CN111979198A - 使用zscan4复壮人细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的名称是使用ZSCAN4复壮人细胞的方法。本公开内容涉及例如通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人细胞中的端粒长度和/或增大一种或多种人细胞的基因组稳定性的方法。还提供了例如通过使对象中的一种或多种人细胞与增大Zscan4的表达的试剂接触，或者通过向有需要的对象施用增大Zscan4的表达的试剂，治疗需要端粒加长的对象的方法、治疗患有基因组和/或染色体异常关联性疾病或状况的方法、复壮一种或多种人细胞的方法、复壮组织或器官的方法、和复壮有需要的对象的方法。

Description

使用ZSCAN4复壮人细胞的方法
本申请是分案申请，原申请的申请日为2014年3月14日、申请号为2014800274601、发明名称为“使用ZSCAN4复壮人细胞的方法”。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/800,668的权益，其通过引用以其全部并入本文。
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技术领域
本公开内容涉及在一种或多种人细胞中增大端粒长度和/或增大一种或多种人细胞的基因组稳定性的方法，例如通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触。本公开内容进一步提供治疗需要端粒加长的对象、治疗基因组和/或染色体异常关联性疾病或状况的方法、复壮一种或多种人细胞的方法、复壮组织或器官的方法、和复壮有需要的对象的方法，例如通过使对象中的一种或多种人细胞与增大Zscan4的表达的试剂接触，或通过向有需要的对象施用增大Zscan4的表达的试剂。
发明背景
端粒是重复DNA序列连同蛋白质，其加帽每条染色体的末端并保护其免于在每个细胞周期中连续降解，从而固定和保护染色体完整性。通过有助于基因组不稳定性，端粒缩短还可导致癌症(Raynaud等人，Crit.Rev Oncol Hematol 66:99-117,2008)，并且已经与老化和细胞衰老相关联(Yang，Cytogenet Genome Res 122:211-218,2008)。业已证实端粒在正常老化的过程期间逐渐地变短。已经报道了随着每一轮DNA复制丢失多达200碱基对的端粒DNA。例如，在人类新生儿中，外周血淋巴细胞在每条染色体的两个末端处具有约10kb的端粒DNA，其到70岁的时候逐渐地缩短至约6kb。还已知的是环境因素和生活方式因素可以加快端粒缩短。有人认为这样的端粒缩短与年龄相关性细胞衰退相关联。还有人认为端粒缩短限制细胞分裂的数目，其最终导致限制人类寿命。还已知的是人类天生具有不同长度的端粒。例如，一些人开始具有约8kb的端粒，而其他人开始具有约12kb的端粒。因此，具有较短的端粒的人可以比那些具有较长的端粒的人更易于在较早的年龄发展出某些年龄相关性病理学状况。这样的病理学状况包括，例如，免疫缺陷、慢性溃疡、动脉粥样硬化、由于视网膜色素上皮细胞的增殖衰退而造成的年龄相关性失明、和癌症。
而且，还存在多种端粒缩短关联性疾病和紊乱(Armanios和Blackburn，Nat RevGenet.2012年10月，13(10):693-704)。可引起端粒缩短的遗传疾病的实例包括先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合症、Revesz综合症和Coats plus综合症。此外，最近显示相当部分的特发性肺纤维变性(IPF)是由端粒缩短引起的。类似地，一些肝硬化和胰囊性纤维化可以是由端粒缩短引起的。考虑到这样的病理学状况的流行，似乎由端粒缩短引起的疾病比预想的更普遍。
端粒缩短关联性疾病的另一个实例是范康尼贫血。范康尼贫血是罕见的常染色体隐性疾病。范康尼贫血是遗传的骨髓衰竭综合症，其表征为进行性各类血细胞减少症和癌症易感性(Bogliolo等人，Mutageneis.2002年11月，17(6):529-38)。已经报道了范康尼贫血患者显示加快的端粒缩短(Leteurte等人，Br.J.Haematol.,1999；Ball等人，Blood，1998；Hanson等人，Cytogenet.Cell Genet.2001；和Callén等人，Hum Mol Genet.2002年2月15日，11(4):439-44)。
治疗这些各种端粒缩短关联性疾病和紊乱的一个潜在的方法是使用端粒酶加长缩短的端粒。端粒酶已经被认定为已知参与端粒延长维持的主要的酶。虽然端粒酶在胚胎干细胞中是活化的，但是端粒酶通常不在非胚胎细胞(即，成体细胞)比如体细胞中表达。因而端粒酶的再活化或成体细胞中端粒酶的强制表达可用于增大端粒长度。然而，伴随使用端粒酶的一个潜在的问题是端粒酶的连续表达通常与肿瘤发生和癌性转变相关联。因此，端粒酶的表达不是在患有端粒缩短关联性疾病和状况的患者中增大端粒长度的理想方法。
加长端粒的另一个潜在的方法是使用最近发现的中草药(TA-65)的成分，其可以潜在地增大端粒长度(Harley等人，Rejuvenation Research 14:45-56,2011)。然而，还没有证实此药草可有效地加长端粒。而且，使用此药草将需要长期连续的药物施用以治疗需要端粒加长的患者。
此外，最近已经显示Zscan4(包含锌指和scan结构域的蛋白质4)对鼠胚胎干细胞中基因组稳定性和正常核型的维持是必需的，并且在鼠胚胎和胚胎干细胞中表达(Falco等人，Dev Biol 307:539-550,2007；Zalzman等人，Nature 464:858-863,2010；PCT公开号WO2008/118957、WO 2011/02880、WO 2012/103235、WO 2012/129342、WO 2012/158561和WO2012158564；和美国专利申请公开号US 2010/0105043、US 2012/0129161和US 2012/0156305)。还已经显示鼠胚胎干细胞中的Zscan4表达与端粒延长相关联(Zalzman等人，Nature 464:858-863,2010；PCT公开号WO 2011/02880、WO 2012/129342和WO 2012158564；和美国专利申请公开号US 2012/0156305)。虽然已经显示人基因组还包含ZSCAN4基因，但Falco等人，Dev Biol 307:539-550，2007；Zalzman等人，Nature 464:858-863，2010；PCT公开号WO 2008/118957、WO 2011/02880、WO 2012/103235、WO 2012/129342、WO 2012/158561和WO 2012158564；或美国专利申请公开号US 2010/0105043、US 2012/0129161和US 2012/0156305中没有一个提供了表明Zscan4表达在人细胞中导致与在鼠胚胎细胞相同的作用的实验支持。特别不清楚人ZSCAN4是否将具有与鼠Zscan4相同的功能，因为鼠基因组包含六个Zscan4基因和三个Zscan4假基因，而人基因组仅包含一个ZSCAN4基因(PCT公开号WO2008/118957)。而且，不知道人细胞比如涉及端粒缩短关联性疾病或状况的体细胞中的ZSCAN4表达是否将具有如鼠胚胎干细胞所示的相同的效果。
发明内容
因此，为了治疗端粒缩短和基因组异常关联性疾病或状况，对在人细胞中增加端粒长度和修正基因组和/或染色体异常的改进的方法存在需要。
为了满足上面的需要，本公开内容提供了新的方法，其通过使人细胞与在细胞中增大Zscan4(包含锌指和scan结构域的蛋白质4)的表达的试剂接触，在人细胞中增大端粒长度、增大人细胞中的染色体和/或基因组稳定性、修正染色体和/或核型异常(例如，21三体)、和/或复壮人细胞。如本文使用的，术语“Zscan4”是指Zscan4多肽和多核苷酸，比如编码来自任何物种——包括鼠和人——的Zscan4多肽的基因。如本文使用的，术语“Zscan4”具体是指人Zscan4多肽和多核苷酸，比如编码Zscan4多肽的基因。
本公开内容还提供了新的方法，其通过向有需要的对象施用增大Zscan4的表达的试剂，治疗端粒、染色体和/或核型异常关联性疾病或状况、在人卵母细胞、人受精卵母细胞和人植入前胚胎中增大基因组稳定性和修正核型异常、复壮组织或器官、和/或复壮有需要的对象。在一些实施方式中，人细胞是人成体细胞(即，非胚胎细胞)。
而且，本公开内容至少部分地基于以下令人惊讶的发现：人细胞比如成纤维细胞中的Zscan4表达仅在两天后就在细胞中迅速地和显著地增大端粒的长度。具体而言，如下面的实施例8中公开的，人成纤维细胞中的Zscan4表达导致在三天内端粒长度增大大约40％。此外，从患有范康尼贫血的患者分离的人成纤维细胞中的Zscan4的表达导致在三天内端粒长度增大大约160％。惊人地，从唐氏综合症患者分离的成纤维细胞群体中的Zscan4表达还能够显著地减小群体中患有21三体的细胞的百分比。具体而言，如下面的实施例15中公开的，从唐氏综合症患者分离的成纤维细胞群体中的Zscan4表达能够修正约55％的细胞中的21三体异常。
考虑到认为以前从来没有显示Zscan4表达可在人细胞中增大端粒长度，本文公开的结果是特别令人惊讶的。本文公开的结果也是意料之外的。虽然先前已经显示Zscan4表达在鼠胚胎干(ES)细胞中增大端粒长度，但是差异不仅在人ZSCAN4和鼠Zscan4之间，而且在人细胞和鼠细胞的生物学之间，以及在ES细胞和非ES细胞比如成体细胞之间，这将不会导致人们预期人细胞中的Zscan4表达也将增大端粒长度。考虑到先前已经表明人和鼠基因组中的转录调控元件差异显著，这是特别相关的。当考虑到甚至具有保守功能的转录因子在人和鼠二者中呈现出显著程度的物种特异性结合活动偏好时，这是异常惊人的(Odom等人，Nature Genetics 6:39,2007)。
有利地，利用增大Zscan4表达的试剂，比如编码Zscan4的核酸分子，可通过复壮和/或修正基因组和/或染色体异常，比如卵母细胞、受精卵母细胞或植入前胚胎中的非整倍性用于在高龄女性中增大体外受精(IVF)和成功怀孕的成功率。此外，利用增大Zscan4表达的试剂，比如编码Zscan4的核酸分子，可通过在受疾病和状况影响的患者的细胞中增大端粒的长度用于治疗患有端粒缩短关联性疾病和状况比如范康尼贫血的患者。而且，增大Zscan4表达的试剂，比如编码Zscan4的核酸分子，还可用于复壮个体中的细胞、个体中的组织、或个体中的器官；或者通过在由端粒缩短引起老化的细胞、组织、器官和个体中增大端粒的长度复壮个体。
因此，本公开内容的某些方面涉及通过使一种或多种人细胞与在人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，在一种或多种人细胞中增大端粒长度的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
本公开内容的其它方面涉及通过使对象中的一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，治疗需要端粒加长的对象的方法，其中增大表达的Zscan4诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗需要端粒加长的对象的方法：i.从对象分离需要端粒加长的一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法，其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有端粒异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正染色体异常以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有染色体异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正染色体异常；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗核型异常关联性疾病或状况的方法，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正核型异常以治疗核型异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗核型异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有核型异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正核型异常；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗核型异常关联性疾病或状况。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，核型异常选自染色体缺体性、染色体单体性、染色体三体性、染色体四体性和染色体五体性。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，核型异常选自21三体、16三体、18三体、13三体、X单体性、XXX非整倍性、XXY非整倍性、XYY非整倍性和1p36重复。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，核型异常关联性疾病或状况选自17p11.2重复综合症(dup(17)(p11.2p11.2))、佩-梅二氏病、22q11.2重复综合症(dup(22)(p11.2p11.2))、猫眼综合症、猫叫综合症(Cri-du-chat syndrome)、午-希二氏综合症、威廉斯综合症(Williams-Beurensyndrome)、夏-马-图三氏病、遗传性压力易感性周围神经病(Hereditary neuropathywith liability to pressure palsies)、Smith-Magenis综合症、神经纤维瘤、Alagille综合症、颚心面综合症(Velocardiofacial syndrome)、迪乔治综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、卡尔曼综合症、线状皮肤缺损小眼畸形(Microphthalmia with linear skindefects)、肾上腺发育不全、甘油激酶缺乏症、佩-梅二氏病、Y染色体上的睾丸决定因子、无精子症(因子a)、无精子症(因子b)、无精子症(因子c)和1p36缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是选自端粒缩短的疾病、骨髓衰竭综合症、年龄相关性端粒缩短疾病或紊乱和早熟衰老疾病或紊乱的一种或多种疾病或状况。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是端粒缩短的疾病，其选自先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合症、Revesz综合症、Coats plus综合症、特发性肺纤维变性、肝硬化、胰囊性纤维化、阿耳茨海默病和骨性关节炎。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是骨髓衰竭综合症，其选自范康尼贫血、无巨核细胞(amegakaryocytic)血小板减少、再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血、先天性角化不良、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Pearson综合症、舒-戴二氏综合症、血小板减少和骨髓增生异常综合症。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是年龄相关性端粒缩短疾病或紊乱、早熟衰老疾病或紊乱、或二者，其选自维尔纳综合症、布卢姆综合症、赫-吉二氏早老综合症、柯克凯内综合症、着色性干皮病、运动失调性毛细血管扩张症、罗-汤二氏综合症、毛发低硫营养不良(Trichothiodystrophy)、Juberg-Marsidi综合症和唐氏综合症。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是选自免疫缺陷、自身免疫性疾病、自身免疫性紊乱、慢性溃疡、动脉粥样硬化、癌症、神经损伤、变性疾病、神经变性疾病、创伤愈合、肌肉修复、心肌修复、软骨置换、关节炎、骨性关节炎、牙齿再生、失明、由于视网膜色素上皮细胞的增殖衰退而造成的年龄相关性失明、耳聋、骨髓衰竭、骨髓移植、糖尿病、肌肉萎缩症、杜兴肌营养不良、遗传疾病、基因突变和DNA损伤的一种或多种疾病或状况。