ES2291025T3 - Celulas lentivirales de empaquetamiento. - Google Patents

Abstract

Una línea celular de empaquetamiento lentiviral que comprende: un primer vector que codifica una poliproteína retroviral gag y una parte de una poliproteína retroviral pol; un segundo vector que codifica el resto de la poliproteína retroviral pol no codificada por dicho primer vector, fusionado a un péptido o a una proteína Vpr o Vpx; y un tercer vector que codifica una proteína viral env.

Description

Células lentivirales de empaquetamiento.

Antecedentes de la invención

El éxito de las técnicas de la terapia génica depende en gran medida de la capacidad para conseguir una combinación de integración cromosómica estable y expresión regulada, de alto nivel, de los genes transferidos de una forma segura para los seres humanos. Muchas técnicas actuales permiten la transfección transitoria eficiente de células in vitro e in vivo con fragmentos grandes de ADN. Sin embargo, la integración cromosómica subsiguiente es muy ineficaz. Para superar los niveles bajos de integración, se pueden usar vectores retrovirales, que se integran de forma muy eficaz en las células permisivas.

Mientras que los vectores retrovirales recombinantes permiten la integración de un transgen en un genoma de célula hospedadora, la mayor parte de los retrovirus sólo pueden transducir células divisorias, lo que limita su uso para la transferencia de genes in vivo a células no proliferantes tales como hepatocitos, miofibras, células tronco hematopoyéticas y neuronas. Las células no divisorias son el tipo de células de larga vida, predominantes, en el cuerpo, y constituyen la mayor parte de las dianas deseables de transferencia de genes, incluyendo hígado, músculo y cerebro. Hasta los protocolos que intentan la transducción de células tronco hematopoyéticas requieren procedimientos exigentes ex vivo para desencadenar la división celular en estas células antes de la infección.

Una forma de superar este obstáculo es emplear vectores lentivirales, en lugar de los vectores retrovirales convencionales. Los lentivirus son retrovirus complejos que, en base a su nivel más elevado de complejidad, se pueden integrar en el genoma de células no proliferantes y modular su ciclo vital, como en el curso de la infección latente. Estos virus incluyen VIH-1, VIH-2 y VIS. Al igual que otros retrovirus, los lentivirus poseen genes gag, pol y env que están flanqueados por dos secuencias de repetición terminal larga (LTR). Cada uno de estos genes codifica múltiples proteínas, inicialmente expresados como una poliproteína precursora. El gen gag codifica las proteínas estructurales internas (matriz, cápsida y nucleocápsida). El gen pol codifica la ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa, integrasa y proteasa). El gen env codifica las glicoproteínas virales de envoltura y de manera adicional contiene un elemento que actúa en cis (RRE) responsable de la exportación nuclear del ARN viral. Las LTR 5' y 3' sirven para fomentar la transcripción y poliadenilación del ARN del virión. La LTR contiene todas las otras secuencias que actúan en cis necesarias para la replicación viral. Junto a la LTR 5' están las secuencias necesarias para la trascripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador de ARNt) y para la encapsidación eficaz del ARN viral en partículas (el sitio Psi). Si las secuencias necesarias para la encapsidación (o empaquetamiento de ARN retroviral en viriones infecciosos) no se encuentran en el genoma viral, el resultado es un defecto en cis que evita la encapsidación del ARN genómico. Sin embargo, el mutante resultante todavía es capaz de dirigir la síntesis de todas las proteínas del virión. Una revisión exhaustiva de lentivirus, tales como VIH, se proporciona, por ejemplo, en Field's Virology (Raven Publishers), eds. B.N. Fields y col., © 1996.

Además de gag, pol y env, los lentivirus, a diferencia de otros retrovirus, tienen diversos genes "accesorios" con función reguladora o estructural. Específicamente, VIH-1 posee al menos 6 de tales genes, incluyendo Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu y Nef. El estrechamente relacionado VIH-2 no codifica Vpu, pero codifica otra proteína no relacionada, Vpx, no encontrada en VIH-1.

El gen Vpr codifica una proteína de 14 kD (96 aminoácidos) (Myers y col. (1993) Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos National Laboratory, N.M.). La fase de lectura abierta de Vpr también está presente en la mayor parte de aislados de VIH-2 y VIS. La comparación de aminoácidos entre Vpr y Vpx de VIH-2 muestra regiones de elevada homología que sugiere que Vpx puede haber surgido por duplicación del gen Vpr (Myers y col. (1993), arriba). Vpr y Vpx están presentes en partículas virales maduras en copias múltiples, y se ha demostrado que se unen a la proteína p6 que es parte de la poliproteína precursora codificada por gag implicada en el ensamblaje viral (documento WO 96/07741; documento WO 96/32494). Así pues, la incorporación de Vpr y Vpx en partículas virales sucede a modo de interacción con p6 (Lavallee y col. (1994) J Virol. 68: 1926-1934; y Wu y col. (1994) J. Virol. 68: 6161). También se ha demostrado que Vpr se asocia, en particular, con la región carboxi terminal de p6. La función precisa de Vpr y Vpx todavía se tiene que determinar claramente, sin embargo, la información hasta la fecha sugiere que estas proteínas tienen una función en la etapa de la infección temprana. También se ha demostrado que Vpr y Vpx, expresados en trans con respecto al genoma VIH, se pueden usar para fijar como diana proteínas heterólogas al virus VIH (documento WO 96/07741; documento WO 96/32494). También se proporciona una descripción de la estructura y función de Vpr y Vpx, incluyendo las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de longitud completa de estas proteínas y sus dominios de unión en el documento WO 96/07741, así como en Zhao y col. (1994) J. Biol. Chem. 269 (22): 1577 (Vpr); Mahalingham y col. (1995) Virology 207: 297 (Vpr); y Hu y col. (1989) Virology 173: 624) (Vpx). Otras referencias relevantes que se refieren a Vpr incluyen, por ejemplo, Kondo y col. (1995) J. Virol. 69: 2759: Lavallee y col. (1994) J. Virol. 68: 1926; y Levy y col. (1993) Cell 72: 541. Otras referencias relevantes que se refieren a Vpx incluyen, por ejemplo, Wu y col. (1994) J. Virol. 68: 6161. Todas las publicaciones arriba mencionadas se describen mediante referencia en la presente memoria descriptiva.

En vista de las ventajas relacionadas con los vectores retrovirales en la terapia génica, en particular los lentivirus que son capaces de infectar células no divisorias, los procedimientos mejorados para generar reservas puras de virus recombinantes, libres de virus auxiliar de replicación competente, serían de gran valor en la técnica. En general, los retrovirus recombinantes se producen introduciendo un vector de ADN proviral adecuado en células de mamíferos ("células de empaquetamiento") que producen las proteínas virales necesarias para la encapsidación del ARN recombinante deseado, pero que carecen de la señal para empaquetar el ARN viral (secuencia \psi). Así pues, mientras que los genes gag, pol y env necesarios de los retrovirus están intactos, no existe liberación del virus auxiliar de tipo salvaje por parte de estas líneas de empaquetamiento. Sin embargo, cuando las células se transfectan con un vector distinto que contiene la secuencia \psi necesaria para el empaquetamiento, el retrovirus de tipo salvaje puede surgir por recombinación (Mann y col. (1983). Cell 33: 153). Este es un peligro principal, particularmente en el caso de los lentivirus, tales como VIH.

Los planteamientos actuales para evitar los peligros para la seguridad relacionados con la recombinación que lleva a la producción del virus auxiliar de replicación competente incluyen la fabricación de mutaciones adicionales (por ejemplo deleciones de LTR) en las construcciones virales usadas para crear líneas de empaquetamiento, y la separación de los genes virales necesarios para producir viriones sobre plásmidos distintos. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que el virus de la leucemia murina de Moloney (MuLV), libre del virus auxiliar detectable, se puede producir separando los genes gag y pol del gen env en las células de empaquetamiento (Markowitz y col. (1988) J. Virol. 62 (4): 1120). Estas células de empaquetamiento contenían dos plásmidos distintos que codifican de manera colectiva las proteínas virales necesarias para la producción del virón, reduciendo la probabilidad de que los procesos de recombinación necesarios para producir retrovirus intactos (es decir, entre tres vectores de plásmidos) tuvieran lugar cuando se cotransfectan con un tercer vector que contiene la señal de empaquetamiento \psi.

