WO2018048046A2 - mTOR 저해제를 함유하는 황반변성 치료용 의약조성물 - Google Patents

mTOR 저해제를 함유하는 황반변성 치료용 의약조성물 Download PDF

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WO2018048046A2
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이현승
박태관
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating macular degeneration, and more particularly, to a pharmaceutical composition for treating macular degeneration containing an inhibitor that inhibits the expression of the mTOR gene.
  • Age-Related Macular Degeneration has become the most important disease that causes blindness in people over 65 years of age in developed countries. This disease is associated with a decline in the function and age of Retinal Pigment Epithelium (RPE), which plays a critical role in maintaining homeostasis and physiological function of the retina, which plays a key role in visual function in all types of animals. Atrophy caused by atrophy is known to be the most important cause, and abnormal changes due to age-related changes of Bruch's Membrane, which serves as the basement membrane of RPE, and are located on the outermost side of RPE and neural retina. The degeneration of choriocapillaris, which plays a role of supplying nutrients and oxygen to photoreceptor cells in which) occurs.
  • RPE Retinal Pigment Epithelium
  • the age-related macular degeneration can be classified into two types according to the phenotype resulting from such changes.
  • Choroidal membranes in dry AMD and dry AMD are characterized by degeneration of RPE, Bruch's membrane, and Choriocapillaris. It is classified as wet AMD, accompanied by Choroidal neovascularization (CNV).
  • Dry AMD is characterized by the development of drusen, the accumulation of complementary and apolipoprotein proteins between RPE and choriocapillaries, presumably their presence impeding the transport of oxygen and nutrients in the choriocapillaries.
  • drusen itself reflects the deterioration of RPE cells, which in turn leads to the lack of oxygen, obstruction of mass transfer, and the occurrence of inflammation, which in turn leads to the death of RPE cells.
  • G geographic atrophy
  • Wet AMD occurs in 5-10% of dry AMD patients and, unlike dry AMD, where vision deterioration occurs over a period of years or decades to twenty years, blindness occurs within months if not treated. It shows an acute phenotype that can result.
  • widespread oxygen partial pressure and nutrient depletion across the subretinal and subRPE spaces, i.e., tissue ischemia and the accompanying inflammatory response play an important role.
  • the complement system which plays an important role in oxidative stress and immunological mechanisms, also acts, causing choroidal neovascularization (CNV) to characteristically occur in the subretinal space or subretinal pigment epithelial space. This results in serous leakage and bleeding.
  • CNV choroidal neovascularization
  • Choroidal neovascularization is known to occur in endothelial cells, RPE cells, and inflammatory cells such as monocytes and macrophages. Treatment for Wet AMD has reduced blindness in many patients with the use of anti-VEGF antibodies that began around 2005. This is because VEGF plays a major role in the development of choroidal neovascularization.
  • the use of anti-VEGF antibodies does not completely inhibit the formation and growth of choroidal neovascularization.
  • photoreceptor cells in the central and central areas of the retina where choroidal neovascularization occurs develop disruption of underlying RPE tissue. Eventually, after several years, the function will be lost.
  • the anti-VEGF antibody acts only on the endothelial cells on the surface of the neovascularized blood vessels, so the size of the neovascularized blood vessels continues to increase without decreasing.
  • mTOR mimmalian target of rapamycin
  • the present inventors have diligently tried to develop a new mechanism of drug development target that is not expected to be effective by anti-VEGF antibody in treating macular degeneration.
  • the present inventors have treated mTOR inhibitors in a laser-induced choroidal neovascular macular degeneration model. In this case, it was confirmed that the lesion size of the macular degeneration was reduced, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating macular degeneration having a novel mechanism of drug mechanism target.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing macular degeneration containing an siRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing macular degeneration containing a recombinant vector into which shRNA (shRNA-mTOR) having mTOR inhibitory ability represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is introduced.
  • shRNA shRNA-mTOR
  • the present invention also provides a method for treating macular degeneration, characterized in that the patient is treated with siRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides a method for treating macular degeneration, characterized in that the patient is treated with a recombinant vector having shRNA (shRNA-mTOR) having mTOR inhibitory ability represented by any one of SEQ ID NO: 1.
  • shRNA-mTOR a recombinant vector having shRNA (shRNA-mTOR) having mTOR inhibitory ability represented by any one of SEQ ID NO: 1.
  • Figure 1 shows that after administration of the shRNA in the laser-induced choroidal neovascular macular degeneration model, choroidal neovascular fluorescence leakage was reduced by fluorescein angiography
  • A is induction of macular degeneration, administration of shRNA and fluorescent fundus vessels The contrast schedule is shown
  • BD shows the fluorescein angiography results before shRNA administration
  • EG shows the fluorescein angiography results after shRNA administration.
  • Figure 2 is a picture showing the expression of mTOR and the expression of cells introduced into the vector after the injection of the scAAV vector into the vitreous, (a) shows a cell into which the vector is introduced, (b) is a change in the expression of mTOR It is shown.
  • Figure 3 shows the change in the expression of CD31 after administration of shRNA in the laser-induced choroidal neovascular macular degeneration model
  • (a) and (b) is a photograph (a) and graphs confirmed in retinal pigment epithelial-choroid complex tissue specimens
  • (b) and (c) are photographs obtained from a neural retinal-retinal pigment epithelial-choroid complex tissue specimen.
  • Figure 4 is a graph confirming the change of inflammatory cells after administration of shRNA in the laser-induced choroidal neovascular macular degeneration model, (a) shows CD11b positive cells, (b) shows F4 / 80 positive cells. .
  • FIG. 5 is a photograph showing the change in autophagy after administration of shRNA in the laser-induced choroidal neovascular macular degeneration model, (a) shows LC3B positive cells, and (b) shows ATG7 positive cells.
  • Figure 6 is a photograph (a) and graph (b) confirming the change in apoptosis after administration of shRNA in the laser-induced choroidal neovascular macular degeneration model.
  • the age-related macular degeneration caused by a decrease in the function of the retinal pigment epithelial cell layer and atrophy due to aging was to be treated by a mechanism other than angiogenesis-inhibitory mechanism by the conventional method using anti-VEGF antibody.
