KR20160147571A

KR20160147571A - 망막색소변성의 치료

Info

Publication number: KR20160147571A
Application number: KR1020150084494A
Authority: KR
Inventors: 로버트 맥클라렌; 다니엘 리핀스키
Original assignee: 옥스포드 유니버시티 이노베이션 리미티드
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2016-12-23

Abstract

본 발명은 망막색소변성을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

Description

망막색소변성의 치료{TREATMENT OF RETINITIS PIGMENTOSA}

발명의 분야

본 발명은 눈 질병의 유전자요법에서 사용하기 위한 화합물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 망막색소변성(RP)의 치료에서 사용하기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것으로, AAV 벡터는 눈으로의 섬모 신경영양 인자(CNTF)의 전달을 가능케 한다.

발명의 배경

망막색소변성(RP)은 시력의 단계적 감소를 발생시키는 유전적 망막이영양증의 표현형적으로 연관된 그룹이다. RP는 3000-4000명의 사람 당 약 1명이 걸린다.

RP의 초기 증상은 야간 및 주변 시력의 악화를 포함한다. 질병이 진행됨에 따라, 세부 시력, 중심 시력 및 색각이 또한 영향을 받을 수 있다. RP 증상의 발생 연령은 다양하나, 통상적으로 10 내지 30세이며, 악화 속도는 개인마다 다양하다.

RP는 일반적으로 막대 광수용체 세포의 진행성 퇴행에 의해 야기된다. 그러나, 망막 색소 상피(RPE) 및 원뿔 광수용체 세포가 또한 질병의 진행 동안 변성될 수 있다.

뇌-유래 신경영양 인자(BDNF; Okoye, G. et al. (2003) J. Neurosci. 23: 4164-4172), 신경아교세포주-유래 신경영양 인자(GDNF; McGee Sanftner, L.H. et al. (2001) Mol. Ther. 4: 622-629; Buch, P.K. et al. (2006) Mol. Ther. 14: 700-709) 및 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 포함하는 여러 화합물이 망막 뉴런의 보존에서 일부 효능을 갖는 것으로 입증되었다. CNTF는 산화 스트레스 및 실험 녹내장의 모델에서 망막 신경절세포 사멸에 대해 보호적인 것으로 밝혀졌다(Ji, J.Z. et al. (2004) Eur. J. Neurosci. 19: 265-272; Leaver, S.G. et al. (2006) Eur. J. Neurosci. 24: 3323-3332; MacLaren, R.E. et al. (2006) Exp. Eye Res. 83: 1118-1127; Maier, K. et al. (2004) Brain Pathol. 14: 378-387; Pease, M.E. et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 2194-2200).

다수의 연구는 AAV-매개 유전자 전달 후의 CNTF의 지속된 발현이 RP의 설치류 모델에서 수개월의 기간 동안 광수용체 세포체의 보존을 발생시킬 수 있음을 입증하였다(Bok, D. et al. (2002) Exp. Eye Res. 74: 719-735; Schlichtenbrede, F.C. et al. (2003) Gene Ther. 10: 523-527; Liang, F.Q. et al. (2001) Mol. Ther. 3: 241-248). 그러나, RP와 같은 신경변성 장애의 느린-진행 특성, 및 상기 연구의 단기 특성으로 인해, 관찰된 임의의 광수용체 보호가 동물의 생애 전체에 걸쳐 유지될지의 여부, 및 결정적으로 보존된 뉴런이 기능을 유지하는지의 여부가 이전에는 불명확하였다.

또한, 이들 연구는 CNTF 처리가 광수용체의 해부학적 보존을 발생시킨 것을 관찰하였으나, 이들은 CNTF의 AAV-매개 전달이 RP의 치료에서의 임상적 사용에 적절하지 않은 것으로 결론내렸다. 특히, 이들 연구에서 수행된 실험(예를 들어, 망막전위도검사, ERG)은 벡터 투여 후에 시기능의 악화를 나타낸다(Schlichtenbrede, F.C. et al. (2003) Gene Ther. 10: 523-527).

눈으로 CNTF를 전달하기 위한 이전의 대안적 접근법은 CNTF를 생성하는 세포를 함유한 장치를 이용한 캡슐화된 세포 기술을 이용하였다. 이들 접근법에 대한 연구는 중간 기간 동안 광수용체 보존에서 일부 성공을 나타내었으나, 적용된 용량은 너무 적었고, 시기능 보호에서의 효능을 결정하기에는 너무 늦었다(Birch, D.G. et al. Long-term follow-up of patients with retinitis pigmentosa (RP) receiving sustained-release CNTF through intraocular encapsulated cell technology implants. ARVO annual meeting (Seattle, WA, 2013); Birch, D.G. et al. (2013) Am. J. Ophthalmol. 156: 283-292 e281). 또한, 상기 기술은 대상체의 눈에 세포-함유 장치를 이식하는데 유의한 수술 개입을 필요로 하며, 이식물 자체가 안전성 및 면역원성과 관련된 문제가 존재할 수 있다.

RP의 발생을 예방하거나, 질병의 발생 후에 시력을 개선시키기 위한 개선된 요법이 현재 없다. 따라서, 특히 시기능에서의 악화를 예방하거나, 병에 걸린 개인의 시력에서의 개선을 가능케 하기 위해 RP의 치료가 매우 필요하다.

발명의 개요

본 발명자는 CNTF의 AAV-매개 발현이 뮤린 모델에서 광수용체 변성에 대한 장기간의 보호를 부여한다는 것을 밝혀내었다. 본 발명자는 생체 내에서 내재성 형광 원뿔 광수용체의 생존을 정량하기 위해 반복 망막 영상화를 이용하였다. 이러한 신규한 접근법은 시기능에 유해한 효과 없이 광수용체 변성을 중지시키기에 충분히 높은 CNTF의 특정 용량 범위를 확인하기 위해 이용되었다.

놀랍게도, 본 발명자는 또한 생존 원뿔 세포가 기능을 유지하고, 뇌로 정확히 신호를 보내는 것을 입증하였다. 특히, 본 발명자는 눈으로의 CNTF의 AAV-매개 전달의 시기능에 대한 예기치 않은 이로운 효과를 발견하기 위해 시각 피질의 영상화 및 시각적으로 유발된 행동 반응의 평가를 이용하였다.

본 발명자는 클리닉에 방문시 많은 RP 환자의 안구 표현형에 가깝게 모방하여 막대 변성이 이미 확립된 단계에서 원뿔 광수용체를 보존시키기 위해 가변적 투여를 이용하였다. 전기생리학적 기능의 표준 평가와 시각적으로 유도된 행동 시험을 조합함으로써, 본 발명자는 이들의 관찰을 시각 피질에서의 더 높은 신호 처리의 증거와 관련시키면서 장기 CNTF 처리 후에 남아 있는 시기능의 정도를 결정하였다.

요컨대, 본 발명자는 눈으로의 CNTF의 AAV-매개 전달이 시기능의 유지 및 RP의 치료에 임상적으로 적용 가능한 것을 예기치 않게 발견하였다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 망막색소변성을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 망막색소변성을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

AAV 벡터는 임의의 혈청형의 AAV 벡터(예를 들어, 임의의 AAV 혈청형 유전체 및/또는 캡시드 단백질을 포함함)일 수 있으나, 단, 벡터는 눈의 세포를 감염시키거나 형질도입시킬 수 있어야 한다.

한 구체예에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 유전체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 2, 4, 5 또는 8 유전체를 포함한다. 바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 혈청형 2 유전체를 포함한다.

바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 벡터 입자의 형태이다.

한 구체예에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질(AAV2/2); AAV2 유전체 및 AAV5 캡시드 단백질(AAV2/5); 또는 AAV2 유전체 및 AAV8 캡시드 단백질(AAV2/8)을 포함한다. 바람직하게는, AAV 벡터 입자는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질(AAV2/2)을 포함한다.

본 발명의 AAV 벡터 입자는 하나 이상의 자연 발생 AAV의 키메라 유도체, 셔플링(shuffled)된 유도체 또는 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 특히, AAV 벡터 입자는 동일 벡터(즉, 슈도타이핑된 벡터(pseudotyped vector)) 내에 AAV의 다양한 혈청형, 클레이드(clade), 클론 또는 분리물로부터의 캡시드 단백질 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, AAV 벡터는 슈도타이핑된 AAV 벡터 입자의 형태이다.

한 구체예에서, CNTF는 인간 CNTF이다.

또 다른 구체예에서, CNTF-인코딩 뉴클레오티드 서열은 (a) SEQ ID NO:1과 적어도 70% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 및 (b) SEQ ID NO:2와 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:2에 의해 표현되는 단백질의 자연 기능을 실질적으로 보유한다.

또 다른 구체예에서, CNTF-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:2에 의해 표현되는 단백질의 자연 기능을 실질적으로 보유한다.

또 다른 구체예에서, CNTF-인코딩 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2에 의해 표현되는 단백질의 자연 기능을 실질적으로 보유한다.

한 구체예에서, AAV 벡터는 CNTF-인코딩 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 분비 신호 서열을 포함한다. 바람직하게는, 분비 신호 서열은 인간 신경 성장인자(NGF) 분비 신호 서열이다.

한 구체예에서, 분비 신호 서열은 SEQ ID NO:3 또는 7과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 펩티드는 작동 가능하게 연결된 CNTF가 이가 발현되는 세포로부터 분비되는 것을 가능케 한다.

한 구체예에서, AAV 벡터는 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여된다. 바람직하게는, AAV 벡터는 망막하 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여된다. 망막하 주사는 본원에 기재된 2-단계 망막하 주사 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

한 구체예에서, AAV 벡터는 단일 용량으로 대상체로 투여된다.

AAV 벡터는, 예를 들어, mL 당 약 1-2x10¹¹, 1-2x10¹² 또는 1-2x10¹³ 유전체 입자(genome particle)(gp)의 농도로 현탁액 내에 존재할 수 있다. 따라서, 약 2x10¹⁰ gp의 AAV 벡터의 용량이, 예를 들어, mL 당 약 2x10¹² gp의 농도의 약 10 μL 용량의 AAV 벡터를 주사함으로써 투여될 수 있다. 당업자는 필요에 따라 AAV 벡터의 용량, 부피 및 농도를 용이하게 조정할 수 있다.

투여되는 AAV 벡터의 부피는, 예를 들어, 약 1-500 μL, 예를 들어, 약 10-500, 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250, 50-150, 1-100 또는 1-10 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 1, 2, 5, 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 AAV 벡터 조성물의 부피는 약 100 μL이다.

한 구체예에서, AAV 벡터는 눈 당 적어도 2x10⁹, 2x10¹⁰, 2x10¹¹ 또는 2x10¹² gp의 투여량으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 눈 당 약 1-2x10⁹, 1-2x10¹⁰, 1-2x10¹¹ 또는 1-2x10¹² gp의 투여량으로 투여된다. 바람직하게는, AAV 벡터는, 바람직하게는 망막하 주사에 의해 눈 당 약 2x10¹¹ gp의 투여량으로 투여된다.

본 발명자는 본 발명의 AAV 벡터를 이용한 망막색소변성의 치료가, 예를 들어, 생존 원뿔 세포를 보호함으로써 막대 세포 대부분 또는 모두가 변성된 경우에도 효과적(예를 들어, 시기능 유지에 효과적)일 수 있음을 놀랍게도 발견하였다. 따라서, 한 구체예에서, 치료되는 눈은 AAV 벡터의 투여시에 약 1억개, 5000만개, 2000만개, 1000만개, 900만개, 800만개, 700만개, 600만개, 500만개, 400만개, 300만개, 200만개, 100만개, 500000개, 250000개, 100000개 또는 50000개 미만의 막대 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 AAV 벡터의 투여시에 치료되는 눈에 막대 세포가 실질적으로 결여되어 있다. 또 다른 구체예에서, 치료되는 눈은 AAV 벡터의 투여시에 0개의 막대 세포를 포함한다.

한 구체예에서, 망막색소변성으로 인한 광수용체 세포 변성은 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방된다. 광수용체 세포는 원뿔 세포 및/또는 막대 세포, 바람직하게는 원뿔 및 막대 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터의 투여시에 치료되는 눈에 존재하는 광수용체 세포(예를 들어, 원뿔 세포 및/또는 막대 세포)의 수의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 이후에 대상체의 생애에 걸쳐 망막세포변성으로 인해 변성된다.

또 다른 구체예에서, 망막색소변성으로 인한 원뿔 세포 변성은 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방된다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터의 투여시에 치료되는 눈에 존재하는 원뿔 세포의 수의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 이후에 대상체의 생애에 걸쳐 망막색소변성으로 인해 변성된다. 바람직하게는, 생존 세포는 기능성인 채로 남아 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 망막색소변성으로 고통받거나 망막색소변성이 발생할 위험이 있는 대상체에서 광수용체 세포 사멸을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

AAV 벡터, CNTF 및 투여 방식(예를 들어, 방법 및 투여량)은 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.

한 구체예에서, 치료된 눈에서 시기능은 실질적으로 회복되거나 유지된다. 시기능(예를 들어, 본원에 기재된 시기능의 시험에 의해 결정됨)은, 예를 들어, 병에 걸린 눈에서 망막색소변성의 발생 전에 존재하는 것과 대략 동일한 수준으로 회복될 수 있다. 대안적으로, 시기능은, 예를 들어, 망막색소변성이 발생할 위험이 있는 건강한 대상체, 또는 망막색소변성으로 이미 고통받는 대상체에서 대략 동일한 수준으로 유지될 수 있다(예를 들어, 본 발명의 AAV 벡터의 투여 후에 망막색소변성의 결과로서 시기능의 실질적으로 악화가 없거나 추가 악화가 발생하지 않음).

미처리된 채로 남는 경우, 대부분 또는 모든 막대 세포는 망막색소변셩의 결과로서 시간 경과에 따라 변성(예를 들어, 사멸)될 수 있다. 원뿔 세포는 또한 질병의 진행 동안 변성될 수 있다.

한 구체예에서, 망막색소변성으로 인한 광수용체 세포 변성은 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방된다. 광수용체 세포는 원뿔 세포 및/또는 막대 세포, 바람직하게는 원뿔 및 막대 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, AAV 벡터의 투여시에 치료되는 눈에 존재하는 광수용체 세포(예를 들어, 원뿔 세포 및/또는 막대 세포)의 수의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 이후에 대상체의 생애에 걸쳐 막막색소변성으로 인해 변성된다.

한 구체예에서, 치료되는 눈은 AAV 벡터의 투여시 약 1억개, 5000만개, 2000만개, 1000만개, 900만개, 800만개, 700만개, 600만개, 500만개, 400만개, 300만개, 200만개, 100만개, 500000개, 250000개, 100000개 또는 50000개 미만의 막대 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 AAV 벡터의 투여시에 치료되는 눈에 막대 세포가 실질적으로 결여되어 있다. 또 다른 구체예에서, 치료되는 눈은 AAV 벡터의 투여시에 0개의 막대 세포를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 망막색소변성의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공하며, AAV 벡터는 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

AAV 벡터, CNTF, 투여 방식(예를 들어, 방법 및 투여량) 및 효과, 및 치료되는 대상체는 본원에 기재된 바와 같을 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 망막색소변성으로 고통받거나 망막색소변성이 발생할 위험이 있는 대상체에서 광수용체 세포 사멸의 감소에서 사용하기 위한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공하며, AAV 벡터는 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 원뿔 세포 생존 및/또는 기능을 분석하기 위한 유전학적으로 변형된 동물을 제공하며, 상기 동물은 이의 원뿔 세포에 검출 가능한 마커를 포함하도록 유전학적으로 변형되었다.

한 구체예에서, 검출 가능한 마커는 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질이다.

또 다른 구체예에서, 동물은 포유동물, 바람직하게는 마우스이다.

