KR20200103634A

KR20200103634A - 치료적으로 유효한 양의 재조합 aav9- 유도 벡터의 망막하 전달을 포함하는 대상체의 원추 광수용체 내 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법

Info

Publication number: KR20200103634A
Application number: KR1020207014057A
Authority: KR
Inventors: 드니즈 달카라; 아넹 카부; 조제-알랭 사엘; 띠에리 르베이야르; 졍 뒤에벨
Original assignee: 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔); 쏘흐본느 유니베흐시테
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2020-09-02
Also published as: JP2021500030A; CN111867635A; JP7420710B2; US11723988B2; WO2019077159A1; EP3697448A1; US20210268125A1

Abstract

아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터의 안구내 주사는 유전자 약물을 망막 내로 전달하기 위한 명백한 경로이었다. 현재, 벡터는 원추로 유전자 전달을 제공하기 위해 망막하 공간 내로 주사될 필요가 있다. 이러한 접근법에서, 유전자 전달은 주사된 유액의 국소 "소포"와 접촉하는 세포에 한정된다. 더욱이, 망막하 주사 동안 발생하는 망막 박리는 망막 변성이 있는 눈에서의 우려사항이다. 여기서, 본 발명자는 마우스 모델, 사람 유도된 다능성 줄기 세포-유기 기관모양, 사후 사람 망막 외부이식편 및 살아있는 마카퀴 내에서 뒷받침하는 연구와 함께 중심와 내의 AAV-매개된 원추 형질도입과 관련된 제한을 극복하기 위한 몇가지 새로운 벡터-프로모터 조합을 확립한다. 이들은 AAV9 변이체가 이러한 취약한 영역의 박리없이, 중심와로부터 수 밀리미터 떨어진 망막하 공간 내로 주사되는 경우 효율적인 중심와 원추 형질도입을 제공한다. 전달 양상은 원추-특이적인 프로모터에 의존하며 광유전성 시력 회복과 양립가능한 고-수준 전이유전자 발현을 생성한다. 따라서, 본 발명은 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어 하에서 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV9-유도 벡터의 치료적으로 유효한 양의 망막하 전달을 포함하는 대상체의 원추 광수용체 내에서 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

Description

치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하여 대상체의 원추 광수용체 내에 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법

발명의 분야

본 발명은 재조합 AAV9-유도(derived) 벡터 및 이의 적용, 특히 치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달(subretinal delivery)을 포함하여, 대상체의 원추 광 수용체(cone photoreceptor) 내에 관심의 폴리뉴클레오티드(polynucleotide of interest)를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경:

황반의 중심에 위치한 중심와(fovea)는 매우 예리한 색각(color vision)을 제공함으로써 영장류의 시 지각(visual perception)을 지배하는 망막의 전문화된 영역이다(1). 원추의 최대 밀도는 로드 광수용체(rod photoreceptor)가 없는 중심와의 중심(중심와 중앙으로부터 <0.3 mm)에서 발견된다(2). 원추 밀도는 중심와로부터의 거리의 100배까지 감소한다(3). 중심와 내 원추 세포는 중간-단계 색소성 망막염(4, 5) 및 색맹(6)과 같은 유전된 망막 질환을 치료하는 것을 목표로 하는 유전자 치료요법의 주요 표적이다. 현재, 치료적 단백질을 암호화하는 바이러스 벡터는 원추로의 유전자 전달을 제공하기 위하여 광수용체와 망막 색소 상피(RPE) 세포 사이의 망막하 공간 내로 주사될 필요가 있다. 이러한 접근법에서, 통상의 AAV(즉, AAV2)를 사용한 유전자 전달은 주사된 유액(fluid)의 국소 "수포(bleb)"를 접촉시키는 세포에 한정된다. 또한, 망막하 주사 동안에 발생하는 망막 박리(retinal detachment)는 망막 변성이 있는 눈에서의 우려사항이다. 아데노-관련 바이러스(AAV)의 망막하 전달을 사용하여 레베르 선천성 흑암시(Leber's Congenital Amaurosis) 환자에서 건강한 RPE65 유전자를 전달하는 초기 임상 시험(7-9)은 바이러스 벡터를 전달하기 위한 황반(macular)의 박리에도 불구하고 시력에서의 일부 개선을 초래한다(10, 11). 그러나, 치료는 특정의 경우에 황반 원공(macular hole) 및 중심와-하 주사(sub-foveal injection)의 경우에 증가된 황반 박화(macular thinning)로 인해 복잡해졌다(11). 또한, 주변 영역과 대조적으로, 중심와 내 치료 이점은 존재하지 않았다(12). AAV를 사용한 유전자 치료요법이 또한 맥락막결손증을 지닌 환자에 대해 연구되어 왔으며 여기서 황반은 유전자 전달을 위한 표적이었다(13). 따라서, 지금까지 이러한 후자의 연구로부터의 6개월 후속 결과는 중심와-하 망막 박리가 이러한 영역 내에서 시력 감소를 유발하지 않지만, 이러한 시험에서 환자들 중 1명은 그의 치료되지 않은 눈과 비교하여 치료된 눈에서 시력 상실이 있었음을 시사하고 있다(13). 임상 단계의 적용에 이르는 추가의 유전자 치료요법으로 이러한 취약한 영역의 박리없이 유전자 치료요법을 중심와에 전달하기 위한 새로운 방법을 찾기 위한 필요성이 대두되고 있다(14). 이는 측면으로 확산하여 중심와 영역에 도달하는 벡터를 사용하여 말초 내에 망막하 주사함으로써 달성할 수 있다.

발명의 요약:

본 발명은 재조합 AAV9-유도 벡터(recombinant AAV9-derived vector) 및, 치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하여, 대상체의 원추 광수용체 내에 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법을 포함하는, 이의 적용에 관한 것이다.

제1 양태에서, 본 발명은 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환의 치료시 사용하기 위한 재조합 AAV9-유도 벡터에 관한 것이며, 상기 벡터는 다음을 포함한다:

- 7 내지 11개 아미노산 길이의 펩티드가 상응하는 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입되어 있는 VP1 캡시드 단백질(여기서 상기 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 어느 하나를 포함한다); 및

- 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터 또는 상기 프로모터의 기능성 변이체의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드.

바람직하게는, 펩티드는 서열 번호: 10에 나타낸 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 588번 아미노산과 589번 아미노산 사이의 GH 루프(loop) 내에 삽입된다.

바람직하게는, 펩티드는 서열 번호: 9를 포함하거나 이로 이루어진다.

바람직하게는, 재조합 AAV9-유도 벡터는 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어하의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

바람직하게는, 재조합 AAV9-유도 벡터로 치료될 대상체는 노인 황반 변성(age-related macular degeneration), 바센-코르츠바이크 증후군(Bassen-kornzweig syndrome), 맥락막결손증, 우곡상 위축(gyrate atrophy), 레프섬 증후군(Refsum syndrome), 어셔 증후군(Usher syndrome), 색각 이상(color blindness), 청색 원추 단색형색각(blue cone monochromacy), 완전 색맹(achromatopsia), 불완전 색맹, 올리고콘 삼색형색각(oligocone trichromacy), 색소성 망막염(RP), 황반 변성, 스타르가르트 질환(Stargardt's Disease), 바뎃-비들 증후군(Bardet-Biedl syndrome), 본홀름 눈 질환(Bornholm eye disease), 베스트 질환(Best's Disease) 및 레베르 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 망막 질환을 겪는다.

바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 색소성 망막염 GTPase 조절인자(RPGRORF15), CNGB3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된(gated) 양이온 채널(cone cyclic nucleotide-gated cation channel)의 베타 소단위), CNGA3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된 양이온 채널의 알파 소단위) 또는 GNAT2를 암호화하는 유전자로부터 선택된, 유전자 대체 치료요법에서 사용될 수 있는 유전자이다.

바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 신경영양 인자를 암호화한다. 보다 바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 RdCVF, RdCVF2, RdCVFL 또는 RdCVFL2를 암호화한다.

바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 로돕신, 포톱신, L/M 파장(적색/녹색) 원추-옵신, 또는 단 파장(S) 원추-옵신(청색)과 같은 옵신을 암호화한다. 보다 바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 또는 서열 번호: 15에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 옵신을 암호화한다.

바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자 기능의 부위-특이적인 녹-다운(knock-down)을 제공하는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제를 암호화한다. 보다 바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 Cas9 뉴클레아제를 암호화한다.

바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 간섭(interfering) RNA(RNAi), 특히 siRNA 또는 shRNA를 암호화한다.

바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 암호화한다.

바람직하게는, 치료는 치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함한다.

바람직하게는, 망막하 전달은 상기 영역의 박리없이 중심와의 거리에서 수행된다.

다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 재조합 AAV9-유도 벡터에 관한 것이다:

7 내지 11개의 아미노산 길이의 펩티드가 상응하는 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 상기 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입되어 있는 VP1 캡시드 단백질(여기서 상기 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 어느 하나를 포함한다); 및

서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터 또는 상기 프로모터의 기능성 변이체의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드.

바람직하게는, 펩티드는 상기 기술된 바와 같다.

바람직하게는, 재조합 AAV9-유도 벡터는 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

바람직하게는, 관심의 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같다.

다른 양태에서, 본 발명은 치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하여, 대상체의 원추 광수용체 내에 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명:

영장류 눈의 망막하 공간의 해부학적으로 독특한 환경 내에서 AAV 형질도입 패턴의 본 발명자들의 이해에 있어서의 갭(gap)은 임상에서 중심와 원추로의 비-침입성 및 효율적인 유전자 전달의 확립을 방해하였다. 본원에서, 본 발명자들은 마우스 모델, 사람 유도된 다능성 줄기 세포-유도 오가노이드(organoid), 사후 사람 망막 이식체 및 살아있는 마카크(macaque)에서의 연구를 뒷받침하는 중심와 내 AAV-매개된 원추 형질도입과 관련한 한계를 극복하기 위한 수개의 신규 벡터-프로모터 조합을 확립한다. 이들은 AAV9 변이체가 이러한 연약한 영역을 박리시키기 않고, 중심와로부터 수 밀리미터 떨어진 망막하 공간 내로 주사하는 경우 효율적인 중심와 원추 형질도입을 제공하는 것을 나타낸다. 이러한 전달 양상은 원추-특이적인 프로모터에 의존하며 광유전자성 시력 복원과 양립할 수 있는 고 수준 이식유전자 발현을 야기한다.

따라서, 본 발명의 제1 목적은 다음을 포함하는, 재조합 AAV9-유도 벡터에 관한 것이다:

7 내지 11개 아미노산 길이의 펩티드가 상응하는 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 상기 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입되어 있는 VP1 캡시드 단백질(여기서 상기 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 어느 하나를 포함한다); 및

서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터 또는 상기 프로모터의 기능성 변이체의 제어하의 관심의 폴리뉴클레오티드.

특히, 재조합 AAV9-유도 벡터는 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 치료적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하여, 대상체의 원추 광수용체 내에 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 전형적으로 사람에 대해 의도된다. 전형적으로, 대상체는 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환에 영향을 미칠 가능성이 있다. 이러한 망막 질환은 원추 광수용체에 직접 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 망막 원추 광수용체에 충격을 주는 광범위한 망막 질환은 본원에 제공된 주어진 교시로 치료될 수 있으며 전형적으로 노인 황반 변성, 바센-코르츠바이크 증후군, 맥락막결손증, 우곡상 위축, 레프섬 증후군, 어셔 증후군, 색각이상, 청색 원추 단색형색각, 완전 색맹, 불완전한 색맹, 올리고콘 삼색형색각, 색소성 망막염(RP), 황반 변성, 스타르가르트 질환, 바뎃-비들 증후군, 본홀름 눈 질환, 베스트 질환 및 레베르 선천성 흑암시를 포함한다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 치료적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체 내 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 양태에서, 원추 광수용체 내에서 발현되는 경우, 특히 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어 하에서 관심의 폴리뉴클레오티드는 망막 질환에 대해 유리한 효과를 가지는데, 특히 상기 질환을 치료할 수 있다.

