CN110305846A - 视网膜节细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种视网膜节细胞的制备方法，包括如下步骤：获取体细胞；构建慢病毒颗粒，用所述慢病毒颗粒转染所述体细胞，从而将Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到体细胞染色体上；诱导培养，获得视网膜节细胞。所得到的视网膜节细胞，通过将外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纤维细胞染色体上过表达制备获得。与现有技术相比，本发明创造性地挑选Ascl1基因、Brn3b基因和Islet1基因的组合，通过慢病毒介导的方式使这三个转录因子在体细胞中过表达，能够在诱导培养7天的情况下，实现超过10％的体细胞转分化为Brn3a阳性、Tuj1阳性的视网膜神经节样细胞，效率高。

Description

视网膜节细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种视网膜节细胞的制备方法。
背景技术
自诺贝尔奖得主山中伸弥发现通过过表达Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc四个转录因子可以将体细胞重编程为多能干细胞(iPS)以来，人们陆续发现通过过表达组织特异性转录因子可以将体细胞直接重编程为其它谱系的体细胞，而无需经过多能干细胞阶段(体细胞直接重编程)。2010年，美国的Marius Wernig实验室发现同时过表达Ascl1，Brn2和Myt1l，可以将小鼠成纤维细胞高效地直接重编程为Tuj1阳性的神经元(Nature 2010，463：1035-41)。这一发现为再生治疗神经退行性疾病开辟了崭新，方便而快捷的供体细胞制备途径。但是这一方法得到的神经元仅仅是普通的泛神经元，而治疗各种神经退行性疾病需要针对此疾病的特定神经元亚型。为此，人们通过筛查不同的因子组合实现了体细胞直接重编程制备多巴胺神经元，运动神经元等神经元亚型的有效方法。但是当前尚缺乏体细胞直接重编程制备视网膜神经元的有效方法。
在发病率最广泛的视网膜退行性疾病-青光眼中视网膜节细胞受到损害而永久丢失，导致视力不可逆丧失。视网膜节细胞移植治疗有望解决青光眼不治之难题。因此建立体细胞直接重编程制备视网膜节细胞的方法具有巨大的临床应用价值，但当前在此领域进展有限。虽然有报道，过表达Ascl1，Brn3b和Ngn2可以将小鼠成纤维细胞重编程为Brn3a阳性的视网膜节细胞样细胞(Neuroscience 2013,250:381-93)，但是此报道中的方法获得视网膜节细胞样神经元的效率不够高。
因此，亟待探索一种效率高的体细胞直接重编程制备视网膜节细胞的方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种视网膜节细胞的制备方法，该制备方法能够高效的将体细胞直接重编程为视网膜节细胞。
本发明的技术方案是通过以下技术方案实现的：
一种视网膜节细胞，通过将外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纤维细胞染色体上过表达制备获得。
一种视网膜节细胞的制备方法，包括如下步骤：
获取体细胞；
构建慢病毒颗粒，用所述慢病毒颗粒转染所述体细胞，从而将Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到体细胞染色体上；
诱导培养，获得视网膜节细胞。
在其中一些实施例中，所述的体细胞为小鼠成纤维细胞。
在其中一些实施例中，所述慢病毒颗粒的构建包括如下步骤：
(1)获取Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA；
(2)将所述Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA克隆到同一慢病毒载体上，获得慢病毒表达质粒；
(3)用慢病毒表达质粒、诱导因子表达质粒、包装质粒转染包装细胞，然后于包装细胞的上清液中收集慢病毒颗粒。
在其中一些实施例中，获取所述Brn3b基因的全长cDNA的步骤包括：
提取小鼠胚胎头部组织总RNA，用反转录酶反转录为cDNA库；以所述cDNA库为模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为引物，进行PCR扩增；或/和，
获取Islet1基因的全长cDNA的步骤包括：
提取小鼠胚胎头部组织总RNA，用反转录酶反转录为cDNA库；以所述cDNA库为模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增或/和，
获取所述Ascl1基因的全长cDNA的步骤包括：
以TetO-FUW-Ascl1为模板，以SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物，进行PCR扩增。
在其中一些实施例中，所述Ascl1基因的全长cDNA如SEQ ID No.7所示；所述Islet1基因的全长cDNA如SEQ ID No.8所示；所述Brn3b基因的全长cDNA如SEQ ID No.9所示。
在其中一些实施例中，所述的慢病毒载体为pSicoR-TetO；所述诱导因子表达质粒为诱导因子rtTA表达质粒；所述包装细胞为HEK293细胞；所述包装质粒为psPAX2、pMD2.G。
