KR100553154B1 - Ｈｉｖ 뉴클레오캡시드 단백질의 동물세포 발현용 벡터 및 이의 제조방법 - Google Patents

Ｈｉｖ 뉴클레오캡시드 단백질의 동물세포 발현용 벡터 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동물세포에서 HIV의 NC 단백질을 발현시키기 위한 벡터 및 전기 발현벡터를 이용하여 동물세포에서 HIV의 NC 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 방법은 HIV의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NC) 유전자, NC 유전자 상부에 위치하는 SV40 19s mRNA 인트론 서열 또는 변형된 SV40 16s mRNA 인트론 서열 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질도입된 동물세포를 배양하고, 이로부터 NC 단백질을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, NC 단백질을 용이하게 생산할 수 있으므로, HIV에 효과적인 항바이러스제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
HIV 뉴클레오캡시드(NC) 단백질, 동물세포

Description

ＨＩＶ 뉴클레오캡시드 단백질의 동물세포 발현용 벡터 및 이의 제조방법{Mammalian expression vector for nucleocapsid protein of HIV and preparation method thereof}
도 1은 pcDNA NC 벡터의 유전자 지도를 나타내는 모식도이다.
도 2는 pBud NC-MH 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
도 3은 pCMV HA-NC 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
도 4는 pCMV (-HA) NC 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
도 5는 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
도 6a는 24시간동안 배양한 세포를 대상으로 노던 블롯을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6b는 48시간동안 배양한 세포를 대상으로 노던 블롯을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 동물세포에서 HIV의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NC) 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 동물세포에서 NC 단백질을 발현시키기 위한 벡터 및 전기 발현벡터를 이용하여 동물세포에서 HIV의 NC 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드 단백질은 성숙한 바이러스 개체의 주요 구성물질로서, 바이러스의 게놈 RNA에 강하게 결합하여 리보핵산단백질 코어 복합체(ribonucleoprotein core complex)를 형성한다. NC 단백질은 바이러스 개체형성을 위한 구조적 역할뿐만 아니라, 바이러스의 생활주기(viral life cycle)에 대하여 기능적으로도 중요한 역할을 한다: 첫째, NC 단백질은 바이러스의 유전적 포막(genomic encapsidation)에 관여하고, 이러한 기능은 독특한 Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys 모티프(CCHC 모티프)로 구성되는 두 개의 징크핑거 도메인으로부터 기인하는데, 상기 도메인은 모든 레트로바이러스(retrovirus)에서 높은 보존성을 나타내며, HIV RNA 포장(packaging)과 감염성 바이러스 생산에 필수적인 것으로 알려져 있다. 둘째, NC 단백질은 바이러스의 역전사 반응(reverstranscription, RT)동안 tRNA 프라이머 어닐링(annealing)과 가닥 이동(strand transfer)을 촉진한다고 알려져 있으며, 이로부터 NC 단백질이 바이러스 복제(viral replication)에 중요한 기능을 한다는 것을 알 수 있다. 또한, NC 단백질은 바이러스의 생활주기에 필요한 핵산 샤페론(chaperone) 활성을 가지며. 최근에는 바이러스 DNA가 숙주세포 염색체에 삽입될 때에도 NC 단백질이 소정의 역 할을 담당한다고 보고되고 있다. 그러므로, NC 단백질에 대한 연구는 HIV 생활주기에서 NC 단백질이 갖는 생물학적 기능을 밝히는 데 뿐만 아니라, 핵심적인 HIV 단백질에 대한 효과적인 항바이러스제를 개발하는 데에도 매우 중요하다.
생체 내에서 NC 단백질의 생물학적 기능을 이해하기 위한, 필수적인 선결 조건은 동물세포에서 NC 단백질을 효과적으로 발현시키는 방법을 개발하는 것이다. 그러나, 현재까지 NC 단백질에 대한 대부분의 연구들이 대장균에서 발현시킨 재조합 NC 단백질을 이용하거나, 유전자 분석을 이용하여 진행되어 왔으며, 아직까지 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 방법에 대한 보고가 없는 실정이다.