본 발명은 또한 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 재조합 AAV9-유도 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환의 치료용 의약의 제조를 위한, 상기 재조합 AAV9-유도 벡터의 용도에 관한 것이다. 상기 설명한 바와 같이, 바람직하게는, 치료는 치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하며, 관심의 폴리뉴클레오티드는 망막 질환을 치료할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 예방적 또는 방지적 치료 뿐만 아니라 치유 또는 질환 변형 치료, 예를 들면, 질환에 걸릴 위험에 있거나 질환에 걸린 것으로 추측된 환자 뿐만 아니라 아프거나 질환 또는 의학적 상태로 고생하는 것으로 진단된 환자의 치료를 지칭하며, 임상 재발의 억제를 포함한다. 치료는 의학적 장애를 가지거나 궁극적으로 장애를 얻을 수 있는 대상체에게 투여됨으로써 장애 또는 재발하는 장애의 하나 이상의 증상의 발병을 방지하고, 치유하며, 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 이를 완화시킬 수 있다. "치료적 요법"은 질병의 치료 양식, 예컨대, 치료요법 동안 사용된 용량의 패턴을 의미한다. 치료적 요법은 유도 요법 및 유지 요법을 포함할 수 있다. 어구 "유도 요법" 또는 "유도 기간"은 질환의 초기 치료를 위해 사용된 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)를 지칭한다. 유도 요법의 일반적인 목표는 치료 요법의 초기 기간 동안 환자에게 고 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 요법은 (부분적으로 또는 전체적으로) "로딩 요법(loading regimen)"을 사용할 수 있으며, 이는 주치의가 유지 요법 동안 사용할 수 있는 것보다 더 많은 용량의 약물을 투여할 수 있거나, 주치의가 유지 요법 동안 약물을 투여할 수 있는 것보다 더 자주 약물을 투여하는 것, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어구 "유지 요법" 또는 "유기 기간"은 질병의 치료 동안 환자의 유지를 위해, 예컨대, 긴 기간(수개월 또는 수년) 동안 환자를 차도(remission) 상태로 유지시키기 위해 사용된 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 지칭한다. 유지 요법은 연속 치료요법(예컨대, 약물을 규칙적인 간격, 에컨대, 매주, 매달, 매년 등) 또는 간헐적 치료요법(예컨대, 비연속 치료, 간혈적 치료, 재발시 치료, 또는 특수한 예정된 기준[예컨대, 질환 징후 등]의 달성시 치료)을 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "원추 광수용체"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 포유동물 눈의 망막 내 3개 유형의 광수용체 세포 중 하나이다. 이들은 색각에 관여하며, 약광에서 보다 우수하게 작동하는 로드 세포(rod cell)와는 대조되는 것으로서, 비교적 밝은 광에서 가장 우수하게 작용한다. 특수한 벡터와 pR1.7 프로모터(또는 상기 프로모터의 기능성 변이체) 사이의 조합은 원추 광수용체 내 관심의 폴리뉴클레오티드의 발현을 구체적으로 유도한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "망막하 전달"은 광수용체 세포와 망막 색소 내피 세포 사이의 망막 내 위치를 지칭하는, 망막하 공간 내로의 벡터의 투여를 지칭한다. 망막하 전달은 "수포(bleb)"의 형성을 초래하며, 이는 눈의 망막하 공간 내 유체-충전된 포켓(fluid-filled pocket)을 지칭한다. 본 발명의 수포는 유체를 단일 공간 내로 단일 주사하거나, 하나 이상의 유체를 동일한 공간 내로 다수 주사하거나, 재위치하는 경우 망막하 공간의 목적한 부위 보다 치료적 효과를 달성하는데 유용한 전체적인 유체 공간을 생성하는, 다수 공간 내로의 다수 주사에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따라서, 망막하 전달은 중심와의 거리에서 수행되며, 이는 수포가 이러한 연약한 부위를 박리시키지 않고, 중심와의 중앙으로부터 0.5 밀리미터 이상으로 떨어져서 형성됨을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "중심와"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 원추 광수용체 세포 만을 함유하고 전체 망막 내에서 최고 밀도의 원추를 함유하는 직경이 대략 0.5 mm 이하인 영장류의 중심 망막 내 소 영역을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 본원의 "관심의 폴리뉴클레오티드"는 임의의 폴리펩티드, 구조적 단백질, 효소 등을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 지정하며, 이의 발현은 특정 유형의 이유로, 표적 세포 내에서 원하여 진다. 이는 또한 비-암호화 서열, 예를 들면, 안티센스 서열 또는 유전자의 발현을 감소시키는 것에 목적을 둔 간섭 RNA의 서열을 지정할 수 있다. 당해 분야의 기술자는, 그의 분야에서 과학 문헌의 이의 지식에 의해, 어느 것이 특정 망막 질환을 치료하기에 보다 적절할 수 있는 폴리뉴클레오티드인지를 알고 있다.

유전자 치료요법은 본원에서 결함이 있는 관심의 폴리뉴클레오티드(예컨대, 유전자)의 기능성 카피를 원추 광수용체 내에 도입하거나(유전자 대체 치료요법), 치료할 눈 질환에서 유리한 효과를 가질 관심의 폴리뉴클레오티드를 원추 광수용체로 전달함으로써(증상 치료요법) 수행될 수 있다. 다시 말해서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환을 치료할 수 있다. 유전자 대체 치료요법을 위해 사용될 수 있는 관심의 폴리뉴클레오티드의 예는 원추 광 수용체에서 특이적으로 또는 우선적으로 발현되는 유전자, 예를 들면 색소성 망막염 GTPase 조절인자(RPGRORF15)(참고: 1. B. S. Pawlyk, O. V. Bulgakov, X. Sun, M. Adamian, X. Shu, A. J. Smith, E. L. Berson, R. R. Ali, S. Khani, A. F. Wright, M. A. Sandberg, T. Li, Photoreceptor rescue by an abbreviated human RPGR gene in a murine model of X-linked retinitis pigmentosa. Gene Ther 23, 196-204 (2016).; 2. D. H. Hong, B. S. Pawlyk, M. Adamian, M. A. Sandberg, T. Li, A single, abbreviated RPGR-ORF15 variant reconstitutes RPGR function in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci 46, 435-441 (2005).; 3. W. A. Beltran, A. V. Cideciyan, A. S. Lewin, W. W. Hauswirth, S. G. Jacobson, G. D. Aguirre, Gene augmentation for X-linked retinitis pigmentosa caused by mutations in RPGR. Cold Spring Harbor perspectives in medicine 5, a017392 (2014).; 4. W. T. Deng, F. M. Dyka, A. Dinculescu, J. Li, P. Zhu, V. A. Chiodo, S. L. Boye, T. J. Conlon, K. Erger, T. Cossette, W. W. Hauswirth, Stability and Safety of an AAV Vector for Treating RPGR-ORF15 X-Linked Retinitis Pigmentosa. Hum Gene Ther 26, 593-602 (2015). 5. Z. Wu, S. Hiriyanna, H. Qian, S. Mookherjee, M. M. Campos, C. Gao, R. Fariss, P. A. Sieving, T. Li, P. Colosi, A. Swaroop, A long-term efficacy study of gene replacement therapy for RPGR-associated retinal degeneration. Hum Mol Genet 24, 3956-3970 (2015).; 6. W. A. Beltran, A. V. Cideciyan, A. S. Lewin, S. Iwabe, H. Khanna, A. Sumaroka, V. A. Chiodo, D. S. Fajardo, A. J. Romaen, W.-T. Deng, M. Swider, T. S. Alemaen, S. L. Boye, S. Genini, A. Swaroop, W. W. Hauswirth, S. G. Jacobson, G. D. Aguirre, in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2012), vol. 109, pp. 2132-2137), CNGB3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된 양이온 채널의 베타 소단위)(참고: 예컨대, Kohl et al.(2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302), GNAT2(트랜스듀신의 원추 특이적인 베타 소단위) 및 CNGA3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된 양이온 채널의 알파 소단위)(참고: 예컨대, GenBank 수탁 번호 NP_001289; 및 Booij et al. (2011) Ophthalmology 118: 160-167)이다.

일부 구현예에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 신경영양성 인자를 암호화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "신경영양성 인자"는 신경 세포의 생존 및 유지, 신경 분화의 촉진과 같은 생리학적 작용을 갖는 단백질의 일반 명이다. 일부 구현예에서, 신경영양성 인자는 RdCVF이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "RdCVF"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 로드-유도 원추 생존능 인자를 지칭한다(Leveillard T, Mohand-Said S, Lorentz O, Hicks D, Fintz A C, Clerin E et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet 2004; 36: 755-759.). 유전자는 추정된 티올-옥시도리덕타제 활성(JEFFERY, Trends Biochem. Sci., vol.24(l):8-l l, 1999; JEFFERY, Trends Genet., vol.19(8) :415-417, 2003)을 갖는 긴 형태(RdCVF-L, 217 aa, Q8VC33) 및 원추에 대한 영양 활성(trophic activity)을 지닌 짧은 형태(RdCVF-S, 109 aa, Q91W38) 둘 다를 암호화한다. 일부 구현예에서, 영양 인자는 RdCVF2이며, 이는 유전자 구조, 로드-의존성 방식의 발현 및 단백질 3D 구조의 측면에서 RdCVF와 많은 유사성을 공유한다(참고: 예컨대, WO2008148860 및 Chalmel F, Laeveillard T, Jaillard C, Lardenois A, Berdugo N, Morel E, Koehl P, Lambrou G, Holmgren A, Sahel JA, Poch O. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 2007 Aug 31;8:74). RdCVF와 유사하게, RdCVF2 짧은 동형은 이의 추정된 티올-옥시도리덕타제 활성과는 독립적인 원추 구조 활성(cone rescue activity)을 나타낸다. 일부 구현예에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 RdCVFL2를 암호화한다.

일부 구현예에서, 관심의 폴리뉴클레오티드 생성물은 옵신이다. 옵신 서열은 사람, 조류(algae) 및 세균을 포함하는 임의의 적합한 단세포 또는 다세포 유기체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 옵신은 로돕신, 포톱신, L/M 파장(적색/녹색) 원추-옵신, 또는 단 파장(S) 원추-옵신(청색)이다. 일부 구현예에서, 옵신은 채널로돕신 또는 할로로돕신 또는 크룩스할로로돕신이다. 일부 구현예에서, 옵신은 미국 특허 공보 제2007/0261127호(예컨대, ChR2; Chop2); 미국 특허 공보 제2001/0086421호; 미국 특허 공보 제2010/0015095호; 및 Diester et al. (2011) Nat. Neurosci. 14:387에 기술된 광-반응성 옵신이다. 옵신의 다른 예는 NpHR, eNpHR 1.0, eNpHR 2.0, eNpHR 3.0, SwiChR, SwiChR 2.0, SwiChR 3.0, Mac, Mac 3.0, Arch, ArchT, Arch 3.0, ArchT 3.0, iChR, ChR2, C1V1-T, C1V1-TT, Chronos, Chrimson, ChrimsonR, CatCh, VChR1-SFO, ChR2-SFO, ChR2-SSFO, ChEF, ChIEF, Jaws, ChloC, Slow ChloC, iC1C2, iC1C2 2.0, 및 iC1C2 3.0을 포함한다. 일부 구현예에서, 옵신은 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14, 또는 서열 번호: 15에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 이루어져 있다.

일부 구현예에서, 관심의 폴리뉴클레오티드 생성물은 유전자 기능의 부위-특이적인 녹-다운(knock-down)을 제공하는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제이며, 예컨대, 여기서 엔도뉴클레아제는 망막 질환과 관련된 대립형질을 녹 아웃(knock out)시킨다. 예를 들면, 우성 대립형질이, 야생형인 경우, 망막 구조 단백질이고/이거나 정상의 망막 기능을 제공하는 유전자의 결함이 있는 카피를 암호화하는 경우, 부위-특이적인 엔도뉴클레아제는 결함이 있는 대립형질에 대해 표적화되어 결함이 있는 대립형질을 녹 아웃시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 따라서 벡터는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 결함이 있는 대립형질의 기능성 카피를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 기능성 카피는 기능성 망막 단백질을 암호화한다. 사용하기 적합한 부위-특이적인 엔도뉴클레아제는 예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN); 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CRISPR-관련 엔도뉴클레아제"는 염기 서열의 짧은 반복체를 함유하는 원핵세포 DNA의 분절인 관련된 크리스퍼(주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열: clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR))를 지칭한다. 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, CRISPR-관련된 엔도뉴클레아제는 작은 가이드 RNA(gRNA) 및/또는 상동성-지시된 복구(homology-directed repair: HDR) 주형과 관련될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 CRISPR-관련된 엔도뉴클레아제는 Cas9 또는 이의 유도체이다. Cas9 뉴클레아제는 야생형 스트렙토코쿠스 피로게네스(Streptococcus pyrogenes) 또는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 서열, 바람직하게는 야생형 스트렙토코쿠스 피로게네스와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 야생형 스트렙토코쿠스 피오게네스 또는 스타필로코쿠스 아우레우스 Cas9 서열은 변형될 수 있다. 예를 들면, Cas9 뉴클레아제 서열은 상업적으로 이용가능한 벡터, 예를 들면, Addgene(매사츄세츠주 캠브릿지 소재)로부터의 PX330 또는 PX260 내에 함유된 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 엔도뉴클레아제는 Genbank 수탁 번호 KM099231.1 GL669193757; KM099232.1; GL669193761; CP032481; LT996890; CP031130; CP022607; AP014942 또는 KM099233.1 GL669193765의 Cas9 엔도뉴클레아제 서열 또는 PX330 또는 PX260의 Cas9 아미노산 서열(Addgene, 매사츄세츠주 캠브릿지 소재) 중 어느 것의 변이체 또는 단편인 아미노산 서열을 가질 수 있다. Cas9 뉴클레오티드 서열은 Cas9의 생물학적으로 활성인 변이체를 암호화하도록 변형될 수 있으며, 이러한 변이체는 예를 들면, 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 첨가, 결실, 또는 치환 돌연변이 또는 이러한 돌연변이의 조합)를 함유하는 덕분에 야생형 Cas9와는 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, Cas9 뉴클레아제는 보존된 FiNH 및 RuvC 도메인에서 돌연변이될 수 있으며, 이는 가닥 특이적인 절단에 포함된다. 예를 들면, RuvC 촉매 도메인 내 아스파르테이트-대-알라닌(D10A) 돌연변이는 Cas9 닉카제 돌연변이체(Cas9n)가 DNA를 절단하기 보다는 닉킹(nicking)시켜 단일-가닥 파괴를 생성하도록 하며, HDR을 통한 후속적인 우선적 복구는 오프-표적 이중-가닥 파괴로부터 원치않는 인델(indel) 돌연변이의 빈도를 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "하나 이상의 가이드 RNA"는 잔기의 삽입 또는 결실을 안내하는 RNA를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 가이드 RNA는 Cas9를 특수한 게놈 유전자자리(loci)에 보충하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 암호화 또는 비-암호화 서열에 대해 상보성인 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에게는 Cas9 엔도뉴클레아제를 암호화하는 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 벡터 및 가이드 RNA를 포함하는 적어도 하나의 벡터의 조합이 투여된다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 생성물은 간섭 RNA(interfering RNA: RNAi), 특히 siRNA이다. "작은 간섭" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 siRNA는 관심의 유전자에 대해 표적화된 뉴클레오티드의 RNA 듀플렉스(duplex)이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 2개의 영역 사이에 상보성 쌍화(complementary pairing)에 의해 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는 유전자에 대해 "표적화"되며 여기서 siRNA의 듀플렉스 부위의 뉴클레오티드 서열은 표적화된 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보성이다. 일부 구현예에서, siRNA의 듀플렉스의 길이는 30개 미만의 뉴클레오티드이다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 생성물은 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA)이다. 용어 "짧은 헤어핀" 또는 shRNA는 루프 구조 내에 뉴클레오티드를 함유하고, siRNA로 프로세싱된 RNA를 지칭한다. 따라서 shRNA는 또한 표적 유전자의 상보성 결합에 따라 서열-특이적인 방식으로 유전자의 녹-다운(know-down)을 초래한다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 생성물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 프레-mRNA 분자, hnRNA(이종 핵 RNA) 또는 mRNA 분자 내 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 이해된다. 안티센스 서열의 상보성(또는 실질적인 상보성)의 정도는 바람직하게는 안티센스 서열을 포함하는 분자가 생리학적 조건 하에서 RNA 분자 내 표적 뉴클레오티드 서열과 안정한 하이브리드를 형성할 수 있도록 한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "AAV"는 30개 이상의 천연적으로 발생하고 이용가능한 아데노-관련 바이러스 뿐만 아니라 인공 AAV를 지칭한다. 전형적으로, 본원에 기술된 AAV 캡시드, ITR, 및 다른 선택된 AAV 구성성분은 임의의 AAV, 예를 들면, 이에 한정되지 않는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, rh10, AAVrh64R1, AAVrh64R2, rh8, 공지되거나 언급된 AAV 중 임의의 변이체 또는 여전히 발견될 AAV 또는 이의 변이체 또는 혼합물로부터 용이하게 선택될 수 있다(참고: WO 2005/033321). 다양한 혈청형의 AAV의 게놈 및 단백질 서열 뿐만 아니라 천연의 말단 반복체(TR)의 서열, Rep 단백질 및 VP1 단백질을 포함하는 캡시드 단위는 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 공공의 데이타베이스, 예를 들면, GenBank 또는 Protein Data Bank(PDB)에서 발견할 수 있다(참고: 예컨대, GenBank 및 PDB 수탁 번호 NC_002077 및 3NG9(AAV-1), AF043303 및 1LP3(AAV-2), NC_001729(AAV-3), U89790 및 2G8G(AAV- 4), NC_006152 및 3NTT(AAV-5), 3OAH(AAV6), AF513851(AAV-7), NC_006261 및 2QA0(AAV-8), AY530579 및 3UX1(AAV-9 (단리체 hu.14)); 이의 개시내용은 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본원에 참고로 포함된다.(참고: 또한, 예컨대, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et al. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; 국제 특허 공보 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 6,156,303 및 US7906111.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합 AAV9-유도 벡터" 또는 "rAAV9-유도 벡터"는 AAV9 기원이 아니고(즉, 이종 서열, 예를 들면, 세포로 전달될 이식유전자) 이의 천연 DNA 또는 단백질(들)(Cap 및/또는 Rep)이 예를 들면, 이의 굴성을 변경시키도록 변형된 관심의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 아데노-관련 바이러스 제9형을 지칭한다. 다시 말해서, 상기 rAAV9-유도 벡터는 천연적으로 존재하지 않는다. 본 발명의 맥락에서, rAAV9-유도 벡터는 특수한 프로모터의 제어 하의 상술한 관심의 폴리뉴클레오티드 서열(이종 서열 로서) 뿐만 아니라 변형된 AAV9 VP1 캡시드 단백질을 포함함으로써, 벡터에 대한 중화 항체의 발달 및/또는 이웃하는 세포 내 오프-표적(off-target) 발현과 같은 임의의 잠재적인 부작용을 최소화하면서, 바람직하게는 망막하 주사 시, 원추 광수용체 내로 폴리뉴클레로티드의 효율적인 전달 및/또는 고-수준의 발현을 제공한다.