  • a mechanism other than angiogenesis-inhibitory mechanism by the conventional method using anti-VEGF antibody.
  • the shRNA-based mTOR inhibitor was treated in a laser-induced macular degeneration animal model, significant decreases in the size of lesions were identified in the treatment group.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing macular degeneration containing an siRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the siRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is an siRNA that acts as an inhibitor of mTOR, and the inhibition of mTOR is involved in the formation of choroidal neovascularization (CNV) in age-related macular degeneration (AMD). It is thought to be able to block the influx and proliferation of inflammatory cells, which can not be shown by the anti-VEGF antibody, and can be a target of new mechanism development. mTOR inhibition inhibits proliferation of endothelial cells, another major member of choroidal neovascularization, and activates autophagy. It also improves apoptosis of nerve cells in neural retinal tissue.
  • siRNA used in the present invention is as follows.
  • the shRNA-based mTOR inhibitor used in the present invention was known to mediate autophagy activation in malignant tumor cells at the time of initial development, and in the present invention the activation and activation of autophagy through macular degeneration animal model Check around.
  • SiRNA used in the present invention can be prepared according to the production method of RNA molecules known in the art.
  • a method for preparing RNA molecules chemical synthesis methods and enzymatic methods can be used.
  • the chemical synthesis of RNA molecules can use the methods described in the literature (Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999), and the enzymatic synthesis of RNA molecules is T7, T3.
  • phage RNA polymerases such as SP6 RNA polymerase are disclosed in the literature (Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180: 51-62, 1989).
  • Viral or viral vectors useful for delivering siRNA for mTOR in the present invention include baculoviridae, parvoviridae, picornoviridae, herpesviridae, Poxviridae, adenoviridae, and the like, but are not limited thereto.
  • the mTOR target siRNA according to the present invention when used as a pharmaceutical composition, it may further include a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition.
  • Carriers, excipients or diluents usable in the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • compositions can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations may include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ( Prepare by mixing sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the amount of the composition may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, but the amount of 0.1 to 2.0 mg / kg may be administered once to several times daily.
  • the dosage of such a composition can be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • composition can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing macular degeneration with a recombinant vector into which shRNA (shRNA-mTOR) having mTOR inhibitory ability represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is introduced.
  • shRNA shRNA-mTOR
  • the present invention provides a method of treating a patient with a recombinant vector having a siRNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or shRNA (shRNA-mTOR) having an mTOR inhibitory ability represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 introduced. It relates to a method for treating macular degeneration characterized by.
  • Adeno Associated Virus AAV
  • Adenoviruses rarely cause immune responses and cytotoxicity.
  • adeno-associated virus serotype 2 can efficiently deliver genes to neurons of the CNS, and can also efficiently express transgenes in the nervous system for a long time.
  • non-viral vectors useful for delivering siRNA for mTOR in the present invention include all vectors commonly used for gene therapy, except for the aforementioned viral vectors, for example, various plasmids and liposomes that can be expressed in eukaryotic cells. Etc.
  • siRNA targeting mTOR is preferably operably linked to at least a promoter in order to be properly transcribed in delivered cells.
  • the promoter may be any promoter capable of functioning in eukaryotic cells, but a human H1 polymerase-III promoter is more preferable.
  • it may further comprise regulatory sequences, including leader sequence, polyadenylation sequence, promoter, enhancer, upstream activation sequence, signal peptide sequence and transcription terminator.
  • choroidal neovascularization was induced by laser treatment on the eye of the animal.
  • 8-week-old male C57 / BL6 mice were anesthetized with 40 mg / kg zolazepam / tiletamine and 5 mg / kg xylazine, followed by dilated pupils with 0.5% tropicamide and 2.5% phenylephrine.
  • Laser photocoagulation in the right eye of the mouse using a PASCAL diode ophthalmic laser system (Nd: YAG, 532nm, Topcon Medical Laser Systems, Inc., Santa Clara, CA, USA) to induce choroidal neovascularization (CNV). laser photoagulation (LP).
  • PASCAL diode ophthalmic laser system Nd: YAG, 532nm, Topcon Medical Laser Systems, Inc., Santa Clara, CA, USA
  • a vector derived from a self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector (scAAV2) was used.
  • Laser photocoagulation was induced in anesthesia and 6 days later, the pupils of the right eye of the mouse were dilated and the vector was injected into the vitreous body.
  • Vector injection was performed using a nanofill syringe with a blunt needle with a 35 gauge thickness, and 1 ⁇ l was injected at a concentration of 5.0 ⁇ 10 10 viral genomes (vg) / ml.
  • mice were divided into three groups of 15 rats, and physiological saline, non-specific shRNA, or mTOR shRNA of SEQ ID NO: 1 were injected into the vitreous. Five mice were treated as negative controls without choroidal neovascularization and intravitreal injection.
  • Subject group 1 (shRNA-mTOR experimental group) Laser-induced choroidal neovascularization + AAV-mTOR shRNA / GFP injection
  • Subject 2 (shRNA-nonspecific control) Laser-induced choroidal neovascularization + AAV-specific shRNA / GFP injection Target group 3 (physiological saline control group) Laser-induced choroidal neovascularization + physiological saline injection Target group 4 (voice control) No treatment
  • the scAAV vector injected into the vitreous was introduced, the scAAV vector into which the gene encoding GFP was inserted was used. Cryosection samples were prepared as described in Example 2-3, and GFP expression was examined using anti-GFP antibodies (abcam, Cambridge, MA). As a result, they were expressed in CD31 positive vascular endothelial cells as well as inner retinal cells. It was found (FIG. 2A).
  • the scAAV vector is known to be introduced into inner retinal cells in the wild-type mouse retina, including cells located in the retinal ganglion cell and the inner nuclear layer (Lee SH).
  • Tissue specimen preparation for immunofluorescence staining was carried out as follows. After anesthetizing the animals, 0.1 M PBS containing 150 U / ml heparin was perfused through the heart, followed by 4% paraformaldehyde / 0.1 M PB. After fixing the fixed eyeball, the anterior segment containing the cornea and lens was removed. The neural retinal-retinal pigment epithelial-choroid complex tissue specimens thus prepared were further fixed in 4% parafomaldehyde / 0.1 M PB. To prepare frozen sections, fixed tissues were transferred to 30% sucrose / PBS and left overnight. Subsequently, sagittal sections having a thickness of 10 ⁇ m were made in a frozen state in which OCT compounds (Sakura Finetek, Torrance, CA) were attached to the microscope slide.
