WO2023048527A1 - AAV2-Trx2-C3 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 녹내장 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

AAV2-Trx2-C3 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 녹내장 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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trx2
glaucoma
aav2
treatment
gene
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박기랑
이현승
최준섭
차세호
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(주) 씨드모젠
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    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics

Definitions

  • the present invention effectively uses Thioredoxin 2 (Trx2) and C3 ADP-ribosyltransferase (C3) fusion proteins loaded on an adeno-associated virus 2 (AAV2) vector. It relates to a composition for preventing or treating glaucoma comprising as a component.
  • Glaucoma is a disease that causes blindness by degeneration of retinal ganglion cells and optic nerve, and an increase in intraocular pressure occurs because the discharge of the aqueous humor is not smooth.
  • Glaucoma is a disease in which retinal ganglion cells degenerate by applying pressure to the retina and optic disc due to increased intraocular pressure, and is one of the three major retinal diseases along with diabetic retinopathy and macular degeneration.
  • Glaucoma is caused by intraocular pressure, and glaucoma caused by intraocular pressure (more than 21 mmHg) is divided into open angle glaucoma and closed angle glaucoma. I have normal tension glaucoma.
  • Glaucoma is characterized by reduction and loss of peripheral vision, and only central vision remains as it progresses.
  • Glaucoma is a virtually incurable disease when vision is lost, and prevention is the top priority, and control of intraocular pressure is one of the important treatment methods.
  • Alpha-adrenergic agonists, beta blockers, carbonic anhyrase inhibitors, prostaglandin, and Rho kinase inhibitors are used as eye drops to lower intraocular pressure. . All of these treatments, most of which are eye drops, must be administered once or twice daily. Accordingly, there is a demand for the development of a treatment method for resolving the inconvenience of daily administration and the side effects of long-term eye drops for the treatment of glaucoma.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating glaucoma containing a recombinant expression vector containing a Thioredoxin 2 (Trx2) gene and a C3 ADP-ribosyltransferase (C3) gene as an active ingredient want to provide
  • the present invention is a recombinant expression vector containing a thioredoxin 2 (Trx2) gene and a C3 ADP-ribosyltransferase (C3) gene, Trx2 and C3 fusion
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating glaucoma which is characterized by expressing a protein and contains an adeno-associated virus 2 (AAV2)-based recombinant viral expression vector as an active ingredient.
  • AAV2 adeno-associated virus 2
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating glaucoma comprising an AAV2-Trx2-C3 fusion protein as an active ingredient.
  • a composition for preventing or treating glaucoma comprising an AAV2-Trx2-C3 fusion protein as an active ingredient.
  • the therapeutic protein to be expressed in vivo was a Trx2-C3 fusion protein, and AAV2-Trx2-C3 was developed using AAV2 as an expression system.
  • a lowering effect was shown, and the protective effect of retinal ganglion cells was confirmed. Accordingly, the present invention can treat glaucoma by a single administration of daily eye drop treatment, and can provide a new glaucoma treatment method to patients.
  • 1 is a schematic vector diagram of AAV2-Trx2-C3 and results confirming the expression of Trx2 and C3 in cells.
  • Figure 2 is a graph showing the result of intraocular pressure lowered by administration of AAV2-Trx2-C3 in the ocular hypertension model induced by dexamethasone.
  • Figure 3 is a photomicrograph confirming the change of the trabecular meshwork (trabecular meshwork) in the ocular hypertension glaucoma model by H&E staining.
  • A is alpha smooth muscle actin (alpha-SMA, alpha smooth muscle actin)
  • B is a picture of fibronectin immunostaining.
  • 5 is a graph quantifying and observing the degeneration and protective effect of retinal neurons in the mouse ocular hypertension glaucoma model by TUNEL staining.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of immunostaining and quantification of the retina with a retinal neural sperm cell marker (Neu N) in order to confirm the reduction and protection of retinal ganglion cells in a mouse ocular hypertension glaucoma model.
  • a retinal neural sperm cell marker Ne N
  • FIG. 8 is a graph showing the results of observing the effect of inhibiting RhoA activity in cells treated with AAV2-Trx2-C3.
  • alpha-SMA alpha smooth muscle actin
  • the inventors of the present invention developed a treatment for glaucoma with an emphasis on the control of intraocular pressure, which is the cause of glaucoma.
  • the cause was to lower intraocular pressure.
  • Aqueous humor is produced in the epithelial cells of the ciliary body, and is discharged into the trabecular meshwork between the cornea and the iris.
  • the increase in intraocular pressure which is the cause of glaucoma, occurs because the aqueous humor is not properly discharged, and this cause may appear due to a problem with the fiber spigot through which the aqueous humor is discharged. Therefore, by regulating the fiber cells of the trabecular meshwork, it is possible to regulate the intraocular pressure by promoting the discharge of aqueous humor.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating glaucoma containing a recombinant expression vector containing a Thioredoxin 2 (Trx2) gene and a C3 ADP-ribosyltransferase (C3) gene as an active ingredient provides
  • the recombinant expression vector may further include a linker between the Trx2 gene and the C3 gene.