Los procedimientos adicionales para producir líneas celulares de empaquetamiento retrovirales más seguras, particularmente líneas celulares de empaquetamiento lentivirales, que generan retrovirus recombinantes, todavía no producen por sí mismas virus auxiliares detectables ni transfieren genes virales, serían de gran valor en la terapia génica de seres humanos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona líneas celulares de empaquetamiento nuevas que producen retrovirus recombinantes, libres del virus auxiliar detectable. Los retrovirus producidos por las líneas celulares de la invención incluyen lentivirus, tales como VIH, capaces de transferir ADN heterólogo a una amplia gama de células no divisorias. Entre otras ventajas, las células de empaquetamiento proporcionan el beneficio de seguridad incrementada cuando se usan en terapia génica de seres humanos al eliminar virtualmente la posibilidad de recombinación molecular que lleva a la producción del virus auxiliar de replicación competente.

En una realización, la invención proporciona una línea celular de empaquetamiento retroviral que contiene al menos tres vectores de expresión distintos que codifican de forma colectiva las poliproteínas gag, pol y env y que, a diferencia de otras líneas celulares de empaquetamiento, separan los genes gag, y pol, al menos en parte, en vectores diferentes para reducir la probabilidad de recombinación con otros vectores retrovirales dentro de la célula, llevando a la producción del virus auxiliar de replicación competente. El primer vector, denominado pgag^pol, codifica la poliproteína gag completa (que contiene proteínas virales de la matriz, cápsida y nucleocápsida, tales como p17, p24, p9 y p6) y, en ciertas realizaciones, también codifica una parte de la poliproteína pol (que contiene proteínas polimerasa virales, tales como proteasa, transcriptasa inversa e integrasa). En una realización, la parte de pol codificada junto con gag en el primer vector incluye la proteína proteasa (PR). El la mayor parte de los genomas lentivirales, PR está codificada por una región de pol que se solapa con gag (véase Figura 5). Por lo tanto, en esta realización, el primer vector codifica gag y la parte de pol que se solapa con gag en el genoma lentiviral (por ejemplo, VIH). Otras partes de solapamiento o no solapamiento de pol también se pueden incluir con gag en el primer vector. Sin embargo, en otra realización, gag y pol están completamente separadas, de tal forma que el primer vector codifica gag en su totalidad y ninguna parte de pol.

El segundo vector, denominado pVpr-RTIN, complementa al primer vector, pgag^pol, codificando la (s) parte (s) restante (s) de la poliproteína pol no codificada por pgag^pol. La poliproteína pol incluye proteasa (PR), transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN). Así pues, en el caso en el que pgag^pol codifica PR, el segundo vector codifica preferiblemente RT e IN. Además, el segundo vector codifica una proteína determinante de diana que dirige las proteínas pol codificadas (por ejemplo RT e IN) para ensamblar viriones en la cara interna de la membrana plasmática. Normalmente, pol está dirigido a ensamblar viriones a través de gag, ya que se expresan juntas como una gran poliproteína precursora gag-pol (por ejemplo, Pr160^{gag-pol}). Sin embargo, en los vectores de la presente invención, gag y al menos una parte de pol están separadas en diferentes vectores. Así pues, la invención emplea un agente que dirige la parte de pol codificada por el segundo vector para ensamblar viriones. El agente determinante de diana (por ejemplo, proteína o péptido) está codificado preferiblemente en fase con la parte de pol, de tal forma que el vector se expresa como una sola proteína de fusión.

Cualquier agente determinante de diana adecuado que se une a un componente de viriones retrovirales de ensamblaje (por ejemplo, proteínas gag lentivirales) se puede codificar (por ejemplo, junto con una parte de pol) por parte del segundo vector. Los agentes determinantes de diana adecuados incluyen, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas y péptidos. En una realización, la proteína determinante de diana es Vpr ó Vpx, incluyendo fragmentos o mutantes de las mismas, que se unen a la proteína gag p6. Así pues, en una realización, el segundo vector codifica una proteína de fusión Vpr ó Vpx que contiene Vpr ó Vpx (o péptidos, mutantes, o variantes de las mismas) y una parte de pol, en la que la parte de pol preferiblemente incluye RT e IN. Dentro de esta construcción de fusión, RT e IN están precedidas preferiblemente por un sitio de escisión de proteasa, de tal forma que están escindidas y activadas por medio de PR una vez que se asocian con los viriones de ensamblaje.

El tercer vector, denominado pENV, codifica una env viral que proporciona una o más proteínas con envuelta para partículas virales codificadas por el primer y segundo vector. En una realización, la env viral procede de un lentivirus, tal como VIH, VIS, VIF, VIE (por ejemplo, gp120 y gp41). En otra realización, la env viral procede de VSV (por ejemplo, glicoproteína VSV-G que pseudotipifica las partículas retrovirales recombinantes codificadas por el primer y segundo vector). Todavía en otra realización, la env viral procede de un retrovirus Tipo C, tal como MoMuL V, HaMuSV, MuMTV, GaL V, FLV y RSV.

El primer, segundo y tercer vector descritos anteriormente se cotransfectan en células de empaquetamiento adecuadas, tales como células de riñón humano 293T, para producir las líneas celulares de empaquetamiento nuevas de la invención. Cuando se cotransfectan con un cuarto vector, que contiene las secuencias \psi y LTR necesarias para el empaquetamiento de ARN en partículas virales, las células producen retrovirus libres de auxiliar, recombinantes. Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona una línea celular productora que contiene un cuarto vector (junto con el primer, segundo y tercer vector), denominada p\psi. El cuarto vector comprende una señal de empaquetamiento retroviral (\psi), preferiblemente junto con un transgen seleccionado, flanqueado por secuencias de repetición terminal larga (LTR). Cualquiera de los vectores primero, segundo, tercero y cuarto también pueden contener un elemento de exportación de ARN, tal como el RRE de VIH, y/o un gen marcador que permita la detección de transformadores de células positivas, así como virus auxiliares no deseados.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir una línea celular de empaquetamiento capaz de generar retrovirus libres de auxiliar, recombinantes. El procedimiento implica la transfección de una célula hospedadora adecuada con un primer vector que codifica una poliproteína retroviral gag junto con (en ciertas realizaciones) una parte de proteína retroviral pol, un segundo vector que codifica el resto de la poliproteína retroviral pol no codificada por el primer vector fusionado a una proteína Vpr ó Vpx, y un tercer vector que codifica una proteína viral env, cada una como se describe anteriormente. Cada uno del primer, segundo o tercer vector contiene un promotor unido de forma operativa a un gen que codifica la poliproteína gag, poliproteína pol, proteína Vpr, proteína Vpx ó proteína env. En una realización, el promotor es un promotor inducible que permite la expresión selectiva de la poliproteína gag, poliproteína pol, proteína Vpr, proteína Vpx ó proteína env dentro de las células de empaquetamiento.

Todavía en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir un retrovirus recombinante por medio de la co-transfección de una célula hospedadora con un primer vector que comprende un gen retroviral gag y (en algunas realizaciones) una parte de un gen retroviral pol, ambos unidos de forma operativa a un promotor; un segundo vector que comprende todo o la parte restante del gen retroviral pol no contenido dentro del primer vector y un gen que codifica toda o parte de una proteína Vpr ó Vpx, estando los genes unidos de forma operativa a un promotor y expresados como una sola proteína de fusión; un tercer vector que comprende un gen viral env; y un cuarto vector que comprende una señal de empaquetamiento viral, una repetición terminal larga viral (LTR), y preferiblemente un transgen, todo como se describe anteriormente. Después de la cotransfección del primer, segundo, tercer y cuarto vector en células adecuadas, los retrovirus recombinantes se pueden recuperar del medio de cultivo celular.

Las líneas celulares de empaquetamiento de la invención, y los retrovirus recombinantes (por ejemplo, VIH y VIS) producidos a partir de estas líneas celulares, se pueden usar para suministrar ácidos nucleicos heterólogos (por ejemplo, transgenes terapéuticos) a células divisorias y no divisorias de una forma segura y eficaz. Por ejemplo, se pueden usar para transformar células diana con un ADN deseado in vitro. De forma adicional, se pueden usar in vivo para suministrar genes terapéuticos a células (por ejemplo, en procedimientos de terapia génica de seres humanos) sin el peligro de la recombinación que lleva a la producción de virus auxiliar de replicación competente.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un mapa del plásmido pgag^pol usado en la línea celular de empaquetamiento de la invención. El plásmido contiene el promotor CMV cadena arriba de un gen pol mutado y gag de VIH. El gen pol está mutado (por ejemplo por deleción o mutagénesis dirigida al sitio para modificar la secuencia codificadora) para evitar la expresión de al menos una parte de la poliproteína pol, preferiblemente transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN). Preferiblemente pol también está mutado para evitar la expresión de genes accesorios.

La Figura 2 muestra un mapa del plásmido pVpr-RTIN usado en la línea celular de empaquetamiento de la invención. El plásmido contiene el promotor RSV-LTR inducible cadena arriba de un gen de fusión de Vpr que codifica Vpr y al menos una parte de pol de VIH que está mutado en el plásmido pgag^pol. Así pues, pVpr-RTIN complementa la secuencia codificadora de gag^pol mutado en pgag^pol. Preferiblemente, pVpr-RTIN codifica una proteína de fusión que contiene Vpr, seguido de un sitio de escisión de proteasa inmediatamente cadena arriba de RT e IN, así como el elemento de exportación del ARN de VIH, RRE, situado de tal forma que se transcribe junto con Vpr, RT e IN, todo como se muestra en la Figura 2.

La Figura 3 muestra un mapa de plásmidos pENV y p\psi usados en la línea celular de empaquetamiento de la invención. El plásmido pENV contiene el promotor RSV-LTR inducible cadena arriba de un gen que codifica la glicoproteína VSVg. Este plásmido proporciona una proteína de envoltura pseudotipificada para el retrovirus recombinante. El plásmido p\psi contiene, de 5' a 3', una LTR 5', la señal de empaquetamiento de VIH (\psi, un elemento de exportación de ARNm (RRE de VIH), el promotor CMV, un gen marcador (GFP), y una LTR 3'. La LTR 5'(izquierda) es preferiblemente una LTR híbrida que contiene secuencias LTR mínimas de VIH en combinación con partes de LTR de MuLV o el promotor CMV. La LTR 3'(derecha) es también preferiblemente un promotor híbrido que contiene secuencias LTR mínimas de VIH en combinación con una secuencia de poli A no lentiviral (por ejemplo, el gen de la \beta-globina de conejo).

La Figura 4 muestra la estructura molecular del virus VIH, incluyendo las proteínas env (gp41 y gp120), proteínas gag (p7/p9, p17 y p24) y proteínas pol (IN, RT).

La Figura 5 muestra un mapa del genoma VIH-1, incluyendo los genes de LTR 5', gag, pol, env, LTR 3' y accesorios.

Descripción detallada de la invención

A diferencia de otras líneas celulares de empaquetamiento retrovirales, las líneas celulares proporcionadas en la presente invención contienen vectores de expresión distintos que codifican al menos partes de poliproteínas gag, pol y env. Separando todo o parte de los genes gag, pol y env en tres plásmidos distintos, se elimina virtualmente el riesgo de recombinación molecular dentro de las células de empaquetamiento para producir el virus auxiliar de replicación competente. Por consiguiente, las células de empaquetamiento retrovirales de la invención son más seguras para usar en terapia génica de seres humanos, además de proporcionar las ventajas de permitir la integración genómica estable del ADN en una amplia gama de células divisorias y no divisorias.

Definiciones

Como se usa en la presente memoria descriptiva, los siguientes términos y frases usados para describir la invención tendrán los significados que se proporcionan a continuación.

La frase "línea celular de empaquetamiento retroviral" se refiere a una línea celular (típicamente una línea celular de mamífero) que contiene las secuencias codificadoras necesarias para producir partículas virales que carecen de la capacidad para empaquetar ARN y producir el virus auxiliar de replicación competente. Cuando la función de empaquetamiento se proporciona dentro de la línea celular (por ejemplo, en trans), la línea celular de empaquetamiento produce retrovirus recombinantes, convirtiéndose así en una "línea celular productora retroviral".

El término "retrovirus" se refiere a cualquier retrovirus conocido (por ejemplo, retrovirus tipo c, tal como el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV) y Virus del Sarcoma de Rous (RSV)). Los "retrovirus" de la invención también incluyen virus de la leucemia de células T humanas, HTLV-1 y HTLV-2, y la familia lentiviral de los retrovirus, tales como virus de la inmunodeficiencia humana, VIH-1, VIH-2, virus de la inmunodeficiencia simia (VIS), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la inmunodeficiencia equina (VIE), y otras clases de retrovirus.

Los términos "poliproteína gag", "poliproteína pol" y "poliproteína env" se refieren a las múltiples proteínas codificadas por los genes retrovirales gag, pol y env, que están típicamente expresados como una sola "poliproteína" precursora. Por ejemplo, gag de VIH codifica, entre otras proteínas, p17, p24, p9 y p6. Pol de VIH codifica, entre otras proteínas, proteasa (PR), transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN). Env de VIH codifica, entre otras proteínas, Vpu, gp120 y gp41. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "poliproteína" incluirá toda o cualquier parte de las poliproteínas gag, pol y env.

Los términos "Vpx" y "Vpr" se refieren respectivamente a las proteínas lentivirales Vpx y Vpr descritas, por ejemplo, en el documento WO 96/07741, incorporado en su totalidad mediante referencia en la presente memoria descriptiva. Estos términos también se refieren a fragmentos, mutantes, homólogos y variantes de Vpr y Vpx que conservan la capacidad de asociarse con p6.

El término "proteína de fusión" se refiere a una molécula que comprende dos o más proteínas unidas entre sí. Típicamente, la proteína de fusión es una secuencia de aminoácidos que comprende dos o más secuencias de proteínas.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. El término "vector de expresión" incluye cualquier vector, (por ejemplo, un plásmido, cósmido o cromosoma de fago) que contiene una construcción génica en una forma adecuada para la expresión por parte de una célula (por ejemplo, unido a un promotor). En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan de forma intercambiable, ya que un plásmido es una forma de vector comúnmente usada. Además, la invención pretende incluir otros vectores que cumplen funciones equivalentes.

El término "transgen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, un gen terapéutico), que es heterólogo en parte o totalmente, esto es, foráneo, a una célula en la que se ha introducido, o, es homólogo a un gen endógeno de la célula en la que se ha introducido, pero que está diseñado para insertarse en el genoma de la célula de tal forma que se modifique el genoma (por ejemplo, se inserta en una localización que es diferente a la del gen natural o su inserción resulta en "una inactivación"). Un transgen puede incluir una o más secuencias reguladoras de la transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones, que pueden ser necesarios para la expresión óptima de un ácido nucleico seleccionado.

Los términos "transformación" y "transfección" se refieren a la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, en una célula receptora.

El término "elemento de exportación del ARN" se refiere a un elemento regulador post-transcripcional que actúa en cis que regula el transporte de una transcripción de ARN desde el núcleo hasta el citoplasma de una célula. Los ejemplos de elementos de exportación del ARN incluyen, pero no se limitan a, el elemento de respuesta rev (RRE) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), (véase, por ejemplo, Cullen y col. (1991) J. Virol. 65: 1053; y Cullen y col. (1991) Cell 58: 423 - 426), y el elemento regulador post-transcripcional (PRE) del virus de la hepatitis B (véase, por ejemplo, Huang y col. (1995) Molec. and Cell. Biol. 15 (7): 3864 - 3869; Huang y col. (1994) J. Virol. 68 (5): 3193 - 3199; Huang y col. (1993) Molec. and Cell. Biol. 13 (12): 7476 - 7486), y Patente de Estados Unidos Nº 5.744.326). En general, el elemento de exportación del ARN se sitúa en la UTR 3' de un gen, y se puede insertar como una o múltiples copias. Los elementos de exportación del ARN se pueden insertar en uno o todos los distintos vectores que generan las líneas celulares de empaquetamiento de la presente invención.

Vectores retrovirales recombinantes

Las células de empaquetamiento de la presente invención comprenden tres o más vectores retrovirales distintos que codifican respectivamente todo o partes de gag, pol y env. Los protocolos para producir vectores retrovirales recombinantes, y para transformar líneas celulares de empaquetamiento, son bien conocidos en la técnica (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. y col. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 9.10 - 9.14 y otros manuales de laboratorio convencionales; Eglitis, y col., (1985) Science 230: 1395 - 1398; Danos y Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 6460 - 6464; Wilson y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 3014 - 3018; Armentano y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 87: 6141 - 6145; Huber y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 88: 8039 - 8043; Ferry y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU 88: 8377 - 8381; Chowdhury y col., (1991) Science 254: 1802 - 1805; van Beusechem y col., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89: 7640 - 7644; Kay y col.; (1992) Human Gene Therapy 3: 641 - 647; Dai y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89: 10892 - 10895; Hwu y col. (1993) J. Immunol. 150: 4104 - 4115; Patente de Estados Unidos Nº 4.868.116; Patente de Estados Unidos Nº 4.980.286; Solicitud PCT WO 89/07136; Solicitud PCT WO 89/02468; Solicitud PCT WO 89/05345; y Solicitud PCT WO 92/07573). Además, las secuencias retrovirales adecuadas que se pueden usar en la presente invención se pueden obtener a partir de fuentes disponibles en el mercado. Por ejemplo, tales secuencias se pueden comprar en forma de plásmidos retrovirales, tales como pLJ, pZIP, pWE y pEM. Las secuencias de empaquetamiento adecuadas que se pueden emplear en los vectores de la invención también están disponibles en el mercado incluyendo, por ejemplo, los plásmidos \psiCrip, \psiCre, \psi2 y \psiAm. Así pues, aunque la presente invención se describa con respecto a realizaciones particulares (por ejemplo, vectores lentivirales particulares), se pueden preparar otros vectores retrovirales para usar en la invención de acuerdo con las directrices descritas en la presente memoria descriptiva.