在其中一些实施例中，所述诱导培养包括：培养所述转染后的体细胞至视网膜节细胞的状态时，采用添加有毛喉素的诱导培养基进行诱导培养。
在其中一些实施例中，所述毛喉素的在所述诱导培养基中的终浓度为4.2～8.4μg/ml。
在其中一些实施例中，所述诱导培养基为N2终浓度为0.5～1.5％、B27终浓度为1.5～2.5％的DMEM/F12与基础培养基体积为1:1的培养基。该处所述的“％”为体积百分比。
在其中一些实施例中，培养所述转染后的体细胞至视网膜节细胞的状态，包括依次采用第一诱导培养基、第二诱导培养基进行培养；第一诱导培养基为含有1～3μg/ml强力霉素的MEF培养基；第二诱导培养基为含有1～3μg/ml强力霉素(Doxycycline)、0.5～1.5％N2、1.5～2.5％B27(体外培养神经元无血清添加剂)的DMEM/F12与基础培养基体积为1:1的培养基。该处所述的“％”为体积百分比。
一种用于制备视网膜节细胞的融合质粒，该融合质粒中包含有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因。
与现有技术相比，本发明具备如下的有益效果：
本发明创造性地挑选Ascl1基因、Brn3b基因和Islet1基因的组合，特别是将这三个转录因子共同克隆到同一个慢病毒载体上，通过慢病毒介导的方式使这三个转录因子在体细胞中过表达，能够在诱导培养7天的情况下，实现超过10％的体细胞转分化为Brn3a阳性、Tuj1阳性的视网膜神经节样细胞，效率高。
本发明还配合在诱导培养中添加forskolin(毛喉素)，特别是，在转染后体细胞处于接近神经细胞的状态时，添加合适浓度的该小分子药物，能够促进Brn3a阳性；Tuj1阳性视网膜神经节样细胞生成，促使生成的视网膜神经节样细胞发散出纤长的细胞突起，展现成熟神经元的形态，具有典型的神经元的细胞膜电生理特征，并且在电流钳去极化作用下能够发放连续的动作电位，少部分的神经元甚至可以发放连续自发动作电位。
附图说明
图1为视网膜神经节样细胞免疫荧光染色图；其中：
图1A是在无外源基因的情况下，小鼠成纤维细胞细胞免疫荧光染色图，不表达神经元标志物Tujl和Brn3a；
图1B、图1C、图1D为实施例1转入3个转录因子后小鼠成纤维细胞细胞免疫荧光染色图，能够同时表达泛神经元标志物Tujl以及视神经节细胞标志物Brn3a、RBPMS、Pax6。
图2为实施例1所得视网膜神经节样细胞在电流钳的作用下发放连续的动作电位图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例提供一种视网膜节细胞的制备方法，具体步骤包括：
步骤1、制备慢病毒表达质粒pSicoR-TetO-Ascl1-P2A-Islet1-T2A-Brn3b(pSicoR-TetO-ABI)
(1)获取Ascl1基因、Brn3b基因、Islet1基因的全长cDNA
1)提取小鼠胚胎第13.5天头部组织的总RNA，用反转录酶SuperscriptⅢ(ThermoFisher,Scientific)反转录为cDNA库。
2)以cDNA库为模板，以如下SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为引物，进行PCR扩增，获得小鼠Brn3b基因全长cDNA；
SEQ ID No.1：5’-gaactgtacaatgatgatgatgtccctgaac-3’，
SEQ ID No.2：5’-ggttgaattcctaaatgccggcagagtatttc-3’；
PCR扩增的体系为：1μl cDNA库，1×Phusion反应缓冲液，200μM dNTP，1μM正向引物SEQ ID No.1，1μM反向引物SEQ ID No.2，1units Phusion DNA聚合酶，加水至反应体系为50μl；
PCR扩增的程序为：步骤一：98℃，30s；步骤二：98℃，10s；60℃，20s；72℃，1min；35个循环；步骤三：72℃，10min。
所基因Brn3b基因全长cDNA的序列(Brn3b-cDNA)如下SEQ ID No.9所示:
atgatgatgatgtccctgaacagcaagcaggcgttcagcatgcctcacgcaggcagcctgcacgtggagcccaagtactcggcgctacacagtgcctccccgggctcctctgcgcccgcggcgccctcggccagttcccctagcagctccagcaacgctggcggcggcggcggtggcggcggaggcggaggcggcggcggccggagcagcagttccagcagcagtggcagcggcggcagcggcggcggcgggggctcggaggcgatgcggagagcttgtcttccaaccccaccgagcaatatattcggcgggctggatgagagtctgctggcccgtgccgaggctctggccgccgtggacatcgtctcccagagtaagagccaccaccaccatccgccccaccacagccccttcaagccggacgccacttaccacaccatgaacaccatcccgtgcacgtcggcagcctcctcttcttctgtgcccatctcgcacccgtccgctctggctggcacccatcaccaccaccaccaccaccatcaccaccatcaccagccgcaccaggcgctggagggcgagctgcttgagcacctaagccccgggctggccctgggagctatggcgggccccgacggcacggtggtgtccactccggctcacgcaccacacatggccaccatgaaccccatgcaccaagcagccctgagcatggcccacgcacatgggctgccctcgcacatgggctgcatgagcgacgtggatgcagacccgcgggacctggaggcgttcgccgagcgtttcaagcagcgacgcatcaagctgggagtgacccaggcagatgtgggctcggcgctggccaacctcaagatcccgggcgtgggctcgctcagccagagcaccatctgcaggtttgagtctctcacgctgtcacacaacaacatgatcgcgctcaagcccatcctgcaggcgtggctggaggaagctgagaaatcccaccgcgagaagctcactaagccggagctcttcaatggcgcggagaagaagcgcaagcgcacgtccatcgcggcgccggagaagcgctctctggaagcctacttcgccatccagccaaggccctcctcggagaagatcgcggccatcgccgaaaagctggatctcaagaaaaatgtggtgcgcgtctggttctgcaaccagaggcagaaacagaagagaatgaaatactctgccggcatttag。
3)以cDNA库为模板，以如下SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增，扩增小鼠Islet1基因全长cDNA，并在5’端添加P2A序列，在3’端添加T2A序列；
SEQ ID No.3：5’-actcaccggtggcagcggcgccacaaacttctctctgctaaagcaagcaggtgatgttgaagaaaaccccgggcctgcatgcatgggagacatgggcgatccacc-3’，
SEQ ID No.4：5’-gaactgtacactcgagtgggccgggattttcctccacgtccccgcatgtTagaagacttcccctgccctcgccggagccgcatgctgcctcaataggactggctaccatgctg-3’；
PCR扩增的体系为：1μl cDNA库，1×Phusion反应缓冲液，200μM dNTP，1μM正向引物SEQ ID No.3，1μM反向引物SEQ ID No.4，1units Phusion DNA聚合酶，加水至反应体系为50μl；
PCR扩增的程序为：步骤一：98℃，30s；步骤二：98℃，10s，60℃，20s，72℃，1min，35个循环；步骤三：72℃,10min。
所得小鼠Islet1基因全长cDNA的序列(Islet1-cDNA)如SEQ ID No.8所示：
atgggagacatgggcgatccaccaaaaaaaaaacgtctgatttccctgtgtgttggttgcggcaatcaaattcacgaccagtatattctgagggtttctccggatttggagtggcatgcagcatgtttgaaatgtgcggagtgtaatcagtatttggacgaaagctgtacgtgctttgttagggatgggaaaacctactgtaaaagagattatatcaggttgtacgggatcaaatgcgccaagtgcagcataggcttcagcaagaacgacttcgtgatgcgtgcccgctctaaggtgtaccacatcgagtgtttccgctgtgtagcctgcagccgacagctcatcccgggagacgaattcgccctgcgggaggatgggcttttctgccgtgcagaccacgatgtggtggagagagccagcctgggagctggagaccctctcagtcccttgcatccagcgcggcctctgcaaatggcagccgaacccatctcggctaggcagccagctctgcggccgcacgtccacaagcagccggagaagaccacccgagtgcggactgtgctcaacgagaagcagctgcacaccttgcggacctgctatgccgccaaccctcggccagatgcgctcatgaaggagcaactagtggagatgacgggcctcagtcccagagtcatccgagtgtggtttcaaaacaagcggtgcaaggacaagaaacgcagcatcatgatgaagcagctccagcagcagcaacccaacgacaaaactaatatccaggggatgacaggaactcccatggtggctgctagtccggagagacatgatggtggtttacaggctaacccagtagaggtgcaaagttaccagccgccctggaaagtactgagtgacttcgccttgcaaagcgacatagatcagcctgcttttcagcaactggtcaatttttcagaaggaggaccaggctctaattctactggcagtgaagtagcatcgatgtcctcgcagctcccagatacacccaacagcatggtagccagtcctattgaggcatga。
4)通过PCR方法从TetO-FUW-Ascl1质粒中扩增出Ascl1基因全长cDNA
以TetO-FUW-Ascl1(从Addgeng购入，货号27150)为模板，以SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6为引物对，PCR扩增，获得小鼠Ascl1基因全长cDNA。