HIV의 다른 구조 단백질의 경우에, 바이러스의 유전부호 활용(codon usage)이 동물세포의 유전부호 활용과 다르다거나, 유전자 내에 저해서열(inhibitory sequence, INS)을 포함한다는 이유로 동물세포 발현이 제한되는 경우가 있는데, 특히, INS를 포함하는 경우 발현된 mRNA의 안정성이 크게 저조한 경향을 보인다. INS의 존재에 의해 바이러스 단백질의 동물세포에서의 발현이 제한되는 경우에는, 돌연변이를 유발하는 등의 방법으로 INS를 불활성화시켜서, 원하는 단백질을 동물세포에서 발현시킬 수 있다. 그러나, NC 단백질의 경우에는 HIV의 다른 구조 단백질과 달리 INS를 포함하지 않음에도 불구하고, 동물세포에서의 발현이 현저히 낮다는 문제점이 있었다.
따라서, 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 새로운 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되고 있다.
이에, 본 발명자들은 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, NC 유전자와 CMV 프로모터 및 인트론을 포함하는 NC 단백질 발현벡터를 이용하여 동물세포에서 NC 단백질을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 인트론 서열과 NC 유전자를 포함하는 발현벡터를 이용하여, 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 방법은 HIV의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NC) 유전자, NC 유전자 상부에 위치하는 SV40 19s mRNA 인트론 서열 또는 변형된 SV40 16s mRNA 인트론 서열 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질도입된 동물세포를 배양하고, 이로부터 NC 단백질을 수득하는 단계를 포함한다: 이때, 동물세포는 특별히 제한되는 것은 아니나, COS-7 세포, 293T 세포 등을 이용함이 바람직하다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명자들은 동물세포에서 NC 단백질을 발현시키기 위하여, 먼저, CMV(cytomegalovirus) 프로모터를 포함하는 진핵세포 발현벡터 pcDNA3에 NC 유전자를 도입하여 pcDNA3 NC 벡터를 작제하였다. 이어, 전기 벡터를 COS-7 세포에 형질도입시킨 다음, 전기 형질도입된 세포를 배양하고, 웨스턴 블럿 방법으로 세포내 NC 단백질의 발현을 측정한 결과, NC 단백질의 발현을 확인할 수 없었다. 이 결과로 부터, 동물세포에서 NC 단백질의 발현이 매우 저조하다는 것을 알 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같이, NC 단백질을 동물세포에서 발현시키는데 실패한 이유가 사용한 NC 유전자의 서열문제때문인지의 여부를 확인하기 위하여, GST 융합 시스템(GST fusion system)을 사용하는 다른 동물세포 발현벡터를 이용하여, NC 단백질의 발현을 시도하였다. 그 결과, 매우 소량이지만, GST-NC 융합 단백질이 발현됨을 확인하였다. 이 결과로 부터, NC 단백질의 동물세포에서의 발현 실패요인이 발현벡터 작제에 사용한 NC 유전자 서열이 아니라, NC mRNA의 발현량이나 안정성 등의 다른 요인이 존재한다는 사실을 유추할 수 있었다.
NC mRNA의 안정성 문제와 관련된 상기 가정은 재조합 백시니아(vaccinia) 바이러스를 사용한 다음의 실험결과로 뒷받침되었다: 즉, T7 RNA 중합효소를 발현하여, 전사되는 mRNA 복제수(copy number)를 증가시킨다고 알려진 재조합 백시니아 바이러스와 함께, 전기 작제한 NC 발현벡터를 동물세포에서 발현시킨 결과, NC 단백질의 발현이 현저하게 증가하였다. 이 결과로 부터, NC 단백질이 효과적으로 발현되기 위해서는 정확한 NC 유전자 서열뿐만 아니라, NC mRNA 복제수의 증가 또한 필요하다는 것을 알 수 있었다.
