare DNA era lo stesso di quello delle figure 4I-III. Le ibridazioni indicano che il genoma di HIV F12 si integrava pienamente senza riarrangiamenti genomici apparenti.

Per stimare la frequenza degli eventi l’infezione nelle cellule CEMss, la clonalità delle cellule neo<r >veniva esaminata. DNA genomico digerito con Hind III di cellule CEMss neo<r >o HUT-78 trasdotte per cocoltivazione con il clone 2 o 12 producente di cellule PA317 era ibridizzato con una sonda neo come mostrato nella figura 8, che è un trasferimento Southern di tali ibridazioni. Iniziando dal lato 5' LTR di N2 del costrutto N2/HIV F12 nef (as), il primo sito riconosciuto dall'enzima Hind III risiede nel gene env di F12, circa 3 kb dal terminale 5'LTR di N2. Come controlli, DNA dal clone 12 (positivo) di PA317 e cellule CEMss parentali (negative) erano utilizzate, il marcatore di peso molecolare era lo stesso di quello nelle figure 4I-III. L’ibridazione del DNA genomico con la sonda neo dimostra che le colture trasdotte di cellule T erano largamente policlonali, pertanto escludendo la possibilità che popolazioni cellulari neo<r >emergessero da eventi di infezione rari.

Quaranta cloni CEMss che integravano ed esprimevano il genoma HIV F12 nef (as) erano isolati e coltivati per effettuare una caratterizzazione molecolare comparativa. Lo schema di digestione conEco RI di due cloni rappresentativi (40 e 41) è mostrato nella figura 4III. Nessuna differenza significativa nella configurazione del RNA o delle proteine di HIV era evidenziata nei cloni CEMss (come giudicato dalla variazione dei siti di integrazione).

Gli RNA poliA+ venivano ibridati sia con sonde specifiche per HIV F12, cioè di intera lunghezza, U3-LTR, nef, e env o con sonde mostrate nella figura 3 che riconoscono regioni differenti del vettore N2. Le figure 9a-d sono ibridazioni Northern di RNA poliA+ da cellule F12 (colonna 1) cellule CEMss parentali (colonna 2), e il clone 40 di CEMss trasdotto con N2/HIV F12 nef (as) (colonna 3) ibridato con HIV F12 di intera lunghezza (figura 9a), HIV F12 U3 LTR (figura 9b), HIV F12 nef (figura 9c), e HIV F12 env (figura 9d), cioè con sonde specifiche per HIV F12. 1 pesi molecolari delle specie maggioritarie di RNA di HIV F12 sono indicate alla sinistra delle figure. Per ciascuna delle ibridazioni Northern mostrate nella figura 9, 5 g di RNA erano corsi in ciascuna colonna del gel utilizzate per generare il blot. I cloni di cellule CEMss che esprimevano HIV F12 nef esprimevano bassi livelli del RNA di HIV processato due volte, cioè messaggeri specifici delle proteine regoiative, come riportato per i cloni di cellule HeLa CD4+ che esprimono HIV F12 (Federico et al. (1995), vedi sopra). In contrasto, gli RNA di intera lunghezza e processati una volta venivano trascritti abbastanza efficientemente. La doppia banda chiaramente evidenziabile nei pesi molecolari più alti corrispondeva a due trascritti di intera lunghezza in orientamenti opposti da HIV F12 e MLV 5’LTR. Questa osservazione era supportata dalla banda singola, invece che doppia a circa 11 kb evidenziata per ibridazione dello stesso RNA poliA+ con una sonda che si sovrappone alla regione U3 del HIV F12 LTR, che potrebbe essere trascritta soltanto dalla catena di DNA che codifica per il vettore retro virale N2.

