JP2023512473A - 網膜神経節細胞の再生 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供するのは、Ａｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１またはＩｌｓ１のうちの１つまたは複数などの転写因子を活性化させることにより、網膜ニューロン細胞から網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を再生させるための組成物および方法である。網膜ニューロン細胞は、アマクリン細胞、水平細胞、および双極細胞などの介在ニューロン細胞であり得る。再生ＲＧＣは分散した皮質下脳領域に軸索を突出させ、網膜－脳の接続を確立することができる。それは、視覚刺激に反応し、電気信号を脳に伝達することができる。したがって、再生ＲＧＣは、損傷したまたは変性したＲＧＣと置き換わり、それによって視覚機能障害または失明を治療することができる。本方法は、変性した、損傷した、または老化したＲＧＣに同様に適用可能であり、それらを刺激して機能性軸索を再成長させることによりＲＧＣを若返らせる。【選択図】なし

Description

本発明は、２０２０年１月１６日に出願された２０２０１００４７６２８．２の優先権を主張し、その内容はその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、網膜の最終出力ニューロンであり、視覚情報を処理し、それを分散した脳の視覚野に伝達して視覚を形成する。大きく分けて緑内障を含む視神経障害、遺伝性視神経症、ならびに毒物、栄養不良、および外傷によって引き起こされる障害に分類される疾患群では、ＲＧＣの消失が失明の主な原因となっている。ヒトおよびすべての哺乳類は、成人になるとＲＧＣを生成する能力が失われるため、これらの患者の視力喪失は不可逆的なものである。斯かる患者の失われた視力を回復させるための再生治療法の開発に大きな関心が集まっている。

視神経障害の再生治療法の開発の一つの魅力的なアプローチは、失われた神経節細胞を置き換え、内在性の細胞を用いて網膜と脳を再接続することである。網膜幹細胞／前駆細胞を同定し、様々なモデル生物において網膜ニューロンがどのように生成されるかを理解するために多大な努力が払われてきた。これまでの研究で、魚類および両生類のような下等脊椎動物は、受傷後に網膜を機能的に再生し、ミュラーグリアが再生網膜ニューロンの細胞源となることが明らかにされている。対照的に、哺乳類のミュラーグリアにはこのような能力はなく、ヒトを含む哺乳類には、成体期に網膜ニューロンを再生する態勢にある他の網膜幹細胞／前駆細胞リザーバーがない。現在のコンセンサスでは、成熟した哺乳類の網膜に継続的にニューロンが追加されることは通常ほとんどない。

これらの病気および症状を治療し、患者の視力を回復させることが強く求められている。

本開示は、Ａｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１、またはＩｌｓ１のうちの１つまたは複数の転写因子を活性化することによって、網膜ニューロンから網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を再生できることを発見したことを報告するものである。再生ＲＧＣは、軸索を分散した皮質下脳領域に突出させ、網膜－脳の接続を確立することができる。それは、視覚刺激に反応し、電気信号を脳に伝達することができる。したがって、再生ＲＧＣは、損傷したまたは変性したＲＧＣと置き換わることにより、視覚機能障害または失明を治療することができる。

別の予想外の発見として、これらの転写因子を活性化することで、変性した、損傷した、または老化したＲＧＣを再活性化し、その結果、機能的な軸索を再生させることも可能である。したがって、これらの転写因子を活性化できる治療薬を対象に投与すると、変性した、損傷した、または老化したＲＧＣを若返らせると同時に、近くの介在ニューロン細胞を再生ＲＧＣにリプログラミングすることができる。この薬剤の二重の効果により、より有効に望ましい治療効果を得ることができる。

本開示の一実施形態に従って、視覚信号に応答する哺乳類細胞を調製する方法であって、網膜ニューロン細胞において、ＰＯＵクラス４ホメオボックス２（Ｂｒｎ３Ｂ）、ＳＲＹボックス転写因子４（Ｓｏｘ４）、アトナールＢＨＬＨ転写因子７（Ａｔｏｈ７）、ＳＲＹボックス転写因子１１（Ｓｏｘ１１）、およびＩＳＬ ＬＩＭホメオボックス１（Ｉｌｓ１）からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることを含む、方法が提供される。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、Ａｔｏｈ７をさらに含む。

いくつかの実施形態では、網膜ニューロン細胞は、アマクリン細胞、水平細胞、または双極細胞などの介在ニューロン細胞である。いくつかの実施形態では、網膜ニューロン細胞は、変性した、損傷した、または老化した網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。いくつかの実施形態では、網膜ニューロン細胞は、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞である。いくつかの実施形態では、網膜ニューロン細胞は、Ｐｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞である。

別の実施形態では、本開示は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の機能を改善する方法を提供し、この網膜神経節細胞は、機能の改善が望まれる、変性した、損傷した、老化した、または正常／健康な網膜神経節細胞であってよい。いくつかの実施形態では、本方法は、ＲＧＣにおいて、Ａｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１、およびＩｌｓ１からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることを伴う。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることは、ｃＤＮＡなどの遺伝子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを網膜ニューロン細胞に導入することを含み、これは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのプラスミドまたはウイルスベクターで提供することが可能である。

また、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ａｔｏｈ７、Ｓｏｘ１１およびＩｌｓ１からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることができる薬剤を対象の網膜に投与することを含む、視覚機能障害または失明の治療を、それを必要とする対象において行う方法が提供される。

いくつかの実施形態では、視覚機能障害または失明は、変性した網膜神経節細胞（ＲＧＣ）により引き起こされる。いくつかの実施形態では、視覚機能障害または失明は、緑内障を含む視神経障害、遺伝性視神経障害、ならびに毒素、栄養不良および外傷によって引き起こされる障害からなる群より選択される状態に関連している。

また、一実施形態において、Ｂｒｎ３ＢおよびＳｏｘ４タンパク質をコードするコード配列と、各コード配列に関連するプロモーターとを含む核酸構築物であって、各プロモーターは網膜ニューロン細胞において活性である、核酸構築物が提供される。

別の実施形態は、核酸構築物によって遺伝子導入された細胞を提供する。さらに別の実施形態は、本明細書に開示される方法によって調製された、視覚信号に応答する細胞を提供する。