한편, 재조합 백시니아 바이러스의 도움없이, 단독으로 동물세포에서 NC 단 백질을 제조하는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 에피토프 표지(epitope tagging)을 포함하는 벡터 시스템을 이용하였다: 첫번째로, MYC와 His 펩티드가 C 말단에 표지된(c-terminally tagging) NC 단백질을 발현하는 벡터를 작제하였다. 이때, pJC1으로부터 수득한 NC 유전자 단편에 중합연쇄반응(PCR)을 이용하여 NC 유전자 말단의 번역 종결 코돈(translation stop codon)을 제거한 후, 이 유전자를 pBud CE4벡터의 MYC와 His 펩티드 발현을 위한 DNA의 상부에 삽입하여, NC 발현벡터를 작제하고, 이를 "pBud NC-MH"라 명명하였다. 두번째로, NC 유전자를 pCMV HA 벡터에 삽입하여 "pCMV HA-NC"라 명명된 NC 단백질 발현벡터를 작제하였는데, 전기 벡터는 시작코돈과 함께 N-말단 HA(hemagglutinin) 에피토프 표지뿐만 아니라, HA 에피토프의 상부에 인트론(intron sequence)을 포함한다. 세번째로, 제한효소 절단과 중합연쇄반응을 이용하여 N-말단 FLAG 융합 NC 단백질 발현벡터를 작제하고 "pCMV FLAG NC"로 명명하였다.
상기 작제한 세가지 동물세포 발현벡터를 COS-7 세포에 형질도입시키고, NC 단백질의 발현을 측정한 결과, pCMV HA-NC 벡터를 발현시킨 경우, 나머지 pCMV FLAG NC 및 pBud NC-MH 벡터를 발현시킨 경우보다, 현저하게 높은 수준으로 NC 단백질이 발현되었다. 293T 등의 다른 동물세포를 사용하여 실험한 경우에도 유사한 결과를 얻은 사실로 미루어 볼 때, pCMV HA-NC 벡터의 높은 NC 단백질 발현은 특정 세포 종류에서만 얻어지는 결과가 아니라, pCMV HA-NC 벡터에 동물세포에서의 NC 단백질 발현에 필요한 어떤 중요한 요인이 존재하기 때문이라는 것을 유추할 수 있었다. 또한, NC 단백질이 발현되지 않는 pBud NC-MH 및 pCMV FLAG NC 벡터와 높 은 수준의 발현을 보이는 pCMV HA-NC 벡터 사이의 차이점이 pCMV HA-NC 벡터에 존재하는 인트론인 점을 감안하여, 이 인트론의 존재로 인해 pCMV HA-NC 벡터에서의 높은 NC 단백질 발현이 가능해졌다는 결론을 내릴 수 있었다.
상술한 실험에서 도출된 결론을 다시 한번 확인하기 위하여, pCMV HA-NC 벡터에서 HA 유전자를 제거하여, "pCMV (-HA) NC 벡터"를 작제하였다. 또한, 전기 작제한 pCMV (-HA) NC 벡터에 FLAG 유전자를 삽입하여, "pCMV (-HA) FLAG NC 벡터"를 작제하였다. 이 두 벡터를 COS-7 세포에 형질도입시키고, 웨스턴 블럿으로 세포내 NC 단백질의 발현을 측정한 결과, pCMV HA-NC 벡터와 마찬가지로, NC 단백질이 높은 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었다. pCMV FLAG NC 벡터 등의 인트론을 포함하지 않는 다른 발현벡터 시스템에서는 동일한 프로모터를 사용했음에도 불구하고, 이와 같이 높은 수준의 발현을 보이지 않았다는 점을 감안한다면, 인트론 서열의 존재가 동물세포에서의 NC 단백질의 발현에 중요한 역할을 한다는 결론을 내릴 수 있다. 다시 말해서, NC 발현벡터내의 인트론으로 인하여, 동물세포 안에서 NC 유전자가 안정적이고 높은 수준으로 발현될 수 있었으며, 이 결과를 백시니아 바이러스와의 동시발현을 통해 NC 단백질의 발현을 현저시 증가시킬 수 있었던 결과와 연관지어 생각할 때, 인트론의 존재는 NC mRNA의 전사수준이나 안정성의 증가와도 관련되었을 것이라는 가정을 도출해낼 수 있었다.
