KR101138930B1

KR101138930B1 - Ｈⅰｖｎｃ 단백질을 포함하는 ａⅰｄｓ 예방 및 치료용조성물

Info

Publication number: KR101138930B1
Application number: KR1020070016786A
Authority: KR
Inventors: 유지창
Original assignee: (주) 에빅스젠; 유지창
Priority date: 2007-02-16
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2012-04-25
Also published as: KR20080076614A; US10149888B2; EP2120993A1; JP2010520858A; EP2120993A4; US20100075901A1; WO2008100061A1

Abstract

본 발명은 HIV의 NC 단백질의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 AIDS 예방 및 치료용 조성물 및 상기 폴리펩티드를 이용한 HIV 증식억제방법에 관한 것이다. 본 발명의 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 과발현시 HIV의 증식을 억제하는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명은 HIV의 증식을 억제하는 새로운 수단을 제공할 뿐만아니라 AIDS 예방 및 치료를 위한 새로운 방법을 제공하는 효과가 있다.

HIV, 증식억제, NC(nucleocapsid), AIDS, 예방, 치료

Description

ＨⅠＶＮＣ 단백질을 포함하는 ＡⅠＤＳ 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating ＡⅠＤＳ comprising ＨⅠＶＮＣ protein}

도 1은 HIV NC 단백질의 HIV 증식 억제효과를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 pLP1/optiNC 발현벡터의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.

도 3은 HIV NC 단백질을 포함하는 6종의 gag 결실돌연변이체를 나타낸 것이다. 이 때, HIV gag 단백질(gag protein)을 구성하는 각 도메인의 약칭은 다음과 같다: MA(Matrix), CA(Capsid), P2(P2 domain), NC(Nucleocapsid), P1(P1 domain), P6(P6 domain).

도 4는 HIV NC 단백질을 포함하는 6종의 gag 결실돌연변이체의 HIV 증식 억제효과를 나타낸 것이다.

도 5는 증식된 HIV가 기능적으로 정상인지 MT-2세포를 이용하여 확인한 결과이다.

본 발명은 HIV의 NC 단백질의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 AIDS 예방 및 치료용 조성물 및 상기 폴리펩티드를 이용한 HIV 증식억제방법에 관한 것이다.

AIDS(acquired immune deficiency syndrome)는 1980년대 초에 처음으로 발견된 이래, 세계적으로 중요한 질병 중의 하나이다. 현재까지 개발된 AIDS의 치료제는 주로 프로테아제 억제제(protease inhibitor), 역전사효소(reverse transcriptase) 억제제로서, AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, 네비라핀 등의 역전사 효소억제제 또는 사키나비르, 인디나비르, 리토나비르 등의 프로테아제 억제제가 있다. 이들 치료제는 단독으로 사용할 경우 별 효과가 없으나, AZT, 3TC 등 두 개의 역전사효소 억제제와 하나의 프로테아제 억제제를 복합 처방할 경우 높은 수준의 치료효과를 보이는 것으로 알려졌다.

그러나 복합 처방을 받은 모든 환자의 병세가 다 호전되는 것은 아니며, 그 가격이 비싸고 구토, 고열 등 심각한 부작용이 있으며, 이들 약제에 대한 저항성을 가지는 변종 바이러스가 나타나는 등의 문제점이 있다.

따라서 더 나은 치료법을 위해 약효가 훨씬 강하며 독성이 적은 새로운 계통의 치료제 개발의 필요성이 요구되고 있다.

AIDS는 HIV(human immunodeficiency virus)의 감염에 의해서 발병하는데, HIV에 의해 감염되면 3~6주 후 감기 몸살같은 증세를 1~2주 정도 앓다가 회복되며, 그 후 증상없는 잠복기가 10여년 간 지속된다. 긴 잠복기 동안 바이러스는 감염자의 면역 세포를 파괴하면서 지속적으로 증식하기 때문에 환자의 면역 기능이 점차 손상되어 잠복기 말기에는 AIDS 증상이 나타난다.