보다 특히, 본 발명에 따른 재조합 AAV9-유도 벡터는 다음을 포함한다:

- 7 내지 11개 아미노산 길이의 펩티드가 상응하는 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 상기 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입되어 있는 VP1 캡시드 단백질(여기서 상기 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 어느 하나를 포함한다); 및

상기 나타낸 바와 같이, 길이가 7 내지 11개 아미노산이고 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 임의의 하나를 포함하는 펩티드(또한 본원에서 삽입 펩티드로 불림)는 VP1 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입된다. 이는 상기 삽입 펩티드가 길이가 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산 또는 11개 아미노산의 길이를 가질 수 있음을 의미한다. 보다 특히, 삽입 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 임의의 하나의 아미노-말단 및/또는 카복실 말단에서 스페이서를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 적합한 스페이서는 하나 이상의 루이신, 알라닌, 글리신 및 세린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 삽입 펩티드는 바람직하게는 서열 번호: 9를 포함하거나 이로 이루어진다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 삽입 펩티드는 서열 번호: 9로 이루어진다. 삽입 펩티드의 역활은 야생형 AAV9와 비교하여 원추 광수용체내로 rAAV9-벡터 감염성을 증가시키는 것이다.

이러한 삽입 펩티드의 존재로 인하여, rAAV9-벡터의 VP1 캡시드 단백질은 야생형(즉, 천연) AAV9 캡시드 단백질(예를 들면, 서열 번호: 10)에 대하여 변형되는 것으로 일컬어진다. 임의로, 본 발명에 따른 VP1 캡시드 단백질은, 상기 캡시드 단백질이 관심의 폴리뉴클레오티드를 봉입(encapsulating)하여 관심의 표적 세포에 결합시키고, 상기 세포 내에 내재화하고 트래픽(traffic)하는 한, 추가의 변형(즉, 돌연변이), 예를 들면, 아미노산 결실, 아미노산 치환 또는 추가의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이의 도입을 허용하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들면, 돌연변이를 랜덤 또는 지시된 돌연변이유발에 의해, 변성 프라이머를 사용하는 PCR에 의해, 예컨대, 참고 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 도입시키는 것이 가능하다. 상기 기술은 문헌(Sambrook et al. in “Molecular Cloning: A laboratory Manual”, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012, 및 2014 이후 업데이트), 및 Ausubel et al. in “Current 25 Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (2012))에 명확히 기술되어 있다.

펩티드 삽입은 상기 캡시드 단백질의 GH 루프(또한 루프 IV로서 알려짐) 내, 보다 특히 GH 루프의 용매-접근가능한 영역 내에서 발생한다(Van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809; Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047; 및 Shen et al. (2007) Mol. Ther. 15: 1955). 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드의 삽입 부위는 AAV9 캡시드 단백질의 570 내지 614번 아미노산 사이에 위치한 2개의 인접한 아미노산 사이의 단일 삽입 부위이다. 예를 들면, 삽입 부위는 AAV9 캡시드 단백질의 571 내지 612번 아미노산 이내이다. 보다 바람직하게는, 상기 펩티드의 삽입 부위는 AAV9 캡시드 단백질의 588번 아미노산과 589번 아미노산 사이에 위치한다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 상술한 바와 같은 펩티드는 서열 번호: 10에 나타낸 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 588번과 589번 사이의 GH 루프내 삽입된다.

보다 바람직한 구현예에서, 상술한 펩티드는 서열 번호: 10에 나타낸 야생형 AAV9 캡시드 단백질의 588번 아미노산과 589번 아미노산 사이의 GH 루프 내에 삽입된다.

심지어 보다 바람직하게는, 서열 번호: 1을 포함하는 펩티드, 바람직하게는 서열 번호: 9의 펩티드는 서열 번호: 10에 나타낸 바와 같은 야생형 AAV9 캡시드 단백질의 588번과 589번 사이의 GH 루프 내에 삽입된다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 rAAV9 벡터는 가장 바람직하게는 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 관심의 폴리뉴클레오티드 서열(즉, AAV에 대해 이종인 폴리뉴클레오티드)이다. 따라서, 본 발명의 재조합 AAV9-유도 벡터 내에서, 서열 번호: 10에 나타낸 바와 같은 AAV9의 천연의 VP1 캡시드 단백질은 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질에 의해 치환될 수 있다.

본 발명의 재조합 AAV9-유도 벡터는 전형적으로 5' 및 3' 아데노-관련 바이러스 역위된 말단 반복체(ITR)인, 프로모터 pR1.7에 작동적으로 연결된 관심의 폴리뉴클레오티드(즉, 이종 폴리뉴클레오티드)이다. 본 발명의 목적을 위하여, 프로모터 pR1.7에 작동적으로 연결된, 관심의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 2개의 AAV ITR에 의해 플랭킹(flanking)된다. 본 발명의 벡터는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 생산된다. 요컨대, 방법은 일반적으로 (a) AAV 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, (b) AAV 헬퍼 작제물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계(여기서 헬퍼 작제물은 AAV 벡터로부터 잃은 바이러스 기능을 포함한다) 및 (c) 헬퍼 바이러스를 숙주 세포내로 도입하는 단계를 포함한다. AAV 비리온(virion) 복제 및 패키징(packaging)을 위한 모든 기능은 AAV 벡터를 AAV 비리온 내로 복제하고 패키징하는 것을 달성하기 위해 존재할 필요가 있다. 숙주 세포내로의 도입은 표준 바이러스학 기술을 사용하여 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 최종적으로, 숙주 세포를 배양하여 AAV 비리온을 생산하고 표준 기술, 예컨대, 이오딕산올 또는 CsCl 구배 또는 다른 정제 방법을 사용하여 정제한다. 이후에 정제된 AAV 비리온은 방법에서 사용하기 위해 준비한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향과 관련하여 상부에 위치한, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 핵산 단편을 지칭하며, DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 전사 개시 부위 및 임의의 다른 DNA 서열, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는 전사 인자 결합 부위, 리프레서(repressor) 및 활성인자 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터 전사의 양을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하기 위해 당해 분야의 기술자에게 공지된 뉴클레오티드의 임의의 다른 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "pR1.7 프로모터"는 문헌(Hum Gene Ther. 2016 Jan;27(1):72-82)에 기술되고 서열 번호: 12에 나타낸 핵산 서열에 의해 특징화된 1.7-kg L-옵신 프로모터를 지칭한다. 프로모터 및 관심의 폴리뉴클레오티드는 작동적으로 연결되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동적으로 연결된"은 서로 기능적 관계에 있도록 하는 방식으로 물리적으로 연결된 2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 성분을 지칭한다. 예를 들면, 프로모터가 암호화 서열의 전사 및/또는 발현을 개시하거나 달리는 제어/조절할 수 있는 경우 프로모터는 암호화 서열에 작동적으로 연결되며, 이러한 경우에 암호화 서열은 프로모터 "의 제어하에" 있는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로, 2개의 핵산 서열이 작동적으로 연결되어 있는 경우, 이들은 동일한 배양으로 존재할 것이며 일반적으로 또한 동일한 판독 프레임 내에 있을 것이다. 이들은 일반적으로 또한 필수적으로 연속적일 것이나, 이것이 요구되지 않을 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 rAAV9-유도 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 관심의 폴리뉴클레오티드는 pR7.1 프로모터의 기능성 변이체의 제어 하에 있다. pR7.1 프로모터의 "기능성 변이체"는 전형적으로 관심의 폴리뉴클레오티드의 전사를 유의적으로 변경시키지 않는, 천연의 pR7.1 프로모터(서열 번호: 12)에 대하여 하나 이상의 뉴클레오티드 돌연변이(예를 들면, 뉴클레오티드 결실, 첨가, 및/또는 치환)을 전형적으로 갖는다. 본 발명의 맥락에서, 상기 기능성 변이체는 관심의 폴리뉴클레오티드의 원추 광수용체 내에서 강력한 발현을 유도하는 능력을 보유한다. 이러한 능력은 문헌(Ye et al. (2016) (18) and Khabou et al. (2018))(17)에 기술된 바와 같이 시험할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 관심의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 12에 나타낸 바와 같은 pR1.7 프로모터 또는 이에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 상기 프로모터의 기능성 변이체의 제어 하에 있다.

기술자에게 잘 공지된 바와 같이, 2개의 뉴클레오티드(또는 아미노산) 서열 사이의 "서열 동일성 %"는 최적의 비교를 위한 정렬시, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 기능이다. 비교된 서열 내 위치가 동일한 뉴클레오티드(또는 아미노산)에 의해 점유되는 경우, 서열은 이러한 위치에서 동일한 것으로 일컬어진다. 실제로, 동일성은 완전한 매치(match) 만을 지칭하며, 서로에 대한 뉴클레오티드(또는 아미노산)의 유사성의 정도를 고려하지 않는다. 서열 동일성의 퍼센트는 동일한 위치의 수에 100을 곱하고 갭(내부 갭 단독, 서열 말단에서의 갭은 제외)을 포함하는, 정렬된 영역(오버랩핑 위치)의 길이를 나누어서 계산할 수 있다. 이러한 비교에서, 서열은 동일한 길이일 수 있거나, 상이한 길이일 수 있다. 서열의 최적의 정렬은 본원에서 바람직하게는 전반적인 상동성 정렬에 의해 수행될 수 있으며 알고리즘은 니들만(Needleman) 및 운슈(Wunsch)(Journal of Molecular Biology; 1970, 48(3): 443-53)에 의해 기술된 알고리즘에 의해, 이러한 알고리즘의 컴퓨터처리된 실행에 의해(예컨대, DNASTAR® Lasergene 소프트웨어 사용), 또는 가시적 관찰에 의해서와 같이, 동일하거나 유사한 길이의 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 정렬은 명확한 길이의 서열을 사용하여 수행하여야 하며, 서열의 최적의 정렬은 바람직하게는 국소 상동성 정렬 알고리즘(local homology alignment algorithm)에 의해, 예를 들면, 스미스(Smith) 및 워터슨(Waterson)이 기술한 알고리즘(Journal of Molecular Biology; 1981, 147: 195-197)에 의해, 이러한 알고리즘의 컴퓨터처리된 실행에 의해(예컨대, DNASTAR® Lasergene 소프트웨어 사용), 또는 가시적 관찰에 의해 수행될 수 있다. 전반적 및 국소 상동성 정렬 알고리즘의 예는 숙련된 기술자에게 잘 공지되어 있으며, ClustalV(전반적인 정렬), ClustalW(국소 정렬) 및 BLAST(국소 정렬)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"치료적으로 유효한 양"은, 충분한 이익/위험 비에서 망막 질환을 치료하기에 충분한 벡터의 양을 의미한다. 벡터의 총 1일 사용은 건전한 의학적 판단 영역 내에서 주치의에 의해 결정될 것이다. 임의의 특수 환자에 대한 특수한 치료적으로 유효?h 용량 수준은 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용된 특수한 화합물의 배출 속도를 포함하는 다양한 인자; 치료 기간; 사용된 특수한 폴리펩티드와 함께 또는 동시에 사용된 약물; 및 의학 분야에서 잘 공지된 유사 인자에 의존할 것이다. 예를 들면, 화합물의 용량을 목적한 치료적 효과를 달성하는데 필요한 용량보다 더 낮은 수준에서 출발하여 목적한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 벡터의 용량은 질환 상태, 대상체(예를 들면, 대상체의 체중 및/또는 연령, 물질대사, 망막의 상태 등에 따라), 치료 스케쥴 등에 따라 조정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 바람직한 유효한 용량은 원추 광수용체의 최적의 형질도입을 허용하는 용량이다. 전형적으로 10⁸ 내지 10¹⁰개의 바이러스 게놈(viral genomes; vg)이 마우스 내에서 용량 당 투여된다. 전형적으로, 사람에서 투여될 AAV 벡터의 용량은 바람직하게는 눈(eye) 당 10⁹ 내지 10¹² vg의 범위일 수 있다.