Le figure 10a-d sono ibridazioni Northern di RNA poiiA+ da cellule F12 (colonna 1), cellule CEMss trasdotte con un vettore pLj retrovirale con un dopoio promotore (colonna 2, Korman et al., PNAS USA84:2150-2154 (1987)), e il clone 40 di cellule CEMss trasdotte con N2/HIV F12 nef (as) (colonna 3) ibridizzate con sonde specifiche per neo (figura 10a), U3-MLV (figura 10b), R/U5-MLV (figura 10c), e MLV (figura 10d). I pesi molecolari delle specie di RNA prodotte in cellule CEMss dai vettori pl_j sono riportate sulla parte sinistra dell’ibridazione Northern: L’ibridazione del RNA poliA+ con sonde specifiche per il gene neo, le regioni U3 e R-U5 del N2 LTR ed il sito N2 mostrava che i trascritti processati una volta e due volte promossi dal HIV F12 5’ LTR erano riconosciuti da ciascuna sonda, indicando che queste specie di RNA erano trascritte fino alla regione U3 del 5'LTR MLV. La singola banda ad alto peso molecolare ottenuta dopo ibridazione con la sonda specifica per il sito N2, che riconosce necessariamente il trascritto promosso da N25’ LTR, indicava che l'RNA HIV F12 non processato non includeva tali sequenze, suggerendo un evento di processamene) che invece, non avveniva negli RNA di HIV F12 processati una e due volte. Nessun RNA processato veniva trascritto dai MLV 5' LTR. Infatti, nessuna banda di RNA aggiuntiva era evidenziata oltre al doppietto di 10-11 kb e di RNA di HIV F12 processati una e due volte, che sono più facilmente visti solo dopo una sovraesposizione della lastra. In accordo, come mostrato nella figura 9, un singolo segnale ad alto peso molecolare era evidenziato ibridizzando RNA poliA+ di CEMss con una sonda HIV F12 U3/LTR che riconosce i trascritti promossi da N25’ LTR.

Il profilo di proteine virali prodotte dai cloni CEMss trasdotti con N2/HIV F12 nef (as) era simile a quello ottenuto con i cloni di cellule HeLa CD4+ trasfettate con HIV F12 (Federico et al: (1995), vedi sopra). La figura 14 è un grafico di cpm/ml del sovranatante di coltura in funzione dei giorni dopo l'infezione (p.i.) e l'inserto è un grafico della percentuale della vitalità cellulare in funzione dei giorni p.i. per i cloni trasdotti CEMss N2/HIV F12 nef-9 (as), per esempio 15, 40 e 41, superinfettati con 10<5 >TCIDso/10<6 >cellule. Le cellule trasdotte con N2 erano utilizzate come controllo. Nessun taglio della glicoproteina gp 160 env era evidenziato, mentre quantità ridotte di proteine p55 e p25 gg erano osservate, a paragone di cellule infettate con un HIV competente per la replicazione. Ad eccezione del clone 21, nessuna riduzione significativa dell'espressione di CD4 era evidenziata in nessuno dei cloni di CEMss che esprimevano HIV F12 nef come mostrato nella tabella III.

TABELLA 111

Analisi FACS di CD4 di cloni di cellule CEMss trasdotte con N2/HIV F12 nef

Il costrutto N2/HIV F12 nef (as) era anche trasdotto in linfociti da sangue periferico fresco umani (PBL). Dopo 24 ore di cocoltivazione, l'efficienza di trasduzione veniva assegnata saggiando estratti intracitoplasmatici per saggio ELISA. La proteina gag era ottenuta in quantità di 15 e 39 pg, rispettivamente, da 10<5 >PBL 5 giorni dopo la terminazione della cocoltivazione con i doni di PA317 3 e 12. In accordo, era estimato per analisi FACS e circa il 5% di PBL erano trasdotti con successo dalle cocolture come mostrato nelle figure 12a-c. Le figure 12a-c sono grafici di conte in funzione dell’intensità di fluorescenza rappresentanti una analisi FACS di cellule HUT78-F12 trattate con anti gag HIV (figura 12a controllo positivo), PBL non infettati (figura 12b controllo negativo) e PBL freschi umani 5 giorni dopo il termine della cocoltivazione con il clone 12 di PA317 (figura 12c). Le percentuali di cellule positive sono 96%, 0.7% e 5.95%, rispettivamente. Questi dati erano supportati da un’analisi Southern del DNA ad alto peso molecolare estratto da PBL trasdotti.

Esempio 7 Caratterizzazione molecolare di doni CEMss trasdotti superinfettati con HIV

25 doni CEMss venivano superinfettati con HIV-1, con HTLVBIII o con il ceppo NL4-3, ad una molteplicità di infezione (m.o.i.) di 5 x 10<3 >o 5 x 10<5 >TCIDsoper 10<® >cellule. L'effetto dtopatico (c.p.e.) della superinfezione con HIV-1 era analizzato in termini di formazione di sincizi e di vitalità cellulare.