これらのおよび他の実施形態について、以下の文章でさらに説明する。

Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンが成体マウスにおいて他のニューロンサブタイプに分化することを示す図である。ａ、網膜断面の画像で、内顆粒層のＬｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンを示す。ｂ、ｃ、Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの網膜断面の画像。Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンからの双極（ｂ）および水平（ｃ）細胞の生成を矢印で強調。ｄ、網膜神経節細胞層に焦点を当てた、フラットマウント網膜サンプルの画像。内顆粒層から神経節細胞層に遊走したＬｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンが緑色で標識されている。ｅ、全視野光の閃光に反応したＬｇｒ５^＋アマクリン細胞の代表的な膜電位。挿入図：色素充填後の記録細胞の蛍光画像。ｆ、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞の全視野光の閃光に反応した代表的な興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ、青）と抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ、赤）。全体で、６個の記録細胞のうち５個が全視野ＬＥＤ光刺激に反応を示した。パネルｅおよびｆの矢印：刺激による人為的結果。ＯＮＬ：外顆粒層；ＯＰＬ：外網状層；ＩＮＬ：内顆粒層、ＩＰＬ：内網状層；ＧＣＬ：神経節細胞層。スケールバーは、パネルａ、ｂおよびｃで＝３０μｍ、パネルｄで＝２００μｍ、パネルｅで＝１０μｍ。 ｉｎ ｖｉｖｏでのＬｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンのＲＧＣへのリプログラミングを示す図である。ａ、ｉｎ ｖｉｖｏでのニューロンリプログラミング戦略。Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにまずタモキシフェン（ＴＭ）を５回与えて（－１１日目（Ｄ－１１）から－７日目（Ｄ－７））、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンをＲｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターで標識し、同一性の追跡を支援した。１週間後、マウスにＤ１でＣｒｅ依存性転写因子を発現するＡＡＶを硝子体内注射し、その後Ｄ３からＤ７までＴＭを与えて、ＡＡＶ送達遺伝子をＬｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンにおいて特異的に活性化させた。マウスは、ウイルス注射の６週間後、解析のために殺処分した。ｂ、Ｃｒｅ依存性逆方向オープンリーディングフレーム（ＤＩＯ）システムを用いたＡＡＶ発現ベクターの図。ｃ、転写因子の単一および種々の組み合わせのリプログラミング効率。示したデータは視神経中のｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索の数である（各グループ４匹のマウスからｎ＝８）。ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰを注射したマウスの視神経では、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索は検出されなかった。（Ｄ－Ｆ）網膜神経節細胞層に焦点を当てた、実験マウスのフラットマウント網膜サンプルの画像である。ｅ、パネルＤの領域の高倍率図であり、矢印は再生ＲＧＣのｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索を指す。ｆ、単一の再生ＲＧＣを強調。ｇ－ｉ、ＲＰＢＭＳ（ｇ）、Ｂｒｎ３Ａ（ｈ）およびＣＡＲＴ（ｉ）に対し特異的な抗体を用いた再生ＲＧＣの免疫組織染色。＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意差なし。パネルｃの略語：Ｂ＝Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓ４＝Ｓｏｘ４、ＢＳ４＝Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４、ＡＢＳ４＝Ａｔｏｈ７＋Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４、ＡＢＳ４Ｓ１１Ｉｓ＝Ａｔｏｈ７＋Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４＋Ｓｏｘ１１＋Ｉｓｌ１。スケールバーは、パネルｄで＝２００μｍ、パネルｅで＝１５０μｍ、パネルｆで＝５０μｍ、パネルｇ、ｈおよびｉで＝４０μｍ。 再生ＲＧＣが脳に軸索を突出させていることを示す図である。ａ、視神経内の再生ＲＧＣの軸索の共焦点画像。ｂ－ｆ、脳の視覚野における再生ＲＧＣ軸索の突起。背側および外側腹側膝状核（ｄＬＧＮおよびｖＬＧＮ、それぞれパネルｂおよびｃ）、視蓋前域オリーブ核（ＯＰＮ、パネルｄ）、ならびに上丘（ＳＣ、パネルｅおよびｆ）におけるｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索末端が示されている。パネルｆの矢印は、ＳＣ領域の再生ＲＧＣ軸索末端における終末ボタン様構造を強調するものである。ｇ－ｉ、ＳＣ脳切片のＰＳＤ－９５染色。ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋バリコシティはＰＳＤ－９５染色の近くに並列しているが重なってはいない。３匹の異なる動物からの脳サンプルの染色パターンは同じである。スケールバーは、パネルａ～ｅで２００μｍ、パネルｆで＝４０μｍ、パネルｇとｈで＝１０μｍ。 Ｐｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン介在ニューロンをＲＧＣにリプログラミングする図である。ａ、Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのフラットマウント網膜サンプルの共焦点画像。ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋置換アマクリン細胞は赤で示されている。Ｐｒｏｋｒ２－ｔｄＴｏｍａｏ^＋置換アマクリン細胞は、フラットマウント網膜サンプル上で軸索をもたない。ｂ、パネルａの領域のハイライト表示。ｃ、転写因子とＥＧＦＰを共発現するＡＡＶを注入したＰｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウスからのフラットマウント網膜サンプルの共焦点画像。再生ＲＧＣは視神経乳頭に軸索を伸ばしている。ｄ、パネルｃの領域のハイライト表示。ｅ、視神経内の再生ＲＧＣの軸索。ｆ－ｋ、ｄＬＧＮとｖＬＧＮ（ｆ）、ＯＰＮ（ｇ）、ＳＣ領域の上層（パネルｈとｉ）と下層（パネルｊとｋ）など、様々な脳網膜受容領域への再生ＲＧＣ軸索の突出。パネルｉとｋの画像は高倍率図である。スケールバーは、パネルａおよびｃで＝１０００μｍ、パネルｅ～ｇおよびパネルｊで＝２００μｍ、パネルｈで＝１００μｍ、パネルｉおよびｋで＝４０μｍ。 再生ＲＧＣは視覚情報を脳に伝え、シナプス後ニューロンとの機能的な接続を確立することを示す図である。ａ、異なる方向のドリフトグレーティングに反応した３例の軸索末端のカルシウムシグナルの追跡。シアンパッチは刺激提示の期間を示し、下部の数値は刺激の方向を示す。本パネルに示された３つの末端は「オン」反応が強いことに注意されたい。ｂ、パネルＡと同じプロットだが、ここで示した末端は「オフ」反応が強い。ｃ、ｄ、方位選択性（ｃ）および方向選択性（ｄ）を持つ３つの軸索末端のカルシウムシグナルの追跡。ｅ、ＳＣニューロンにおける光誘発シナプス後ＡＭＰＡ受容体応答の代表的なＥＰＳＣ。矢印は、複数のシナプス前入力のシナプス後応答を示す。ｆ、ＳＣニューロンにおける光誘発シナプス後ＮＭＤＡ受容体応答の代表的なＥＰＳＣ。ｇ、ＳＣニューロンにおける光誘発シナプス後活動電位の一例。ｈ、ｉ、光誘発ＡＭＰＡ受容体応答のＥＰＳＣ振幅（ｈ）とピーク数（ｉ）のまとめ（７匹の動物よりｎ＝１１）。ｊ、光誘発ＮＭＤＡ受容体応答のＥＰＳＣ振幅のまとめ（３匹の動物よりｎ＝３）。データは平均±ｓｅｍである。 緑内障モデルマウスで機能性ＲＧＣを再生させることを示す図である。ａ－ｄ．網膜サンプルの共焦点画像。ａ、正常なＬｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの網膜。ｂ、７日前に眼圧上昇（ＩＰＩ）により損傷を受けたマウスの網膜。ｃ、７日前にＩＰＩにより損傷を受けたが、毎日リパスジル治療を受けたマウスの網膜。ｄ、ＩＰＩにより損傷を受けたが、リパスジル治療とＲＧＣ運命特定転写因子を発現するＡＡＶ（ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＴＦ）の注射の両方を受けたマウスの網膜。マウスはＡＡＶ注射の６週間後に殺処分した。ｅ、ｆ、ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰ（ｅ）およびＡＡＶ－ＤＩＯ－ＴＦ（ｆ）を投与した眼の視神経の共焦点画像。ｇ－ｋ、左眼にＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰ、右眼にＡＡＶ－ＤＩＯ－ＴＦを注射したＬｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスから切り出した脳切片の共焦点画像。再生ＲＧＣ軸索の大部分は反対側（左）へ突出し、ごく一部は同側（右）へ突出した。提示の脳視覚野は、視交叉のすぐ隣の視索（ｇ）、視索（ｈ）、ｄＬＧＮ、ｖＬＧＮおよび視蓋前野への突出（ｉ）、ｄＬＧＮ（ｊ）ならびにＳＣ（ｋ）である。ｌ－ｎ、ＡＭＰＡ受容体を介したＥＰＳＣ（ｌ）、ＮＭＤＡ受容体を介したＥＰＳＣ（ｎ）および活動電位（ｎ）を含む、ＳＣニューロンの光誘発シナプス後応答。スケールバーは、パネルｄ、ｊ、およびｋで＝１００μｍ、パネルｅおよびｆで＝２００μｍ、パネルｇで＝４００μｍ、パネルｈおよびｉで＝６００μｍ。 Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンの形態と神経節細胞層への遊走を示す図である。ａ－ｃ、Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのｔｄＴｏｍａｔｏレポーターで疎に標識されたＬｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンの共焦点画像。Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞のｔｄＴｏｍａｔｏレポーターによる疎な標識は、マウスにタモキシフェンを１回だけ与えることで達成された。画像は、フラットマウント網膜サンプルから、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞が局在する内顆粒層に焦点を当てて撮影した。ｄ、Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの網膜断面の共焦点画像。矢印は、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターで標識されたＬｇｒ５^＋アマクリン細胞を強調している。この細胞の樹状突起は、神経節細胞層に到達する。ｅ－ｇ、神経節細胞層に焦点を当てた、Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}マウスのフラットマウント網膜サンプルの共焦点画像。矢印は、神経節細胞層中のＬｇｒ５^＋アマクリン細胞の存在を強調している。ｇ、２０ヶ月齢のマウスの神経節細胞層におけるＬｇｒ５^＋アマクリン細胞の群。ｈ、網膜あたりの神経節細胞層におけるＬｇｒ５^＋アマクリン細胞の数。神経節細胞層においてＬｇｒ５^＋アマクリン細胞の年齢依存的な増加が見られ、これらの細胞が内顆粒層から神経節細胞層へ遊走している可能性が示唆される。スケールバーは、パネルａ～ｃでは＝２０μｍ、パネルｄで＝３０μｍ、パネルｅ～ｆで＝５０μｍ。 Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおけるニューロンの同一性のリプログラミングを示す図である。ａ、ｂ、ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰを注射したマウスのフラットマウント網膜サンプル（ａ）および視神経（ｂ）の代表的画像。これらのマウスでは、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋の軸索は検出されなかった。ｃ－ｅ、高用量のＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰ（７ｘ１０^１２ｐｆｕ、２μＬ）を注射したマウスの視神経の代表的画像。ＡＡＶ－ＤＩＯプラスミドはＤＮＡ増幅およびウイルスベクター作製時に自己組換えするため（反転（ｆｌｉｐｐｅｄ）ベクター）、大量のＡＡＶ粒子を注射すると、少数だが（一桁以内）オリジナルのＲＧＣとその軸索が、Ｃｒｅ非依存的導入遺伝子発現を介して、注入されたＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰにより標識される可能性がある。しかし、これらのＥＧＦＰ^＋軸索はｔｄＴｏｍａｔｏを発現しないことから、再生ＲＧＣからのものではないことが示唆される。ｆ－ｈ、内網状層（ＩＰＬ）に存在するＬｇｒ５－ＥＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏの二重陽性細胞のハイライト表示で、内顆粒層（ＩＮＬ）から網膜神経節層（ＲＧＬ）へのＬｇｒ５^＋アマクリン細胞の遊走がプログラミングによって引き起こされることを示唆する。ｉ－ｌ、αＲＧＣマーカーＳＭＩ－３２を発現する再生ＲＧＣの共焦点画像。ｍ－ｒ、ＡＡＶ送達遺伝子発現の特異性と効率を調べるためにＡＡＶ－ＤＩＯ－ｔｄＴｏｍａｔｏを硝子体内注射したＬｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}マウスからの網膜断面の共焦点画像。タモキシフェンを５回投与後、ＡＡＶ送達ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子がＬｇｒ５^＋アマクリン細胞を特異的に標識する。ｐ－ｒ、パネルｍ～ｏの同じ眼から撮影した高倍率画像。ｓ、パネルｍ～ｒのＥＧＦＰ^＋／ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞についての統計。この発現系では、約２１．３％のＬｇｒ５^＋アマクリン細胞をＡＡＶ送達ｔｄＴｏｍａｔｏによって標識することができた。ｔ、ＡＡＶ－ＤＩＯ－Ｂｒｎ３ＢおよびＡＡＶ－ＤＩＯ－Ｓｏｘ４を硝子体内注射したＬｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおけるＢｒｎ３ＢおよびＳｏｘ４の発現レベルについての統計。Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４の発現は定量ＰＣＲで測定し、ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰを硝子体内注射した対照マウスの１に正規化した。スケールバーは、パネルａで＝１５０μｍ、パネルｂで＝２００μｍ、パネルｃ～ｅで＝３００μｍ、パネルｆ～ｌで＝４０μｍ、パネルｏで＝４００μｍ、パネルｒで＝５０μｍである。 再生ＲＧＣが軸索を分散した脳視覚野内に成長させるのにかかる時間を示す図である。Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの片眼にＡＡＶ－ＤＩＯ－Ｂｒｎ３ＢとＡＡＶ－ＤＩＯ－Ｓｏｘ４を硝子体内注射し、その後タモキシフェンを５回与えて遺伝子発現を活性化させた。マウスは異なる時点で殺処分して脳切片を作成し、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索の存在を共焦点顕微鏡で調べた。ａ、ウイルス注射後３０日目に殺処分したマウスの脳切片の共焦点画像。反対側の脳（写真左側）のｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索は外側膝状核を通過している。同じ脳切片の同側では、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索は検出されなかった。ｂ、パネルａと同じマウスの上丘（ＳＣ）領域の共焦点画像。この時点ではｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索はＳＣに到達していなかった。ｃ、ウイルス注射後３５日目に殺処分したマウスの脳スライドの共焦点画像。強調したのは、反対側の脳（写真左側）のＬＧＮ（外側膝状核）の後部とＳＣの前部の領域である。同側の脳でもｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索は検出されたが、その数は劇的に少なかった。ｄ、再生ＲＧＣの軸索突起の時間経過。再生ＲＧＣの軸索がＯＣ（視交叉）、ＬＧＮおよびＳＣに到達するまでにかかる時間を、ウイルス注射後、再生ＲＧＣの軸索がこれらの場所で最初に観察された時間を数えることによって求めた。再生ＲＧＣの軸索は、およそ１８日目にＯＣに、２８日目にＬＧＮに、３５日目にＳＣに到達した（各群ｎ＝８）。 Ｐｒｏｋｒ２ノックインマウス系統の構築と、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン介在ニューロンのＲＧＣへのリプログラミングを示す図である。ａ、Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウス系統を作るための標的戦略の図。ＣｒｅＥＲＴ２コード領域が、Ｐｒｏｋｒ２座位の開始コドンにノックインされる。５’アームとＣｒｅＥＲＴ２領域を標的とするサザンブロッティングプローブの位置が示されている。ｂ、５’アームプローブ（上）およびＣｒｅＥＲＴ２プローブ（下）を用いたサザンブロッティング膜の画像。ファウンダー１、２、３、４は正しいゲノムターゲティングを有し、さらなる育種に使用された。ｃ－ｅ、Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの網膜断面の、抗ＲＢＰＭＳ抗体を用いた免疫組織染色。Ｐｒｏｋｒ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞はＲＧＣマーカーＲＢＰＭＳを発現していない。ｆ－ｈ、Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの脳冠状断（ｆ）、上丘（ｇ）および視神経（ｈ）の共焦点画像。Ｐｒｏｋｒ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞は脳と視神経に存在する。ｉ、ｊ、ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰを硝子体内注射したＰｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウスの画像。ＡＡＶ－ＤＩＯプラスミドがＤＮＡ増幅およびウイルスベクター製造中に自己組換えするため、反転ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰベクターは、ごく少数だがオリジナルの網膜神経節細胞（ｉ）およびその軸索（ｊ）を標識する。ｋ、Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウスにおけるリプログラミング戦略およびＡＡＶ発現ベクターの図。１日目（Ｄ１）に、マウスにＡＡＶを硝子体内注射し、その後、Ｄ３～Ｄ７にＣｒｅ依存性ＡＡＶ－ＤＩＯ系によって送達された遺伝子の発現を活性化するためにタモキシフェン（ＴＭ）を与えた。Ｄ４２以降にマウスを殺処分して解析した。ｌ、転写因子組み合わせのリプログラミング効率。対照群では、反転ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰはごく少数の内在性ＲＧＣを標識した。スケールバーは、パネルｄで＝４０μｍ、パネルｆで＝８００μｍ、パネルｇで＝２００μｍ、パネルｈで＝１００μｍ、パネルｉで＝１０００μｍ、およびパネルｊで＝１００μｍ。 ＲＧＣのカルシウムイメージングとオプトジェネティクス解析を示す図である。ｉｎ ｖｉｖｏでのカルシウムイメージングのセットアップの図。ｂ、ＳＣ領域における再生ＲＧＣ末端の代表画像。ｃ、３匹のマウスで記録したすべての応答末端の方位選択性指数（ＯＳＩ）のヒストグラム分布。ｄ、パネルｃに示されたすべての末端データについてのＯＳＩ累積パーセントプロット。ｅ、ｆ、ＣｈＲ２でＲＧＣを標識したＣ５７Ｂ６／ＪマウスのＳＣニューロンにおける光誘発シナプス後ＡＭＰＡ受容体応答（ｅ）とシナプス後活動電位（ｆ）の代表的なＥＰＳＣ。スケールバー＝１０μｍ。 オリジナルのＲＧＣを損傷した後のｉｎ ｖｉｖｏでのリプログラミングを示す図である。ＰｖａｌｂはＲＧＣのいくつかのサブタイプで発現しているため、Ｐｖａｌｂ^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを用いて、眼圧上昇（ＩＰＩ）が原因の損傷ＲＧＣとその軸索の状態を確立した。ａ、Ｐｖａｌｂ^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの視神経の共焦点画像。Ｐｖａｌｂ－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋のＲＧＣの軸索は無傷である。ｂ、眼圧上昇（ＩＰＩ）により損傷を受けた７日後のＰｖａｌｂ^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの視神経の共焦点画像。すべての軸索がＩＰＩにより損傷している。ｃ－ｅ、Ｐｖａｌｂ^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのフラットマウント網膜サンプルの共焦点画像。Ｐｖａｌｂ－ｔｄＴｏｍａｔｏは、損傷のない正常なマウスのＲＧＣとその軸索を標識する（ｃ）。眼圧上昇（ＩＰＩ）により損傷を受けた７日後、マウスの網膜ではＰｖａｌｂ－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋ＲＧＣの劇的な喪失が見られる（ｄ）。リパスジル処理によりＰｖａｌｂ－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋ＲＧＣの変性は遅くなるが、残存したＲＧＣが無傷の軸索を持つまでにはいかない（ｅ）。ｆ、ＩＰＩによりオリジナルのＲＧＣが損傷した後のＬｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのｉｎ ｖｉｖｏでの神経リプログラミングの図。Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにまずタモキシフェン（ＴＭ）を５回（－１１日目（Ｄ－１１）～－７日目（Ｄ－７））与えて、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンをＲｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターで標識して同一性の追跡を支援した。１週間後、Ｄ１で眼圧上昇によりマウスのＲＧＣとその軸索を損傷させた。Ｄ７にＣｒｅ依存性転写因子を発現するＡＡＶをマウスに硝子体内注射し、Ｄ９～Ｄ１３までタモキシフェン（ＴＭ）を与えて、遺伝子発現を活性化させた。マウスはＤ４９以降に殺処分し、解析を行った。Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンおよび他の網膜ニューロンを保護するために、マウスはＤ１～Ｄ４９まで毎日リパスジル点眼薬で処置した。スケールバー＝１００μｍ。 フラットマウント網膜サンプルと視神経の共焦点画像である。ａ）ＰＶ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのフラットマウント網膜におけるパバルブミン（ＰＶ）陽性ＲＧＣとその軸索。ｂ）眼圧上昇後、多くのＲＧＣが死に、その軸索は変性する。ｃ）残存したＲＧＣにＡｔｏｈ７＋Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４を発現させると、これらの細胞は軸索を再成長/再生させる。ｄ）ＰＶ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの視神経におけるＰＶ陽性ＲＧＣ軸索。ｅ）眼圧上昇によりＲＧＣが損傷した後、ＲＧＣの軸索は視神経内で変性する。Ｆ）残存したＲＧＣにおけるＡｔｏｈ７＋Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４の過剰発現後に再生した視神経内のＲＧＣ軸索。 再生ＲＧＣ軸索の脳視覚野への突出を示す図である。ａ）背側および外側腹側膝状核における再生ＲＧＣの軸索。ｂ）上丘核における再生ＲＧＣの軸索。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定されない限り、以下の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法、装置および材料は、本明細書に記載される組成物および方法の実施において使用することができる。以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供され、本開示の範囲を限定することは意図していない。本明細書で言及される全ての文献は、その全体が参照により組み込まれるものとする。