따라서 본 발명의 벡터는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 벡터 외에도, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하며 활성 성분(즉, 본 발명의 벡터)의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정밀한 특성은 기술자에 의해 투여 경로, 즉, 여기서 망막하 주사에 따라 측정될 수 있다. 약제학적 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광 오일 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리학적 염수 용액, 염화마그네슘, 덱스트로즈 또는 다른 사카라이드 용액 또는 글리콜, 예를 들면, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜리 포함될 수 있다. 주사를 위해, 활성 성분은 수용액의 형태일 것이며, 이는 발열원이 없고(pyrogen-free), 적합한 pH, 등장성 및 용해도를 갖는다. 당해 분야의 관련 기술자는 예를 들면, 등장성 비히클, 예를 들면, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액(Ringer's Injection), 락테이트화된 링거 주사액(latated Ringer Injection)을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제, 예를 들면, 주사 물질에 대한 결합을 피하는 세제와 같은 다른 첨가제(즉, 플루로닉(Pluronic))이 필요할 경우, 포함될 수 있다. 지연된 방출을 위해, 벡터가 약제학적 조성물 속에 포함될 수 있으며, 이는 서방출(slow release)을 위해, 예를 들면, 생적합성 중합체로부터 형성된 마이크로캅셀(microcapsule) 또는 당해 분야에 공지된 방법에 따른 리포좀 담체 시스템 속에 포함될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 예비충전된 주사기 속에 공급된다. "사용 준비된 주사기(ready-to-use syringe)" 또는 "예비충전된 주사기"는 충전된 상태로 공급된 주사기이며, 즉, 투여될 약제학적 조성물은 주사기 속에 이미 존재하며 투여용으로 준비된다. 예비충전된 주사기는 별도로 제공된 주사기 및 바이알과 비교하여 많은 이점, 예를 들면, 증진된 편의성, 감당능력(affordability), 정밀도, 살균성(sterility), 및 안전성을 갖는다. 예비충전된 주사기의 사용은 보다 큰 용량 정확도, 바이알로부터 약물이 빠져나오는 동안 발생할 수 있는 침 스틱 손상(needle stick injury)에 대한 잠재능의 감소, 주사기 내로 의약을 재구성하고/하거나 꺼내는 것에 대한 필요성으로 인하여 투여 오차를 감소시키는 예비-측정된 투여량, 및 약물 소비를 최소화함으로써 비용을 감소시키는데 도움을 주는 주사기의 과충전을 적게한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물의 pH는 5.0 내지 7.0, 5.1 내지 6.9, 5.2 내지 6.8, 5.3 내지 6.7 또는 5.4 내지 6.6의 범위 내이다.

청구범위에도 불구하고, 본 발명은 다음의 절(clause)의 방식으로 또한 정의된다.

절 1. 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV9-유도 벡터의 치료적으로 유효한 양을 망막하 전달함을 포함하여, 대상체의 원추 광수용체에서 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.

절 2. 절 1에 있어서, 대상체가 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환에 영향을 받거나 영향받을 가능성이 있는 방법.

절 3. 절 1에 있어서, 대상체가 노화-관련 황반 변성, 바센-코르츠바이크 증후군, 맥락막결손증, 우곡상 위축, 레프섬 증후군, 어셔 증후군, 색각이상, 청색 원추 단색형색각, 완전 색맹, 불완전 색맹, 올리고콘 삼색형색각, 색소성 망막염(RP), 황반 변성, 스타르가르트 질환, 바뎃-비들 증후군, 본홀름 눈 질환, 베스트 질환 및 레베르 선천성 흑암시로 이루어진 그룹으로부터 선택된 망막 질환을 앓는 방법.

절 4. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 색소성 망막염 GTPase 조절인자(RPGRORF15), CNGB3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된 양이온 채널의 베타 소단위), CNGA3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된 양이온 채널의 알파 소단위) 또는 GNAT2를 암호화하는 방법.

절 5. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 신경영양 인자를 암호화하는 방법.

절 6. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 RdCVF, RdCVF2, RdCVFL 또는 RdCVFL2를 암호화하는 방법.

절 7. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 할로로돕신 또는 크룩스할로로돕신과 같은 로돕신, 포톱신, L/M 파장(적색/녹색) 원추-옵신, 또는 단 파장(S) 원추-옵신(청색)과 같은 옵신을 암호화하는 방법.

절 8. 절 7에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 또는 서열 번호: 15에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 옵신을 암호화하는 방법.

절 9. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자 기능의 부위-특이적인 녹-다운(knock-down)을 제공하는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제를 암호화하는 방법.

절 10. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 방법.

절 11. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 간섭(interfering) RNA(RNAi), 특히 siRNA 또는 shRNA를 암호화하는 방법.

절 12. 절 1에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드를 암호화하는 방법.

절 13. 절 1에 있어서, 망막하 전달이 상기 영역의 박리없이 중심와의 거리에서 수행되는 방법.

절 14. 서열 번호: 11에 나타낸 바와 같은 VP1 캡시드 단백질 및 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 AAV9-유도 벡터.

절 15. 절 14에 있어서, 원추 광수용체에 영향을 미치는 망막 질환의 치료 방법에서 사용하기 위한 재조합 AAV9-유도 벡터.

본 발명을 다음의 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다. 그러나, 이러한 실시예 및 도면은 어떠한 방식으로도 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도면
도 1. AAV9-7m8은 원위 수포(diatal bleb) 내 전달을 통해 중심와를 형질도입하며 PR1.7-Jaws와 견고한 광유전자 광 반응을 제공한다. (A) 안저(Eye fundus) 적외선 영상 및 (B) 말초 망막 내에서 AAV9-7m8의 망막하 전달 직후 광 간섭성 단층촬영기술(optical coherence tomography: OCT) 영상. (C) 주사 1개월 후 안저 형광성 영상은 망막하 수포 내에서 및 중심와를 포함하여, 주사 부위로부터 떨어서 강력한 Jaws-GFP 발현을 나타낸다. 삽입도 확대: ×1.5. (D-F) 중심와 플랫마운트(foveal flatmount)는 망막하 AAV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP를 사용한 매우 효율적이고 특이적인 중심와 형질도입을 나타낸다. 기준 자(Scale bar): 50 μm. (G-L) Jaws의 광유전자 자극에 의해 개시된 광 반응의 특성화. (G) 2-광자 영상을 사용한 살아있는 조직내 Jaws-발현 원추의 측면도. (H 및 I) Jaws-GFP+ 마카퀴 원추의 전체-세포 패치 클램프 기록(Whole-cell patch clamp recordings). 광 강도의 기능으로서 Jaws-유도된 광전류, 자극은 1 × 1014로부터 3 × 1017 광자 cm-2 s-1(n = 2마리의 동물의 2개의 망막으로부터의 9개 세포)까지 적용하였다. (J) 광-유도된 과분극에 이어 짧은 탈분극을 나타내는, 전류 제로 방식(안정 막 전위는 회색으로 나타냄)에서 전류-클램프 구조로 기록된 Jaws-GFP+ 원추. (K) 망막하 주사된 마카퀴 눈에서 자극 파장의 기능으로서 Jaws-유도된 광전류. 자극은 8 × 1016 광자 cm-2·s-1과 동일한 강도에서, 400-650 nm로부터 적용하였고, 25-nm 단계로 분리하였다. 최대 반응은 575 nm(별표)에서 수득하였다. (L) 일시적 특성의 특성화. 2-30 Hz로부터, 8 × 1016 광자 cm-2·s-1에서, Jaws-발현 마카퀴 원추 내에서 증가하는 자극 주파수에서 Jaws-유도된 막 광전류의 변화(modulation). AAV, 아데노-관련 바이러스; PR1.7: 사람 적색 옵신 유전자 인핸서 및 프로모터 서열을 기반으로 한, 길이가 1.7 킬로염기(kilobase)인 프로모터; IR: 적외선.
도 2. 용량 반응의 특성화를 위한 마카퀴 안저 영상. AAV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP의 1x1010개 입자(n=1개의 눈, 우세한 수포)(A) 및 5x109개 입자(n=2개의 눈, 열악한 수포)(B)의 망막하 주사 후 2주째에 Jaws-GFP 발현.
도 3. 생체내 안저 및 광 간섭 단층촬영장치(optical coherence tomography: OCT) 영상을 사용하는 원위 하급 망막하 투여 사후 점검(follow-up). 영상은 AAV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP, 5x109 바이러스 입자(n=2개의 눈)의 말초 주사 전 및 후에 획득하였다. 안저 적외선 영상은 황반에 중점을 두고 있으며 OCT 영상은 주사 직전 및 직후에 중심와의 수준에서 또는 수포의 수준에서 취하였다. 사후점검 영상은 동물이 앉아있는 동안 주사 1시간 후 획득하였다. 다른 영상은 주사 24시간 후 획득하였다. 수소: 망막하 주사된 유액; hrs: 시간; 별표: 중심와; 굵은 화살표: 각각의 영상의 우측 부분에 나타낸, 강조된 망막의 OCT 영상; 사선: 수포의 획선(delimitation).
도 4. 고 용량의 AVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP를 망막하 공간 내로 주사한 동물로부터의 대표적인 조직학적 발견. 기준자 100 μm. RPE: 망막 색소 상피; ONL: 외부 핵 층; INL: 내부 핵 층; GCL: 신경절 세포 층.
도 5. 중심와 근처의 면역조직화학은 유리체내 주사 후 적응성 세포 면역 반응이 없음을 시사한다. 좌측 패널은 망막하 주사 후 AAV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP(1010 vg)로 처리된 2개의 눈 중 하나로부터의 대표적인 영상을 나타낸다. 우측 패널은 4개의 주사되지 않은 눈 중 하나의 대표적인 영상을 나타낸다.

실시예:

물질 & 방법:

AAV 생산

AAV 벡터는 동시-형질감염 방법을 사용하여 앞서 기술한 바와 같이 생산하였고 요오딕산올(iodixanol) 구배 초원심분리로 정제하였다(49). AAV 벡터 스톡(stock)은 정량적 PCR(50)로 SYBR 그린(Green)(Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 적정하였다.

동물 및 안내 주사(Animals and intraocular injections)

야생형 C57BL6/j(Janvier Labs) 또는 rd10 마우스(Vision Institute의 동물 시설에서 교배되어 생산됨), 및 시노몰구스 마카퀴(cynomolgus macaque)(Noveprim, Mauritius)를 본 연구를 위해 사용하였다.

눈 주사(n=6개의 눈/조건)를 위해, 6-주령의 암컷 마우스를 이소플루오란 흡입으로 마취시켰다. 동공을 확장시키고 33-게이지(gauge) 침을 눈 내로 삽입하여 2 μL의 AAV 벡터 용액을 유리체내로 또는 1μL를 망막하로 전달하였다.

마카퀴 눈 주사와 관련하여, 마카퀴를 우선 AAV에 대한 중화 항체 역가의 부재를 기반으로 선택하였다. 수술에 앞서, 영장류를 10 mg/kg의 케타민 및 0.5 mg/kg의 크실라진을 근육내 주사하여 마취시켰다. 마취는 프로포폴, 1ml/kg/h(PropoVet Multidose 10mg/ml, Zoetis)의 정맥내 주사로 유지시켰다. 이후에, 이의 동공을 확장시키고 이의 눈꺼풀을 분벌리개(eyelid speculum)를 사용하여 눈이 떠 있도록 하였다. 32-mm, 27-게이지 침이 장착된 1-ml의 주사기를 유리체내 주사를 위해 사용하였다. 침은 자장자리에 대해 뒤쪽으로 대략 2 mm까지 공막 내로 삽입하여 100 μl의 바이러스 벡터 용액을 전달하였다. 최종적으로, 침을 서서히 제거하였다. 동물에게 국소 코르티코스테로이드 주사를 제공하지 않았다.

망막하 AAV 주사를 위해, 2개의 25-게이지 유리체절제술 포트(vitrectomy port)를 가장자리에 대해 뒤쪽으로 대략 2 mm까지 셋팅하였으며, 하나는 엔도-조명 프로브(endo-illumination probe) 용이었고 다른 것은 망막하 캐뉼라(subretinal cannula) 용이었다. 41-게이지 팁(gauge tip)이 있는 25-게이지 망막하 캐뉼라가 장착된 1-ml들이 Hamilton 주사기를 주사에 사용하였다. 엔조조명 프로브 및 캐뉼라를 눈 내로 도입하였다. 바이러스 벡터 용액(50 μl)을 망막하에 주사하여 중심와의 하부 또는 상부에 수포를 생성시켰다. 이후에 장치를 제거하였다. NHP5의 우측 눈을 제외하고는 12 mg의 케나코트(Kenacort)(Bristol-Myers Squibb)의 측안구 주사(laterobulbar injection)로 이루어진 코르티코스테로이드 치료(47)를 눈에 제공하였다. 망막하 또는 유리체내 벡터 투여 후, 눈 스테로이드(opthtalmic steroid) 및 항생체 연고(Fradexam, TVM)를 주사 후 각막에 적용시켰다.

생체내 마카퀴 눈 영상

동공 확장 후, Spectralis HRA+OCT 시스템(Heidelberg Engineering, 독일)을 사용하여 OCT 영상을, 및 488 nm의 여기 파장 및 500 nm의 장벽 여과기로 이루어진 "기저부 자가형광성 방식(Fundus Autofluoresence mode)"을 사용한 GFP의 형광성 영상을 획득하였다.

마카퀴 망막의 2-광자 영상 및 생체외(ex-vivo) 전기생리학적 기록

펄스된 펨토-초 레이저(pulsed femto-second laser)(InSight™ DeepSee™ - Newport Corporation)가 있는 40x 수 침지 대물렌즈(LUMPLFLN40x/W/0.80, Olympus)가 장착된 2-광자 현미경을 전체가 올려진 망막(광수용체-세포가 위로 향하도록 함) 또는 망막 슬라이스(수직 단면)으로부터의 GFP-양성 망막 세포를 영상화하는데 사용하였다. AAV-처리된 마카퀴 망막을 단리하고 후에 산소화된(95% O2, 5% CO2) Ames 배지(Sigma-Aldrich) 속에서 영상화하였다. 살아있는 2-광자 영상을 위해, 망막을 현미경의 기록 챔버(recording chamber)에 두고, z-스택(stack)을 930 nm의 파장에서 여기 레이저를 사용하여 획득하였다. 영상을 ImageJ(NIH)를 사용하여 오프라인에서 가공하였다. 전체-세포 패치-클램프 기록을 위해, Axon Multiclamp 700B 증폭기를 사용하였다. 전극을 붕규산염 유리(BF100- 50-10, Sutter Instruments)로부터 제조하여 6-9 MΩ까지 끌어당겼다. 피펫을 115 mM K 글루코네이트, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, 1.5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 및 4 mM ATP-Na2(pH 7.2)로 충전시켰다. 세포를 전압-클램프 구조에서 -40 mV의 전위로 클램핑(clamping)하거나, 전류-클램프(전류 제로) 구조로 기록하였다. 망막을 기록 전에 기록 챔버 속에서 적어도 30분 동안 암실에 적응시켰다.