HIV의 단백질 중 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid, 이하, 'NC'라 명명함)은 바이러스 개체형성을 위한 구조적 역할뿐만 아니라, 바이러스의 생활주기(viral life cycle)에 대하여 기능적으로도 중요한 역할을 한다. HIV NC 단백질의 주요 기능을 살펴보면, 첫째, NC 단백질은 바이러스의 유전적 포막(genomic encapsidation)에 관여한다. 이러한 기능은 독특한 Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys 모티프(CCHC 모티프)로 구성되는 두 개의 징크핑거 도메인으로부터 기인하는데, 상기 도메인은 모든 레트로바이러스(retrovirus)에서 높은 보존성을 나타내며, HIV RNA 포장(packaging)과 감염성 바이러스 생산에 필수적인 것으로 알려져 있다. 둘째, NC 단백질은 바이러스의 역전사 반응(reverstranscription, RT)동안 tRNA 프라이머 어닐링(annealing)과 가닥 이동(strand transfer)을 촉진한다고 알려져 있으며, 이로부터 NC 단백질이 바이러스 복제(viral replication)에 중요한 기능을 한다는 것을 알 수 있다. 셋째, NC 단백질은 바이러스의 생활주기에 필요한 핵산 샤페론(chaperone) 활성을 가지며, 최근에는 바이러스 DNA가 숙주세포 염색체에 삽입될 때에도 NC 단백질이 소정의 역할을 담당한다고 보고되고 있다.

따라서, 이러한 NC 단백질에 대한 연구는 HIV 생활주기에서 NC 단백질이 갖는 생물학적 기능을 밝히는데 뿐만 아니라, 핵심적인 HIV 단백질에 대한 효과적인 항바이러스제를 개발하는 측면에 있어서도 매우 중요하다 할 것이다.

이에 본 발명자들은 HIV NC 단백질의 생리학적 활성을 연구하던 중 HIV NC 단백질 및 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드가 HIV의 증식을 억제하는 것을 알아내어 AIDS의 예방 및 치료용 조성물로 이용할 수 있다는 점을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 HIV NC 단백질의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 AIDS 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시켜 HIV 증식억제방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명은 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 물질을 탐색하여 AIDS의 예방 및 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물은 HIV(human immunodeficiency virus) NC(Nucleocapsid) 단백질 자체 또는 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 "HIV의 NC 단백질”은 AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome, 후천성 면역결핍증)을 일으키는 병원체인 HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질을 의미하며, 상기 단백질은 바이러스 게놈 RNA에 강하게 결합하여 리보 핵산단백질 코어 복합체(ribonucleoprotein core complex)를 형성한다.

바람직하게는 HIV NC 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며, Genbank Accession No. P03349, P03366, P04585, P03367, P12497, P03369, P04587, P04584, P35963, P24740, P05961, P04591, Q73368, P20892, P20875, P12498, P05888, P12493, Q9QBZ5, Q9QBY3, O89940, Q9WC63, Q9WC54, Q75002, P24736, Q9QBZ1, O89290, Q9QBZ6, Q9QBY4, P12499, P05959, P18802, P04588, P04589, P05960, Q70622, P20889, P12494, P03347, Q9QSR3, Q9Q720, Q9IDV9, Q9WC62, Q9WC53, Q9Q721, Q74230, Q73367, O12157, P35962, P18800, P04592, P20873, P05887, P03348, P04593, Q89928, Q79666, Q77373, O41798, O93215, O91080, P05962, Q9QBZ2, Q9QC00, O89291, P05891, P15833, P17757, P18096, Q9QSR4, Q9IDV8, Q75001, O89939, P18095, P05890, P04594, P12495, Q76634, P20876, P18042, P0C1K7, Q79665, Q77372, O93182, O91079, P05889, P12451, P24107, Q76633, P12450, P18041, P15832, P24106, P17756, Q69383, Q74120, Q74119, P20874, P04590, P03363, Q0R5R2, Q1A268, Q1A250, Q1A267, P03353, Q0R5R3, Q1A249에 기재된 NC 단백질(예를 들면, P03349의 경우 380 내지 434번째 아미노산 서열)일 수 있다.