本明細書で使用される場合、用語「～を含む」は、組成物および方法が記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。組成物および方法を定義するために使用される場合、「本質的に～からなる」とは、組み合わせに本質的な意味を持つ他のものを除外することを意味するものとする。例えば、本明細書で定義された要素から本質的になる組成物は、特許請求された発明の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を与えない他の要素を除外しないであろう。「～からなる」とは、微量を超える他の成分および記載された実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの各移行語で定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。

用語「約」は、所与の値または範囲の±１０％、±５％または±１％以内を意味する。一実施形態では、約とは、所与の値または範囲の±１０％を意味する。別の実施形態では、約とは、所与の値または範囲の±５％を意味する。別の実施形態では、約とは、所与の値または範囲の±１％を意味する。

「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列をいう。発現制御配列がヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を制御および調節する際は、発現制御配列はヌクレオチド配列に「作動可能に連結」している。したがって、発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのためのスプライシング信号、および停止コドンが含まれ得る。「発現制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現に影響を与えるように設計された配列を含むことを意図しており、さらに有利な成分を含むことも可能である。例えば、リーダー配列および融合パートナー配列が、発現制御配列である。この用語はまた、望ましくない、フレーム内外の潜在的な開始コドンが配列から除去されるような核酸配列の設計を含み得る。また、望ましくない潜在的なスプライス部位が除去されるような核酸配列の設計も含み得る。ポリＡテール、すなわちｍＲＮＡの３’末端にある一連のアデニン残基であり、ポリＡ配列とも称され得るものの付加を指示する配列、つまりポリアデニル化配列（ｐＡ）も含む。また、ｍＲＮＡの安定性を高めるように設計することもできる。昆虫細胞での使用に適した、転写および翻訳の安定性に影響を与える発現制御配列、例えば、プロモーター、および翻訳に影響を与える配列、例えば、Ｋｏｚａｋ配列が、当業者に周知である。発現制御配列は、より低い発現レベルまたはより高い発現レベルが達成されるように、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列を調節するような性質であり得る。

本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」または「転写調節配列」は、１つまたは複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に特定される核酸断片を指し、前記任意の他のＤＮＡ配列としては、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写量を調節するために直接的または間接的に作用する当業者にとって既知のヌクレオチドの任意の他のヌクレオチド配列、例えばアテニュエーターまたはエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されず、サイレンサーも含まれる。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの組織において、ほとんどの生理的および発生上の条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、例えば化学的誘導物質の適用により、生理的または発生上調節されたプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の組織または細胞においてのみ活性がある。

「ベクター」とは、パッセンジャー核酸配列（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主細胞に導入する役割を果たす核酸分子（典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡ）である。一般的なベクターには、プラスミド、ファージ、およびウイルスの３種類がある。好ましくは、ベクターはウイルスである。ポリヌクレオチドを作動的に連結することができるプロモーターとクローニングサイトの両方を含むベクターが、当技術分野で周知である。このようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給源から商業的に入手可能である。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するには、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、追加または変更して、転写または翻訳のレベルのいずれかで、発現を妨げるまたは減少させる可能性のある余分で潜在的で不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を排除することが有用であろう。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’側に挿入して、発現を増強することもできる。

「ウイルスベクター」とは、遺伝子産物をコードするウイルス遺伝子、制御配列およびウイルスパッケージング配列の一部または全部を含むベクターをいう。「パルボウイルスベクター」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、組換え生産されたパルボウイルスまたはパルボウイルス粒子と定義される。パルボウイルスベクターの例としては、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。ここで、パルボウイルスベクター構築物とは、ウイルスゲノムまたはその一部と、導入遺伝子とを含むポリヌクレオチドを指す。

用語「投与」とは、薬剤を患者の体内に導入することをいう。有効量を投与することができ、これは治療する医師等によって決定され得る。関連する用語およびフレーズである「投与する」および「～の投与」は、化合物または錠剤（および文法上の同等物）に関連して用いられる場合、いずれも直接投与を指し、これは医療従事者による患者への投与または患者による自己投与であり得る。

「治療上有効な量」または「有効量」とは、本明細書に記載の医薬組成物を介して、ある状態に苦しむ患者に局所的に投与した場合に、意図した治療効果、例えば、患者の状態の１つまたは複数の症状の緩和、寛解、緩和または除去をもたらす薬物または薬剤の量を意味する。完全な治療効果が必ずしもすぐに起きるわけではなく、治療上有効な量がある期間継続して送達された後にのみ起きる場合もある。疾患部位に有効量の薬物を常に提供する、確認可能かつ制御可能な放出速度で送達溶媒から疾患部位に徐放される徐放性または制御放出性製剤の場合、「治療上有効な量」または「有効量」は、一定期間中の有効量の合計を指す場合がある。いくつかの実施形態では、「治療上有効な量」または「有効量」は、所定の期間、例えば、１日当たりで疾患部位に放出される量を指す。

用語「薬学的に許容される」とは、ヒトへの投与に対して一般的に安全かつ無毒であることをいう。

「治療」、「治療すること」、および「治療する」とは、疾患、障害、または状態に薬剤を作用させて、疾患、障害、もしくは病気および／またはその症状の有害なまたは他の望ましくない影響を軽減または改善することと定義される。

他の網膜ニューロン細胞からの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の再生
緑内障および様々な視神経障害では、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）とその軸索の変性が視力低下の根底にある。これらの疾患に影響を受けた患者の失われた視力を回復させる治療法は今のところない。ＲＧＣを再生し、網膜を脳に再接続することが理想的な治療戦略であるが；哺乳類には、成体期に新しいニューロンを産生する態勢にある網膜幹細胞／前駆細胞のリザーバーがない。

添付の実験例では、網膜ニューロンの直接の系譜リプログラミングにより、ＲＧＣが再生されることが実証された。アマクリンおよび置換アマクリン介在ニューロンのＲＧＣへの変換に成功し、ＲＧＣは軸索を脳網膜受容領域に突出させた。それらは、正常な動物と眼圧上昇によりオリジナルのＲＧＣが損傷した緑内障の動物モデルの両方で、視覚刺激に反応して視覚情報を脳に伝え、シナプス後ニューロンに電気信号を伝達することができた。

したがって、本開示の一実施形態に従って、非ＲＧＣニューロン細胞をリプログラミングして視覚信号に応答するようにする方法を提供する。リプログラミングには、一実施形態では、非ＲＧＣニューロン細胞における１つまたは複数の転写因子の活性化（または生物活性の増加）を伴う。いくつかの実施形態では、転写因子は、前神経転写因子である。

転写因子の例は、Ｂｒｎ３ＢなどのＰＯＵドメイン転写因子である。Ｂｒｎ３Ｂ（ＰＯＵクラス４ホメオボックス２、つまりＰＯＵ４Ｆ２、ＢＲＮ３．２、またはＢｒｎ－３ｂ）は、ＰＯＵドメイン転写因子ファミリーのメンバーであり、網膜における視覚系ニューロンの維持に関与している。ヒトの代表的なＢｒｎ３Ｂ遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿００４５６６．２であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿００４５７５．３である。マウスの代表的なＢｒｎ３Ｂ遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿６２０３９４．２であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿１３８９４４．３である。

別の例の転写因子は、ＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）転写因子であり、例えばＳｏｘ４である。Ｓｏｘ４（ＳＲＹボックス転写因子４、またはＣＳＳ１０、またはＥＶＩ１６）は、ＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）転写因子ファミリーのメンバーであり、胚発生の調節および細胞の運命決定に関与している。ヒトの代表的なＳｏｘ４遺伝子は、タンパク質の配列がＮＰ＿００３０９８．１であり、ｍＲＮＡの配列がＮＭ＿００３１０７．３である。マウスの代表的なＳｏｘ４遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿０３３２６４．２であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿００９２３８．３である。

ＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）転写因子ファミリーの他の例示的なメンバーは、Ｓｏｘ１１である。Ｓｏｘ１１（ＳＲＹボックス転写因子１１、またはＣＳＳ９、またはＭＲＤ２７）は、ＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）転写因子ファミリーのメンバーであり、胚発生の調節および細胞の運命決定に関与している。ヒトの代表的なＳｏｘ１１遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿００３０９９．１であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿００３１０８．４である。マウスの代表的なＳｏｘ１１遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿０３３２６０．４であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿００９２３４．６である。

別の例示的な転写因子は、Ａｔｏｈ７などの塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子である。Ａｔｏｈ７（アトナールｂＨＬＨ転写因子７、またはＭａｔｈ５、ＮＣＲＮＡ、ＲＮＡＮＣ、ＰＨＰＶＡＲ、またはｂＨＬＨａ１３）は、転写因子の塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスファミリーのメンバーで、光受容体の発生を制御している。この遺伝子は、網膜神経節細胞および視神経の形成で中心的な役割を担っている。ヒトの代表的なＡｔｏｈ７遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿６６０１６１．１であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿１４５１７８．４である。マウスの代表的なＡｔｏｈ７遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿０５８５６０．１またはＮＰ＿００１３５１５７７．１であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿０１６８６４．３またはＮＭ＿００１３６４８．２である。

別の例の転写因子は、ＬＩＭ／ホメオドメイン転写因子であり、例えば、Ｉｌｓ１である。Ｉｌｓ１（ＩＳＬ ＬＩＭホメオボックス１、またはＩｓｌ－１、またはＩＳＬＥＴ１）は、転写因子のＬＩＭ／ホメオドメインファミリーのメンバーであり、中でもインスリン遺伝子のエンハンサー領域に結合し、インスリン遺伝子発現の調節に重要な役割を果たし得る。Ｉｌｓ１は膵臓細胞系譜の発生の中心であり、運動ニューロン生成に必要である。ヒトの代表的なＩｌｓ１遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿００２１９３．２であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿００２２０２．３である。マウスの代表的なＩｌｓ１遺伝子は、タンパク質配列がＮＰ＿０６７４３４．３であり、ｍＲＮＡ配列がＮＭ＿０２１４５９．４である。

これらの転写因子例のタンパク質および核酸配列の例を、以下の表１に示す。

遺伝子の生物活性を増加させる方法は、当該技術分野において既知である。生物活性の増加は、タンパク質の発現の増加、またはタンパク質の機能の増加、またはその両方であり得る。

いくつかの実施形態では、転写因子の少なくとも１つが細胞内で活性化される。一実施形態では、Ｂｒｎ３Ｂの生物活性が増加する。一実施形態では、Ｓｏｘ４の生物活性が増加する。一実施形態では、Ａｔｏｈ７の生物活性が増加する。一実施形態では、Ｓｏｘ１１の生物活性が増加する。一実施形態では、Ｉｌｓ１の生物活性が増加する。

いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも２つの生物活性が増加する。その２つは、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４、Ｂｒｎ３ＢとＡｔｏ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ１１、Ｂｒｎ３ＢとＩｌｓ１、Ｓｏｘ４とＡｔｏ７、Ｓｏｘ４とＳｏｘ１１、Ｓｏｘ４とＩｌｓ１、Ａｔｏ７とＳｏｘ１１、Ａｔｏ７とＩｌｓ１、またはＳｏｘ１１とＩｌｓ１であり得る。

いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも３つの生物活性が増加する。この３つは、限定するわけではないが、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＡｔｏｈ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＳｏｘ１１、またはＢｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＩｌｓ１であり得る。いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも４つの生物活性が増加する。いくつかの実施形態では、転写因子の５つ全ての生物活性が増加する。

内在性転写因子の活性化
一例では、対応する内在性遺伝子の発現が活性化または増強される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター（ＣＭＶという）は、高い転写活性を有する天然の哺乳類プロモーターである。ＣＭＶエンハンサーは、様々な哺乳類細胞における強力なエンハンサーであり、広範囲の哺乳類細胞における様々な遺伝子の異所性発現を駆動するため、およびトランスジェニック動物における広範囲の組織における外来遺伝子の異所発現を駆動するために広く使用されてきた。いくつかの例では、天然のＮＦ－κＢ結合部位を、高い結合親和性を有する人工的に選択したＮＦ－κＢ結合配列に変更することによって、ＣＭＶエンハンサーの転写活性をさらに改善することができる（Wang et al., Protein Expression and Purification 142:16-24, 2018）。米国特許第１０３２９５９５号明細書も、２つの改善されたＣＭＶプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６および２７）の生成について報告している。他の有用な遺伝子プロモーターおよびエンハンサーも当技術分野で既知である。

いくつかの実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーは、ニューロンで常時発現している遺伝子の発現を調節するものである。アマクリン細胞などのニューロンで発現する遺伝子例としては、Ｐａｘ６、Ｔｃｆａｐ２Ｂ、Ｇａｄ１、ＧｌｙＴ１、ＲＢＰＭＳ、およびＰｒｏｘ１が挙げられる。別の遺伝子例はシナプシン１である。プロモーター／エンハンサーの例を表２に示す。

遺伝子発現プロモーターやエンハンサーは、従来のノックイン技術によりまたはＣＲＩＳＰＲ法で標的遺伝子に導入することができる。

また、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子活性化技術も豊富に存在する。一例では、不活性Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）が、適切な転写エフェクタードメインに融合される。一般的に使用される転写活性化因子ドメインには、ＶＰ６４、ＮＦ－κＢのｐ６５ドメイン、エプスタインバールウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）、および熱ショック因子１（ＨＳＦ１）の活性化因子ドメインが含まれる。内在性の文脈の場合、複数の転写因子と補因子が同調して働いて、遺伝子の転写を刺激する。実際、複数の固有の転写活性化因子をプロモーターに補充するＣＲＩＳＰＲツールは、単一の転写活性化因子ドメインまたは同じエフェクターの冗長コピーを持つツールより優れている。また、同じプロモーター上の複数の部位を標的にすることで、ＣＲＩＳＰＲによる遺伝子の活性化が増大する。最も効果的なＣＲＩＳＰＲエフェクターの一つは、ＣＲＩＳＰＲ相乗活性化メディエーター（Synergistic Activation Mediator, ＳＡＭ）複合体で、これは、標的とする遺伝子プロモーターに３つの固有の転写活性化ドメインをリクルートする。この系では、１つの転写活性化因子ＶＰ６４（ＶＰ１６の多量体形態）がｄＣａｓ９に直接融合している。

別の例では、ｄＣａｓ９－ｐ３００ ＣＲＩＳＰＲ Ｇｅｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｏｒシステム（Signa Aldrich, Hilton, Isaac B., et al. Nature Biotechnology (2015)）が、ｄＣａｓ９とヒトＥ１Ａ関連タンパク質ｐ３００の触媒ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コアドメインの融合を基礎としている。このアプローチにより、転写開始部位（ＴＳＳ）に対して近位および遠位の両方の位置で遺伝子が活性化される。

外来性転写因子の導入
転写因子の生物活性（または発現）を増加させるより一般的な方法は、転写因子をコードする外来性の配列、または転写因子タンパク質を導入することである。タンパク質は、リポソームなどのビヒクルに封入する手段によって細胞内に導入することができる。転写因子のタンパク質配列の例を表１で提供する。

また、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのコード配列を標的細胞内に導入することもできる。転写因子のコード配列の例を表１で提供する。いくつかの実施形態では、これらの転写因子の１つまたは複数のコード配列を含む核酸構築物が調製される。コード配列は、適切なプロモーターまたはエンハンサーに機能的に接続され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーは、網膜介在ニューロンなどの標的細胞に特異的である。プロモーターの例を表２で提供する。

構築物はプラスミドであってもよいし、好ましくはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターには、レンチウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが含まれる。

本明細書において「組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」（または「ｒＡＡＶベクター」）とは、１つまたは複数の目的のポリヌクレオチド配列と、目的の遺伝子産物と、少なくとも１つのパルボウイルスまたはＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と隣接している目的の遺伝子つまり「導入遺伝子」とを含むベクターをいう。斯かるｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞中にあると複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターがより大きな核酸構築物（例えば、染色体中、またはクローニングもしくは遺伝子導入に使用されるプラスミドもしくはバキュロウイルスなどの別のベクター中の）に組み込まれる場合は、ｒＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶパッケージング機能および必要なヘルパー機能の存在下で複製およびカプセル化されることにより「救済」され得る「プロベクター」といわれる。好ましくは、目的の遺伝子産物は、いずれかの側でＡＡＶ ＩＴＲと隣接している。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２からのＩＴＲを含むＡＡＶ ＩＴＲを本発明の構築物に使用することができる。

本技術で使用するＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、哺乳類細胞中で作製してもよいし、昆虫細胞中で作製してもよい。いずれの方法も当技術分野で説明されている。例えばＧｒｉｍｍら（2003 Molecular Therapy 7(6):839-850）は、２９３Ｔ細胞へ２つのプラスミドのみを遺伝子導入することに基づく、ヘルパーウイルスフリーかつ光学的に制御可能な方法でＡＡＶベクターを作製する戦略を開示している。彼らは、ＡＡＶ２ ＩＴＲとＡＡＶ５カプシドタンパク質とを含むハイブリッドＡＡＶベクターの作製方法を開示している。さらなる情報は、Ｂｌｉｔｓら（２０１０）（Journal of Neuroscience methods 185(2):257-263）にも見出すことができる。用語「ハイブリッド」および「偽型の」は、本明細書において互換的に用いられ、Ｒｅｐタンパク質、ＩＴＲおよび／またはカプシドタンパク質が異なる血清型であるベクターを示すために使用される。例えば、ＩＴＲおよびＲｅｐタンパク質はＡＡＶ２のそれであり、カプシドタンパク質はＡＡＶ５のそれである。本明細書において、用語「キメラ」は、例えばカプシドなどの単一の遺伝子が、異なる血清型に由来する少なくとも２つの配列で構成されていることを説明するために用いられる。

ＡＡＶは、限定するわけではないが、例えば、以下の方法に従って哺乳類細胞で作製することができる：ベクターゲノムは、ＡＡＶ血清型２由来の２つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接した導入遺伝子発現カセットを含む。ウイルスベクターゲノムの全長は、効率的なパッケージング効率を維持するために、野生型ゲノムサイズである４．７ｋＢ以下とすることができる。１つのカプシドは、ＶＰ１（６２ｋＤａ）、ＶＰ２（７３ｋＤａ）、またはＶＰ３（８７ｋＤａ）のいずれかの６０個のウイルスタンパク質からなり、その比率は１：１：１０である。ＡＡＶベクターの製造プロセスは、ローラーボトル（表面積８５０ｃｍ２）内で、２つのプラスミドをヒト胎児由来腎臓生成細胞（ＨＥＫ２９３）にＣａ（ＰＯ４）２を遺伝子導入し、その後、ろ過およびクロマトグラフィー技術によりカプシド形成したベクターゲノムを精製することに基づいている。第１プラスミドはウイルスベクタープラスミドであり、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接した発現構築物を含んでいる。第２プラスミドはパッケージングプラスミドであり、所望の血清型のＡＡＶ ｒｅｐ ｔｙｐｅ２およびｃａｐ ｔｙｐｅ５遺伝子と、アデノウイルス初期ヘルパー遺伝子Ｅ２Ａ、ＶＡ、Ｅ４（ｐＤＰ５）とをコードしている。生成細胞株のゲノムはアデノウイルスＥ１を含んで、ヘルパー機能を提供する。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で２つのプラスミドを同時導入した後、細胞を無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３日間インキュベートし、ベクター作製を行わせる。ローラーボトルでのベクター作製は、平均して細胞あたり３×１０^３個のベクターゲノム、またはローラーボトルあたり４×１０^１１個のベクターゲノムの収量をもたらす（ｑＰＣＲにより定量化）。その後、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含む緩衝液で細胞培養物を溶解し、低速遠心分離で細胞破片を除去する。清澄化したバルクをＡＶＢセファロースアフィニティークロマトグラフィーで精製し、４００ｋＤａ中空糸モジュール（例えばＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いた濃縮および透析ろ過によりＰＢＳ／５％スクロース中に配合する。

昆虫細胞におけるｒＡＡＶベクターの作製のために本発明で使用され得るＡＡＶ ＩＴＲおよびＲｅｐ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来し得る。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸レベルおよび核酸レベルで有意な相同性を持つゲノム配列を有する。これは、本質的に物理的および機能的に等価なビリオンを作製するための同一の遺伝的機能のセットを提供する。様々なＡＡＶ血清型のゲノム配列およびゲノム類似性の概要については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（1997, J. Vir. 71: 6823-33）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（1983, J. Vir. 45:555-64)；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（1999, J. Vir. 73:1309-1319）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（1998, J. Vir. 72:309-319）；およびＷｕら（2000, J. Vir. 74: 8635-47）を参照されたい。ｒＡＡＶ血清型１、２、３、４および５が本発明の文脈での使用に好ましいＡＡＶ核酸配列の供給源である。好ましくは、本発明の文脈において使用するためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、および／またはＡＡＶ５に由来する。より好ましくは、本発明で使用するためのＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。同様に、Ｒｅｐ（Ｒｅｐ７８／６８およびＲｅｐ５２／４０）コード配列は、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、および／またはＡＡＶ５、より好ましくはＡＡＶ２に由来する。

特に、ＡＡＶのＲｅｐとＩＴＲの配列は、ほとんどの血清型間で保存されている。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐ７８タンパク質は、例えば、８９％超同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ６の間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列同一性は約８２％である（Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947）。さらに、多くのＡＡＶ血清型のＲｅｐ配列およびＩＴＲは、哺乳類細胞におけるＡＡＶ粒子の作製において、他の血清型からの対応する配列を効率的に交差補完（すなわち、機能的に置換）することが知られている。また、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号明細書では、昆虫細胞において、ＡＡＶのＲｅｐおよびＩＴＲ配列が他のＡＡＶのＲｅｐおよびＩＴＲ配列と効率的に交差補完することが報告されている。

ＡＡＶのＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞内トロピシティ（ｔｒｏｐｉｃｉｔｙ）を決定することが知られている。ＶＰタンパク質をコードする配列は、異なるＡＡＶ血清型間においてＲｅｐタンパク質および遺伝子ほど有意に保存されてはない。本発明の文脈において使用するためのウイルスタンパク質（ＶＰ）ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、ＡＡＶ５に由来する。最も好ましくは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、ＡＡＶ５のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３である。あるいは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、野生型ＡＡＶ５配列である。ＲｅｐおよびＩＴＲ配列が他の血清型の対応する配列を交差補完する能力は、１つの血清型のカプシドタンパク質と別のＡＡＶ血清型のＩＴＲ配列とを含む偽型ｒＡＡＶ粒子の作製を可能にする。斯かる偽型ｒＡＡＶ粒子は、本発明の一部である。

ＡＡＶの各血清型は、１つまたは複数の特定の組織により適している場合がある。例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７およびＡＡＶ８は網膜に適している場合があり；ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７およびＡＡＶ１０はニューロンに適している場合があり；ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は脳に対して適している場合があり；ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０は肺に対して適している場合があり；ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０は心臓に適している場合があり；ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ６－１０は肝臓に適している場合があり；ＡＡＶ５を除くすべての血清型は筋肉組織に適している場合があり；ＡＡＶ２およびＡＡＶ１０は腎臓に適している場合があり；ＡＡＶ１、ＡＡＶ７およびＡＡＶ９は膵臓に適している場合がある。

