WO2019240431A1 - 세포 투과 펩티드 및 rpe65의 융합 단백질을 포함하는 레버 선천성 흑암시 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

세포 투과 펩티드 및 rpe65의 융합 단백질을 포함하는 레버 선천성 흑암시 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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신우리
백이용
최준섭
구혜정
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(주) 에빅스젠
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    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of lever congenital dark age, comprising the cell-penetrating peptide and the fusion protein of RPE65 as an active ingredient.
  • LCA Leber's congenital amaurosis
  • RPE65 retina pigment epithelium-specific 65 kDa
  • CEP290 centrosomal protein 290 kDa
  • GUCY2D retinal guanylate cylase-1
  • CRB1 crumbs homolog 1
  • APL1 aryl hydrocarbon interacting
  • RPE65 is a 65 kDa retinoid isomerase present in retinal pigment epithelium and is a 11-cis-retinol that acts as a chromophore in photoreceptor cells. ) Is synthesized. Lever congenital dark vision caused by the RPE65 mutation accounts for 10% of the total.
  • the present inventors have studied a method for delivering normal RPE65 protein to retinal pigment epithelial cells of patients with lever congenital melanoma. Thus, using a cell-penetrating peptide derived from a nucleocapsid protein of human immunodeficiency virus (HIV), It was confirmed that the cell permeability can be improved to complete the present invention.
  • HAV human immunodeficiency virus
  • An object of the present invention is a fusion protein comprising a cell-penetrating peptide and RPE65 (Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein), a pharmaceutical composition for treating Leber's congenital amaurosis comprising the same as an active ingredient, and a method of treatment To provide its use.
  • RPE65 Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein
  • One aspect of the invention provides a cell penetrating peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And it provides a fusion protein comprising RPE65 (Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • RPE65 Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein
  • Another aspect of the invention provides a polynucleotide encoding said fusion protein.
  • Another aspect of the invention provides a recombinant vector comprising said polynucleotide.
  • Another aspect of the present invention provides a host cell comprising the recombinant vector.
  • Another aspect of the invention provides a method of producing a fusion protein comprising the steps of: (a) culturing the host cell in a culture medium; And (b) recovering the fusion protein from the culture medium.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of lever congenital amaurosis comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • Another aspect of the invention provides a method of treating lever congenital dark vision, comprising administering the composition to a subject.
  • Another aspect of the invention provides the use of said fusion protein in the manufacture of a medicament for the treatment of lever congenital darkness.
  • the fusion protein of the cell penetrating peptide and RPE65 has an increased cell permeability, and thus may be usefully used for the treatment of lever innate dark.
  • Figure 2 shows the results confirmed by HPLC (high performance liquid chromatography) of the enzyme activity of the ACP-RPE65M fusion protein.
  • Figure 3 shows the results confirming the retinal pigment epithelial cell permeation activity of the ACP-bound RPE65 protein.
  • One aspect of the present invention to achieve the above object is a cell penetrating peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And RPE65 described by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • CPP Cell Penetrating Peptides
  • RPE65 Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa
  • the term 'conjugate' refers to a substance in which a protein which is biologically or pharmacologically active with a cell penetrating peptide is connected by chemical physical covalent or non-covalent bond.
  • RPE65 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be used as the protein.
  • the cell penetrating peptide may be linked to the N-terminus of RPE65 to form a fusion protein.
  • the cell penetrating peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, RPE65 protein described by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 May be encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the fusion protein may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (ACP-RPE65).
  • Another aspect of the invention provides a polynucleotide encoding said fusion protein.
  • polynucleotide' is a polymer of deoxyribonucleotides or ribonucleotides present in single- or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom and includes analogs of natural polynucleotides unless specifically stated otherwise.
  • the polynucleotide includes not only the nucleotide sequence encoding the fusion protein, but also a sequence complementary to the sequence.
  • Such complementary sequences include sequences that are substantially complementary, as well as sequences that are substantially complementary.
  • the polynucleotide sequence may be modified, and modifications include addition, deletion or non-conservative substitutions or conservative substitutions of nucleotides.
  • the polynucleotide encoding the fusion protein may comprise a polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (ACP-RPE65).
  • Another aspect of the invention provides a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding said fusion protein.