또 다른 구체예에서, 동물은 또한 질병 모델 동물이다. 바람직하게는, 동물은 망막색소변성에 대한 모델을 제공하기 위해 유전학적으로 변형되었고, 예를 들어, 동물은 로돕신의 녹아웃에 대해 동형접합일 수 있다.

도면의 설명
도 1
(a) 반점의 백색 점으로 표시된 원뿔 광수용체를 제시하는 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스 안저의 자가형광(AF) 이미지. (a') 코 혈관 분기(α, 점선)에서의 원뿔 광수용체의 특수한 그룹(β에서 γ로 정렬됨) 및 개별적 원뿔(백색 화살표)을 나타내는 배율 증가 AF 이미지. (b) 망막 혈관구조를 상세히 보여주는 근적외선(NIR) 안저 이미지 및 (b') 코 혈관 분기(α, 점선)를 상세히 보여주는 확대된 NIR 이미지. (c) 렉틴으로 대조염색된 망막 혈관구조를 갖는 편평하게 마운팅된 사후 망막. (c') 코 분기(α, 점선)에서의 원뿔 광수용체(녹색 점)의 분포를 나타내는 망막 편평 마운트의 확대된 이미지. 패널(c')에서의 원뿔의 패턴은 원뿔 광수용체의 특수한 그룹(β에서 γ로 정렬됨) 및 개별적 원뿔(백색 화살표)을 포함하는 생체내 AF 영상화 (a')에 의해 관찰된 것과 정확하게 상관됨을 주목하라. (d-g) 출생후(PW) 8주로부터 PW30까지 고용량의 rAAV2/2.hCNTF로 처리된 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스의 반복 AF 안저 영상화. (d'-g') 각각의 동물의 망막 혈관 수명이 얼마나 되는지 나타내는 확대된 AF 이미지. 원뿔 광수용체(백색 점)는 원뿔 생존의 고도로 재현성 있는 장기적 평가를 가능케 하는 ROI 내에서 정량(적색 점 오버레이)될 수 있다. 생존은 기준선(PW8)에서의 원뿔 광수용체 수의 함수(%)로 표현된다. 모든 축척 막대는 ~100 μm이다. (h) 각각의 처리 그룹에 대해 기준선(PW8)에서 원뿔 광수용체 수의 함수(%)로서 표현된 원뿔 광수용체의 생존: 고용량(어두운 청색), 중간 용량(밝은 청색), 저용량(엷은 청색) 또는 PBS 모의(회색). hCNTF 처리는 원뿔 광수용체 생존에 유의한 영향을 미쳤다: * = p<0.05; ** = p<0.01; *** = p<0.001, 요인으로서 용량 및 시간을 갖는 2원 반복 측정 ANOVA. PW30에서, 고용량 그룹 n=5, 중간 용량 그룹 n=6, 저용량 그룹 n=8.
도 2
PW8 및 PW30에서 고용량 rAAV2/2.hCNTF-처리된 마우스 및 PBS 모의-처리된 마우스의 근적외선 반사율(NIR) 및 자가형광(AF) 안저 영상화. 모의-처리된 대조군은 PW30까지 망막 색소 상피(RPE) 위축(a, c) 및 EGFP-발현 원뿔 광수용체의 손실(b, d)을 나타내는 증가된 반사율의 영역을 나타낸다. 고용량 rAAV2/2.hCNTF 처리된 눈은 동일 기간에 걸쳐 RPE 위축(e, g)의 징후를 나타내지 않고, 원뿔 광수용체의 최소 손실(f, h)을 나타낸다. PW30에서 PBS 모의 처리된(i) 망막의 대표적 조직학은 막대 및 원뿔 광수용체 둘 모두의 부재를 나타낸다. 바깥핵층(ONL) 내의 원뿔(GFP-발현) 및 막대(GFP-발현하지 않음) 광수용체의 보존을 나타내는 PW30에서의 고용량 rAAV2/2.hCNTF 처리된(j-o) 망막의 조직학. (j-k) 원뿔 광수용체(l-o)는 정확한 세포 구획(바깥분절; OS)에서 Mws-옵신(화살표 머리)을 발현하며, 세포체에서 옵신 정위착오(mislocalisation)의 증거는 없다(*).원뿔 광수용체 형태는 막대 변성 후의 다수의 핵 열의 손실로 인해 내핵층(INL)과 RPE 사이의 압축을 나타낸다.
도 3
(a-b) 레이저 스펙클 영상화(LSI)가 510 nm 플리커 자극을 이용한 자극 후 주로 시각 피질에서의 미세혈관 혈류의 변화를 검출하는 것을 나타내는 PW6에서 미처리된 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스에서의 피질 혈류(CBF)에서의 변화. (c) 시각 입력이 자극된 눈에 대측인 반구에 위치된 시각 피질에서 주로 처리됨을 나타내는 마우스에서의 시각 경로의 개략적 표현. 백색 화살표 = 상시상정맥동; 화살표 머리 = 람다; OS = 좌안(좌측); OD = 우안(우측). CBF에서의 변화가 PBS-처리된 눈(d, g) 또는 rAAV2/2.hCNTF-처리된 눈(e, h)의 독립적 자극 후에 PW30에서 (d-e) 중간 용량 및 (g-i) 고용량 처리된 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스에서 시험되었고, 이는 모의 대조군에 비해 고용량 처리된 눈(i)에서 CBF에서 유의한 차이를 나타내었다. ns = 유의하지 않음; * = p<0.05, 윌콕슨 부호-순위 검증. LSI: 고용량 n=3; 중간 용량 n=6.
도 4
(a) 드럼의 회전 방향과 관련한 시각운동 반응(OMR)의 개략적 표현. (b) PW30에서 개별적 마우스로부터의 머리-추적 반응(동물 당 3회 시험)의 수. 오류 = SEM; X = 반응 없음; L = 저용량, M = 중간 용량, H = 고용량 (c) 쌍을 이룬 PBS 모의-처리된 대조군에 비해 중간 용량(밝은 청색) 및 고용량(어두운 청색)으로부터의 유의하게 더 큰 수의 머리 추적을 나타내는 PW30에서의 OMR 시험에 대한 평균 그룹 반응. ns = 유의하지 않음, *** = p<0.001, 1원 ANOVA. 저용량 n=5, 중간 용량 n=6, 고용량 n=4.
도 5
(a) PW30에서 쌍을 이룬 PBS 모의-처리된 대조군(그룹 당 n=4 마우스)에 비한 변경된 유전자 발현을 나타내는 저용량, 중간 용량 및 고용량 rAAV2/2.hCNTF 처리된 마우스로부터의 전사체 산물의 계층적 클러스터링, 여기서 각각의 컬럼의 청색 실선은 기준선(청색 점선)에 비한 배수 변화를 나타낸다. 가장 높은 전사 변화를 갖는 유전자와 관련된 2개의 클러스터가 확대되며; 상부 패널은 이온 운반 및 시각 주기와 관련된 유전자의 하향-조절을 나타내고; 하부 패널은 세린-, 시스테인- 및 금속펩티다제 억제제를 인코딩하는 유전자의 광범위한 상향-조절을 나타낸다. (b) 사이토스케이프에 대한 질의 향상 맵 플러그인(enrichment map plugin for cytoscape)을 이용하여 시각화된 유전체 연구 메타 분석(Genome Search Meta Analysis)(GMSA) 본체론(ontology)을 이용한 유전자 기반 기능의 클러스터링.
도 6
(a) rAAV2/2.hCNTF를 이용한 형질도입 후의 HEK293 세포로부터 흡인된 매질, 또는 (b) rAAV2/2.hCNTF-주사된 눈으로부터의 ELISA에 의한 hCNTF 단백질 수준의 검출, 이는 투여된 벡터 입자의 수를 변경시킴으로써 hCNTF의 확실한 분비 및 용량을 대략적으로 조절하는 능력을 나타낸다. (c-j) PW8로부터 PW30까지 고용량의 rAAV2/2.hCNTF로 처리된 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스의 반복 AF 안저 영상화. (c'-j') 동물의 생애 전체에 걸쳐 일정하게 유지되는 관심 영역(ROI)을 규정하기 위해 어떠한 망막 혈관 기준점이 이용될 수 있는지 나타내는 확대된 AF 이미지. 원뿔 광수용체(백색 점)는 원뿔 생존의 고도로 재현성 있는 장기간의 평가를 가능케 하는 ROI 내에서 정량(적색 점 오버레이)될 수 있다. 생존은 기준선(PW8)에서의 원뿔 광수용체 수의 함수(%)로 표현된다. 모든 축척 막대는 ~100 μm이다. * = p<0.05, 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정; 그룹 당 n=3웰 (a); 그룹 당 n=3 눈 (b).
도 7
(a) 고용량; (b) 중간 용량; 또는 (c) 저용량 rAAV2/2.hCNTF; 또는 (d) PBS 모의의 처리 그룹 각각에 할당된 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스의 대표적 근적외선(NIR) 및 자가형광(AF) 안저 이미지. 용량은 2 μL 부피의 눈 당 투여되는 유전체 입자(gp)로 제공된다. 원뿔 광수용체가 반점의 백색 점으로서 자가형광(AF) 모드 상에서 관찰된다. RPE 위축은 저용량(c vii-viii) 및 PBS 모의(d vi-viii) 처리 그룹에서 특히 이후 시점에서 NIR 영상화에 의해 증가된 밝기의 영역으로 관찰될 수 있다.
도 8
쌍을 이룬 PBS 모의 눈(회색)에 비한 (a) 저용량(엷은 청색), (c) 중간 용량(밝은 청색) 또는 (e) 고용량 rAAV2/2.hCNTF(어두운 청색)로 한 눈에서 처리된 Rho^{-/-TgOPN1LW-EGFP+/-} 마우스의 대표적 망막전위도검사(ERG) 추적. (b, d, f) b-파 진폭을 나타내는 1 Hz 25 cd.s / m² 광자극(30 cd / m² 다염성 백색광 배경)에 반응한 PW8, 10 및 12에서의 광순응 b-파의 측정. 광순응 b-파 진폭은 12주까지 모든 그룹에서 부재하거나 기록 가능한 수준 아래였다. * = p<0.05; ** = p<0.01; *** = p<0.001, 본페로니 사후 보정(Bonferroni post-hoc correction)을 이용한 다수의 t-검정. PW12에서, 고용량 그룹 n=6, 중간 용량 그룹 n=6, 저용량 그룹 n=8.
도 9
(a) PW30에서 개별적 중간 용량 및 고용량-처리된 마우스에 대한 OMR 스코어와 원뿔 광수용체 생존의 상관관계; 실선 = 선형 회귀, 점선 = 95% 신뢰 구간. r²=0.80, F=33, p=0.0004. (b) PBS 모의 대조군에 비한 고용량 처리된 눈에서의 전사체 분석을 나타내는 도표적 표현; 23365개의 전사체(회색 점)가 표준화된 평균 카운트에 비한 log2-배수 변화를 기초로 하여 차별적 발현에 대해 평가되었다. 1533개의 유전자(적색 점)는 쌍을 이룬 모의-처리된 대조군에 비해 고용량 rAAV2/2.hCNTF 처리된 눈에서 유의하게 상이한 발현 수준을 갖는 것으로 관찰되었다.
표 1
유전자 본체론에 의해 그룹화된 선택된 유전자. 유전자 기호(UCSC, mm9), 설명, 배수-변화, log2 배수 변화 및 유의성이 각각의 유전자에 대해 제공된다. 상향조절된 유전자 = 청색 음영; 하향조절 = 적색 음영.

발명의 상세한 설명

본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예는 이제 비제한적인 예에 의해 기재될 것이다.

본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 화학, 생화학, 분자생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당업자의 능력 내이다. 상기 기술은 문헌에서 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press.]을 참조하라. 상기 전반적 문헌 각각은 참조로서 본원에 포함된다.

한 양태에서, 본 발명은 망막색소변성을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 망막색소변성을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

망막색소변성(RP)

망막색소변성(RP)은 일반적으로 막대 광수용체 세포의 진행성 변성에 의해 야기되는 유전성 망막이영양증의 표현형적으로 관련된 그룹이다. 망막 색소 상피(RPE) 및 원뿔 광수용체 세포가 또한 질병의 진행 동안 변성될 수 있다.

RP는 망막의 색소에서의 변화에 의한 임상적 모양을 특징으로 하며, 이는 세동맥 약화 및 시신경 위축을 수반할 수 있다. 망막에서의 변화는 망막 색소의 분산 및 응집으로부터 발생할 수 있다. 이는 과립상 또는 반상으로부터 골소극과 유사한 독특한 국소적 응집의 범위의 모양을 발생시킬 수 있다. 흑색 또는 어두운 갈색의 색소의 성상 농축이 나타날 수 있다. 또한, 망막의 한 사분면에 제한된 색소침착, 디스크로부터 방사상으로 퍼지는 것으로 보이는 이상 및 중증 혈관병증과 관련된 변화가 관찰될 수 있다.

본원에 기재된 RP의 치료 또는 예방은 상기 기재된 RP 표현형의 모양을 감소시키거나 예방할 수 있다. 이는 변성으로부터 광수용체 세포, 예를 들어, 원뿔 세포의 보호를 발생시킬 수 있다. 바람직하게는, 치료는 변성으로부터 원뿔 및 막대 세포 둘 모두를 보호한다.

막대 및 원뿔의 수는 적응 광학, 자가형광 및 광간섭 단층영상(OCT) 스캔과 같은 기술을 이용하여 임상 분야의 당업자에 의해 평가될 수 있다.

바람직하게는, RP의 치료는 시기능에서의 유지 또는 개선을 가능케 한다.

망막의 모양의 시각화 및 시기능의 평가는 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 당업자에 의해 수행될 수 있는 시기능 시험은 최고 교정 시력, 시야 검사, 미세시야검사(microperimetry), 색각, 암순응검사, 망막전위도 및 원뿔 플리커 융합 검정을 포함한다. 본원에서 사용되는 "시기능의 유지 또는 개선"은 치료된 눈의 시력이 본 발명의 방법이 수행되기 전 및 후에 비교되는 경우에 시기능의 하나 이상의 상기 검정에 의해 평가시 시력 수준에서의 실질적으로 동일한 수준의 유지 또는 개선으로 이해되어야 한다.

눈의 구조

본원에 개시된 약제는 망막색소변성(RP)의 치료 또는 예방과 관련하여 포유동물, 바람직하게는 인간 눈으로 전달될 수 있다.

눈의 질병의 치료에서의 당업자는 눈의 구조의 상세하고 충분한 이해를 가질 것이다. 그러나, 본 발명과 특히 관련된 하기 구조가 기재된다.

망막

망막은 눈의 내부 후방에 라이닝되어 있고, 시각적 세상의 이미지를 감지하는 다층막이며, 이는 시신경을 통해 뇌와 소통한다. 눈의 내부로부터 외부로의 순서로, 망막은 감각신경 망막층 및 망막 색소 상피와 함께 망막 색소 상피 외부에 놓여 있는 맥락막을 포함한다.

감각신경 망막 및 광수용체 세포

감각신경 망막은 광을 직접 감지하는 광수용체 세포를 갖는다. 이는 다음과 같은 층을 포함한다: 내경계막(ILM); 신경섬유층; 신경절세포층; 내망상층; 내핵층; 외망상층; 바깥핵층(광수용체의 핵); 외경계막(ELM); 및 막대 및 원뿔의 광수용체(내분절 및 바깥분절).

당업자는 광수용체 세포의 상세한 이해를 가질 것이다. 간단히, 광수용체 세포는 광을 생물학적 신호로 전환시키는 망막에 위치된 특화된 뉴런이다. 광수용체 세포는 망막 전체에 걸쳐 상이하게 분포된 막대 및 원뿔 세포를 포함한다.

막대 세포는 주로 망막의 외부에 걸쳐 분포되어 있다. 이들은 매우 민감하며, 낮은 광 수준에서의 시각을 제공한다. 정상 인간 망막에는 평균 약 1억 2천 5백만개의 막대 세포가 존재한다.