사람 iPSC 배양

본 발명자들은 이미 발표된 프로토콜(37)을 기반으로 하여 사람 iPSC로부터 망막 기관모양을 생성시켰다. 클론 hiPSC-2를 확장시키고 앞서 기술한 바와 같이(37) "전신경 배지" 속의 산후 사람 포피(ATCC CRL 2429)로부터의 섬유아세포 공급자에서 분화시켰다. 고 합치성의 부착성(highly confluent adherent) iPS 세포 배양물로부터 출발하여 및 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)의 부재하에서, 자가-형성 망막 기관모양을 2주 후 확인할 수 있다. 이 시점에서, 기관모양을 기계적으로 단리하고 3D 조건에서 43일까지 배양하였다. FGF2를 기관모양의 기계적 단리 후 7일 동안 3개 조건 속에서 배지에 공급함으로써 이의 성장을 촉진시켰다. 망막 기관모양을 분화 28일 째에 5x10¹⁰ vg/기관모양의 용량에서 GFP 유전자를 수반하는 AAV2-7m8 벡터를 사용하여 pR1.7 프로모터의 제어 하에 감염시켰다. 10 μM DAPT(Selleck)를 28일째로부터 1주 동안 배지에 가하여 존재하는 세포 집단의 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 촉진시켰다. 형광성 강도를 감염 후 5일째에 처음 관찰하고 43일까지 지속적으로 증가시켰다.

사람 사후의 망막 체외이식편(explant)

사람 망막 체외이식편을 앞서 기술된 프로토콜(38)을 사용하여 제조하였다. 요약하면, 눈을 CO2-독립-배지(Thermo Fischer Scientific) 속에서 절개하였다. 전방 부위를 제거하고, 망막을 단리하며 작은 조각으로 절단하였다. 이러한 체외이식편을 트랜스웰 세포 배양 삽입체(Transwell cell culture insert)(Corning) 상에 광 수용체를 위로 향하도록 위치시키고, B27(Thermo Fischer Scientific)이 보충된 신경기본 배지(Neurobasal medium)(Thermo Fischer Scientific) 2mL를 각각의 체외이식편 아래의 각각의 웰(well)에 가하였다. 다음 날, 각각의 체외 이식편을 10¹⁰개의 바이러스 입자를 함유하는 AAV-pR1.7-GFP의 0,5 μL의 1 방울로 감염시켰다. 벡터-감염된 체외이식편을 10 내지 15일 동안 항온처리함으로써 GFP 발현을 허용하였으며, 이는 에피형광 매크로스코프(epifluorescence macroscope)를 사용하여 점검하였다.

조직학, 면역조직화학 및 현미경

마우스 눈을 적출하고 크리오섹션(cryosection)을 위해 즉시 10% 포르말린 - 4% 포름알데하이드 속에 2시간 동안 고정시켰다. 마카퀴 망막을 4% 포름알데하이드 속에 절개 후 3시간 동안 고정시켰다. 망막 기관모양 및 사람 망막 체외이식편을 이들의 배양 주기 말기에 PBS 속에서 세정하고 4% 파라포름알데하이드 속에 10분 동안 고정시켰다. 크리오섹션을 위해, 마우스 및 마카퀴 망막, 망막 기관모양 및 사람 망막 체외이식편을 PBS-30% 슈크로즈 속에 4℃에서 밤새 침지시켰다. 마우스 세안컵(eyecup), 사람 망막 체외이식편, 마카퀴 망막을 OCT(최적의 절단 온도) 배지 속에 포매(embedding)시키고 액체 질소 속에서 동결시키면서, 이 동안 망막 기관모양을 PBS 중 7.5% 젤라틴 및 10% 슈크로즈 속에 포매시키고 무수 빙-냉 이소펜탄 속에서 동결시켰다. 10 μm-두께의 수직 단면을 미크롬 저온유지장치(Microm cryostat)로 절단하였다. 차단 완충액 속에서 항온처리 후, 단면을 4℃에서 밤새 1차 항체: 사람 원추 아레스틴(human Cone Arrestin: hCAR) 항체(미국 로스앤젤레스 소재의 서던 캘리포니아 대학 체리 크라프트(Cheryl Craft)로부터의 선물); M/L 옵신 항체(Millipore AB5405), 및 마우스 원추 아레스틴 항체(Millipore, AB15282)와 함께 항온처리하였다. 단면을 다수회 세척한 후, 제2 항체(Alexa Fluor 488, 594 또는 647, ThermoFisher) 및 DAPI를 가한 후, 수회 세척하였다. 망막 플랫마운트 또는 동결단면을 형광 현미경용 벡타쉴드 마운팅 배지(Vectashield mounting medium)(Vector Laboratories) 속에 넣고, 안드레티날 단면(andretinal section)을 Olympus Upright 공초점 현미경을 사용하여 가시화한 후 Fiji 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 중심와의 3-차원 영상을 Imaris 소프트웨어(Bitplane)를 사용하여 생성시켰다.

잠재적인 조절 요소 및 전사적 분석의 인 실리코(In silico) 확인

TF 결합 부위 분석을 적색 옵신 유전자 프로모터 서열 - pR2.1 및 pR1.7 서열 - 및 원추 아레스틴 3 게놈 영역에서 수행하였다. TRANSFAC 데이타베이스 8.3(http://alggen.lsi.upc.es/)를 TF 결합 부위 예측에 사용하였다. 예측된 목록으로부터의 각각의 TF를 감각 시스템(Sensory System)(KBASS, http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/transcriptomics/index.php)용 놀리지 베이스(Knowledge Base)를 사용하여 분석함으로써 전사적 실험 RNG209(51)을 사용하여 사람 망막 속에서 발현된 것을 선택하였다. 필터를 사용하여 앞서 기술한 바와 같이(52) 견고한 다중-배열 평균(Robust Multi-array Average: RMA)으로 표준화한 후 실험 RNG209로부터 제조한 샘플 속에서 40 단위(unit)보다 우수한 신호 강도 값을 지닌 TF를 유지시켰다. 당해 실험에서, 대조군으로서 사용한 사람 망막 표본(specimen)은 눈 질환 또는 당뇨병의 과거 병력이 없는 환자의 사망 후 12시간 내에 수집한 사후 표본이었다. 19개의 샘플을 17명의 환자를 나타내는 19개의 눈으로부터 수집하였다. 성별 비는 평균 연령이 61세(25 내지 78세)인 12명의 남성/7명의 여성이었다.

통계학

데이타를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)(다중 비교, 터키 수정(Tukey correction))에서 일원 분산 분석(one-way Anova test)을 사용하여 분석하였다. 그래프에서 오차 바아(error bar)는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. p 값은 다음의 *p<0,033로서 나타내며, ns는 비-유의적이다.

연구 승인

동물의 경우, 실험은 실험 동물의 보호 및 사용을 위한 국립 기관의 보건 지침(National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 실현시켰다. 프로토콜은 지역 동물 윤리 위원회(Local Animal Ethics Committees)에 의해 승인되었으며 유럽 의회(European Parliament)의 지시 2010/63/EU에 따라 수행하였다. 공여자로부터의 사후 사람 안구는 수술 학교(School of Surgery)(Ecole de Chirugie, Assitance Publique Hopitaux de Paris)로부터 획득하였다. 프로토콜은 수술 학교 및 퀸제-빙츠 국립 안과 병원(Quinze-Vingts National Ophtalmology Hospital)의 기관감사위원회에 의해 입증되었다. 사후 사람 망막 체외이식편에 대한 모든 실험은 지역 규제뿐만 아니라 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)의 지침에 따라 수행하였다.

결과:

쥐 모델에서 강력하고 특이적인 원추-세포 특이적인 프로모터의 선택

주사 부위로부터 떨어져서 표적화하는 강력하고 특이적인 원추에 적합한 벡터-프로모터 조합을 발견하기 위하여, 본 발명자는 마우스 망막내 유리체내 및 망막하 전달 후 수개의 AAV를 비교하였다. 효율적인 원추 광수용체 표적화가 가능하도록 하기 위하여, 본 발명자는 AAV2-7m8로 불리는 가공된 AAV를 사용하였으며, 이는 투여 경로 둘 다를 통해 광수용체를 효율적으로 표적화하는 것으로 밝혀졌다(16, 17). 원추 세포의 특이적인 표적화는 유리체에 투여된 AAV를 사용하여 시도된 적은 전혀 없었다. 임상에서 적용가능한 원추내 제한된 유전자 발현을 위해 적합한 프로모터 서열을 발견하기 위하여, 본 발명자는 비-사람 영장류(NHP)(18) 또는 사람 조직(4)에서 이미 입증된 프로모터에 촛점을 맞추었다. 본 발명자들은 mCAR(마우스 원추 아레스틴), pR2.1 및 pR1.7 프로모터(사람 적색 옵신 유전자 인핸서 및 프로모터 서열을 기반으로 한 합성 프로모터)의 제어 하에서 GFP를 암호화하는 AAV2-7m8 벡터를 생성시키고 이들을 6주령의 야생형 마우스의 눈에 동등한 역가에서 주사하였다. 망막하 주사 후 3주째에, 망막 교차-단면을 원추 아레스틴으로 염색하고 GFP 발현을 실험하였다(데이타는 나타내지 않음). 본 발명자들은 mCAR 프로모터를 사용하여 로드 및 원추 광수용체 둘 다에서 높은 GFP 발현을 발견하였지만 pR2.1 및 pR1.7은 주로 원추에서 강력한 발현을 초래한다. 동일한 벡터를 사용하여, 본 발명자들은 유리체내 전달 후 매우 상이한 발현 패턴을 수득하였다(데이타는 나타내지 않음). mCAR 프로모터는 일부 원추 내에서 GFP 발현을 초래하지만, 로드 뿐만 아니라 내부 핵 층(INL) 및 신경절 세포 층(GCL)의 세포 쪽으로 드러났다(데이타는 나타내지 않음). pR2.1 및 pR1.7 프로모터 둘 다는 mCAR 프로모터보다 더 원추 표지화를 초래한다(데이타는 나타내지 않음). pR2.1은 pR1.7보다 더 원추를 형질도입시켰으나, 이는 또한 INL 및 GCL에서 비-특이적인 GFP 발현을 생산하였다. pR1.7 프로모터 만이 로드에 있어서 최소의 발현으로 원추내 GFP 발현을 나타내었으며 내부 망막을 향해 드러나지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 최종적으로, 망막 질환 상태는 AAV-매개된 유전자 전달 및 전이유전자 발현 패턴에 영향을 미칠 수 있으므로(20, 21) 본 발명자들은 망막 변성의 마우스 모델에서 AAV2-7m8-pR1.7 벡터-프로모터 조합을 입증하였다. 본 발명자들은 AAV2-7m8-pR1.7-GFP를 색소성 망막염의 rd10 마우스 모델에서 유리체 내에 주사하였다. 주사 2개월 후, GFP 발현은 유리체내 및 망막하 주사 둘 다를 통해 원추-지시된 유전자 치료요법을 위한 이러한 벡터의 적합성을 뒷받침하는 원추에 한정되었다(데이타는 나타내지 않음).

mCAR, pR1.7 및 pR2.1 프로모터 서열의 생물정보 분석

다른 종에서 추가의 연구로 이동하기 전에, 본 발명자들은 3개의 프로모터를 사용하여 수득된 다양한 발산 패턴 이면의 이유를 보다 잘 이해하는데 목표를 두었다. 이를 위해, 본 발명자들은 생물정보학을 사용하여 각각의 프로모터 서열내 전사 인자(TF) 결합 부위를 분석하였다(데이타는 나타내지 않음). 본 분석은 다음의 질문에 답하는 것을 목표로 하였다: (i) pR1.7가 원추에서 pR2.1보다 더 효과적인 이유, (ii) pR2.1 및 mCAR 프로모터가 유리체내 투여 후 오프-표적(off-target) 발현을 초래하는 이유. 본 발명자들은 pR1.7과 pR2.1 사이에 관찰된 차등적인 발현 패턴이 pR2.1 프로모터의 5' 영역내에 위치한 337 bp 서열 내에서 발견된 추가의 TF 결합 부위에 기인하지만 pR1.7 프로모터에 위치한 것에 기인하지 않는다고 가설을 세웠다(데이타는 나타내지 않음). 흥미롭게도, 본 발명자들은 이러한 337 bp 서열 내에 닭 오브알부민 상부 프로모터-전사 인자 I(COUP-TFI) 결합 부위를 발견하였다(데이타는 나타내지 않음). COUP-TFI는 마우스 망막내 녹색 옵신 유전자(Opn1mw)를 억제하는 것으로 밝혀졌으므로(22) AAV가 망막하 전달되는 경우 마카퀴 원추 내에서 pR2.1 프로모터를 사용한 보다 낮은 발현에 책임이 있을 수 있다. 동일한 특이적인 337bp 영역 내에서, 본 발명자들은 또한 포괄적인, 편재성 활성인자 TF(데이타는 나타내지 않음), 예를 들면, CCAAT/인핸서 결합 단백질 베타(CEBPB) 및 일반적인 전사 인자 II-I(GTF2I)에 대한 다수 결합 부위를 발견하였다. 결합 및 기본적인 전사 기구 조립을 향상시키고 원추 내에서 특이적으로 발현되지 않는 TF의 이러한 추가의 결합 부위는 pR1.7과 비교하여 pR2.1로 관찰된 오프-표적 발현 중 일부에 관여할 수 있다(데이타는 나타내지 않음). 본 발명자들은 또한 게놈 mCAR 프로모터 서열(마우스 Arr3로서 또한 공지됨)내 TF 결합 부위를 분석하여 AAV 작제물에 사용된 이러한 프로모터의 짧은 버젼을 사용하여 특이성의 결여를 설명하였다. 짧은 서열은 TATA-박스, TATA-유사 박스 뿐만 아니라 CRX(원추-로드 호메오박스 단백질) 및 SP(특이성 단백질) TF(23)에 대한 결합 부위를 나타내는 게놈성의 근위 CAR 프로모터(데이타는 나타내지 않음)의 521bp 부위로 이루어져 있다(데이타는 나타내지 않음). 그러나, 521bp 영역의 바로 상부에 위치한 CAR 프로모터 활성을 조절하는 'Reg' 서열 조절 CAR 프로모터 활성(23)은 짧은 mCAR 서열로부터 배제된다(데이타는 나타내지 않음). STRING 데이타베이스(24)로부터 수득된 TF 결합 mCAR 프로모터의 상호작용체를 기반으로 하여, CRX 및 SP TF는 서로 및 RARA(레티노산 수용체 알파), RXRA(레티노이드 X 수용체 알파) 및 THRB(갑상선 호르몬 수용체 베타) TF와 상호작용한다(데이타는 나타내지 않음). 이러한 3개의 핵 수용체(NR)는 세포-특이적인 전사 공-활성인자 복합체(26, 27)를 형성함으로써 MED1(25)(매개인자 복합체 소단위 1)를 통한 유전자 발현의 세포-형 특이적인 조절에 포함된다(데이타는 나타내지 않음). CRX 및 SP 결합 부위는 521bp 영역에 위치하는 반면, RXRA, RARA 및 THRB 결합 부위는 Reg 영역에 위치한다(데이타는 나타내지 않음). 또한, Reg 영역은 원추 내에서 발현된 중요한 핵 수용체인 THRβ2에 대해 5개의 결합 부위를 함유한다(28)(데이타는 나타내지 않음). 모든 이러한 이유로, Reg 영역의 제거는 짧은 mCAR 프로모터로 관찰된 오프-표적 발현에 관여하는 경향이 있다.