  • OCT compounds Sakura Finetek, Torrance, CA
  • the mTOR shRNA inserted with the mTOR shRNA of SEQ ID NO: 1 was injected into the vitreous and mTOR expression was examined.
  • Expression of mTOR was immunofluorescent stained using an anti-mTOR antibody (1: 200; R & D Systems, Minneapois, MN, AF15371) on frozen sections prepared as described in Example 2-3.
  • the expression of mTOR was not observed in the negative control group, which was not irradiated with laser. However, in the case of choroidal neovascularization by laser irradiation, the expression was increased in the neural retina and subretinal regions.
  • This mTOR expression was not changed by physiological saline or nonspecific shRNA, but was shown to be reduced by mTOR shRNA, confirming that the sequence was effective in inhibiting mTOR expression (FIG. 2).
  • the scAAV vector containing the mTOR shRNA inserted into the vitreous is injected into the shRNA as described in Example 2 in the choroidal neovascular macular degeneration animal model. Treatment effect was confirmed in Examples 3-1 to 3-5.
  • Fluorescent leakage of choroidal neovascularization was measured using fluorescein angiography (FFA). Fluorescein angiography was performed using a Scanning laser ophthalmoscope (Heidelberg Retina Angiograph 2; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany). 0.1 ml of 2% fluorescein sodium was injected intraperitoneally into the mice in anesthesia, wait 3 to 5 minutes, and the pupils were shaken to obtain an FFA image. Proper choroidal neovascularization was confirmed after 5 days of laser irradiation, and then, as described in Example 2-1, scAAV-mTOR shRNA was injected into the vitreous body and 7 days later (after 13 days of laser irradiation). .
  • FFA fluorescein angiography
  • mTOR shRNA was treated with anti-CD31 antibody (1: 200; BD Pharmingen, Inc., San Diego, CA, 550274), which can selectively identify vascular endothelial cells. Endothelial cells were observed.
  • Tissue specimen preparation for immunofluorescence staining was carried out as follows. After anesthetizing the animals, 0.1 M PBS containing 150 U / ml heparin was perfused through the heart, followed by 4% paraformaldehyde / 0.1 M PB. After fixing the fixed eyeball, the anterior segment containing the cornea and lens was removed.
  • neural retina was further removed to make retinal pigment epithelial choroid complex and further fixed in 4% paraformaldehyde / 0.1 M PB.
  • the eyeball was removed and further fixed in 4% parafomaldehyde / 0.1 M PB with neural retina attached.
  • the retinal pigment epithelial-choroid complex or neural retinal pigment epithelial-choroid complex thus prepared was transferred to 30% sucrose / PBS and submerged overnight to produce a frozen section specimen, followed by an OCT compound (Sakura Finetek, Torrance, CA). 10 ⁇ m thick sagittal sections were made in the frozen state and attached to the microscope slide.
  • Retinal pigment epithelial-choroid complex fragments were stained with anti-CD31 antibody and phalloidin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, A22287), and the choroidal neovascular region was expressed by mTOR shRNA as compared with physiological saline or non-specific shRNA injection. This was shown to be significantly reduced (Fig. 3) and the result of examining the retinal-retinal pigment epithelial-choroid complex fragments showed that the mTOR shRNA was introduced to reduce the CD31 positive cells among the cells expressing GFP (Fig. 3). ).
  • mTOR shRNA acts on vascular endothelial cells, inhibits vascular growth and shows macular degeneration.
  • the numerical value is arithmetic with the mean ⁇ standard error of the mean, and statistical analysis (Kruskal-wallis test, posthoc analysis, Bonferroni's mehtod) using SPSS software (ver. 20.0 for Windows; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) , p ⁇ 0.05 was considered as a significant level.
  • the number of CD11b and F4 / 80 positive staining cells observed in the subretinal and retina was measured, indicating that the mTOR shRNA was significantly reduced compared to the physiological saline or non-specific shRNA injection. That is, the number of F4 / 30 positive inflammatory cells introduced into the retina was reduced to 84.4 ⁇ 17 or 82.8 ⁇ 10.0 when injected with saline or non-specific shRNA or 42.4 ⁇ 10.4 when injected with mTOR shRNA. , 123.8 ⁇ 13.0 or 127.6 ⁇ 14.4 was found to decrease to 90.0 ⁇ 11.6 (Fig. 4).
  • mTOR inhibition by mTOR shRNA has a therapeutic effect on macular degeneration by reducing the retinal influx and proliferation of inflammatory cells.
  • anti-LC3 antibodies (1: 200; Novus Biologicals, Littleton, CO, NB110-2220), which can selectively identify autophagy to determine whether choroidal neovascular lesions are reduced by mTOR shRNA; Immunofluorescence staining was performed using anti-ATG7 antibody. Tissue specimen preparation for immunofluorescence staining followed the preparation of neural retinal-retinal pigment epithelial-choroid complex tissue specimens described in Example 3-2. As a result, LC3B or ATG7 positive cells were not observed when physiological saline or non-specific shRNA was injected, but when mTOR shRNA was injected, it was observed at the lesion site and around, indicating that autophagy was increased by mTOR shRNA (FIG. 5). ).
  • mTOR inhibition by mTOR shRNA has a therapeutic effect on macular degeneration by increasing autophagy.
  • TUNEL terminal dUTP nick-end labeling
  • the number of TUNEL positive cells was found to be reduced to 17.8 ⁇ 4.8 or 19.4 ⁇ 4.0 when injected with saline or non-specific shRNA or 8.4 ⁇ 3.0 when injected with mTOR shRNA (Figure 6).
  • mTOR inhibition by mTOR shRNA decreases the cells located in the outer nuclera layer and thus has a therapeutic effect on macular degeneration.
  • age-related macular degeneration which is a representative retinal disease causing adult blindness.