원뿔 세포는 망막 전체에 걸쳐 발견되나, 중추의 고해상도 시각을 담당하는 감각신경 망막 내의 구덩이인 와(fovea) 내에 주로 집중되어 있다. 원뿔 세포는 막대 세포보다는 덜 민감하다. 정상 인간 망막에는 평균 약 6백만 내지 7백만개의 원뿔 세포가 존재한다.

망막 색소 상피

망막 색소 상피(RPE)는 감각신경 망막의 외부에 가까이에 위치된 세포의 색소화된 층이다. RPE는 광수용체 세포로의 영양소 및 다른 물질의 운반, 및 시각을 개선시키기 위한 산란광의 흡수를 포함하는 다수의 기능을 수행한다.

맥락막

맥락막은 RPE와 눈의 외부 공막 사이에 위치된 혈관층이다. 맥락막의 혈관구조는 망막으로의 산소 및 영양소의 공급을 가능케 한다.

섬모 신경영양 인자( CNTF )

섬모 신경영양 인자(CNTF)는 뉴런 및 희소돌기아교세포에 대한 생존 인자인 것으로 밝혀진 폴리펩티드 호르몬 및 신경 성장인자이다. 또한, CNTF는 특정 뉴런 집단에서 신경전달물질 합성 및 신경돌기 증식을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 한 구체예에서, CNTF는 인간 CNTF이다.

한 구체예에서, CNTF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 NCBI 등록 번호 NM_000614로 기탁된 서열이다.

또 다른 구체예에서, CNTF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

한 구체예에서, CNTF의 아미노산 서열은 NCBI 등록 번호 NP_000605로 기탁된 서열이다.

또 다른 구체예에서, CNTF의 아미노산 서열은 하기와 같다:

본 발명의 CNTF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO:1과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:2에 의해 표현되는 단백질의 자연 기능을 실질적으로 보유한다.

본 발명의 CNTF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO:2와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있으며, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2에 의해 표현되는 단백질의 자연 기능을 실질적으로 보유한다.

바람직하게는, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2의 단백질과 비교하여 RP로 고통받거나 RP가 발생할 위험이 있는 대상체에서 (a) RP와 관련된 망막 색소 변화의 임상적 모양; (b) 광수용체(예를 들어, 원뿔 세포, 바람직하게는 원뿔 및 막대 세포) 세포 사멸; 및/또는 (c) 시기능에서의 악화의 유사하거나 더 높은 예방을 제공하는 것을 돕는 단백질을 인코딩한다.

분비 신호 서열

본 발명의 한 구체예에서, AAV 벡터는 CNTF-인코딩 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 분비 신호 서열을 포함한다.

신호 서열은 일반적으로 단백질을 세포의 분비 경로로 표적화하는 단백질의 N-말단의 짧은 펩티드이다. 본원에서 사용되는 "분비 신호 서열"은 세포로부터의 단백질(예를 들어, CNTF)의 분배를 촉진하는 펩티드, 또는 적절한 경우 상기 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

분비 신호 서열의 펩티드는 세포로부터의 이의 분비시 단백질로부터 분해되어 상기 단백질의 성숙 형태를 발생시킬 수 있다.

한 구체예에서, 분비 신호 서열은 인간 신경 성장인자(NGF) 분비 신호 서열이다.

또 다른 구체예에서, 분비 신호 서열은 NCBI 등록 번호 NM_002506으로 기탁된 NGF 뉴클레오티드 서열의 신호 서열(예를 들어, 상기 등록 번호로 기탁된 mRNA의 뉴클레오티드 170-223에 해당하는 서열)이다.

또 다른 구체예에서, 분비 신호 서열은 하기와 같다:

또 다른 구체예에서, 분비 신호 서열은 하기와 같다:

본 발명의 분비 신호 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO:3 또는 7과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 펩티드는 작동 가능하게 연결된 CNTF가 이가 발현되는 세포로부터 분비되는 것을 가능케 한다.

"작동 가능하게 연결된"은 개별적 성분이 이들의 기능을 실질적으로 방해받지 않고 수행하는 것을 가능케 하는 방식으로 개별적 성분이 함께 연결되는 것으로 이해되어야 한다(예를 들어, 세포로부터 관심 뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단백질의 분비를 촉진하기 위해 분비 신호 서열이 관심 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있거나; 세포에서의 관심 뉴클레오티드의 발현을 촉진하기 위해 프로모터가 관심 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있다).

SEQ ID NO:8 및 9는 각각 인간 CNTF 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 NGF 분비 신호 서열의 예시적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 해당한다.

본 발명의 한 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO:8과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 단백질은 SEQ ID NO:9에 의해 표현되는 단백질의 자연 기능을 실질적으로 보유한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, AAV 벡터는 SEQ ID NO:9와 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:9에 의해 표현되는 단백질의 자연 기능을 실질적으로 보유한다.

벡터

벡터는 한 환경으로부터 또 다른 환경으로의 존재물의 전달을 가능케 하거나 촉진하는 도구이다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절인자를 포함할 수 있다.

아데노 -관련 바이러스( AAV ) 벡터

본 발명의 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 벡터 입자의 형태이다.

바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어, AAV로부터 유래된 것을 제조하고 변형시키는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 당업자에 의해 필요 목적에 대해 용이하게 적합화될 수 있다.

AAV 벡터는 AAV 유전체 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.

AAV 유전체는 AAV 입자의 생성에 필요한 기능을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이들 기능은 AAV 유전체의 AAV 입자로의 캡시드화를 포함하는 숙주 세포에서의 AAV의 복제 및 패키징 주기에서 작용하는 기능을 포함한다. 자연 발생 AAV는 복제-결여되어 있으며, 복제 및 패키징 주기의 완성을 위해 트랜스의 헬퍼 기능의 공급에 의존한다. 따라서, 본 발명의 벡터의 AAV 유전체는 통상적으로 복제-결여되어 있다.

AAV 유전체는 양성 또는 음성-센스의 단일-가닥 형태일 수 있거나, 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다. 이중-가닥 형태의 이용은 표적 세포에서의 DNA 복제 단계의 우회를 가능케 하며, 따라서 트랜스진(transgene) 발현을 가속화시킬 수 있다.

AAV 유전체는 AAV의 임의의 자연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드로부터 유래될 수 있다. 따라서, AAV 유전체는 자연 발생 AAV의 전체 유전체일 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 자연 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.

일반적으로, AAV는 이들의 혈청형과 관련하여 언급된다. 혈청형은 캡시드 표면 항원의 발현의 프로파일로 인해 다른 변이체 아종과 구별하기 위해 이용될 수 있는 특이한 반응성을 갖는 AAV의 변이체 아종에 해당한다. 통상적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 특이적인 중화 항체와 유효하게 교차 반응하지 않는다.

AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 최근에 영장류 뇌로부터 확인된 재조합 혈청형, 예를 들어, Rec2 및 Rec3을 포함한다. 이들 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형이 본 발명에서 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, AAV 벡터 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2 또는 Rec3 AAV 벡터 입자이다.

본 발명에서 사용하기 위한 AAV의 바람직한 혈청형은 AAV2이다.

본 발명에서 사용하기 위한 특히 관심있는 다른 혈청형은 눈의 조직, 예를 들어, 망막 색소 상피를 효과적으로 형질도입시키는 AAV4, AAV5 및 AAV8을 포함한다.

AAV 혈청형의 개관은 문헌[Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310 and Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27]에서 발견될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함하는 AAV 유전체의 서열 또는 AAV 유전체의 요소의 서열은 AAV 전체 유전체 서열에 대해 하기 등록 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-관련 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-관련 바이러스 2 NC_001401; 아데노-관련 바이러스 3 NC_001729; 아데노-관련 바이러스 3B NC_001863; 아데노-관련 바이러스 4 NC_001829; 아데노-관련 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-관련 바이러스 6 NC_001862; 조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.

AAV는 또한 클레이드 또는 클론과 관련하여 언급될 수 있다. 이는 자연 유래 AAV의 계통발생학적 관계, 및 통상적으로 공통의 조상으로 역 추적될 수 있는 AAV의 계통발생학적 그룹을 나타내며, 이들의 모든 자손을 포함한다. 또한, AAV는 특정 분리물, 즉, 자연에서 발견되는 특정 AAV의 유전적 분리물과 관련하여 언급될 수 있다. 용어 유전적 분리물은 다른 자연 발생 AAV와 제한된 유전적 혼합을 겪음으로써 유전적 수준에서 인지 가능하게 다른 집단을 규정하는 AAV의 집단을 기재한다.

당업자는 이들의 공통의 일반적 지식을 기초로 하여 본 발명에서 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 클레이드, 클론 또는 분리물을 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전적 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 입증되는 바와 같이 영장류 원뿔 광수용체를 효과적으로 형질도입시키는 것으로 밝혀졌다(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).

AAV 혈청형은 AAV 바이러스의 감염(또는 향성)의 조직 특이성을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여되는 AAV에서 사용하기에 바람직한 AAV 혈청형은 눈 내에서 표적 세포의 높은 감염효율지수 또는 이에 대한 자연 향성을 갖는 혈청형이다. 한 구체예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 AAV 혈청형은 감각신경 망막, 망막 색소 상피 및/또는 맥락막의 세포를 감염시키는 혈청형이다.

통상적으로, AAV의 자연 유래 혈청형, 분리물 또는 클레이드의 AAV 유전체는 적어도 하나의 역방위 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능성 복제 기점을 제공하고, 벡터의 통합 및 세포의 유전체로부터의 절제를 가능케 하기 위해 시스(cis) 작용한다. 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 ITR 서열이 CNTF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 측접한다. AAV 유전체는 통상적으로 AAV 입자에 대한 패키징 기능을 인코딩하는 패키징 유전자, 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 포함한다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 이들의 변이체 중 하나 이상을 인코딩한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예를 들어, VP1, VP2 및 VP3 또는 이들의 변이체를 인코딩한다. 이들 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변이체는 하기에 논의된다.

프로모터가 패키징 유전자 각각에 작동 가능하게 연결될 것이다. 상기 프로모터의 특정 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다(Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 rep 유전자를 발현시키기 위해 일반적으로 사용되는 한편, p40 프로모터는 cap 유전자를 발현시키기 위해 일반적으로 사용된다.

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 벡터에서 사용되는 AAV 유전체는 따라서 자연 발생 AAV의 전체 유전체일 수 있다. 예를 들어, 전체 AAV 유전체를 포함하는 벡터가 시험관 내에서 AAV 벡터 또는 벡터 입자를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 상기 벡터는 원칙적으로는 환자에 투여될 수 있으나, 이는 실제로는 드물게 수행될 것이다. 바람직하게는, AAV 유전체는 환자로의 투여 목적을 위해 유도체화될 것이다. 상기 유도체화는 당 분야에서 표준이며, 본 발명은 AAV 유전체의 임의의 공지된 유도체, 및 당 분야에 공지된 기술을 적용시킴으로써 생성될 수 있는 유도체의 사용을 포함한다. AAV 유전체 및 AAV 캡시드의 유도체화는 상기 참조된 문헌[Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99, 및 Choi et al. and Wu et al.]에 개관되어 있다.

AAV 유전체의 유도체화는 생체 내에서 본 발명의 벡터로부터의 트랜스진의 발현을 가능케 하는 AAV 유전체의 임의의 트렁케이션되거나 변형된 형태를 포함한다. 통상적으로, 최소의 바이러스 서열을 포함하나, 상기 기능을 보유하는 AAV 유전체를 유의하게 트렁케이션시키는 것이 가능한다. 이는 야생형 바이러스를 갖는 벡터의 재조합의 위험을 감소시키고, 또한 표적 세포 내의 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의한 세포 면역 반응을 촉발시키는 것을 피하는 안전성 이유로 바람직하다.

통상적으로, 유도체는 적어도 하나의 역방위 말단 반복 서열(ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예를 들어, 2개의 ITR 또는 그 초과를 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상은 다양한 혈청형을 갖는 AAV 유전체로부터 유래될 수 있거나, 이는 키메라 또는 돌연변이 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이 ITR은 trs(말단 분해 부위)의 결실을 갖는 것이다. 이러한 결실은 유전체의 지속된 복제를 가능케 하여 코딩 및 상보성 서열 둘 모두를 함유하는 단일-가닥 유전체, 즉, 자가-상보성 AAV 유전체를 생성시킨다. 이는 표적 세포의 DNA 복제의 우회를 가능케 하고, 따라서 가속화된 트랜스진 발현을 가능케 한다.

하나 이상의 ITR은 바람직하게는 어느 한 말단에서 CNTF를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 측접할 것이다. 하나 이상의 ITR의 포함은, 예를 들어, 숙주 세포 DNA 중합효소의 작용에 의해 단일-가닥 벡터 DNA의 이중-가닥 DNA로의 전환 후에 숙주 세포의 핵에서 본 발명의 벡터의 콘카타머(concatamer) 형성을 돕는데 바람직하다. 상기 에피솜 콘카타머의 형성은 숙주 세포의 생애 동안 벡터 작제물을 보호함으로써 생체 내에서 트랜스진의 장기간 발현을 가능케 한다.

바람직한 구체예에서, ITR 요소는 유도체 내에서 자연 AAV 유전체로부터 유지된 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 자연 유전체의 rep 및/또는 cap 유전자 및 자연 유전체의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 상기 기재된 이유로 바람직하며, 또한 숙주 세포 유전체로의 벡터의 통합 가능성을 감소시키는데 바람직하다. 또한, AAV 유전체의 크기를 감소시키는 것은 트랜스진에 더하여 벡터 내에 다른 서열 요소(예를 들어, 조절 요소)를 혼입시키는데 있어서 증가된 유연성을 가능케 한다.

따라서, 본 발명의 유도체에서 다음과 같은 부분이 제거될 수 있다: 1개의 역방위 말단 반복(ITR) 서열, 복제(rep) 및 캡시드(cap) 유전자. 그러나, 일부 구체예에서, 유도체는 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 AAV 유전체의 다른 바이러스 서열을 추가로 포함할 수 있다. 자연 발생 AAV는 인간 유전체 19 상의 특정 부위에 높은 빈도로 통합되며, 아주 약간의 빈도의 무작위 통합을 나타내며, 벡터 내에서의 통합 능력의 보유가 치료 환경에서 용인될 수 있다.

유도체가 캡시드 단백질, 즉, VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 자연 발생 AAV의 키메라 유도체, 셔플링된 유도체 또는 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일 벡터(즉, 슈도타이핑된 벡터(pseudotyped vector)) 내에 AAV의 다양한 혈청형, 클레이드, 클론 또는 분리물로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포함한다.

키메라 유도체, 셔플링된 유도체 또는 캡시드-변형된 유도체는 통상적으로 바이러스 벡터에 대해 하나 이상의 요망되는 기능을 제공하도록 선택될 것이다. 따라서, 이들 유도체는 자연 발생 AAV 유전체를 포함하는 AAV 벡터, 예를 들어, AAV2의 AAV 벡터에 비해 증가된 유전자 전달의 효율, 감소된 면역원성(체액성 또는 세포성), 특정 세포 유형의 변경된 향성 범위 및/또는 개선된 표적화를 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 증가된 효율은 세포 표면에서의 개선된 수용체 또는 공동-수용체 결합, 개선된 내재화, 세포 내 및 핵으로의 개선된 트래피킹(trafficking), 바이러스 입자의 개선된 탈외피 및 단일-가닥 유전체의 이중-가닥 형태로의 개선된 전환에 의해 달성될 수 있다. 증가된 효율은 또한 특정 세포 집단의 변경된 향성 범위 또는 표적화에 관한 것일 수 있으며, 벡터 용량은 이가 필요하지 않은 조직으로의 투여에 의해 희석되지 않는다.