  • the term 'vector' refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell.
  • it may include, but is not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors.
  • Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (eg, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14).
  • phages eg, ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1 and M13, etc.
  • viruses eg, CMV, SV40, etc.
  • the recombinant vector may include a promoter operatively linked to the polynucleotide sequence and the polynucleotide sequence.
  • the term 'operably linked' means a functional bond between a nucleotide expression control sequence (e.g., a promoter sequence) and another nucleotide sequence, whereby the control sequence is a derivative of the other nucleotide sequence. Transcription and / or translation.
  • recombinant vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), phage (eg, ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, M13, and the like) or viruses (eg, SV40, etc.).
  • plasmids eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.
  • phage eg, ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, M13, and the like
  • viruses eg, SV40, etc.
  • the recombinant vector may comprise a tag sequence that facilitates purification of the cell penetrating peptide and the RPE65 fusion protein, eg, contiguous histidine codons, maltose binding protein codons and Myc codons, and the like. It may further include a fusion partner or the like for increasing solubility. It can also include sequences specifically cleaved by enzymes, expression control sequences, and marker or reporter gene sequences to confirm intracellular delivery in order to remove unnecessary portions when expressing fusion proteins.
  • a tag sequence that facilitates purification of the cell penetrating peptide and the RPE65 fusion protein, eg, contiguous histidine codons, maltose binding protein codons and Myc codons, and the like. It may further include a fusion partner or the like for increasing solubility. It can also include sequences specifically cleaved by enzymes, expression control sequences, and marker or reporter gene sequences to confirm intracellular delivery in order to remove
  • Another aspect of the invention provides a host cell comprising said recombinant vector, ie, a cell transformed with said recombinant vector.
  • the host cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector may be any host cell known in the art.
  • Prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, and E. coli W3110.
  • host cells include yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, plant cells and animal cells, such as SP2 / 0, Chinese hamster ovary K1, CHO DG44, PER.C6, W138. , BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN and MDCK cell lines and the like can be used.
  • the delivery of the polynucleotide or the recombinant vector comprising the same into the host cell may be carried by transport methods well known in the art.
  • a CaCl 2 method or an electroporation method may be used.
  • a micro-injection method, calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, Liposome-mediated transfection and gene bombardment may be used, but is not limited thereto.
  • the method for selecting the transformed host cell can be easily carried out according to a method known in the art using a phenotype expressed by a selection label.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene
  • the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of culturing the host cell in the culture medium; And recovering the fusion protein from the culture medium.
  • the cell culture may be a large-scale cell culture
  • the cell culture method may use a conventionally used cell culture method.
  • the cell culture method is not limited to this, but batch culture, repeated batch culture, fed-batch culture, repeated fed-batch culture It may be any one or more selected from the group consisting of continuous culture (peruous culture) and perfusion culture (perfusion culture).
  • the step of recovering the fusion protein from the culture medium may be carried out through a variety of separation and purification methods known in the art.
  • cell lysates are centrifuged to remove cell debris, culture impurities, and the like, followed by precipitation, for example, salting out (ammonium sulfate precipitation and sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (acetone, ethanol, iso Protein fraction precipitation using propyl alcohol), and the like, dialysis, electrophoresis and various column chromatography can be performed.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of lever congenital amaurosis comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the term 'leber's congenital amaurosis' is a hereditary retinal disease that causes congenital blindness.
  • RPE65 retina pigment epithelium-specific 65 kDa
  • CEP290 centrosomal protein 290 kDa
  • GUCY2D retinal It is caused by genetic mutations such as guanylate cylase-1), CRB1 (crumbs homolog 1), and AIPL1 (aryl hydrocarbon interacting protein like 1).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in the pharmaceutical composition as needed in addition to the fusion protein.
  • Such pharmaceutically acceptable carriers are commonly used in the manufacture of pharmaceuticals, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose , Polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may also further comprise lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like as additives.
  • the carrier may be included in the pharmaceutical composition of the present invention in an amount of about 1% to about 99.99% by weight, preferably about 90% to about 99.99% by weight, based on the total weight thereof, and the additive is about 0.1% by weight. To about 20% by weight.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, but may be directly administered to the skin in a topical manner.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form or formulated into pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients or incorporated into multi-dose containers.