AAV의 유리체내 투여를 통한 마카퀴 중심와 원추로의 안전한 유전자 전달

다른 연구자 및 본 발명자들은 편재한 프로모터(16, 29-31)를 지닌 AAV 변이체를 사용한 마카퀴 원추의 형질도입을 나타내었지만, 유리체 투여된 AAV에 의한 원추 형질도입을 달성하는 것은 염증을 이끄는 고 용량에서만 가능하였다(16, 29). 본 발명자들은 안전성과 양립가능한 보다 낮은 유리체내 주사된 AAV 용량에서 강력한 원추-특이적인 프로모터를 사용하는 경우 중심와 원추 표적화가 달성될 수 있다고 추론하였다(29, 32). 이러한 "용량 절약(dose sparing)"이 가능한지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 2개의 마카퀴 눈에 AAV2-7m8-pR1.7-GFP를 주사하고 2마리의 다른 마카퀴 눈에 AAV2-7m8-CMV-GFP를 10¹¹개의 바이러스 게놈(vg)의 용량에서 주사하였다(표 1). 생체내 안저 영상을 사용하여, 본 발명자들은 CMV를 사용한 주사 후 2주 더 일찍 GFP 발현을 관찰하였으며 주사 후 2개월까지 증가하였다(데이타는 나타내지 않음). GFP 형광성은 주로 말초 및 부중심와 영역에 존재하였다. pR1.7을 사용한 GFP 발현은 투여 후 6 내지 8주째에 검출가능하게 되었으며 중심와로 한정되었다(데이타는 나타내지 않음). 광 간섭 단층촬영장치(Optical Coherence Tomography: OCT)에 의해 평가된 바와 같은 중심와에 대해 검출가능할만한 손상은 존재하지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 동물을 주사 후 3개월 째에 희생시켰다. 이후에 본 발명자들은 황반의 플랫마운트(데이타는 나타내지 않음) 및 중심와의 수준에서 망막 크리오섹션(데이타는 나타내지 않음) 및 영상화된 GFP 형광성을 공초점현미경을 사용하여, 각각의 눈에 대해 동등한 획득 셋팅으로 제조하였다. 이러한 영상은 생체내 발견을 입증하였으며 10¹¹개의 입자의 용량에서 AAV2-7m8-pR1.7을 사용하여, 유리체로부터 특이적이고 견고한 원추 형질도입을 나타낸다. 약 58%의 hCAR+ 세포는 소와(foveola) 내에서 GFP의 검출가능한 수준을 발현하는 것으로 밝혀졌다. 유사한 용량을 사용하여, 원추를 CMV로 형질도입시키는 것이 가능하지 않다(검출가능한 전이유전자 발현이 없음).

NHP, 비사람 영장류; kg, 킬로그램; M, 남성; superior bleb: 우세한 수포; LE, 좌측 눈; RE, 우측 눈; AAV, 아데노-관련 바이러스; CMV, 사이토메갈로바이러스 프로모터; PR1.7, 사람 적색 옵신 유전자 인핸서 및 프로모터 서열을 기반으로 한, 1.7 킬로염기의 프로모터; vg, 바이러스 게놈.

광유전학 기술을 사용한 시력 회복을 위한 중심와 원추로 치료적 유전자 전달

본 발명자들은 다음에 치료적 유전자 전달을 위해 이러한 프로모터의 사용 가능성을 평가하는 것을 목표로 하였다. 유전자 대체 후 기능적 결과를 시험하기 위한 눈먼 마카퀴 또는 망막 변성의 영장류 모델은 존재하지 않는다(즉, 색맹의 치료를 위한 CNGB3). 그러나, 본 발명자들은 광유전성-매개된 광 반응 대 내인성 원추 옵신-매개된 반응 사이를 구별할 수 있으므로 광유전성 전략을 사용하여 야생형 마카퀴에 있어서 시력 회복을 평가하는 것이 가능하다(4). 본 발명자들은 중심와 원추 내 Jaws, 과분극화 미생물 옵신(15)의 발현에 의한 광유전성 시력 회복의 잠재능을 평가하였다. 본 발명자들은 1마리의 마카퀴에게 10¹¹ vg의 AAV2-7m8-pR1.7-Jaws-GFP를 유리체 내에 주사하여 마우스에서 앞서 기술한 바와 같이 중간-단계 색소성 망막염에서 휴면기 원추의 재활성화를 위한 이의 치료적 잠재능을 평가하였다(4,15). 본 발명자들은 GFP 발현 단독(데이타는 나타내지 않음)과 유사한 주사된 눈에서 중심와 원추에 한정된 고 수준의 Jaws-GFP 발현을 발견하였다(데이타는 나타내지 않음). 이후에 동물을 주사 후 2개월 째에 희생시키고 망막의 1/2을 조직학을 위해 가공하였다. 망막 플랫마운트는 본 발명자들의 고도로 예민한 시력에 관여하는 조밀화되고 패킹된 원추를 함유하는 중심와의 영역인, 소와내 원추의 대표적인 해부학을 나타내었다. 원추 아레스틴에 대한 면역염색을 사용하여 형질도입된 원추를 정량화하였다(데이타는 나타내지 않음). 약 50 퍼센트의 원추 아레스틴 양성 세포(hCAR+)가 이러한 망막 내에서 검출가능한 수준의 Jaws-GFP를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 망막의 다른 1/2은 과분극화 펌프 Jaws로부터 발생한 광유전성 광 반응의 특성화를 위해 외부이식편(33)으로서 보존하였다(데이타는 나타내지 않음). 전기생리학적 기록은 Jaw를 발현하는 형질도입된 원추 상에서 및 GFP 발현이 없는 대조군 원추 내에서 수행되었다(데이타는 나타내지 않음). GFP 양성 Jaws-원추에서 전체-세포 패치-클램프 기록은 오렌지 광 플래쉬(flash)에 대해 견고한 광 반응을 나타내었다(n=4)(데이타는 나타내지 않음). 기록된 세포의 작용 스펙트럼은 최고 광 반응이 Jaws에 대해 앞서 나타낸 바와 같이(14) 575nm와 600nm 사이에서 오렌지 광을 사용하여 수득되었음을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음). 전류-클램프 구조 내에 기록된 Jaws-발현 원추는 광-여기된 과분극에 이어 짧은 탈분극을 나타내었지만(n=4개의 세포), 대조군 원추는 동일한 광 자극에 대해 반응하지 않았다(n=3개의 세포)(데이타는 나타내지 않음).

최종적으로, 본 발명자들은 다른 마카퀴 눈에 AAV2-7m8-pR1.7-Jaws-GFP의 10¹⁰개 입자를 유리체내 주사하여 균일하게 보다 낮은 용량에서 중심와 형질도입의 실현가능성을 평가하였다. 본 발명자들은 발현 수준이 10¹¹개 입자를 사용하는 것보다 더 낮았지만(데이타는 나타내지 않음), 이러한 보다 낮은 용량에서도 검출가능한 중심와 Jaw 발현을 수득하였다. 이와 함께, AAV2-7m8-pR1.7-GFP(n=2) 또는 Jaws-GFP(n=2)를 주사받은 모든 4개의 마카퀴 눈은 원추의 광유전성 재활성화와 양립가능한 유리체내 접근법의 재생산능 및 강도를 나타낸다.

AAV9-7m8-Jaws의 원위 망막하 투여를 통한 중심와 원추 내의 향상된 광유전자 반응

강력한 원추 프로모터를 지닌 AAV2-7m8의 유리체내 주사를 통한 중심와 원추의 형질도입은 소와 내에 주로 존재하는 휴면 원추를 지닌 색소성 망막염 환자의 취약한 망막 내 원추를 치료하기에 이상적인 접근법일 수 있다. 그러나, 완전 색맹 환자 뿐만 아니라, AAV2에 대해 강력한 중화 항체 역가를 지닌 색소성 망막염 환자의 서브세트(32)의 경우, 망막하 접근법이 유리할 수 있다. 이전의 연구는, 아마도 AAV9의 망막하 주사가 원추 광수용체에서 AAV9에 대한 주요 수용체인, 갈락토실화된 글리칸의 풍부성으로 인하여, 저 용량에서 중심 및 말초 둘 다에서 원추 내 효율적인 전이유전자 발현을 초래함을 나타내었다(30, 34). 이를 기반으로 하여, 본 발명자들은 향상된 AAV9 변이체는 원위 수포로부터 중심와 원추의 효율적인 형질도입을 제공할 수 있음을 추론하였다. 원위 망막하 주사 부위를 통한 중심와 원추 유전자 전달을 촉진시키기 위하여, 본 발명자들은 야생형 AAV9보다 감염성에 있어서 30-배 증가를 제공하는 AAV9-7m8 변이체를 사용하였다. 본 발명자들은 1마리의 동물에게 중심와를 분리하지 않고 Jaws-GFP를 암호화하는 이러한 벡터의 5x10¹⁰개 입자를 말초 망막 내로 망막하 주사하였다(도 1, A-B). 주사 후 2주와 같이 일찍이 본 발명자들은 수포 내(사선으로 범위를 정함) 및 또는 소와 내(도 1c)에서 강력한 Jaws-GFP 형광을 관찰하였다. 형광 강도는 유리체내-치료된 망막과 비교하여 소와 내에서 더 높았다. 본 발명자들은 10¹⁰ vg의 동일한 벡터의 보다 낮은 용량을 주사한 제2의 눈을 사용하여 동일한 데이타를 관찰하였다(도 2a). 일단, 동물이 올바른 위치에 있으면 보다 우수한 말초 수포가 중심와를 향해 내려오지 않았는지를 추가로 확인하고 추가의 용량 감소가 가능한지를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 2개의 다른 눈에 5¹⁰ vg의 용량을 주사하였으며, 이러한 시간은 중심와에 비해 더 낮다(표 1). OCT를 사용하여, 본 발명자들은 중심와가 수술 후 박리되지 않았음을 관찰하였다(도 3). 중심와 원추로 연장되는 동일한 발현 패턴을 이러한 망막에서 수득하였다(도 2b). 이러한 결과는 이러한 접근법의 재생능 및 낮은 바이러스 용량과 이의 양립가능성을 총괄적으로 나타낸다.

망막 플랫마운트를 이후 제조하였다. 중심와를 조직학을 위해 프로세싱하였으며 주사 부위와 중심와의 내부 사이의 영역 내의 큰 집단의 원추(도 1d)에서 강력한 Jaws-GFP 발현을 나타내었다(도 1, D-F). GFP의 세포 계수 및 중심와 내 원추-아레스틴 양성(CAR⁺) 세포는 유리체내 주사로 수득된 약 50 퍼센트와 비교하여 이러한 망막하 접근법(도 1, E-F)을 사용하여 약 95 퍼센트의 원추가 표지되었음을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음). 광전류의 진폭은 유리체 내 전달 후 Jaw 원추 내의 것(데이타는 나타내지 않음)과 비교하여, 망막하 전달 후 Jaws 원추 내에서 유사한 형태의 광 민감성 커브로, 5배 더 컸다(도 1, G-H). 이는 유리체내로 형질도입된 원추와 비교하여 망막하 형질도입된 원추 내 보다 큰 Jaw 발현에 기인하는 경향이 있다. 상이한 주파수에서 플릭커 자극(flicker stimulation)을 사용한 일사적인 분석은 8x10¹⁶ 광자 cm^-2 s^-1에서 2 Hz로부터 30 Hz 까지 매우 신속하고 견고한 광전류 반응을 나타내었다(도 1l). 둘 다의 경우에서 광 강도 반응 역치가 10¹⁵ 광자 cm^-2 s^-1에서 관찰되었다. 전류 제로 방식에서 전류-클림프 구조의 원추를 기록하는 것은 실험자가 세포의 실제 휴지하는 막 전위를 기록할 수 있도록 하지만, 본 발명자들은 광-여기된 과분극(도 1, I-J)에 이어서, 망막하 주사된 망막으로 보다 가시성인 짧은 탈분극을 관찰하였으며, 이는 유리체내 주사된 망막에서보다 Jaws-GFP의 보다 높은 발현 수준과 관련된다. Jaws-유도된 광전류는 예측된 바와 같이, 575nm에서 자극 파장 피킹(peaking)의 함수로서 진폭이 변하였다(도 1k). 증가하는 자극 주파수의 적용은 신뢰가능한 광전류가 8.10¹⁶ 광자 cm^-2 s^-1에서, 30 Hz 이하에서 기본선까지 되돌아와서 수득될 수 있음을 나타내었다(도 1l).

pR1.7 프로모터는 사람 원추 내에서 강력하고 고도로 특이적인 유전자 발현을 유도한다.