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是癌症，其选自心脏的癌症(例如，血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)；肺癌(例如，支气管癌(扁平细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、蜂窝状(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤)；胃肠道癌(例如，食管(扁平细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)；胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)；胰腺癌(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤(gastrinoma)、类癌瘤、血管活性肠肽肿瘤)；小肠癌(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)；大肠癌(腺癌、管状腺癌、绒毛状腺癌、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道癌(例如，肾(腺癌、维尔姆斯肿瘤、肾胚细胞瘤、淋巴瘤、白血病)；膀胱和尿道癌(扁平细胞癌、移行细胞癌、腺癌)；前列腺癌(腺癌、肉瘤)；睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺癌、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏癌(例如，肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞癌、血管肉瘤、肝细胞腺癌、血管瘤)；骨癌(例如，成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统癌症(例如，颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤、松果体瘤、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓(神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤))；妇科癌症(例如，子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前(pre-tumor)宫颈发育异常)、卵巢(卵巢癌、浆液性囊腺癌、粘蛋白性囊腺癌、子宫内膜样肿瘤、布伦纳癌、透明细胞癌、未分类的癌(unclassified carcinoma)、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞尔托利-莱迪希细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(扁平细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌，扁平细胞癌、葡萄状肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌))；血液癌症(例如，血液(髓细胞性白血病(急性的和慢性的)、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症)、何杰金病、非何杰金淋巴瘤(恶性淋巴瘤))；皮肤癌(例如，恶性黑素瘤、基底细胞癌、扁平细胞癌、卡波西肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、脉管瘤(angioma)、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣)；和肾上腺癌(例如，成神经细胞瘤)。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是自身免疫性疾病，其选自甲状腺炎、古德帕斯彻病、风湿性关节炎、少年少关节炎(juvenileoligoarthritis)、胶原性关节炎(collagen-induced arthritis)、佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis)、斯耶格伦综合症、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、自身免疫性胃萎缩、寻常天疱疮、牛皮癣、白癜风、1型糖尿病、非肥胖型糖尿病、重症肌无力、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性涎腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、阿狄森病、全身性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是神经变性疾病，其选自脑白质肾上腺萎缩症(ALD)、酒精中毒、亚历山大病、阿耳珀病、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、卢伽雷病(Lou Gehrig's Disease)、运动失调性毛细血管扩张症、巴腾病、施-伏-斯-巴四氏病(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease)、疯牛病(BSE)、卡纳万病、大脑性麻痹、柯克凯内综合症、皮质基底节变性(Corticobasal degeneration)、克-雅二氏病、家族性致死性失眠症、额颞叶变性、亨廷顿舞蹈病、HIV关联性痴呆(HIV-associated dementia)、肯尼迪病、克腊比病、Lewy小体痴呆、神经包柔螺旋体病(neuroborreliosis)、马查多-约瑟夫病(Machado-Josephdisease)、脊髓小脑性共济失调3型、多系统萎缩、多发性硬化、昏睡病、尼-皮二氏病、帕金森病、佩-梅二氏病、皮克病、原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性核上麻痹、雷弗素姆病、山德霍夫病、谢耳德病、恶性贫血继发性脊髓亚急性联合变性(subacute combineddegeneration of spinal secondary to Pernicious Anaemia)、施-伏-斯-巴四氏病、巴腾病、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、斯-里-奥三氏病、脊髓痨和中毒性脑病。
本公开内容的其它方面涉及，通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种癌细胞中增大Zscan4的表达的试剂治疗癌症的方法，其中增大Zscan4的表达抑制一种或多种癌细胞的生长，从而治疗癌症。本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种癌干细胞中减小内源性ZSCAN4的表达的试剂，提高癌症患者对化学疗法的应答性的方法，其中减小内源性ZSCAN4的表达减小或消除一种或多种癌干细胞对一种或多种化学治疗剂的抗性，从而提高对象对一种或多种化学治疗剂的应答性。在一些实施方式中，减小内源性ZSCAN4的表达的试剂是ZSCAN4特异性siRNA或shRNA。在一些实施方式中，癌症选自心脏的癌症(例如血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)；肺癌(例如、支气管癌(扁平细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、蜂窝状(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤)；胃肠道癌(例如、食管(扁平细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)；胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)；胰腺癌(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽肿瘤)；小肠癌(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)；大肠癌(腺癌、管状腺癌、绒毛状腺癌、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道癌(例如，肾(腺癌、维尔姆斯肿瘤、肾胚细胞瘤、淋巴瘤、白血病)；膀胱和尿道癌(扁平细胞癌、移行细胞癌、腺癌)；前列腺癌(腺癌、肉瘤)；睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺癌、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏癌(例如，肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞癌、血管肉瘤、肝细胞腺癌、血管瘤)；骨癌(例如，成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统癌症(例如，颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤、松果体瘤、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓(神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤))；妇科癌症(例如，子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育异常)、卵巢(卵巢癌、浆液性囊腺癌、粘蛋白性囊腺癌、子宫内膜样肿瘤、布伦纳癌、透明细胞癌、未分类的癌、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞尔托利-莱迪希细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(扁平细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、扁平细胞癌、葡萄状肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、输卵管(癌))；血液癌症(例如，血液(髓细胞性白血病(急性的和慢性的)、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症)、何杰金病、非何杰金淋巴瘤(恶性淋巴瘤))；皮肤癌(例如，恶性黑素瘤、基底细胞癌、扁平细胞癌、卡波西肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、脉管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣)；和肾上腺癌(例如，成神经细胞瘤)。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人细胞的基因组稳定性的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的基因组稳定性。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人细胞的DNA修复能力的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的DNA修复能力。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触复壮一种或多种人细胞的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4复壮一种或多种人细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的皮肤局部地施用增大Zscan4的表达的试剂，复壮皮肤、治疗特应性皮炎和/或皮肤损害的方法。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的头皮局部地施用增大Zscan4的表达的试剂治疗脱发的方法。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的一个或多个毛囊施用增大Zscan4的表达的试剂，预防头发花白(hair graying)、治疗头发花白或二者的方法。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的角膜施用增大Zscan4的表达的试剂复壮角膜的方法。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的角膜施用增大Zscan4的表达的试剂治疗干眼症的方法。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的肺施用增大Zscan4的表达的试剂治疗特发性肺纤维变性的方法。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的血流施用增大Zscan4的表达的试剂，治疗动脉粥样硬化、冠心病或二者的方法。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，提供一种或多种人细胞对一种或多种遗传毒性剂的抗性的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞对一种或多种遗传毒性剂的抗性。在一些实施方式中，遗传毒性剂是丝裂霉素C或顺铂。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是人成体细胞。在一些实施方式中，一种或多种人细胞是成体干细胞、组织干细胞、祖细胞或诱导多能干细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是一种或多种成体干细胞、组织干细胞或祖细胞，其选自造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞和生殖干细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是体细胞、成熟细胞或分化细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是体细胞、成熟细胞或分化细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是一种或多种体细胞、成熟细胞或分化细胞，其选自表皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、上皮细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰腺β细胞、角质化细胞、红细胞、外周血细胞、神经细胞、星形细胞、生殖细胞、精细胞和卵母细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人iPS细胞与在一种或多种人iPS细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，用于在一种或多种人诱导多能干(iPS)细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人iPS细胞，增大表达的Zscan4在一种或多种人iPS细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，复壮一种或多种人卵母细胞的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4复壮一种或多种人卵母细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人卵母细胞的基因组稳定性的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人卵母细胞中的基因组稳定性。本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4诱导修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常。在一些实施方式中，在与增大Zscan4的表达的试剂接触之前，从对象分离一种或多种人卵母细胞。在一些实施方式中，在与增大Zscan4的表达的试剂接触后，一种或多种人卵母细胞经历体外受精。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种受精的人卵母细胞与在一种或多种受精的人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种受精的人卵母细胞的基因组稳定性的体外方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的受精的人卵母细胞胚胎，增大表达的Zscan4增大一种或多种受精的人卵母细胞中的基因组稳定性。