  • the Trx2 gene and the C3 gene may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, but are not limited thereto.
  • the recombinant expression vector can express the Trx2 and C3 fusion proteins.
  • Trx2 and C3 were used as the therapeutic genes of the present invention, and Trx2 is a small oxidoreductase that is present in all tissues and mainly regulates active oxygen, mitochondrial membrane potential and active oxygen-induced apoptosis. It is also known to inhibit TGF-b-induced epithelial cell transformation (epithelial-mesenchymal transition, EMT).
  • C3 is one of the ADP-ribosyltransferases and is a Bacterial Exoenzyme. C3 is known to inhibit the activity of RhoA.
  • expression vector refers to a plasmid, viral vector or other medium known in the art capable of expressing an inserted nucleic acid in a host cell.
  • Polynucleotides encoding the fusion proteins of the invention may be operably linked.
  • the expression vector is generally operably linked to an origin of replication capable of proliferating in a host cell, one or more expression control sequences (eg, promoter, enhancer, etc.) for controlling expression, a selective marker, and an expression control sequence. It may contain a polynucleotide encoding the fusion protein of the invention.
  • Vectors used in the present invention include linear DNA expressed in human or animal cells, plasmid vectors, vectors including viral expression vectors, recombinant retrovirus vectors, recombinant adenovirus vectors, and recombinant adenovirus vectors. It may be a recombinant viral expression vector including a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector, a recombinant herpes simplex virus vector or a recombinant lentivirus vector, more preferably , The recombinant viral expression vector may be adeno-associated virus 2 (rAAV2), but is not limited thereto.
  • rAAV2 adeno-associated virus 2
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared using pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvants in addition to the active ingredients, and the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants, and glidants. Alternatively, a solubilizer such as a flavoring agent may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be preferably formulated as a pharmaceutical composition by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredient for administration.
  • acceptable pharmaceutical carriers are sterile and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added if necessary.
  • a diluent, a dispersing agent, a surfactant, a binder, and a lubricant may be additionally added to formulate an injection formulation such as an aqueous solution, suspension, or emulsion, pill, capsule, granule, or tablet.
  • the pharmaceutical formulation form of the pharmaceutical composition of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions, and sustained-release preparations of active compounds.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a conventional manner via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, intranasal, inhalational, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes.
  • An effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required for preventing or treating a disease.
  • the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, weight, general health condition, sex and diet, administration time, administration route and composition It can be controlled by various factors including secretion rate, duration of treatment, and drugs used concurrently.
  • the composition of the present invention when administered once to several times, in the case of a compound can be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 13 vg/person can be administered at a dose of 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 13 vg/person.
  • Trx2-C3 fusion protein was designed to express Thioredoxin 2 (Trx2) protein and C3 ADP-ribosyltransferase (C3) protein as one protein.
  • Trx2 Thioredoxin 2
  • C3 C3 ADP-ribosyltransferase
  • Trx2 NM_012473.4 of NCBI was referred to, and for C3, fusion protein was designed with reference to M74038.1.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the therapeutic gene used in the present invention is shown in FIG. 1, and type 2 was used as the adeno-associated virus serotype for expressing the therapeutic gene in the present invention.
  • pAAV2-Trx2-C3 the pAAV-F.IX cis plasmid containing the CMV promoter, SV40 polyadenylation signal and two ITRs was used, and the total nucleotide length of the Trx2-C3 fusion protein is 1,140 bp (SEQ ID NO: One).
  • AAV2 rep-cap plasmid DNA pAAV2-R2C2 plasmid, Stratagene Co., Ltd. USA
  • adenovirus helper plasmid pHelper plasmid, Stratagene Co., USA
  • HEK293 human embryonic kidney 293; ATCC CRL-1573 cells were transfected with all three types of plasmid DNAs (pAAV-Trx2-C3, pAAV-R2C2, and pHelper), cultured for 72 hours, and HEK293 cells were Pooled and sonicated, recombinant AAV (rAAV) particles were subjected to CsCl density gradient centrifugation to obtain AAV2-Trx2-C3 vectors.
  • rAAV recombinant AAV
  • Trx2-C3 fusion protein was used, and HeLa cells were treated with 10% FBS (Cat# S001-01, WELGENE, Korea) and 1% antibiotics (Cat# LS202-02, WELGENE, Korea). was cultured in DMEM (Cat# LM001-05, WELGENE, Korea) medium.
  • Real-time polymerase amplification reaction (Real-time PCR) was performed to confirm the product produced by introduction of the AAV2-Trx2-C3 viral vector.
  • 293T cells were dispensed in a number of 4.0 ⁇ 10 5 into a 6-well plate, and each virus was introduced at 500 moi.