상기의 NC 발현벡터 내에 존재하는 인트론이 NC mRNA의 안정성 증가에 기여한다는 가정을 검증하기 위하여, 노던블럿 분석을 실시하였다. 전기 작제한 pcDNA NC 벡터, pBud NC-MH 벡터, pCMV FLAG NC 벡터, pCMV HA-NC 벡터, pCMV (-HA) NC 벡터 및 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터 등의 다양한 NC 발현벡터들을 COS-7 세포에 형질도입시키고, 전기 형질도입된 세포에서 발현되는 NC mRNA의 양을 노던블럿으로 측정 및 비교한 결과, 인트론 서열을 포함하는 pCMV HA-NC, pCMV(-HA) NC 및 pCMV(-HA)FLAG NC 벡터에서만 높은 수준의 NC mRNA가 발현됨을 확인하였다. 게다가, 인트론이 없는 NC 발현벡터를 사용한 경우에는, NC mRNA가 분해되어 생겨난 부산물로 예상되는, 매우 작은 크기의 NC mRNA 조각이 검출되었다. 따라서, NC 발현벡터 내의 인트론 서열의 존재는 NC mRNA의 전사 수준(transcription level)을 증가시킬 뿐만 아니라, 발현된 mRNA의 안정성 증가에도 큰 영향을 미친다고 결론지을 수 있었다.
인트론 서열을 포함하는 본 발명의 발현벡터는 NC 단백질을 동물세포에서 용이하게 생산할 수 있으므로, HIV에 효과적인 항바이러스제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: pcDNA3 NC 벡터를 이용한 동물세포에서의 NC 단백질 제조
동물세포에서 NC 단백질을 제조하기 위하여, pcDNA3 NC 벡터를 작제하고, 전기 벡터를 동물세포에 형질도입시킨 다음, 전기 세포를 배양하여 NC 단백질의 발현을 측정하였다.
실시예 1-1: pcDNA NC 벡터의 작제
여기에서 언급하는 대부분의 플라스미드에 사용되는 NC 유전자 서열은 pJC1 벡터에서 유래되었다(참조: HIV Nucleocapsid Protein; Expression in E. coli, Purification and Characterization. J. Biol. Chem. 268, 16519-16527, 1993). NC 단백질의 동물세포 발현벡터를 제작하기 위하여, pJC1 벡터에 제한효소 DraⅠ과 PstⅠ 처리와 클레노우 처리를 하여 NC를 암호화하는 유전자 단편을 수득하였다. 이 유전자 단편을 제한효소 EcoR Ⅴ를 처리한 pcDNA3(Invitrogen, USA)에 도입하여 pcDNA NC 벡터를 작제하였다(참조: 도 1). 도 1은 pcDNA NC 벡터의 유전자 지도를 나타내는 그림이다.
실시예 1-2: 동물세포 배양과 pcDNA NC 벡터의 형질도입 및 NC 단백질 발현 확인
COS-7 세포 또는 293T 세포를 10%(v/v) 우배아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액에서 배양하였다.
형질도입 하루 전에, 배양한 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 2x105 정도의 밀도로 접종하여. 형질도입시 60-80% 정도의 조밀도(confluency)를 보이도록 배양하였다. 한편, 각각의 플라스미드 1㎍을 5㎕의 LipofectAMINETM 제제(Gibco BRL)와 혼합한 후, 200㎕의 무혈청 배양액과 함께 실온에서 20분간 반응시켰다. 이어, 형질도입시킬 세포의 배양액을 1㎖의 무혈청 배양액으로 교환하고, 전기 무혈청 배양액에 전기 반응액을 첨가하여, 이산화탄소 세포 배양기에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. 추가 배양 후에, 세포 배양액을 10%(v/v) FBS를 포함하는 DMEM배양액으로 교환한 후, 24시간 및 48시간동안 다시 배양하고, 세포를 수득하여 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)용액으로 세척한 다음, 동결-해동 방법(freezing-thawing method)으로 세포를 분쇄하였다.