아울러, 본 발명의 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드는, 이에 한정되지는 않으나, HIV의 gag 결실 돌연변이체일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 HIV NC 단백질은 세포내에서 발현시 HIV의 증식을 효과적으로 억제할 수 있으며(실시예 1 참조), HIV NC 단백질을 포함하는 gag 결실 돌연변이체 역시 세포내에서 발현시 HIV의 증식을 효과적으로 억제하였다(실시예 2 참조). 이와 같은 점은 본 발명자들에 의해 최초로 밝혀진 것이다. 따라서, 본 발명은 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 AIDS 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 HIV NC 단백질 자 체 또는 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 AIDS를 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 HIV NC 단백질 또는 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 약학적으로 유효한 양으로는 0.0001 내지 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.01 내지 1mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경 로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글 리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.

경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.

흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 AIDS를 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다

한편, 본 발명은 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 세포내 수준을 증가시켜 HIV 바이러스의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

상기 ‘세포내 수준’이란 세포내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 세포내 수준은 전사 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 HIV NC 단백질 또는 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자, 예를 들면 서열번호 8 내지 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 연결한 발현벡터로 세포를 형질전환하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 상기 세포내 수준의 증가의 또 다른 예로 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 목적하는 세포에 전달하는 방법이 이용될 수 있다. 이와 같은 전달방법은 통상의 유전자 치료(gene therapy)에서 사용되는 방법들을 본원발명에 부합되게 수정한 방법에 따라 수행될 수 있으며, 이에 대해서는 당업자들에게 널리 공지되어 있다.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기에 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy , 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol . Biol . 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발 현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 발현벡터는 pLP1/optiNC일 수 있다.

pLP1/optiNC 벡터는 다음과 같은 방법으로 제조되었다: 서열번호 15의 코돈 최적화된 HIV NC 유전자(OptiNC DNA)를 EcoRI/HindIII로 제한효소 처리한 다음 상기 제한효소 처리된 단편을 먼저 준비해 둔 EcoRI/HindIII로 처리된 pUC57 벡터(Genescript, 미국)에 클로닝하였고 이를 pUC57/OptiNC라 명명하였다. 상기 pUC57/OptiNC와 pcDNA4/TO(Invitrogen, 미국)를 HindIII와 EcoRI으로 절단한 다음 라이게인션하여 pcDNA4/TO/OpicNC를 제작하였다. 상기 pcDNA4/TO/OptiNC를 HindIII와 NotI으로 처리한 다음 절단된 HIV NC 유전자가 포함된 DNA 단편을 클리나우(Klenow)로 중합하여 평활말단으로 하였다. pCMV(-HA) 벡터(Clontech Laboratories, Inc., 미국)도 EcoRI 및 NotI으로 처리한 다음 벡터부위의 DNA 단편에 클리나우(Klenow)로 중합하여 평활말단으로 하였다. 상기 클리나우(Klenow) 단편이 처리된 두 단편을 라이게이션하여 이를 pCMV(-HA)/OptiNC라 명명하였다. pLP1 벡터(Invitrogen사)에 PmlI/AvrII/BspEI 을 처리하여 GAG-POL 유전자를 잘라내고, OptiNC 폴리뉴클레오티드는 pCMV(-HA)/OptiNC 벡터에서 XmaI/EcoRI 처리하여 수득하였다. 상기 pLP1 벡터와 수득한 OptiNC 폴리뉴클레오티드 모두 클리나우(Klenow)로 중합하여 평활말단을 만들고, 평활말단 라이게이션(Blunt end ligation)하여 이를 pLP1/optiNC 벡터라 명명하였다.

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987)).

또한, 본 발명에서 규명한 바와 같이 HIV NC 단백질 및 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 발현이 HIV의 증식을 억제하는 활성을 가지므로 본 발명은 HIV NC 단백질 및 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 물질을 탐색하여 AIDS의 예방 및 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 스크리닝 방법은

(a) HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계 및;

(b) HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 세포 내 수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기에서 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 세포 내 수준 증가라 함은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현이 증가되어 세포 내에 존재하는 상기 폴리펩티드의 양이 증가되는 것을 말한다. 따라서, 본 발명에서 스크리닝되어지는 물질은 상기 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 특성을 지닌 물질이다. 상기 항암 물질은 단백질 뿐 아니라 천연에서 분리되거나 화학적으로 합성된 화합물 또는 추출물을 포함한다.

HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 세포 내 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 공동-면역침전법(co-immunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)이 포함된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 표적으로 한 스크리닝 방법은 고효율 스크리닝(high throughput screening; HTS)을 적용할 수 있다. HTS는 다수의 후보물질을 병행 시험하여, 다수의 후보물질의 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법이다. 특정 양태로서, 96-웰 미세역가 플레이트 또는 192-웰 미세역가 플레이트에서 세포주를 배양하고, 여기에 다수개의 후보물질을 처리한 다음 면역화학적 방법에 의해 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 발현정도를 측정할 수 있다. 이 포맷에서는, 96회의 독립적인 시험을 96개의 반응 웰을 함유하는 단일 8cm×12cm 플라스틱 플레이트 상에서 동시에 수행할 수 있다. 상기 웰은 전형적으로 50㎕ 내지 500㎕에 이르는 검정 용적을 필요로 한다. 플레이트 이외에, 96-웰 포맷을 광범위한 균일계 및 불균일계 검정에 적합하게 하기 위해 다수의 계기, 기구, 피펫터, 로봇, 플레이트 세척기 및 플레이트 판독기가 상업적으로 이용 가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 293FT 세포에 HIV 바이러스를 생산할 수 있는 벡터인 pNL4-3GFP 및 HIV NC 단백질을 발현하는 pLP1/optiNC 벡터를 도입하여 형질전환하고, 상기 형질전환된 293FT 세포에서 증식되는 HIV 바이러스의 수를 확인하였다. 그 결과, HIV NC 단백질을 발현하는 세포에서는 그렇지 않은 세포에 비해 약 100배이상의 HIV 증식억제 효과가 있음을 알 수 있었다(실시예 1 및 도 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 HIV NC 단백질을 포함하는 gag 결실돌연변이체를 발현하는 6종의 벡터를 제조하고, 이를 293FT 세포에 pNL4-3GFP 벡터와 함께 형질전환한 다음, 상기 형질전환된 293FT 세포에서 증식되는 HIV 바이러스의 수를 확인하였다. 그 결과, 상기 결실 돌연변이체를 발현하는 세포에서는 그렇지 않은 세포에 비해 약 5배 내지 70배이상의 HIV 증식억제 효과가 있음을 알 수 있었다(실시예 2 및 도 4 참조)

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

NC 단백질의 HIV 증식억제 효과 확인

<1-1> NC 단백질을 발현하는 형질전환세포 제작

형질전환에 사용된 293FT 세포(Invitrogen, 미국)는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 비필수 아미노산을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 293FT 세포를 6-well 플레이트에서 24시간동안 배양한 후 pNL4-3GFP 벡터 및 pLP1/optiNC 벡터로 리포펙타민(lipofectamine; invitrogen, 미국) 2000 프로토콜에 따라 형질전환을 시켰다. 이 때, NC 단백질을 생산하지 않는 대조군으로 pLP1/optiNC 벡터 대신 pLP1/0 벡터(pLP1 벡터에 아무 것도 삽입하지 않은 벡터)를 사용하였다. 형질전환 방법은 다음과 같다: 세포를 6-well 플레이트에서 약 90%의 컨플루언스(confluence) 정도까지 배양하였다. pNL4-3GFP 벡터 1μg과 pLP1/optiNC 벡터 2μg, pNL4-3GFP 벡터 1μg과 pLP1/optiNC 벡터 3μg 및 대조군으로 pNL4-3GFP 1 μg and pLP1/0 2 μg를 각각 혼합한 다음 250 μl의 opti-MEM I Reduced Serum Medium으로 희석하였다. 이와는 별개로, 9 μl의 리포펙타민 2000을 250 μl 의 opti-MEM에 희석한 다음 실온에서 5분간 놓아두었다. 그 후, 희석된 리포펙타민 2000을 상기 벡터의 혼합물에 넣은 다음 약 30분간 놓아두었다. 6-well 플레이트에서 배양한 세포를 500 μl의 PBS (Phosphate-Buffered Saline)로 세척한 다음 다시 500 μl의 opti-MEM 배지를 넣었다. 상기에서 혼합한 벡터와 리포펙타민 2000의 혼합물을 각각의 배지에 넣고, 37 °C, 5 % CO₂의 조건으로 배양하였다.