  • DNase I cat# 18068015, Thermofisher, USA
  • Reverse Transcription Master Premix Cat# EBT-1512, ELPISBIOTECH, Korea
  • real-time polymerase amplification was carried out using Real-Time PCR 2x Master Mix (cat# EBT-1802, ELPISBIOTECH, Korea) proceeded using The reaction was carried out by repeating 95 °C, 3 minutes reaction, 95 °C, 10 seconds, 60 °C, 20 seconds 40 times. After the reaction was completed, the resulting product was confirmed through agarose gel electrophoresis.
  • Primer sets used in the reaction are as follows.
  • HeLa cells were infected with AAV2-Trx2-C3, and expression of the therapeutic gene of Trx2-C3 through transduction was confirmed using a real-time polymerase reaction (FIG. 1).
  • An intraocular pressure glaucoma animal model for observing the therapeutic effect of AAV2-Trx2-C3 prepared in Example 1 was prepared as follows.
  • TonoVet (Reichert Inc., USA) was used to measure intraocular pressure. did
  • the therapeutic agent AAV2-Trx2-C3 (1 ⁇ 10 9 vg/ml, 10 ul) was administered by intracameral injection into the anterior chamber, and intraocular pressure was continuously measured after administration.
  • the intraocular pressure increased by dexamethasone decreased after administration of AAV2-Trx2-C3, and it was confirmed that the reduced intraocular pressure was maintained even one month after administration (FIG. 2).
  • the frozen cut slides were fixed in 4% paraformaldehyde for 30 minutes, washed with PBS, and then stained with Hematoxylin and Eosin to observe changes in TM tissue (FIG. 3). Additionally, immunostaining was performed for alpha smooth muscle actin (alpha-SMA, anti-alpha SMA, ab7817, Abcam) and fibronectin (anti-fibronectin, ab2413, Abcam) to detect changes in TM organization. Observed.
  • FIG. 3 it was confirmed by administration of the AAV2-Trx2-C3 therapeutic vector. It was confirmed that the TM tissue was contracted in the ocular hypertension model induced by dexamethasone, and was expanded by the administration of AAV2-Trx2-C3, and it was confirmed that there was no difference from normal.
  • FIGS. 4A and 4B The cytoskeleton and extracellular matrix immunostaining are shown in FIGS. 4A and 4B.
  • alpha smooth muscle actin and fibronectin were increased in TM tissues, but AAV2-Trx2 It was confirmed that -C3 was decreased in ocular tissue.
  • the ocular hypertension glaucoma animal administered only with dexamethasone was Sham, the group administered AAV2-GFP as a control group in the dexamethasone-induced intraocular hypertension animal model was GFP, and the AAV2-Trx2-C3 group was the control group in the dexamethasone-induced intraocular hypertension animal model.
  • the group administered with was indicated as Trx2-C3.
  • TUNEL-positive cells the degeneration of membrane neurons (TUNEL-positive cells) and the number of ganglion cells in the retina decreased in the ocular hypertension model induced by dexamethasone and the GFP gene control, whereas in the retina administered with AAV2-Trx2-C3, TUNEL-positive cells increased. It decreased to a normal level, and showed the same number of Neu N-positive cells as normal (Figs. 5 and 6).
  • HeLa cells were cultured in DMEM (Cat# LM001-05, WELGENE, Korea) medium supplemented with 10% FBS (Cat# S001-01, WELGENE, Korea) and 1% antibiotics (Cat# LS202-02, WELGENE, Korea) It became. Phalloidin staining was performed to confirm changes in actin stress fibers caused by introduction of the AAV2-Trx2-C3 viral vector. The number of HeLa cells was 8.0 ⁇ 10 4 and dispensed into a 6 well plate, and each virus was introduced at 500 moi. After 72 hours, washing was performed once using PBS, and fixation was performed with 3.7% formaldehyde for 5 minutes.
  • RhoA activity was observed in HeLa cells (Active-RhoA detection).
  • HeLa cells were cultured in the same manner as in Example 6, and Active Rho Detection Kit (Cat# #8820, Cell Signaling Technology) was used to confirm the change of active-RhoA by introduction of scAAV2-Trx2-C3 virus.
  • 1.0 ⁇ 10 6 HeLa cells were seeded in a 100 mm culture dish and infected with the virus at 500 moi. After 48 hours, washing was performed once using PBS, and 700 ul of lysis buffer was added and reacted for 5 minutes.
  • alpha-SMA alpha smooth muscle actin
  • AAV2-Trx2-C3 alpha smooth muscle actin
  • HeLa cells were cultured in the same manner as in Example 6, and 2.0 ⁇ 10 5 HeLa cells were dispensed per well in a 6-well culture dish and infected with scAAV2-Trx2-C3 virus at 500 moi.