一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ２のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ３のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ４のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ５のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ７のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ８のそれである。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）表面可変領域ＶＩＩＩ（ＶＲ－ＶＩＩＩ）に１０個のアミノ酸挿入を有し、ＡＡＶ２の抗原性領域の改変と、硝子体内投与後に網膜細胞に効率的に形質導入する能力とをもたらす操作されたカプシドである、ＡＡＶ２．７ｍ８ベクターである（Bennett et al., J Struct Biol, 2020 Feb 1;209(2):107433. doi: 10.1016/j.jsb.2019.107433. Epub 2019 Dec 16）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、８つの異なる野生型天然ウイルスをシャッフルすることにより操作されたＡＡＶ－ＤＪ（２型／８型／９型キメラ）である（Katada Y, et al., 2019. PeerJ 7:e6317）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ７ｍ８ベクターである（Ramachandran et al., Hum Gene Ther. 2017 Feb;28(2):154-167. doi: 10.1089/hum.2016.111. Epub 2016 Oct 17）。

標的細胞
リプログラミングは、ＲＧＣではない任意の網膜ニューロンなど、網膜中の非ＲＧＣ細胞で行うことができる。いくつかの実施形態では、斯かる網膜ニューロンは、介在ニューロン細胞である。介在ニューロン細胞の例は、アマクリン細胞、双極細胞、および水平細胞である。いくつかの実施形態では、非ＲＧＣ細胞は、光受容体である。また、非ＲＧＣ細胞は、いくつかの実施形態ではミュラー細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、アマクリン細胞は、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞である。いくつかの実施形態では、アマクリン細胞はＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞である。いくつかの実施形態では、アマクリン細胞はＬｇｒ５^＋アマクリン細胞であり、Ｂｒｎ３ＢおよびＳｏｘ４の両方の生物活性（発現）がＬｇｒ５^＋アマクリン細胞において増加する。いくつかの実施形態では、アマクリン細胞はＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞であり、Ｂｒｎ３ＢおよびＳｏｘ４の両方の生物活性（発現）がＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞において増加する。いくつかの実施形態では、アマクリン細胞はＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞であり、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４およびＡｔｏ７の全ての生物活性（発現）がＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞において増加する。

標的細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでリプログラミングすることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでリプログラミングされた場合、細胞は再生ＲＧＣに変換され、それを必要とする対象に移植することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでリプログラミングされた場合、再生ＲＧＣは損傷したまたは変性したＲＧＣに取って代わることができ、それによって視覚機能障害または失明を治療することができる。

網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の若返り
もう一つの驚くべき発見では、本発明者らは、本開示の転写因子の活性化が、損傷したＲＧＣの再活性化にも有効であることを明らかにした（実施例２）。再活性化されたＲＧＣは機能的な軸索を再生することができ、これは視神経に突出し脳とつながった。

したがって、本開示の別の実施形態は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の機能を改善する方法を提供する。ＲＧＣは、機能の改善が望まれる、変性した、損傷した、老化した、または正常／健康なＲＧＣであってもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、ＲＧＣにおいて、Ａｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１、およびＩｌｓ１からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることを伴う。

遺伝子の生物活性を増加させる方法は、当該技術分野において既知である。生物活性の増加は、タンパク質の発現の増加、タンパク質の機能の増加、またはその両方であり得る。

いくつかの実施形態では、転写因子の少なくとも１つが、細胞内で活性化される。一実施形態では、Ｂｒｎ３Ｂの生物活性が増加する。一実施形態では、Ｓｏｘ４の生物活性が増加する。一実施形態では、Ａｔｏｈ７の生物活性が増加する。一実施形態では、Ｓｏｘ１１の生物活性が増加する。一実施形態では、Ｉｌｓ１の生物活性が増加する。

いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも２つの生物活性が増加する。その２つは、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４、Ｂｒｎ３ＢとＡｔｏ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ１１、Ｂｒｎ３ＢとＩｌｓ１、Ｓｏｘ４とＡｔｏ７、Ｓｏｘ４とＳｏｘ１１、Ｓｏｘ４とＩｌｓ１、Ａｔｏ７とＳｏｘ１１、Ａｔｏ７とＩｌｓ１、またはＳｏｘ１１とＩｌｓ１であり得る。

いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも３つの生物活性が増加する。その３つは、限定するわけではないが、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＡｔｏｈ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＳｏｘ１１、またはＢｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＩｌｓ１であり得る。いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも４つの生物活性が増加する。いくつかの実施形態では、転写因子の５つ全ての生物活性が増加する。

内在性転写因子を活性化する方法および外内性転写因子を導入する方法の例は、上記でより詳細に説明される。前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏであっても、ｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。

組成物および再生／若返り細胞
本明細書に開示の技術の実施を容易にすることができる、薬剤、試薬および組成物も提供される。また、いくつかの実施形態において、本技術によって再生または若返らせたＲＧＣ細胞も提供される。

本開示の一実施形態は、細胞の所望のリプログラミングのために標的細胞に導入することができる核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、核酸構築物は、本明細書に開示される転写因子の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、またはすべてをコードするコード配列を含む。一実施形態では、核酸構築物はＢｒｎ３Ｂのコード配列を含む。一実施形態では、核酸構築物はＳｏｘ４のコード配列を含む。一実施形態では、核酸構築物はＡｔｏｈ７のコード配列を含む。一実施形態では、核酸構築物はＳｏｘ１１のコード配列を含む。一実施形態では、核酸構築物はＩｌｓ１のコード配列を含む。これらの転写因子のタンパク質およびコード配列の例を表１で提供する。

ある実施形態では、核酸構築物は、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４、Ｂｒｎ３ＢとＡｔｏ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ１１、Ｂｒｎ３ＢとＩｌｓ１、Ｓｏｘ４とＡｔｏ７、Ｓｏｘ４とＳｏｘ１１、Ｓｏｘ４とＩｌｓ１、Ａｔｏ７とＳｏｘ１１、Ａｔｏ７とＩｌｓ１、またはＳｏｘ１１とＩｌｓ１であり得る少なくとも二つの転写因子のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物は転写因子のうち少なくとも３つのコード配列を含み、これらは、限定するわけではないが、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＡｔｏ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＳｏｘ１１、またはＢｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＩｌｓ１であり得る。いくつかの実施形態では、核酸構築物は少なくとも４つの転写因子のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、５つ全ての転写因子のコード配列を含む。

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、各コード配列に関連するプロモーターまたはエンハンサーを含む。プロモーターまたはエンハンサーは、網膜介在ニューロン細胞において活性である。非限定的な例は、Ｐａｘ６、Ｔｃｆａｐ２Ｂ、Ｇａｄ１、ＧｌｙＴ１、ＲＢＰＭＳ、およびＰｒｏｘ１のプロモーター、または表２で提供されるプロモーターである。特定の例では、プロモーターはシナプシン１プロモーターである。

いくつかの例では、核酸構築物は発現ベクターを含み、これはプラスミドベクターまたはウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターであり得る。ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２からなる群より選択されてもよい。

一実施形態では、ＡＡＶは血清型ＡＡＶ２のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは血清型ＡＡＶ３のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは血清型ＡＡＶ４のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは血清型ＡＡＶ５のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは血清型ＡＡＶ７のそれである。一実施形態では、ＡＡＶは血清型ＡＡＶ８のそれである。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）表面可変領域ＶＩＩＩ（ＶＲ－ＶＩＩＩ）に１０個のアミノ酸挿入を有し、ＡＡＶ２の抗原性領域の改変と、硝子体内投与後に網膜細胞を効率的に形質導入する能力とをもたらす操作されたカプシドである、ＡＡＶ２．７ｍ８ベクターである（Bennett et al., J Struct Biol, 2020 Feb 1;209(2):107433. doi: 10.1016/j.jsb.2019.107433. Epub 2019 Dec 16）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、８個の異なる野生型天然ウイルスをシャッフルすることにより操作されたＡＡＶ－ＤＪ（２型／８型／９型キメラ）である（Katada Y, et al., 2019. PeerJ 7:e6317）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ７ｍ８ベクターである（Ramachandran et al., Hum Gene Ther. 2017 Feb;28(2):154-167. doi: 10.1089/hum.2016.111. Epub 2016 Oct 17）。

ベクターで遺伝子導入された細胞、および本開示の技術によってリプログラミングされたまたは若返った細胞も提供される。一実施形態では、視覚信号に応答する哺乳類細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、網膜介在ニューロン細胞、または変性した、損傷した、もしくは老化したＲＧＣなどの網膜細胞において、本明細書に開示する１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることによって調製される。別の実施形態において、網膜細胞はミュラー細胞である。さらに別の実施形態では、網膜細胞は、光受容体である。いくつかの実施形態では、リプログラミングされた細胞は、再生された網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。いくつかの実施形態では、リプログラミングされた細胞は、若返った網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。

いくつかの実施形態では、再生または若返ったＲＧＣは、軸索を分散した皮質下脳領域に突出させることができる。いくつかの実施形態では、再生されたまたは若返ったＲＧＣは、網膜－脳の接続を確立することができる。いくつかの実施形態では、再生されたまたは若返ったＲＧＣは視覚刺激に反応し、電気信号を脳内に伝達することができる。

いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞はヒト細胞である。

治療と使用方法
大きく分けて緑内障を含む視神経障害、遺伝性視神経障害、ならびに毒物、栄養不良、および外傷によって引き起こされる障害に分類される疾患群では、ＲＧＣの消失が失明の主要因である。したがって、本技術は、視覚機能障害または視力喪失（失明）の治療に用いることができる。

いくつかの実施形態では、治療または使用は、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ａｔｏｈ７、Ｓｏｘ１１、およびＩｌｓ１などの本明細書に開示される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることができる薬剤を患者に投与すること（例えば、患者の網膜または瞳孔に）を伴う。いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも２つの生物活性が増加する。その２つは、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４、Ｂｒｎ３ＢとＡｔｏ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ１１、Ｂｒｎ３ＢとＩｌｓ１、Ｓｏｘ４とＡｔｏ７、Ｓｏｘ４とＳｏｘ１１、Ｓｏｘ４とＩｌｓ１、Ａｔｏ７とＳｏｘ１１、Ａｔｏ７とＩｌｓ１、またはＳｏｘ１１とＩｌｓ１であり得る。いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも３つの生物活性が増加する。その３つは、限定するわけではないが、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＡｔｏｈ７、Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＳｏｘ１１、またはＢｒｎ３ＢとＳｏｘ４とＩｌｓ１であり得る。いくつかの実施形態では、転写因子のうち少なくとも４つの生物活性が増加する。いくつかの実施形態では、転写因子の５つ全ての生物活性が増加する。

対応する内在性転写因子の１つまたは複数にプロモーターやエンハンサーを導入する核酸構築物（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム）、転写因子の１つまたは複数をコードする核酸構築物、および転写因子の発現タンパク質などの薬剤の例を前述した。

投与は、局所適用、眼科的適用、または硝子体内注射であってよく、特に限定されない。

いくつかの実施形態では、薬剤は、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターを含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、投与されるＡＡＶベクターまたは医薬組成物は、１×１０^６～１×１０^２０ゲノムコピー（ｇｃ）／ｋｇ、または１×１０^７～１×１０^２０、または１×１０^８～１×１０^２０、または１×１０^８～１×１０^１９、または１×１０^９～１×１０^１９、または１×１０^９～１×１０^１８、または１×１０^１０～１×１０^１８、または１×１０^１１～１×１０^１７、または１×１０^１２～１×１０^１７、または１×１０^１３～１×１０^１６、２×１０^１３～２×１０^１５、８×１０^１３～６×１０^１４ｇｃ／対象体重ｋｇであり得る。投与量の値は、緩和されるべき状態の重症度によって変わり得ることに留意されたい。任意の特定の対象に対し、具体的な投与レジメンは、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って経時的に調整され得る。本明細書に記載の投与量範囲は例示であり、医療従事者によって選択され得る投与量範囲を限定するものではない。

いくつかの実施形態では、治療は、本明細書に開示されるリプログラミングされた網膜細胞（例えば、再生ＲＰＣ）を患者の眼に移植することを伴い、ここで、網膜細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでリプログラミングされる。

実施例１．網膜介在ニューロン細胞のリプログラミング
本例は、他の網膜ニューロンが網膜神経節細胞の再生のための内在性細胞源として使用できることを示す。ＲＧＣ分化に重要な転写因子の異所性発現により、アマクリンおよび置換されたアマクリン介在ニューロンをＲＧＣにリプログラミングすることが可能である。再生されたＲＧＣは、軸索を脳の皮質下領域へ突出させる。それは、通常の状態下でも眼圧の上昇によりオリジナルのＲＧＣが損傷している緑内障の動物モデルでも、視覚刺激に反応し電気信号を脳に伝達することができる。

方法
マウスおよび飼育。Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}ノックインマウス系統、Ｐｖａｌｂ^{ＣｒｅＥＲＴ２}ノックインマウス系統、Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウス系統を、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２マウス}およびＰｖａｌｂ^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウスをＲｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスと交配し、それぞれＬｇｒ^{５ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスおよびＰｖａｌｂ^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを作製した。

Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウス系統を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いた相同組換えにより作製した。簡単に述べると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＣａｓ９ ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびドナーベクタープラスミドを混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵の前核に注入した。ドナーベクタープラスミドは、ＣｒｅＥＲＴ２のコード領域とそれに続くＰｏｌｙＡ配列をＰｒｏｋｒ２座位のＡＴＧ開始コドンに挿入するように設計した。注入した接合子は３．５日目までに胚盤胞期まで培養し、その後、偽妊娠させたメスの子宮に移植した。正しくゲノム標的したＦ０マウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配して、Ｆ１ Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウスを作製した。Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウスをＲｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスと交配して、Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを作製した。Ｐｒｏｋｒ２の翻訳開始部位周辺のＤＮＡ配列は、以下の通りである：

翻訳開始部位は太字で、使用したｓｇＲＮＡの標的配列は下線で強調してある。ドナーベクタープラスミドは、５’４ｋｂ－相同性アーム、ＣｒｅＥＲＴ２－ｐｏｌｙＡカセット、および３’４ｋｂ－相同性アームを含み、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニング法で構築されたものである。

すべてのマウスは、１２時間明／１２時間暗のサイクルの動物施設に収容した。動物実験は８－１２ヶ月齢のオスとメスマウスの両方で行い、すべての動物実験手順は上海理工大学の動物愛護使用委員会の承認を得た。

ＡＡＶベクターの構築と作製。マウスＡｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１、Ｉｌｓ１およびＥＧＦＰのコード配列を、オリジナルのＡｒｃｈ－ＧＦＰ配列に代えて、ＣＡＧ駆動型Ｃｒｅ依存性発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃２２２２２）にサブクローニングした。単一のＡＡＶベクターから転写因子とＥＧＦＰを共発現させるために、Ｐ２Ａフラグメントを二つのコード配列の間に配置した。

ＡＡＶウイルス粒子作製のため、ＰＥＩを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、ｐＡＡＶ７ｍ８血清型プラスミド、およびｐＨｅｌｐｅｒプラスミドを遺伝子導入した。細胞は４８－７２時間後に回収した。ウイルス粒子はイオジキサノール密度勾配遠心で精製し、ｑＰＣＲで滴定した。

ＡＡＶの硝子体内注射。マウスにケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の混合物をＩＰ注射して麻酔し、フェニルフェリン塩酸塩点眼液（２．５％）の局所投与により瞳孔を拡張した。０．５％プロパラカイン塩酸塩点眼液で短時間の局所麻酔を行った後、角膜を穿刺して眼圧を下げ、３４ゲージ針でＡＡＶウイルス粒子１．５ｕＬを硝子体腔に注射した。ＡＡＶ混合物の注射の場合、まず各ＡＡＶを１ｘ１０^１２粒子／ｍＬに希釈してから混合した。

緑内障モデル。臨床における急性閉塞隅角緑内障を模倣した眼圧上昇（ＩＰＩ）誘発虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）モデルを用いて、マウスのＲＧＣを損傷させた。既報のプロトコルに若干の修正を加え、マウスの前眼房を針で環状にし、その針を、高く置いた生理食塩水（０．１％ヘパリン入り）リザーバーにチューブを介して接続した。生理食塩水リザーバーの高さを眼球の１５０ｃｍ上まで上げ、網膜内側の血流を停止させた（虚血）。６０分後に針を抜いて循環を回復させた（再灌流）。このプロトコルにより、すべてのＲＧＣ軸索が変性し、他の網膜ニューロンが死滅する。他の網膜ニューロンのアポトーシスを防ぐために、ロック阻害剤リパスジル塩酸塩二水和物の溶液（ＰＢＳ中０．４％）を１日１回マウスの眼球表面に投与した。

免疫組織化学とイメージング。生理食塩水（ｄｄＨ２Ｏ中０．９％ＮａＣｌ）で経心的に灌流し、その後４％ＰＦＡを用いた後、マウスの眼、視神経および脳を採取し、４％ＰＦＡで２４時間ポストフィックスを行った。眼と脳組織は、細胞保護のために３０％スクロースに入れ、ミクロトームクリオスタットを用いてそれぞれ１０μｍと３０μｍの厚さで切片化した。免疫組織化学染色を標準的なプロトコルに従って行った。以下の抗体を使用した：ＲＧＣを標識するためのウサギ抗ＲＢＰＭＳ（Ａｂｃａｍ，１：４００）、ＲＧＣを標識するためのマウス抗Ｂｒｎ３Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：２００）、α－ＲＧＣを標識するためのウサギ抗ＳＭＩ－３２（Ａｂｃａｍ，１：４００）、ｉｐＲＧＣを標的するためのウサギ抗メラノプシン（Ａｂｃａｍ，１：５００）、オン－オフＣＡＲＴを標識するためのウサギ抗ＣＡＲＴ（コカインおよびアンフェタミン制御転写物）（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ、１：２５００）、ならびにシナプス後細胞膜を標識するためのマウス抗ＰＳＤ９５（Ａｂｃａｍ、１：４００）。二次検出には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ロバ抗ウサギ（ＩＦＫｉｎｅ(商標)，１：４００）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ロバ抗マウス（ＩＦＫｉｎｅ(商標)，１：４００）、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ウサギ（Ａｂｃａｍ，１：４００）を使用した。免疫染色した組織切片は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡、Ｎｉｋｏｎスピニングディスク（ＣＳＵ Ｗ１ Ｓｏｒａ）共焦点顕微鏡、またはＳＴＥＤ ＳＰ８顕微鏡で画像化した。

Ｉｎ ｖｉｖｏカルシウムイメージング。手術のためにマウスをウレタンで麻酔し（１．５ｇ／ｋｇ）、眼球を眼軟膏で覆って定位脳装置に置いた。特注のチタン製ヘッドプレートを、黒色歯科用セメント（光を遮断するためにＦｅ_３Ｏ_４を加えた）を用いて、マウスの長軸と平行に人字縫合のほぼ中央にある頭蓋骨に接着させた。後内側ＳＣと下丘の上に３ｍｍの開頭を行い、直径３ｍｍのカバーガラスを硬膜に軽く押し付け、開頭を黒色歯科用セメントで密封した。二光子機能イメージング中の視覚刺激による光の汚染を避けるため、ヘッドプレートに遮光布を取り付けた。

視覚刺激はＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）の関数Ｐｓｙｃｈｔｏｏｌｂｏｘを用いて生成し、対側眼から１５ｃｍのところにある補正済み１７’ＬＣＤモニター（Ｄｅｌｌ、１２８０×１０２４ピクセル、リフレッシュレート７５Ｈｚ）上に表示した。刺激は灰色の均一な背景上に提示された、フルスクリーンの正弦波ドリフトグレーティングであった（空間周波数：０．０５サイクル／°、時間周波数：２Ｈｚ）。グレーティングは、１秒間の継続と１－２秒間の刺激間隔で５回繰り返して提示した。刺激は、４５°の一定間隔で４つの方位に対して直交する８方向にドリフトさせた。

軸索末端からの蛍光の二光子イメージングを、モードロックＴｉ：Ｓａレーザー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ ＶＩＳＩＯＮ－Ｓ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）と結合させた特注のＬｏｔｏｓＳｃａｎ顕微鏡（ＬｏｔｏｓＳｃａｎ、Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてモニターした。励起波長は９２０ｎｍに固定した。イメージングは４０Ｘ、０．８ＮＡ対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ）を用いて行った。ビームサイズは４０Ｘ対物レンズの後部開口を満たす大きさであった。画像は５０Ｈｚのフレームレートで取得した（４８０ｘ２４０ピクセル、０．２２５μｍ／ピクセル）。

画像を、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）およびＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて解析した。画像データの横方向の動きを補正するために、Ｔｕｒｂｏｒｅｇソフトウェア（ＩｍａｇｅＪプラグイン）を使用して、形状保存変換に基づくフレームごとのアライメントを適用した。末端は、サイズ、形状、および輝度に基づいて手作業で同定した。各フレームにおいて末端マスク内の画素強度値を平均することにより、個々の末端の時間経過を抽出した。イメージング中に脳脈動が明らかな場合は、これらのデータは使用しなかった。ニューロピルの信号は、以前に報告された方法^４０を用いることにより減算した。この補正の後、各刺激提示に対する反応（Ｆｔ）を、刺激開始直前の０．２秒間の反応（Ｆ０）で正規化した。各刺激について、すべての刺激条件と試行に対する反応を平均することにより、平均蛍光変化量（ΔＦ／Ｆ）を算出した。視覚的に反応する細胞を、ブランク期間と刺激提示期間にわたるＡＮＯＶＡによって定義した（Ｐ＜０．０５）。

Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンのホールセルパッチクランプ記録。マウスを２時間以上暗順応させてから安楽死させた。次に網膜の切開を、ＮａＣｌ１２６ｍＭ、ＮａＨ_２ＰＯ_４１．２５ｍＭ、ＫＣｌ２．５ｍＭ、ＣａＣｌ_２２ｍＭ、ＭｇＣｌ_２２ｍＭ、グルコース１０ｍＭおよびＮａＨＣＯ_３２６ｍＭを含む人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中で赤外光下で行った。網膜切片を、剃刀を用いて手作業で切断し、その後ろ紙片に貼り付けて、顕微鏡のステージ上の記録室に移し、酸素添加（９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２）したＡＣＳＦで灌流した。ＩＮＬ中のＬｇｒ５－ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞を、二光子顕微鏡を用いて同定し、赤外光下でホールセルパッチクランプ記録用に標的した。ピペット（４－７ＭΩ）に、電圧クランプ記録用のＣｓ－メタンスルホネート１２０ｍＭ、ＮａＣｌ５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ＥＧＴＡ５ｍＭ、ＱＸ３１４ ５ｍＭ、ＣａＣｌ_２０．５ｍＭ、ＡＴＰ４ｍＭ、ＧＴＰ０．５ｍＭ、または電流クランプ記録用のＫ－グルコネート１２３ｍＭ、ＫＣｌ１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ＥＧＴＡ２ｍＭ、ＣａＣｌ_２１ｍＭ、ＭｇＣｌ_２１ｍＭ、ＡＴＰ４ｍＭ、ＧＴＰ０．５ｍＭを含む細胞内溶液を充填した。上記で使用した試薬はすべてＳｉｇｍａ社より得た。記録された細胞の形態を可視化するために、Ａｌｅｘａ４８８ヒドラジド（０．２ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を細胞内溶液に加えた。信号をＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ａ増幅器とｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェアスイート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて取得し処理した。信号を１ｋＨｚでフィルタリングし、１０ｋＨｚでサンプリングした（Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。ＥＰＳＣをＣｌ^－の逆転電位（－６７ｍＶ）で記録し、ＩＰＳＣを０ｍＶで記録した。記録用コンピュータで制御された白色ＬＥＤライトを使用して、全視野光刺激を与えた。

ＳＣニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏホールセルパッチクランプ記録。深く麻酔したマウスに、塩化コリン９２ｍＭ、ＫＣｌ２．５ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ３０ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ０．５ｍＭ、グルコース２５ｍＭ、Ｎａ－アスコルベート５ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム３ｍＭ、およびチオウレア２ｍＭを含む氷冷酸素添加（９５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２）切断液を経心的に循環させた。切断液のｐＨ値は濃縮ＨＣｌを加えることにより７．３－７．４に調整し、浸透圧は３１０－３１５ｍＯｓｍに調整した。頭蓋骨から取り出した後、ＳＣ領域を含む脳組織を振動刃ミクロトーム（ＶＴ１２００ Ｓ、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、切断液内で３００μｍの冠状切片に切断した。次に、切片を同じ切断液中で、３１－３２℃で１５分間インキュベートした後、室温の酸素添加保持液（ＮａＣｌ９２ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ３０ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２５ｍＭ、ＫＣｌ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ ２ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２ｍＭおよびグルコース２５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ、Ｎａ－アスコルベート５ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム３ｍＭ、およびチオウレア２ｍＭ、ｐＨ値７．３－７．４およびモル浸透圧濃度値３１０－３１５ｍＯｓｍ）を含む保持室に移した。１時間保存後、切片を室温の酸素添加した記録液（ＮａＣｌ１１９ｍＭ、ＮａＨＣＯ３ ２４ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４ １．２５ｍＭ、ＫＣｌ２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ ２ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２ｍＭ、およびグルコース１２．５ｍＭ）を含む記録室に移した。ＳＣ領域を含む３～５枚の切片が、典型的には、１匹の動物から作製された。記録は中央ＳＣ領域を含む脳切片からとった。