本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种受精的人卵母细胞与在一种或多种受精的人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，修正一种或多种受精的人卵母细胞中的一种或多种核型异常的体外方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的受精的人卵母细胞，增大表达的Zscan4诱导修正一种或多种受精的人卵母细胞中的一种或多种核型异常。在一些实施方式中，一种或多种受精的人卵母细胞通过体外受精而受精。在一些实施方式中，在受精之前，从对象分离一种或多种人卵母细胞。在一些实施方式中，一种或多种受精卵母细胞是一细胞期和胚泡期之间的胚胎。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有端粒异常关联性疾病或状况的对象分离人骨髓细胞；ii.使人骨髓细胞与在人骨髓细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达在人骨髓细胞中诱导端粒加长；和iii.将接触的人骨髓细胞植入对象以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有染色体异常关联性疾病或状况的对象分离人骨髓细胞；ii.使人骨髓细胞与在人骨髓细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大Zscan4的表达诱导在人骨髓细胞中修正染色体异常；和iii.将接触的人骨髓细胞植入对象以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是选自端粒缩短的疾病、骨髓衰竭综合症、年龄相关性端粒缩短疾病或紊乱和早熟衰老疾病或紊乱的一种或多种疾病或状况。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是端粒缩短的疾病，其选自先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合症、Revesz综合症、Coats plus综合症、特发性肺纤维变性、肝硬化、胰囊性纤维化、阿耳茨海默病和骨性关节炎。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是骨髓衰竭综合症，其选自范康尼贫血、无巨核细胞血小板减少、再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血、先天性角化不良、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Pearson综合症、舒-戴二氏综合症、血小板减少和骨髓增生异常综合症。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是年龄相关性端粒缩短疾病、早熟衰老疾病或二者，其选自维尔纳综合症、布卢姆综合症、赫-吉二氏早老综合症、柯克凯内综合症、着色性干皮病、运动失调性毛细血管扩张症、罗-汤二氏综合症、毛发低硫营养不良、Juberg-Marsidi综合症和唐氏综合症。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在组织或器官中增大Zscan4的表达的试剂，复壮对象中的组织或器官的方法，其中增大Zscan4的表达复壮组织或器官。
本公开内容的其它方面涉及通过向对象施用增大Zscan4的表达的试剂复壮有需要的对象的方法，其中增大Zscan4的表达复壮对象。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，延长一种或多种人细胞的寿命的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在组织或器官中增大Zscan4的表达的试剂，延长对象中的组织或器官的寿命的方法，其中增大Zscan4的表达延长组织或器官的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂延长对象的寿命的方法，其中增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命，从而延长对象的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤延长对象的寿命的方法：i.从对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以延长对象的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤在一种或多种人细胞中测定一种或多种Zscan4诱导效应的方法：i.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触；ii.测量一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平；和iii.将一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平与没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平进行比较，其中一种或多种人细胞中SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平的增大表明在一种或多种人细胞中存在一种或多种Zscan4诱导效应。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4的增大表达是瞬时的。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂增大Zscan4表达持续大约1小时至大约23小时。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂增大Zscan4表达持续大约1天至大约10天。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂直接与内源性Zscan4相互作用以增大Zscan4的表达。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂是编码Zscan4的分离的核酸分子。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，分离的核酸分子是合成mRNA。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，分离的核酸分子包含载体。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，载体是病毒载体。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，病毒载体是副粘病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，病毒载体是副粘病毒载体。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，副粘病毒载体是仙台病毒载体。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，载体是质粒载体。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，载体编码可操作地连接至启动子的Zscan4。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，启动子是诱导型启动子。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是Zscan4-ERT2融合蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是Zscan4-ΔC蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包括至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是鼠Zscan4、人ZSCAN4或其同系物。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4选自Zscan4a、Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e和Zscan4f。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，分离的核酸分子包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于选自SEQ ID No:1-10和21-30的核苷酸序列的核苷酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是人ZSCAN4。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，分离的核酸分子包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂是Zscan4蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白融合至细胞穿膜肽(cell-penetrating peptide)。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，细胞穿膜肽包含蛋白转导结构域。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，细胞穿膜肽包含聚精氨酸(poly-arginine)肽标签。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白封装在纳米颗粒中。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是鼠Zscan4蛋白、人ZSCAN4蛋白或其同系物。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白选自Zscan4a蛋白、Zscan4b蛋白、Zscan4c蛋白、Zscan4d蛋白、Zscan4e蛋白和Zscan4f蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于选自SEQ ID No:11-20和31-40的氨基酸序列的氨基酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是人ZSCAN4蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是Zscan4-ERT2融合蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是Zscan4-ΔC蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包含鼠Zscan4蛋白、人ZSCAN4蛋白或其同系物，并且其中Zscan4蛋白包含至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包含选自Zscan4a蛋白、Zscan4b蛋白、Zscan4c蛋白、Zscan4d蛋白、Zscan4e蛋白和Zscan4f蛋白的Zscan4蛋白，并且其中Zscan4蛋白包含至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包含人ZSCAN4蛋白，并且其中Zscan4蛋白包含至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂是类维生素A、诱导氧化应激的试剂、或二者。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，在一种或多种人细胞中增大端粒长度的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
本公开内容的其它方面涉及通过使对象中的一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，治疗需要端粒加长的对象的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大表达的Zscan4诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗需要端粒加长的对象的方法：i.从对象分离需要端粒加长的一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有端粒异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正染色体异常以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有染色体异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正染色体异常；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗核型异常关联性疾病或状况的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正核型异常以治疗核型异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗核型异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有核型异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正核型异常；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗核型异常关联性疾病或状况。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，核型异常选自染色体缺体性、染色体单体性、染色体三体性、染色体四体性和染色体五体性。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，核型异常选自21三体、16三体、18三体、13三体、X单体性、XXX非整倍性、XXY非整倍性、XYY非整倍性和1p36重复。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，核型异常关联性疾病或状况选自17p11.2重复综合症、佩-梅二氏病、22q11.2重复综合症、猫眼综合症、猫叫综合症、午-希二氏综合症、威廉斯综合症、夏-马-图三氏病、遗传性压力易感性周围神经病、Smith-Magenis综合症、神经纤维瘤、Alagille综合症、颚心面综合症、迪乔治综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、卡尔曼综合症、线状皮肤缺损小眼畸形、肾上腺发育不全、甘油激酶缺乏症、佩-梅二氏病、Y染色体上的睾丸决定因子、无精子症(因子a)、无精子症(因子b)、无精子症(因子c)和1p36缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是选自端粒缩短的疾病、骨髓衰竭综合症、年龄相关性端粒缩短疾病或紊乱和早熟衰老疾病或紊乱的一种或多种疾病或状况。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是端粒缩短的疾病，其选自先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合症、Revesz综合症、Coats plus综合症、特发性肺纤维变性、肝硬化、胰囊性纤维化、阿耳茨海默病和骨性关节炎。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是骨髓衰竭综合症，其选自范康尼贫血、无巨核细胞血小板减少、再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血、先天性角化不良、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Pearson综合症、舒-戴二氏综合症、血小板减少和骨髓增生异常综合症。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是年龄相关性端粒缩短疾病或紊乱、早熟衰老疾病或紊乱、或二者，其选自维尔纳综合症、布卢姆综合症、赫-吉二氏早老综合症、柯克凯内综合症、着色性干皮病、运动失调性毛细血管扩张症、罗-汤二氏综合症、毛发低硫营养不良、Juberg-Marsidi综合症和唐氏综合症。