  • Primary antibodies include Trx2-C3 fusion protein (ab185544, Abcam), p-cofilin (CST-3313S, Cell signaling), cofilin (SC-376476, Santacruz biotech), alpha-SMA (ab7817, Abcam), ⁇ -actin ( sc-47778, Santacruz biotech) was used, and after reaction, washed with TBST and reacted with secondary antibodies (Anti-rabbit (sc-2357, Sntacruz biotech), Anti-mouse (sc516102, Santacruz biotec) for 1 hour at room temperature , the expression of cofilin and alpha-SMA was confirmed using a chemiluminescence system (Luminograph II, ATTO, Japan), and ROD (related optical density) was measured using Image J, as shown in Figures 9 and 10.
  • Trx2-C3 fusion protein ab185544, Abcam
  • p-cofilin CST-3313S, Cell signaling
  • cofilin SC-3764

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Abstract

본 발명은 AAV2-Trx2-C3 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 녹내장 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 녹내장 치료를 위하여 매일 투여하는 불편한 점과 장기간 점안으로 인한 눈의 부작용을 해소하기 위한 치료방법을 개발하기 위하여, AAV2를 이용한 녹내장 치료제 연구를 진행하였고, 그 결과, 단회 투여로 녹내장을 치료할 수 있는 유전자 치료제를 개발하였다. 생체내 발현될 치료 단백질은 Trx2-C3 융합단백질을 이용하였고, 발현 시스템으로 AAV2를 사용하여 AAV2-Trx2-C3를 개발하였고, 개발된 AAV2-Trx2-C3는 스테로이드로 유도된 고안압 녹내장 모델에서 안압하강 효과를 나타내었으며, 망막 신경절세포의 보호효과를 확인하였다. 이에, 본 발명은 매일 점안하여 치료하는 녹내장 치료를 단회 투여에 의하여 치료가 가능하며, 새로운 녹내장 치료방법을 환자에게 제공할 수 있다.

Description

AAV2-Trx2-C3 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 녹내장 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 아데노 관련 바이러스 2(adeno-associated virus 2; AAV2) 벡터에 탑재된 티오레독신 2(Thioredoxin 2; Trx2) 및 C3 ADP-리보실트랜스퍼레이즈(C3 ADP-ribosyltransferase; C3) 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 녹내장 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
녹내장은 망막신경절세포 및 시신경을 퇴화시켜 실명을 유발하는 질환으로, 안압의 상승은 안방수의 배출이 원활하지 않아 발생한다. 녹내장은 안압이 상승하여 망막 및 시신경 유두에 압력을 가하여, 망막신경절세포가 퇴화되는 질환으로, 당뇨망막병증 및 황반변성과 함께 망막 질환 중 주요 3대 질환의 하나이다. 녹내장은 안압이 원인이며, 고안압(21 mmHg 이상)으로 인한 녹내장은 개방각(Open angle glaucoma) 녹내장과 폐쇄각(closed angle glaucoma) 녹내장으로 나뉘고, 안압이 정상 범위에 있지만 녹내장 증상을 동반하는 정상안압(Normal tension glaucoma) 녹내장이 있다.
녹내장의 발병인자로는 노화, 스테로이드 의약품의 장기간 사용, 당뇨, 심장질환, 고혈압 등 다양한 요인이 있으며, 증상으로는 두통 또는 구토가 있고, 시야 및 시력의 감소 외에 환자가 느끼는 증상은 없다. 급성 녹내장의 경우 눈의 통증이 동반한다. 진단으로는 안압측정기를 이용한 안압확인과 시야 검사 및 동공의 크기를 확인하고, 시신경유두의 함몰 확인에 의한 검사가 있다. 녹내장은 주변시야 (Peripheral vision)가 줄어들며 소실되는 특징을 보이며, 진행될수록 중심시야만 남는다.
현재 녹내장의 치료는 안압을 낮추는 치료제가 대부분이고, 외과적 수술로 안압을 낮추는 수술이 이루어지고 있다. 녹내장은 시력이 손실되면 사실상 치료가 불가능한 질환으로 예방이 최우선이며, 안압의 조절이 중요한 치료방법 중의 하나이다. 안압을 낮추는 치료제는 알파유도체(alpha-adrenergic agonists), 베타차단제(Beta blockers), 탄산탈수효소억제제(Carbonic anhyrase inhibitor), 프로스타글란딘 제제(Prostaglandin), Rho 키나제 억제제(Rho kinase inhibitor)가 점안제로 사용되고 있다. 이러한 치료제들은 모두 대부분 점안제로 하루에 한번에서 두 번 점안 투여를 해야 한다. 이에, 녹내장 치료를 위하여 매일 투여하는 불편한 점과 장기간 점안으로 인한 눈의 부작용을 해소하기 위한 치료방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 티오레독신 2(Thioredoxin 2; Trx2) 유전자 및 C3 ADP-리보실트랜스퍼레이즈(C3 ADP-ribosyltransferase; C3) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 티오레독신 2(Thioredoxin 2; Trx2) 유전자 및 C3 ADP-리보실트랜스퍼레이즈(C3 ADP-ribosyltransferase; C3) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로, Trx2 및 C3 융합단백질을 발현시키는 것을 특징으로 하고, 아데노 관련 바이러스 2(adeno-associated virus 2; AAV2) 기반의 재조합 바이러스성 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 AAV2-Trx2-C3 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 녹내장 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명자들은 녹내장 치료를 위하여 매일 투여하는 불편한 점과 장기간 점안으로 인한 눈의 부작용을 해소하기 위한 치료방법을 개발하기 위하여, AAV2를 이용한 녹내장 치료제 연구를 진행하였고, 그 결과, 단회 투여로 녹내장을 치료할 수 있는 유전자 치료제를 개발하였다. 생체내 발현될 치료 단백질은 Trx2-C3 융합단백질을 이용하였고, 발현 시스템으로 AAV2를 사용하여 AAV2-Trx2-C3를 개발하였고, 개발된 AAV2-Trx2-C3는 스테로이드로 유도된 고안압 녹내장 모델에서 안압하강 효과를 나타내었으며, 망막 신경절세포의 보호효과를 확인하였다. 이에, 본 발명은 매일 점안하여 치료하는 녹내장 치료를 단회 투여에 의하여 치료가 가능하며, 새로운 녹내장 치료방법을 환자에게 제공할 수 있다.