  • the formulation may be in the form of a solution, a suspension or an emulsion, or may include an exercire, an excipient, a powder, a granule, a tablet, a warning, a coughing agent, a lotion, an ointment, and the like.
  • the daily amount of the pharmaceutical composition of the present invention is usually 0.001 ⁇ 150 mg / kg body weight range, it can be administered once or divided into several times. However, since the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined in view of various related factors such as the route of administration, the age, sex, weight of the patient, and the severity of the patient, the dosage limits the scope of the present invention in any aspect. It should not be understood.
  • Another aspect of the invention provides a method of treating lever congenital dark vision, comprising administering the composition to a subject.
  • the subject refers to an animal, and may typically be a mammal that may have a beneficial effect on treatment with the fusion protein of the invention.
  • Preferred examples of such subjects may include primates, such as humans.
  • such subjects may include all subjects having or at risk of having a lever congenital dark age.
  • Another aspect of the invention provides the use of said fusion protein in the manufacture of a medicament for the treatment of lever congenital darkness.
  • ACP (Avixgen's advanced cell penetrating peptide, described below as ACP: SEQ ID NO: 1) was used as a cell penetrating peptide.
  • ACP Avixgen's advanced cell penetrating peptide, described below as ACP: SEQ ID NO: 1
  • the ACP-RPE65M gene was inserted into the pET28a vector using restriction enzymes, and the recombinant vector into which the ACP-RPE65M gene was inserted was named pET28a ACP-RPE65M-1.
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed and shake cultured at 37 ° C until the OD 0.5 to 0.6 in LB liquid medium. After the incubation, the culture medium was centrifuged to collect E. coli pellets, and a plasmid extraction kit (Qiagen) was used to isolate the pET28a ACP-RPE65M-1 vector from the E. coli pellets collected according to the manufacturer's protocol. The isolated pET28a ACP-RPE65M-1 vector was identified after quantitative concentration by UV-specrophotometer.
  • baculoviruses were prepared using pFastBac1-MBP vector to express ACP-RPE65M in insect cells, and ACP-RPE65M- expressed in insect cells using the vector replication method in Escherichia coli above. 2 recombinant bacmids were obtained.
  • BL21 (DE3) (Thermo Fisher, USA) was transformed with the pET28a ACP-RPE65M-1 vector, plated on LB plates and incubated at 37 ° C. for 12 hours. Colonies formed after 12 hours were inoculated in LB liquid medium and further incubated at 37 ° C. After about 12 hours, the culture medium which reached OD 0.5 to 0.6 was inoculated in 250 ml of LB liquid medium and incubated for 3 to 4 hours at OD 0.4 to 0.6 at 37 ° C.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-thiogalactoside
  • the E. coli lysate was centrifuged to separate the supernatant and the precipitate, and the supernatant was packed into a tube using a 0.45 ⁇ m filter.
  • the supernatant filled in the tube was placed in a column filled with a Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) resin (resin) to bind the protein and the resin to each other.
  • the resin was then washed by adding wash buffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole and pH 8.0) to remove foreign proteins that did not bind to the resin.
  • Final proteins were obtained by gradient mobile phase using imidazole-added buffers (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 400 mM imidazole and pH 8.0). Next, the protein obtained to remove imidazole was placed in a membrane tube, using a buffer containing no imidazole (20 mM NaH 2 PO 4 , 200 mM NaCl, 2 mM DTT, 10% glycerol and pH 7.0). Buffer exchange was carried out by osmotic action. Finally, ACP-RPE65M-1 protein expression was confirmed by measuring the concentration of the protein dissolved in the buffer containing no imidazole by the Bradford assay. ACP-RPE65M-2 recombinant baccimid was expressed in SF9 cells, and then isolated and purified in the same manner to obtain ACP-RPE65M-2 protein.
  • HeLa cells were seeded in 12-well plates containing glass at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / well and incubated for 24 hours to attach the cells to the glass. Then, HeLa cells were treated with 1 ⁇ M of ACP-RPE65M, and after 3 hours, the cells were washed three times with PBS. The washed cells were fixed with 3.7% formaldehyde for 20 minutes and treated with PBS containing 0.2% Triton X-100 to increase cell membrane permeability. Thereafter, the cells were blocked with 3% BSA for 1 hour, reacted with ACP antibody (abcam, ab9108) at room temperature for 2 hours, and washed three times with PBS.