En una realización particular, la invención proporciona una célula de empaquetamiento que comprende tres o más vectores lentivirales recombinantes. Estos vectores se pueden preparar insertando secuencias lentivirales seleccionadas en un vector adecuado (por ejemplo, un plásmido de expresión disponible en el mercado que contiene elementos reguladores apropiados (por ejemplo, un promotor y potenciador), sitios de restricción para clonación, genes marcadores, etc.). Esto se puede conseguir usando técnicas de clonación convencionales, incluyendo PCR, como se conoce bien en la técnica. Las secuencias lentivirales que se van a clonar en tales vectores se pueden obtener a partir de cualquier fuente conocida, incluyendo ARN genómico lentiviral o ADNc correspondiente a ARN viral. Los ADNc adecuados que corresponden al ARN genómico lentiviral están disponibles en el mercado e incluyen, por ejemplo, pNLENV-1 (Maldarelli y col. (1991) J. Virol. 65: 5732) que contiene secuencias genómicas de VIH-1. Otras fuentes de clones de ADNc retrovirales (por ejemplo, lentivirales) incluyen la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD.

Una vez clonadas en un vector apropiado (por ejemplo, vector de expresión), las secuencias retrovirales (por ejemplo, gag, pol, env, secuencias LTR y que actúan en cis) se pueden modificar como se describe en la presente memoria descriptiva. En una realización, las secuencias lentivirales amplificadas de plásmidos, tales como pNLENV-1, se clonan en un vector de estructura central adecuado, tal como un vector pUC (por ejemplo, pUC19) (Universidad de California, San Franciasco), pBR322, ó pcDNA1 (InVitrogen, Inc.), y después se modifican por deleción (usando enzimas de restricción), sustitución (por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio), u otra modificación (por ejemplo, química) para evitar la expresión o función de secuencias lentivirales seleccionadas. Como se describe en los Ejemplos proporcionados en la presente memoria descriptiva, las partes de los genes gag, pol y env se pueden eliminar o mutar, junto con genes accesorios seleccionados. Por ejemplo, en una realización, una parte de pol se suprime o se muta de otra forma para producir un gen gag^pol truncado que contiene todo de gag y una parte de pol.

Es preferible que cada vector de la invención contenga las secuencias lentivirales mínimas necesarias para codificar las proteínas lentivirales deseadas (por ejemplo, gag, pol y env) o dirigir la función lentiviral deseada (por ejemplo, empaquetamiento de ARN). Esto es, el resto del vector es preferiblemente de origen no viral, o de un virus distinto a un lentivirus (por ejemplo, VIH). En una realización, las LTR lentivirales contenidas en los vectores retrovirales de la invención se modifican reemplazando una parte de la LTR con una secuencia funcionalmente similar de otro virus, creando una LTR híbrida. Por ejemplo, la LTR 5' lentiviral, que sirve de promotor, se pude reemplazar parcialmente por el promotor CMV o una LTR de otro retrovirus diferente (por ejemplo, MuLV ó MuSV). De forma alternativa, o adicional, la LTR 3' lentiviral se puede reemplazar parcialmente por una secuencia de poliadenilación de otro gen o retrovirus. En una realización, una parte de la LTR 3' de VIH-1 se reemplaza por la secuencia de poliadenilación del gen de la \beta-globina de conejo. Minimizando las secuencias lentivirales totales dentro de los vectores de la invención de esta forma, la oportunidad de recombinación entre los vectores, que lleva al lentivirus auxiliar de replicación competente, se reduce enormemente.

Cualquier vector de expresión adecuado se puede emplear en la presente invención. Como se describe en los Ejemplos a continuación, las construcciones de expresión adecuadas incluyen una construcción del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV). El promotor del citomegalovirus se puede obtener a partir de cualquier fuente adecuada. Por ejemplo, el potenciador-promotor del citomegalovirus completo se puede derivar del citomegalovirus humano (hCMV). Otras fuentes adecuadas para obtener promotores del CMV incluyen fuentes comerciales, tales como Clontech, Invitrogen y Stratagene. Se puede usar parte de o todo el promotor del CMV en la presente invención. Otros ejemplos de construcciones que se pueden usar para poner en práctica la invención incluyen construcciones que usan promotores de MuLV, SV40, Virus del Sarcoma de Rous (RSV), vacuna P7,5 y \beta-actina de rata. En algunos casos, tales como el RSV y MuLV, estos elementos promotor-potenciador se sitúan dentro de o junto a las secuencias LTR.

Las secuencias reguladoras adecuadas requeridas para la transcripción, traducción, procesamiento y secreción de genes están reconocidas en la técnica, y se seleccionan para dirigir la expresión de la proteína deseada en una célula apropiada. Por consiguiente, el término "secuencia reguladora", como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye cualquier elemento genético presente en 5' (cadena arriba) ó 3' (cadena abajo) de la región traducida de un gen y que controla o afecta la expresión del gen, tal como las secuencias potenciadoras y promotoras. Tales secuencias reguladoras se discuten, por ejemplo, en Goeddel, Gene expression Technology: Methods in Enzymology, página 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), y se pueden seleccionar por parte de aquellos expertos habituales en la técnica para usar en la presente invención.

En una realización, la invención emplea un promotor inducible dentro de los vectores retrovirales, de tal forma que la transcripción de los genes seleccionados se puede activar y desactivar. Esto minimiza la toxicidad celular provocada por la expresión de proteínas virales citotóxicas, aumentando la estabilidad de las células de empaquetamiento que contienen los vectores. Por ejemplo, los niveles elevados de expresión de VSV-G (proteína de envoltura) y Vpr pueden ser citotóxicas (Yee, J.-K., y col. Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9654 - 9568 (1994) y, por tanto, la expresión de estas proteínas en las células de empaquetamiento se pueden controlar por medio de un sistema operador inducible, tal como el sistema operador inducible por Tet (GIBCOBRL), que permite la regulación estrecha de la expresión génica (esto es, la generación de partículas retrovirales) por medio de la concentración de tetraciclina en el medio de cultivo. Esto eso, con el sistema operador de Tet, en presencia de tetraciclina, la tetraclina está unida a la proteína de fusión del transactivador Tet (tTA), evitando la unión de tTA a las secuencias operadoras de Tet y permitiendo la expresión del gen bajo el control de las secuencias operadoras de Tet (Gossen y col. (1992) PNAS 89: 5547 - 5551). En ausencia de tetraciclina, tTA se une a las secuencias operadoras de Tet evitando la expresión del gen bajo el control del operador de Tet.

Los ejemplos de otros sistemas operadores inducibles que se pueden usar para la expresión controlada de la proteína que proporciona una envoltura pseudotipificada son 1) promotores eucarióticos inducibles sensibles a iones metálicos (por ejemplo, el promotor de metalotioneína), hormonas glucocorticoides y 2) el Sistema de Expresión Mamífera Inducible LacSwitcht^{TM} (Stratagene) de E. coli. En pocas palabras, en el operón lactosa de E. coli, el represor Lac se une en forma de un homotetrámero al operador lac, bloqueando la transcripción del gen lac2. Los inductores tales como alolactosa (un inductor fisiológico) o isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG, un inductor sintético) se unen al represor Lac, provocando un cambio en la conformación y disminuyendo de forma eficaz la afinidad del represor al operador. Cuando el represor se retira del operador, la transcripción del operón lactosa se reanuda.

Todavía en otro planteamiento, la expresión selectiva de los genes retrovirales contenidos dentro de los vectores de la invención se puede conseguir mediante la clonación en un sistema represor Cre/lox cadena arriba de secuencias codificadoras seleccionadas. Específicamente, se puede insertar una señal de politerminación entre el (los) gen (es)
para expresarse de forma selectiva y un promotor 5'. La señal de politerminación está flanqueada por dos sitios loxP1 (Sauer (1993) Methods in Enzymology 225: 890 - 900). Tras el contacto con recombinasa cre, los sitios lox recombinarán y suprimirán la señal de politerminación, permitiendo al promotor actuar en cis para activar la expresión
del (los) gen (es).