도 1은 AAV2-Trx2-C3의 벡터 모식도와 세포에서 Trx2와 C3의 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 덱사메타손으로 유도된 고안압 모델에서 AAV2-Trx2-C3의 투여에 의하여 안압이 하강된 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 고안압 녹내장 모델에서 섬유주망대(trabecular meshwork)의 변화를 H&E 염색으로 확인한 현미경 사진이다.
도 4는 고안압 녹내장 모델에서 세포 골격과 세포외기질(extracellular matrix)의 증가 및 AAV2-Trx2-C3 치료제 투여로 감소를 관찰한 형광현미경 사진으로, A는 알파 평활근 액틴(alpha-SMA, alpha smooth muscle actin)이며, B는 피브로넥틴(fibronectin) 면역염색 사진이다.
도 5는 마우스 고안압 녹내장 모델에서 망막신경세포의 퇴화와 보호효과를 TUNEL염색으로 관찰한 결과와 정량화한 그래프이다.
도 6는 마우스 고안압 녹내장 모델에서 망막신경절세포의 감소와 보호를 확인하기 위하여 망막신경정세포 마커(Neu N)로 망막을 면역염색한 결과와 정량화한 그래프이다.
도 7은 AAV2-Trx2-C3가 처리된 세포에서 세포골격 단백질(F-actin)의 변화를 팔로이딘(phalloidin)으로 염색한 결과이다.
도 8은 AAV2-Trx2-C3가 처리된 세포에서 RhoA의 활성 억제 효과를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 AAV2-Trx2-C3가 처리된 세포에서 Trx2-C3 fusion protein, p-Cofilin, Cofilin, Beta-actin의 발현을 확인한 western blot 분석과 Cofilin의 인산화를 비교분석한 결과이다.
도 10은 AAV2-Trx2-C3가 처리된 세포에서 알파 평활근 액틴(alpha-SMA, alpha smooth muscle actin)의 발현 억제를 관찰한 western blot 결과와 그래프이다.
이에, 본 발명자들은 녹내장 치료를 위하여, 녹내장의 원인인 안압의 조절에 중점을 두고 개발을 진행했으며, 안압의 조절 방법 중 안방수(Aqueous humor)의 배출을 촉진시킬 수 있는 유전자를 발현시켜 녹내장의 원인인 안압을 낮추고자 하였다.
안방수(Aqueous humor)는 모양체(Ciliary body)의 상피세포에서 생성되고, 배출은 각막과 홍채 사이의 섬유주망대(Trabecular meshwork)로 배출된다. 녹내장의 원인이 되는 안압의 상승은 안방수의 배출이 제대로 이루어지지 않아 발생하며, 이러한 원인은 방수가 배출되는 섬유주망대에 문제가 발생하여 나타날 수 있다. 따라서 섬유주망대의 섬유세포를 조절함으로써 방수의 배출을 촉진하여 안압을 조절할 수 있다.
본 발명은 티오레독신 2(Thioredoxin 2; Trx2) 유전자 및 C3 ADP-리보실트랜스퍼레이즈(C3 ADP-ribosyltransferase; C3) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 상기 Trx2 유전자 및 상기 C3 유전자 사이에 링커가 추가로 포함될 수 있다.
바람직하게는, 상기 Trx2 유전자 및 상기 C3 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 Trx2 및 C3 융합단백질을 발현시킬 수 있다.