전기 세포분쇄물에서, HIV-1 NCp7 다클론 항체를 이용하여, NC 단백질의 발현을 웨스턴 블럿 방법으로 측정한 결과, NC 단백질 발현을 확인할 수 없었다. 또한, 유전자 서열 분석을 통하여, 벡터 작제에 사용한 NC 유전자에 돌연변이나 격자 이동(frame shift) 등의 문제가 없음을 확인하였다.
이 결과로 부터, 동물세포에서 NC 단백질의 발현이 제한됨을 알 수 있었다.
실시예 2: pHY GNC 벡터를 이용한 동물세포에서의 GST-NC 융합 단백질의 제 조
전기 실시예 1에서, 동물세포에서 NC 단백질의 발현이 실패한 원인을 규명하기위하여, GST 융합 벡터 시스템(GST fusion vector system)을 사용하여 NC 단백질의 발현을 시도함으로써, NC 유전자의 결함 여부를 확인하였다.
실시예 2-1: pHY GNC 벡터의 작제
동물세포에서 GST-NC 융합 단백질을 발현시키기 위하여, pJC1 벡터에 제한효소 Sau3A Ⅰ을 처리하여 NC 유전자 단편을 수득하였다. 전기 수득한 유전자 단편을 제한효소 BamH1을 처리한 pHY GST 동물세포 발현벡터에 도입하여 pHY GNC 벡터를 작제하였다.
실시예 2-2: 동물세포에서 pHY GNC 벡터의 형질도입과 NC 단백질 발현의 확인
전기 pHY GNC 벡터를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로, COS-7세포에 전기 발현벡터를 형질도입시키고, 도입된 세포를 배양한 다음,이로부터 수득한 세포분쇄물을 대상으로 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 매우 소량이지만, GST-NC 융합 단백질이 발현된 것을 확인하였다. 이로부터, 이 발현벡터 작제에 사용한 NC 유전자 서열에는 문제가 없다는 것을 확인할 수 있었으며, 발현된 NC mRNA의 양이나 안정성의 문제일 수도 있다는 가정을 도출하게 되었다.
실시예 3: 재조합 백시니아 바이러스를 이용한 동물세포에서의 NC 단백질 제조
실시예 2-2에서, 도출된 가정을 검증하기 위하여, T7 RNA 중합효소를 발현하여 mRNA 발현을 증가시킨다고 알려진 재조합 백시니아 바이러스를 사용하여, 동물세포에서 NC 단백질의 발현을 시도하였다.
즉, 실시예 1-2와 같은 방법으로, 전기 pHY GNC 벡터를 동물세포에 형질도입시킨 다음, 24시간 후 전기 형질도입시킨 세포에 재조합 백시니아 바이러스를 포함하는 5㎕의 혼합용액을 처리하고, 이산화탄소 배양기에서 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어, 24시간 후에 전기 배양한 세포를 수확하여, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 NC 단백질의 발현을 측정하였다.
상술한 실험 결과, 전기 발현벡터와 재조합 바이러스를 함께 동물세포에서 발현시켰을 때, NC 단백질 발현이 크게 증가되는 것을 볼 수 있었다. 이 결과로 부터, 동물세포에서 NC 단백질이 효과적으로 발현되기 위해서는 정확한 유전자 서열뿐만 아니라, NC mRNA 복제수의 증가 또한 필요하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: pBud NC-MH 와 pCMV HA-NC 및 pCMV FLAG NC 벡터를 이용한 동물세포에서의 NC 단백질의 제조
실시예 3에서, 재조합 백시니아 바이러스의 도움 없이 단독으로, 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 에피토프 표지 벡터 시스템을 이용하여, 동물세포에서 NC 단백질의 발현을 시도하였다.