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Abstract

본 발명은 황반변성 치료용 의약조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 mTOR 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 함유하는 황반변성 치료용 의약조성물에 관한 것이다. 성인 실명의 원인이 되는 대표적인 망막질환인 나이관련 황반변성을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

mTOR 저해제를 함유하는 황반변성 치료용 의약조성물
본 발명은 황반변성 치료용 의약조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 mTOR 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 함유하는 황반변성 치료용 의약조성물에 관한 것이다.
나이관련 황반변성(Age-Related Macular Degeneration;AMD)은 여러 선진국에서 65 세 이상의 인구에서 실명을 초래하는 가장 중요한 질병으로 자리잡고 있다. 본 질환은 모든 종류의 동물에서 시기능의 핵심적인 역할을 담당하고 있는 망막의 항상성 및 생리적인 기능 유지에 결정적인 역할을 하는 망막색소상피세포층(Retinal Pigment Epithelium; RPE)의 기능저하 및 연령의 증가에 의한 위축이 가장 중요한 원인이 되는 것으로 알려져 있으며, 그 외 RPE의 기저막 역할을 하는 브루크막(Bruch's Membrane)의 나이에 따른 변화로 인한 비정상적인 변화 및 RPE 및 신경망막의 가장 외측에 위치하며 광변환(phototransduction)이 일어나는 광수용체세포(photoreceptor cell)에 영양분 및 산소를 공급하는 역할을 수행하는 맥락막 모세혈관(Choriocapillaris)이 퇴화 등이 함께 작용할 것으로 생각되고 있다.
이와 같은 변화에 의하여 나타나는 표현형에 따라 나이관련 황반변성은 크게 두 가지로 분류되는데, RPE와 Bruch's membrane, Choriocapillaris의 퇴화 및 기능의 저하를 특징으로 하는 건성 황반변성(Dry AMD)과 Dry AMD의 양상에 맥락막에서 기원한 신생혈관(Choroidal neovascularization; CNV)를 동반하는 습성 황반변성(wet AMD)으로 분류된다.
Dry AMD의 경우는 RPE와 맥락막모세혈관 사이에 보체계 단백질과 apolipoprotein 종류의 단백질들이 축적되는 드루젠(drusen)의 발생을 특징적으로 나타내며, 아마도 이들의 존재가 맥락막모세혈관에서 산소 및 영양분의 이동을 방해하며, 드루젠의 발생 자체가 RPE 세포의 기능저하를 반영하는 것으로 결국 점점 더 산소의 부족과 물질이동의 방해, 그리고, 염증의 발생을 초래하게 되며, 결국, RPE 세포의 사멸을 초래하여 시간의 경과에 따라 RPE 조직의 광범위한 결손을 나타내는 지도상위축(geographic atrophy;GA)이 특징으로 나타난다.
이와 같은 표현형을 가지는 dry AMD에 대한 치료는 현재 특별한 것이 없으며, 단지 항산화 효과를 가지는 비타민과 미량원소 및 로테인 등의 건강식품으로 다소간의 진행을 느리게 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 최근 보체계(complement system 관련 단백질을 타겟으로 하는 다양한 임상연구가 진행되었으나, C3, C5 등을 타겟으로 한 연구들은 모두 실패하였으며, factor blockade를 위해 개발된 단클론항체 약제인 Lampalizumab(Roche사에서 개발) 가 임상2상에서 18 개월 동안 관찰한 결과 매달 1회의 유리체강내 주사를 통해 GA의 확대를 20% 억제하는 효과를 보여, 현재 3 상 연구가 진행되고 있다.
Wet AMD는 dry AMD의 환자들 중 5-10%에서 발생되며, 시력의 저하가 수년 혹은 십 내지 이십 년의 기간에 걸쳐 진행되는 dry AMD와 달리, 치료를 하지 않는 경우에, 수 개월 이내에 실명을 초래할 수 있는 급성형의 표현형을 보인다. 이 경우는 수망막하공간(subretinal space) 및 망막색소상피하 공간(subRPE space) 걸친 광범위한 산소분압 및 영양분의 저하, 즉 조직내 허혈(ischemia) 현상과 여기에 동반되는 염증반응이 중요한 역할을 수행하며, 그 외에서 산화 스트레스(oxidative stress), 면역학적 기전에서 중요한 역할을 하는 보체계가 역시, 작용하여, 맥락막신생혈관(CNV; Choroidal neovascularization)가 특징적으로 망막하 공간 혹은 망막색소상피하 공간에 발생하게 되어, 장액유출 및 출혈을 초래하게 된다.
맥락막신생혈관의 발생은 혈관내피세포(endothelial cell), RPE cell, 그리고 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage) 등의 염증세포(nflammatory cells)가 하는 것으로 알려져 있다. Wet AMD에 대한 치료는 2005년경부터 시작된 anti-VEGF antibody의 사용으로 많은 환자에서 실명을 감소시키고 있다. 이와 같은 약제의 사용은 맥락막신생혈관의 발생에 VEGF가 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 그러나, anti-VEGF antibody의 사용은 맥락막신생혈관의 형성 및 성장을 완벽하게 억제하지는 못하며, 특히, 맥락막신생혈관이 발생하는 망막의 중앙부인 중심와 부위의 광수용체세포는 아래에 존재하는 RPE 조직의 붕괴로 결국, 수년의 시간이 지나면, 기능을 잃어버리게 된다. 또한, anti-VEGF antibody를 사용하여도 맥락막신생혈관의 표면에 존재하는 endothelial cell에만 작용하므로 맥락막신생혈관의 크기는 줄지 않고 계속 증가하게 된다.
이런 배경에서 맥락막신생혈관의 발생에 관여하는 다양한 신호전달 체계들 중 VEGF 경로 이외의 경로를 대상으로 하는 약제의 개발이 반드시 필요하다고 할 것이다. 최근 Novartis사에서 anti-VEGF antibody가 효과적으로 혈관내피세포에 작용하는 것을 방해하는 주된 원인으로 생각되는 pericyte를 맥락막신생혈관의 endothelial cell에서 분리시켜, anti-VEGF antibody가 endothelial cell과 보다 잘 결합하게 하여 약제의 효과를 높이기 위한 목적으로 anti-PDGF 효과를 가지는 약제를 개발하고 있다.