본 발명의 치료유전자로는 Trx2 및 C3를 사용하였으며, Trx2는 작은 산화환원 효소로 모든 조직에 존재하고 있으며, 주로 활성산소의 조절을 하며, 미토콘드리아의 막전위 및 활성산소에 의한 세포사멸을 조절한다. 또한, TGF-b에 의한 상피세포의 변형(epithelial-mesenchymal transition, EMT)를 억제하는 것으로도 알려져 있다. C3는 ADP-리보실트랜스퍼레이즈(ADP ribosyltransferase) 중의 하나이며, Bacterial Exoenzyme이다. C3는 RhoA의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 있어서, “발현벡터”는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터, 또는 재조합 레트로바이러스(recombinant retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(recombinant adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 관련 바이러스(recombinant adeno-associated virus, rAAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(recombinant herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(recombinant lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스성 발현벡터일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 재조합 바이러스성 발현벡터는 아데노 관련 바이러스 2(recombinant adeno-associated virus 2; rAAV2)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 1×105 ~ 1×1013 vg/person 용량으로 투여할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> AAV2-Trx2-C3의 제작
Trx2-C3 융합 단백질은 티오레독신 2(Thioredoxin 2; Trx2) 단백질과 C3 ADP-리보실트랜스퍼레이즈(C3 ADP-ribosyltransferase; C3) 단백질을 하나의 단백질로 발현이 되도록 디자인하였다. Trx2는 NCBI의 NM_012473.4를 참고하였고, C3 는 M74038.1을 참고하여 융합 단백질을 디자인하였다.
본 발명에서 사용된 치료유전자의 모식도는 도 1에 나타내었고, 본 발명에서 치료유전자를 발현시키기 위한 아데노 관련 바이러스 혈청형은 type 2를 이용하였다.
pAAV2-Trx2-C3을 제작하기 위해 CMV 프로모터, SV40 폴리아데닐화 시그널 및 두개의 ITR를 함유하는 pAAV-F.IX cis 플라스미드를 이용하였고, Trx2-C3 융합단백질의 뉴클레오티드는 총 1,140 bp이다(서열번호 1).
유전자 치료에 이용되는 재조합 AAV2-Trx2-C3 벡터를 제작하기 위해서는 상기 제작된 pAAV2-Trx2-C3 이외에 AAV2 rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 AAV2 rep-cap 플라스미드 DNA(pAAV2-R2C2 플라스미드, Stratagene Co., USA)와 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드(pHelper 플라스미드, Stratagene Co., USA)가 필요하다. 상기 세 가지 종류의 플라스미드 DNA(pAAV-Trx2-C3, pAAV-R2C2 및 pHelper)를 HEK293(human embryonic kidney 293; ATCC CRL-1573) 세포에 모두 형질감염한 다음, 72시간 배양한 후, HEK293 세포를 모아서 초음파 파쇄하고, 재조합 AAV (rAAV) 입자를 CsCl 밀도구배 원심분리하여, AAV2-Trx2-C3 벡터를 수득하였다.
<실시예 2> AAV-Trx2-C3의 in vitro 발현 시험
Trx2-C3 융합 단백질의 발현을 확인하기 위하여, HeLa 세포를 이용하였고, HeLa 세포는 10% FBS(Cat# S001-01, WELGENE, Korea)와 1% antibiotics(Cat# LS202-02, WELGENE, Korea)가 첨가된 DMEM(Cat# LM001-05, WELGENE, Korea) 배지에서 배양되었다. AAV2-Trx2-C3 바이러스 벡터의 도입에 의한 생성 산물을 확인하기 위해 실시간 중합효소 증폭 반응(Real-time PCR)을 진행하였다. 실시간 중합효소 증폭 반응을 위해 293T 세포를 4.0×105의 수만큼 6 well plate에 분주하고, 각 바이러스는 500 moi로 도입시켰다. 48 시간이 지난 후, TRIzol(Cat# 15596026, Thermofisher, USA) 시약을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. AAV2 유전체에 의한 비특이적 증폭을 억제하기 위해 DNase I(cat#18068015, Thermofisher, USA)을 처리하였다. Reverse Transcription Master Premix(Cat# EBT-1512, ELPISBIOTECH, Korea)를 사용하여 mRNA에 상보적인 cDNA를 합성하고 실시간 중합효소 증폭 반응은 Real-Time PCR 2x Master Mix(cat# EBT-1802, ELPISBIOTECH, Korea)를 이용하여 진행하였다. 반응은 95℃, 3분 반응 후 95℃, 10초, 60℃, 20초를 40회 반복하여 진행하였다. 반응이 종료 후, 생성 산물을 아가로즈 겔 전기영동을 통해 확인하였다. 반응에 사용된 프라이머 세트는 다음과 같다.
C3 transferase (C. Botulinum) 프라이머 (Size: 181 bp)
F-TTTAGAGGTGATGACCCTGCTT, R-TTGGTCTTCCTCCAAATTGC
β-actin (Human) 프라이머 (Size: 106 bp)
F-TGAAGATCAAGATCATTGCTC, R-TGCTTGCTGATCCACATCTG
AAV2-Trx2-C3를 HeLa 세포에 감염 및 형질전달(transduction)을 통한 Trx2-C3 치료유전자 발현을 실시간 중합효소 반응을 이용하여 확인하였다(도 1).