실시예 4-1: pBud NC-MH 벡터의 작제 및 동물세포 형질도입을 통한 NC 단백질의 제조
pJC1 벡터로부터 연쇄중합반응을 통하여 수득한 NC 유전자 단편에 제한효소(EcoRI)를 처리하여, NC 유전자의 C 말단에 존재하는 종결 부호를 제거한 후, pBudCE4(Invitrogen, USA) 벡터에 삽입하여, 단백질의 c-말단에 MYC과 His 펩티드가 포함된 NC 단백질을 발현하는 pBud NC-MH 벡터를 작제하였다(참조: 도 2): 이때, 전기 연쇄중합반응은 전면 프라이머(sense primer)로서 프라이머 1: 5'-GGGGAATTCGGTACAATAATGCAGAGAGAGGCAATTTTAGG-3'(서열번호 1)과 후면 프라이머로서 프라이머 2: 5'-GGGGAATTCCCTGATCCATTAGCCTGTCTCTCAG-3'(서열번호 2)를 사용하여 수행하였다. 도 2는 pBud NC-MH 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
실시예 1-2와 동일한 방법으로, 전기 작제한 pBud NC-MH 벡터를 동물세포에 형질도입시킨 다음, 전기 형질도입시킨 세포의 배양을 통하여 NC 단백질을 제조하 고, 그 발현을 확인하였다.
실시예 4-2: pCMV HA-NC 벡터의 제작 및 동물세포 형질도입을 통한 NC 단백질의 제조
제한효소 Sal1처리 후, 클레노우(klenow) 반응시킨 pCMV HA 벡터(Invitrogen, USA)와, pJC1 벡터에 제한효소 Bgl1 과Pst1 및 클레노우(klenow)를 순차적으로 처리하여 수득한 NC 유전자 단편을 접합시켜 pCMV HA-NC 벡터를 작제하였다(참조: 도 3). 도 3은 pCMV HA-NC 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
실시예 1-2와 같은 방법으로, 전기 작제한 pCMV HA-NC 벡터를 동물세포에 형질도입시킨 다음, 전기 형질도입시킨 세포의 배양을 통하여 NC 단백질을 제조하고, 그 발현을 확인하였다.
실시예 4-3: pCMV FLAG NC 벡터의 제작 및 동물세포 형질도입을 통한 NC 단백질의 제조
pJC1에 제한효소 Bgl1과 Pst1을 처리하여 수득한 NC 유전자 단편을, BamH1과 Pst1을 처리한 pCMV Tag 2B 벡터(Stratagene, USA)에 삽입하여 pCMV FLAG NC 벡터를 작제하였다.
실시예 1-2와 같은 방법으로, 전기 작제한 pCMV FLAG NC 벡터를 동물세포에 형질도입시킨 다음, 전기 형질도입시킨 세포의 배양을 통하여 NC 단백질을 제조하고, 그 발현을 확인하였다.
전기 pBud NC-MH와 pCMV HA-NC 및 pCMV FLAG NC 벡터를 실시예 1-2와 같은 방법으로 동물세포에 형질도입하여 NC 단백질의 발현을 측정한 결과, pCMV HA-NC 벡터의 경우에, 나머지 두 벡터에 비해 현저하게 높은 NC 단백질의 발현함을 확인하였다.
전기 벡터의 형질도입에 사용한 COS-7 세포 대신에, 293T 세포 등의 다른 세포에 형질도입시킨 경우에도 유사한 결과를 얻은 사실로 미루어 볼 때, 전기 pCMV HA-NC 벡터로부터 높은 수준의 NC 단백질이 발현되는 것이 특정 세포 종류에서만 얻어지는 결과가 아니라, pCMV HA-NC 벡터 내에 NC 단백질 발현에 필수적인 요인이 존재하기 때문이라는 것을 추측할 수 있었다. 또한, NC 단백질이 발현되지 않는 pBud NC-MH 및 pCMV FLAG NC 벡터와 높은 수준의 발현을 보이는 pCMV HA-NC 벡터 사이의 공통적인 차이점이 pCMV HA-NC 벡터에 존재하는 인트론인 점을 감안하여, 인트론의 존재로 인해, pCMV HA-NC 벡터를 이용하여 동물세포에서 NC 단백질 발현시키는 것이 가능했다는 결론을 내릴 수 있었다.