Proteínas virales de envoltura y pseudotipificación

Además de codificar las proteínas retrovirales necesarias para la producción y ensamblaje de viriones centrales (por ejemplo, proteínas gag y pol), las líneas celulares de empaquetamiento de la invención también codifican proteínas virales de envoltura (env) que determinan el intervalo de células hospedadoras que se pueden infectar y transformar en último término por medio de retrovirus recombinantes generados a partir de las líneas celulares. En el caso de lentivirus, tales como VIH-1, VIH-2, VIS, VIF y VIE, las proteínas env incluyen gp41 y gp120. Preferiblemente, las proteínas virales env expresadas por las células de empaquetamiento de la invención están codificadas en un vector distinto de los genes virales gag y pol, como se ha descrito anteriormente.

Los ejemplos de genes env retrovirales derivados que se pueden emplear en la invención incluyen, pero no se limitan a, proteínas retrovirales de envoltura de tipo C, tales como las del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), el virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del gibón (GaLV), y Virus del Sarcoma de Rous (RSV). Otros genes virales env que se pueden usar incluyen, por ejemplo, genes env de virus de la inmunodeficiencia (VIH-1, VIH-2, VIF, VIS y VIE), virus de la leucemia de células T humanas (HTLV-1 y HTLV-3) y virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Proteína G). Cuando se producen los retrovirus recombinantes de la invención (por ejemplo, lentivirus recombinantes), se puede usar el gen env retroviral de tipo salvaje (por ejemplo, lentiviral), o se puede sustituir con cualquier otro gen viral env, tal como los enumerados arriba. Los procedimientos de pseudotipificación de virus recombinantes con proteínas de envoltura a partir de otros virus de esta forma se conocen bien en la técnica. Como se refiere en la presente memoria descriptiva, una "envoltura pseudotipo" es una proteína de envoltura distinta a la que surge de origen natural con el virión central retroviral (resultando en un virus fenotípicamente mezclado).

En una realización, la invención proporciona células de empaquetamiento que producen lentivirus recombinantes (por ejemplo, VIH, VIS, VIF, VIE) pseudotipificados con la glicoproteína VSV-G. La glicoproteína VSV-G tiene un amplio intervalo hospedador. Por lo tanto, los retrovirus pseudotipificados VSV-G demuestran un amplio intervalo hospedador (pantrópico) y son capaces de infectar de forma eficaz las células que son resistentes a la infección por retrovirus ecotrópicos y anfotrópicos. (Yee y col. (1004) PNAS 91: 9564 - 9568. Cualquier serotipo (por ejemplo, Indiana, Nueva Jersey, Chandipura, Piry) y cepa de VSV-G adecuados (por ejemplo, VSV Indiana, San Juan) se pueden usar en la presente invención. La proteína elegida para pseudotipificar el virión central determina el intervalo hospedador de la línea celular de empaquetamiento. VSV-G interactúa con un fosfolípido específico sobre la superficie de células mamíferas (Schlegel, R., y col., Cell, 32: 639 - 646 (1983); Spuertzi, F., y col., J. Gen. Virol., 68: 387 - 399 (1987)). Así pues, las líneas celulares de empaquetamiento que utilizan VSV-G para proporcionar una envoltura pseudotipificada para el virión central retroviral tienen un amplio intervalo hospedador (pantrópico). Además, las partículas retrovirales pseudotipificadas de VSV-G se pueden concentrar más de 100 veces por ultracentrifugado (Bums, J. C., y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 8033 - 8037 (1993)). Las líneas celulares de empaquetamiento de retrovirus pseudotipificados de VSV-G estables permiten la generación de preparaciones virales a gran escala (por ejemplo, de 10 a 50 litros de sobrenadante) para proporcionar reservas retrovirales que varían entre 10^{7} y 10^{11} de partículas retrovirales por ml.

Las proteínas virales de envoltura de la invención (pseudotipificadas o no) también se pueden modificar, por ejemplo, por medio de inserciones, deleciones o mutaciones de aminoácidos para producir secuencias de envoltura fijadas como diana tales como envoltura ecotrópica con el ligando EPO, envolturas sintéticas y/u otras híbridas; derivados de la glicoproteína VSV-G. Además, se ha demostrado que es posible limitar el espectro de la infección de los retrovirus y por consiguiente de vectores con base retroviral, modificando las proteínas virales de empaquetamiento sobre la superficie de la partícula viral (véase, por ejemplo las publicaciones PTC WO93/25234 y WO94/06920). Por ejemplo, las estrategias para la modificación del espectro de la infección de vectores retrovirales incluyen: el acoplamiento de anticuerpos específicos para los antígenos de superficie celular a la proteína viral env (Roux y col. (1989) PNAS 86: 9079 - 9083; Julan y col. (1992) J. Gen Virol 73: 3251 - 3255; y Goud y col. (1983) Virology 163: 251 - 254); o el acoplamiento de ligandos receptores de la superficie celular a las proteínas virales env (Neda y col. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14143 - 14146). El acoplamiento puede ser en forma de reticulación química con una proteína u otra variedad (por ejemplo lactosa para convertir la proteína env a una asialogliproteína), así como mediante la generación de proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión env/anticuerpo de una sola cadena). Esta técnica, aunque es útil para limitar o dirigir de otra forma la infección a ciertos tipos de tejidos, también se pude usar para convertir un vector ecotrópico en un vector anfotrópico.

Líneas celulares de empaquetamiento

Cualquier línea celular adecuada se puede emplear para preparar las células de empaquetamiento de la invención. Generalmente, las células son células de mamífero. En una realización particular, las células usadas para producir la línea celular de empaquetamiento son células humanas. Las líneas celulares humanas adecuadas que se pueden usar incluyen, por ejemplo, células 293 (Graham y col. (1997) J. Gen Virol., 36: 59 - 72, células tsa 201 (Heinzel y col. (1988) J Virol., 62: 3738) y células NIH3T3 (ATCC)). Otras líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para usar en la presente invención incluyen otras líneas celulares de empaquetamiento derivadas de líneas celulares humanas (por ejemplo, derivadas de líneas celulares embrionarias) y líneas celulares de empaquetamiento derivadas de líneas celulares murinas, tales como células Psi-2 (Mann y col. (1983) Cell, 33: 153 - 159; FLY (Cossett y col. (1993) Virol., 193: 385-395; células BOSC 23 (Pear y col. (1993) PNAS 90: 8392 - 8396; células PA317 (Miller y col. (1986) Molec. and Cell. Biol., 6: 2895 - 2902; línea celular Kat (Finer y col., (1994) Blood, 83: 43 - 50; células GP+E y células GP+EM12 (Markowitz y col., (1988) J. Virol., 62: 1120 - 1124, y células Psi Crip y Psi Cre (Patente de Estados Unidos nº 5.449.614; Danos, O. y Mulligan y col. (1988) PNAS 85: 6460 - 6464). Las líneas celulares de empaquetamiento de la presente invención pueden producir partículas retrovirales que tienen un intervalo hospedador pantrópico, anfotrópico o écotrópico. Las líneas celulares de empaquetamiento preferidas producen partículas retrovirales, tales como partículas lentivirales (por ejemplo, VIH-1, VIH-2 y VIS) capaces de infectar células divisorias, así como no divisorias.

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Transfección y selección celular

Los vectores retrovirales recombinantes de la invención que codifican de forma colectiva proteínas gag, pol y env (necesarias para la producción de partículas virales vacías), en los que gag y pol están al menos en parte separados en dos vectores distintos, se cotransfectan en células adecuadas usando técnicas de transfección convencionales para crear líneas celulares de empaquetamiento. Cualquier técnica de transfección celular conocida se puede emplear a este efecto. En general, las células se incuban (esto es, se cultivan) con los vectores en un medio apropiado en condiciones de transfección adecuadas, como se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos tales como electroporación y precipitación de fosfato cálcico (O'Mahoney y col. (1994) DNA & Cell Biol. 13 (12): 1227 - 1232).

Los transformadores de células de empaquetamiento positivas (es decir, células que han recogido e integrado los vectores retrovirales) se pueden seleccionar usando una diversidad de marcadores de selección que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los genes marcadores, tales como los genes de la proteína fluorescente verde (GFP), resistentes a higromicina (Hyg), resistentes a neomicina (Neo) y \beta-galactosidasa (\beta-gal) se pueden incluir en los vectores y ensayar usando, por ejemplo, ensayos de actividad enzimática o de resistencia al fármaco. De forma alternativa, las células se pueden ensayar para detectar la actividad de la transcriptasa inversa (RT) como describe Goff y col. (1981) J. Virol. 38: 239 como una medida de la producción de proteínas virales.