키메라 캡시드 단백질은 자연 발생 AAV 혈청형의 2개 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 발생된 것을 포함한다. 이는, 예를 들어, 하나의 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열이 상이한 혈청형의 캡시드 서열과 공동-트랜스펙션되는 마커 구조 접근법에 의해 수행될 수 있으며, 요망되는 특성을 갖는 캡시드 서열을 선택하기 위해 직접 선택이 이용된다. 다양한 혈청형의 캡시드 서열은 신규한 키메라 캡시드 단백질을 생성시키기 위해 세포 내에서 상동성 재조합에 의해 변경될 수 있다.

키메라 캡시드 단백질은 또한 2개 이상의 캡시드 단백질 사이, 예를 들어, 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질 사이에 특정 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특정 아미노산 잔기를 전달하도록 캡시드 단백질 서열을 공학 처리함으로써 발생된 것을 포함한다.

셔플링된 캡시드 단백질 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링 또는 오류-빈발 PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련된 AAV 유전자의 서열, 예를 들어, 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열을 무작위로 단편화시키고, 이후 서열 상동성 영역에서 교차를 또한 야기시킬 수 있는 자가-프라이밍 중합효소 반응에서 상기 단편을 재어셈블리시킴으로써 생성될 수 있다. 여러 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링시킴으로써 상기 방식으로 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리는 요망되는 기능을 갖는 바이러스 클론을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 유사하게, 이후에 요망되는 특성에 대해 선택될 수 있는 다양한 라이브러리의 변이체를 생성시키기 위해 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이시키기 위해 오류 빈발 PCR이 이용될 수 있다.

캡시드 유전자의 서열은 또한 자연의 야생형 서열과 관련하여 특정 결실, 치환 또는 삽입을 도입시키기 위해 유전학적으로 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 열린해독틀 내, 또는 캡시드 코딩 서열의 N-말단 및/또는 C-말단에 관련되지 않은 단백질 또는 펩티드의 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다.

관련되지 않은 단백질 또는 펩티드는 유리하게는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용함으로써 표적 세포에 대한 개선된 결합을 부여하거나, 특정 세포 집단으로의 벡터의 표적화의 특이성을 개선시키는 것일 수 있다. 예로는 망막 색소 상피에서 흡수를 차단함으로써 주위 망막 조직의 형질도입을 향상시키는 RGD 펩티드의 사용을 포함할 수 있다(Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048). 관련되지 않은 단백질은 또한 생성 과정의 일부로서 바이러스 입자의 정제를 돕는 것, 즉, 에피토프 또는 친화성 태그일 수 있다. 삽입 부위는 통상적으로 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어, 바이러스 입자의 내재화, 트래피킹을 간섭하지 않도록 선택될 것이다. 당업자는 이들의 공통의 일반적인 지식을 기초로 하여 삽입에 적합한 부위를 확인할 수 있다. 특정 부위가 상기 참조된 문헌[Choi et al.]에 개시되어 있다.

본 발명은 자연 AAV 유전체의 것과 상이한 순서 및 입체형태의 AAV 유전체의 서열의 제공을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자의 또 다른 바이러스로부터의 서열 또는 하나 초과의 바이러스로부터의 서열로 구성된 키메라 유전자에 의한 대체를 포함한다. 상기 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 2개 이상의 관련 바이러스 단백질로부터의 서열로 구성될 수 있다.

본 발명의 벡터는 AAV 유전체 또는 이의 유도체를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 CNTF 트랜스진 또는 이의 변이체를 인코딩하는 서열의 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 AAV 입자는 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 유전체 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드에 패키징되는 트랜스캡시드화 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 입자는 또한 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 변형되지 않은 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 캡시드를 구성하는 모자이크 형태를 포함한다. AAV 입자는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 갖는 화학적으로 변형된 형태를 포함한다. 예를 들어, 상기 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화시키기 위한 항체를 포함할 수 있다.

따라서, 예를 들어, 본 발명의 AAV 입자는 AAV2 유전체 및 AAV2 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/2), AAV2 유전체 및 AAV5 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/5) 및 AAV2 유전체 및 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 것(AAV2/8)을 포함한다.

프로모터 및 조절 서열

본 발명의 벡터는 또한 시험관 내 또는 생체 내에서 CNTF 트랜스진의 발현을 가능케 하는 요소를 포함할 수 있다. 이들은 발현 조절 서열로 언급될 수 있다. 따라서, 벡터는 통상적으로 트랜스진을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열을 포함함)을 포함한다.

임의의 적합한 프로모터가 이용될 수 있으며, 이의 선택은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 항시적으로 활성(즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 작동성)일 수 있거나, 대안적으로 특정 숙주 세포 환경에서만 활성일 수 있어, 이에 따라 특정 세포 유형에서의 트랜스진의 표적화된 발현을 가능케 할 수 있다(예를 들어, 조직-특이적 프로모터). 프로모터는 또 다른 요인, 예를 들어, 숙주 세포 내에 존재하는 요인의 존재에 반응하여 유도성 발현을 나타낼 수 있다. 임의의 사건에서, 벡터가 요법을 위해 투여되는 경우, 프로모터는 표적 세포 배경에서 기능성인 것이 바람직하다.

일부 구체예에서, 트랜스진이 망막 세포 집단에서만 발현되는 것을 가능케 하기 위해 프로모터가 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은, 예를 들어, 감각신경 망막 및 막막 색소 상피의 세포로만 제한된 망막-세포 특이적일 수 있다.

바람직한 프로모터는 임의로 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서 요소와 조합된 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 예시적 프로모터는 하이브리드 CBA/CAG 프로모터, 예를 들어, rAVE 발현 카세트(GeneDetect.com)에서 사용되는 프로모터이다. 본 발명에서 사용하기 위한 추가의 예시적 프로모터는 하기 서열을 갖는다:

망막-특이적 유전자 발현을 유도하는 인간 서열을 기초로 한 프로모터의 예는 막대 및 원뿔에 대한 로돕신 키나제(Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), 원뿔만에 대한 PR2.1(Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) 및/또는 망막 색소 상피에 대한 RPE65(Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9)를 포함한다.

본 발명의 벡터는 또한 전사전 또는 전사후에 작용할 수 있는 하나 이상의 추가 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 자연 트랜스진 유전자좌의 일부일 수 있거나, 이종성 조절 서열일 수 있다. 본 발명의 벡터는 자연 트랜스진 전사물로부터의 5'-UTR 또는 3'-UTR의 일부를 포함할 수 있다.

조절 서열은 트랜스진의 발현을 촉진시키는, 즉, 전사물의 발현을 증가시키거나, mRNA의 핵 유출을 개선시키거나, mRNA의 안정성을 향상시키는 작용을 하는 임의의 서열이다. 상기 조절 서열은, 예를 들어, 인핸서 요소, 조절후 요소 및 아데닐중합체형성 부위를 포함한다. 바람직한 아데닐중합체형성 부위는 하기 제시된 바와 같을 수 있는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호이다:

본 발명의 벡터의 상황에서, 상기 조절 서열은 시스-작용할 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 추가의 유전적 작제물에 위치된 트랜스-작용 조절 서열의 사용을 포함한다.

본 발명의 벡터에서 사용하기 위한 바람직한 조절후 요소는 우드척 간염 조절후 요소(woodchuck hepatitis postregulatory element)(WPRE) 또는 이의 변이체이다. WPRE의 예시적 서열은 하기 제시된다:

본 발명은 WPRE이 없는 벡터에 비해 트랜스진의 발현을 증가시키는 WPRE의 임의의 변이체 서열의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 서열은 이의 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO:6과 적어도 70%의 상동성, 더욱 바람직하게는 이의 전체 서열에 걸쳐 SEQ ID NO:6과 75%, 80%, 85%, 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 96% 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 나타낸다.

본 발명의 벡터에서 이용될 수 있는 또 다른 조절 서열은 스캐폴드-부착 영역(SAR)이다. 추가의 조절 서열은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.

투여 방법

본 발명의 한 구체예에서, AAV 벡터는 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여된다.

당업자는 개별적 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 친숙할 것이며, 개별적 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사를 잘 수행할 수 있을 것이다.

바람직하게는, AAV 벡터는 망막하 주사에 의해 투여된다.

망막하 주사

망막하 주사는 망막하 공간, 즉, 감각신경 망막 아래로의 주사이다. 망막하 주사 동안, 주사되는 물질은 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE) 층으로 향하며, 이들 사이에 공간을 발생시킨다.

주사가 작은 망막절개술을 통해 수행되는 경우, 망막 박리가 발생될 수 있다. 주사된 물질에 의해 발생되는 망막의 분리된 부푼 층은 "수포"로 언급된다.

망막하 주사에 의해 발생된 구멍은 주사된 용액이 투여 후에 유리체강으로 유의하게 역류되지 않도록 충분히 작아야 한다. 상기 역류는 약물이 주사되는 경우에 특히 문제가 되는데, 이는 약물의 효과가 표적 구역으로부터 떨어져 향하게 되기 때문이다. 바람직하게는, 주사는 감각신경 망막 내에 자가-밀봉 진입점을 발생시키며, 즉, 주사 바늘이 제거된 후, 바늘에 의해 발생된 구멍은 이러한 구멍을 통해 매우 적은 주사 물질이 방출되거나 실질적으로 주사 물질이 방출되지 않도록 재밀봉된다.

상기 과정을 촉진하기 위해, 전문적인 망막하 주사 바늘이 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, DORC 41G Teflon 망막하 주사 바늘, Dutch Ophthalmic Research Center International BV, Zuidland, The Netherlands). 이들은 망막하 주사를 수행하도록 설계된 바늘이다.

주사 동안 망막에 대한 손상이 발생하지 않고, 충분히 작은 바늘이 사용되는 한, 실질적으로 모든 주사된 물질은 박리된 감각신경 망막과 국소화된 망막 박리 부위의 RPE 사이에 국소화된 채로 남아 있는다(즉, 유리체강으로 역류되지 않는다). 게다가, 단기간에 걸친 수포의 통상적인 지속은 일반적으로 주사된 물질의 유리체로의 누출이 거의 존재하지 않는 것을 나타낸다. 수포는 주사된 물질이 흡수됨에 따라 장기간에 걸쳐 사라질 수 있다.

예를 들어, 광간섭 단층영상을 이용한 눈, 특히 망막의 시각화가 수술전에 이루어질 수 있다.

2-단계 망막하 주사

본 발명의 벡터는 국소화된 망막 박리가 첫번째 용액의 망막하 주사에 의해 발생되는 2-단계 방법을 이용하여 증가된 정확성 및 안전성으로 전달될 수 있다. 첫번째 용액은 벡터를 포함하지 않는다. 이후, 첫번째 망막하 주사에 의해 발생된 수포의 망막하 유체로 벡터를 포함하는 약물을 전달하기 위해 두번째 망막하 주사가 이용된다. 약물을 전달하는 주사는 망막을 박리시키는데 사용되지 않으므로, 특정 부피의 용액이 이러한 두번째 단계로 주사될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, (a) 망막을 적어도 부분적으로 박리시켜 망막하 수포를 형성시키기에 효과적인 양으로 용액을 망막하 주사에 의해 대상체에 투여(여기서, 상기 용액은 벡터를 포함하지 않음)하고; (b) 망막하 주사에 의해 약물 조성물을 단계 (a)에 의해 형성된 수포에 투여(여기서, 약물은 벡터를 포함함)함으로써 AAV 벡터가 전달된다.

망막을 적어도 부분적으로 박리시키기 위해 단계 (a)에서 주사되는 용액의 부피는, 예를 들어, 약 10-1000 μL, 예를 들어, 약 50-1000, 100-1000, 250-1000, 500-1000, 10-500, 50-500, 100-500, 250-500 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 μL일 수 있다.

단계 (b)에서 주사되는 약물 조성물의 부피는, 예를 들어, 약 10-500 μL, 예를 들어, 약 50-500, 100-500, 200-500, 300-500, 400-500, 50-250, 100-250, 200-250 또는 50-150 μL일 수 있다. 부피는, 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 주사되는 약물 조성물의 부피는 100 μL이다. 더 많은 부피는 망막을 신장시킬 위험을 증가시킬 수 있는 반면, 더 적은 부피는 관찰하기가 어려울 수 있다.

약물을 포함하지 않는 용액(즉, 단계 (a)의 "첫번째 용액")은 하기에 기재되는 바와 같이 약물을 포함하는 용액과 유사하게 제형화될 수 있다. 약물을 포함하지 않는 바람직한 용액은 평형 염 용액(BSS) 또는 망막하 공간의 pH와 삼투질농도와 매치되는 유사한 완충 용액이다.

수술 동안의 망막 시각화

특정 상황하에서, 예를 들어, 말단-단계 망막 변성 동안, 망막을 확인하는 것은 어려운데, 이는 망막이 얇고, 투명하고, 이 위에 있는 찢어지고 과하게 색소화된 상피를 관찰하기가 어렵기 때문이다. 청색 생체 염료(예를 들어, Brilliant Peel^®, Geuder; MembraneBlue-Dual^®, Dorc)의 사용은 망막 박리 절차(즉, 본 발명의 2-단계 망막하 주사 방법에서 단계 (a))에서 만들어진 망막 구멍의 확인을 촉진시킬 수 있어, 약물이 유리체강으로 역류되는 위험 없이 동일 구멍을 통해 투여될 수 있다.

청색 생체 염료의 사용은 또한 두꺼워진 내경계막 또는 망막앞막이 존재하는 망막의 임의의 영역을 확인하는데, 이는 이들 구조 중 어느 쪽을 통한 주사가 망막하 공간으로의 깔끔한 접근을 방해하기 때문이다. 또한, 수술 직후 기간에서의 이들 구조 중 어느 것에서의 수축은 망막 진입 구멍의 신장을 초래할 수 있으며, 이는 약물의 유리체강으로의 역류를 발생시킬 수 있다.

약학적 조성물 및 주사 용액

본 발명의 약물, 예를 들어, 벡터는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 약물에 더하여 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 안정화제 또는 당 분야에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 상기 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 간섭하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로, 예를 들어, 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.

약학적 조성물은 통상적으로 액체 형태이다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어, 물, 석유, 동물 또는 식물 오일, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리학적 식염수, 마그네슘 클로라이드, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예를 들어, 플루론산(PF68) 0.001%가 이용될 수 있다.

질병 부위의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예를 들어, 소듐 클로라이드 주사액, 링거 주사액 또는 락테이트화 링거 주사액을 이용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가물이 필요에 따라 포함될 수 있다.

지연 방출을 위해, 약물은 느린 방출을 위해 제형화되는 약학적 조성물, 예를 들어, 당 분야에 공지된 방법에 따른 생체적합성 중합체로부터 형성된 미세캡슐 또는 리포솜 담체 시스템 내에 포함될 수 있다.

치료 방법

본 발명의 상황에서 예방에 대한 언급은 예방적 치료와 더욱 일반적으로 관련되나, 치료에 대한 본원의 모든 언급은 치료적, 완화적 및 예방적 치료를 포함함이 인지되어야 한다. 치료는 또한 질병의 중증도에서 진행을 억제하는 것을 포함할 수 있다.

포유동물, 특히 인간의 치료가 바람직하다. 그러나, 인간 및 수의 치료 둘 모두가 본 발명의 범위 내이다.

변이체 , 유도체, 유사체, 동족체 및 단편

본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드에 더하여, 본 발명은 또한 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 이들의 단편의 사용을 포함한다.

본 발명의 상황에서, 임의의 제공된 서열의 변이체는 잔기의 특정 서열(아미노산이거나 핵산 잔기이건 간에)이 당해 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이의 기능을 실질적으로 유지하도록 하는 방식으로 변형된 서열이다. 변이체 서열은 자연 발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 첨가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변화에 의해 획득될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 결과로서 발생된 단백질 또는 폴리펩티드가 이의 내인적 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 유지하도록 하는 조건으로 서열로부터 또는 서열로의 하나(또는 그 초과)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변화, 변형, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함한다.

폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉, 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인적 기능 중 적어도 하나를 갖는 화학적 화합물을 포함한다.

통상적으로, 아미노산 치환은, 예를 들어, 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환으로 이루어질 수 있으나, 단, 변형된 서열은 필요한 활성 또는 능력을 실질적으로 유지해야 한다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 유사체의 사용을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성시키고, 기능적으로 동등한 단백질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 계획적 아미노산 치환은 내인적 기능이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음성으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양성으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.

보존성 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두번째 컬럼 내의 동일 블록, 바람직하게는 세번째 컬럼 내의 동일 라인의 아미노산이 서로 치환될 수 있다:

본원에서 사용되는 용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 특정 상동성을 갖는 존재물을 의미한다. 용어 "동족체"는 "동일성"과 같을 수 있다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로, 동족체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할 수 있고, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동성은 또한 유사성과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본원에 상술된 SEQ ID NO 중 어느 하나에 대한 동일성 퍼센트를 갖는 서열에 대한 언급은 언급된 SEQ ID NO의 전장에 걸친 언급된 동일성 퍼센트를 갖는 서열을 나타낸다.

상동성 비교는 육안, 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 육안에 의해 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 상동성 또는 동일성 백분율을 계산할 수 있다.

상동성 백분율은 연속 서열에 걸쳐 계산될 수 있으며, 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고, 한 서열 내의 각각의 아미노산이 한번에 하나의 잔기로 다른 서열 내의 해당 아미노산과 직접 비교된다. 이는 "갭이 없는" 정렬로 언급된다. 통상적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 비교적 짧은 수의 잔기에 걸쳐서만 수행된다.

이는 매우 간단하고 일치하는 방법이나, 이는, 예를 들어, 서열의 달리 동일한 쌍에서, 뉴클레오티드 서열 내의 하나의 삽입 또는 결실이 다음의 코돈이 정렬에서 빠지게 되어 이에 따라 잠재적으로는 전체적인 정렬이 수행되는 경우 상동성 퍼센트에서의 큰 감소를 발생시킬 수 있다는 것을 고려할 수 없다. 결과로서, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어를 부당하게 불리화시키지 않고 가능한 삽입 및 결실을 고려한 최적 정렬을 발생시키도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화시키기 위해 서열 정렬 내에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.

그러나, 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 대한 "갭 페널티"를 부여하여, 동일한 아미노산의 동일 수에 대해, 2개의 비교된 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 것보다 높은 스코어를 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트 및 갭 내의 각각의 이후의 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과하는 "어파인 갭 코스트(Affine gap cost)"가 통상적으로 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 발생시킬 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 상기 소프트웨어를 이용하는 경우 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 이용하는 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12 및 각각의 신장에 대해 -4이다.

따라서, 최대 상동성 백분율의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 발생을 필요로 한다. 상기 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지(Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 슈트 비교 툴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 이용 가능하다(Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나, 일부 적용에 대해, GCG Bestfit 프로그램을 이용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequences로 언급되는 또 다른 툴이 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 이용 가능하다(FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8 참조).

최종 상동성 백분율은 동일성과 관련하여 측정될 수 있으나, 정렬 과정 자체는 통상적으로 올-오어-낫씽(all-or-nothing) 쌍 비교를 기초로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리(evolutionary distance)를 기초로 하여 스코어를 각각의 쌍을 이룬 비교에 할당하는 스케일드 유사성 스코어 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 일반적으로 이용된다. 일반적으로 사용되는 상기 매트릭스의 예는 BLAST 슈트 프로그램에 대한 디폴트 매트릭스인 BLOSUM62 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공적 디폴트 값 또는 공급된 경우 맞춤 기호 비교 표를 이용한다(추가 세부사항에 대해서는 사용자 메뉴얼 참조). 일부 적용을 위해, GCG 패키지에 대한 공적 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우에서, 디폴트 매트릭스, 예를 들어, BLOSUM62를 이용하는 것이 바람직하다.

소프트웨어가 최적 정렬를 생성한 후, 상동성 백분율, 바람직하게는 서열 동일성 백분율을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 통상적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하며, 숫자상의 결과를 발생시킨다.

전장 CNTF의 "단편"은 또한 변이체이며, 상기 용어는 통상적으로 기능적 또는, 예를 들어, 검정에서 중요한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 나타낸다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 나타낸다.

상기 변이체는 표준 재조합 DNA 기술, 예를 들어, 부위-특이적 돌연변이유발을 이용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어져야 하는 경우, 삽입 부위의 어느 한 측면에서 자연-발생 서열에 해당하는 5' 및 3' 측접 영역과 함께 삽입물을 인코딩하는 합성 DNA가 제조될 수 있다. 측접 영역은 자연 발생 서열 내의 부위에 해당하는 편리한 제한 부위를 함유할 것이며, 이에 서열은 적절한 효소(들)로 절단될 수 있고, 합성 DNA가 상기 절단부로 라이게이션될 수 있다. 이후, DNA는 본 발명에 따라 발현되어 인코딩된 단백질을 제조한다. 이들 방법은 단지 DNA 서열의 조작을 위한 당 분야에 공지된 다수의 표준 기술의 예시이며, 다른 공지된 기술이 또한 이용될 수 있다.

코돈 최적화

본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 WO 1999/41397호 및 WO 2001/79518호에 이전에 기재되었다. 다양한 세포는 이들의 특정 코돈의 사용에 있어서 다양하다. 이러한 코돈 편향은 세포 유형에서의 특정 tRNA의 상대적 과다에서의 편향에 해당한다. 해당 tRNA의 상대적 과다와 일치하도록 맞춤화되도록 서열 내의 코돈을 변경시킴으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 같은 이유로, 해당 rRNA가 특정 세포 유형에서 드문 것으로 공지된 코돈을 일부러 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 추가적인 번역 정도 조절이 이용 가능하다.

실시예

실시예 1

재료 및 방법

마우스 및 마취

모든 동물 실험을 안구 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명(ARVO statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)에 따라 수행하였고, 유효한 영국 내무부 인가 하에서 수행하였다. 로돕신 녹아웃 마우스(C57B/6.129 Rho^tm1Phm, 본원에서 Rho^-/-로 언급됨)는 이전에 기재되었었고(Humphries, M.M. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 216-219), 제인 파라(Jane Farrar)(Trinity College Dublin, Ireland)로부터의 증여로 획득하였다. OPN1LW-EGFP 마우스(C57BL/6J^TgOPN1LW ^- ^EGFP85933Hue, 본원에서 B6^TgOPN1LW ^- ^EGFP로 언급됨)는 이전에 기재되었었고(Fei, Y. et al. (2001) Vis. Neurosci. 18: 615-623), 레이첼 피어슨 박사(Dr Rachel Pearson)(University College London (UCL) Institute of Ophthalmology, London, UK)의 도움으로 돌연변이 마우스 지역 자원 센터(Mutant Mouse Regional Resource Centres)(MMRRC), 미국 국립보건원으로부터 획득하였다. 원뿔 광수용체에서 EGFP를 발현하고, 일차 막대 특이적 변성을 갖는 마우스(Rho^{-/-TgOPN1LW-EGFP+/-})를 B6^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/+마우스(OPN1LW-EGFP 트랜스진 삽입에 대해 동형접합)와 Rho^-/-(표적화된 로돕신 녹아웃에 대해 동형접합)의 교배 후, 모(parental) Rho^-/- 계통으로의 F1 프로제니(Rho^+/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/-)의 역교배를 통해 발생시켰다. 마우스를 AF 영상화에 의해 이유시에 표현형 분석하였고, PCR에 의해 유전형 분석하였다. 모든 마우스를 음식 및 물을 자유롭게 이용 가능하게 하면서 표준 12h:12h 명/암 주기로 사육하였다. 도르미터(Dormitor)(메데토미딘 하이드로클로라이드, 1 mg/kg 체중) 및 케타민(60 mg/kg 체중)의 단일 복막내 주사에 의해 전신 마취를 유도하였고, 동공을 1% 트로피카미드 및 2.5% 페닐에프린 하이드로클로라이드 점안약(둘 모두 Bausch & Lomb, Kingston-Upon-Thames, UK)으로 완전히 확장시켰다. 적절한 경우, 시술 후 안티세단(아티파메졸, 5 mg/kg 체중)의 복막내 주사에 의해 마취를 풀었다.

벡터 작제물

아데노-관련 바이러스 혈청형 2 벡터 백본 플라스미드(pUF11)가 윌리엄 W. 호스워쓰(William W. Hauswirth)(University of Florida, USA)에 의해 제공되었다. 인간 신경 성장인자(NGF; NM_002506) 및 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF; NM_000614)의 cDNA 클론을 Origene(Rockville, MD, USA)으로부터 구입하였다. 각각의 작제물로부터 NGF 분비 신호(센스 프라이머, GTACGCGGCCGCATGTCCATGTTGTTC; 안티센스 프라이머, GCTCTGTGAAAGCTGAGTGTGGTTCC), 및 코작 컨센서스 서열과 동일성을 갖는 번역 시작 코돈 및 주위 서열을 제외한 CNTF 코딩 영역(센스 프라이머, GGAACCACACTCAGCTTTCACAGAGC; 안티센스 프라이머, TCTAGTCGACCTACATTTTCTTG)을 증폭시키기 위해 PCR을 이용하였다. 이후, 2개의 단편을 "시험관내 작제된 엑손을 라이게이션시키기 위한 스위프트 PCR(swift PCR for ligating in vitro constructed exons)"(SPLICE) 반응(Davies, W.L. et al. (2007) Biotechniques 43: 785-789)을 이용하여 조합시키고, 합성 NotI 및 AccI 제한 부위(밑줄)를 이용하여 pUF11 백본으로 라이게이션시켰다. 최종 AAV2.CBA.hCNTF 작제물의 정확도를 둘 모두의 방향의 전장 시퀀싱에 의해 확인하였다.

바이러스 생성 및 적정

CNTF 작제물을 패키징하는 재조합 AAV 혈청형 2(rAAV2/2) 바이러스(rAAV2/2.hCNTF로 언급됨)를 세포 공장(cell factories)(HYPERflask; Corning, Tewksbury, MA, USA)에 시딩된 HEK293 세포의 일시적 공동-트랜스펙션 후, 이전에 보고된 바와 같은 이오딕사놀 구배 원심분리(Zolotukhin, S. (2005) Hum. Gene Ther. 16: 551-557; Jacobson, S.G. et al. (2006) Mol. Ther. 13: 1074-1084)를 이용한 정제에 의해 생성시켰다. 정제된 rAAV2/2.hCNTF 바이러스를 100 μL의 전체 부피로 멸균 인산염 완충 염수(PBS)에 재현탁되기 전에 잔여 이오딕사놀을 제거하는 완충액 교환(Amicon Ultra-15, Millipore, Billerica, MA, USA)에 의해 농축시키고, 미리 블로킹된 튜브(0.01% BSA)로 분취시켰다. 바이러스를 표준으로서 공지된 역가의 벡터 플라스미드 및 바이러스를 이용하여 폴리-A 영역 내의 120 bp 단편을 증폭시키도록 설계된 프라이머를 이용한 정량 PCR(qPCR)에 의해 적정하였다. rAAV2/2.hCNTF 바이러스의 역가는 mL 당 2x10¹³ 유전체 입자(gp)인 것으로 계산되었다.

안구내 주사

4주령 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스의 동공을 상기와 같이 확장시키고, 각막 상의 6 mm 원형 커버 슬립의 위치결정 전에 겔 윤활제(Viscotears, Novartis, Frimley, UK)를 적용시켜, 수술 현미경(M620 F20, Leica, Wetzlar, Germany) 하에서 관찰하는 경우 망막의 우수한 시각화를 가능케 하였다. 10 mm 34-게이지 바늘(65N, Hamilton AG)을 갖는 Hamilton 주사기를 감각신경 망막을 통해 유리체로 경공막적으로 진입시킴으로써 주사를 수행하였다. 2 μL의 벡터 현탁액 또는 완충액(PBS)을 후극에 가깝게 유리체강으로 전달하였고; 바늘을 제거하기 전에 안압을 정상화시킴으로써 역류를 최소화시켰다. 노치 포셉(notched forceps)을 이용하여 상직근을 고정시킴으로써 눈의 방향 및 안정화를 처음부터 끝까지 유지시켰다.

효소 결합 면역흡착 측정법(ELISA)

HEK293 세포를 6-웰 플레이트(웰 당 1x10⁶ 세포)에 시딩하고, 2 μL rAAV2/2.hCNTF(1x10¹³ gp/mL) 바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입 배지 3일 후 수거하고, 제조업체의 설명서에 따라 상업적으로 이용 가능한 인간 CNTF-특이적 ELISA(R&D systems, Abingdon, UK)를 이용하여 검정하였다. hCNTF 발현의 생체 내 평가를 2x10⁸ gp(저용량), 2x10⁹ gp(중간 용량) 또는 2x10¹⁰ gp(고용량) rAAV2/2.hCNTF 벡터를 이용한 출생 4주 후의 (PW4) Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스의 유리체내 주사에 의해 수행하였다. 4주 동안 유전체 통합 및 벡터 발현시켰고, 이 시점에서(PW8) 눈을 수거하고, 액체 질소로 급속 동결시켰다. 안구를 100 μL PBS 중에서 해동시키고, 균질화시킨 후, 상기 언급된 바와 같은 상업적으로 이용 가능한 인간 CNTF-특이적 ELISA(R&D systems, Abingdon, UK)를 이용하여 hCNTF 단백질 수준을 평가하였다.

자가형광 ( AF ) 영상화 및 원뿔 정량

각각의 마우스의 안저를 이전에 기재된 바와 같이 8, 10, 12, 15, 18, 21, 24 및 30주에서 공초점 주사 레이저 검안경(cSLO; Spectralis HRA, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)을 이용하여 영상화시켰다(Charbel Issa, P. et al. (2011) Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.). 간단히, 확장 후, 컨택트 렌즈를 점성 커플링 젤(0.3% w/v 하이프로멜로스, Matindale Pharmaceuticals, Romford, UK)을 이용하여 각막 상에 배치하여, 백내장 형성을 예방하고, 이미지 품질을 개선시키고 표준화시켰다. 마우스를 영상화 플랫폼에 배치하고, 근적외선(NIR) 반사율 모드(820 nm 레이저)를 이용하여 감각신경 망막의 공초점면에 카메라 정렬을 달성하였다. 내재성으로 EGFP를 발현하는 원뿔 광수용체를 55° 렌즈를 이용한 자가형광(AF) 모드(480 nm 여기)를 이용하여 이미지화시키고, 고해상도 이미지(1536 x 1536 픽셀)를 자동화 실시간(ART) 평균화를 이용하여 표준화된 검출기 민감도로 기록하였다. 원뿔 수를 시간 경과에 걸쳐 각각의 눈에 대한 관심 영역을 표준화시키기 위해 망막 하부 내의 혈관 기준점을 이용하여 ImageJ 소프트웨어(Abramoff, M.D. et al. (2004) Biophotonics International 11: 36-42)를 이용하여 각각의 이미지로부터 수작업으로 정량하였다.

망막전위도검사 (ERG)

ERG 기록을 이전에 기재된 바와 같이 PW8, PW10, 및 PW12에서 표준 프로토콜에 따라 Espion E2 시스템(Diagnosys LLC, Cambridge, UK)을 이용하여 수행하였다(Lipinski, D.M., et al. (2011) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52: 6617-6623). 명순응 기간(>10분, 다염성 백색광, 30 cd/m²) 후, 짧은(4 ms) 백색 섬광을 3, 10 및 25 cd.s/m²(강도 당 20 섬광)로 전달하고, Espion 소프트웨어(Diagnosys LLC, Cambridge, UK)를 이용하여 b-파 진폭을 정량하였다.

