KR100599456B1

KR100599456B1 - ＨＩＶｐｓｉ에 대한 결합력이 증가된 ＮＣ 돌연변이체및 이를 함유하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100599456B1
Application number: KR1020040060514A
Authority: KR
Inventors: 유지창; 이병욱
Original assignee: 유지창
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2006-07-13
Also published as: KR20060011602A

Abstract

본 발명은 HIV psi에 대한 결합력이 증가된 NC 돌연변이체 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 있어서, 24번째 및 41번째 아미노산이 각각 발린(valine)과 글리신(glycine)으로 치환되거나 37번째부터 55번째까지의 아미노산이 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 HIV의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NC)의 경쟁적 저해제로 작용하여 야생형 NC와 psi의 결합을 억제함으로써 HIV의 조립을 저해한다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 HIV에 의한 감염증을 치료 또는 예방하는 항-HIV 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

HIV NC, Psi, 결합력, 돌연변이

Description

ＨＩＶｐｓｉ에 대한 결합력이 증가된 ＮＣ 돌연변이체 및 이를 함유하는 약학적 조성물{NC mutants having an enhanced binding activity to HIV psi and pharmaceutical composition comprising the same}

도 1은 DNA 셔플링(shuffling)에 의해 돌연변이가 유발된 NC 유전자를 함유하고 있는 콜로니를 psi-lacZ 융합 어세이를 통하여 선별하는 과정을 나타낸 것이다.

A: 1차 스크리닝 과정을 나타낸 사진

WtNC: 야생형 NC 유전자를 함유하고 있는 형질전환 대장균

NC2, NC3 및 NC3: 변이형 NC 유전자를 함유하고 있는 형질전환 대장균

B: 1차 스크리닝에서 선별된 화이트 콜로니를 배지에 다시 스트리킹(streaking)하여 완전한 화이트 콜로니를 재선별한 2차 스크리닝 과정을 나타낸 사진

도 2는 His-태깅(tagging)을 통하여 정제된 변이형 NC 폴리펩티드들을 확인하기 위하여 17.5% SDS-PAGE를 수행한 결과이다.

M: 분자량 사이즈 마커

NC2, NC6 및 NC3: 변이형 NC 폴리펩티드

도 3은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 HIV의 psi에 대한 결합력을 풀-다운 어세이로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

1/10 input: 방사성 동위원소로 표지된 Psi RNA 양의 1/10을 겔에 로딩한 경우(탐침만을 로딩한 경우)

Bead:: 니켈-결합 비드(Ni-conjuagted bead)

W/T NC(100nM): 야생형 NC 폴리펩티드

NC5(100nM): 본 발명에 따른 NC5 폴리펩티드

NC6(100nM): 본 발명에 따른 NC6 폴리펩티드

본 발명은 HIV Psi에 대한 결합력이 증가된 NC 단백질 돌연변이체 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 있어서, 24번째 및 41번째 아미노산이 각각 발린(valine)과 글리신(glycine)으로 치환되거나 37번째부터 55번째까지의 아미노산이 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

AIDS(Acquired Immunodeficiency Syndrome, 후천적 면역 결핍증)을 일으키는 병원체인 HIV(Human Immunodeficiency Virus)는 사람의 면역세포 중 CD4+ T 세포에 선택적으로 침입하고 증식하여 바이러스의 출아 및 바이러스 env 당단백의 삽입에 대항하는 CD4+ T 세포를 용해시키거나, 새로이 합성되거나 재활용되는 CD4+ T 세포와 바이러스 gp120의 세포 간 결합을 저해한다. 뿐만 아니라, CD8+를 발현하는 세포독성 T 세포 및 항체 의존성 세포의 독성, 흉선에서의 CD4+ T 세포의 성숙, CD4+ T 세포와 항원-발현세포상의 class Ⅱ MHC의 결합, 대식세포(macrophages) 및 자연살세포(natural killer cells)의 작용 등을 방해함으로써, T 세포 및 B 세포에 의한 사람의 면역체계를 파괴한다.

현재까지, 체내로 침입된 HIV를 공격하기 위하여, AZT(azidothymidine), ddI(dideoxyinosine) 등의 HIV 역전사 효소(reverse transcriptase)에 대한 억제제 및 HIV 단백질 분해효소(protease) 억제제가 개발되었으며, 최근에는 HIV의 단백질을 암호화하는 유전자를 이용한 DNA 백신(Hinkula et al., Vaccine, 15: 874-878, 1997; Calarota et al., Lancet, 351: 1320-1325, 1998) 또는 HIV-1의 부속 유전자인 net 등을 제거시킨 약독화 HIV를 이용한 백신(Kestler Jeang, Science, 270: 1219-1222, 1995; Chakrabarti et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:9810-9815, 1996)의 사용 가능성이 연구되고 있다.