형질전환에 사용한 벡터에 대해서 상세히 설명하면, 다음과 같다: pNL4-3EGFP 벡터는 Nef 유전자의 절반이 EGFP 리포터 유전자로 대체된 것을 제외하고는 모든 HIV-1의 유전자를 포함하고 있어 재조합 HIV 바이러스를 생산할 수 있는 벡터로서, 공지된 문헌(Lee et al., 1997, Biochem. Biophy. Res. Comm., 233: 288-292)에 상세히 기재되어 있다. pLP1/optiNC 벡터는 NC 단백질을 발현시키기 위한 벡터로서 . pLP1/0 벡터는 상기 pLP1/optiNC 벡터에서 NC 유전자에 해당하는 부분이 삽입되어 있지 않은 벡터이다.

<1-2> NC 발현에 따른 HIV 증식속도 측정

상기 실시예 <1-1>에서 형질전환된 293FT 세포의 배지를 형질전환 후 5 내지 6시간 경과 후에 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)이 함유된 DMEM 배지로 대체하였다. 그 후 각각 6시간, 12시간, 24시간, 36시간 및 48시간 경과 후 배지샘플을 수득하여 바이러스의 포함정도를 ELISA 분석을 통하여 측정하였다.

상기 ELISA 분석은 비로노스티카 HIV-1 항체 p24 ELISA 키트(Vironostika HIV-1 antigen p24 ELISA kit, Biomerieux, 프랑스)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다: 상기에서 배지샘플을 키트의 웰에 옮겨 배양(incubate)하고, 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, 0.17 M KH₂PO₄, 0.72 M K₂HPO₄) 100μl를 혼합하고 30초간 놓아 두는 방법으로 4회 세척하였다. 이에 p24 항체를 넣고 37℃에서 1시간동안 반응시키고, 다시 HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 2차항체를 넣고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 여기에 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine, TMB)을 넣고 항체 복합체와 10분간 접합시켰다. 이를 80pg/ml에서 5pg/ml까지 2배씩 희석하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 각각의 시료내의 바이러스의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 1 및 하기 표 1(단위 : pg/ml)에서 보듯이, NC 단백질이 HIV 바이러스의 생산을 농도의존적으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 특히, 48시간 경과시에 3μg의 NC 발현벡터(pLP1/optiNC 벡터)를 첨가한 경우는 NC를 발현하지 않는 세포에 비해 약 100배 이상의 증식억제 효과를 보였다. 이러한 결과는 NC 단백질이 HIV의 증식을 억제하는 항바이러스 제제로 이용될 수 있음을 보여준다.

	8hr	12hr	24hr	36hr	48hr
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1/0(2μg)	17615.14	67442.3	226266.4	350834.2	410004
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1/optiNC(2μg)	111.535	181.964	5566.944	7985.42	15466.862
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1/optiNC(3μg)	45.04886	50.409	2125.266	2719.573	7825.96

<2-1> Gag 결실 돌연변이체의 제조

NC 단백질을 포함하는 Gag 결실 돌연변이체(deletion mutant)가 HIV 증식억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 6종의 Gag 결실 돌연변이체를 제조하였다. pLP1의 서열정보를 이용하여 도 2에서와 같은 NC 단백질을 포함하는 Gag 결실 돌연변이체를 제조하기 위하여 하기 표 2와 같은 PCR 프라이머를 디자인하였다.