<실시예 3> 고안압 녹내장 모델에서 안압 하강 관찰
실시예 1에서 제작한 AAV2-Trx2-C3의 치료 효과를 관찰하기 위한 고안압 녹내장 동물 모델은 다음과 같이 제작하였다.
마우스(C57BL, 6-7 주령)에 덱사메타손(Dexamethasone)을 10 mg/ml 농도로 매일 하루 두 번 3주 동안 점안하여 고안압을 유도하였고, 안압의 측정은 TonoVet (Reichert Inc., USA)을 사용하였다.
고안압 유도 후, 치료제 AAV2-Trx2-C3(1×109 vg/ml, 10ul)는 안구 전방(anterior chamber)에 주사(Intracameral injection)하여 투여하였고, 투여 후, 지속적으로 안압을 측정하였다. 덱사메타손에 의하여 높아진 안압은 AAV2-Trx2-C3의 투여 후, 하강하였으며, 낮아진 안압은 투여 후 1달에도 유지되는 것을 확인하였다 (도 2).
<실시예 4> AAV2-Trx2-C3에 의한 TM의 조직 변화
고안압에 의한 안구 조직의 변화를 관찰하기 위하여 고안압이 유도된 마우스의 안구를 냉동 고정하고, 냉동 절삭하여 슬라이드를 제작하였다.
냉동 절삭된 슬라이드는 4% 파라포름알데하이드에 30분 고정하였고, PBS로 세척한 다음 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색을 실시하여, TM 조직의 변화를 관찰하였다(도 3). 추가로, 알파 평활근 액틴(Alpha smooth muscle actin; alpha-SMA, anti-alpha SMA, ab7817, Abcam)과 피브로넥틴(Fibronectin; anti-fibronectin, ab2413, Abcam)에 대한 면역 염색을 실시하여 TM 조직의 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, AAV2-Trx2-C3 치료제 벡터의 투여에 의하여 확인하였다. TM 조직은 덱사메타손으로 유도된 고안압 모델에서 수축된 것을 확인할 수 있었으며, AAV2-Trx2-C3의 투여에 의하여 확장되고, 정상과 차이가 없음을 확인하였다.
세포골격 및 세포외 기질 면역염색은 도 4A와 4B에 나타내었으며, 덱사메타손에 의하여 유도된 고안압 모델에서는 TM 조직에서 알파 평활근 액틴(alpha smooth muscle actin) 및 피브로넥틴(fibronectin)이 증가하였으나, AAV2-Trx2-C3가 투여된 안구 조직에서는 감소한 것을 확인하였다. 덱사메타손만 투여된 고안압 녹내장 동물은 Sham으로, 덱사메타손으로 유도된 고안압 동물모델에서 대조군인 AAV2-GFP를 투여한 군은 GFP로, 덱사메타손으로 유도된 고안압 동물모델에서 대조군인 AAV2-Trx2-C3를 투여한 군은 Trx2-C3로 표시하였다.
<실시예 5> 망막 신경절세포 보호효과 관찰
실시예 3의 방법으로 덱사메타손으로 유도된 고안압 마우스모델에서 망막 신경절 세포의 감소 및 보호효과를 관찰하였다. 동결절편으로 제작된 조직슬라이드에서 망막신경세포의 퇴화는 TUNEL 염색(Kit 12156792910, Roche Diagnostics)을 실시하여 퇴화되는 망막신경세포를 확인하였으며, 망막 신경절 세포의 관찰은 Neu N 항체(anti-Neu N antibody, MAB377, Merck)를 이용하여 면역염색을 진행하여 확인하였다.
그 결과, 덱사메타손에 의하여 유도된 고안압 모델 및 GFP gene control에서는 막신경세포의 퇴화(TUNEL 양성 세포)와 망막의 신경절 세포의 수가 감소한 반면, AAV2-Trx2-C3가 투여된 망막에서는 TUNEL 양성 세포가 정상 수준으로 줄어들었고, Neu N 양성 세포가 정상과 같은 수를 보였다(도 5 및 도 6).
<실시예 6> AAV2-Trx2-C3의 세포내 전달에 의한 세포골격 변화
녹내장 치료용 유전자 치료제인 AAV2-Trx2-C3의 세포내 작용을 확인하기 위하여 HeLa 세포를 이용한 세포골격 변화 시험을 진행하였다.
HeLa 세포는 10% FBS(Cat# S001-01, WELGENE, Korea)와 1% antibiotics (Cat# LS202-02, WELGENE, Korea)가 첨가된 DMEM(Cat# LM001-05, WELGENE, Korea) 배지에서 배양되었다. AAV2-Trx2-C3 바이러스 벡터 도입에 의한 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)의 변화를 확인하기 위해 팔로이딘(Phalloidin) 염색을 진행하였다. HeLa 세포를 8.0×104의 수만큼 6 well plate에 분주하고 각 바이러스는 500 moi로 도입시켰다. 72 시간이 지난 후 PBS를 이용하여 세척을 1회 진행하고 3.7% 포름알데하이드로 5분간 고정을 진행하였다. 세척 후 0.2% Triton X-100 용액에 5분간 반응시키고 세척을 진행하였다. 팔로이딘-테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트(Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate; Cat# P1951, Sigma, USA)와 40분간 반응 후 세척을 진행하고 형광현미경을 통해 결과를 분석하였다.