Inoltre, una attività di trascrìttasi inversa (RT) dei sovranatanti veniva misurata.

Nessuna formazione di sincizi era evidenziabile in nessuno dei cloni CEMss superìnfettati con HIV. In contrasto sia cellule CEMss selvatiche che cellule CEMss integranti il vettore N2 formavano rapidamente grandi sincizi e morivano pochi giorni dopo la superìnfezione con HIV. La cinetica dell'attività RT e della vitalità cellulare dei tre cloni CEMss rappresentativi è mostrata nelle figure 13 e 14.

La figura 13 è un grafico di cpm/ml del sovranatante di coltura in funzione dei giorni post-infezione (p.i.) e l’inserto è un grafico della percentuale di vitalità cellulare in funzione dei giorni p.i. per cloni trasdotti di CEMss con N2/HIV F12 nef (as) rappresentativi, cioè 15, 40 e 41, superìnfettati con 5x10<3 >TCIDso/10<6 >cellule. Sia le cellule CEMss parentali che le cellule CEMss trasdotte con N2 erano utilizzate come controlli. La figura 14 è come già descrìtto.

I dati mostrano che la superìnfezione con HIV non interferisce in maniera significativa con la crescita dei cloni che esprìmono HIV F12, anche alla più alta m.o.i. I punti positivi evidenziati nel saggio RT del clone 15 alla più alta m.o.i. erano rappresentativi dei pochi campioni RT positivi che si originano da 5 dei 25 cloni di CEMss trasdotti superìnfettati alla stessa m.o.i. Tuttavia, nei restanti cloni CEMss, valori molto bassi o negativi di RT erano evidenziabili, a prescindere alla m.o.i. utilizzata e dal numero di giorni dopo la superìnfezione.

Pertanto, l’espressione del genoma di HIV F12 inibisce fortemente la replicazione di un HIV superi nfettante selvatico, senza interferire con l’esposizione del recettore per HIV CD4. La proprietà interferente era pertanto anche così preservata quando il genoma HIV F12 mancante del suo gene nef era inserito nel vettore N2 e trasdotto con infezione retrovirale rìcombinante (vedi anche Federico et ai (1995) vedi sopra).

Tutti i riferimenti qui citati, compresi i brevetti, domande di brevetto, pubblicazioni e libri sono qui incorporati come riferimento per intero.

Mentre l'invenzione è stata descritta rispetto a una o più forme preferite di attuazione sarà ovvio per gli esperti del settore che possono essere utilizzate variazioni, comprese variazioni che derivano da miglioramenti nel settore e che l’invenzione può essere attuata in modi diversi da quelli descritti specificatamente. In accordo l'invenzione comprende tutte le variazioni e modificazioni che rientrano nello spirito e nell’ambito dell'invenzione come definito dalle seguenti rivendicazioni.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione che comprende un vetore retrovirale comprendente un genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente, in quantità sufficiente da ottenere una integrazione stabile di detto genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente in almeno alcuni dei genomi nucleari di cellule bersaglio e l'espressione di detto genoma di un variante HIV, non difettivo, non producente in dette cellule bersaglio, per conferire resistenza a cellule alla superinfezione con HIV.
2. 2. Composizione secondo la rivendicazione 1 in cui detta variante genomica di HIV non difettiva non producente si integra in almeno circa 1<*>1% dei genomi nucleari di dette cellule bersaglio.
3. 3. Composizione secondo la rivendicazione 2 in cui detta variante genomica di HIV non difettiva non producente si integra in circa da!!’1% a circa il 10% dei genomi nucleari delle cellule.
4. 4. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui dette cellule bersaglio sono cellule T.
5. 5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto genoma della variante di HIV non difettiva non producente è quello di HIV F12.
6. 6. Composizione secondo la rivendicazione 5 in cui il 3’LTR di deto HIV F12 è deleto.
7. 7. Composizione secondo la rivendicazione 6 in cui deto HIV F12 è inserito in detto vettore retrovirale nell’orientamento antisenso.
8. 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui deto vetore retrovirale è derivato dal virus della leucemia mulina di Moloney.