SEQ ID No.5：5’-actcgctagccaccatggagagctctggcaag-3’，
SEQ ID No.6：5’-actcaccggtgaaccagttggtaaagtccagcagctc-3’；
PCR扩增的体系为：1μlcDNA库，1×Phusion反应缓冲液，200μM dNTP，1μM正向引物SEQ ID No.5，1μM反向引物SEQ ID No.6，1units Phusion DNA聚合酶，加水至反应体系为50μl；
PCR扩增的程序为：步骤一：98℃，30s；步骤二：98℃，10s，60℃，20s，72℃，1min，35个循环；步骤三：72℃，10min。
所得小鼠Ascl1基因全长cDNA的序列(Ascl1-cDNA)如下SEQ ID No.7所示：
atggagagctctggcaagatggagagtggagccggccagcagccgcagcccccgcagcccttcctgcctcccgcagcctgcttctttgcgaccgcggcggcggcggcagcggcggcggccgcggcagctcagagcgcgcagcagcaacagccgcaggcgccgccgcagcaggcgccgcagctgagcccggtggccgacagccagccctcagggggcggtcacaagtcagcggccaagcaggtcaagcgccagcgctcgtcctctccggaactgatgcgctgcaaacgccggctcaacttcagcggcttcggctacagcctgccacagcagcagccggccgccgtggcgcgccgcaacgagcgcgagcgcaaccgggtcaagttggtcaacctgggttttgccaccctccgggagcatgtccccaacggcgcggccaacaagaagatgagcaaggtggagacgctgcgctcggcggtcgagtacatccgcgcgctgcagcagctgctggacgagcacgacgcggtgagcgctgcctttcaggcgggcgtcctgtcgcccaccatctcccccaactactccaacgacttgaactctatggcgggttctccggtctcgtcctactcctccgacgagggatcctacgaccctcttagcccagaggaacaagagctgctggactttaccaactggttctga。
(2)通过分子克隆方法将步骤(1)所得三个cDNA克隆入同一个诱导表达慢病毒载体pSicoR-TetO中，得到pSicoR-TetO-ABI质粒
本步骤采用的pSicoR-TetO质粒，可通过常规分子生物学手段改造pSicoR(addgene，11579)获得，包括：以含有TetO序列的质粒为模板，PCR扩增TetO序列，用限制性内切酶NotI-NheI分别酶切PCR产物和pSicoR质粒，连接合成pSicoR-TetO载体质粒。
构建pSicoR-TetO-ABI质粒的步骤包括：
首先，用限制性内切酶NheI和AgeI分别酶切pSicoR-TetO和Ascl1-cDNA，然后将Ascl1-cDNA连接入pScoR-TetO载体中，转化感受态细菌，挑单克隆菌株，扩增培养，提取质粒，送测序公司测序，核实正确pSicoR-TetO-Ascl1菌株。
然后，用限制性内切酶BsrGI和EcoRI分别酶切pSicoR-TetO-Ascl1和Brn3b-cDNA，连接，转化感受态细菌，挑单克隆，扩增培养，提取质粒，送测序公司测序，核实正确pSicoR-TetO-Ascl1-Brn3b菌株。
最后，用限制性内切酶AgeI和BsrGI分别酶切pSicoR-TetO-Ascl1-Brn3b和IsletI-cDNA，连接，转化感受态细菌，挑单克隆，扩增培养，提取质粒，送测序公司测序，核实正确pSicoR-TetO-Ascl1-P2A-Islet1-T2A-Brn3b(简称pSicoR-TetO-ABI)菌株。
扩增培养pSicoR-TetO-ABI菌株，利用Qiagen质粒提取试剂盒QIAGEN PlasmidMidi Kit(货号12145)提取纯化质粒，以备转染293细胞制作病毒使用。
步骤2、将pSicoR-TetO-ABI质粒，以及诱导因子rtTA表达质粒分别和包装质粒psPAX2和pMD2.G通过钙转染方法转染HEK293细胞。
转染36小时后，收集含病毒上清液，通过PEG沉降的方法富集慢病毒，最后重悬慢病毒于DMEM培养基中(25ml起始病毒上清液最后重悬于100μl DMEM培养基中)，分装冻存于-80℃冰箱待用。
步骤3、第0天：准备传代第3代的小鼠成纤维细胞(MEF)，培养于MEF培养基中(DMEM+10％FBS)，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。该步骤的“％”为体积比。
步骤4、第1天：用MEF培养基稀释慢病毒(按每毫升培养基添加50μl pSicoR-TetO-ABI，15μl rtTA慢病毒的比例加入)，吸去MEF培养基，换成添加了慢病毒的培养基，继续置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
步骤5、第2天：加入病毒24小时后，吸去含慢病毒培养基，更换入新鲜MEF培养基，同时加入Doxycycline(2μg/ml)(第一诱导培养基)。