비-사람 영장류에서 본 발명자들의 데이타 모두는 시력 회복을 위한 광유전성 적용과 양립될 수 있는 비-침입성의, 특이적인 고-수준 영장류 중심와 원추 형질도입을 최초로 나타낸다. 그러나, 프로모터 활성은 종에 따라 중요한 변화를 나타내므로(29, 35, 36) 본 발명자들 사람 세포 및 조직 내에서 pR1.7을 입증하는 것이 필수적인 것으로 고려하였다. 우수한 사람 광수용체 세포주 또는 원추 프로모터 활성의 효율을 시험하는데 사용될 수 있는 다른 모델의 결여로 인하여, 본 발명자들은 사람 유도된 다능성 줄기(iPS) 세포로부터 유도된 3D 망막 장기모양을 사용하였다(37). 본 발명자는 광수용체-농축된 망막 장기모양을 생성시키고 이들을 pR1.7 프로모터의 제어하에서 GFP를 암호화하는 AAV2-7m8 벡터로 감염시켰다(데이타는 나타내지 않음). GFP 발현을 감염 5일 후 조기에 관찰하였고 43일째에 분석을 위해 실험을 종결할 때까지 지속적으로 증가시켰다. 이러한 장기모양 내 GFP 발현은 사람 원추 아레스틴(hCAR) 면역염색으로 동시국재화하였다(데이타는 나타내지 않음). 마지막으로, 사람 망막 장기모양은 성숙한 사람 망막의 모든 특징을 나타내지 않으므로, 본 발명자는 사후 사람 망막 외부이식편 내 pR1.7 프로모터의 효율 및 특이성을 입증하였다. 사람 망막 이식체를 앞서 기술한 바와 같이 배양하고(38) 1 방울의 AAV2-7m8-pR1.7-GFP로 감염시켰다(데이타는 나타내지 않음). 감염 15일 후, GFP 발현을 크리오섹션 위에서 분석하였다. 발현은 ONL로 한정되었으며(데이타는 나타내지 않음), 원추 세포 마커인 M/L-옵신으로 동시-국재화하였다(데이타는 나타내지 않음). 이러한 데이타는 사람 원추 내 제한된 유전자 발현으로 이끄는 pR1.7의 고 효율 및 특이성에 대해 총괄적으로 지적한다.

눈-주사 생체내 안전성 연구

본 발명자들은 이후에 AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFP의 유리체내 주사 및 AAV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP의 망막하 주사 후 면역 반응을 평가하였다.

망막 이상 및 침윤물의 검출

염증(면역 반응)을 망막 크리오섹션 상에서 H&E 염색 및 염증 세포 면역화학(IHC)을 주사한 후 2개월 째에 평가하였다. 망막 단면 내 H&E 염색 및 현미경 관찰을 기반으로 하여, AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFP(도 4a)의 유리체내 투여 또는 AVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP의 망막하 주사(도 4b)의 어느 것도 앞서의 부분에서 킬러 레드(Killer Red) 및 GFP 눈과는 대조적으로 세포 침윤물 또는 망막 분열과 관련되지 않았다.

염증 마커의 검출을 위한 면역조직화학

국소 적응성 면역 반응을 분석하기 위해, 본 발명자들은 AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFP 및 AVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP 작제물 둘 다를 주사한 원숭이 망막의 IHC 분석을 수행하였다. 망막하 치료된 동물 및 유리체내 치료된 동물로부터의 크리오섹션을 항-사람 HLA ABC(MHC I), 항-HLA-DR(주요 조직적합성 복합체 II(MHC II), 항-사람 CD8, 항-F4/80으로 염색하였다. 단면 중 어느 것도 상술한 마커에 대해 양성이었다. 신경 교원세포 산성 단백질(GFAP) 이온화된 칼슘-결합 어댑터 분자 1(IBA1)에 대한 염색시, 소교세포 및 대식구에 대한 조혈 마커는 음성이었다(도 5는 AVV9-7m8-PR1.7-Jaws-GFP와 관련되었으며; AAV2-7m8-PR1.7-Jaws-GFP에 대해 데이타는 나타내지 않았다).

논의:

중심와는 영장류 내 망막 표면적의 1% 미만을 차지하지만 이는 일차 시각 피질(1) 내 세포의 약 50%까지 투입을 제공한다. 망막의 가장 얇고 가장 정밀한 부분인, 중심와 내 고 농도의 원추는 고도로 예민한 시력을 허용하며, 이는 치료학적 개입 동안 이러한 부위 내에서 원추의 유일한 기능(39) 및 구조(40)를 보존하는데 최고로 중요하다. 중심와 원추는 망막하 또는 유리체내 주사를 사용하여, 상이한 투여 경로를 통해 표적화될 수 있지만(35, 41, 42) 중심와를 박리시키는 것은 특히 변성 망막 내에서 기계적 손상을 초래할 수 있다(43). 모든 이러한 이유로, 이러한 영역의 박리없이, 중심와에 치료제를 전달하는 방법이 필요하다. 유리체내 주사는 막막 박리없이 치료제를 전달하기 위한 외과적으로 간단한 방법이다. 유전자 치료요법 벡터는 광수용체에 대한 손상없이 설치류에서 유리체내 주사를 통해 다른 망막을 표적화할 수 있다(17, 35). 그러나 유리체내 주사를 통해 영장류 원추로 안전하고 효율적으로 유전자 전달하는 것은, 아마도 유리체 내 벡터의 실질적인 희석 및 수득되는 효율의 손실로 인하여 지금까지 달성되지 않았다. 보다 낮은 국소 농도를 사용한 고-수준 유전자 발현을 제공하는 세포-형 특이적인 프로모터의 사용은 이러한 챌린지를 극복하기 위해 중요하다(29, 44).

본 연구에서, 본 발명자들은 AAV2-7m8 캡시드와 함께 다양한 프로모터를 사용하여 비-침입성, 유리체내 주사를 통한 원추의 강력하고 배타적인 형질도입을 최초로 달성한 것으로 고려하였다. 본 발명자는 3개의 프로모터를 선택하였고 이들을 원추 형질도입의 특이성 및 강도에 대해 나란히 시험하였다. 마우스 망막내에서 생체내에서 시험한 모든 프로모터는 망막하 전달되는 경우 광수용체 층 내 이식유전자 발현을 초래한다. mCAR 프로모터는 로드(rod) 및 원추 내 발현을 이끌었다. 놀랍게도, 유리체 내 전달 후, pR1.7 만이 원추에 대해 이의 특이성을 유지한 반면, pR2.1 및 mCAR은 내부 망막 세포에서 비-특이적인 발현을 생성하여, 하부 뉴우런에서의 임의의 발현이 광수용체로부터의 반응을 취소시킬 수 있는 경우 이들이 광유전자 적용에 부적합하도록 하였다. 각각의 프로모터 서열 내 TF 결합 부위의 후속적인 인 실리코 분석은 pR1.7을 사용한 보다 특이적인 형질도입에 대한 기본 및 mCAR 프로모터를 사용한 특이성의 관찰된 결여를 제시한다. 다음에, 중심와 원추를 형질도입시키는 pR1.7 프로모터가 장착된 AAV2-7m8의 능력을 연구하기 위해, 본 발명자는 마카퀴 눈에서 유전자 전달 연구를 수행하였다. 영장류 원추에 대한 유전자 발현의 완전한 제한은 유리체내 투여를 통해 중심와 내에서 AAV2-7m8-pR1.7을 사용하여 달성하였다.

유리체내 주사 경로를 사용한 한가지 단점은 망막하 투여와 비교하여 면역계와 상호작용하는 이러한 구획내로 투여된 AAV의 보다 높은 민감성이다(32). 항체 중화는 비-사람 영장류 내에서 유리체 내 AAV 벡터 매개된 유전자 전달에 대한 장벽(barrier)을 제거하며 이는 사람 적용을 위한 챌린지(challenge)를 제거하는 경향이 있을 것이다. 따라서, 본 발명자는 AAV2에 대해 중화 항체를 갖는 환자에 대해 다른 유전자 전달 접근법을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이러한 목표를 위해 본 발명자는 원위 부위에서 AAV9-7m8의 망막하 투여에 의해 중심와 원추로의 유전자 전달을 시험하였다(표 2). 본 발명자는 수포의 측면으로 확산하고 외부로의 발현을 매개하는 벡터의 능력 덕분에, 견고한 광 반응이 이러한 새로운 전달 접근법으로 수득될 수 있었음을 입증하였다. 동일한 광유전성 원추 재활성화 전략을 사용하여, 본 발명자는 이러한 접근법이 또한 Jaws에 의해서 그러나 유리체내 경로와 비교하여 보다 높은 퍼센트의 원추에서 매개된 견고한 광 반응을 제공함을 입증하였다(4, 15).

본 발명자의 생체내 발견은 총괄적으로 망막 유전자 전달시 3개의 중요한 고려사항을 지적한다. 첫째로, 향상된 AAV 벡터는, 지시된 진화(AAV2-7m8(35)) 또는 망막 설계(AAV9-7m8(17))를 통해 수득됨에 상관없이, 모 혈청형이 충분한 유전자 전달을 제공하는데 실패하는 경우 치료적 목적을 달성할 수 있다. 실제로, AAV2 및 AAV9는 비-침입성 중심와 표적화를 수행할 수 없지만(30, 31) 7m8 변형된 벡터는 이러한 갭을 브릿지(bridge)한다. 둘째로, 강력한 세포-형 특이적인 프로모터는 유전자 치료요법의 안전성에 중요한 용량 절약을 허용한다(즉, 면역 반응을 피한다). 셋째로, 본 발명자의 연구는 전이유전자 발현 패턴에 있어서 벡터 투여 경로의 무시할 수 없는 충격을 나타낸다. 최종적으로, 동물에서 본 발명자의 생체내 결과를 보완하기 위하여, 본 발명자는 생체내 실험과 함께, 임상 적용을 위한 유전자 치료요법을 입증하기 위한 다목적 플랫포옴(versatile platform)을 구성하는 사람 조직 내 생체외 시험의 배터리(battery)를 수행하였다. 본원에 기술된 벡터-프로모터 조합은 모든 망막 질환에서의 유용성을 발견할 것이며 여기서 원추 표적화가 요구된다. 각각의 투여 경로 및 벡터는 환자의 혈청학적 상태 및 표적화된 질환의 자연사(natural hisory)를 기반으로 고려될 수 있다(참고: 표 2). pR1.7 및 AAV2-7m8의 조합은 유리체 내로 전달되는 경우 사람 중심와 원추 내 치료적 유전자 발현에 이상적이며 색소성 망막염에서 광유전학을 사용한 남아있는 휴면기 원추를 되살리는 이상적인 방법일 수 있다(4). 원추는 색맹에서 중심 및 말초 둘 다에 존재하므로, AAV9-7m8-pR1.7을 사용한, 말초 내 유전자 전달은, 중심와 및 말초 원추 둘 다 내로 치료적 유전자를 전달할 수 있기 때문에, 보다 효율적일 수 있다.

본 발명자의 생체내 실험은 AAV9-7m8-pR1.7 및 AAV2-7m8-pR1.7 벡터의 안전성을 추가로 확인하는데, 이는 이들이 주사 후 면역 반응을 유발하지 않았기 때문이다.

서열:

서열 번호: 1: 스페이서가 없는 삽입 펩티드 7m8

서열 번호: 2: 삽입 펩티드

서열 번호: 3: 삽입 펩티드

서열 번호: 4: 삽입 펩티드

서열 번호: 5: 삽입 펩티드

서열 번호: 6: 삽입 펩티드

서열 번호: 7: 삽입 펩티드

서열 번호: 8: 삽입 펩티드

서열 번호: 9: 삽입 펩티드 7m8

서열 번호: 10: 야생형 AAV9 VP1 캡시드

서열 번호: 11: 재조합 AAV9-유도 벡터의 VP1 캡시드

서열 번호: 12: pR1.7 프로모터

서열 번호: 13: Jaws-GFP= Halo57 +2 돌연변이 + KGC + GFP + ER2

서열 번호: 14: Jaws = Halo57 + 2개의 돌연변이 + KGC + ER2

서열 번호: 15: Halo57 + 2개의 돌연변이 + KGC

참고문헌

본 명세서 전체에서, 다양한 참고문헌은 본 발명이 속한 기술의 상태를 설명한다. 이러한 참고문헌의 개시내용은 본원에 의해 본 개시내용에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> INSERM SORBONNE UNIVERSITE <120> METHODS OF EXPRESSING A POLYNUCLEOTIDE OF INTEREST IN THE CONE PHOTORECEPTORS OF A SUBJECT COMPRISING THE SUBRETINAL DELIVERY OF A THERAPEUTICALLY EFFECTIVE AMOUNT OF A RECOMBINANT AAV9-DERIVED VECTOR <130> IP20203831FR <150> EP17306430 <151> 2017-10-20 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7m8 peptide without spacer <400> 1 Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertion peptide <400> 2 Asn Glu Thr Ile Thr Arg Pro 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertion peptide <400> 3 Lys Ala Gly Gln Ala Asn Asn 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertion peptide <400> 4 Lys Asp Pro Lys Thr Thr Asn 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertion peptide <400> 5 Lys Asp Thr Asp Thr Thr Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertion peptide <400> 6 Arg Ala Gly Gly Ser Val Gly 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertion peptide <400> 7 Ala Val Asp Thr Thr Lys Phe 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insertion peptide <400> 8 Ser Thr Gly Lys Val Pro Asn 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7m8 peptide <400> 9 Ala Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 733 <212> PRT <213> adeno-associated virus 9 <400> 10 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Gln Ala Gln Thr 580 585 590 Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp 595 600 605 Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr 610 615 620 Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys 625 630 635 640 His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp 645 650 655 Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln 660 665 670 Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys 675 680 685 Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr 690 695 700 Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr 705 710 715 720 Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 725 730 <210> 11 <211> 743 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 capsid of the recombinant AAV9-derived vector <400> 11 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Ala Leu Gly 580 585 590 Glu Thr Thr Arg Pro Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln 595 600 605 Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln 610 615 620 Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro 625 630 635 640 Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile 645 650 655 Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn 660 665 670 Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val 675 680 685 Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp 690 695 700 Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val 705 710 715 720 Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile 725 730 735 Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg 740 <210> 12 <211> 1724 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR1.7 promoter <400> 12 ggaggctgag gggtggggaa agggcatggg tgtttcatga ggacagagct tccgtttcat 60 gcaatgaaaa gagtttggag acggatggtg gtgactggac tatacactta cacacggtag 120 cgatggtaca ctttgtatta tgtatatttt accacgatct ttttaaagtg tcaaaggcaa 180 atggccaaat ggttccttgt cctatagctg tagcagccat cggctgttag tgacaaagcc 240 cctgagtcaa gatgacagca gcccccataa ctcctaatcg gctctcccgc gtggagtcat 300 ttaggagtag tcgcattaga gacaagtcca acatctaatc ttccaccctg gccagggccc 360 cagctggcag cgagggtggg agactccggg cagagcagag ggcgctgaca ttggggcccg 420 gcctggcttg ggtccctctg gcctttcccc aggggccctc tttccttggg gctttcttgg 480 gccgccactg ctcccgctcc tctcccccca tcccaccccc tcaccccctc gttcttcata 540 tccttctcta gtgctccctc cactttcatc cacccttctg caagagtgtg ggaccacaaa 600 tgagttttca cctggcctgg ggacacacgt gcccccacag gtgctgagtg actttctagg 660 acagtaatct gctttaggct aaaatgggac ttgatcttct gttagcccta atcatcaatt 720 agcagagccg gtgaaggtgc agaacctacc gcctttccag gcctcctccc acctctgcca 780 cctccactct ccttcctggg atgtgggggc tggcacacgt gtggcccagg gcattggtgg 840 gattgcactg agctgggtca ttagcgtaat cctggacaag ggcagacagg gcgagcggag 900 ggccagctcc ggggctcagg caaggctggg ggcttccccc agacacccca ctcctcctct 960 gctggacccc cacttcatag ggcacttcgt gttctcaaag ggcttccaaa tagcatggtg 1020 gccttggatg cccagggaag cctcagagtt gcttatctcc ctctagacag aaggggaatc 1080 tcggtcaaga gggagaggtc gccctgttca aggccaccca gccagctcat ggcggtaatg 1140 ggacaaggct ggccagccat cccaccctca gaagggaccc ggtggggcag gtgatctcag 1200 aggaggctca cttctgggtc tcacattctt ggatccggtt ccaggcctcg gccctaaata 1260 gtctccctgg gctttcaaga gaaccacatg agaaaggagg attcgggctc tgagcagttt 1320 caccacccac cccccagtct gcaaatcctg acccgtgggt ccacctgccc caaaggcgga 1380 cgcaggacag tagaagggaa cagagaacac ataaacacag agagggccac agcggctccc 1440 acagtcaccg ccaccttcct ggcggggatg ggtggggcgt ctgagtttgg ttcccagcaa 1500 atccctctga gccgcccttg cgggctcgcc tcaggagcag gggagcaaga ggtgggagga 1560 ggaggtctaa gtcccaggcc caattaagag atcaggtagt gtagggtttg ggagctttta 1620 aggtgaagag gcccgggctg atcccacagg ccagtataaa gcgccgtgac cctcaggtga 1680 tgcgccaggg ccggctgccg tcggggacag ggctttccat agcc 1724 <210> 13 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Jaws-GFP= Halo57 +2 mutations + KGC + GFP + ER2 <400> 13 Met Thr Ala Val Ser Thr Thr Ala Thr Thr Val Leu Gln Ala Thr Gln 1 5 10 15 Ser Asp Val Leu Gln Glu Ile Gln Ser Asn Phe Leu Leu Asn Ser Ser 20 25 30 Ile Trp Val Asn Ile Ala Leu Ala Gly Val Val Ile Leu Leu Phe Val 35 40 45 Ala Met Gly Arg Asp Leu Glu Ser Pro Arg Ala Lys Leu Ile Trp Val 50 55 60 Ala Thr Met Leu Val Pro Leu Val Ser Ile Ser Ser Tyr Ala Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ser Gly Leu Thr Val Gly Phe Leu Gln Met Pro Pro Gly His Ala 85 90 95 Leu Ala Gly Gln Glu Val Leu Ser Pro Trp Gly Arg Tyr Leu Thr Trp 100 105 110 Thr Phe Ser Thr Pro Met Ile Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Asp 115 120 125 Thr Asp Ile Ala Ser Leu Phe Thr Ala Ile Thr Met Asp Ile Gly Met 130 135 140 Cys Val Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ile Thr Ser Ser His Leu Leu 145 150 155 160 Arg Trp Val Phe Tyr Gly Ile Ser Cys Ala Phe Phe Val Ala Val Leu 165 170 175 Tyr Val Leu Leu Val Gln Trp Pro Ala Asp Ala Glu Ala Ala Gly Thr 180 185 190 Ser Glu Ile Phe Gly Thr Leu Arg Ile Leu Thr Val Val Leu Trp Leu 195 200 205 Gly Tyr Pro Ile Leu Phe Ala Leu Gly Ser Glu Gly Val Ala Leu Leu 210 215 220 Ser Val Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr Ser Gly Leu Asp Ile Leu Ala 225 230 235 240 Lys Tyr Val Phe Ala Phe Leu Leu Leu Arg Trp Val Ala Ala Asn Glu 245 250 255 Gly Thr Val Ser Gly Ser Gly Met Gly Ile Gly Ser Gly Gly Ala Ala 260 265 270 Pro Ala Asp Asp Arg Pro Val Val Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly 275 280 285 Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val Ala Pro Ala Gly 290 295 300 Ala Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 305 310 315 320 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 325 330 335 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 340 345 350 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 355 360 365 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 370 375 380 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 385 390 395 400 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 405 410 415 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 420 425 430 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 435 440 445 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 450 455 460 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 465 470 475 480 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 485 490 495 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 500 505 510 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 515 520 525 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Val 530 535 540 Ala Phe Cys Tyr Glu Asn Glu Val 545 550 <210> 14 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Jaws = Halo57 + 2 mutations + KGC + ER2 <400> 14 Met Thr Ala Val Ser Thr Thr Ala Thr Thr Val Leu Gln Ala Thr Gln 1 5 10 15 Ser Asp Val Leu Gln Glu Ile Gln Ser Asn Phe Leu Leu Asn Ser Ser 20 25 30 Ile Trp Val Asn Ile Ala Leu Ala Gly Val Val Ile Leu Leu Phe Val 35 40 45 Ala Met Gly Arg Asp Leu Glu Ser Pro Arg Ala Lys Leu Ile Trp Val 50 55 60 Ala Thr Met Leu Val Pro Leu Val Ser Ile Ser Ser Tyr Ala Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ser Gly Leu Thr Val Gly Phe Leu Gln Met Pro Pro Gly His Ala 85 90 95 Leu Ala Gly Gln Glu Val Leu Ser Pro Trp Gly Arg Tyr Leu Thr Trp 100 105 110 Thr Phe Ser Thr Pro Met Ile Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Asp 115 120 125 Thr Asp Ile Ala Ser Leu Phe Thr Ala Ile Thr Met Asp Ile Gly Met 130 135 140 Cys Val Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ile Thr Ser Ser His Leu Leu 145 150 155 160 Arg Trp Val Phe Tyr Gly Ile Ser Cys Ala Phe Phe Val Ala Val Leu 165 170 175 Tyr Val Leu Leu Val Gln Trp Pro Ala Asp Ala Glu Ala Ala Gly Thr 180 185 190 Ser Glu Ile Phe Gly Thr Leu Arg Ile Leu Thr Val Val Leu Trp Leu 195 200 205 Gly Tyr Pro Ile Leu Phe Ala Leu Gly Ser Glu Gly Val Ala Leu Leu 210 215 220 Ser Val Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr Ser Gly Leu Asp Ile Leu Ala 225 230 235 240 Lys Tyr Val Phe Ala Phe Leu Leu Leu Arg Trp Val Ala Ala Asn Glu 245 250 255 Gly Thr Val Ser Gly Ser Gly Met Gly Ile Gly Ser Gly Gly Ala Ala 260 265 270 Pro Ala Asp Asp Arg Pro Val Val Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly 275 280 285 Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val 290 295 300 <210> 15 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Halo57 + 2 mutations + KGC <400> 15 Met Thr Ala Val Ser Thr Thr Ala Thr Thr Val Leu Gln Ala Thr Gln 1 5 10 15 Ser Asp Val Leu Gln Glu Ile Gln Ser Asn Phe Leu Leu Asn Ser Ser 20 25 30 Ile Trp Val Asn Ile Ala Leu Ala Gly Val Val Ile Leu Leu Phe Val 35 40 45 Ala Met Gly Arg Asp Leu Glu Ser Pro Arg Ala Lys Leu Ile Trp Val 50 55 60 Ala Thr Met Leu Val Pro Leu Val Ser Ile Ser Ser Tyr Ala Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ser Gly Leu Thr Val Gly Phe Leu Gln Met Pro Pro Gly His Ala 85 90 95 Leu Ala Gly Gln Glu Val Leu Ser Pro Trp Gly Arg Tyr Leu Thr Trp 100 105 110 Thr Phe Ser Thr Pro Met Ile Leu Leu Ala Leu Gly Leu Leu Ala Asp 115 120 125 Thr Asp Ile Ala Ser Leu Phe Thr Ala Ile Thr Met Asp Ile Gly Met 130 135 140 Cys Val Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ile Thr Ser Ser His Leu Leu 145 150 155 160 Arg Trp Val Phe Tyr Gly Ile Ser Cys Ala Phe Phe Val Ala Val Leu 165 170 175 Tyr Val Leu Leu Val Gln Trp Pro Ala Asp Ala Glu Ala Ala Gly Thr 180 185 190 Ser Glu Ile Phe Gly Thr Leu Arg Ile Leu Thr Val Val Leu Trp Leu 195 200 205 Gly Tyr Pro Ile Leu Phe Ala Leu Gly Ser Glu Gly Val Ala Leu Leu 210 215 220 Ser Val Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr Ser Gly Leu Asp Ile Leu Ala 225 230 235 240 Lys Tyr Val Phe Ala Phe Leu Leu Leu Arg Trp Val Ala Ala Asn Glu 245 250 255 Gly Thr Val Ser Gly Ser Gly Met Gly Ile Gly Ser Gly Gly Ala Ala 260 265 270 Pro Ala Asp Asp Arg Pro Val Val Lys Ser Arg Ile Thr Ser Glu Gly 275 280 285 Glu Tyr Ile Pro Leu Asp Gln Ile Asp Ile Asn Val 290 295 300

Claims

- VP1 캡시드 단백질로, 7 내지 11개 아미노산 길이의 펩티드가 상응하는 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 상기 캡시드 단백질의 GH 루프(loop) 내에 삽입되어 있고, 상기 펩티드가 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 어느 하나를 포함하는, VP1 캡시드 단백질; 및
- 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터 또는 상기 프로모터의 기능성 변이체의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드,
를 포함하는, 원추 광수용체(cone photoreceptor)에 영향을 미치는 망막 질환의 치료시 사용하기 위한 재조합 AAV9-유도 벡터(recombinant AAV9-derived vector).
제1항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 10에 나타낸 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 588번 아미노산과 589번 아미노산 사이의 GH 루프 내에 삽입되는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드가 서열 번호: 9를 포함하거나 이로 이루어지는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어하의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 노인 황반 변성(age-related macular degeneration), 바센-코르츠바이크 증후군(Bassen-kornzweig syndrome), 맥락막결손증, 우곡상 위축(gyrate atrophy), 레프섬 증후군(Refsum syndrome), 어셔 증후군(Usher syndrome), 색각 이상(color blindness), 청색 원추 단색형색각(blue cone monochromacy), 완전 색맹, 불완전 색맹, 올리고콘 삼색형색각(oligocone trichromacy), 색소성 망막염(RP), 황반 변성, 스타르가르트 질환(Stargardt's Disease), 바뎃-비들 증후군(Bardet-Biedl syndrome), 본홀름 눈 질환(Bornholm eye disease), 베스트 질환(Best's Disease) 및 레베르 선천성 흑암시(Leber's congenital amaurosis)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 망막 질환을 앓고 있는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가, 바람직하게는 색소성 망막염 GTPase 조절인자(RPGRORF15), CNGB3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된 양이온 채널(cone cyclic nucleotide-gated cation channel)의 베타 소단위), CNGA3(원추 사이클릭 뉴클레오티드-게이트된 양이온 채널의 알파 소단위) 또는 GNAT2를 암호화하는 유전자로부터 선택된, 유전자 대체 치료요법에서 사용될 수 있는 유전자인, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 신경영양 인자(neurotrophic factor)를 암호화하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제7항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 RdCVF, RdCVF2, RdCVFL 또는 RdCVFL2를 암호화하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 로돕신, 포톱신, L/M 파장(적색/녹색) 원추-옵신, 또는 단 파장(S) 원추-옵신(청색)과 같은 옵신을 암호화하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제9항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 서열 번호: 13, 서열 번호: 14 또는 서열 번호: 15에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 옵신을 암호화하는 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자 기능의 부위-특이적인 녹-다운(knock-down)을 제공하는 부위-특이적인 엔도뉴클레아제를 암호화하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제11항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 간섭(interfering) RNA(RNAi), 특히 siRNA 또는 shRNA를 암호화하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드를 암호화하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제15항에 있어서, 망막하 전달이 상기 영역의 박리없이 중심와(fovea)의 거리에서 수행되는 재조합 AAV9-유도 벡터.
- VP1 캡시드 단백질로, 7 내지 11개의 아미노산 길이의 펩티드가 상응하는 야생형 AAV9 캡시드 단백질에 대하여 상기 캡시드 단백질의 GH 루프 내에 삽입되어 있고, 상기 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 8 중 어느 하나를 포함하는, VP1 캡시드 단백질; 및
- 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터 또는 상기 프로모터의 기능성 변이체의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드,
를 포함하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제17항에 있어서, 펩티드가 제2항 또는 제3항에 정의된 바와 같은, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제17항 또는 제18항에 있어서, 서열 번호: 11에 나타낸 VP1 캡시드 단백질 및 서열 번호: 12에 나타낸 pR1.7 프로모터의 제어 하의 관심의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 관심의 폴리뉴클레오티드가 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 재조합 AAV9-유도 벡터.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 치료적으로 유효한 양의 재조합 AAV9-유도 벡터의 망막하 전달을 포함하여, 대상체의 원추 광수용체에서 관심의 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 방법.