  • ACP antibody abcam, ab9108
  • Alexa 488 secondary antibody was treated for 1 hour at room temperature, washed twice with PBS, and stained with DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) for 10 minutes. HeLa cells adhered to the glass was removed and placed on a slide glass, and observed with a confocal laser scanning microscopy (LSM 700, Zeiss, Germany).
  • ACP-RPE65M-1 is a fusion protein expressed and purified in E. coli
  • ACP-RPE65M-2 is a fusion protein expressed and purified using baculovirus.
  • C57BL / 6 mice were anesthetized with 2% avertin, and 1 ⁇ l of ACP-RPE65 containing 100 mM His-tag and 1 ⁇ l of RPE65 solution containing His-tag were subretinal injection.
  • the patient was euthanized with an overdose anesthesia, the eye was taken out, and fixed in 4% paraformaldehyde for 1 hour at room temperature. After fixation, the eye was transferred to PBS, washed for 30 minutes, the cornea and lens were removed under a dissecting microscope, an eye cup was made, and transferred to a 24-well dish. Thereafter, RPE65 was confirmed by immunostaining with His-tag antibody.
  • the eye cup was reacted with anti-His-tag for 2 hours, washed with phosphate buffered saline, and immunostained with a secondary antibody with a fluorescent probe.
  • the retina was stretched outwards, the cover glass was covered to make a slide, and the prepared slide was observed under fluorescence microscopy. From the eye retinal epithelial cells in which ACP-RPE65 and RPE65 were injected subretinally, into the retinal pigment epithelial cells The delivered RPE65 was confirmed by performing immunostaining with anti-his-tag.
  • ACP has the ability to deliver RPE65 protein into retinal pigment epithelial cells.

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Abstract

세포 투과 펩티드와 RPE65(Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa)의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 RPE65의 세포 투과성이 증가되어 있으므로 레버 선천성 흑암시 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 투과 펩티드 및 RPE65의 융합 단백질을 포함하는 레버 선천성 흑암시 치료용 약학적 조성물
본 발명은 세포 투과 펩티드 및 RPE65의 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 레버 선천성 흑암시 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
흑암시(amaurosis)는 겉으로는 눈에 별다른 이상이 없어 보지지만 물체를 인식할 수 없는 시력 장애를 말하며, 흑내장이라고도 불리운다. 흑암시 중에서 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis, LCA)는 선천성 실명을 유발하는 유전성 망막질환으로, 심한 시력 소실, 사시, 눈떨림, 눈부심 및 망막 색소변성 등을 특징을 나타낸다.
레버 선천성 흑암시를 유발하는 유전자 돌연변이는 RPE65(retinal pigment epithelium-specific 65 kDa), CEP290(centrosomal protein 290 kDa), GUCY2D(retinal guanylate cylase-1), CRB1(crumbs homolog 1), AIPL1(aryl hydrocarbon interacting protein like 1), LCA5, CRX(cone rod homeobox) 등을 포함하여 현재까지 약 17종이 알려져 있으며, 모두 광수용세포 및 망막색소상피세포와 관련된 돌연변이이다.
RPE65는 망막색소상피(retinal pigment epithelium)에 존재하는 65 kDa 크기의 레티노이드 이성질화효소(retinoid isomerase)이며, 광수용세포에서 광색소(chromophore)로 작용하는 11-시스-레티놀(11-cis-retinol)을 합성한다. RPE65 돌연변이에 의한 레버 선천성 흑암시는 전체의 10%를 차지한다.
본 발명자들은 레버 선천성 흑암시 환자의 망막색소상피세포에 정상적인 RPE65 단백질을 전달하기 위한 방법을 연구한 결과, HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid) 유래 세포 투과 펩티드를 사용하면 RPE65의 세포 투과성을 높일 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포 투과 펩티드와 RPE65(Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein)를 포함하는 융합 단백질, 이를 유효성분으로 포함하는 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis) 치료용 약학적 조성물 및 치료방법과 그의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 RPE65(Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 상기 숙주세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 레버 선천성 흑암시의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 레버 선천성 흑암시의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다.