실시예 5: pCMV(-HA) NC 벡터와 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터의 작제 및 동물세포 형질도입을 통한 NC 단백질의 제조
실시예 4에서 상술한 바와 같이, 실시예 4-2의 pCMV HA-NC 벡터가 동물세포에서 높은 수준의 NC 단백질을 발현할 수 있었던 요인이, HA 표지라기보다는 벡터 내의 인트론 서열의 존재라는 가정을 검증하기 위하여, pCMV HA-NC 벡터에서 HA 유전자를 제거한 pCMV (-HA) NC 벡터와, HA 유전자를 제거하고 FLAG 유전자를 삽입한 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터를 작제하고, 전기 두 벡터를 각각 동물세포에 형질도입시켜서, NC 단백질의 발현을 시도하였다
실시예 5-1: pCMV (-HA) NC 벡터를 이용한 동물세포에서의 NC 단백질 제조
실시예 4-2에서, HA 표지(tagging)없이 NC 단백질만 발현되도록 하기 위하여, pCMV HA-NC 벡터에 제한효소 Apa1과 EcoR1을 처리하고 재접합시키는 과정을 통해, HA 유전자를 제거하여 pCMV(-HA) NC 벡터를 작제하였다(참조: 도 4). 도 4는 pCMV (-HA) NC 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
실시예 1-2와 같은 방법으로, 전기 작제한 pCMV (-HA) NC 벡터를 동물세포에 형질도입시킨 다음, 전기 형질도입시킨 세포의 배양을 통하여 NC 단백질을 제조하고, 그 발현을 확인하였다.
실시예 5-2: pCMV (-HA) FLAG NC 벡터를 이용한 동물세포에서의 NC 단백질 제조
실시예 4-2에서, HA 표지를 제거하고, 대신 FLAG이 표지된 NC 단백질을 발현시키기 위하여, pCMV HA-NC 벡터에 제한효소 Apa1, 클레노우(klenow), Xho1을 순차적으로 처리한 pCMV (-HA) 벡터와 pCMV FLAG NC 벡터에 제한효소 Sal1, 클레노우, Xho1을 차례로 처리하여 얻은 FLAG NC 유전자 단편을 접합시켜 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터를 작제하였다(참조: 도 5). 도 5는 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터의 유전자지도를 나타내는 모식도이다.
실시예 1-2와 같은 방법으로, 전기 작제한 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터를 동물세포에 형질도입시킨 다음, 전기 형질도입시킨 세포의 배양을 통하여 NC 단백질을 제조하고, 그 발현을 확인하였다.
상술한 실험 결과, pCMV HA-NC 벡터와 마찬가지로, NC 단백질이 높은 수준으로 발현됨을 확인 할 수 있었다. 이 결과로 NC 발현벡터 내에 인트론이 존재함으로써, 동물세포 안에서 NC 유전자가 안정적이고 높은 수준으로 발현 될 수 있다는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 실시예 3의 백시니아 바이러스와의 동시 발현을 통해 NC 단백질의 발현을 현저히 증가시킬 수 있었던 결과와 연관지어 생각할 때, 인트론의 존재는 NC mRNA의 전사수준이나 안정성의 증가와도 관련될 것이라는 가정을 도출해낼 수 있었다.
실시예 6: 동물세포에서의 NC mRNA 발현 비교
실시예 5에 도출된 가정을 검증하기 위하여, 노던블럿 분석으로 NC mRNA 발현을 측정하였다.