그러나, 상기 치료제들은 인간의 면역세포 염색체 내에 바이러스 DNA가 삽입되어 있는 프로바이러스(provirus) 상태의 HIV 또는 프로바이러스를 가지고 있는 인간의 면역세포를 선별적으로 제거할 수 없으므로, 변이성에 의한 새로운 돌연변이 HIV가 생성되어 약제 내성을 쉽게 획득하거나, 약독화 바이러스 백신의 사용 시 에도 재조합에 의한 복귀변이체 HIV의 생성으로 원래 형질을 획득할 수 있는 가능성이 제기되고 있다(Berkhout et al., J. Virol., 73: 1138-1145, 1999). 또한 최근에는 HIV가 숙주세포의 수용체인 CD4+ 분자뿐만 아니라, T 세포 친화적(T-tropic)인 CXCR4/fusin 또는 M 세포 친화적인 CCR5 등의 조수용체(coreceptor)를 필요로 한다는 사실이 밝혀짐으로써(Feng et al., Science, 272: 872-877, 1996), 숙주세포의 수용체와 HIV의 결합을 억제하여 AIDS를 치료하고자 하는 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 수용체는 정상적인 염증반응에도 관여하는 케모카인(chemokine) 수용체로도 작용하므로, 이를 표적대상으로 하는 경우 심각한 부작용이 예상된다(Murphy P. M., Ann. Rev. Immunol., 12: 593-633, 1994). 따라서 숙주세포의 면역반응 또는 수용체와 관련된 생리활성에 영향을 주지 않으면서도 HIV에 선택적인 치료 효과를 나타내는 항-HIV 제제의 개발이 요구되고 있다. 바이러스 조립(assembly)에 관여하는 HIV의 인자들의 선택적인 상호작용이 이러한 개발의 표적으로 대두되고 있다. 그러나 이에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다.

이에 본 발명자들은 HIV의 바이러스 조립을 저해하는 항-HIV 제제를 개발하기 위하여 연구를 거듭하던 중, HIV의 바이러스 조립에 필요한 포장 염기서열(packaging sequence)에 대한 결합력이 HIV 야생형 NC에 비해 현저히 높은 변이형 NC 폴리펩티드를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 HIV의 바이러스 조립을 저해하는 항-HIV 제제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HIV의 psi와 높은 결합력을 가지는 폴리펩티드를 제공한다.

구체적으로 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 HIV의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 폴리펩티드에 있어서, 24번째 및 41번째 아미노산이 각각 발린(valine)과 글리신(glycine)으로 치환되거나 37번째부터 55번째까지의 아미노산이 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 제공한다.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

나아가, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드 및 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 HIV 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

HIV의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, 이하 'NC'라 함)는 HIV의 생식 (reproduction)의 거의 모든 과정에 필수적인 역할을 수행하는 단백질이다. 특히, 바이러스 조립시 HIV는 바이러스 게놈 RNA만을 선별적으로 포장(packaging)하여 나오는데, 이러한 포장은 상기 NC와 HIV 게노믹 RNA의 5' 말단의 LTR(long terminal repeat)에 존재하는 'psi'라고 불리는 4개의 스템-루프(stem-loop) 구조를 갖는 포장 염기서열(packaging sequence) 간의 상호작용에 의해 이루어진다(Lever A. et al., J. virol., 63: 4085-4087, 1994; Aldovini A. et al., J. Virol., 64: 1920-1926, 1993; Luban J. et al., J. Virol., 65: 3203-3212, 1991; Feng YX. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7577-7581, 1996). 그러므로 HIV의 NC와 psi 간의 상호작용을 저해하면 HIV가 제대로 조립될 수 없어 HIV에 의한 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 HIV의 NC와 psi 간의 상호작용을 저해하는 항-HIV 제제(anti-HIV agent)를 제공한다.