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是选自免疫缺陷、自身免疫性疾病、自身免疫性紊乱、慢性溃疡、动脉粥样硬化、癌症、神经损伤、变性疾病、神经变性疾病、创伤愈合、肌肉修复、心肌修复、软骨置换、关节炎、骨性关节炎、牙齿再生、失明、由于视网膜色素上皮细胞的增殖衰退而造成的年龄相关性失明、耳聋、骨髓衰竭、骨髓移植、糖尿病、肌肉萎缩症、杜兴肌营养不良、遗传疾病、基因突变和DNA损伤的一种或多种疾病或状况。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是癌症，其选自心脏的癌症(例如，血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)；肺癌(例如，支气管癌(扁平细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、蜂窝状(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤)；胃肠道癌(例如，食管(扁平细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)；胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)；胰腺癌(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽肿瘤)；小肠癌(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)；大肠癌(腺癌、管状腺癌、绒毛状腺癌、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道癌(例如，肾(腺癌、维尔姆斯肿瘤、肾胚细胞瘤、淋巴瘤、白血病)；膀胱和尿道癌(扁平细胞癌、移行细胞癌、腺癌)；前列腺癌(腺癌、肉瘤)；睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺癌、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏癌(例如，肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞癌、血管肉瘤、肝细胞腺癌、血管瘤)；骨癌(例如、成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统癌症(例如，颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤、松果体瘤、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓(神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤))；妇科癌症(例如，子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育异常)、卵巢(卵巢癌、浆液性囊腺癌、粘蛋白性囊腺癌、子宫内膜样肿瘤、布伦纳癌、透明细胞癌、未分类的癌、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞尔托利-莱迪希细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(扁平细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、扁平细胞癌、葡萄状肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、输卵管(癌))；血液癌症(例如，血液(髓细胞性白血病(急性的和慢性的)、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症)、何杰金病、非何杰金淋巴瘤(恶性淋巴瘤))；皮肤癌(例如、恶性黑素瘤、基底细胞癌、扁平细胞癌、卡波西肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、脉管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣)；和肾上腺癌(例如，成神经细胞瘤)。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是自身免疫性疾病，其选自甲状腺炎、古德帕斯彻病、风湿性关节炎、少年少关节炎、胶原性关节炎、佐剂性关节炎、斯耶格伦综合症、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、自身免疫性胃萎缩、寻常天疱疮、牛皮癣、白癜风、1型糖尿病、非肥胖型糖尿病、重症肌无力、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性涎腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、阿狄森病、全身性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是神经变性疾病，其选自脑白质肾上腺萎缩症(ALD)、酒精中毒、亚历山大病、阿耳珀病、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、卢伽雷病、运动失调性毛细血管扩张症、巴腾病、施-伏-斯-巴四氏病、疯牛病(BSE)、卡纳万病、大脑性麻痹、柯克凯内综合症、皮质基底节变性、克-雅二氏病、家族性致死性失眠症、额颞叶变性、亨廷顿舞蹈病、HIV关联性痴呆、肯尼迪病、克腊比病、Lewy小体痴呆、神经包柔螺旋体病、马查多-约瑟夫病、脊髓小脑性共济失调3型、多系统萎缩、多发性硬化、昏睡病、尼-皮二氏病、帕金森病、佩-梅二氏病、皮克病、原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性核上麻痹、雷弗素姆病、山德霍夫病、谢耳德病、恶性贫血继发性脊髓亚急性联合变性、施-伏-斯-巴四氏病、巴腾病、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、斯-里-奥三氏病、脊髓痨和中毒性脑病。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种癌细胞中增大Zscan4的表达的试剂治疗癌症的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达抑制一种或多种癌细胞的生长，从而治疗癌症。本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种癌干细胞中减小内源性ZSCAN4的表达的试剂，提高癌症患者对化学疗法的应答性的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中减小内源性ZSCAN4的表达减小或消除一种或多种癌干细胞对一种或多种化学治疗剂的抗性，从而提高对象对一种或多种化学治疗剂的应答性。在一些实施方式中，减小内源性ZSCAN4的表达的试剂是ZSCAN4特异性siRNA或shRNA。在一些实施方式中，癌症选自心脏的癌症(例如血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)；肺癌(例如，支气管癌(扁平细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、蜂窝状(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤)；胃肠道癌(例如，食管(扁平细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)；胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)；胰腺癌(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽肿瘤)；小肠癌(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)；大肠癌(腺癌、管状腺癌、绒毛状腺癌、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道癌(例如，肾(腺癌、维尔姆斯肿瘤、肾胚细胞瘤、淋巴瘤、白血病)；膀胱和尿道癌(扁平细胞癌、移行细胞癌、腺癌)；前列腺癌(腺癌、肉瘤)；睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺癌、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏癌(例如，肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞癌、血管肉瘤、肝细胞腺癌、血管瘤)；骨癌(例如，成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统癌症(例如，颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤、松果体瘤、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓(神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤))；妇科癌症(例如，子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育异常)、卵巢(卵巢癌、浆液性囊腺癌、粘蛋白性囊腺癌、子宫内膜样肿瘤、布伦纳癌、透明细胞癌、未分类的癌、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞尔托利-莱迪希细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(扁平细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、扁平细胞癌、葡萄状肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、输卵管(癌))；血液癌症(例如，血液(髓细胞性白血病(急性的和慢性的)、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症)、何杰金病、非何杰金淋巴瘤(恶性淋巴瘤))；皮肤癌(例如，恶性黑素瘤、基底细胞癌、扁平细胞癌、卡波西肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、脉管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣)；和肾上腺癌(例如，成神经细胞瘤)。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人细胞的基因组稳定性的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的基因组稳定性。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人细胞的DNA修复能力的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的DNA修复能力。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，复壮一种或多种人细胞的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4复壮一种或多种人细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的皮肤局部地施用增大Zscan4的表达的试剂，复壮皮肤、治疗特应性皮炎和/或皮肤损害的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的头皮局部地施用增大Zscan4的表达的试剂治疗脱发的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的一个或多个毛囊施用增大Zscan4的表达的试剂，预防头发花白、治疗头发花白或二者的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的角膜施用增大Zscan4的表达的试剂复壮角膜的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的角膜施用增大Zscan4的表达的试剂治疗干眼症的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的肺施用增大Zscan4的表达的试剂，治疗特发性肺纤维变性的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象的血流施用增大Zscan4的表达的试剂，治疗动脉粥样硬化、冠心病或二者的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，提供一种或多种人细胞对一种或多种遗传毒性剂的抗性的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞对一种或多种遗传毒性剂的抗性。在一些实施方式中，遗传毒性剂是丝裂霉素C或顺铂。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是人成体细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是成体干细胞、组织干细胞、祖细胞或诱导多能干细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是一种或多种成体干细胞、组织干细胞或祖细胞，其选自造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞和生殖干细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是体细胞、成熟细胞或分化细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是体细胞、成熟细胞或分化细胞。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，一种或多种人细胞是一种或多种体细胞、成熟细胞或分化细胞，其选自表皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、上皮细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰腺β细胞、角质化细胞、红细胞、外周血细胞、神经细胞、星形细胞、生殖细胞、精细胞和卵母细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人iPS细胞与在一种或多种人iPS细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，用于在一种或多种人诱导多能干(iPS)细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人iPS细胞，增大表达的Zscan4在一种或多种人iPS细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，复壮一种或多种人卵母细胞的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4复壮一种或多种人卵母细胞。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人卵母细胞的基因组稳定性的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人卵母细胞中的基因组稳定性。本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4诱导修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常。在一些实施方式中，在与增大Zscan4的表达的试剂接触之前，从对象分离一种或多种人卵母细胞。在一些实施方式中，在与增大Zscan4的表达的试剂接触后，一种或多种人卵母细胞经历体外受精。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种受精的人卵母细胞与在一种或多种受精的人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种受精的人卵母细胞的基因组稳定性的体外方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的受精的人卵母细胞胚胎，增大表达的Zscan4增大一种或多种受精的人卵母细胞中的基因组稳定性。