결과는 도 7에 나타내었으며, 혈청의 고갈(starvation)으로 변형된 세포골격 (F-actin)은 AAV2-Trx2-C3의 투여로 변화가 억제되는 것을 확인하였다.
<실시예 7> AAV2-Trx2-C3의 RhoA 활성 억제 확인
AAV2-Trx2-C3의 세포내 기전을 확인하기 위하여 HeLa 세포에서 RhoA의 활성 관찰(Active-RhoA detection)을 진행하였다. HeLa 세포는 실시예 6에서와 같은 방법으로 배양되었고, scAAV2-Trx2-C3 바이러스 도입에 의한 active-RhoA의 변화를 확인하기 위해 Active Rho Detection Kit (Cat# #8820, Cell Signaling Technology)을 사용하였다. 100 mm 배양 접시에 1.0×106의 HeLa 세포를 분주하고 500 moi로 바이러스를 감염시켰다. 48시간이 지난 후, PBS를 이용하여 세척을 1회 진행하고 700 ul의 lysis buffer를 넣어 5분간 반응시켰다. 4℃, 16,000xg에서 15분 동안 원심분리를 진행하고 상층액을 새 튜브에 모았다. Kit에 포함된 glutathione resin과 GST-Rhotekin-RBD를 섞은 튜브에 세포 상층액을 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 과정을 진행 후, 2X SDS sample buffer를 넣어 5분간 끓여 샘플을 준비하였다. 준비된 샘플은 western blot 과정을 통해 검출하였다. 결과는 western blot의 결과를 그래프로 변환하여 도 8에 나타내었다.
< 실시예 8> AAV2 - Trx2 -C3의 RhoA 활성 억제에 의한 cofilin과 alpha- SMA의 조절 확인
녹내장 동물모델에서 AAV2-Trx2-C3의 투여에 의하여 감소가 확인된 alpha-SMA(alpha smooth muscle actin)를 Hela 세포에서 확인하고, RhoA 활성 억제를 통한 세포내 기전을 확인하기 위하여, RhoA의 하위 조절 단백질인 cofilin의 활성과 alpha-SMA의 발현을 Western blot 분석법으로 확인하였다. HeLa 세포는 실시예 6에서와 같은 방법으로 배양되었고, 6 well 배양 접시에 각 well 당 2.0×105의 HeLa 세포를 분주하고 500 moi로 scAAV2-Trx2-C3 바이러스를 감염시켰다. 72시간이 지난 후, PBS를 이용하여 세척을 1회 진행하고 인산화효소 억제제 (phosphatase inhibitor cocktail 3 (Merck, Germany))가 포함된 RIPA buffer (ELPIS-BIOTECH, South Korea)로 단백질을 추출하였다. 단백질의 정량은 Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하였고, 동량의 단백질을 SDS-PAGE gel에 전기영동하고, PVDF membrane에 이동시키고, 3% BSA(Bovine serum albumine)이 포함된 1차 항체를 4℃에서 12시간 반응시켰다. 1차 항체는 Trx2-C3 fusion protein (ab185544 ,Abcam), p-cofilin (CST-3313S, Cell signaling), cofilin (SC-376476, Santacruz biotech), alpha-SMA (ab7817, Abcam), β-actin (sc-47778, Santacruz biotech)을 사용하였고, 반응 후 TBST로 세척하고 실온에서 1시간 동안 2차 항체 (Anti-rabbit(sc-2357, Sntacruz biotech), Anti-mouse(sc516102, Santacruz biotec)로 방응 시켰고, chemiluminescence system (Luminograph II, ATTO, Japan)를 이용하여 cofilin과 alpha-SMA의 발현을 확인하였고, Image J를 이용하여 ROD (related optical density)를 측정하였고, 도 9와 10에 나타내었다. Hela 세포에서 AAV2-Trx2-C3의 투여에 의하여 cofilin의 활성형태인 p-cofilin이 줄어든 것을 확인하였고(도 9), alpha-SMA의 발현이 줄어든 것을 확인하였다(도 10).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 티오레독신 2(Thioredoxin 2; Trx2) 유전자 및 C3 ADP-리보실트랜스퍼레이즈(C3 ADP-ribosyltransferase; C3) 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 유효성분으로 함유하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 상기 Trx2 유전자 및 상기 C3 유전자 사이에 링커가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Trx2 유전자 및 상기 C3 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 Trx2 및 C3 융합단백질을 발현시키는 것을 특징으로 하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 재조합 바이러스성 발현벡터인 것을 특징으로 하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 재조합 바이러스성 발현벡터는 아데노 관련 바이러스 2(adeno-associated virus 2; AAV2)인 것을 특징으로 하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학조성물.
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