결실 돌연변이체	정방향 프라이머	역방향 프라이머
D1	tttctagaggacacgtgatggtgcagaacatc (서열번호 16)	ccctcgagtccggattattgtgacga (서열번호 19)
D2	tttctagaggacacgtgatggctgaagcaatg (서열번호 17)	ccctcgagtccggattattgtgacga (서열번호 19)
D3	tttgtagaggacacgtgatgatacagaaa (서열번호 18)	ccctcgagtccggattattgtgacga (서열번호 19)
D4	tttctagaggacacgtgatggctgaagcaatg (서열번호 17)	ccctcgagtccggatcaaaaattccctgg (서열번호 20)
D5	tttctagaggacacgtgatggctgaagcaatg (서열번호 17)	ccctcgagtccggatcaattagcctgtct (서열번호 21)
D6	tttgtagaggacacgtgatgatacagaaa (서열번호 18)	ccctcgagtccggatcaaaaattccctgg (서열번호 20)

6종의 결실 돌연변이체는 상기 표 2의 각각의 프라이머 조합을 이용하고, pLP1 벡터를 주형으로 하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다: 95℃에서 5분간 전변성, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 35회 증폭 및 72℃ 5분의 연장(extention). 증폭된 각각의 PCR 산물은 pmlI과 BspEI으로 절단하여 pLP1의 pmlI 및 BspEI 제한효소 부위에 클로닝하고, 이를 각각 pLP1-D1 내지 pLP1-D6라고 하였다.

< 실시예 2> NC 단백질을 포함하는 Gag 결실 돌연변이체의 HIV 증식 억제효과 확인

<2-2> NC 발현에 따른 HIV 증식속도 측정

상기 실시예 <2-1>에서 제조된 각각의 Gag 결실 돌연변이체의 발현시 HIV 증식속도에 미치는 영향을 측정하기 위하여, pLP1/optiNC 벡터 대신 상기 돌연변이체를 발현하는 pLP1-D1 내지 pLP1-D6 벡터를 각각 1μg씩 사용한 것 및 DMEM 배치로 대체후 24시간 경과 후에 배지샘플을 수득하여 측정한 것 이외에는 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>의 방법과 같이 하여 측정하였다.

그 결과, 하기 도 4 및 표 3(단위 : pg/ml)과 같이 NC 단백질을 포함하는 6종의 Gag 결실 돌연변이체 모두 HIV 바이러스의 생산을 억제하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 NC 단백질 자체는 물론, NC 단백질이 포함된 펩티드가 HIV의 증식을 억제하는 효과가 있음을 보여준다.

	24hr
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1-gag/pol(1μg)	204652.942
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1-D1(1μg)	46076.011
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1-D2(1μg)	8973.306
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1-D3(1μg)	6346.566
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1-D4(1μg)	3063.140
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1-D5(1μg)	20383.209
pNL4-3EGFP(1μg) + pLP1-D6(1μg)	4540.682

상기한 바와 같이, 본 발명의 HIV NC 단백질을 포함하는 폴리펩티드는 과발현시 HIV의 증식을 억제하는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명은 HIV의 증식을 억제하는 새로운 수단을 제공할 뿐만아니라 AIDS 예방 및 치료를 위한 새로운 방법을 제공하는 효과가 있다.