한편, mTOR(mammalian target of rapamycin)은 세포의 증식과 자가포식에 중요한 역할을 담당하고 있으며, 악성종양의 치료에서 잠재적인 타겟으로 여겨지고 있어, 많은 연구자들에 의해 치료제 개발이 진행되고 있다. 주로 mTOR의 작용을 억제시켜 세포의 증식을 억제하고, 자가포식을 활성화시키는 것을 목적으로 사용되고 있다.
이에, 본 발명자들은 황반변성을 치료하는데 있어서, anti-VEGF antibody에 의한 효과로는 기대되지 않는 새로운 기전의 약제개발 타겟을 개발하고자 예의 노력한 결과, 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에 mTOR 저해제를 처리하는 경우, 황반변성의 병변 크기가 감소되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 새로운 기전의 약제기전 타겟을 가지는 황반변성 치료용 의약 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 siRNA를 함유하는 황반변성 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 mTOR 저해능을 가지는 shRNA(shRNA-mTOR)가 도입되어 있는 재조합벡터를 함유하는 황반변성 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 siRNA를 환자에 처리하는 것을 특징으로 하는 황반변성의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1어느 하나의 염기서열로 표시되는 mTOR 저해능을 가지는 shRNA(shRNA-mTOR)가 도입되어 있는 재조합벡터를 환자에 처리하는 것을 특징으로 하는 황반변성의 치료방법을 제공한다.
도 1은 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에서 shRNA를 투여한 후, 맥락막신생혈관 형광누출이 감소된 것을 형광안저혈관조영으로 확인한 것으로, (A)는 황반변성 유도, shRNA의 투여 및 형광안저혈관조영 스케쥴을 나타낸 것이고, (B-D)는 shRNA 투여 전 형광안저혈관조영 결과를 나타낸 것이며, (E-G)는 shRNA 투여 후 형광안저혈관조영 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 scAAV 벡터를 유리체내로 주입한 후, 상기 벡터가 도입된 세포 및 mTOR의 발현 변화를 나타낸 사진으로, (a)는 벡터가 도입된 세포를 나타낸 것이고, (b)는 mTOR의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에서 shRNA를 투여한 후, CD31의 발현 변화를 확인한 것으로, (a) 및 (b)는 망막색소상피-맥락막 복합체 조직 표본에서 확인한 사진(a) 및 그래프(b)이고, (c)는 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체 조직 표본에서 확인한 사진이다.
도 4는 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에서 shRNA를 투여한 후, 염증세포의 변화를 확인한 그래프로, (a)는 CD11b 양성 세포를 나타낸 것이고, (b)는 F4/80 양성 세포를 나타낸 것이다.
도 5는 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에서 shRNA를 투여한 후, 자가포식의 변화를 확인한 사진으로, (a)는 LC3B 양성 세포를 나타낸 것이고, (b)는 ATG7 양성 세포를 나타낸 것이다.
도 6은 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에서 shRNA를 투여한 후, 세포사멸의 변화를 확인한 사진(a) 및 그래프(b)이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명에서는 망막색소상피세포층의 기능저하 및 노화에 의한 위축에 의하여 발생하는 나이관련 황반변성을 기존의 항 VEGF 항체를 이용한 방법에 의한 신생혈관 억제 기작 이외의 다른 기작으로 치료하고자 하였으며, 세포증식과 자가포식에 중요한 역할을 담당하는 단백질인 mTOR의 작용을 억제시키는 경우, 황반변성 치료효과가 있는지 확인하였다. 이를 위하여, 레이저유발 황반변성 동물모델에 shRNA 기반 mTOR 저해제를 처리하는 경우, 치료군에서 의미있는 병변의 크기 감소를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 siRNA를 함유하는 황반변성 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 siRNA는 mTOR의 저해제로 작용하는 siRNA로, mTOR의 저해는 나이관련 황반변성(AMD)에서 맥락막신생혈관(CNV)의 형성에 관여하는 다양한 종류의 염증세포의 유입 및 증식을 차단할 수 있을 것을 생각되며, 이 부분은 anti-VEGF antibody에 의해서는 나타날 수 없는 효과로, 새로운 기전의 약제개발 타겟이 될 수 있다. mTOR 저해를 통해 맥락막신생혈관의 또 다른 주된 구성원인 혈관내피세포(endothelial cell)의 증식을 억제할 뿐만 아니라 자가포식(autophagy)을 활성화 시킨다. 또한 신경망막 조직에 존재하는 신경세포의 세포사멸(apoptosis)을 개선시킨다
본 발명에서 사용되는 siRNA의 서열은 다음과 같다.
서열번호 1: GAAUGUUGACCAAUGCUAU
본 발명에서 사용되는 shRNA 기반의 mTOR 저해제는 최초 개발 당시, 악성종양의 세포에서 자가포식(autophagy) 활성화를 매개하는 것이 알려졌으며, 본 발명에서는 황반변성 동물모델을 통하여 자가포식의 활성화를 병변 및 병변주위에서 확인하였다.
본 발명의 일양태에서는, 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에서 치료를 하지 않은 생리식염수 대조군 및 비특이적 shRNA 대조군과 비교하였을 때, mTOR shRNA 실험군에서는 유의미한 병변의 크기 감소가 확인되어 황반변성에 대한 치료효과가 확인되었다(도 1 및 도 3).
본 발명의 다른 양태에서는, mTOR shRNA를 투여한 맥락막신생혈관 병변주위에서 염증세포의 수가 감소되며, 세포사멸이 또한 감소되는 것을 확인하였으며, 이는 shRNA 기반의 mTOR 저해가 단순하게 맥락막신생혈관의 크기를 줄이는 기능 이외에 염증반응의 개선 및 주변 신경망막 조직에 존재하는 신경세포의 사멸화 과정을 개선시키는 결과를 나타낸다는 것을 의미한다(도 4 및 도 6).
본 발명에서 사용되는 siRNA는 당업계에 공지된 RNA 분자의 제조방법에 따라 제조할 수 있다. RNA 분자의 제조방법으로는 화학적 합성 방법 및 효소적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, RNA 분자의 화학적 합성은 문헌에 개시되어 있는 방법을 사용할 수 있으며(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999), RNA 분자의 효소적 합성은 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 파아지 RNA 폴리머라제를 이용하는 방법이 문헌에 개시되어 있다(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180: 51-62, 1989).