세포 투과 펩티드와 RPE65의 융합 단백질은 세포 투과성이 증가되어 있으므로 레버 선천성 흑암시 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 ACP-RPE65M 융합 단백질의 세포막 투과 활성을 HeLa 세포에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 ACP-RPE65M 융합 단백질의 효소 활성을 HPLC(high performance liquid chromatography)로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 ACP가 결합된 RPE65단백질의 망막 색소상피세포 투과 활성을 확인한 결과를 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 기재되는 RPE65를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '세포 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptides, CPP)'는 약 10개 내지 60개 정도의 짧은 펩티드로 이루어진 세포막 투과성 펩티드로 세포막을 손상시키지 않으면서 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 DNA나 단백질까지 세포 내로 전달할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, 'RPE65(Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa)'는 망막상피세포에서 11-시스-레티놀(11-cis-retinol)을 합성하는 효소이다. RPE65 유전자에 돌연변이가 발생하면 트란스-레티놀(trans-retinol)과 시스-레티놀(cis-retinol)의 전환이 이루어지지 않아 시신경이 정상적으로 작동할 수 없게 된다.
본 명세서에 사용된 용어, '융합 단백질(conjugate)'은 세포 투과 펩티드와 생물학적 또는 약제학적으로 활성을 가지는 단백질이 화학적 물리적 공유 또는 비공유 결합으로 연결된 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 세포 투과 펩티드에 결합되어 융합 단백질이 될 수 있는 '생물학적 또는 약제학적 활성을 갖는 단백질'이란 생체 내의 생리현상을 조절할 수 있는 단백질을 의미한다. 단백질, 펩티드를 포함하고, 단백질 또는 펩티드와 연결된 지방, 탄수화물 및 화합물(chemical compound), 또는 형광표지물질 등을 포함한다. 예를 들어, 단백질로는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 RPE65가 사용될 수 있다. 상기 세포 투과 펩티드는 RPE65의 N-말단과 연결되어 융합 단백질을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩(coding)될 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 기재되는 RPE65 단백질은 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 3(ACP-RPE65)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)'는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있으며, 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6(ACP-RPE65)으로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '벡터(vector)'는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '작동적으로 연결된'은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 세포 투과 펩티드와 RPE65 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열, 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합 단백질의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 융합 단백질 발현 시 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포, 즉, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다. 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776 및 E. coli W3110 등이 있다. 진핵세포에 형질전환시키는 경우 숙주세포로, 효모( Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl 2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질전환된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당해 기술 분야에 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 세포 투과 펩티드와 RPE65의 융합 단백질 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 배양은 대규모 세포 배양일 수 있으며, 세포 배양 방법은 통상적으로 사용되는 세포 배양법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 배양 방법은 이로 한정되는 것은 아니지만, 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법(repeated batch culture), 유가 배양법(fed-batch culture), 반복 유가 배양법(repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법(perfusion culture)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있다. 통상적으로 세포 조각(cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis) 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis)'는 선천성 실명을 유발하는 유전성 망막질환으로 RPE65(retinal pigment epithelium-specific 65 kDa), CEP290(centrosomal protein 290 kDa), GUCY2D(retinal guanylate cylase-1), CRB1(crumbs homolog 1) 및 AIPL1(aryl hydrocarbon interacting protein like 1) 등의 유전자 돌연변이에 의하여 발생한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 이외에 필요에 따라 약학적 조성물에 있어서 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
이러한 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학적 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으나, 국소 투여 방식으로 피부에 직접 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고, 도고제, 로션, 연고 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 ㎎/㎏ 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 레버 선천성 흑암시의 치료 방법을 제공한다.
상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 융합 단백질을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 레버 선천성 흑암시의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 레버 선천성 흑암시의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포 투과 펩티드-RPE65M 융합 단백질 제작
세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)로는 ACP(Avixgen's advanced cell penetrating peptide, 이하 ACP로 기재함: 서열번호 1)를 사용하였다. ACP와 RPE65M이 결합(conjugation)된 융합 단백질의 발현 여부를 확인하고, 단백질을 정제하기 위하여 다음과 같이 재조합 벡터를 제작하였다.