<110> YOU, Ji Chang <120> Composition for preventing and treating AIDS comprising HIV NC protein <130> NP07-0008 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV opti-NC <400> 1 Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe 1 5 10 15 Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg 20 25 30 Lys Lys Gly Cys Trp Arg Cys Gly Arg Glu Gly His Gln Met Lys Asp 35 40 45 Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn 50 55 <210> 2 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D1 <400> 2 Met Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser Pro 1 5 10 15 Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser 20 25 30 Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro 35 40 45 Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala 50 55 60 Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp 65 70 75 80 Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg 85 90 95 Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu 100 105 110 Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr 130 135 140 Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe 145 150 155 160 Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala 165 170 175 Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn 180 185 190 Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala 195 200 205 Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly 210 215 220 His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro 225 230 235 240 Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr 245 250 255 Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys 260 265 270 Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His 275 280 285 Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile 290 295 300 Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro 305 310 315 320 Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg Phe Gly Glu Glu Thr 325 330 335 Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Ser Ser Gln 355 360 365 <210> 3 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D2 <400> 3 Met Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile 1 5 10 15 Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn 20 25 30 Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys 50 55 60 Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys 65 70 75 80 Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro 85 90 95 Pro Glu Glu Ser Phe Arg Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln 100 105 110 Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg 115 120 125 Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Ser Ser Gln 130 135 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D3 <400> 4 Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys 1 5 10 15 Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro 20 25 30 Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys 35 40 45 Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser 50 55 60 His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr 65 70 75 80 Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro 85 90 95 Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser 100 105 110 Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Ser Ser Gln 115 120 <210> 5 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D4 <400> 5 Met Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile 1 5 10 15 Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn 20 25 30 Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys 50 55 60 Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys 65 70 75 80 Gly Arg Pro Gly Asn Phe 85 <210> 6 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D5 <400> 6 Met Ala Glu Ala Met Ser Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile 1 5 10 15 Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn 20 25 30 Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys 50 55 60 Thr Glu Arg Gln Ala Asn 65 70 <210> 7 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D6 <400> 7 Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys 1 5 10 15 Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro 20 25 30 Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys 35 40 45 Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser 50 55 60 His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe 65 70 <210> 8 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV opti-NC <400> 8 atgcagcggg gaaacttcag gaaccagcga aaaactgtga agtgcttcaa ttgcggaaag 60 gagggccaca tcgctaagaa ctgccgggcc cccagaaaga aaggctgctg gagatgcggc 120 agagagggcc accagatgaa ggactgcact gagcggcagg caaac 165 <210> 9 <211> 1101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D1 <400> 9 gtgcagaaca tccaggggca aatggtacat caggccatat cacctagaac tttaaatgca 60 tgggtaaaag tagtagaaga gaaggctttc agcccagaag tgatacccat gttttcagca 120 ttatcagaag gagccacccc acaagattta aacaccatgc taaacacagt ggggggacat 180 caagcagcca tgcaaatgtt aaaagagacc atcaatgagg aagctgcaga atgggataga 240 gtgcatccag tgcatgcagg gcctattgca ccaggccaga tgagagaacc aaggggaagt 300 gacatagcag gaactactag tacccttcag gaacaaatag