본 발명에서 mTOR에 대한 siRNA를 전달하기에 유용한 바이러스 또는 바이러스 벡터로는 바쿨로비리디애(baculoviridae), 파르보비리디애(parvoviridae), 피코르노비리디애(picornoviridae), 헤레페스비리디애(herepesviridae), 폭스비리디애(poxviridae), 아데노비리디애(adenoviridae) 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 mTOR 표적 siRNA를 약학조성물로 사용할 경우에는 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 2.0 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　
또한, 이러한 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
다른 관점에서 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 mTOR 저해능을 가지는 shRNA(shRNA-mTOR)가 도입되어 있는 재조합벡터를 황반변성 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 siRNA 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 mTOR 저해능을 가지는 shRNA(shRNA-mTOR)가 도입되어 있는 재조합벡터를 환자에 처리하는 것을 특징으로 하는 황반변성의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 mTOR에 대한 siRNA를 전달하기에 유용한 바이러스로는 아데노 부속 바이러스(Adeno Associated Virus, AAV)를 이용하는 것이 가장 바람직하다. 아데노부속 바이러스는 면역반응과 세포독성을 거의 유발하지 않는다. 특히, 아데노 부속 바이러스 혈청형2(serotype 2)는 CNS의 신경세포로 효율적인 유전자 전달을 할 수 있으며, 또한 신경계에서 형질전환 유전자(transgene)를 효과적으로 장기간 발현할 수 있다.
또한, 본 발명에서 mTOR에 대한 siRNA를 전달하기에 유용한 비바이러스 벡터로는 전술한 바이러스 벡터를 제외한 통상적으로 유전자 요법에 사용되는 모든 벡터를 포함하며, 예를들어 진핵세포에서 발현 가능한 다양한 플라스미드 및 리포좀 등이 있다.
한편, 본 발명에서 mTOR을 표적으로 하는 siRNA는 전달된 세포에서 적절히 전사되기 위하여 적어도 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 상기 프로모터는 진핵세포에서 기능할 수 있는 프로모터라면 어떤 것이든지 무방하나, 사람 H1 폴리머라제-III 프로모터가 보다 바람직하다. mTOR을 표적으로 하는 siRNA의 효율적인 전사를 위하여 필요에 따라 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로모터, 인핸서, 업스트림 활성화 서열, 신호 펩타이드 서열 및 전사 종결인자를 비롯한 조절서열을 추가로 포함할 수도 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 레이저유발 맥락막신생혈관(laser-induced choroidal neovascularization, CNV) 황반변성 모델의 제작
나이관련 황반변성 동물모델을 수립하기 위하여 동물의 안구에 레이저를 시술하여 맥락막신생혈관을 유도하였다. 8주령의 수컷 C57/BL6 마우스를 40 mg/kg zolazepam/tiletamine 및 5 mg/kg xylazine으로 마취시킨 후 0.5% tropicamide 및 2.5% phenylephrine으로 동공을 확장시켰다. 맥락막신생혈관(CNV)을 유도하기 위하여 PASCAL diode ophthalmic laser system(Nd:YAG, 532nm, Topcon Medical Laser Systems, Inc., Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 마우스의 오른쪽 눈에 레이저광응고화(laser photoagulation, LP)를 일으켰다. 시신경원반(optic nerve head) 주위로 다섯 내지 여섯 개의 지점에 레이저를 조사한 후 레이저 조사 지점에서 공기방울이 생성되는 것을 보고 브루크막의 파열을 확인하였다. 맥락막신생혈관의 형성은 도 1 B-D에 나타난 바와 같이, 레이져 조사 5일 후 형광안저혈관조영을 통해 확인할 수 있었다.
실시예 2: mTOR shRNA의 도입 및 이를 통한 mTOR 발현 저해 확인
2-1: scAAV 벡터 제작 및 이의 유리체 내 주입
본 실시예에서는 scAAV2(self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector)에서 유래된 벡터를 사용하였다. 마취상태에서 레이저광응고화를 유도하고 6일 후에 마우스 오른쪽 눈의 동공을 확장시키고 유리체내로 벡터를 주입하였다. 벡터의 주입은 35 게이지 굵기에 끝이 뭉툭한 바늘을 가진 나노필 주사기를 사용하였으며, 5.0×1010 viral genomes(vg)/ml의 농도로 1 ㎕를 주입하였다. 표 1에 나타난 바와 같이 맥락막신생혈관이 형성된 마우스를 15마리씩 3개의 그룹으로 나누어 생리식염수, 비특이 shRNA, 또는 서열번호 1의 mTOR shRNA를 유리체내로 주입하였다. 5마리의 마우스는 맥락막신생혈관과 유리체내 주입을 시행하지 않고 음성대조군으로 하였다.
그룹 처치내용
대상군 1(shRNA-mTOR 실험군) 레이저유발 맥락막신생혈관 형성＋AAV-mTOR shRNA/GFP 주사
대상군 2(shRNA-비특이 대조군) 레이저유발 맥락막신생혈관 형성＋AAV-비특이 shRNA/GFP 주사
대상군 3(생리식염수 대조군) 레이저유발 맥락막신생혈관 형성＋생리식염수 주사
대상군 4(음성대조군) 처치 없음
2-2: scAAV 벡터 도입 세포의 확인
유리체내로 주입된 scAAV 벡터가 어떤 종류의 세포에 도입되었는지 확인하기 위해 GFP를 코딩하는 유전자가 삽입된 scAAV 벡터를 이용하였다. 실시예 2-3에 기술한 바와 같이 동결절편표본을 제작하였고, anti-GFP 항체(abcam, Cambridge, MA)를 이용하여 GFP 발현을 조사한 결과, inner retinal cells 뿐만 아니라 CD31 양성 혈관내피세포에서 발현되는 것으로 나타났다(도 2a). scAAV 벡터는 야생형의 마우스 망막의 경우 retinal ganglion cell 및 inner nuclear layer에 위치한 세포를 포함하여 inner retinal cell에 도입되는 것으로 알려져 있는데(Lee SH et al., Hum Gene Ther Methods 25:159-61, 2015), 레이저 유발 맥락막신생혈관이 형성되는 경우에는 CD31 양성 혈관내피세포에도 도입되는 것으로 나타났다. 이는 황반변성이 발생한 경우 scAAV 벡터를 이용하여 혈관내피세포를 타겟한 치료가 가능하다는 것을 의미한다.