시각운동 반응(OMR)

속도 및 격자 크기가 정확하게 조절되는 것을 가능케 하는 회전 실린더로 구성된 맞춤 제작 시각운동 시스템을 생성시켰다. 마우스를 드럼의 중간에 상승된 플랫폼에 두고, 밝은 백색 자극(~1000 럭스)에 의해 위로부터 조명을 비추고, 1분 동안 드럼에 순응시키고, 이 동안 드럼은 정지된 상태로 유지되며, 마우스는 플랫폼을 자유롭게 탐색하였다. 각각의 실험 작업은 교대의 30초 기간으로 나누어진 1분의 시계방향 회전 및 1분의 시계 반대방향 회전으로 구성되었다. 실험 작업을 각각의 동물에 대해 각 시점에서 독립적으로 3회 반복하였고, 반응의 수를 평균을 내었다. 사각파 격자의 회전은 머리-추적 반응을 유도하였고, 단일 반응은 드럼의 회전 방향의 느린 머리-추적 이동 후, 중심 위치로의 머리의 신속한 재위치결정으로 구성된다. 회전 드럼에 반응한 각각의 마우스의 거동을 중심 플랫폼 바로 위에 마운팅된 디지털 카메라를 이용하여 기록하였고; 머리-추적 반응의 수를 처리와 관련하여 맹검된 스코어러가 수작업으로 정량하였다.

레이저 스페클 피질 영상화

한쪽 눈에 rAAV2/2.hCNTF 처리가 제공되고, 대측 눈에 PBS 모의 처리가 제공된 30주령 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스(n=4, 고용량; n=6, 중간 용량; n=8 저용량)의 피질을 이미지화시켰다. 양성 대조군은 원뿔 퇴행이 아직 시작되지 않은 연령(6주령)의 동일한 백그라운드의 마우스(n=3)로 구성되었다. 마우스를 8시간 동안 어두운 곳에 적응시킨 후, 영상화시키고, 모든 예비 단계를 흐린 적색 조명 하에서 암실에서 수행하였다. 마우스를 마취시키고, 동공을 상기 기재된 바와 같이 완전히 확장시켰다. 머리를 정위틀에 고정시키고, 두피를 절제하여 시각 피질 상의 두개골을 드러내었다. 경두개 영상화를 스페클 대조 이미저(moorFLIP, Moor instruments, Delaware, USA)를 이용하여 수행하고, 데이터를 25 Hz에서 획득하였다. 심부 체온을 직장 온도측정법에 의해 모니터하고, 실험 동물의 신체 주위에 둘러싸인 피드백 열 패드에 의해 전체에 걸쳐 유지시켰다. 피질 혈류(CBF)에서의 변화를 각각의 눈의 자극 후에 독립적으로 측정하였으며, 대측 눈을 암순응을 유지시키기 위해 전체에 걸쳐 덮었다. 시험되는 눈을 먼저 각각의 마우스에 대해 무작위화시켰고, 연구자는 어떠한 눈이 rAAV.hCNTF 처리를 받았는지에 대해 맹검되었다. 각각의 눈을 1 초 동안 5 Hz에서 14.5 cd 510 ± 3 nm 단색광의 짧은(10 ms) 섬광에 의해 자극하였다(LED 자극이 없는 Grass PS33 광자극기). 자극을 30초의 자극간 간격으로 눈 당 10회 반복(5분의 전체 시간)하였다. 광자극을 시험을 위해 대측 눈으로 즉시 이동시켰고, 이시간 동안 마우스 및 영상화 장치를 정적 상태로 유지시켰다. 데이터를 MATLAB R2012b(버전 8.0.0.783)를 이용하여 처리하였다. 데이터를 5 Hz로 다운-샘플링시킨 후, 관심 영역(ROI)을 양측 시각 피질에 대해 선택하였고, 이로부터 시계열적 변화가 추출되었고, 각각의 ROI 내의 픽셀 상에서 평균이 구해졌다. 개별적 시계열을 이후 Chebyshev 타입 1 필터를 이용하여 평탄화시켰다. 10 s 자극전 기준선 기간에 비한 CBF에서의 백분율 변화를 좌반구 및 우반구에 대해 계산하였다. 양 반구의 반응을 각각의 눈 시험에 대해 합계(대측 + 동측)하고, CBF에서의 크기 변화를 rAAV.hCNTF-처리된 눈과 PBS 모의-처리된 눈 사이에서 비교하였다.

RNA 시퀀싱 및 분석

안락사 후, 뮤린 눈을 적출하고, 액체 질소 상의 RNAlater(Ambion, Paisley, UK)에서 급속 동결시키고, 처리때까지 -80℃에서 저장하였다. 전체 눈을 균질화시키고, 전체 RNA를 추출하였다(RNA tissue mini kit, QIAGEN, Manchester, UK). 오염 DNA를 "컬럼 상" 분해 프로토콜(RNase-Free DNase, QIAGEN, Manchester, UK)에 따른 DNase I 처리에 의해 제거하였다. 아데닐중합체 형성된 mRNA를 자성 분리(NEBNextPoly(A) mRNA 자성 분리 모듈, New England Biolabs, Hitchin, UK)에 의해 샘플 당 2 μg의 전체 RNA로부터 정제하였다. 다음과 같은 변형과 함께 Illumina 키트에 대한 NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set(New England Biolabs, Hitchin, UK)를 이용하여 라이브러리 제조 프로토콜을 수행하였다: 단편화 후 RNA는 추가 세정(Ampure XP, 2.8x 부피비, Ambion, Paisley, UK) 및 세척(2 x 80% 에탄올) 단계를 겪은 후 EB 완충액 중에서 용리되었다. Superscript II(Invitrogen, Paisley, UK)로 역전사(RT)를 수행하였고, RT 후 세정(Ampure XP, 1.2x 부피비) 및 세척(2 x 80% 에탄올) 단계를 수행하였다. cDNA를 말단-복구시키고, A-꼬리 및 어댑터 라이게이션(맞춤 어댑터)시킨 후, PCR 증폭(12주기)시켰다. 제조된 라이브러리를 다중화(4x)시키고, 품질에 대해 평가한 후, 50 bp의 판독 길이로 IlluminaHiSeq 2000 플랫폼 상에서 페어드-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)을 수행하였다. 산출 FASTQ 파일을 품질에 대해 평가하고(SAMStat and FastQC:Read QC), 손질(FASTQ groomer; Blankenberg, D. et al. (2010) Bioinformatics 26: 1783-1785)한 후, 어댑터 제거(Cutadapt)하고, 페어드-엔드 방식으로 참조 유전체(무스 무스쿨루스(Mus musculus), UCSC, mm9.fa)에 정렬시켰다(TopHat for Illumina; Trapnell, C. et al. (2009) Bioinformatics 25: 1105-1111). 인정된 히트(hit)의 산출물을 SAM 포맷(SAM Tools)으로 전환시키고, HiSeq-Count를 이용하여 참조 유전체와의 비교에 의해 히트를 유전체 특징부에 지정하였다. 효과적인 라이브러리 크기에 대한 표준화 및 2%로 설정된 허위발견률(FDR)를 갖는 DESeq R 패키지(Bioconductor)를 이용하여 차별적 발현을 발생시켰다. 차별적으로 발현된 유전자는 발현 수준에서 최소 2배(1 2log-배수) 변화를 갖는 유전자로 간주하였다. RColorBrewer 및 R에 대한 gplots 패키지로 히트맵(heatmap) 산출물을 생성시켰다.

통계

각각의 실험에 대한 전체 데이터 세트에서의 정규성에 대한 앤더슨-달링(Anderson-Darling) 시험은 데이터가 다음과 같은 경우에 정상적으로 분포된 집단으로부터 샘플링된 것을 나타내었다: 생체 내 원뿔 정량, A²=0.509, p=0.1983; 저용량 ERG, A²=0.3402, p=0.4824; 중간 용량 ERG, A²=0.4483, p=0.2785; 고용량 ERG, A²=0.7228, p=0.0594. 각각의 실험 그룹에 대한 잔차 대 적합 평균의 작도는 각각의 그룹 내에서 분산이 동등한 것을 입증하였다(플롯은 제시되지 않음). 인자로서 용량(독립 변수) 및 시간(반복 측정), 및 종속 변수로서 원뿔 수를 이용한 생체 내 원뿔 정량 분석에 반복 측정 2원 ANOVA를 이용하였다. 인자로서 섬광 강도(독립 변수) 및 시간(반복 측정), 및 각각의 경우에 종속 변수로서 명순응 b-파 진폭을 이용한 ERG 반응을 분석하기 위해 반복 측정 2원 ANOVA를 이용하였고, 여기서 각각의 용량은 독립적으로 분석되었다. 정규성은 시각운동 반응 데이터에 대해 확인되지 않았다: A²=4.5536, p=<0.0005. 던 다중 비교(Dunn's multiple comparisons) 검정과 함께 비-파라미터 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정을 수행하여 각각의 용량에서 처리된 눈 및 미처리된 눈으로부터 유도된 평균 머리 추적 반응을 비교하였다. 적은 샘플 크기로 인해, 시험관 내 또는 생체 내 벡터 형질도입 후에 CNTF 수준을 평가하는 경우 그룹에 대해 분산이 작도될 수 없었다. 모의 형질도입된 세포 상층액(시험관 내) 또는 수거된 눈(생체 내)에 비한 형질도입에서의 평균 CNTF 수준을 비교하기 위해 둘 모두의 예에서 비-파라미터 만-휘트니 U 검정을 적용시켰다. 본페로니 사후 검정을 모든 ANOVA에 적용시켰다. 모든 시험에 대한 유의성(p) 수준을 0.05로 설정하였다. 대조군. ns = 유의하지 않음, *** = p<0.001, 1원 ANOVA. 저용량 n=5, 중간 용량 n=6, 고용량 n=4.

결과

장기간 CNTF 요법에 반응한 원뿔 생존 및 기능을 정확하게 모델링하기 위해, 로돕신(Rho)의 녹아웃에 대해 동형접합인 C57B/6.129 Rho^tm1Phm 마우스를 원뿔 광수용체에서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 C57BL/6J^TgOPN1LW ^- ^EGFP85933Hue 트랜스제닉 마우스와 교배시켰다(Fei, Y. et al. (2001) Vis. Neurosci. 18: 615-623; Humphries, M.M. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 216-219). 말단-단계 망막색소변성의 상기 모델(RP; 본원에 언급됨, Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/-)에서, 로돕신 단백질의 부재로 인한 막대 광수용체의 아폽토시스가 출생후(PW) 8주까지 발생하며, 내재성 형광 원뿔의 이차 손실이 후속되어, 전체 광수용체 변성이 발생한다(Hobson, A.H. et al. (2000) Exp. Eye Res. 71: 247-254). 진행된 막대 손실에 이차적인 원뿔 광수용체가 변성된 동물 모델의 이용은 RP 환자에서 가장 일반적으로 관찰되는 질병 표현형(막대-원뿔 퇴행위축)을 반영한다. 또한, 상기 모델은 막대 광수용체 대부분이 변성되고, 광수용체 손실에 기초가 되는 병인론과 상관 없이 원뿔 매개 시력을 보존하는 것이 우선되는, 신경보호가 가장 가능성 있게 적용될 수 있는 임상 시나리오를 꼭 맞게 개괄한다. 상기 접근법은 광수용체 손실의 원인이 보통염색체 우성 병증의 50% 및 보통염색체 열성 병증의 30%에서 불충분하게 이해되어 있는 RP에 특히 적절하다(Hartong, D.T. et al. (2006) Lancet 368: 1795-1809; Lipinski, D.M. et al. (2013) Prog. Retin. Eye Res. 32: 22-47).

재조합 아데노-관련 바이러스 혈청형 2(rAAV2/2)-기반 벡터를 업스트림 인간 신경 성장인자 분비 신호의 첨가를 통해 세포외 방출에 대해 변형된 인간 CNTF(hCNTF) 단백질을 발현하도록 제조하였다(mL 당 1x10¹³ 유전체 입자(gp)). 생성된 rAAV2/2.hCNTF 벡터로부터의 단백질 분비를 HEK293 세포의 형질도입(MOI=1000)에 의해 시험관 내에서 확인하여, 효소 결합 면역흡착 측정법(ELISA; 도 6a)에 의해 배지에서 높은 수준의 hCNTF 단백질이 검출 가능하게 하였다. PW4 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^-EGFP+/- 마우스(그룹 당 n=3)의 유리체강으로의 rAAV2/2.hCNTF의 생체 내 투여(유리체내 주사)는 가장 가능성 있게는 AAV2-기반 벡터에 의해 효과적으로 형질도입되는 것으로 공지된 뮐러 아교 세포 및 신경절 세포로부터 높은 수준의 분비된 hCNTF 단백질을 유사하게 발생시켰다. 중요하게는, 본 발명자는 눈 당 투여되는 유전체 입자의 수를 변경시키는 것이 hCNTF 단백질의 유효 용량을 광범위하게 조절할 수 있는 것을 관찰하였다(도 6b).

용량 의존 방식으로 RP의 발생을 예방하는 CNTF

Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스에 유의한 원뿔 광수용체 손실 전(PW4)에 저용량(2x10⁸ gp; n=8 마우스), 중간 용량(2x10⁹ gp; n=6 마우스) 또는 고용량(2x10¹⁰ gp; n=5 마우스)의 rAAV2/2.hCNTF의 유리체내 주사를 투여하였다. 모든 마우스의 대측 눈에 수술 개입의 효과에 대한 대조군으로 동등한 부피(2 μL)의 인산염 완충 염수(PBS)의 모의 주사를 투여하였다.

주사 4주 후(PW8), 주사된 마우스의 망막을 동공을 통한 안저의 직접 시각화에 의해 망막 병리의 비-침습성 평가를 가능케 하는 공초점 주사 레이저 검안경(cSLO)으로 이미지화시켰다. 특히, cSLO 자가형광(AF) 영상화 모드는 EGFP의 흡수 피크와 가까운 여기 파장을 갖는 레이터를 이용하여, 망막 내의 EGFP-발현 세포의 시각화를 가능케 한다(Beck, S.C. et al. (2010) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51: 493-497; Charbel Issa, P. et al. (2011) Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.). Rho^{-/-TgOPN1LW-EGFP+/-} 마우스 안저의 AF 영상화는 망막 전체에 걸친 EGFP-발현 원뿔 광수용체의 예상 분포에 해당하는 점-유사 패턴(도 1a)을 나타내었다. AF 영상화 직후 Rho^{-/-TgOPN1LW-EGFP+/-} 마우스로부터 분리된 망막의 사후 렉틴 염색(도 1c)은 생체 내에서 관찰된 개별적 "점-유사" 신호가 단일 EGFP-발현 원뿔 광수용체에 해당한 것을 확증하였다(도 1a-c). 실험 동물의 생애 전체에 걸쳐 일정하게 남아 있는 각각의 눈 내의 관심 표준화 영역을 규정하기 위한 혈관 기준점을 이용하여, 원뿔 광수용체 수를 정확하게 정량하고, hCNTF 처리에 반응한 생존을 장기적으로 평가하는 것이 가능하였다(도 1d-g; 도 6c-j).

AF 영상화는 PW8에서 모든 처리 및 대조군 그룹에서 EGFP-발현 원뿔 광수용체의 동등한 분포를 입증하였다(도 1h; 도 7a-d). 원뿔 광수용체 수는 실험 시간 경과에 걸쳐 PBS 모의 처리된 그룹에서 신속히 감소하였고, 원뿔 수는 PW24에서 0에 도달하였다(도 1h, 도 7d). 검출 가능한 hCNTF 단백질의 부재(도 6b)와 일치하게, rAAV2/2.hCNTF의 저용량(2x10⁸ gp) 유리체내 주사가 투여된 눈에서의 원뿔 광수용체 수는 임의의 시점에서 쌍을 이룬 PBS 모의 주사된 눈과 유의하게 상이하지 않았다(도 1h; 도 7c; p≥0.05, 본페로니 사후 검정과 함께 반복 측정 2원 ANOVA, n=8). 근적외선 반사율(NIR) 영상화는 후기-단계 RP에서의 일반적인 임상 관찰인 피개 광수용체의 손실과 일치하는 망막 색소 상피(RPE)에서의 국소 지리적 변화를 나타내었다(도 2a-d, 도 7c-d). 이러한 관찰은 PBS 모의 처리된 눈에서의 막대 및 원뿔 광수용체 둘 모두의 부재를 입증한 PW30에서 수행된 조직학에 의해 뒷받침된다(도 2i).