gatggatgac acataatcca 360 cctatcccag taggagaaat ctataaaaga tggataatcc tgggattaaa taaaatagta 420 agaatgtata gccctaccag cattctggac ataagacaag gaccaaagga accctttaga 480 gactatgtag accgattcta taaaactcta agagccgagc aagcttcaca agaggtaaaa 540 aattggatga cagaaacctt gttggtccaa aatgcgaacc cagattgtaa gactatttta 600 aaagcattgg gaccaggagc gacactagaa gaaatgatga cagcatgtca gggagtgggg 660 ggacccggcc ataaagcaag agttttggct gaagcaatga gccaagtaac aaatccagct 720 accataatga tacagaaagg caattttagg aaccaaagaa agactgttaa gtgtttcaat 780 tgtggcaaag aagggcacat agccaaaaat tgcagggccc ctaggaaaaa gggctgttgg 840 aaatgtggaa aggaaggaca ccaaatgaaa gattgtactg agagacaggc taatttttta 900 gggaagatct ggccttccca caagggaagg ccagggaatt ttcttcagag cagaccagag 960 ccaacagccc caccagaaga gagcttcagg tttggggaag agacaacaac tccctctcag 1020 aagcaggagc cgatagacaa ggaactgtat cctttagctt ccctcagatc actctttggc 1080 agcgacccct cgtcacaata a 1101 <210> 10 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D2 <400> 10 gctgaagcaa tgagccaagt aacaaatcca gctaccataa tgatacagaa aggcaatttt 60 aggaaccaaa gaaagactgt taagtgtttc aattgtggca aagaagggca catagccaaa 120 aattgcaggg cccctaggaa aaagggctgt tggaaatgtg gaaaggaagg acaccaaatg 180 aaagattgta ctgagagaca ggctaatttt ttagggaaga tctggccttc ccacaaggga 240 aggccaggga attttcttca gagcagacca gagccaacag ccccaccaga agagagcttc 300 aggtttgggg aagagacaac aactccctct cagaagcagg agccgataga caaggaactg 360 tatcctttag cttccctcag atcactcttt ggcagcgacc cctcgtcaca ataa 414 <210> 11 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D3 <400> 11 atgatacaga aaggcaattt taggaaccaa agaaagactg ttaagtgttt caattgtggc 60 aaagaagggc acatagccaa aaattgcagg gcccctagga aaaagggctg ttggaaatgt 120 ggaaaggaag gacaccaaat gaaagattgt actgagagac aggctaattt tttagggaag 180 atctggcctt cccacaaggg aaggccaggg aattttcttc agagcagacc agagccaaca 240 gccccaccag aagagagctt caggtttggg gaagagacaa caactccctc tcagaagcag 300 gagccgatag acaaggaact gtatccttta gcttccctca gatcactctt tggcagcgac 360 ccctcgtcac aa 372 <210> 12 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D4 <400> 12 atggctgaag caatgagcca agtaacaaat ccagctacca taatgataca gaaaggcaat 60 tttaggaacc aaagaaagac tgttaagtgt ttcaattgtg gcaaagaagg gcacatagcc 120 aaaaattgca gggcccctag gaaaaagggc tgttggaaat gtggaaagga aggacaccaa 180 atgaaagatt gtactgagag acaggctaat tttttaggga agatctggcc ttcccacaag 240 ggaaggccag ggaatttt 258 <210> 13 <211> 210 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D5 <400> 13 atggctgaag caatgagcca agtaacaaat ccagctacca taatgataca gaaaggcaat 60 tttaggaacc aaagaaagac tgttaagtgt ttcaattgtg gcaaagaagg gcacatagcc 120 aaaaattgca gggcccctag gaaaaagggc tgttggaaat gtggaaagga aggacaccaa 180 atgaaagatt gtactgagag acaggctaat 210 <210> 14 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gag mutant comprising HIV NC protein - D6 <400> 14 atgatacaga aaggcaattt taggaaccaa agaaagactg ttaagtgttt caattgtggc 60 aaagaagggc acatagccaa aaattgcagg gcccctagga aaaagggctg ttggaaatgt 120 ggaaaggaag gacaccaaat gaaagattgt actgagagac aggctaattt tttagggaag 180 atctggcctt cccacaaggg aaggccaggg aatttt 216 <210> 15 <211> 193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV NC protein <400> 15 aagcttcccg ggaatgcagc ggggaaactt caggaaccag cgaaaaactg tgaagtgctt 60 caattgcgga aaggagggcc acatcgctaa gaactgccgg gcccccagaa agaaaggctg 120 ctggagatgc ggcagagagg gccaccagat gaaggactgc actgagcggc aggcaaactg 180 actgcaggaa ttc 193 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1 forward <400> 16 tttctagagg acacgtgatg gtgcagaaca tc 32 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D2, D4, D5 forward <400> 17 tttctagagg acacgtgatg gctgaagcaa tg 32 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D3, D6 forward <400> 18 tttgtagagg acacgtgatg atacagaaa 29 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D1, D2, D3 reverse <400> 19 ccctcgagtc cggattattg tgacga 26 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D4, D6 reverse <400> 20 ccctcgagtc cggatcaaaa attccctgg 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D5 reverse <400> 21 ccctcgagtc cggatcaatt agcctgtct 29

Claims

HIV NC(human immunodeficiency virus nucleocapsid) 단백질을 유효성분으로 포함하는 AIDS(acquired immune deficiency syndrome) 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 HIV NC 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
삭제
삭제
프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 HIV NC 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 AIDS 예방 및 치료용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 HIV NC 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택된 서열로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 상기 발현벡터는 pLP1/optiNC인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) HIV NC 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계 및;

(b) HIV NC 단백질의 세포 내 수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS의 예방 및 치료 물질의 스크리닝 방법.
제11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 HIV NC 단백질의 세포 내 수준의 증가는 HIV NC 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 HIV NC 단백질의 세포 내 수준은 면역침전법(co-immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.