2-3: 조직 표본 제작
면역형광염색을 위한 조직 표본 제작은 다음과 같은 절차를 거쳤다. 동물을 마취한 후 150 U/ml heparin이 함유된 0.1 M PBS를 심장을 관통하여 관류시키고 이어서 4% paraformaldehyde/0.1 M PB를 흘려주었다. 고정된 안구를 적출한 후 각막 및 수정체가 포함된 안구앞부분(anterior segment)을 제거하였다. 이렇게 제작된 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체 조직 표본을 4% parafomaldehyde/0.1 M PB에서 추가 고정하였다. 동결절편표본을 제작하기 위하여 고정된 조직을 30% sucrose/PBS로 옮겨 잠긴 채로 하룻밤동안 두었다. 이후 OCT compound(Sakura Finetek, Torrance, CA)에 함몰시킨 동결상태에서 10 ㎛ 두께의 시상절단(sagittal section) 절편을 만들어 현미경용 슬라이드에 부착시켰다.
2-4: mTOR shRNA에 의한 mTOR 발현 저해 확인
서열번호 1의 mTOR shRNA가 삽입된 scAAV 벡터를 유리체내로 주입한 후 mTOR 발현을 조사하였다. mTOR의 발현은 실시예 2-3에 기술한 바와 같이 제작된 동결절편표본에 anti-mTOR 항체(1:200; R&D Systems, Minneapois, MN, AF15371)를 사용하여 면역형광염색하였다. 레이저가 조사되지 않은 음성대조군의 경우에 mTOR의 발현이 관찰되지 않으나 레이저 조사에 의해 맥락막신생혈관이 형성된 경우에는 신경망막(neural retina) 및 망막하(subretinal) 부위에서 그 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 이 mTOR 발현은 생리식염수 또는 비특이 shRNA에 의해 변하지 않으나, mTOR shRNA에 의해 감소되는 것으로 나타나 상기 서열이 mTOR 발현 저해에 효과적임이 확인되었다(도 2).
실시예 3: mTOR shRNA의 황반변성에 대한 치료효과 확인
서열번호 4의 mTOR shRNA가 황반변성 동물모델에서 치료 효과를 나타내는지 알아보기 위하여, 맥락막신생혈관 황반변성 동물모델에 실시예 2에 기재된 바와 같이 mTOR shRNA가 삽입된 scAAV 벡터를 유리체 내로 주입하여 shRNA에 의한 치료효과를 실시예 3-1 내지 3-5에서 확인하였다.
3-1: mTOR shRNA에 의한 맥락막신생혈관의 형광누출 감소 효과 확인
형광안저혈관조영(Fundus Fluorescein Angiography, FFA)을 이용하여 맥락막신생혈관의 형광누출을 측정하였다. 형광안저혈관조영은 Scanning laser ophthalmoscope(Heidelberg Retina Angiograph 2; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany) 기기를 이용하였다. 마취상태에 있는 마우스에 2% fluorescein sodium 0.1 ml을 복강내로 주입하고 3 내지 5분을 기다렸다가 동공을 산동시킨 후 FFA image를 얻었다. 맥락막신생혈관이 제대로 형성된 것을 레이저 조사 5일 후 확인하였고, 이후, 실시예 2-1에 기술한 바와 같이 유리체내로 scAAV-mTOR shRNA 주입하고 7일후(레이저 조사 13일 후) 치료효과를 검사하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 생리식염수 또는 비특이 shRNA 처치 시에는 병변부위에서 형광누출의 변화가 없으나, mTOR shRNA 처치 시 형광누출이 감소되는 것으로 나타나, mTOR shRNA에 의한 mTOR 저해는 황반 변성 치료에 효과가 있다는 것이 확인되었다.
3-2: mTOR shRNA에 의한 혈관 성장의 저해 확인
mTOR shRNA가 맥락막신생혈관의 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 혈관내피세포를 선택적으로 확인할 수 있는 anti-CD31 항체(1:200; BD Pharmingen, Inc., San Diego, CA, 550274)를 사용하여 혈관내피세포를 관찰하였다. 면역형광염색을 위한 조직 표본 제작은 다음과 같은 절차를 거쳤다. 동물을 마취한 후 150 U/ml heparin이 함유된 0.1 M PBS를 심장을 관통하여 관류시키고 이어서 4% paraformaldehyde/0.1 M PB를 흘려주었다. 고정된 안구를 적출한 후 각막 및 수정체가 포함된 안구앞부분(anterior segment)을 제거하였다. 망막색소상피세포층 조직 표본(RPE whole mount)을 제작하기 위하여 신경망막(neural retina)을 추가로 제거하여 망막색소상피-맥락막 복합체를 만들고 4% paraformaldehyde/0.1 M PB에서 추가 고정하였다. 또한, 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체 조직 표본을 제작하기 위하여 안구앞부분을 제거하고 신경망막이 부착된 상태로 4% parafomaldehyde/0.1 M PB에 추가 고정하였다. 이렇게 제작된 망막색소상피-맥락막 복합체 또는 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체는 동결절편표본을 제작하기 위하여 30% sucrose/PBS로 옮겨 잠긴 채로 하룻밤이 지난 뒤 OCT compound(Sakura Finetek, Torrance, CA)에 함몰시키고 동결상태에서 10 ㎛ 두께의 시상절단(sagittal section) 절편을 만들어 현미경용 슬라이드에 부착시켰다.
망막색소상피-맥락막 복합체 절편을 anti-CD31 항체와 phalloidin(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, A22287)로 염색한 결과, 생리식염수 또는 비특이 shRNA를 주입한 경우에 비하여 mTOR shRNA에 의해 맥락막신생혈관 영역이 유의미하게 감소되는 것으로 나타났으며(도 3) 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체 절편을 조사한 결과에서도 mTOR shRNA가 도입되어 GFP를 발현하는 세포 중에서 CD31 양성 세포가 감소된 것으로 확인되었다(도 3).