本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种受精的人卵母细胞与在一种或多种受精的人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，修正一种或多种受精的人卵母细胞中的一种或多种核型异常的体外方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的受精的人卵母细胞，增大表达的Zscan4诱导修正一种或多种受精的人卵母细胞中的一种或多种核型异常。在一些实施方式中，一种或多种受精的人卵母细胞通过体外受精而受精。在一些实施方式中，在受精之前，从对象分离一种或多种人卵母细胞。在一些实施方式中，一种或多种受精卵母细胞是一细胞期和胚泡期之间的胚胎。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有端粒异常关联性疾病或状况的对象分离人骨髓细胞；ii.使人骨髓细胞与在人骨髓细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达在人骨髓细胞中诱导端粒加长；和iii.将接触的人骨髓细胞植入对象以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法：i.从患有染色体异常关联性疾病或状况的对象分离人骨髓细胞；ii.使人骨髓细胞与在人骨髓细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达诱导在人骨髓细胞中修正染色体异常；和iii.将接触的人骨髓细胞植入对象以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是选自端粒缩短的疾病、骨髓衰竭综合症、年龄相关性端粒缩短疾病或紊乱和早熟衰老疾病或紊乱的一种或多种疾病或状况。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是端粒缩短的疾病，其选自先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合症、Revesz综合症、Coats plus综合症、特发性肺纤维变性、肝硬化、胰囊性纤维化、阿耳茨海默病和骨性关节炎。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是骨髓衰竭综合症，其选自范康尼贫血、无巨核细胞血小板减少、再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血、先天性角化不良、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Pearson综合症、舒-戴二氏综合症、血小板减少和骨髓增生异常综合症。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，疾病或状况是年龄相关性端粒缩短疾病、早熟衰老疾病、或二者，其选自维尔纳综合症、布卢姆综合症、赫-吉二氏早老综合症、柯克凯内综合症、着色性干皮病、运动失调性毛细血管扩张症、罗-汤二氏综合症、毛发低硫营养不良、Juberg-Marsidi综合症和唐氏综合症。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在组织或器官中增大Zscan4的表达的试剂，复壮对象中的组织或器官的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达复壮组织或器官。
本公开内容的其它方面涉及通过向对象施用增大Zscan4的表达的试剂复壮有需要的对象的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达复壮对象。
本公开内容的其它方面涉及通过使一种或多种人细胞与在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，延长一种或多种人细胞的寿命的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在组织或器官中增大Zscan4的表达的试剂，延长对象中的组织或器官的寿命的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达延长组织或器官的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，延长对象的寿命的方法，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命，从而延长对象的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤延长对象的寿命的方法：i.从对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体，并且其中增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以延长对象的寿命。
本公开内容的其它方面涉及通过以下步骤在一种或多种人细胞中测定一种或多种Zscan4诱导效应的方法：i.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中试剂是编码Zscan4的合成mRNA分子或病毒载体，优选是编码Zscan4的仙台病毒载体；ii.测量一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平；和iii.将一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平与没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平进行比较，其中一种或多种人细胞中SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平的增大表明在一种或多种人细胞中存在一种或多种Zscan4诱导效应。
在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4的增大表达是瞬时的。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂增大Zscan4表达持续大约1小时至大约23小时。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂增大Zscan4表达持续大约1天至大约10天。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂直接与内源性Zscan4相互作用以增大Zscan4的表达。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，载体编码可操作地连接至启动子的Zscan4。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，启动子是诱导型启动子。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是Zscan4-ERT2融合蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是Zscan4-ΔC蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包括至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是鼠Zscan4、人ZSCAN4或其同系物。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4选自Zscan4a、Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e和Zscan4f。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，分离的核酸分子包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于选自SEQ ID No:1-10和21-30的核苷酸序列的核苷酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4是人ZSCAN4。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，分离的核酸分子包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ IDNO:7的核苷酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂是Zscan4蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白融合至细胞穿膜肽。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，细胞穿膜肽包含蛋白转导结构域。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，细胞穿膜肽包含聚精氨酸肽标签。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白封装在纳米颗粒中。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是鼠Zscan4蛋白、人ZSCAN4蛋白或其同系物。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白选自Zscan4a蛋白、Zscan4b蛋白、Zscan4c蛋白、Zscan4d蛋白、Zscan4e蛋白和Zscan4f蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于选自SEQ ID No:11-20和31-40的氨基酸序列的氨基酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是人ZSCAN4蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是Zscan4-ERT2融合蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4蛋白是Zscan4-ΔC蛋白。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包含鼠Zscan4蛋白、人ZSCAN4蛋白或其同系物，并且其中Zscan4蛋白包含至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包含选自Zscan4a蛋白、Zscan4b蛋白、Zscan4c蛋白、Zscan4d蛋白、Zscan4e蛋白和Zscan4f蛋白的Zscan4蛋白，并且其中Zscan4蛋白包含至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白包含人ZSCAN4蛋白，并且其中Zscan4蛋白包含至少一个锌指结构域的缺失。在可以与任何在先的实施方式组合的一些实施方式中，试剂是类维生素A、诱导氧化应激的试剂、或二者。
根据以下参照附图进行的详述，本公开内容的前述和其它目标与特征将变得更显而易见。
附图说明
图1描绘了在转染hZSCAN4-mRNA的鼠ES细胞中修正染色体异常。图1A描绘了实验过程。图1B描绘了转染hZSCAN4 mRNA的整倍体鼠ES细胞的百分比。
图2描绘了在感染表达mZscan4或hZSCAN4的仙台病毒载体的鼠ES细胞中修正染色体异常。图2A描绘了感染SeVmZscan4或SeVhZSCAN4的整倍体鼠ES细胞的百分比。图2B描绘了感染SeVmZERT2或SeVhZERT2的整倍体鼠ES细胞的百分比。
图3描绘了在感染表达mZscan4或hZSCAN4的热敏仙台病毒载体的鼠ES细胞中修正染色体异常。图3A描绘了感染SeVmZscan4-TS15或SeVhZSCAN4-TS15，然后在35℃下培养三天的整倍体鼠ES细胞的百分比。图3B描绘了感染SeVmZscan4-TS15或SeVhZSCAN4-TS15，然后在35℃下培养六天的整倍体鼠ES细胞的百分比。图3C描绘了感染SeVmZscan4-TS15或SeVhZSCAN4-TS15，然后在35℃下培养三天，并且然后在37℃下培养三天的整倍体鼠ES细胞的百分比。
图4描绘了Zscan4生物制品对鼠ES细胞的作用。图4A描绘了鼠ES细胞转染hZSCAN4mRNA的效果。图4B描绘了鼠ES细胞感染表达Zscan4的仙台病毒载体的效果。图4C描绘了鼠ES细胞感染表达mZscan4或hZSCAN4的热敏仙台病毒载体的效果。
图5描绘了Zscan4生物制品对人iPS细胞的作用。图5A描绘了人iPS细胞转染Zscan4 mRNA的效果。图5B描绘了人iPS细胞感染表达Zscan4的仙台病毒载体的效果。图5C描绘了人iPS细胞感染表达mZscan4或hZSCAN4的热敏仙台病毒载体的效果。
图6描绘了转染hZSCAN4 mRNA或GFP mRNA的来自DKC患者的人成纤维细胞的生长检测的结果。
图7A描绘了感染SeVhZScan4的来自DKC患者的人成纤维细胞的生长检测的结果。图7B显示了描绘感染SeVhZScan4的来自DKC患者的人成纤维细胞的细胞形态的显微照片。
图8A描绘了实验过程。图8B描绘了转染hZSCAN4 mRNA或GFP mRNA的来自DKC患者的人成纤维细胞的端粒长度检测的结果。
图9描绘了转染hZSCAN4 mRNA或GFP mRNA的维尔纳综合症(WS)患者的成纤维细胞的生长检测的结果。
图10描绘了使用Zscan4的示例性治疗方案。
图11描绘了显示人ZSCAN4的过表达在正常成人成纤维细胞中增大端粒长度的柱状图。“N”表示重复数。
图12描绘了显示人ZSCAN4的过表达在从患有范康尼贫血，互补群A的患者分离的人成纤维细胞中增大端粒长度的柱状图。“N”表示重复数。
图13描绘了转染hZSCAN4 mRNA、mZscan4 mRNA或GFP mRNA的人成人真皮成纤维(HDFa)细胞的生长检测的结果。图13A描绘了转染hZSCAN4 mRNA或GFP mRNA并培养约50天的HDFa细胞的生长检测的结果。图13B描绘了转染hZSCAN4 mRNA或GFP mRNA并培养约30天的HDFa细胞的生长检测的结果。图13C描绘了转染mZscan4 mRNA、hZSCAN4 mRNA或GFP mRNA并培养约20天的HDFa细胞的生长检测的结果。
图14描绘了在感染表达鼠Zscan4或人ZSCAN4的热敏仙台病毒载体的人间充质干(MS)细胞中端粒长度延长的结果。
图15描绘了Zscan4生物制品对分化细胞和组织干细胞的作用。
图16描绘了转染hZSCAN4 mRNA的来自唐氏综合症患者的成纤维细胞(DS细胞)的21号染色体的倍数性数目。图16A描绘了FISH分析的典型结果。三个点指示21三体而两个点指示正常二倍体21号染色体。图16B描绘了转染一次hZSCAN4 mRNA的DS细胞。图16C描绘了转染两次hZSCAN4 mRNA的DS细胞。在图中，“n”指示检验的细胞核的数目。
图17A描绘了实验过程。图17B描绘了感染SeVhZSCAN4-TS15一次，然后感染SeVhZSCAN4两次的来自唐氏综合症患者的成纤维细胞(DS细胞)的21号染色体的倍数性数目。图17C描绘了感染SeVhZSCAN4-TS15一次，然后感染SeVhZSCAN4四次的来自唐氏综合症患者的成纤维细胞(DS细胞)的21号染色体的倍数性数目。
图18描绘了使用鼠Zscan4或人ZSCAN4，用于在人卵母细胞、人受精卵母细胞和人植入前胚胎中复壮和/或修正染色体异常的示例性治疗方案。
图19描绘了感染SeVmZscan4-TS15或者SeVhZSCAN4-TS15的HCT116癌细胞的细胞生长的抑制。
具体实施方式
综述
如上面所讨论的，先前已经显示鼠胚胎干细胞中鼠Zscan4的表达与端粒延长相关联。考虑到鼠基因组包含六个Zscan4基因和三个Zscan4假基因，虽然人基因组仅包含一个Zscan4基因，本领域普通技术人员还没有能够将Zscan4在鼠细胞中表达的结果外推至人细胞。然而，如下面的实施例8中公开的，本申请人已经首次显示了完全分化的成人成纤维细胞中人ZSCAN4的表达在成纤维细胞中导致端粒长度增大大约40％。而且，本申请人已经显示Zscan4在从患有范康尼贫血的患者分离的人成纤维细胞中的表达在成纤维细胞中导致端粒长度增大大约160％。这些结果令人惊讶地表明Zscan4在端粒延长中是上游效应器，而不是下游作用物，因为单独的Zscan4表达显示足以在从患有范康尼贫血的患者分离的人成纤维细胞中增大端粒长度。正因如此，活化或增大Zscan4在细胞中的表达可以是对范康尼贫血或任何其它端粒缩短关联性疾病或状况的有效治疗。进一步，如下面的实施例15中公开的，本申请人还已经首次显示了Zscan4表达不仅仅是提高基因组稳定性那么简单。具有21三体的人成纤维细胞群体中的Zscan4表达诱导修正约55％细胞的21三体异常。因此，活化或增大Zscan4的表达可用于治疗细胞中的非整倍性，以及通过复壮和/或修正染色体异常，比如卵母细胞和受精卵母细胞中的非整倍性，在高龄女性中增大体外受精(IVF)和成功怀孕的成功率。