중간 용량(2x10⁹ gp) 또는 고용량(2x10¹⁰ gp)의 rAAV2/2.hCNTF 벡터로 처리된 눈에서의 원뿔 수는 PW12로부터 이후로 대측 대조군 눈에 비해 유의하게 더 컸다(도 1h; 도 7a-b). 원뿔 광수용체의 신경보호는 용량 의존적이었고, 중간 용량 처리된 눈(44.90±1.69%; PW30 대 PW8)에 비해 고용량 처리된 눈(62.38±1.95%)에서 가장 큰 생존이 관찰되었다. 원뿔 광수용체 손실의 비율은 둘 모두의 처리 그룹에서 PW15로부터 이후로 거의 0이었고(도 1h; 0.42-0.69%/주); 중간 용량 또는 고용량 처리된 눈에서 RP 표현형이 관찰되지 않았다(도 2e-h; 도 7a-b). PW30에서의 조직학은 고용량 rAAV2/2.hCNTF 벡터가 투여되는 눈에서 원뿔(GFP-발현) 및 막대(GFP-발현하지 않음) 광수용체 둘 모두의 보존을 나타내었다(도 2j). 중간 파 민감성(Mws) 원뿔 옵신 발현과의 EGFP 공동 국소화의 부재는 별개의 원뿔 외부 세그먼트의 존재를 강하게 나타내며(도 2k-o), 여기서 섬모 연결은 존재하는 경우 광수용체 세포체 외부 세그먼트로부터의 EGFP 단백질의 트래피킹을 효과적으로 방해한다.

전기생리학적 반응의 약간의 억제에도 불구하고 시기능을 보존하는 CNTF

rAAV2/2.hCNTF 처리된 마우스를 빛을 이용한 자극 후 망막의 집중된 전기적 반응을 간접적으로 측정하는 각막 전극을 이용하는 기술인 망막전위도검사(ERG)에 의해 PW8에서 시험하였다. CNTF 단백질의 존재하에서 감소된 원뿔 민감성을 입증한 이전 연구의 증거와 일치하게, 원뿔 광수용체-매개 반응이 용량 의존적 방식으로 억제되는 것이 관찰되었다(Wen, R. et al (2012) Prog. Retin. Eye Res. 31: 136-151)(도 8a-f). 피크 ERG 기록은 PW12까지 모든 그룹에서 백그라운드 노이즈의 평균 진폭(~20 μV) 미만으로 떨어졌고, 따라서 이는 기록 가능하지 않은 것으로 간주되었다. 피크 ERG 진폭에서의 감소는 모든 그룹에서 유의한 원뿔 광수용체 손실의 기간과 일치한 한편, 중간 용량(2x10⁹ gp) 및 고용량(2x10¹⁰ gp) 처리된 눈은 PW12를 지나서 원뿔의 유의한 보존을 입증하였고, 이는 원뿔 광수용체 세포체의 보존에도 불구하고 원뿔-매개 시력의 부재를 잠재적으로 나타낸다(도 2j-o). 따라서, 본 발명자는 PW30에서 추가의 전기생리학적 시험 및 거동 시험으로 더욱 상세히 시기능을 조사하였다.

뇌로의 시각 경로를 통해 신호를 중계하는 남아 있는 원뿔의 능력을 빛에 의한 망막의 자극 동안 시각 피질의 레이저 스페클 영상화(LSI)를 수행함으로써 직접 평가하였다. LSI는 미세혈관계 내의 적혈구 세포의 증가된 운동과 선형으로 관련된 무작위 스페클 패턴에서의 변화를 검출할 수 있는 높은 시공간적 해상도를 갖는 비-접촉 영상화 기술이다(도 3c). 본원에서, LSI는 14.5 cd 단색광(510±3 nm)의 짧은(10 ms) 섬광을 이용한 단안 자극 후의 시각 피질에서의 피질 혈류(CBF)에서의 변화를 측정하기 위해 사용되었고, 여기서 상기 파장은 뮤린 M-원뿔의 흡수의 최대 피크와 가장 가깝다. 원뿔-매개 반응을 유도하는 선택된 자극 파라미터의 능력은 PW6의 미처리된 Rho^-/- ^TgOPN1LW ^- ^EGFP ^+/- 마우스(n=3)에서 확인되었다. CBF에서의 변화는 주로 자극된 눈에 대측의 시각 피질에서 검출되었고, 이는 시각 자극의 적절한 다운-스트림 처리를 나타낸다(도 3a-c). 중간 용량(2x10⁹ gp)의 rAAV2/2.hCNTF 벡터로 처리된 눈의 자극 동안 PW30에서의 피질 LSI는 대측 시각 피질에서 증가되었으나 유의하지는 않은 CBF 변화를 나타내었다(도 3d-f; p=0.20, 단측 윌콕슨 매치된-쌍, n=6). 대조적으로, 고용량(2x10¹⁰ gp)의 rAAV2/2.hCNTF가 투여된 눈의 자극 동안 LSI는 모의-처리된 대조군 눈의 자극 동안 유도된 반응보다 유의하게 큰 대측 시각 피질에서의 증가된 CBF를 입증하였다(도 3c, g-i; p=0.012, 단측 윌콕슨 매치된-쌍, n=4). PW6 동물로부터 획득된 기준선 LSI CBF 측정(+0.819%)과 비교하는 경우, 고용량(+0.509%)의 CNTF 처리된 눈의 자극 후에 유도된 CBF 변화의 정도는 PW30에서 관찰된 원뿔 광수용체 생존 백분율(PW8의 62.38±1.95%)과 대체로 서로 관련되었다. 피질 LSI는 생존 원뿔이 광 민감성인 채로 남아 있으며, 뇌로 신호를 중계할 수 있음을 강하게 나타내었다. 피질 혈류에서의 변화가 유용한 시각의 처리에 해당하는 정도를 시각운동 반응(OMR)의 측정에 의해 평가하였다. OMR은 실험 동물이 전시야 시각 자극에 반응하는 불수의 머리-추적 운동의 수를 측정하며, 이는 고전적으로 동물이 위치되는 규정된 폭 및 대조(100% 대조; 0.2 주기/도)의 수직으로 배향된 흑색 및 백색 스트립을 갖는 불빛이 밝은(~1000 럭스) 회전 드럼으로 구성된다(도 4a). OMR은 드럼의 회전 방향에서의 느린-단계의 머리-추적 운동 후, 중심 위치로의 머리의 신속한 단계의 재배향을 특징으로 한다. 느린 단계의 머리-추적 운동은 각각의 눈에 의해 독립적으로 유도되며, 드럼의 회전 방향에 좌우된다(도 4a)(Hobbelen, J.F. et al. (1971) Doc. Ophthalmol. 30: 227-236; Harvey, R.J. et al. (1997) Vision Res. 37: 1615-1625; Douglas, R.M. et al. (2005) Vis. Neurosci. 22: 677-684). 실험 동물이 PW30에서 시험되는 경우, 모의 처리된 눈으로부터 기록된 분 당 머리 추적 반응의 수는 어떠한 그룹에서도 0을 유의하게 초과하지 않았다(0.33±0.05/분). 중간 용량(2.11±0.31/분) 및 고용량 처리된 눈(6.92±0.92/분)의 자극에 의해 유도된 머리 추적 반응의 수는 쌍을 이룬 모의 눈보다 유의하게 큰 한편(도 4b-c; p=<0.001, 던 다중 비교와 함께 크루스칼-왈리스 검정, n=4), PW30에서의 OMR 반응 대 잔여 원뿔 수의 선형 회귀 분석은 유의한 양성 상관관계를 나타내었다(r²=0.80, F=33, p=0.0004)(도 9a).

집합적으로, 이들 데이터는 ERG에 의해 평가시 전기생리학적 기능의 명백한 억제에도 불구하고, hCNTF-매개 신경보호에 의해 보존된 원뿔 광수용체가 빛에 민감한 채로 남아 있고, 신호를 시신경을 통해 중추 시각 경로로 유용하게 중계할 수 있음을 강하게 나타낸다.

보체 인자 단백질 및 단백질분해의 억제제를 상향조절하는 CNTF

23,365개의 마우스 유전자의 전사체 분석을 수행하여 CNTF에 반응한 원뿔 광수용체의 장기간 신경보호의 기초가 되는 메커니즘을 결정하였다. 처리된 눈의 전사체를 PW30에서 전체 눈으로부터 추출된 전체 mRNA의 차세대 시퀀싱에 의해 각각의 용량에서 쌍을 이룬 모의 처리된 대조군(그룹 당 n=4 눈)과 비교하였다. 허위발견률을 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg) 절차에 따라 2%로 고정시키고, 모든 샘플을 효과적인 라이브러리 크기와 관련하여 표준화시켰다. 고용량 처리된(2x10¹⁰ gp) 눈과 쌍을 이룬 PBS 모의-처리된 대조군의 전사체를 비교하는 경우, 1,533개의 유전자가 유의하게 차별적인 발현을 나타내는 것이 발견되었다(p<0.05; 도 9b). 이 중에서, 460개의 유전자는 이들의 발현 수준에서 >2배 변화를 나타내었고, 이후 유전자 본체론을 이용하여 세포 기능을 기초로 하여 그룹화되었다(도 5a-b). 세린-유형, 시스테인-유형 및 금속-유형 펩티다제 억제제(17 유전자; 표 1.1)는 쌍을 이룬 모의-처리된 대조군에 비해 고용량 hCNTF-처리된 눈에서 89배까지 더 큰 발현을 나타내는 일원을 갖는 가장 전사적으로 상향 조절된 패밀리를 포함하였다. 이러한 그룹의 일원은 세포내 및 세포외 펩티다제 억제제를 인코딩하며, 이의 기능이상은 망막 질병의 발생과 이전에 관련되었으며, 상기 그룹의 일원의 예는 금속단백분해효소 3의 조직 억제제(Timp3, +3.49배)이며, 이의 돌연변이는 보통염색체 우성 솔스비 안저 이상증과 연관된다(Weber, B.H. et al. (1994) Nat. Genet. 8: 352-356). 펩티다제 억제제의 전사 조절은 잘 이해되어 있지 않지만, 활성화는 매개되는 전사 3(Stat3)의 신호전달인자 및 활성인자(+2.46배 발현)인 것으로 보이며, 이는 전사 인자의 CCAAT/인핸서 결합 단백질(Cebp) 패밀리의 일원을 필요로 하며, 이 중 3개(Cebpα, Cebpβ 및 Cebpδ)가 또한 유의하게 상향 조절되었다(표 1.2)(Zhao, H. et al. (2007) Mol. Cell Biol. 27: 5286-5295; Udofa, E.A. et al. (2013) PLoS One 8: e57855).

다양한 보체 성분(예를 들어, C3, C4a) 및 보체 인자 유전자(예를 들어, Cfb)를 포함하는 고전적 및 대안적 보체 캐스케이드의 여러 일원(16 유전자, 표 1.3)이 유의하게 상향 조절(10배 이하)되었다. 광수용체에서 발현되고, 스트레스-유도 염증 반응을 감소시키는 것으로 공지된 사이토카인 신호전달 3(SOCS3) 및 5(SOCS5)의 억제인자를 포함하는 사이토카인 신호전달의 다수의 조정자가 상향조절(19 유전자, 8배 이하; 표 1.4)되었다(Ozawa, Y. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283: 24561-24570; Takase, H. et al. (2005) J. Neuroimmunology 168: 118-127).

비타민-A 사이클의 중요 성분인 레시틴 레티놀 아실트랜스페라제(LRAT), 및 내부 망막 뉴런에서 발현되는 이온 채널 및 G 단백질-결합 수용체를 인코딩하는 여러 유전자의 하향 조절(1.7배)이 중간 용량 및 고용량 rAAV2/2.hCNTF 처리된 눈에서 관찰되었고(표 1.5), 이는 이전 연구와 일치하는 CNTF 처리에 반응한 광신호전달의 광범위한 변화를 나타낸다(Wen, R. et al. (2012) Prog. Retin. Eye Res. 31: 136-151).

논의

눈의 독특한 광학 특성의 이용을 통해, 본 발명자는 진행성 뉴런 변성을 실시간으로 평가할 수 있었고, 반복 생체 내 영상화를 통해 내인적으로 형광인 원뿔 광수용체의 생존을 정확히 정량할 수 있었다. 이러한 작업은 변성 질병 모델에서 일생에 걸친 보호를 제공하는 신경영양 화합물의 능력을 처음으로 입증한다.

본 발명의 데이터는 원뿔 광수용체가 개입 없이 전체 외부-망박 변성이 예상되는 시점을 넘어서 rAAV-매개 hCNTF 분비에 의해 보존될 수 있음을 입증한다. 원뿔 광수용체 일원의 안정화가 중간 용량(44.90±1.69%) 및 고용량(62.38±1.95%) 처리 그룹에서 관찰되었고, 이는 보호가 장기간 유지될 수 있음을 암시한다. 이들 발견은 광수용체 보존이 단기간 내지 중간 기간(5년 이하)에서 입증되었으나, 장기간의 신경보호의 결과는 인간에서의 RP의 느린 진행 특성으로 인해 알 수 없는 채로 남아있는 듯한 지속된 CNTF 전달을 제공하는 캡슐화된 세포 기술을 이용하는 최근의 임상 시험에 비추어 유의하다(Birch, D.G. et al. Long-term follow-up of patients with retinitis pigmentosa (RP) receiving sustained-release CNTF through intraocular encapsulated cell technology implants. ARVO annual meeting (Seattle, WA, 2013); Birch, D.G. et al. (2013) Am. J. Ophthalmol. 156: 283-292 e281).

본 발명의 연구에서, 세포 생존은 용량-의존적인 것으로 관찰되었고, 망막전위도검사(ERG)에 의해 평가시 생리학적 기능의 억제도 또한 그러하였으며; 이전에 제안된 바와 같이 기능적 억제 없이 신경보호가 달성되는 용량이 관찰되지 않았다(McGill, T.J. et al. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48: 5756-5766). 보존된 광수용체의 수, 및 빛에 대한 각각의 광수용체의 민감성은 hCNTF 단백질의 생체이용률에 직접 비례하는 것으로 보인다. 이는 기능적 억제 및 세포 생존에 기초가 되는 메커니즘이 뒤엉킨 채로 연결될 수 있음을 강하게 암시한다. 따라서, 환자가 달리 우수한 시력을 갖는 경우 진행성 변성 질병의 초기 단계 동안의 시기능의 억제는 치료 없이 실명이 발생하는 시점을 넘어서까지 시력을 연장시키는 잠재성에 의해 보다 중요해질 수 있다.

개입의 시점은 원뿔 광수용체를 성공적으로 보존시키고, 기능을 유지시키는데 있어서 중요할 수 있는 또 다른 요인이다. 본 발명의 연구에서, 본 발명자는 최대 CNTF 발현 지점에 막대 광수용체의 유의한 비율이 부재하는 임상 시나리오에 가깝게 모델링하는 것을 목표로 하였다. 이는 트랜스진 발현의 피크가 막대 변성이 로돕신 녹아웃 마우스 모델에서 잘 진행되는 시점인 PW8-10까지 발생하지 않도록 rAAV.hCNTF 투여 시기를 맞춤으로써 달성되었다(Humphries, M.M. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 216-219). 본 발명의 발견은 유망하며, 본원에 제공된 조직학이 CNTF 처리 후에 원뿔에 더하여 막대 광수용체(GFP를 발현하지 않는 세포)의 보존을 명백히 입증하는 것이 주목할 만한 가치가 있다.