步骤6、第4天：更换培养基为DMEM/F12：Neurobasal(1：1)+N2(1％)+B27(2％)，仍然保持添加2μg/ml Doxycycline(第二诱导培养基)。该步骤的“％”为体积比。Neurobasal即基础培养基。
步骤7、第7天：半量更换培养基。
步骤8、第9天：撤掉Doxycycline，同时培养基中添加4.2μg/ml Forskolin，继续培养(第三诱导培养基)。
步骤9、第10天至第16天，每两天更换半量培养基，获得视网膜节细胞。
步骤10、第16天：取细胞进行免疫荧光染色(检测Brn3a，Tuj1等表达情况)和膜片钳电生理检测(电压钳下检测钠钾离子通道开放情况，电流钳下检测动作电位发放情况等)。
结果见图1至图2。
图1为视网膜神经节样细胞免疫荧光染色图；其中：图1A是在无外源基因的情况下，小鼠成纤维细胞细胞免疫荧光染色图，不表达神经元标志物Tujl和Brn3a；图1B、图1C、图1D为实施例1转入3个转录因子后小鼠成纤维细胞细胞免疫荧光染色图，能够同时表达泛神经元标志物Tujl以及视神经节细胞标志物Brn3a、RBPMS、Pax6。
图2为本实施例所得视网膜神经节样细胞在电流钳的作用下发放连续的动作电位图。膜片钳电生理检测显示，所有检测的细胞(7个细胞)均可以发放动作电位，平均发放13个连续动作电位；静息动作电位在-68到-109mv之间；电压钳下显示钠离子电流在500到1621pA之间，钾离子电流在100到440pA之间，说明重编程获得的视网膜节细胞具有典型成熟神经元电生理功能。
实施例2
本实施例是实施例1的变化例，提供一种视网膜节细胞的制备方法，与实施例1相比，变化之处在于，本实施例的外源Ascl1基因、外源Islet1基因、外源Brn3b基因分别位于不同的质粒上。制备方法包括：
步骤1、获取分别携带外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因的慢病毒表达质粒
(1)携带外源Ascl1基因的慢病毒表达质粒直接采用TetO-FUW-Ascl1，从Addgeng购入，货号27150。
(2)构建慢病毒表达质粒pSicoR-TetO-Islet1
1)参照实施例1获得Islet1基因全长cDNA(Islet1-cDNA)，其中扩增引物替换为：
SEQ ID No.10：5’-ggttgctagccaccatgggagacatgggcgatcc-3’，
SEQ ID No.11：5’-ggtatgtacatcatgcctcaataggactgg-3’。
2)通过分子克隆方法将Islet1-cDNA克隆入诱导表达慢病毒载体pSicoR-TetO中，获得pSicoR-TetO-Islet1，包括：
用限制性内切酶NheI和BsrGI分别酶切pSicoR-TetO和IsletI-cDNA，连接，转化感受态细菌，挑单克隆，扩增培养，提取质粒，送测序公司测序，核实正确pSicoR-TetO-Islet1(简称pSicoR-TetO-Islet1)菌株。
(3)构建慢病毒表达质粒pSicoR-TetO-Brn3b
1)参照实施例1获得Brn3b基因全长cDNA(Islet1-cDNA)，其中扩增引物替换为：
SEQ ID No.12：5’-ggttgctagccaccatgatgatgatgtccctgaac-3’，
SEQ ID No.13：5’-ggttgaattcctaaatgccggcggaatatttc-3’。
2)通过分子克隆方法将Brn3b-cDNA克隆入诱导表达慢病毒载体pSicoR-TetO中，获得pSicoR-TetO-Brn3b，包括：
用限制性内切酶NheI和EcoRI分别酶切pSicoR-TetO和Brn3b-cDNA，连接，转化感受态细菌，挑单克隆，扩增培养，提取质粒，送测序公司测序，核实正确pSicoR-TetO-Brn3b(简称pSicoR-TetO-Brn3b)菌株。
步骤2、将步骤1中通过操作(1)购买的TetO-FUW-Ascl1、通过操作(2)构建的慢病毒表达质粒pSicoR-TetO-Islet1、通过操作(3)构建的慢病毒表达质粒pSicoR-TetO-Brn3b以及诱导因子rtTA表达质粒分别和包装质粒psPAX2和pMD2.G通过钙转染方法转染HEK293细胞。
转染36小时后，收集含病毒上清液，通过PEG沉降的方法富集慢病毒，最后重悬慢病毒于DMEM培养基中(25ml起始病毒上清液最后重悬于100μl DMEM培养基中)，分装冻存于-80℃冰箱待用。
步骤3、第0天(Day0)：准备传代第3代的小鼠成纤维细胞(MEF)，培养于MEF培养基中(DMEM+10％FBS)，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
步骤4、Day1：用MEF培养基稀释慢病毒(按每毫升培养基添加50μl TetO-FUW-Ascl1、pSicoR-TetO-Islet1、pSicoR-TetO-Brn3b的混合物，15μl rtTA慢病毒的比例加入)，吸去MEF培养基，换成添加了慢病毒的培养基，继续置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
步骤5至步骤10同实施例1。
结果同实施例1。实施例2步骤10所得细胞免疫荧光染色后，根据染色结果可知，能够同时表达泛神经元标志物Tujl以及视神经节细胞标志物Brn3a、RBPMS、Pax6。膜片钳电生理检测显示，所有检测的细胞(7个细胞)均可以发放动作电位，平均发放13个连续动作电位；静息动作电位在-68到-109mv之间；电压钳下显示钠离子电流在500到1621pA之间，钾离子电流在100到440pA之间，说明重编程获得的视网膜节细胞具有典型成熟神经元电生理功能。