因此，本公开内容的方法一般地涉及在人细胞中增大Zscan4的表达(例如，Zscan4蛋白表达)以增大端粒长度和/或增大基因组稳定性。本公开内容的各种方面涉及在一种或多种人细胞中增大端粒长度、治疗需要端粒加长的对象、治疗端粒异常关联性疾病或状况、治疗染色体异常关联性疾病或状况、增大一种或多种人细胞的基因组稳定性、复壮一种或多种人细胞、复壮对象中的组织或器官、和复壮有需要的对象。
在一个方面，本公开内容涉及在一种或多种人细胞中增大端粒长度的方法，其包括使一种或多种人细胞与在人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
在另一个方面，本公开内容涉及治疗需要端粒加长的对象的方法，其包括使对象中的一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大表达的Zscan4诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
在另一个方面，本公开内容涉及治疗需要端粒加长的对象的方法，其包括：i.)从对象分离需要端粒加长的一种或多种人细胞；ii.)使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长；和iii.)向对象施用接触的一种或多种人细胞。
在另一个方面，本公开内容涉及治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法，其包括向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法，其包括：i.)从患有端粒异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.)使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长；和iii.)向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正染色体异常以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及通过以下步骤治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法：i.)从患有染色体异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.)使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正染色体异常；和iii.)向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，治疗核型异常关联性疾病或状况的方法，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正核型异常以治疗核型异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及通过以下步骤治疗核型异常关联性疾病或状况的方法：i.)从患有核型异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；ii.)使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导在一种或多种人细胞中修正核型异常；和iii.)向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗核型异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种癌细胞中增大Zscan4的表达的试剂治疗癌症的方法，其中增大Zscan4的表达抑制一种或多种癌细胞的生长，从而治疗癌症。
在另一个方面，本公开内容涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种癌干细胞中减小内源性ZSCAN4的表达的试剂，提高癌症患者对化学疗法的应答性的方法，其中减小内源性ZSCAN4的表达减小或消除一种或多种癌干细胞对一种或多种化学治疗剂的抗性，从而提高对象对一种或多种化学治疗剂的应答性。
在另一个方面，本公开内容涉及增大一种或多种人细胞的基因组稳定性的方法，其包括使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的基因组稳定性。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人细胞的DNA修复能力的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的DNA修复能力。
在另一个方面，本公开内容涉及复壮一种或多种人细胞的方法，其包括使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4复壮一种或多种人细胞。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，提供一种或多种人细胞对一种或多种遗传毒性剂的抗性的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞对一种或多种遗传毒性剂的抗性。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种人iPS细胞与在一种或多种人iPS细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，用于在一种或多种人诱导多能干(iPS)细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人iPS细胞，增大表达的Zscan4在一种或多种人iPS细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，复壮一种或多种人卵母细胞的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4复壮一种或多种人卵母细胞。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种人卵母细胞的基因组稳定性的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人卵母细胞中的基因组稳定性。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种人卵母细胞与在一种或多种人卵母细胞增大Zscan4的表达的试剂接触，修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人卵母细胞，增大表达的Zscan4诱导修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种受精的人卵母细胞与在一种或多种受精的人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，增大一种或多种受精的人卵母细胞的基因组稳定性的体外方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的受精的人卵母细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种受精的人卵母细胞中的基因组稳定性。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种受精的人卵母细胞与在一种或多种受精的人卵母细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，修正一种或多种受精的人卵母细胞中的一种或多种核型异常的体外方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的受精的人卵母细胞，增大表达的Zscan4诱导修正一种或多种受精的人卵母细胞中的一种或多种核型异常。
在另一个方面，本公开内容涉及治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法，其包括：i.)从患有端粒异常关联性疾病或状况的对象分离人骨髓细胞；ii.)使人骨髓细胞与在人骨髓细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达在人骨髓细胞中诱导端粒加长；和iii.)将接触的人骨髓细胞植入对象以治疗端粒异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法，其包括：i.)从患有染色体异常关联性疾病或状况的对象分离人骨髓细胞；ii.)使人骨髓细胞与在人骨髓细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达诱导在人骨髓细胞中修正染色体异常；和iii.)将接触的人骨髓细胞植入对象以治疗染色体异常关联性疾病或状况。
在另一个方面，本公开内容涉及复壮对象中的组织或器官的方法，其包括向有需要的对象施用在组织或器官中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达复壮组织或器官。
在另一个方面，本公开内容涉及复壮有需要的对象的方法，其包括向对象施用增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达复壮对象。
在另一个方面，本公开内容涉及通过使一种或多种人细胞与在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，延长一种或多种人细胞的寿命的方法，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命。
在另一个方面，本公开内容涉及通过向有需要的对象施用在组织或器官中增大Zscan4的表达的试剂，延长对象中的组织或器官的寿命的方法，其中增大Zscan4的表达延长组织或器官的寿命。
在另一个方面，本公开内容涉及通过向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，延长对象的寿命的方法，其中增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命，从而延长对象的寿命。
在另一个方面，本公开内容涉及通过以下步骤延长对象的寿命的方法：i.从对象分离一种或多种人细胞；ii.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达延长一种或多种人细胞的寿命；和iii.向对象施用接触的一种或多种人细胞以延长对象的寿命。
在另一个方面，本公开内容涉及通过以下步骤在一种或多种人细胞中测定一种或多种Zscan4诱导效应的方法：i.使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触；ii.测量一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平；和iii.将一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平与没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平进行比较，其中一种或多种人细胞中SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平的增大表明在一种或多种人细胞中存在一种或多种Zscan4诱导效应。
Zscan4
包含锌指和SCAN结构域4(zinc finger and SCAN domain containing 4)(Zscan4)基因表示先前已经认定为呈现2-细胞-特异表达和ES细胞-特异表达的一组基因(PCT公开号WO 2008/118957)。使用大规模cDNA测序工程(Ko等人，Development 127:1737-1749,2000；Sharov等人，PLoS Biol 1:E74,2003)和DNA微阵列分析(Hamatani等人，DevCell 6:117-131,2004)通过鼠胚胎的全部胚胎植入前阶段的表达谱认定Zscan4基因。在小鼠中，术语“Zscan4”是指包括三个假基因(Zscan4-ps1、Zscan4-ps2和Zscan4-ps3)和六个表达基因(Zscan4a、Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e和Zscan4f)的基因集合。在六个种内同源基因之中，Zscan4c、Zscan4d和Zscan4f的开放阅读框编码SCAN结构域——预测介导蛋白质-蛋白质相互作用——以及四个锌指结构域——暗示它们的潜在角色是转录因子。与小鼠相比，人基因组仅包含一个拷贝的Zscan4。Zscan4可以是指Zscan4多肽并且Zscan4可以是指编码Zscan4多肽的多核苷酸。
最近已经显示Zscan4(包含锌指和scan结构域的蛋白质4)——在小鼠中其在2-细胞期胚胎和ES细胞中特异地表达(Falco等人，Dev Biol 307:539-550,2007)——对于维持ES细胞中的基因组稳定性和正常核型是必需的(Zalzman等人，Nature 464:858-863,2010)。虽然仅一小部分(～1％至～5％)的未分化ES细胞在给定时间下表达Zscan4(Falco等人，Dev Biol 307:539-550,2007)，基本上全部培养的ES细胞在九次传代内经历瞬时的Zscan4+状态(Zalzman等人，Nature 464:858-863,2010)。在短发夹RNA(shRNA)介导的对Zscan4的抑制后，在大约8次传代后，ES细胞经历大量核型恶化。现有研究也已经显示鼠ES细胞的Zscan4+状态与端粒延长相关联(Zalzman等人，Nature 464:858-863,2010)。虽然ES细胞具有最好的能力以在培养中维持它们的基因组完整性，但是也广泛地认识到即使ES细胞也在长期培养中逐步地丢失它们的发育潜力。端粒可以是指真核染色体的末端——参与染色体的复制和稳定的专门结构。端粒在特定方向中包含许多短DNA序列的重复。端粒功能包括保护染色体的末端，使得染色体不最后接合在一起，并且(通过端粒酶)允许染色体的最末端的复制。在染色体的末端处的端粒DNA的重复的数目随着年龄减小。
先前还已经显示在鼠ES细胞中强制表达鼠Zscan4三天从约40kb的标准长度增大端粒的平均长度至约66kb(Zalzman等人，2010)。这表明Zscan4可单独有效地和快速地增大端粒长度。然而，不知道Zscan4是否可以在非胚胎人细胞比如成体干细胞和体细胞中增大端粒的长度。
人细胞
本公开内容的某些方面涉及通过利用在一种或多种人细胞中增大Zscan4表达(例如，Zscan4蛋白表达)的试剂，在一种或多种人细胞中增大端粒长度，所述人细胞包括但不限于人成体细胞。在某些实施方式中，一种或多种人细胞在需要端粒加长或患有或诊断有端粒异常关联性疾病或状况的对象中。
多种人细胞发现在本文所述的方法中使用。如本文公开的，术语“人细胞(一种或多种)”是指在胚胎发育期间和之后遍及人体发现的任何细胞(一种或多种)，比如人胚胎细胞、干细胞、多能细胞、分化细胞、成熟细胞、体细胞和成体细胞。在一些实施方式中，本公开内容的人细胞是人成体细胞。如本文公开的，术语“人成体细胞(一种或多种)”是指在胚胎发育之后遍及人体发现的任何细胞(一种或多种)(即，非胚胎细胞)。本公开内容的人细胞包括但不限于精细胞、卵母细胞、受精卵母细胞(即，受精卵)、胚胎细胞、成熟细胞、分化细胞、体细胞、祖细胞、胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、成体干细胞、体干细胞和组织干细胞。成体干细胞——其还被称为体干细胞或组织干细胞——可以是指在胚胎发育之后遍及人体发现的未分化细胞，其通过细胞分裂繁殖以补充死亡细胞和再生受损组织。祖细胞可以是指分化为特定类型的细胞或细胞系的寡能或单能细胞。祖细胞相似于干细胞但是分化程度更高且呈现出有限的自我更新。示例性成体干细胞、组织干细胞和/或祖细胞可以包括但不限于造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、肠干细胞、皮肤干细胞和生殖细胞(比如，精细胞和卵母细胞)。