흥미롭게도, 개입의 초기 시점에도 불구하고, 이전의 전임상 연구는 한결같이 기능적 보존을 관찰하는데 실패하였으며, 이는 시력의 유지가 망막 변성의 개시 전에 치료가 제공되는 경우에도 가능하지 않을 수 있음을 암시한다. 이들 연구와 일치하게, 본 발명자는 먼저 잔여 전기생리학적 기능의 일차 평가로서 ERG를 이용하였고, 측정이 PW12까지 모든 그룹에서 기록할 수 없게 된것을 관찰하였다. ERG는 각막 표면 상에 위치된 전극에 의해 검출되는 충분한 진폭 및 균일성의 전기적 신호의 전파에 의존하는 망막 기능의 간접 척도임에 따라, PW12를 넘어서는 기록 가능한 원뿔 ERG의 부재는 기능적 시력의 부재를 반드시 반영하는 않는 것으로 생각되었다. 게다가, 이는 변성 망막에 대해 광 민감성을 회복시키기 위한 광수용체 이식 및 광유전학적 접근법에 집중하는 연구에 의해 가장 강조되는 원리인 망막의 적은 영역이 광 민감성이 되고, 아직 검출 가능한 신호를 전파하지 않을 가능성이 매우 높고, 여기서 시기능은 부분적으로 회복될 수 있으나, ERG 반응은 거의 확실히 부재한 채로 남아 있을 수 있다(Mace, E. et al. (2015) Mol. Ther. 23: 7-16; Gaub, B.M. et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: E5574-5583; Singh, M.S. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: 1101-1106; Francis, P.J. et al. (2013) Translational vision science & technology 2: 4).

PW12를 지나 본 발명의 연구에서 관찰된 ERG 반응의 부재에 대한 기여 요인은 CNTF 처리 후의 막대 광수용체를 이용하여 기재된 바와 같은 외부 세그먼트 형성의 억제일 수 있다(Wen, R. et al. (2006) J. Neurosci. 26: 13523-13530). 원뿔 외부 세그먼트 형성에 대한 CNTF의 효과에 대한 연구는 제한적이나, 본 발명자는 PW30에서 제한된 옵신-함유 원뿔 외부 세그먼트의 지속을 관찰하였고, 이는 원뿔이 ERG 부재에도 불구하고 광 민감성인 채로 남아 있을 수 있음을 강하게 나타낸다(Li, Y. et al. (2010) PLoS One 5: e9495; Beltran, W.A. et al. (2007) Exp. Eye Res. 84: 753-771; Rhee, K.D. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: E4520-4529). 원뿔 광수용체가 시각 피질 및 뇌의 덮개앞 구역으로 해석 가능한 신호를 중계하는 능력을 보유한다는 가정을 시험하기 위해, 본 발명자는 레이저 스페클 영상화(LSI)를 수행하였다. 편측 안구 자극 동안의 LSI는 중요하게는 각각의 동물 내에서 처리된 눈 및 처리되지 않은 눈으로부터의 반응의 묘사를 독립적으로 가능케 하는 남아 있는 원뿔의 광 민감성을 평가하는 확실한 방법임을 입증하였다. 피질 영상화는 고용량 rAAV.hCNTF 처리된 눈의 자극이 대측 시각 피질에서의 피질 혈류의 유의한 변화를 유도한 것을 나타내었고, 이는 잔여 원뿔 광수용체가 광에 감수성이고, 정확히 시냅스화된 채로 남아 있음을 강하게 암시한다. 중요하게는, 신경운동 반응의 전파는 시각 피질에 의해 수용된 신호가 생리학적으로 관련된 정보를 인코딩한 것을 나타내었다. 모의-처리된 대조군 눈의 자극 후에 머리 추적 반응이 유도되지 않았으며, 이는 말단-단계 변성에서도 내부 망막에 존재하는 내인적 광수용 망막 신경절 세포가 OMR에 기여하지 않는다는 증거를 뒷받침한다(Cahill, H. et al (2008) PLoS One 3: e2055). 상기 발견은 또한 캡슐화된 세포 기술을 이용하여 hCNTF 단백질을 발현시키는 임상 시험과 특히 관련성이 있는데, 이는 이들이 단기 기능적 억제에도 불구하고, 유용한 시력이 말단-단계 질병 및 실명이 달리 발생할 수 있는 시점을 넘어서까지 여전히 보존될 수 있음을 나타내기 때문이다.

CNTF 투여의 영향은 광수용체가 증가된 용량과 일치하게 기능적으로 억제되는 RP의 치료에서 중요한 것으로 보일 뿐만 아니라, 다른 신경변성 질병에 대한 치료를 평가하는 경우에 중요한 고려사항이다. 특히, 과거의 성공적이지 않은 임상 시험은 ALS에서의 운동 뉴런 손실을 방지하는 것을 목표로 하였으며, 이는 고용량의 CNTF로 전신적으로 치료된 환자에서 치료 효능의 부재 및 유해 사례의 유의한 발생을 나타내었다(A double-blind placebo-controlled clinical trial of subcutaneous recombinant human ciliary neurotrophic factor (rHCNTF) in amyotrophic lateral sclerosis. ALS CNTF Treatment Study Group. (1996) Neurology 46: 1244-1249; Bongioanni, P. et al. (2004) The Cochrane database of systematic reviews, CD004302). 이들 발견은 현재의 신경보호 전략에 의해 제공되는 것보다 더욱 표적화되어, 이에 의해 세포 생존에 기초가 되는 이로운 메커니즘이 유해 사례를 발생시키는 메커니즘으로부터 분리된 접근법이 필요할 수 있음을 나타낸다. 이러한 연구에서, 본 발명자는 말단-단계 망막 질병에서 생존 뉴런의 전사체 분석을 수행함으로써 아직까지 불완전하게 이해된 채로 남아 있던 지속된 발현 후의 CNTF-매개 신경보호의 잠재적 메커니즘에 대한 독특한 통찰을 나타낼 수 있었다. rAAV2/2.hCNTF-처리된 눈 대 모의-처리된 눈의 전사체 분석은 여러 중요한 발견을 나타내었다. 첫째로, Cntfr/Lifrβ/Gp130 활성의 수용체 복합체를 통한 CNTF 신호가 Stat3에 의해 매개된 것을 나타내는 이전 연구와 일치하게 Stat3 유전자의 유의한 과발현이 중간 용량 및 고용량 rAAV2/2.hCNTF-처리된 눈에서 관찰되었다(Rhee, K.D. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: E4520-4529; Davis, S. et al. (1993) Science 259: 1736-1739; Kassen, S.C. et al. (2009) Exp. Eye Res. 88: 1051-1064; Peterson, W.M. et al. (2000) J. Neurosci. 20: 4081-4090).

둘째로, 단백질분해의 억제제를 인코딩하는 유전자의 여러 패밀리가 확실하게 과발현되었고(89배 이하), 이는 hCNTF-매개 신경보호에서의 중요한 역할을 나타낸다. 세린 프로테아제 억제제(Serpin) 패밀리의 일원(11 유전자)의 활성화는 특히 Stat3 발현 수준과 밀접하게 관련되며, 종양에서 과발현되는 경우 항-아폽토시스인 것으로 입증되었다(Ahmed, S.T. et al. (2009) Biochem. Biophys. Res. Commun. 378: 821-825). 각각 세포외 기질 성분 및 브루크막의 분해를 방지하는 작용을 하고, 솔스비 안저 이상증 및 연령-관련 황반 변성(AMD)과 연관된 Timp3 및 Serpin1b을 포함하는 단백질분해의 억제제가 망막 질병에서 중요한 역할을 할 수 있다(Weber, B.H. et al. (1994) Nat. Genet. 8: 352-356; Chong, N.H. et al. (2005) Am. J. Pathol. 166: 241-251; Sorsby, A. et al. (1949) Br. J. Ophthalmol. 33: 67-97). 신경변성 질병에서의 뉴런, 예를 들어, 광수용체의 물리적 분해가 통상적으로 세린-시스테인 프로테아제, 리소좀 프로테아제 및 보체 매개 용해에 의해 매개되는 것과 함께, 본 발명자는 본원에서 관찰된 단백질분해의 내인성 억제제의 과발현이 세포 스트레스에 반응한 뉴런 아폽토시스에 대한 중요한 방어 메커니즘을 제공할 수 있는 것으로 가정한다. 본 발명자는 분비된 단백질분해성 억제제의 직접적인 과발현이 변성 질병에서 뉴런 세포 사멸의 예방을 위한 신규한 치료적 수단을 제공할 수 있음을 제안한다. 게다가, 세포체 및 세포외 기질 분해의 직접적인 억제를 통해 RP에서 광수용체 변성을 예방하는 것을 목적으로 한 표적화된 접근법을 이용하는 것은 광수용체가 기능의 생리학적 억제 없이 보존되는 것을 가능케 할 수 있다. ALS의 경우, 단백질분해의 억제를 통해 직접적으로 피질 운동 뉴런의 변성을 예방하는 것은 CNTF가 고용량으로 전신 전달된 임상 시험에서 관찰된 유의한 유해 효과 없이 치료 효능이 달성되는 것을 가능케 할 수 있다(A double-blind placebo-controlled clinical trial of subcutaneous recombinant human ciliary neurotrophic factor (rHCNTF) in amyotrophic lateral sclerosis. ALS CNTF Treatment Study Group. (1996) Neurology 46: 1244-1249; Bongioanni, P. et al. (2004) The Cochrane database of systematic reviews, CD004302).

마지막으로, AMD(Cfi 유전자에 의해 인코딩됨) 및 망막 광 손상(Cfd 유전자에 의해 인코딩됨)과 관련된 2개의 보체 인자를 포함하는 고전적 및 대안적 보체 캐스케이드의 여러 일원(16 유전자)의 유의한 상향조절(10배 이하)을 특징으로 하는 지속된 선천 면역 반응이 중간 용량 및 고용량 처리된 눈에서 관찰되었다(van de Ven, J.P. et al. (2013) Nat. Genet. 45: 813-817; Rohrer, B. et al. (2007) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48: 5282-5289). 흥미롭게도, PW30에서 저용량 처리된 눈에서 보체 또는 사이토카인 상향조절이 관찰되지 않았는데, 이는 광수용체 변성이 완료된 후에 선천 면역 반응이 중지된 것을 나타낸다. 여러 상향조절된 프로테아제 억제제의 역할은 공지되어 있지 않은 채로 남아 있으나, 단백질분해 억제제를 인코딩하는 유전자의 발현은 또한 다양한 성분(예를 들어, C3, C4 및 Cfb 단백질)이 단백질분해성 분해 후에만 활성화되는 중추신경계에서 발생하는 선천 면역 반응을 변형시키는 것과 특히 관련이 있을 수 있다. 예를 들어, Serpin3k는 Wnt 경로의 차단을 통해 종양 괴사 인자 알파(Tnf-α), 세포내 부착 분자 1(Icam-1) 및 혈관 내피 성장인자(Vegf)를 억제하는 강한 항염증 및 항혈관신생 특성을 갖는 것으로 공지되어 있다(Zhang, B. et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 3943-3952). 망막 괴사 세포 사멸을 예방하는 것에 더하여, Serpin3k는 또한 막대 외부 세그먼트 발생을 유의하게 억제하며, 따라서 hCNTF에 의한 이의 상향조절은 또한 감소된 망막 민감성에 기여할 수 있다(Zhang, B. et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 3943-3952; Zhang, B. et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 6900-6905; Zhang, B. et al. (2008) PLoS One 3: e4077).

요컨대, 본 연구는 눈의 독특한 광학적 특성이 치료적 개입에 반응한 뉴런 생존이 반복 생체 내 영상화를 통해 큰 정확도로 장기적으로 평가되는 것을 가능케 함을 입증하였다. 여기서, 본 발명자는 지속된 hCNTF 발현이 원뿔 광수용체의 평생의 보존을 발생시키며, 제한된 전기생리학적 억제에도 불구하고, 유용한 시력이 변성의 말단-단계까지 유지된 것을 입증하였다. 본 연구는 강한 세포 생존이 이용 가능한 CNTF의 용량과 직접적으로 관련된 것을 입증하였다. 전사체 분석은 세포내 및 세포외 프로테아제 억제제의 Stat3-매개 과발현이 가능하게는 세포 및 세포외 기질 분해의 직접적인 억제를 통해 hCNTF 처리 후에 RP에서의 원뿔 보존의 기초가 되는 것을 확실히 나타낸다. 본 발명자는 특정 내인성 프로테아제 억제제의 과발현이 RP/AMD 및 다른 신경변성 장애, 예를 들어, ALS에서 세포 사멸에 대한 뉴런의 보호를 위한 신규한 치료적 수단을 제공할 수 있음을 제안한다.

상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 기재된 화합물, 용도 및 방법의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 상기 특정 구체예로 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 또한, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Isis Innovation Limited <120> Treatment of Retinitis Pigmentosa <130> P107083KR <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 603 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggctttca cagagcattc accgctgacc cctcaccgtc gggacctctg tagccgctct 60 atctggctag caaggaagat tcgttcagac ctgactgctc ttacggaatc ctatgtgaag 120 catcagggcc tgaacaagaa catcaacctg gactctgcgg atgggatgcc agtggcaagc 180 actgatcagt ggagtgagct gaccgaggca gagcgactcc aagagaacct tcaagcttat 240 cgtaccttcc atgttttgtt ggccaggctc ttagaagacc agcaggtgca ttttacccca 300 accgaaggtg acttccatca agctatacat acccttcttc tccaagtcgc tgcctttgca 360 taccagatag aggagttaat gatactcctg gaatacaaga tcccccgcaa tgaggctgat 420 gggatgccta ttaatgttgg agatggtggt ctctttgaga agaagctgtg gggcctaaag 480 gtgctgcagg agctttcaca gtggacagta aggtccatcc atgaccttcg tttcatttct 540 tctcatcaga ctgggatccc agcacgtggg agccattata ttgctaacaa caagaaaatg 600 tag 603 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro 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Claims

섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 망막색소변성을 치료하거나 예방할 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 망막색소변성을 치료하거나 예방하는 방법.
제 1항에 있어서, AAV 벡터가 AAV 혈청형 2 유전체를 포함하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, CNTF가 인간 CNTF인 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 CNTF-인코딩 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 분비 신호 서열을 포함하는 방법.
제 4항에 있어서, 분비 신호 서열이 인간 신경 성장인자(NGF) 분비 신호 서열인 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 망막하, 직접 망막 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여되는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 망막하 주사에 의해 대상체의 눈으로 투여되는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 단일 용량으로 대상체에 투여되는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 AAV 벡터의 투여시에 치료되는 눈에 막대 세포가 실질적으로 결여되어 있는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 망막색소변성으로 인한 광수용체 세포 변성이 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방되는 방법.
제 10항에 있어서, 망막색소변성으로 인한 원뿔 세포 변성이 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방되는 방법.
망막색소변성으로 고통받거나 망막색소변성이 발생할 위험이 있는 대상체에서 광수용체 세포 사멸을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이 섬모 신경영양 인자(CNTF)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 광수용체 세포 사멸을 감소시킬 필요가 있는 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 치료된 눈에서 시기능이 실질적으로 회복되거나 유지되는, 방법.
제 12항에 있어서, 망막색소변성으로 인한 광수용체 세포 변성이 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방되는 방법.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 망막색소변성으로 인한 원뿔 세포 변성이 대상체의 생애 동안 실질적으로 예방되는 방법.
제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 AAV 벡터의 투여시에 치료되는 눈에 막대 세포가 실질적으로 결여되어 있는 방법.