구체적으로 본 발명에서는 DNA 셔플링(shuffling)에 의해 HIV의 야생형 NC의 변이형 폴리펩티드들을 제조하고(도 1 참조), 이들 중 HIV의 psi에 대하여 야생형 NC 보다 더 강한 결합력을 나타내는 폴리펩티드를 선발하였다(도 3 및 표 2 참조). 본 발명에 따른 폴리펩티드는 야생형 NC의 경쟁적 저해제로서 작용하여 야생형 NC와 psi 간의 결합을 저해할 수 있으며, 이를 통해 HIV가 조립되지 못하도록 할 수 있다.

본 발명에서 제공되는 폴리펩티드는, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 HIV의 야생형 NC에 있어서, 24번째 및 41번째 아미노산이 각각 발린(valine)과 글리신(glycine)으로 치환되거나 37번째부터 55번째까지의 아미노산이 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드이다. 바람직하게 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 서열번호 6로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명자들은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 'NC5'로, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 'NC6' 으로 명명하였다.

또한 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 8 또는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 가진다. 본 발명에 따른 핵산은 적절한 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 여기서, "발현 벡터"라 함은 본 발명의 핵산이 삽입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 상기에서 세포는 효모, 식물 세포와 같은 진핵세포 또는 대장균과 같은 원핵세포일 수 있으며, 세포의 종류에 특별히 한정 받지 않는다. 바람직하게는 대장균일 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 전기천공법(electroporation), 초음파 처리(sonication), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 HIV의 psi와 특이적으로 결합하여 HIV의 야생형 NC 와 psi 간의 상호작용을 억제함으로써 HIV의 조립을 저해한다. 그러므로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 HIV에 의한 감염증의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 HIV에 의한 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 상기에서 'HIV에 의한 감염증'은 HIV의 감염에 의해 유발되는 질환을 의미한다. 상기 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 림프절병증(lymphadenopathy), 기회감염(Opportunistic infection), CNS 질환(CNS diseases), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 및 AIDS를 포함한다(Vaishnav YN., et al., Annual Review of Biochemistry, 60: 577-630, 1991; Bakshi R., Frontiers in Bioscience. 9: 632-46, 2004; Knowles DM., et al., European Journal of Cancer., 37(10): 1236-1250, 2001). 바람직하게는 AIDS일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 약학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 이외에 상기 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 각종 제형의 형태로 제조될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer)등의 형태로 제조할 수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.1 ㎍ 내지 10 ㎎, 바람직하게는 1 ㎍ 내지 1 ㎎의 유효 용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나, 상기 폴리펩티드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 폴리펩티드의 HIV에 의한 감염증의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물은 본 발명에 의한 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한 본 발명에 따른 HIV에 의한 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유할 수 있다. 즉, 본 발명의 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 삽입시킨 후, 상기 발현 벡터를 감염(infection) 또는 형질도입(transduction) 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시켜 HIV에 의한 감염증에 대한 유전자 치료에 사용할 수 있다.

플라스미드 발현 벡터를 이용한 유전자 전달 방법은 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서, FDA로부터 승인받은 사람에게 사용할 수 있는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249: 1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입, 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감 염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법, 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267: 963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263: 14621-14624, 1988).

또한, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등이 포함된다.

상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 357: 455-460, 1992). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6: 2895-2902, 1986).

비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld et al., Cell, 68: 143-155, 1992; Jaffe et al., Nature Genetics, 1: 372-378, 1992; Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1: 379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 HIV에 의한 감염증을 치료하기 위한 유효량으로 표적세포 내로 직접 주사할 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 약학적 조성물을 혈액순환계 내로 투여할 수 있다.

본 발명의 핵산을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제로는 분산제, 습윤제, 현탁제, 희석제 및 충진제가 포함된다. 특정의 약학적으로 허용되는 담체와 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 발현벡터의 비율은 조성물의 용해도와 화학적 성질, 특정의 투여방식 등에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 약학적 조성물의 치료학적 또는 예방학적 유효량은 투여대상, 연령, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 10 ㎎, 보다 바람직하게는 1 ㎍ 내지 1 ㎎일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

NC 유전자의 DNA 서플링(suffling)

본 발명자들은 Taq DNA 중합효소가 가지는 돌연변이 생산 속성을 역이용하여 HIV의 NC 유전자에 무작위적 돌연변이를 도입하였다.