人细胞还可以包括但不限于体细胞、成熟细胞和分化细胞。体细胞可以是指身体的任何细胞，其包括但不限于生殖细胞、组织干细胞、祖细胞、诱导多能干(iPS)细胞和分化细胞。示例性体细胞、成熟细胞、和/或分化细胞可以包括但不限于表皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、上皮细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰腺β细胞、角质化细胞、红细胞、外周血细胞、骨髓细胞、神经细胞、星形细胞和生殖细胞。生殖细胞可以是指产生两性生殖的生物体的配子(即，卵子和精子)的细胞。在某些实施方式中，生殖细胞包括但不限于卵母细胞和精细胞。在一些实施方式中，本公开内容的体细胞、成熟细胞和/或分化细胞还包括但不限于植入前胚胎。增大Zscan4的表达的试剂
本公开内容的某些方面涉及利用在人细胞中增大Zscan4表达(例如，Zscan4蛋白表达)的试剂以增大人细胞中的端粒长度。试剂可以是指任何核酸分子、蛋白质、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或其它感兴趣的分子。在一些实施方式中，试剂是通过与内源性Zscan4基因(包括任何上游或下游调控序列)直接相互作用或者通过与导致诱导Zscan4表达的基因和/或蛋白质相互作用而增大Zscan4的表达的任何试剂。在一些实施方式中，试剂可以是编码Zscan4的核酸分子，其包括但不限于合成mRNA和表达载体，其包括但不限于病毒载体比如仙台病毒载体。在其它实施方式中，试剂可以是包含Zscan4蛋白或其功能部分比如Zscan4-ΔC的多肽。在一些实施方式中，试剂可以是类维生素A或诱导氧化应激的试剂。
在一些实施方式中，在人细胞中增大Zscan4表达(例如，Zscan4蛋白表达)的本公开内容的试剂瞬时地增大Zscan4表达。例如，在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂可以增大Zscan4表达持续大约1小时至大约23小时(例如，持续大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约6小时、大约7小时、大约8小时、大约9小时、大约10小时、11小时、大约12小时、大约13小时、大约14小时、大约15小时、大约16小时、大约17小时、大约18小时、大约19小时、大约20小时、大约21小时、大约22小时或大约23小时)；或大约1天至大约10天(例如，大约1天、大约1.25天、大约1.5天、大约1.75天、大约2天、大约2.25天、大约2.5天、大约2.75天、大约3天、大约3.25天、大约3.5天、大约3.75天、大约4天、大约4.25天、大约4.5天、大约4.75天、大约5天、大约6.25天、大约6.5天、大约6.75天、大约7天、大约7.25天、大约7.5天、大约7.75天、大约8天、大约8.25天、大约8.5天、大约8.75天、大约9天、大约9.25天、大约9.5天、大约9.75天或大约10天)。
在一些实施方式中，在人细胞中增大Zscan4表达(例如，Zscan4蛋白表达)的公开的有益效果可以通过重复瞬时增大Zscan4表达而增强。因此，在某些实施方式中，在人细胞中增大Zscan4表达(例如，Zscan4蛋白表达)的本公开内容的试剂可以用于间隔每4小时、每8小时、每12小时、每16小时、每24小时、每32小时、每40小时、每48小时、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每三个月、每四个月、每六个月、每七个月、每八个月、每九个月、每10个月、每11个月、每年、每两年、每三年、每四年、每五年、每六年、每七年、每八年、每九年、每10年、每11年、每12年、每13年、每14年、每15年、每16年、每17年、每18年、每19年、每20年、每21年、每22年、每23年、每24年、每25年、每26年、每27年、每28年、每29年、每30年、每35年、每40年、每45年、或每50年反复地增大人细胞中的Zscan4表达。
如本文公开的，人细胞通常不以任何显著的量表达ZSCAN蛋白。正因如此，增大Zscan4表达的本公开内容的试剂在待治疗的细胞中增大Zscan4蛋白表达。在一些实施方式中，使用增大Zscan4表达的本公开内容的试剂治疗人细胞可导致Zscan4蛋白表达增大至少1.5倍至增大至少1,000,000倍。
因此，在某些实施方式中，例如，相对于在没有与试剂接触的人细胞中的Zscan4蛋白表达，在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂增大Zscan4蛋白表达至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.15倍、至少2.2倍、至少2.25倍、至少2.3倍、至少2.35倍、至少2.4倍、至少2.45倍、至少2.5倍、至少2.55倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍、至少6.0倍、至少6.5倍、至少7.0倍、至少7.5倍、至少8.0倍、至少8.5倍、至少9.0倍、至少9.5倍、至少10倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍、至少8,000倍、至少9,000倍、至少10,000倍、至少25,000倍、至少50,000倍、至少75,000倍、至少100、000倍、至少125,000倍、至少150,000倍、至少175,000倍、至少200,000倍、至少225,000倍、至少250,000倍、至少275,000倍、至少300,000倍、至少325,000倍、至少350,000倍、至少375,000倍、至少400,000倍、至少425,000倍、至少450,000倍、至少475,000倍、至少500,000倍、至少525,000倍、至少550,000倍、至少575,000倍、至少600,000倍、至少625,000倍、至少650,000倍、至少675,000倍、至少700,000倍、至少725,000倍、至少750,000倍、至少775,000倍、至少800,000倍、至少825,000倍、至少850,000倍、至少875,000倍、至少900,000倍、至少925,000倍、至少950,000倍、至少975,000倍或至少1,000,000倍。
可以使用测定细胞中的Zscan4蛋白表达或定量每个细胞蛋白质的数目(即，蛋白质化学计量学)的本领域已知的和本文公开的任何方法。在一些实施方式中，不是在使用试剂治疗的细胞群体或对象中的全部细胞都将受试剂影响。例如，在其中试剂是表达Zscan4的病毒载体的实施方式中，病毒载体可以不感染治疗的细胞群体或对象中的每个细胞。正因如此，如本文使用的Zscan4蛋白表达的“成倍增大”是指在受试剂影响的治疗的细胞群体或对象中的细胞中Zscan4蛋白表达的平均增大。例如在其中试剂是病毒载体的实施方式中，Zscan4蛋白表达的成倍增大可以是指在治疗的细胞群体或对象中的感染细胞中的Zscan4蛋白表达的平均增大。
Zscan4多核苷酸
在一些实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂是包括编码Zscan4蛋白的核酸序列的核酸分子。多核苷酸可以是指任何长度的核酸序列(比如线性序列)。因此，多核苷酸包括寡核苷酸，以及还有在染色体中发现的基因序列。寡核苷酸是通过天然磷酸二酯键接合的多个接合核苷酸。寡核苷酸是在长度上具有6和300个核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸类似物是指功能类似于寡核苷酸但具有非自然出现的部分的部分。例如，寡核苷酸类似物可包含非自然出现的部分，比如改变的糖部分或糖间键合(inter-sugar linkage)，比如硫代磷酸寡核苷酸。自然出现的多核苷酸的功能类似物可结合至RNA或DNA，并且包括肽核酸(PNA)分子。
编码Zscan4多肽的核酸分子被称为Zscan4多核苷酸或核酸分子。这些多核苷酸包括编码Zscan4的DNA、cDNA和RNA序列，比如mRNA序列。应当理解的是，本文还包括编码Zscan4多肽的全部多核苷酸，只要它们编码具有识别Zscan4活性比如调节基因组稳定性或端粒长度的能力的多肽。基因组稳定性可以是指细胞如实地复制DNA并维持DNA复制机器(machinery)的完整性的能力。长端粒被认为提供对抗细胞衰老的缓冲，并且通常指示基因组稳定性和总体细胞健康。染色体稳定性(例如，极少突变、没有染色体重排或数目变化)与基因组稳定性也是相关联的。基因组稳定性的丧失与癌症、神经紊乱和早熟衰老相关联。基因组不稳定的征兆包括提高的突变率、严重的染色体重排、染色体数目变化和端粒缩短。
先前已经在本领域中描述Zscan4核酸序列(参见，例如，WO 2008/118957，其公开内容在本文通过引用并入；Falco等人，Dev.Biol.307(2):539-550,2007；和Carter等人，Gene Expr.Patterns.8(3):181-198,2008)。Zscan4核酸可以包括但不限于呈现2细胞胚胎期或ES细胞特异表达的鼠Zscan4基因的群组中的任何一个(包括Zscan4a、Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e和Zscan4f)、人直接同源物ZSCAN4、或Zscan4的任何其它物种直接同源物。
如本文公开的，鼠Zscan4a基因的核苷酸序列陈述在SEQ ID NO:1中，鼠Zscan4b基因的核苷酸序列陈述在SEQ ID NO:2中，鼠Zscan4c基因的核苷酸序列陈述在SEQ ID NO:3中，鼠Zscan4d基因的核苷酸序列陈述在SEQ ID NO:4中，鼠Zscan4e基因的核苷酸序列陈述在SEQ ID NO:5中，并且鼠Zscan4f基因的核苷酸序列陈述在SEQ ID NO:6中。此外，人ZSCAN4基因的核苷酸序列陈述在SEQ ID NO:7中。
来自其它物种的Zscan4核酸序列是可公开获取的，其包括狗Zscan4(GenBank登录号XM.sub.--541370.2和XM.sub.--848557.1；SEQ ID NO:8)；牛Zscan4(GenBank登录号XM.sub.--001789250.1；SEQ ID NO:9)；马Zscan4(GenBank登录号XM.sub.--001493944.1；SEQ ID NO:10)；大猩猩Zscan4(UniProt登录号A1YEQ9的核苷酸序列；SEQ ID NO:21)；倭黑猩猩Zscan4(UniProt登录号A1YFX5的核苷酸序列；SEQ ID NO:22)；婆罗洲猩猩Zscan4(UniProt登录号A2T7G6的核苷酸序列；SEQ ID NO:23)；苏门答腊猩猩(UniProt登录号H2P0E3的核苷酸序列；SEQ ID NO:24)；大熊猫Zscan4(UniProt登录号G1LE29的核苷酸序列；SEQ ID NO:25)；猪Zscan4(UniProt登录号F1SCQ2的核苷酸序列；SEQ ID NO:26)；白颊长臂猿Zscan4(UniProt登录号G1RJD4的核苷酸序列；SEQ ID NO:27)；普通猕猴Zscan4(UniProt登录号F7GH55的核苷酸序列；SEQ ID NO:28)；豚鼠Zscan4(UniProt登录号H0V5E8的核苷酸序列；SEQ ID NO:29)；和多纹地松鼠(Thirteen-lined ground squirrel)(UniProt登录号I3N7T3的核苷酸序列；SEQ ID NO:30)。每个上面列出的GenBank登录号在本文通过引用并入，因为它出现在2009年8月11日的GenBank数据库中。每个上面列出的UniProt登录号在本文通过引用并入，因为它出现在2013年3月15日的UniProt数据库中。
在具体的实例中，Zscan4是鼠Zscan4c或人ZSCAN4。Zscan4核酸还可以包括但不限于Zscan4核酸或其同系物，其编码能够增大基因组稳定性和/或增大端粒长度的Zscan4多肽。
本领域普通技术人员可使用分子技术容易地制备Zscan4多核苷酸的片段和变体。在一些实施方式中，Zscan4多核苷酸的片段包括至少250个、至少500个、至少750个、至少1000个、至少1500个或至少2000个连续核酸的Zscan4多核苷酸。在一些实施方式中，Zscan4的片段是当在感兴趣的细胞中表达时给予Zscan4功能的片段，比如，但不限于增大基因组稳定性和/或增大端粒长度。
Zscan4多核苷酸序列的较小修饰可导致肽的表达，其相对于本文所述的未修饰的对应多核苷酸具有基本上等价的活性。这样的修饰可以是有意的——如通过定点突变，或可以是自发的。通过这些修饰产生的全部多核苷酸都包括在本文中。
Zscan4多核苷酸可包括重组DNA，其被并入载体；并入自主复制的质粒或病毒；或并入原核生物或真核生物的基因组DNA，或者其作为独立于其它序列的单独分子(例如，cDNA)存在。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一个核苷酸的修饰形式。术语包括单链和双链形式的DNA。重组核酸或多肽是具有不是自然出现的序列或具有通过人工组合序列的两个另外分开的片段而制得的序列的核酸或多肽。此人工组合通常通过化学合成或通过人工操作核酸的分离的片段，例如，通过基因工程技术完成。
在一些实施方式中，可在本公开内容的方法中使用本文所述的任何Zscan4多核苷酸的简并变体(degenerative variant)。简并变体可以是指编码多肽比如Zscan4多肽的多核苷酸，其包括由于遗传密码而简并的序列。存在20个天然氨基酸，其中大多数被超过一个的密码子所规定。因此，包括全部简并核苷酸序列，只要通过核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列没有改变。
Zscan4编码序列可以可操作地连接至异源启动子以指导编码核酸序列的Zscan4的转录。启动子可以是指指导核酸的转录的核酸控制序列。启动子包括在转录起始位点附近的必要的核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏元件。组成型启动子是连续地活跃并不受外部信号或分子调控的启动子。相比之下，诱导型启动子的活性被外部信号或分子(例如，转录因子)调控。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列可操作地连接至第二核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。一般而言，可操作地连接的核酸序列是连续的，并且在其中有必要以相同的阅读框接合两个蛋白质编码区。异源多肽或多核苷酸是指来源于不同来源或物种的多肽或多核苷酸。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列，比如，在II型聚合酶启动子、TATA元件的情况下。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏元件，其可以距转录起始位点差不多数千个碱基对而定位。在一个实例中，启动子是组成型启动子，比如CAG启动子(Niwa等人，Gene 108(2):193-9,1991)，或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施方式中，启动子是诱导型启动子比如四环素-诱导型启动子(Masui等人，Nucleic AcidsRes.33:e43,2005)。可用于驱动Zscan4表达的其它示例性启动子包括但不限于：lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、SV40的早期和晚期启动子、来源于多瘤的启动子、腺病毒、反转录病毒、杆状病毒与猿猴病毒、用于3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子、和酵母α-交配因子的启动子。在一些实施方式中，使用天然Zscan4启动子。本公开内容的Zscan4多核苷酸可以在组成型启动子、诱导型启动子、或本文所述的任何其它合适启动子、或本领域普通技术人员将容易想到的其它合适启动子的控制下。
两个或更多个核酸序列、或两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性根据序列之间的同一性或相似性表达。根据百分比同一性测量序列同一性；百分比越高，序列越同一。可根据百分比相似性测量序列相似性(其考虑保守氨基酸替换)；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同系物或直接同源物具备相对高程度的序列同一性/相似性。当相比于更远缘相关的物种(比如人和线虫序列)，直向同源蛋白质或cDNA来源于更紧密相关的物种(比如人和鼠序列)时，此同源性是更显著的。