对比例1
本例是实施例2的对比例，本对比例仅将外源Ascl1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纤维细胞染色体上过表达制备视网膜节细胞，制备步骤包括：
步骤1、获取分别携带外源Ascl1基因、Brn3b基因的慢病毒表达质粒
(1)携带外源Ascl1基因的慢病毒表达质粒直接采用TetO-FUW-Ascl1，从Addgeng购入，货号27150。
(2)携带外源Brn3b基因的慢病毒表达质粒，其制备参照实施例2。
步骤2至步骤10同实施例2。
结果，当仅向小鼠成纤维细胞染色体上整合Ascl1、Brn3b两个转录因子时，虽然有近10％的小鼠成纤维细胞表达Tuj1，但是不表达Brn3a，说明Ascl1、Brn3b两个转录因子的组合使用仅能将小鼠成纤维细胞重编程为泛神经元样细胞，但不能将其重编程为视网膜神经节细胞。
对比例2
本例是实施例2的对比例，区别之处仅在于：本实施例的步骤8中没有添加Forskolin。
结果，本例没有添加Forskolin时，仅有约3.5％的细胞转分化为Brn3a阳性、Tuj1阳性的视网膜神经节细胞，且细胞突起相对添加Forskolin组短小，说明神经元相对不成熟。而实施例2添加Forskolin时，有超过10％的小鼠成纤维细胞转分化为Brn3a阳性、Tuj1阳性的视网膜神经节细胞，且神经元突起纤长展现成熟神经元形态。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中山大学中山眼科中心
<120> 视网膜节细胞的制备方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaactgtaca atgatgatga tgtccctgaa c 31
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttgaattc ctaaatgccg gcagagtatt tc 32
<210> 3
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcaccggt ggcagcggcg ccacaaactt ctctctgcta aagcaagcag gtgatgttga 60
agaaaacccc gggcctgcat gcatgggaga catgggcgat ccacc 105
<210> 4
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaactgtaca ctcgagtggg ccgggatttt cctccacgtc cccgcatgtt agaagacttc 60
ccctgccctc gccggagccg catgctgcct caataggact ggctaccatg ctg 113
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actcgctagc caccatggag agctctggca ag 32
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actcaccggt gaaccagttg gtaaagtcca gcagctc 37
<210> 7
<211> 696
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
atggagagct ctggcaagat ggagagtgga gccggccagc agccgcagcc cccgcagccc 60
ttcctgcctc ccgcagcctg cttctttgcg accgcggcgg cggcggcagc ggcggcggcc 120
gcggcagctc agagcgcgca gcagcaacag ccgcaggcgc cgccgcagca ggcgccgcag 180
ctgagcccgg tggccgacag ccagccctca gggggcggtc acaagtcagc ggccaagcag 240
gtcaagcgcc agcgctcgtc ctctccggaa ctgatgcgct gcaaacgccg gctcaacttc 300
agcggcttcg gctacagcct gccacagcag cagccggccg ccgtggcgcg ccgcaacgag 360
cgcgagcgca accgggtcaa gttggtcaac ctgggttttg ccaccctccg ggagcatgtc 420
cccaacggcg cggccaacaa gaagatgagc aaggtggaga cgctgcgctc ggcggtcgag 480
tacatccgcg cgctgcagca gctgctggac gagcacgacg cggtgagcgc tgcctttcag 540
gcgggcgtcc tgtcgcccac catctccccc aactactcca acgacttgaa ctctatggcg 600
ggttctccgg tctcgtccta ctcctccgac gagggatcct acgaccctct tagcccagag 660
gaacaagagc tgctggactt taccaactgg ttctga 696
<210> 8
<211> 1050
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