단계 (a): 먼저 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 HIV-1 NC를 암호화하는 유전자를 함유하는 pJC1 벡터(You J.C., et al., J. Biol. Chem., 269: 31491-31495, 1994)를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이 때 프라이머로는 서열번호 2로 기재되는 NCSTAR-BGL 프라이머와 서열번호 3으로 기재되는 NCSTOP-PST 프라이머를 이용하였다. PCR 수행시 Taq DNA 중합효소의 서열 충실도(fidelity)를 저하시켜 돌연변이 유발율(약 300-500개/10⁶개)을 증가시키기 위해 PCR 반응 혼합물에 Mg²⁺를 고농도(2 mM, 3 mM 및 4 mM)로 첨가하였다. 구체적인 PCR 반응 혼합물(총 100㎕)의 조성은 다음과 같다: 주형 DNA인 pJC1 벡터 0.1 ㎍, 1.25 unit의 Taq 중합효소, 2, 3 또는 4 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1 mM KCl 및 200 nM 프라이머. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 94℃에서 2분 동안 가열하여 주형 DNA를 전-변성시킨 후, 94℃에서 1분; 46℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 한 싸이클(cycle)로 하여 총 30회 반복 수행. 상기의 조건으로 PCR을 수행함으로써 Taq DNA 중합효소의 돌연변이 유발율을 약 3000-5000개/10⁶개로 증가시켰다.

단계 (b): 상기에서 얻은 PCR 산물 2-4 ㎍에 0.0015 unit의 DNaseⅠ을 25℃에서 10-20분 동안 처리하여 PCR 산물을 무작위로 절단하였다(절단되는 DNA 절편의 크기=30 bpㅁ 20bp). 절단된 PCR 산물을 2% 저융해 아가로스 겔(low melting agarose gel)상에 전기영동한 후 BIO101 키트(BIO101)를 이용하여 제조사의 권장방법에 따라 분리·정제하였다.

단계 (c): 겔로부터 정제된 각 DNA 절편 10-30 ng/㎕을 주형으로 하여 프라이머 없이 PCR을 수행하였다. 2.5 unit의 Taq DNA 중합효소와 4 mM MgCl₂를 사용한 것을 제외하고는 상기 단계 (a)과 동일한 조성의 PCR 반응 혼합물을 사용하였다. PCR 94℃에서 1분; 46℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 한 싸이클로 하여 총 25, 30, 35, 40, 45 및 50 싸이클을 반복 수행하였다. 각 싸이클로 재결합된 DNA 절편들을 2% 아가로스 겔에서 확인한 후, 겔로부터 분리·정제하였다.

단계 (d): 상기에서 얻은 PCR 산물을 40배 희석한 후, 상기 단계 (a)에서 사용한 동일한 프라이머로 다시 PCR을 수행하였다. 구체적인 PCR 반응 혼합물(총 100㎕)의 조성은 다음과 같다: PCR 산물 0.1㎍, 1.25 unit의 Taq 중합효소, 4mM MgCl₂, 0.2mM dNTPs, 20mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1mM KCl 및 200nM 프라이머. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 94℃에서 2분 동안 가열하여 주형 DNA를 전-변성시킨 후 , 94℃에서 1분; 46℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 한 싸이클로 하여 총 30회 반복 수행.

상기 기재된 단계 (a)-(d)의 과정을 모두 3회 반복하여 무작위로 돌연변이가 유발된 NC 유전자들을 얻었다. 이후, pJC1 벡터 내에 삽입된 야생형 NC 유전자를 제거하고, 상기 돌연변이가 유발된 NC 유전자들을 각각 삽입하여 HIV NC 유전자의 랜덤 돌연변이체 DNA 풀(random mutant DNA pool)을 제조하였다.

<실시예 2>

psi-lacZ 융합 어세이( psi-lacZ fusion assay)를 이용한 변이형 NC 유전자의 탐색

상기 실시예 1에서 제조된 HIV-1 NC 유전자의 랜덤 돌연변이 DNA 풀을 대상으로 본 발명자들이 이전에 개발한 HIV의 NC-psi의 상호작용을 탐색할 수 있는 psi-lacZ 융합 어세이(cell-based assay)(대한민국 등록특허 제10-0360275호)를 수행하여 psi와 결합하는 변이형 NC 유전자들을 선별하였다.