ACP-RPE65M 단백질을 발현시키기 위하여 pET28a 벡터에 ACP-RPE65M 유전자를 제한효소를 이용하여 삽입하였고, ACP-RPE65M 유전자가 삽입된 재조합 벡터는 pET28a ACP-RPE65M-1으로 명명하였다.
pET28a ACP-RPE65M-1 벡터를 복제하기 위하여 대장균 DH5α에 상기 벡터를 형질전환하고, LB 액체배지에서 OD 0.5 내지 0.6이 될 때까지 37℃에서 진탕 배양(shake culture)하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 원심분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 수거하고, plasmid extraction kit(Qiagen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수거한 대장균 펠렛에서 pET28a ACP-RPE65M-1 벡터를 분리하였다. 분리한 pET28a ACP-RPE65M-1 벡터는 UV-specrophotometer로 농도를 정량한 후 확인하였다.
추가로 곤충의 세포에서 ACP-RPE65M를 발현시키기 위하여 pFastBac1-MBP 벡터를 이용하여 바큘로바이러스(baculovirus)를 제작하였고, 위의 대장균에서 벡터 복제 방법을 이용하여, 곤충 세포에서 발현되는 ACP-RPE65M-2 재조합 박시미드(bacmid)를 얻었다.
실시예 1-2: ACP-RPE65M 발현 및 정제
상기에서 제작한 pET28a ACP-RPE65M-1 벡터 및 재조합 박시미드 ACP-RPE65M-2의 단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
BL21(DE3)(Thermo Fisher, 미국)에 pET28a ACP-RPE65M-1 벡터를 형질전환시키고, LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 12시간 후 형성된 콜로니(colony)를 LB 액체배지에 접종하고, 37℃에서 추가로 배양하였다. 약 12시간 후 OD 0.5 내지 0.6에 도달한 배양액을 LB 액체배지 250 ㎖에 접종하고, 37℃에서 OD 0.4 내지 0.6이 되도록 3시간 내지 4시간 동안 배양하였다. 배양액의 OD가 0.4 내지 0.6이 되었을 때 배양액에 IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside) 0.25 mM을 첨가하고, 16℃에서 18시간 동안 배양하였다. 18시간 후 배양액을 원심분리하여 BL21 펠렛을 수득하고, 수득한 펠렛을 용해 버퍼(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole 및 pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기를 이용하여 대장균을 파쇄(amplitude 35%)하였다.
상기 대장균 파쇄물을 원심분리하여 상층액과 침전물로 분리하고, 상층액을 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 튜브에 충전시켰다. 튜브에 충전된 상층액을 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid) 레진(resin)이 충진된 컬럼에 넣어 단백질과 레진을 서로 결합시켰다. 이후, 레진에 결합하지 않는 외래 단백질을 제거하기 위하여 세척 버퍼(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole 및 pH 8.0)를 첨가하여 레진을 세척하였다. 이미다졸(imidazole)이 첨가된 버퍼(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 400 mM imidazole 및 pH 8.0)를 이용하여 이동상 기울기(gradient mobile phase)로 최종 단백질을 수득하였다. 다음으로, 이미다졸을 제거하기 위하여 수득한 단백질을 멤브레인 튜브에 넣고, 이미다졸이 포함되지 않은 버퍼(20 mM NaH 2PO 4, 200 mM NaCl, 2mM DTT, 10% glycerol 및 pH 7.0)를 이용하여 삼투압 작용에 의한 버퍼 교환을 진행하였다. 마지막으로, 이미다졸이 포함되지 않은 버퍼에 용해되어 있는 단백질을 브래드포드 방법(Bradford assay)으로 농도를 측정하여 ACP-RPE65M-1 단백질 발현을 확인하였다. ACP-RPE65M-2 재조합 박시미드는 SF9 세포에서 발현시킨 후 상기와 같은 방법으로 분리 및 정제하여 ACP-RPE65M-2 단백질을 수득하였다.