Se pueden usar ensayos similares para analizar la producción del virus auxiliar de replicación competente no deseado por parte de células de empaquetamiento. Por ejemplo, los genes marcadores, tales como los descritos anteriormente, se pueden incluir en el vector "productor" que contiene la secuencia de empaquetamiento viral (\psi) y LTR. Después de la transfección transitoria de las células de empaquetamiento con el vector productor, las células de empaquetamiento se pueden subcultivar con otras células de no empaquetamiento. Estas células de no empaquetamiento se infectarán con los vectores retrovirales recombinantes carentes de replicación de la invención que llevan el gen marcador. Sin embargo, debido a que estas células de no empaquetamiento no contienen los genes necesarios para producir partículas virales (por ejemplo, genes gag, pol y env), a su vez, no deberían ser capaces de infectar otras células cuando se subcultivan con estas otras células. Si estas otras células son positivas para detectar la presencia del gen marcador cuando se subcultivan con las células de no empaquetamiento, entonces se ha producido el virus de replicación competente no deseado.

Por consiguiente, para analizar la producción del virus auxiliar no deseado, las células de empaquetamiento de la invención se pueden subcultivar con una primera línea celular (por ejemplo, células NIH3T3) que, a su vez, se subcultiva con una segunda línea celular que se analiza para detectar la presencia de un gen marcador o actividad de RT que indica la presencia del retrovirus auxiliar de replicación competente. Los genes marcadores se pueden ensayar usando, por ejemplo, FACS, ensayos de actividad enzimática y tinción, como se conocen bien en la técnica.

Usos en terapia génica

Las líneas celulares de empaquetamiento nuevas de la invención se pueden usar para producir retrovirus recombinantes (por ejemplo, lentivirus recombinantes) libres del virus auxiliar no deseado, que son capaces de transferir (e integrar de forma eficaz) ADN heterólogo (por ejemplo, un transgen terapéutico) en células eucarióticas. Esto es, los retrovirus recombinantes se pueden recolectar a partir de líneas celulares de empaquetamiento de la invención y usarse como reserva viral para infectar células receptoras en cultivo o in vivo. En el caso de proteínas secretadas o proteínas expresadas en células hematopoyéticas, se pueden usar ensayos sensibles tales como ELISA o transferencia de Western para evaluar la eficacia de la transferencia génica.

De manera específica, los lentivirus recombinantes producidos por las células de empaquetamiento de la invención se pueden usar de forma segura para transformar no sólo una diversidad de tipos de células divisorias, sino también tipos de células no divisorias, aumentando el intervalo de enfermedades tratables por medio de terapia génica. Por ejemplo, estos lentivirus recombinantes se pueden usar para transformar células de neuronas, músculos, corazón, pulmones, hígado, piel y médula ósea.

A través de la invención se puede transferir una amplia diversidad de ADN heterólogo a las células. Dicho ADN incluye, por ejemplo, genes terapéuticos (por ejemplo, proteínas terapéuticas codificadoras que se pueden usar para tratar enfermedades). Ya que las células no divisorias, tanto como las divisorias, se pueden transformar a través de retrovirus recombinantes (por ejemplo, lentivirus) de la invención, las enfermedades tratables incluyen, por ejemplo, trastornos de la globina, deficiencia en el factor de coagulación de la sangre, trastornos neurales, enfermedades autoinmunes, enfermedades del pulmón. Así pues, los genes terapéuticos adecuados para transferirse pueden incluir, por ejemplo, genes de la \beta-globina humana, Factor VIII, Factor IX y Fibrosis Quística. De manera alternativa, los vectores retrovirales de la invención se pueden usar para suministrar polinucleótidos de polaridad opuesta a células que inhiben la expresión de los genes seleccionados (Yee, J.-K., y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9564 - 9568 (1994); Dranoff, G., y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 3539 - 3543 (1993); Miller, A.D., y col, Meth. in Enz 217: 581 - 599 (1993)).

Además, las líneas celulares de empaquetamiento de la presente invención también se pueden usar para producir retrovirus que contienen ADN de interés para introducir ADN o genes de interés en células de mamíferos, tales como células humanas, que posteriormente se administrarán en zonas localizadas del cuerpo (por ejemplo, infección ex vivo de glóbulos blancos autólogos para el suministro de la proteína en zonas localizadas del cuerpo, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.399.346).

Ejemplos Preparación de la línea celular de empaquetamiento lentiviral libre de auxiliar

Las líneas celulares de empaquetamiento estables que producen VIH recombinante, libres del virus auxiliar detectable, se prepararon como se describe a continuación. Las líneas celulares de empaquetamiento eliminan virtualmente la posibilidad de procesos de recombinación que pueden dar como resultado el virus auxiliar de replicación competente intacto, separando las secuencias codificadoras necesarias para producir y ensamblar viriones, y ARN de empaquetamiento, en cuatro plásmidos distintos, denominados en la presente memoria descriptiva plásmidos pgag^pol, pVpr-RTIN, pENV y p\psi. Estos plásmidos contienen secuencias de VIH comunes mínimas, y secuencias no codificadoras de VIH mínimas. También contienen promotores inducibles para prevenir la toxicidad a las células de empaquetamiento provocada por la expresión de proteínas citotóxicas, tales como Vpr. Cuando se cotransfectan de manera transitoria en células de empaquetamiento mamíferas adecuadas, las células producen partículas de vectores retrovirales derivados de VIH sin recombinación para producir el virus auxiliar.

Preparación del plásmido

Cada plásmido de expresión se construyó usando técnicas de clonación convencionales (Sambrook, J. y col. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual-2nd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York, EE. UU.). Los oligonucleótidos para clonación se sintetizaron usando protocolos convencionales, o se obtuvieron a partir de fuentes disponibles en el mercado, tales como GENSET Inc. La precisión de la construcción del plásmido se verificó usando técnicas de secuenciación de nucleótidos convencionales. Todos los plásmidos contenían secuencias promotoras adecuadas, tales como el promotor temprano del citomegalovirus humano (hCMV) y, opcionalmente, un gen informador, tal como el gen de la proteína verde fluorescente (GFP). Las secuencias codificadoras y no codificadoras lentivirales deseadas (por ejemplo, VIH-1) se obtuvieron amplificando las secuencias seleccionadas a partir de los plásmidos disponibles que contenían ADN proviral, tal como PNLENV-1 (Maldarelli y col. (1991) J. Virol. 65: 5732).

Plásmido pgag^pol

El plásmido pgag^pol se diseñó para codificar la poliproteína gag y una parte de la poliproteína pol, preferiblemente la parte de pol que se solapa con gag en el genoma lentiviral que incluye, pero no se limita a, la proteasa lentiviral (PR) (véase, por ejemplo, la Figura 5). Esto se consiguió o bien suprimiendo una parte de la secuencia codificadora de pol, o bien mutando una parte de la secuencia codificadora de pol, de tal forma que solamente se expresó una parte del gen pol.

Para construir pgag^pol, un ADNc que contiene el genoma proviral de VIH, tal como PNLENV-1 (Maldarelli y col., (1991) J. Virol. 65: 5732) (amablemente proporcionado por Stephen Goff), se amplificó y clonó en uno o más vectores de expresión adecuados, tales como pCDNA 1 y pCDNA 3 (Invitrogene Corp). Las secuencias codificadoras y no codificadoras seleccionadas se suprimieron o por el contrario se mutaron (por ejemplo, por adición o sustitución de nucleótidos) dentro del vector del plásmido, usando técnicas convencionales, de tal forma que sólo se expresaron las poliproteínas deseadas gag y pol. Si no se suprimen del vector, las secuencias de VIH que no se van a expresar (por ejemplo, secuencias que codifican las proteínas de pol de transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN), proteínas env, genes accesorios y secuencias no codificadoras que actúan en cis (por ejemplo, elementos de exportación y secuencias LTR) se mutaron de tal forma que ya no tenían homología suficiente con las secuencias de nucleótidos contenidas en cualquiera de los plásmidos pVpr-RTIN, pENV ó p\psi descritos a continuación. Un promotor adecuado, tal como el promotor CMV, también se clonó en el vector cadena arriba de las secuencias codificadoras de pgag^pol si todavía no estaban presente en la estructura central del plásmido. En la Figura 1 se muestra un mapa de pgag^pol.

Plásmido pVpr-RTIN

El plásmido pVpr-RTIN se diseñó para codificar una proteína de fusión Vpr (ó Vpx) que contiene la parte restante de la poliproteína pol de VIH no codificada por el plásmido pgag^pol. Específicamente, pVpr-RTIN codificaba una proteína de fusión que contenía Vpr (que se podía haber reemplazado con Vpx), o partes de la misma que se unen a p6, y transcriptasa inversa (RT) e integrasa (IN) de pol. Las secuencias codificadores de RT e IN estaban precedidas cadena arriba por un sitio de escisión de proteasa, como se muestra en la Figura 2. Una vez expresada en las células de empaquetamiento, la proteína de fusión Vpr (ó Vpx) se asocia a través de p6 con viriones ensamblados de VIH producidos a partir de gag sobre pgag^pol. Esto permite que las proteínas de RT e IN fusionadas a la Vpr se empaqueten en los viriones centrales. Así pues, Vpr (ó Vpx) actúa para dirigir o "transportar" las proteínas RT e IN a las partículas de ensamblaje viral en la parte interna de la membrana plasmática, donde los precursores de la poliproteína gag dirigen dicho ensamblaje viral.