전기 작제한 pcDNA NC 벡터, pBud NC-MH 벡터, pCMV FLAG NC 벡터, pCMV HA-NC 벡터, pCMV (-HA) NC 벡터 및 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터 등의 다양한 NC 발현벡터들을 실시예 1-2와 같은 방법으로, COS-7 세포에 형질도입하고, 발현되는 NC mRNA의 양을 측정하였다. 이때, NC mRNA 발현 측정은 pCMV HA-NC 벡터의 890에서 1097번째 염기사이에 존재하는 DNA 조각을 프로브로 사용하여, 노던블럿 방법으로 수행하였다(참조: 도 6a, 도 6b). 이때, 대조군으로는 형질도입되지 않은 COS-7 세포를 이용하고, β-액틴을 노던 블롯 확인용 마커로 사용하였다. 도 6a는 24시간동안 배양한 세포를 대상으로 노던 블롯을 수행한 결과를 나타내는 사진이고, 도 6b는 48시간동안 배양한 세포를 대상으로 노던 블롯을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 6a 및 도 6b에서 1번 레인은 형질도입되지 않은 COS-7 세포의 RNA이고, 2번 레인은 pcDNA NC 벡터로 형질도입된 COS-7 세포의 RNA이며, 3번 레인은 pCMV HA-NC 벡터로 형질도입된 COS-7 세포의 RNA이고, 4번 레인은 pCMV (-HA) NC 벡터로 형질도입된 COS-7 세포의 RNA이며, 5번 레인은 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터로 형질도입된 COS-7 세포의 RNA이다.
도 6a 및 도 6b에서 보듯이, 벡터 내에 인트론 서열을 포함하는 pCMV HA-NC, pCMV (-HA) NC 및 pCMV (-HA) FLAG NC 벡터에서만 높은 수준의 NC mRNA가 발현됨을 확인하였다. 또한, 인트론이 없는 NC 발현벡터를 사용한 경우에는, NC mRNA가 분 해되어 생겨난 부산물로 여겨지는 매우 작은 크기의 NC mRNA 조각이 검출되었다. 이 결과로 부터, NC 발현벡터 내의 인트론 서열의 존재는 NC mRNA의 전사수준 뿐만 아니라, 발현된 NC mRNA의 안정성 증가에도 큰 영향을 미친다는 결론을 내릴 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 동물세포에서 HIV의 NC 단백질을 발현시키기 위한 벡터 및 전기 발현벡터를 이용하여 동물세포에서 HIV의 NC 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 동물세포에서 NC 단백질을 제조하는 방법은 HIV의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NC) 유전자, NC 유전자 상부에 위치하는 SV40 19s mRNA 인트론 서열 또는 변형된 SV40 16s mRNA 인트론 서열 및 CMV 프로모터를 포함하는 발현벡터로 형질도입된 동물세포를 배양하고, 이로부터 NC 단백질을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, NC 단백질을 용이하게 생산할 수 있으므로, HIV에 효과적인 항바이러스제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
<110> EVICSGENE INC. <120> Process for Preparing Nucleocapsid protein of HIV in Mammalian Cell <160> 2 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 GGGGAATTCG GTACAATAAT GCAGAGAGAG GCAATTTTAG G 41 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 GGGGAATTCC CTGATCCATT AGCCTGTCTC TCAG 34

Claims (5)

  1. HIV NC(nucleocapsid) 유전자의 상부에 SV40 19s mRNA 인트론 서열 또는 변형된 SV40 16s mRNA 인트론 서열을 연결시키는 단계를 포함하는 HIV NC 단백질의 동물세포 발현용 벡터의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 동물세포는 COS-7 세포 또는 293T 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터는 상기 NC 유전자의 상부에 FLAG 유전자가 추가로 연결된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 프로모터, SV40 19s mRNA 인트론 서열 또는 변형된 SV40 16s mRNA 인트론 서열, FLAG 유전자 및 HIV NC 유전자를 순차적으로 포함하고, 도 5에 도시된 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 HIV NC 단백질의 동물세포 발현용 벡터.
  5. 삭제
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