실시예 2: ACP-RPE65M 융합 단백질 분석
2-1. ACP-RPE65M 의 세포막 투과성 확인
HeLa 세포를 1x10 5 세포/well의 밀도로 글라스가 들어있는 12-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양하여 세포를 글라스에 부착시켰다. 이후, HeLa 세포에 ACP-RPE65M 1 μM을 처리하고, 3시간 후 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 세포를 3.7% 포름알데하이드로 20분 동안 고정시키고, 0.2% Triton X-100이 포함된 PBS를 처리하여 세포막 투과성을 증가시켰다. 이후, 세포를 3% BSA로 1시간 동안 블로킹시키고, ACP 항체(abcam, ab9108)와 상온에서 2시간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. Alexa 488 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 2회 세척한 후 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)로 10분 동안 염색하였다. HeLa 세포가 부착된 글라스를 떼어내어 슬라이드 글라스 위에 올려 놓고, 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscopy, LSM 700, Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 세포 내에서 FITC 형광 신호를 확인하여 ACP-RPE65M이 세포막을 투과하여 HeLa 세포 내로 유입된 것을 알 수 있었다. 도 1에서 ACP-RPE65M-1은 대장균에서 발현 및 정제한 융합 단백질이고, ACP-RPE65M-2는 바큘로바이러스를 사용하여 발현, 정제한 융합 단백질이다.
2-2. ACP-RPE65M의 효소 활성 확인
ACP-RPE65M 융합 단백질 10 ㎍과 총-트란스-레티놀(all-trans-retinol)로서 4 mM 농도의 레티닐 아세테이트(retinyl acetate; in 10mM Tris pH 7.4) 200 ㎕를 혼합한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 메탄올 300 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고, 헥산(hexan) 300 ㎕를 첨가한 후 볼텍싱(vortexing)하였다. 이후 원심분리하여 상층액을 회수한 후 HPLC로 총-트란스-레티놀과 11-시스 레티놀(11-cis-retinol)을 확인하였다.
확인 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 ACP-RPE65M 에 의하여 11-시스 레티놀이 생성된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 ACP-RPE65M 융합 단백질이 RPE65의 효소 활성을 유지하고 있음을 의미한다.
실시예 3: ACP-RPE65 단백질의 망막상피세포 투과성 확인
ACP-RPE65 단백질이 망막 색소상피세포 내로 전달되어 실질적으로 RPE65 효소 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스를 2%의 avertin으로 마취하고, 100 mM의 His-tag를 포함하는 ACP-RPE65 및 His-tag를 포함하는 RPE65 용액 1㎕를 망막 하로 주사(subretinal injection)하였다. 주사 6시간 후 용량 초과 마취로 안락사시키고, 안구를 적출한 다음, 상온에서 4%의 파라포름알데히드에 1시간 동안 고정시켰다. 고정 후, PBS로 안구를 옮기고 30분간 세척한 다음, 해부현미경하에서 각막 및 수정체를 제거하고, Eye cup을 만든 다음, 24웰 디쉬에 옮겼다. 그 후, His-tag 항체를 이용한 면역염색으로 RPE65를 확인하였다. Eye cup을 항 His-tag에 2시간 반응 시키고, 인산완충 식염수로 세척한 후, 형광 probe가 붙어있는 2차항체로 면역 염색을 진행하였다. 망막이 위쪽으로 보이도록 하여 펼치고, 커버글라스를 덮어 슬라이드를 제작하였고, 제작된 슬라이드를 형광 현미경 하에서 관찰하여, ACP-RPE65 및 RPE65가 망막하로 주사된 안구의 망막 상피세포에서, 망막색소상피세포 내로 전달된 RPE65를 항 his-tag을 이용한 면역염색을 수행하여 확인하였다.
확인 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, ACP가 결합된 RPE65단백질이 망막 색소상피세포에 전달된 것으로 확인되었으며, ACP가 결합되지 않은 RPE65는 망막 색소상피세포 내로의 전달율이 낮은 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 ACP가 RPE65단백질을 망막 색소상피세포 내로 전달시킬 수 있는 능력을 가지고 있다는 것을 시사한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드; 및
    서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 RPE65(Retinal Pigment Epithelium-specific 65 kDa protein)를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  5. 하기 단계를 포함하는 융합 단백질을 생산하는 방법:
    (a) 제4항의 숙주세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계.
  6. 제1항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 레버 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis) 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 레버 선천성 흑암시의 치료 방법.
  8. 레버 선천성 흑암시의 치료를 위한 약제의 제조에서 제1항의 융합 단백질의 용도.
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