Para construir pVpr-RTIN, los plásmidos de expresión que contienen las secuencias codificadoras lentivirales deseadas se construyeron como se describe para pgag^pol (por ejemplo, mutando secuencias de VIH contenidas dentro de PNLENV-1, seguido de la clonación en una construcción de expresión apropiada). La secuencia codificadora de Vpr (ó Vpx) se clonó después en el plásmido en fase con las secuencias codificadoras de pol contenidas en el mismo (por ejemplo, RT e IN). Esto se hizo primero realizando una PCR en un plásmido que contenía la secuencia codificadora completa de VPR, tal como SCVCMV (Yau y col. (1995) J. Virol 69: 7032 - 7044). Esto permitió que una secuencia Kozak se colocara al principio de la secuencia codificadora de VPR (ó Vpx) y un sitio Bgl 2 en el extremo final de la secuencia codificadora de VPR, así como la creación de vectores mutantes de VPR para reducir la citotoxicidad. Por ejemplo, la sustitución de GGG (GLY en la posición del aminoácido 75) con AAC (ASN), o la supresión de la secuencia codificadora de Vpr de tal forma que sólo se codifiquen los aminoácidos 1-88 N-terminales (Yau y col. (1995) arriba) ha mostrado reducir la toxicidad de la proteína Vpr en células. La construcción amplificada de Vpr (ó Vpx) resultante se clonó después en el plásmido que contiene la secuencia codificadora de pol parcial en fase con por ejemplo, las secuencias codificadores de RT e IN, conservando y manteniendo el sitio de escisión de la proteasa (PR) de 33 pares de bases que precede IN. Otros sitios de PR de VIH y no VIH también se pueden usar en lugar del sitio de PR que precede inmediatamente IN. Por ejemplo, se puede usar el sitio de escisión de la proteasa de VIH-1 que tiene la secuencia de aminoácidos VSQNYPIV (SEC. ID. Nº: 1), situada en la unión entre p16^{GAG} y p24^{GAG} de VIH-1. Por ejemplo, se puede usar el sitio de escisión de la proteasa de VIH-1 que tiene la secuencia de aminoácidos VSQNYPIV (SEC. ID. Nº: 1), situada en la unión entre p16^{GAG} y p24^{GAG} de VIH-1. De manera alternativa, se puede usar el sitio de escisión de la proteasa de VIH-1 que tiene la secuencia de aminoácidos ARULAEA (SEC ID Nº: 2) situada en la unión entre p24^{GAG} y p2^{GAG} de VIH-1. En la Figura 2 se muestra un mapa del plásmido pVpr-RTIN.

Plásmido pENV

El plásmido pENV se diseñó para codificar las proteínas de envoltura pensadas para el lentivirus recombinante. Estas proteínas son necesarias para formar partículas de viriones e imponer el intervalo de células hospedadoras que se pueden infectar (y así transformar) usando el lentivirus recombinante. Si se usa un gen env no lentiviral (por ejemplo, no VIH) en pENV, entonces la línea celular de empaquetamiento resultante producirá viriones lentivirales pseudotipificados. Por ejemplo, la secuencia codificadora para la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVg) se puede usar en lugar del gen env de VIH. Esto proporciona las ventajas de conferir un intervalo hospedador más amplio (pantrópico) sobre el lentivirus recombinante y una mayor estabilidad, permitiendo la concentración de partículas virales por ultracentrifugado.

Para preparar pENV, se clonó una secuencia codificadora de env deseada (por ejemplo VIH de PNLENV-1 ó VSVg) en uno o más vectores de expresión adecuados usando técnicas de clonación convencionales. La secuencia codificadora de env estaba precedida cadena arriba por un promotor adecuado (por ejemplo, un promotor inducible, tal como el promotor RSV) y cadena abajo por una señal de poliadenilación, como se muestra en la Figura 3. pENV también contiene un marcador de selección, tal como el gen resistente a neomicina (neo).

Plásmido p\psi

El plásmido p\psi se diseñó para contener secuencias de empaquetamiento (\psi) y de repetición terminal larga (LTR) mínimas necesarias para el empaquetamiento de ARN transcrito de p\psi en viriones lentivirales, junto con un transgen de interés (esto es, un gen terapéutico para usar en terapia génica de seres humanos). La LTR (5') izquierda actúa en forma de un promotor y la LTR (3') derecha actúa en forma de una secuencia de poliadenilación. Cuando se construye p\psi usando vectores con base lentiviral (por ejemplo, VIH), es preferible reemplazar las secuencias LTR lentivirales con secuencias funcionalmente similares de otros virus. Esto reduce la probabilidad de recombinación (por ejemplo con los plásmidos pgag^pol, pVpr-RTIN y pENV) y aumenta la seguridad de la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, una LTR 5' híbrida se puede usar, que reemplaza una parte de la LTR 5' de VIH con el promotor CMV o una LTR de un retrovirus diferente (por ejemplo, MuLV ó MuSV), y una LTR 3' híbrida se puede usar, que reemplaza una parte de la LTR 3' de VIH con una secuencia de poliadenilación de la \beta-globina de conejo o retroviral. El plásmido p\psi también contiene preferiblemente un elemento de exportación de ARN (por ejemplo el elemento de respuesta Rev (RRE) de VIH (Cullen y col. (1991) Science 16: 346-350; Rosen y col. (1990) AIDS 4: 499-509) o el elemento regulador postranscripcional (PRE) de VHB (Huang y col. (1995) Molec. and Cell. Biol. 15 (7): 3864 - 3869), que provoca la exportación del ARN fuera del núcleo de la célula hospedadora en el citoplasma, y un gen marcador (por ejemplo, GFP), todo como se muestra en la Figura 3.

El plásmido p\psi se construyó como se describe anteriormente para los plásmidos pgag^pol, pVpr-RTIN y pENV por ejemplo, subclonando LTR de VIH, \psi y RRE (por ejemplo, a partir de pNLENV-1) en una estructura central adecuada, tal como pUC 19. Se emplearon técnicas convencionales para preparar LTR híbridas por, por ejemplo, clonación de secuencias de promotor y poliadenilación adecuadas en secuencias LTR de VIH, y suprimiendo la parte apropiada de las LTR de VIH. También se añadió a p\psi un sitio de restricción adecuado para la clonación de ADNc heterólogo (esto es, transgenes), seguido de la inserción de un gen terapéutico deseado (por ejemplo, \beta-globina humana).

Citotoxicidad

En la construcción de los plásmidos descritos anteriormente se pueden tomar medidas adicionales para dirigir la toxicidad potencial a células a partir de la expresión de proteínas virales, tales como VPR y proteasas virales. En un planteamiento, las secuencias codificadoras para estas proteínas se pueden suprimir, de tal forma que sólo se codifican las partes mínimas de las proteínas necesarias para la función (por ejemplo dominios de unión a p6/VPR). Por ejemplo, se sabe que la expresión de VPR de longitud completa puede ser tóxica para las células, pero que una forma truncada de la proteína que contiene solamente los primeros 88 aminoácidos N-terminales reduce la citotoxicidad de la proteína, sin afectar su función (esto es, su capacidad para unirse a p6). Así pues, en un planteamiento, los plásmidos de la invención codifican una proteína de VPR menos tóxica, truncada.

En otro planteamiento, la citotoxicidad se dirige usando elementos represores convencionales en los plásmidos de la invención. Por ejemplo, se puede usar el Sistema de Expresión Regulada por TET (GIBCO BRL Inc.) o el Sistema de Expresión Mamífera Inducible LacSwitcht^{TM} (Stratagene). En pocas palabras, en el operón lactosa de E. coli, el represor Lac se une en forma de un homotetrámero al operador lac, bloqueando la transcripción del gen lac2. Los inductores tales como alolactosa (un inductor fisiológico) o isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG, un inductor sintético) se unen al represor Lac, provocando un cambio en la conformación y disminuyendo de forma eficaz la afinidad del represor al operador. Cuando el represor se retira del operador, la transcripción del operón lactosa se reanuda.

El Sistema de Expresión Mamífera Inducible LacSwitcht^{TM} utiliza un sistema de vectores en el que varios elementos del operón lactosa se han modificado para usar en células eucarióticas para el control de la expresión génica. Este procedimiento para la expresión inducible de genes exógenos en células eucarióticas está constituido por un vector de expresión del represor Lac eucariótico, p3'SS y dos vectores eucarióticos que contienen el operador lac, pOP13CAT y pOPRSVICAT, cada uno disponible de Stratagene, en los que los genes lentivirales de interés se pueden insertar por clonación. Estos vectores se transfectan en células cultivadas donde la expresión de los genes lentivirales está reprimida hasta un inductor, tal como IPTG, que permite la inducción en 4 - 8 horas.