먼저, pZ1-1(psi-lacZ reporter vector)(대한민국 등록특허 제10-0360275호)를 대장균 JM109(Promoga)에 전기천공법으로 도입한 후, 형질전환체를 카나마아신 함유 LB 플레이트에서 선별하였다. 선별된 형질전환체를 'JM109(pZ1-1)'이라 명명하였다. JM109(pZ1-1)를 2% 글루코스와 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양액을 100배 희석하여 다시 3시간 동안 배양하였다. 배 양된 균주에 상기 실시예 1에서 제조된 돌연변이된 NC 유전자들을 함유하고 있는 재조합 벡터들 또는 pJC1 벡터(대조군)를 전기천공법으로 도입시켰다. 형질전환된 균주 200㎕를 M9 최소 배지(1% sucrose, 0.6% Na₂HPO₄, 0.3% KH₂PO ₄, 0.05% NaCl, 0.1% NH₄Cl, 1.5% agar,0.05% LB, 2mM MgSO4, 40㎎/ℓ X-gal, 0.01mM IPTG, 100㎍/㎖ ampicillin, 25㎍/㎖ kanamycin)에 도말하여 화이트 콜로니를 선별하였으며(1차 스크리닝), 이들을 NC 뒤에 일련의 숫자를 붙여 명명하였다(예: NC1, NC2 등)(도 1의 A 참조). 선별된 화이트 콜로니를 다시 배지에 스트리킹(streaking)하여 완전한 화이트 콜로니를 재선별하였다(2차 스크리닝)(도 1의 B 참조). 그 결과, 스크리닝된 전체 콜로니 총 80만 개 중에서 약 5000개의 화이트 콜로니를 얻었다.

<실시예 3>

변이형 NC 유전자의 분리 및 서열분석

상기 실시예 2에서 얻은 화이트 콜로니들로부터 플라스미드 DNA를 미디-프렙 키트(Midi-prep kit, Quiagen)로 분리·정제하였다. 이후, 정제된 DNA를 서열분석하여 돌연변이를 조사하였으며, 이들로부터 아미노산 서열을 추정하였다. 총 4개의 변이형 NC 유전자(NC2, NC5, NC6 및 NC19)를 얻었다. 상기 4개의 변이형 NC 유전자는, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 아미노산 서열상에서 치환 또는 결실 돌연변이를 가지는 폴리펩티드를 암호화한다. 상기 4개의 변이형 NC 유전자로부터 추정되는 아미노산 서열을 서열번호 4 내지 서열번호 7로 기재하였다.

		서열	서열번호
야생형	NC	MQRGNFRNQR KTVKCFNCGK EGHIAKNCRA PRKKGCWRCG REGHQMKDCT ERQAN	1
변이형 NC	NC2	MQRGNFR Y QR KTVKCFNCGK EGH V AKNC G A PRKK C CWRCG REGHQMKD Y T ERQAN	4
	NC5	MQRGNFRNQR KTVKCFNCGK EGH V AKNCRA PRKKGCWRCG G EGHQMKDCT ERQAN	5
	NC6	MQRGNFRNQR KTVKCFNCGK EGHIAKNCRA PRKKGC	6
	NC19	MQRGNFRNQR KTVKCFNCGK EGH V AKNC G A PRKKCCWRCG REGHQMKD Y T ERQAN	7

<실시예 4>

변이형 NC 폴리펩티드의 psi 결합력 조사

상기 실시예 3을 통하여 돌연변이가 일어난 것으로 확인된 NC 유전자를 pQE32(Quiagen) 벡터에 삽입하여 His-태깅된 펩티드의 형태로 발현시킨 후 제조사의 권장방법에 따라 정제하였다. 도 2는 정제된 변이형 NC 폴리펩티드를 17.5% SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이후, 정제된 변이형 NC 폴리펩티드들의 HIV psi RNA에 대한 결합력을 하기와 같은 방법으로 조사하였다.

<4-1> 풀-다운 어세이(pull-down assay)

Psi RNA에 대한 결합 친화력(binding affinity)을 방사성 동위원소로 표지된(radiolabeled) Psi RNA를 이용하여 풀-다운 어세이로 조사하였다. 풀-다운 어세이는 김 등의 방법(KIM S.J. et al., BBRC, 291: 925-931, 2002)에 따라 조사하였다.