이는 mTOR shRNA가 혈관내피세포에 작용하여 혈관 성장을 저해하고 황반 변성 치료 효과를 나타낸다는 것을 보여준다.
3-3: mTOR shRNA에 의한 항염증 효과 확인
mTOR 저해에 의한 황반변성의 개선이 염증세포 활성의 조절을 통해 일어나는 것인지 알아보기 위하여, 대식세포 및 단핵구를 선택적으로 염색하는 anti-CD11b 항체(1:200; Serotec, Oxford, UK, MCA711G) 및 anti-F4/80 항체(1:200; Serotec, Oxford, UK, MCA497GA)를 이용하여 망막 횡단면을 염색하였다. 면역형광염색을 위한 조직 표본 제작은 실시예 3-2에 기술된 바와 같이 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체 조직 표본을 제작하였다.
대식세포 및 단핵구의 세포수의 측정은 5편의 망막 횡단면 절편에서 CD11b 및 F4/80 양성 세포를 세었다. 수치는 평균값 ± 평균의 표준오차로 산술하고, SPSS 소프트웨어(ver. 20.0 for Windows; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 통계분석(Kruskal-wallis test, posthoc analysis, Bonferroni's mehtod)하여, p<0.05를 기준으로 유의미한 수준을 판단하였다.
망막하 및 망막내에서 관찰되는 CD11b 및 F4/80 양성 염색 세포의 수를 측정한 결과, 생리식염수 또는 비특이 shRNA를 주입한 경우에 비하여 mTOR shRNA의 경우 유의미하게 감소되어있는 것으로 나타났다. 즉, 망막으로 유입된 F4/30 양성 염증세포의 수는 생리식염수 또는 비특이 shRNA 주입 시 84.4 ± 17 또는 82.8 ± 10.0이나 mTOR shRNA 주입 시 42.4 ± 10.4로 감소되었으며, CD11b 양성 염증세포 수의 경우에도, 123.8 ± 13.0 또는 127.6 ± 14.4에서 90.0 ± 11.6로 감소된 것으로 나타났다(도 4).
이는 mTOR shRNA에 의한 mTOR 저해는 염증세포의 망막내 유입 및 증식을 감소시킴으로서 황반 변성에 대한 치료효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
3-4: mTOR shRNA에 의한 자가포식(autophagy) 증가 확인
mTOR shRNA에 의해 맥락막신생혈관의 병변이 감소되는 것에 자가포식이 관여하는지 알아보기 위하여 자가포식을 선택적으로 확인할 수 있는 anti-LC3 항체(1:200; Novus Biologicals, Littleton, CO, NB110-2220) 및 anti-ATG7 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하였다. 면역형광염색을 위한 조직 표본 제작은 실시예 3-2에 기술된 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체 조직 표본의 제작과정을 따랐다. 그 결과, 생리식염수 또는 비특이적인 shRNA를 주입한 경우 LC3B 또는 ATG7 양성 세포가 관찰되지 않았으나, mTOR shRNA를 주입한 경우 병변부위 및 주위에서 관찰되어 mTOR shRNA에 의해 자가포식이 증가되는 것으로 나타났다(도 5).
이는 mTOR shRNA에 의한 mTOR 저해는 자가포식을 증가시킴으로서 황반 변성에 대한 치료효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
3-5: mTOR shRNA에 의한 세포사멸(apoptosis) 감소
레이저 유발 맥락막신생혈관에서 mTOR shRNA가 세포사멸에 미치는 영향을 조사하기 위하여 TUNEL(terminal dUTP nick-end labeling)을 수행하였다. 면역형광염색을 위한 조직 표본 제작은 실시예 3-2에 기술된 신경망막-망막색소상피-맥락막 복합체 조직 표본의 제작 과정을 따랐다. 레이저 조사 14일 후 관찰한 결과, 생리식염수, 비특이 shRNA, 및 mTOR shRNA를 처치한 모든 대상군에서 TUNEL 양성 세포가 outer nuclear layer(ONL) 및 CNV에서 발견되었다. 생리식염수 또는 비특이 shRNA를 주입한 경우에 비하여 mTOR shRNA의 경우 ONL 영역에서 TUNEL 양성 세포가 유의미하게 감소된 것으로 나타났다. 즉, TUNEL 양성 세포의 수는 생리식염수 또는 비특이 shRNA 주입 시 17.8 ± 4.8 또는 19.4 ± 4.0이나 mTOR shRNA 주입 시 8.4 ± 3.0으로 감소된 것으로 나타났다(도 6).
이는 mTOR shRNA에 의한 mTOR 저해는 outer nuclera layer에 위치한 세포를 감소시킴으로서 황반 변성에 대한 치료효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
종합하면, 도 1 및 도 3에 나타난 바와 같이, 레이저유발 맥락막신생혈관 황반변성 모델에서 치료를 하지 않은 생리식염수 대조군 및 비특이적 shRNA 대조군과 비교하였을 때, mTOR shRNA 실험군에서는 유의미한 병변의 크기 감소가 확인되어 황반변성에 대한 치료효과가 확인되었다.
또한, 도 4 및 6에 나타난 바와 같이, 맥락막신생혈관 병변주위에서 염증세포의 수가 감소되며, 세포사멸이 또한 감소되는 것이 두 가지 대조군과 비교하여 관찰되었으며, 이는 shRNA 기반의 mTOR 저해가 단순하게 맥락막신생혈관의 크기를 줄이는 기능 이외에 염증반응의 개선 및 주변 신경망막 조직에 존재하는 신경세포의 사멸화 과정을 개선시키는 결과를 나타낸다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따르면, 성인 실명의 원인이 되는 대표적인 망막질환인 나이관련 황반변성을 효과적으로 치료할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (3)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 siRNA를 함유하는 황반변성 치료 또는 예방용 약학조성물.
  2. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 mTOR 저해능을 가지는 shRNA(shRNA-mTOR)가 도입되어 있는 재조합벡터를 함유하는 황반변성 치료 또는 예방용 약학조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합벡터는 AAV인 것을 특징으로 하는 황반변성 치료 또는 예방용 약학조성물.
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