シナプス反応のホールセルパッチクランプ記録を、Ｋ－グルコン酸１２５ｍＭ、ＫＣｌ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ０．５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ１０ｍＭ、Ｐ－クレアチン１０ｍＭ、ＡＴＰ－Ｍｇ４ｍＭ、およびＧＴＰ０．３ｍＭ（ｐＨ７．３）の内部溶液を入れた２－４ＭΩガラスピペットで行った。青色刺激光を４７０ｎｍ ＬＥＤ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，３５ｍＷ／ｍｍ^２）で生成し、４０Ｘ対物レンズ（ＯＬＹＭＰＵＳ）を通して照射した。５ｍｓの刺激持続時間で、記録されたシナプス後応答を飽和させることができることがわかった。ニューロンの入力抵抗は１－５ＧΩの範囲であり、直列抵抗は２０ＭΩ以下であった。記録は以下のプロトコルで行った：膜電位をまず－７０ｍＶに保持して、光によって誘発されたＡＭＰＡ受容体を介したシナプス電流を記録した（この保持電位ではＮＭＤＡ受容体はおそらくマグネシウムによってブロックされていた）。次に膜保持電位を＋５５ｍＶに切り替えて、ＡＭＰＡとＮＭＤＡ受容体が介在する電流の混合を記録した。この条件下で、次にＡＭＰＡ受容体アンタゴニストＣＮＱＸ（１０ｍＭ）を記録液に加えて、ＡＭＰＡ受容体を介したシナプス電流を遮断し、ＮＭＤＡ受容体を介するＥＰＳを検出できるようにした。次に、記録を電流クランプモードに切り替えて活動電位を検出した。ＡＭＰＡ受容体アンタゴニストＣＮＱＸ（Ｔｏｃｒｉｓ）およびＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＤ－ＡＰＶ（Ｔｏｃｒｉｓ）の適用を、それぞれの薬物を浸漬記録液に加えることにより行った。記録はすべてＡｘｏｎ７００Ｂ増幅器で行い，Ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０ ａｎａｌｏｇ－ｔｏ－ｄｉｇｉｔａｌボードでデジタル化した．刺激とデータ取得はｐＣｌａｍｐソフトウェアで行い，５０ｋＨｚでデジタル化した．すべての装置とソフトウェアはＡｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）より得た。

統計。２群間の差を、両側スチューデントのｔ検定を用いて比較した。

結果
Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンのＲＧＣへのｉｎ ｖｉｖｏでのリプログラミング。まず、Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス系統を用いて、ＲＧＣがアマクリン介在ニューロンから再生され得るか否かを検証した。Ｌｇｒ５は、内顆粒層の硝子体側に位置する網膜細胞のサブセットで発現している（図１のａ）。このＬｇｒ５^＋細胞は、アマクリン介在ニューロンの典型的な形態を示すだけでなく（図１のａ－ｃおよび７のａ－ｄ）、光刺激に反応する活発なシナプス結合も有する（図１のｅ、ｆ）。それらは、標的パッチクランプ記録によって明らかにされたように、興奮性および抑制性シナプス後電流（ＥＰＳＣおよびＩＰＳＣ）の両方を受け取り、それらによって脱分極または過分極され得（図１のｅ、ｆ）、それらが実際に成熟アマクリン介在ニューロンであることを示唆した。しかし、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンをｔｄＴｏｍａｔｏレポーターで標識し、成体マウスで系譜追跡すると、数ヶ月後に検出できたｔｄＴｏｍａｔｏ^＋双極細胞および水平細胞（一部のＬｇｒ５^＋アマクリン細胞がＬｇｒ５発現を停止して他の網膜系譜に分化転換することを示す）は非常に少数であり（任意の時点で網膜あたり１細胞未満）（図１のｂ、ｃ）、再生能が限られていることを示した。マウスの加齢に伴い、網膜神経節細胞層において少数のＬｇｒ５^＋アマクリン細胞が検出できたが、これはそれらが内顆粒層から網膜神経節層へ移動する能力がある可能性を示唆した（図１のｄおよび図７のｅ－ｇ）。網膜神経節細胞層内のＬｇｒ５^＋細胞の数は年齢とともに増加し（図７のｈ）、これらの細胞の一部はＬｇｒ５発現を停止するが、ＲＧＣになることはない。

Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンがＲＧＣにリプログラミングされ得るか否かを調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏでの系譜追跡とリプログラミング戦略を考案した（図２のａ）。まず、Ｌｇｒ５^＋アマクリンニューロンをＲｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターで標識し、次に、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介して送達されるＣｒｅ依存性の二重ｌｏｘＰ導入（ｄｏｕｂｌｅ－ｆｌｏｘｅｄ）逆方向オープンリーディングフレーム（ＤＩＯ）発現系を用いて、これらの細胞でＲＧＣ運命決定に必須の遺伝子を特異的に異所的に発現させた（図２のｂ）。Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞からのＲＧＣの生成について、フラットマウント網膜サンプル中のＲＧＣの形態を持つｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞の存在と、後の時点における視神経のｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索の存在を調べることにより解析した。

フラットマウント網膜サンプルではｔｄＴｏｍａｔｏ^＋ＲＧＣ細胞を観察することができず、ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰを硝子体内注射した対照マウスの視神経ではｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索を観察することができなかった（図２のｃおよび８のａ－ｅ）。しかしながら、ＲＧＣの運命決定に重要な遺伝子群（Ａｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１およびＩｓｌ１）を発現するＡＡＶを注射したマウスの網膜サンプルでは、ＲＧＣの形態を有するｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞が検出され得た。遺伝子発現を誘導してから６週間後、網膜サンプルにおいてＲＧＣの形態を持つｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞が観察された（図２のｄ－ｆ）。これらの細胞は、軸索様突起を視神経乳頭に向かって突出させ、視神経内に伸ばしていた（図３のａ）。その細胞体は網膜神経節細胞層に位置し、ＲＧＣ特異的マーカーＲＢＰＭＳおよびＢｒｎ３Ａで染色することができた（図２のｇ、ｈ）。したがって、これらの細胞は新しく発生したＲＧＣと考えることができる可能性がある。

平均して、ウイルス注射から６週間後に網膜あたり約１８０個の新しいＲＧＣが再生された（図２のｃ）。この数は、ｉｎ ｖｉｖｏでのリプログラミングを開始したときに網膜神経節層に存在したＬｇｒ５^＋アマクリン細胞の数（２－３ヶ月齢のマウスの網膜神経節細胞層で約１０－１５個）（図７のｈ）よりはるかに多い。この結果は、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞におけるＲＧＣ運命決定因子の異所性発現が、これらの細胞の一部を内顆粒層から神経節細胞層へ遊走させる引き金となり得ることを示唆している。この考えを支持するものとして、Ｌｇｒ５－ＥＧＦＰ発現レベルのより低いｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞が内網状層で検出された（図８のｆ－ｈ）。

単一の転写因子とそれらの組み合わせのリプログラミング活性を調べたところ、単一の転写因子（Ｂｒｎ３ＢまたはＳｏｘ４）でもＬｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンのＲＧＣへのリプログラミングが可能であるが、その効率は非常に低いことがわかった（図２のｃ）。Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４の組み合わせは、リプログラミング活性を劇的に相乗させた。Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４の組み合わせにＡｔｏｈ７を加えても、さらにリプログラミング効率はあまり改善されなかった（図２のｃ）。従って、特に断らない限り、残りの実験にはＢｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４の組み合わせを用いた。

ＲＧＣは網膜ニューロンの異種で、異なるサブタイプに分類され得る。サブタイプ特異的抗体を用いた免疫組織学的解析を行ったところ、抗ＣＡＲＴ（オンオフ方向選択性神経節細胞用）および抗ＳＭＩ－３２（α神経節細胞用）により再生ＲＧＣを識別することができるが（図２のｉおよび８のｉ－l）、メラノプシン発現内在性感光性神経節細胞は検出されないことが分かった。まとめると、これらの結果は、特定の転写因子の異所性発現により、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンのＲＧＣへのリプログラミングが可能であり、再生されたＲＧＣはサブタイプ特異的であることを示唆するものである。

再生ＲＧＣの脳の視覚核への軸索の突出。再生ＲＧＣが脳内で適切に再接続できるか否かを調べるために、向網膜経路に沿った再生ＲＧＣの軸索と、脳の主要な網膜受容領域へのその突出を調べた。ウイルス注射から６週間後、再生ＲＧＣの軸索の多くは視神経全体を縦断し、視交叉を経て、背側および外側腹側膝状核（ｄＬＧＮおよびｖＬＧＮ）、視蓋前野、および上丘（ＳＣ）を含む脳の視覚核に進入した（図３）。再生ＲＧＣ軸索の視覚経路とは無関係な脳領域への異常な突出は観察されなかった。網膜受容領域内では、再生ＲＧＣの軸索分枝に沿ってミクロンサイズの結節状構造が観察される。この結節状構造はシナプス後密度タンパク質ＰＳＤ－９５の染色と密接に関連しており（図３のｇ－ｉ）、仮想シナプス前終末ボタンであることを示唆する。

再生ＲＧＣの軸索の脳の３つの重要な視覚部位、視交叉（ＯＣ）、ＬＧＮ、およびＳＣへの突出の時間経過を、ウイルス注射後の脳切片で、再生ＲＧＣ軸索がこれらの部位で最初に検出された時期を解析することにより求めた。その結果、ＲＧＣ軸索がＯＣに到達するまでには約１８日、ＬＧＮに到達するまでには２８日、最も遠くの視覚標的ＳＣに到達するまでには３５日かかることがわかった（図９）。まとめると、これらのデータは、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロン由来のＲＧＣが、軸索を脳の適切な領域に突出させ、網膜－脳の接続を確立できることを実証している。

Ｐｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン介在ニューロンのＲＧＣへのリプログラミング。他の網膜ニューロンもＲＧＣにリプログラミングすることが可能か否かを考えた。アマクリン介在ニューロンはＲＧＣ層に位置するため、ＲＧＣ置換のためのより良好な細胞源となる可能性がある。このニューロンサブタイプがＲＧＣにリプログラミングされ得るか否かを試験するために、Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}ノックインマウス系統を作製した（図１０のａ、ｂ）。Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}マウスは、タモキシフェン誘導性ＣｒｅＥＲＴ２リコンビナーゼを、置換アマクリン介在ニューロンのサブグループで発現するＰｒｏｋｒ２遺伝子の内在性転写制御下で発現させる。予想通り、タモキシフェンで処理した成体Ｐｒｏｋｒ２^{ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスでは、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞が網膜神経節細胞層に位置する。それらは視覚突起を持たず、ＲＧＣマーカーＲＢＰＭＳを発現しない（図４のａ、ｂおよび図１０のｃ－ｅ）。

Ｐｒｏｋｒ２は、網膜で発現することに加え、視神経や脳の細胞でも発現する（図１０のｆ－ｈ）。このため、Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを使用して再生ＲＧＣの軸索を追跡することができなかった。この障害を克服するために、プログラミング中にＥＧＦＰを転写因子と共発現させることによって、再生ＲＧＣを標識した（図１０のｋ）。転写因子の２つの組み合わせ（Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４およびＡｔｏｈ７＋Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４）を用いてリプログラミングを行ったところ、いずれの組み合わせでもＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン介在ニューロンをＲＧＣに効率的にリプログラミングできることがわかった（図４のｃ、ｄ）。しかし、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンの場合とは異なり、Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４の組み合わせにＡｔｏｈ７を含めると、リプログラミング効率が劇的に向上した（図１０のｌ）。Ｐｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン介在ニューロン由来のＲＧＣは、視神経および様々な脳の視覚標的に軸索突起を伸ばした（図４のｅ－ｋ）。このように、これらの結果により、ｉｎ ｖｉｖｏで複数の網膜ニューロンサブタイプをリプログラミングすることにより、ＲＧＣを再生できることが実証された。

再生ＲＧＣによる視覚情報の脳への伝達。再生ＲＧＣが視覚刺激に反応し、脳の下流標的に視覚情報を伝達できるか否かを調べるため、ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＧＣａｍｐ６ｆをリプログラミングカクテルに加えることにより、Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}マウスにおいて再生ＲＧＣをカルシウム指標ＧＣａｍｐ６ｆで標識した。次に、ウイルス注射から６週間後に麻酔したマウスのＳＣを露出させ、ｉｎ ｖｉｖｏ機能性カルシウムイメージングを用いて、再生ＲＧＣ軸索末端の視覚誘発カルシウムダイナミクスを測定した（図１１のａ）。

マウスにドリフトグレーティングを提示すると、ＳＣの軸索分枝に沿った個々のＲＧＣの終末ボタンが、刺激誘発カルシウムシグナルを示し（図１１のｂ）、再生ＲＧＣが視覚刺激に反応し、視覚信号を脳に伝えることができることを示した。視覚に反応する終末ボタンは、その反応パターンに基づいて異なるカテゴリーに分類することができた。終末ボタンは刺激のオンとオフだけでなく、ドリフトグレーティングの方位および方向に対しても異なる反応をした（図５のａ－ｄおよび１１のｃ、ｄ）。まとめると、これらのデータは、再生ＲＧＣが視覚情報を脳に伝えることができ、ｉｎ ｖｉｖｏのリプログラミングによって機能的に異なるＲＧＣサブタイプを生成できることを示唆している。