먼저, 방사성 동위원소로 표지된 psi RNA를 제조하였다. 서열번호 10으로 표시되는 psi 서열을 갖는 DNA 약 0.5-1 ㎎를 30 mCi〔α-³²P〕UTP(800 Ci/mmole), T7 RNA 중합효소 50 unit 및 RNase 저해제 20 unit와 함께 전사 완충용액(transcription buffer)(40 mM Tris (pH 7.5), 6 mM MgCl₂, 2 mM spermidine, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 500 mM each of rAGCmix, 10 mM rUTP)에서 37℃, 3시간 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 반응을 종결시키기 위하여, 상기 반응액에 RQ1 DNase 4 unit을 첨가하고 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 제조된 Psi RNA를 페놀/클로로포름/이소아밀알코올로 추출한 후, 에탄올로 침전하고 재현탁시켰다. 이후, Psi RNA를 6% 폴리아크릴아미드/7 M 우레아 겔에 로딩하여 전기영동시켰다. Psi RNA의 예상되는 크기에 해당하는 밴드를 일루션(elution)하고, 겔로부터 상기 Psi RNA를 정제하였다. 신틸레이션(scintillation) 방법으로 정제된 Psi RNA의 방사능(radioactivity)을 조사하였다.

이와 같이 방사성 동위원소로 표지된 Psi RNA의 결합 친화력을 조사하기 위하여, 상기 Psi RNA 5 nM을 상기 실시예 4에서 얻은 변이형 NC 폴리펩티드(100 nM)또는 야생형 NC 폴리펩티드(100 nM)와 함께 RNA 결합 완충용액에서 30분 동안 상온에서 인큐베이션하였다. RNA를 제거하기 위하여 비드를 3-4회 세척하여 결합하지 않은 RNA(unbound RNA)를 제거하였다. 결합한 RNA는 페놀 추출에 의해 비드로부터 일루션하였다. 일루션된 RNA를 6% 폴리아크릴아미드/7 M 우레아 겔에 로딩하여 전기영동하였다. 겔을 건조한 후, 결합한 RNA를 자기방사법(autoradiography)으로 가시화하였다.

그 결과, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열에 있어서, 24번째 및 41번째 아미노산이 각각 발린(valine)과 글리신(glycine)으로 치환된 NC5 폴리펩티드(서열번호 5)와 37번째부터 55번째까지의 아미노산이 결실된 NC6 폴리펩티드(서열번호 6)가 HIV psi RNA에 대하여 야생형 NC 폴리펩티드(서열번호 1)보다 더 강한 결합력을 나타내었으며, 그 결합 활성은 야생형 NC 폴리펩티드에 비해 약 4-5배 이상인 것으로 나타났다(도 3 참조).

<4-2> 비아코어 어세이(BIAcore assay)

또한 본 발명자들은 NC5 폴리펩티드의 psi 결합 Kd 값을 비아코어 어세이(KIM S. J. et al., BBRC, 291: 925-931, 2002)로 조사하였다.

표면 플라스몬 공명 실험(surface plasmon resonance experiment)을 위해 비아코아 3000(BIAcore 3000, Pharmacia)을 이용하였다. 먼저, CM5 센서 칩에 폴리펩티드를 부착시키기 위하여, 칩의 표면을 HEPES로 전-평형화(pre-equilibration)시켰다. 이후, 0.05M NHS(N-hydroxysuccinimide)와 0.2M EDC(N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl) carbodiimide)로 덱스트란의 카르복시메틸기를 수식하여 칩의 표면을 활성화시켰다(전-활성화). NC5 폴리펩티드 또는 야생형 NC 폴리펩티드를 각 플로우 셀(flow cell)에 주입(injection)하였다. 폴리펩티드를 고정(immobilization)시킨 후에, 칩의 표면을 1M 에탄올아민 하이드로클로라이드(ethanolamine hydrochloride)(pH 8.5)로 비활성화(deactivation)시켰다. 베이스라인(base line)을 안정화시키기 위하여, psi RNA를 다양한 농도(500 nM, 250 nM, 100 nM, 20 nM and 5 nM)로 주입하고, 이들 RNA에 대한 KD값을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 NC5 폴리펩티드가 야생형 NC 폴리펩티드에 비해 더 강한 psi 결합 활성을 나타내었다.

단백질	Kd(M)
단백질	평균값	SD
야생형 NC	2.45×10^-9	0.93
본 발명의 NC5	4.29×0^-10	0.99

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 HIV의 psi에 대하여 야생형 NC보다 더 강한 결합력을 나타내는 HIV NC의 변이형 폴리펩티드를 제조하였다. 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 NC과 psi 간의 결합을 억제하여 HIV의 조립을 저해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 HIV에 의한 감염증을 치료 또는 예방하는 항-HIV 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 있어서, 24번째 및 41번째 아미노산이 각각 발린(valine)과 글리신(glycine)으로 치환되거나 37번째부터 55번째까지의 아미노산이 결실된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
제2항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제3항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제1항의 폴리펩티드 또는 이를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 HIV 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.