Todavía en otro planteamiento, la expresión selectiva de los genes lentivirales contenidos dentro de los plásmidos de la invención se puede conseguir por medio de la clonación en un sistema represor cre/lox cadena arriba de secuencias codificadoras. De manera específica, se inserta una señal de politerminación entre el (los) gen (es) que se va (n) a expresar de forma selectiva y su promotor. La señal de politerminación está flanqueada por dos sitios loxP1 (Saber (1993) Methods in Enzymology 225: 890 - 900). Tras el contacto con recombinasa cre, los sitios lox recombinarán y suprimirán la señal de politerminación, permitiendo al promotor que actúe en cis para activar la expresión del (los) gen (es). Este enfoque tiene la ventaja dual de permitir que los plásmidos de la invención codifiquen proteínas tóxicas para permanecer en las células de empaquetamiento sin efectos secundarios tóxicos, y aumentar su seguridad ya que los plásmidos pueden permanecer en cultivo durante periodos de tiempo más largos sin producir virus.

Para insertar un sistema represor cre/lox en plásmidos, se pueden usar oligos para clonar dos sitios lox que abarcan una señal de politerminación en, por ejemplo, pgag^pol cadena arriba de la secuencia codificadora de pgag^pol pero cadena abajo de la secuencia del promotor, como se muestra en la Figura 1.

Transfección, infección y selección celular

Para crear células de empaquetamiento, una línea celular adecuada se cotransfecta con los Plásmidos 1 - 3 que codifican de forma colectiva las proteínas virales necesarias para formar viriones lentivirales carentes de replicación, libres de auxiliar. Después, el Plásmido 4 se puede transfectar en las células de empaquetamiento para crear una línea celular productora (esto es, que produce viriones que han empaquetado el Plásmido 4).

Cualquier línea celular adecuada se puede usar en forma de una línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, se pueden usar células 293T humanas (fibroblastos de riñón). Estas células se pueden cultivar y transfectar como describen Pear y col. (1993) PNAS 90: 8392 - 8396 y Danos y col. (1988) PNAS 85: 6460 - 6464. En pocas palabras, las células se pueden cultivar a 37ºC con CO_{2} al 5%/aire al 95% en DMEM suplementado con suero de ternero inactivado por calor al 10%, glucosa 4,5 mg/ml, glutamina 2,0 mM, penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 \mug/ml.

El ADN de plásmido se puede preparar por medio del procedimiento Qiagen (Qiagen, Inc.) y transfectar en células usando, por ejemplo, el procedimiento de fosfato cálcico (5'3', Inc). Después de la transfección de los Plásmidos 1 - 3 en células, se pueden seleccionar colonias usando higromicina B 320 \mug/ml (Calbiochem). Las colonias se pueden recoger, expandir, y seleccionar para detectar la actividad de la transfectasa inversa, como se describe en Goff y col., (1981) J. Virol 38: 239 - 248), y para detectar la infectividad (después de la transfección transitoria con el cuarto plásmido) analizando, por ejemplo, GFP mediante aislamiento en citofluorímetro (FACS) usando la proteína fluorescente verde (GFP, de Clonetech), o para detectar la expresión de \beta-gal usando, por ejemplo, un ensayo de movilización de \beta-galactosidasa, como se describe en Pearl y col. (1993), arriba, y Danos y col. (1988), arriba. La infectividad se puede analizar en diversos tipos de células, divisorias y no divisorias.

Claims (13)

1. Una línea celular de empaquetamiento lentiviral que comprende:

un primer vector que codifica una poliproteína retroviral gag y una parte de una poliproteína retroviral pol;

un segundo vector que codifica el resto de la poliproteína retroviral pol no codificada por dicho primer vector, fusionado a un péptido o a una proteína Vpr o Vpx; y

un tercer vector que codifica una proteína viral env.

2. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 1 en la que dicho lentivirus se selecciona de VIH-1, VIH-2, VIS, VIF y VIE.

3. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 1 en la que (a) dicha poliproteína retroviral gag codificada por dicho primer vector comprende proteínas retrovirales de la matriz, cápsida y núcleocápsida; o

(b) dicha parte de dicha poliproteína pol codificada por dicho primer vector comprende una proteasa retroviral; o

(c) dicho resto de dicha poliproteína retroviral pol codificada por dicho segundo vector comprende una transcriptasa inversa retroviral y una integrasa retroviral.

4. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 3 en la que dicho resto de dicha poliproteína retroviral pol además comprende un sitio de escisión de proteasa cadena arriba a partir de dicha transcriptasa inversa y dicha integrasa.

5. La línea celular de empaquetamiento de la reivindicación 1 (a) en la que dicha proteína viral env codificada por dicho tercer vector comprende una proteína de envoltura seleccionada a partir de un virus seleccionado del grupo que está constituido por un retrovirus Tipo C, un lentivirus y virus de la estomatitis vesicular; o

(b) en la que la transcripción de una cualquiera de dichas proteínas codificadas por dichos vectores está conducida por un promotor inducible; o

(c) en la que la transcripción de una cualquiera de dichas proteínas codificadas por dichos vectores está inducida por contacto de recombinasa Cre con uno o más sitios Lox contenidos en dicho vector; o

(d) que además comprende un cuarto vector que contiene una señal de empaquetamiento, una repetición terminal larga viral (LTR), y un transgen, en la que la co-expresión de dicho cuarto vector con dichos primero, segundo y tercer vectores, en dicha línea celular de empaquetamiento, da como resultado la producción de un retrovirus libre de auxiliar, recombinante, que contiene dicho transgen.

6. Un procedimiento para producir una línea celular de empaquetamiento capaz de producir un lentivirus libre de auxiliar, recombinante, que comprende la transfección de una célula hospedadora con:

un primer vector que codifica una poliproteína retroviral gag y una parte de una poliproteína retroviral pol;

un segundo vector que codifica el resto de la poliproteína retroviral pol no codificada por dicho primer vector, fusionado a un péptido o a una proteína Vpr ó Vpx; y

un tercer vector que codifica una proteína viral env.

7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que uno cualquiera de dichos primer, segundo o tercer vectores comprende un promotor inducible operativamente unido a un gen que codifica dicha poliproteína gag, dicha poliproteína retroviral pol, dicha proteína o péptido Vpr, dicha proteína o péptido Vpx, o dicha proteína env, y opcionalmente además comprende la etapa de poner en contacto dicha célula hospedadora con un agente que induce dicho promotor.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que dicho lentivirus se selecciona de VIH-1, VIH-2, VIS, VIF y VIE.

9. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que (a) dicha poliproteína retroviral gag codificada por dicho primer vector comprende proteínas lentivirales de la matriz, cápsida y núcleocápsida;

o

(b) dicha parte de dicha poliproteína retroviral pol codificada por dicho primer vector comprende una proteasa retroviral; o

(c) dicho resto de dicha poliproteína retroviral pol codificada por dicho segundo vector comprende una transcriptasa inversa retroviral y una integrasa retroviral.

10. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dicha proteína viral env codificada por dicho tercer vector comprende una proteína de envoltura seleccionada de un virus seleccionado de un retrovirus tipo C, un lentivirus y Virus de la Estomatitis Vesicular.

11. Un procedimiento para producir un lentivirus recombinante que comprende la transfección de una célula hospedadora con:

un primer vector que comprende un gen retroviral gag y una parte de un gen retroviral pol unido operativamente a un promotor;

un segundo vector que comprende la parte del gen retroviral pol no codificada por el primer vector y un gen que codifica toda o una parte de una proteína Vpr o Vpx, en el que ambos dichos genes se expresan como una sola proteína de fusión y están unidos operativamente a un promotor;

un tercer vector que comprende un gen viral env; y

un cuarto vector que comprende una señal de empaquetamiento viral, una repetición terminal larga (LTR) viral y un transgen operativamente unido a un promotor; y la recuperación del virus recombinante.

12. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que (a) uno cualquiera de dichos promotores contenidos dentro de dicho primer, segundo, tercer o cuarto vector es inducible, y opcionalmente además comprende la etapa de poner en contacto dicha célula hospedadora con un agente que induce dicho promotor; o

(b) dicho retrovirus es un lentivirus opcionalmente VIH; o

(c) dicha parte de dicho gen pol contenido en dicho primer vector codifica una proteasa retroviral; o

(d) dicho resto de dicho gen pol contenido en dicho segundo vector codifica una transcriptasa inversa retroviral y una integrasa retroviral.

13. Una línea celular de empaquetamiento producible por medio de un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.