再生ＲＧＣによる、シナプス後ニューロンとの機能的なシナプス結合の確立。再生ＲＧＣが脳内のシナプス後ニューロンに神経信号を伝達できるか否かを調べるために、Ｌｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの再生ＲＧＣにチャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）を発現させ、ホールセルパッチ記録を用いてウイルス注射８－１０週後の脳切片におけるＳＣニューロンの光誘発シナプス後応答を検出した。

再生ＲＧＣの軸索末端を光で刺激すると、ＳＣニューロンでＡＭＰＡ受容体媒介興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）が検出された。単一の光インパルスが複数のピークを持つＡＭＰＡ受容体媒介ＥＰＳＣを誘発し（図５のｅ、ｈおよびｉ）、再生ＲＧＣの軸索がＳＣニューロンと、活性化されたＡＭＰＡグルタミン酸作動性受容体を持つ多入力シナプスを形成したことを示唆した。また、光刺激後のシナプス後ＳＣニューロンでは、ＮＭＤＡ受容体媒介ＥＰＳＣと活動電位が検出された（図５のｆ、ｇ、ｊ）。さらに、再生されたＣｈＲ２発現ＲＧＣに対するＳＣニューロンの応答は、ＣｈＲ２を発現する通常のＲＧＣの応答と同等である（図１１のｅ、ｆ）。まとめると、これらの結果から、光刺激に反応して、再生ＲＧＣ軸索末端は神経伝達物質としてグルタミン酸を放出し、ＳＣニューロンとの機能的なシナプス結合を確立することが示唆された。

緑内障モデルマウスでの機能的ＲＧＣの再生。次に、再生ＲＧＣが病状下で視覚回路を修復できるか否かを調べた。特に、オリジナルのＲＧＣとその軸索が変性した場合でも、再生ＲＧＣが軸索を脳の適切な標的に送り、網膜－脳の接続を再構築できるか否かを判断することに興味があった。

眼圧上昇誘発緑内障モデルを用いてＲＧＣとその軸索に損傷を与え、視神経内のすべてのＲＧＣ軸索の変性と網膜内のＲＧＣ細胞体の著しい消失を引き起こし得る条件を最適化した（図１２のａ－ｅ）。しかし、この損傷条件では、眼圧上昇から７日後にＬｇｒ５^＋アマクリン細胞も劇的に消失させた（図６のｂ）。そのため、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞を保護できる試薬を探したところ、Ｒｏｃｋ阻害剤リパスジルがＬｇｒ５^＋アマクリン細胞を効率的に保存できることを発見した（図６のｃ）。

ニューロン保護とｉｎ ｖｉｖｏでのリプログラミングを組み合わせたプロトコルを考案して、新たに生成したＲＧＣがＬｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの損傷した視覚回路を修復できるか否かをテストした（図１２のｆ）。タモキシフェン投与を受けたＬｇｒ５^{ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＣｒｅＥＲＴ２}；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの両目を損傷させて、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞をｔｄＴｏｍａｔｏレポーターで標識した。損傷後、両目をリパスジルで１日１回治療し、７日後に左目には対照としてＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰを注射し、右目にはＢｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、およびＡｔｏ７などの転写因子を発現するＡＡＶの組み合わせを注射して、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンのリプログラミングを行った。ウイルス注射から６週間後、マウスを解析のために殺処分した。ＡＡＶ－ＤＩＯ－ＥＧＦＰを注射した左眼では、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋ＲＧＣ軸索が左視神経に検出されなかったので、ＲＧＣは再生されなかった（図６のｅ）。一方、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４およびＡｔｏｈ７の過剰発現により、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞がＲＧＣにリプログラミングされ、再生ＲＧＣは、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索を視神経および反対側の様々な脳の視覚標的に突出させた（図６のｆ－ｋ）。

再生ＲＧＣは、病状下で、シナプス後脳ニューロンとの機能的なシナプス結合を確立した。光によって誘発されるシナプス後反応は、脳切片上のＳＣニューロンで検出され、ここではすべてのＲＧＣ軸索末端が、オリジナルのＲＧＣが損傷した後に再生されたＲＧＣからのものだった（図６ｌ－ｎ）。まとめると、これらの結果は、再生ＲＧＣが病状下でも網膜と脳を再び接続し、シナプス後ニューロンに視覚情報を伝達できることを実証している。

これらの結果は、成体哺乳類において、完全に分化した網膜介在ニューロンのｉｎ ｖｉｖｏリプログラミングにより、機能的なＲＧＣを生成できることを実証している。必須転写因子の異所性発現により、アマクリンおよび置換アマクリン介在ニューロンの両方を正確にＲＧＣにリプログラミングすることができ、新たに生成したＲＧＣは視覚回路に統合され、視覚情報を脳に伝達することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでのニューロンの同一性リプログラミングは中枢神経系（ＣＮＳ）の他の領域でも達成されているが、ニューロンのサブタイプ間での変換の成功は生後１週間に限られ、また成体マウスでは化学物質のバルプロ酸が存在する場合に限定的に成功するのみであった。一方、本例では、化学的な刺激がなくても、網膜ニューロンの同一性スイッチングは成体でも可能であり、リプログラミングの成功は、内顆粒層からＲＧＣ層へのアマクリン介在ニューロンの遊走さえ誘発することが示された。これらの結果は、ニューロンが驚くほど予想外の同一性の柔軟性を示すことを示唆しており、このことは再生目的のために利用できる可能性がある。

Ｂｒｎ３ＢとＳｏｘ４の組み合わせは、Ｌｇｒ５^＋アマクリン介在ニューロンとＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン介在ニューロンの両方をＲＧＣに効率的にリプログラミングし、ＲＧＣ運命決定にこれら二つの転写因子が十分であることを示した。Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４の組み合わせにＡｔｏｈ７を含めると、Ｌｇｒ５^＋アマクリン細胞のリプログラミングは改善されないが、Ｐｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞からＲＧＣを再生する効率は著しく改善された。このことは、直接的な細胞系譜のリプログラミングが、ソース細胞の内在的な性質に影響されることを示唆している。

再生ＲＧＣは、オリジナルＲＧＣと軸索が損傷した動物でも、軸索を様々な脳の視覚野に長距離突出させることにより網膜と脳を接続する。この発見から、成体哺乳類の視覚系に、神経回路を再接続する優れた能力が維持されていることが明らかになった。

実施例２．変性したＲＧＣの若返り
本例は、変性したＲＧＣも転写因子によって再活性化され、再び機能的な軸索を成長させることができることを示す。

本例では、ＰＶ－ＣｒｅＥＲＴ２；Ｒｏｓａ２６－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおいて、眼圧の上昇を利用して網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のアポトーシスを誘発し、その軸索を変性させた。この動物モデルでは、残存したＲＧＣに３つの転写因子（Ａｔｏｈ７＋Ｂｒｎ３Ｂ＋Ｓｏｘ４）を発現させると、これらの細胞が刺激されて軸索が再成長（再生）した（図１３）。また、重要なことに、再生ＲＧＣの軸索が視神経に突出し、脳の視覚野に到達した（図１４）。

したがって、この結果は、転写因子の組み合わせは、介在ニューロン細胞を再生ＲＧＣにリプログラミングできるだけでなく、変性した、損傷した、傷害された、または老化したＲＧＣを若返らせることもできることを実証するものである。したがって、これらの転写因子を視覚の修復、回復、または改善を望む対象に投与すると、介在ニューロンとＲＧＣの両方に協調して作用して、所望の治療効果を得ることができる。

本開示について、開示の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、上記に詳述された具体例および研究は、本開示の例示に過ぎないことを容易に理解しよう。本開示の趣旨から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることを理解されたい。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (39)

1. 視覚信号に応答する哺乳類細胞を調製する方法であって、網膜ニューロン細胞において、以下の：
   ＰＯＵクラス４ホメオボックス２（Ｂｒｎ３Ｂ）
   ＳＲＹボックス転写因子４（Ｓｏｘ４）
   アトナールＢＨＬＨ転写因子７（Ａｔｏｈ７）、
   ＳＲＹボックス転写因子１１（Ｓｏｘ１１）、および
   ＩＳＬ ＬＩＭホメオボックス１（Ｉｌｓ１）
   からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることを含む、方法。
2. 前記１つまたは複数の遺伝子はＢｒｎ３ＢとＳｏｘ４とを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記１つまたは複数の遺伝子はさらにＡｔｏｈ７を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記網膜ニューロン細胞は、アマクリン細胞、水平細胞、および双極細胞からなる群より選択される網膜介在ニューロン細胞であるか、または変性した、損傷した、もしくは老化した網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記網膜ニューロン細胞はＬｇｒ５^＋アマクリン細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記網膜ニューロン細胞はＰｒｏｋｒ２^＋置換アマクリン細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
7. 網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の機能を改善する方法であって、前記ＲＧＣにおいて、Ａｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１およびＩｌｓ１からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることを含む、方法。
8. 前記ＲＧＣは、変性した、損傷した、老化した、または正常な網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である、請求項７に記載の方法。
9. 前記１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることは、該遺伝子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを前記網膜ニューロン細胞へ導入することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記１つまたは複数のポリヌクレオチドはｃＤＮＡである、請求項９に記載の方法。
11. 前記１つまたは複数のポリヌクレオチドはプラスミドまたはウイルスベクターにおいて提供される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記１つまたは複数のポリヌクレオチドはｍＲＮＡである、請求項９に記載の方法。
14. 前記遺伝子の生物活性を増加させることは、対応するタンパク質を前記網膜ニューロン細胞に導入することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記遺伝子の生物活性を増加させることは、前記網膜ニューロン細胞における内在性遺伝子の発現を活性化することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記網膜ニューロン細胞は、視覚機能障害を有する対象においてｉｎ ｖｉｖｏである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記網膜ニューロン細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
18. 視覚信号に応答する調製された哺乳類細胞を、視覚機能障害を有する対象に移植することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 視覚機能障害または失明を治療する薬の調製のための、Ａｔｏｈ７、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ｓｏｘ１１およびＩｌｓ１からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることが可能な薬剤の使用。
20. Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ａｔｏｈ７、Ｓｏｘ１１、およびＩｌｓ１からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることができる薬剤を対象の網膜に投与することを含む、視覚機能障害または失明の治療を、それを必要とする対象において行う方法。
21. 前記１つまたは複数の遺伝子はＢｒｎ３ＢとＳｏｘ４とを含む、請求項１９に記載の使用または請求項２０に記載の方法。
22. 前記視覚機能障害または失明は、変性した網膜神経節細胞（ＲＧＣ）によって引き起こされる、請求項１９もしくは２０に記載の使用または請求項１９もしくは２１に記載の方法。
23. 前記視覚機能障害または失明は、緑内障を含む視神経障害、遺伝性視神経障害、ならびに毒素、栄養不良および外傷によって引き起こされる障害からなる群より選択される状態に関連している、請求項２２に記載の使用または方法。
24. 前記薬剤は、前記１つまたは複数の遺伝子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の使用または方法。
25. 前記投与は硝子体内注射による、請求項２０に記載の方法。
26. Ｂｒｎ３ＢおよびＳｏｘ４タンパク質をコードするコード配列と、各コード配列に関連するプロモーターとを含む核酸構築物であって、各プロモーターは網膜ニューロン細胞において活性である、核酸構築物。
27. 前記プロモーターの少なくとも１つは、Ｐａｘ６、Ｔｃｆａｐ２ｂ、Ｇａｄ１、ＧｌｙＴ１、ＲＢＰＭＳ、またはＰｒｏｘ１遺伝子のプロモーターである、請求項２６に記載の核酸構築物。
28. 前記プロモーターの少なくとも１つはシナプシン１プロモーターである、請求項２６に記載の核酸構築物。
29. プラスミドベクターまたはウイルスベクターである発現ベクターをさらに含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
30. 前記発現ベクターはＡＡＶベクターである、請求項２９に記載の核酸構築物。
31. 前記ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２からなる群より選択される、請求項３０に記載の核酸構築物。
32. 前記ＡＡＶは血清型ＡＡＶ２のそれである、請求項３０に記載の核酸構築物。
33. 前記ＡＡＶはＡＡＶ２．７ｍ８またはＡＡＶ７ｍ８である、請求項３０に記載の核酸構築物。
34. 請求項２６～３３のいずれか一項に記載の核酸構築物によって遺伝子導入された細胞。
35. 網膜ニューロン細胞である、請求項３４に記載の細胞。
36. 視覚信号に応答する、請求項３５に記載の細胞。
37. 網膜ニューロン細胞において、Ｂｒｎ３Ｂ、Ｓｏｘ４、Ａｔｏｈ７、Ｓｏｘ１１およびＩｌｓ１からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の生物活性を増加させることにより調製される、視覚信号に応答する哺乳類細胞。
38. ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される、請求項３７に記載の哺乳類細胞。
39. 再生されたまたは若返った網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である、請求項３７または３８に記載の哺乳類細胞。
    

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