atgggagaca tgggcgatcc accaaaaaaa aaacgtctga tttccctgtg tgttggttgc 60
ggcaatcaaa ttcacgacca gtatattctg agggtttctc cggatttgga gtggcatgca 120
gcatgtttga aatgtgcgga gtgtaatcag tatttggacg aaagctgtac gtgctttgtt 180
agggatggga aaacctactg taaaagagat tatatcaggt tgtacgggat caaatgcgcc 240
aagtgcagca taggcttcag caagaacgac ttcgtgatgc gtgcccgctc taaggtgtac 300
cacatcgagt gtttccgctg tgtagcctgc agccgacagc tcatcccggg agacgaattc 360
gccctgcggg aggatgggct tttctgccgt gcagaccacg atgtggtgga gagagccagc 420
ctgggagctg gagaccctct cagtcccttg catccagcgc ggcctctgca aatggcagcc 480
gaacccatct cggctaggca gccagctctg cggccgcacg tccacaagca gccggagaag 540
accacccgag tgcggactgt gctcaacgag aagcagctgc acaccttgcg gacctgctat 600
gccgccaacc ctcggccaga tgcgctcatg aaggagcaac tagtggagat gacgggcctc 660
agtcccagag tcatccgagt gtggtttcaa aacaagcggt gcaaggacaa gaaacgcagc 720
atcatgatga agcagctcca gcagcagcaa cccaacgaca aaactaatat ccaggggatg 780
acaggaactc ccatggtggc tgctagtccg gagagacatg atggtggttt acaggctaac 840
ccagtagagg tgcaaagtta ccagccgccc tggaaagtac tgagtgactt cgccttgcaa 900
agcgacatag atcagcctgc ttttcagcaa ctggtcaatt tttcagaagg aggaccaggc 960
tctaattcta ctggcagtga agtagcatcg atgtcctcgc agctcccaga tacacccaac 1020
agcatggtag ccagtcctat tgaggcatga 1050
<210> 9
<211> 1236
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
atgatgatga tgtccctgaa cagcaagcag gcgttcagca tgcctcacgc aggcagcctg 60
cacgtggagc ccaagtactc ggcgctacac agtgcctccc cgggctcctc tgcgcccgcg 120
gcgccctcgg ccagttcccc tagcagctcc agcaacgctg gcggcggcgg cggtggcggc 180
ggaggcggag gcggcggcgg ccggagcagc agttccagca gcagtggcag cggcggcagc 240
ggcggcggcg ggggctcgga ggcgatgcgg agagcttgtc ttccaacccc accgagcaat 300
atattcggcg ggctggatga gagtctgctg gcccgtgccg aggctctggc cgccgtggac 360
atcgtctccc agagtaagag ccaccaccac catccgcccc accacagccc cttcaagccg 420
gacgccactt accacaccat gaacaccatc ccgtgcacgt cggcagcctc ctcttcttct 480
gtgcccatct cgcacccgtc cgctctggct ggcacccatc accaccacca ccaccaccat 540
caccaccatc accagccgca ccaggcgctg gagggcgagc tgcttgagca cctaagcccc 600
gggctggccc tgggagctat ggcgggcccc gacggcacgg tggtgtccac tccggctcac 660
gcaccacaca tggccaccat gaaccccatg caccaagcag ccctgagcat ggcccacgca 720
catgggctgc cctcgcacat gggctgcatg agcgacgtgg atgcagaccc gcgggacctg 780
gaggcgttcg ccgagcgttt caagcagcga cgcatcaagc tgggagtgac ccaggcagat 840
gtgggctcgg cgctggccaa cctcaagatc ccgggcgtgg gctcgctcag ccagagcacc 900
atctgcaggt ttgagtctct cacgctgtca cacaacaaca tgatcgcgct caagcccatc 960
ctgcaggcgt ggctggagga agctgagaaa tcccaccgcg agaagctcac taagccggag 1020
ctcttcaatg gcgcggagaa gaagcgcaag cgcacgtcca tcgcggcgcc ggagaagcgc 1080
tctctggaag cctacttcgc catccagcca aggccctcct cggagaagat cgcggccatc 1140
gccgaaaagc tggatctcaa gaaaaatgtg gtgcgcgtct ggttctgcaa ccagaggcag 1200
aaacagaaga gaatgaaata ctctgccggc atttag 1236
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 10
ggttgctagc caccatggga gacatgggcg atcc 34
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 11
ggtatgtaca tcatgcctca ataggactgg 30
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 12
ggttgctagc caccatgatg atgatgtccc tgaac 35
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 13
ggttgaattc ctaaatgccg gcggaatatt tc 32

Claims (10)

1.一种视网膜节细胞，其特征在于，通过将外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纤维细胞染色体上过表达制备获得。
2.一种视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取体细胞；
构建慢病毒颗粒，用所述慢病毒颗粒转染所述体细胞，从而将Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到体细胞染色体上；
诱导培养，获得视网膜节细胞。
3.根据权利要求2所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述的体细胞为小鼠成纤维细胞。
4.根据权利要求2或3所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒颗粒的构建包括如下步骤：
(1)获取Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA；
(2)将所述Ascl1基因的全长cDNA、Islet1基因的全长cDNA、Brn3b基因的全长cDNA克隆到同一慢病毒载体上，获得慢病毒表达质粒；
(3)用慢病毒表达质粒、诱导因子表达质粒、包装质粒转染包装细胞，然后于包装细胞的上清液中收集慢病毒颗粒。
5.根据权利要求4所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，获取所述Brn3b基因的全长cDNA的步骤包括：
提取小鼠胚胎头部组织总RNA，用反转录酶反转录为cDNA库；以所述cDNA库为模板，以SEQ ID No.1、SEQ ID No.2为引物，进行PCR扩增；或/和，
获取Islet1基因的全长cDNA的步骤包括：
提取小鼠胚胎头部组织总RNA，用反转录酶反转录为cDNA库；以所述cDNA库为模板，以SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为引物，进行PCR扩增；或/和，
获取所述Ascl1基因的全长cDNA的步骤包括：
以TetO-FUW-Ascl1为模板，以SEQ ID No.5、SEQ ID No.6为引物，进行PCR扩增。
6.根据权利要求5所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述Brn3b基因的全长cDNA如SEQ ID No.9所示；所述Islet1基因的全长cDNA如SEQ ID No.8所示；所述Ascl1基因的全长cDNA如SEQ ID No.7所示。
7.根据权利要求4所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述的慢病毒载体为pSicoR-TetO；所述诱导因子表达质粒为诱导因子rtTA表达质粒；所述包装细胞为HEK293细胞；所述包装质粒为psPAX2、pMD2.G。
8.根据权利要求2至7任一项所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述诱导培养包括：培养所述转染后的体细胞至视网膜节细胞的状态时，采用添加有毛喉素的诱导培养基进行诱导培养。
9.根据权利要求11所述的视网膜节细胞的制备方法，其特征在于，所述毛喉素的在所述诱导培养基中的终浓度为4.2～8.4μg/ml。
10.用于制备视网膜节细胞的融合质粒，其特征在于，该融合质粒中包含有Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因。
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