在两个或更多个序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)背景下的术语“同一的”或百分比“同一性”可以是指相同的两个或更多个序列或子序列。当在比较窗口或指定区域上比较和比对最大对应时，如果两个序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的规定的百分比(即，在规定的区域上，或者当未规定时，在整个序列上29％的同一性，任选地30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性)，则两个序列是基本上同一的，如使用以下序列比较算法中的一个或通过人工比对和目测所测量的。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法，测试和参考序列被输入计算机，指定子序列坐标——如果必要的话，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定可选的参数。序列比较算法然后基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。当因同一性比较两个序列时，序列没有必要是连续的，但是任何缺口将使其带有将减小总体百分比同一性的罚分。对于blastp，默认参数是跳空缺口(Gap opening)罚分＝11且缺口延伸(Gap extension)罚分＝1。对于blastn，默认参数是跳空缺口罚分＝5且缺口延伸罚分＝2。
比较窗口可以包括参考任一个数目的连续位置的片段，所述数目包括但不限于从20至600，经常大约50至大约200，更经常大约100至大约150，其中在两个序列最佳地比对后，序列可以与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。例如，可以通过Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J Mol Biol 48(3):443-453的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448的相似性搜索方法，通过这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI)的计算机化实施，或通过人工比对和目测[参见，例如，Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou Ed)]，进行用于比较的最佳序列比对。
适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述在Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol Biol 215(3)-403-410中。用于进行BLAST分析的软件是可以通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获取的。此算法涉及首先通过鉴定查询序列中的长度W的短字(word)来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述短字匹配或者满足一些正值的阈值评分T。T被称为邻近字评分阈值(Altschul等人，如上)。这些最初的邻近字命中(hit)充当起始检索以找到更长的包含它们的HSP的种子。然后字命中沿着每个序列的两个方向延伸直到累积比对评分不能增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于匹配残基对的奖励评分；总是>0)和参数N(对于错配残基对的惩罚评分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。当：累积比对评分从其最大到达值下跌数量X时；由于一个或多个负评分残基比对的积累，积累评分到零或以下时；或到达任一序列的末端时，字命中在每个方向中的延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏性和速度。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长、和10的期望值(E)、和50的BLOSUM62评分矩阵[参见Henikoff和Henikoff，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919]比对(B)、10的期望值、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。对于核苷酸序列，BLASTN程序使用11的字长(W)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4和两条链比较作为默认值。
BLAST算法还在两个序列之间进行相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul，(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877)。由BLAST算法提供的相似性的一个测量是最小合计概率(P(N))，其对两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的几率提供指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小合计几率小于大约0.2，更优选小于大约0.01，并且最优选小于大约0.001，则核酸被认为相似于参考序列。
两个核酸分子密切相关的一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。然而由于遗传密码的简并性，不显示高度同一性的核酸序列可以编码同一的或相似的(保守的)氨基酸序列。使用此简并性可以在核酸序列中做出改变以产生全部编码基本上相同的蛋白质的多种核酸分子。两个核酸序列基本上同一的可选的(并且不必要累积的)指示是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽免疫交叉反应。
而且，两个多肽基本上同一的一个指示是第一多肽与抵御第二多肽升高的抗体免疫交叉反应。因而，多肽通常基本上同一于第二多肽，例如，其中两个肽仅保守替换不同。
本公开内容的各种方面涉及分离的实体，比如分离核酸或合成mRNA分子。分离核酸已经基本上从其它核酸序列和从其中核酸自然出现的生物体的细胞分开或纯化，即，其它染色体和染色体外DNA和RNA。术语“分离的”因而包含通过标准核酸纯化方法纯化的核酸。术语还包含通过重组表达在宿主细胞中制备的核酸以及化学合成的核酸。类似地，分离蛋白质已经基本上从其中蛋白质自然出现的生物体的细胞的其它蛋白质分开或纯化，并且包含通过重组表达在宿主细胞中制备的蛋白质以及化学合成的蛋白质。类似地，分离细胞已经基本上从其它细胞类型分开。
因此，在某些实施方式中，本公开内容的多核苷酸包括由于遗传密码而是简并的序列。存在20个天然氨基酸，其中大多数被超过一个的密码子所规定。因此，包括全部简并核苷酸序列，只要通过核苷酸序列编码的Zscan4多肽的氨基酸序列是没有功能改变的。如本文公开的，Zscan4多核苷酸编码Zscan4多肽。编码Zscan4多肽的示例性多核苷酸序列可以包括，例如，来自SEQ ID No:1-10和21-30的核苷酸序列。进一步，根据本公开内容的任何方法，人ZSCAN4的非人同系物可用于增大人对象中的Zscan4表达，因为这样的非人Zscan4同系物的表达是瞬时的，并且正因如此将不导致人对象中的不良免疫应答。
在一些实施方式中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸是人ZSCAN4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸是鼠Zscan4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸是Zscan4a多核苷酸、Zscan4b多核苷酸、Zscan4c多核苷酸、Zscan4d多核苷酸、Zscan4e多核苷酸或Zscan4f多核苷酸。在一些实施方式中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸是狗Zscan4多核苷酸、牛Zscan4多核苷酸、马Zscan4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于来自SEQ ID NO:1-10和21-30中的任一个的核苷酸序列的核苷酸序列。
在某些实施方式中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸是人ZSCAN4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:7的核苷酸序列的核苷酸序列。
将Zscan4多核苷酸引入人细胞的方法
在一些实施方式中，Zscan4多核苷酸被引入人细胞。将核酸分子或蛋白质引入细胞包括将核酸分子或蛋白质递送入细胞的任何手段。例如，核酸分子可被转染、转导或电穿孔入细胞。例如，可以通过将蛋白质融合至细胞穿膜肽，比如具有蛋白转导结构域(例如，HIV-1 Tat)的肽、或聚精氨酸肽标签(Fuchs和Raines，Protein Science 14:1538-1544,2005)，实现将蛋白质递送入细胞。蛋白转导结构域可以是指小阳离子肽，其通过独立于经典的胞吞的机制促进较大分子(蛋白质、核酸分子等)进入细胞。聚精氨酸肽标签可以是指由精氨酸残基组成的短肽(通常7至11个残基)，其促进较大分子(比如蛋白质和核酸分子)递送入细胞(参见，例如，Fuchs和Raines，Protein Science 14:1538-1544,2005)。
将Zscan4多核苷酸引入人细胞可涉及使用病毒载体(比如整合或非整合病毒载体)或质粒载体，递送编码Zscan4多核苷酸的mRNA分子，或直接递送Zscan4蛋白。这些方法中的每个已经在本领域中描述并且因此在本领域普通技术人员的能力内。本文提供了可用于递送Zscan4至人细胞的每个方法的简述。载体可以是指如引入宿主细胞的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许它在宿主细胞中复制的核酸序列，比如复制起点(参与起始DNA合成的DNA序列)。例如，表达载体包含必要调控序列以允许一个或多个插入基因的转录和翻译。载体还可以包括一种或多种可选择的标记基因和本领域已知的其它基因元件。载体可以包括，例如，病毒载体和质粒载体。
Zscan4启动子序列和表达载体
包括Zscan4启动子序列的表达载体，其可操作地连接至编码异源多肽(比如报道基因)的核酸序列，可用于鉴定表达Zscan4的细胞。检测报道基因的表达的方法根据报道基因的类型变化并且在本领域是众所周知的。例如，当使用荧光报道基因时，可通过FACS或荧光显微术实现表达的检测。可使用可选的方法实现表达Zscan4的人细胞的鉴定，其包括但不限于，使用ZSCAN4特异性抗体或通过原位杂交。
在一些实施方式中，异源核酸序列(比如报道分子)在Zscan4启动子(例如在载体中)的控制下表达。Zscan4启动子可以是调控本文所述的内源性Zscan4多核苷酸的表达的启动子序列。Zscan4启动子的鉴定完全在本领域普通技术人员的能力内，并且考虑到本公开内容。其它表达控制序列——包括合适的增强子、转录终止子、在蛋白质编码基因前的起始密码子(即，ATG)、内含子剪接信号和终止密码子——可与Zscan4启动子一起包括在表达载体中。通常启动子至少包括足以指导异源核酸序列转录的最小序列。在一些实施方式中，异源核酸序列编码报道分子。
在一些实施方式中，异源核酸序列(比如报道分子)被并入对象的基因组DNA，比如通过同源重组。例如，GFP的编码序列可被插入Zscan4的编码区，或可能置换Zscan4的编码区，以便于GFP以与内源性Zscan4相同的方式表达。通过同源重组的基因“敲入”方法在本领域中是众所周知的。
由异源核酸序列编码的异源蛋白质通常是报道分子，比如标记、酶、荧光蛋白、给予细胞抗生素抗性的多肽、或抗原，其可以使用常规的分子生物学过程鉴定。报道分子可用于鉴定感兴趣的细胞或细胞群体，比如已经与在人细胞中增大Zscan4表达的试剂接触的人细胞。在一些实施方式中，异源蛋白质是荧光标记(比如绿色荧光蛋白或其变体，例如Emerald(Invitrogen,Carlsbad,Calif.))；抗原标记(比如人生长激素、人胰岛素、人HLA抗原)；细胞表面标记(比如CD4或任何细胞表面受体)；或酶标记(比如lacZ、碱性磷酸酶)。报道基因的表达指示细胞表达Zscan4。检测报道基因的表达的方法根据报道基因的类型变化并且在本领域是众所周知的。例如，当使用荧光报道基因时，可通过FACS或荧光显微术实现表达的检测。
表达载体通常包含复制起点以及特定基因，其允许对转化细胞进行表型选择，比如抗生素抗性基因。适于本文使用的载体在本领域中是众所周知的，其包括病毒载体和质粒载体(比如本文所述的那些)。在一些实施方式中，增强子位于Zscan4启动子的上游，但是增强子元件通常位于载体上的任何地方并仍具有增强效果。然而，增大的活性的量将通常随距离减小。此外，增强子序列的两个或更多个拷贝可以一个接一个可操作地连接以产生甚至更大增大的启动子活性。
包括Zscan4启动子的表达载体可用于转染宿主细胞，比如，例如，人细胞。能够在宿主中表达和复制的生物学功能病毒和质粒DNA载体在本领域中是众所周知的，并且可用于转染感兴趣的任何细胞。宿主细胞可以是指载体可以在其中繁殖且它的DNA在其中表达的细胞。术语还包括对象宿主细胞的任何子代。应当理解的是，全部子代可以不同一于亲代细胞，因为可以存在在复制期间发生的突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时包括这样的子代。
转染的细胞可以是指核酸分子(例如，DNA分子)，比如包括Zscan4启动子元件的DNA分子已经被引入其中(或已经被引入其祖先中)的宿主细胞。转染过程或转染可以是指将核酸引入细胞或组织的过程。可以通过大量方法中的任一个实现转染，比如，但不限于脂质体介导的转染、电穿孔和注射。可通过本领域普通技术人员众所周知的常规技术进行重组核酸分子对宿主细胞的转染。转染可包括脂质体介导的转染、电穿孔、注射或将核酸分子引入细胞的任何其它合适的技术。
病毒载体
在一些实施方式中，在本公开内容的方法中使用的载体是病毒载体。多种病毒载体在本领域中是已知的，并且描述在本文中。
可以在本公开内容的方法中使用副粘病毒。副粘病毒载体可包括但不限于载体(或运载体)，其来源于副粘病毒并用于基因转移，比如Zscan4多核苷酸，转移至宿主细胞，比如人细胞。副粘病毒载体可以是核糖核蛋白(RNP)或具有感染性的病毒颗粒。感染性可以是指副粘病毒载体通过它的细胞粘附和膜融合能力转移包含在载体中的基因至载体粘附至其的细胞的能力。副粘病毒载体可具有复制能力或可以是不具有复制能力的缺陷载体。复制能力可以是指副粘病毒载体在感染病毒载体的宿主细胞中复制和产生感染性病毒颗粒的能力(参见例如US 2004/0005296)。
副粘病毒是副粘病毒科家族的病毒或其衍生物。副粘病毒可以包括但不限于属于副粘病毒科的病毒，比如仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、猿猴副流感病毒(SV5)、和I、II与III型人副流感病毒。本文使用的病毒载体可基于副粘病毒属的病毒或其衍生物。本文使用的病毒载体可基于多种副粘病毒，其包括但不限于I型人副流感病毒(HPI-V-1)、III型人副流感病毒(HPIV-3)、III型牛副流感病毒(BPIV-3)、仙台病毒(还称为“I型鼠副流感病毒”)或x型猿猴副流感病毒(SPIV-10)。这些病毒可以是自然出现的、野生型、突变体、实验室传代的、或人工构建的毒株。不完全病毒比如，例如，DI颗粒(Willenbrink W.和Neubert W.J.，J.Virol.,1994,68,8413-8417)和合成的寡核苷酸还可被利用为生产本文使用的副粘病毒病毒载体的材料(参见例如US 2004/0005296)。
编码副粘病毒的蛋白质的基因包括NP、P、M、F、HN和L基因。NP、P、M、F、HN和L基因表示分别编码核壳体蛋白质、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶和大蛋白的那些基因。NP基因还可表示为N基因。前述的副粘病毒蛋白在本领域中是众所周知的。例如，仙台病毒——例如，在核苷酸序列数据库中分类为副粘病毒科的呼吸道病毒——的每个基因的登录号是NP基因的M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218；P基因的M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008；M基因的D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056；F基因的D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131；HN基因的D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131；和L基因的D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886(参见例如US 2004/0005296)。请注意，本文使用的基于副粘病毒的载体，比如基于仙台病毒的载体可以包括修饰，比如内源性病毒蛋白的缺失。
基于副粘病毒的病毒载体可用于在宿主细胞中表达核酸。因为副粘病毒载体在人中是不致病的，考虑到安全，它们可被建议优选地在人基因治疗的临床试验中利用。高效基因转移中的主要障碍是，在大多数情况下，引入的DNA必须转运进入细胞核或核膜，必须经由质粒DNA或类似消除外源性基因的表达。然而，在仙台病毒的情况下，当病毒复制时，细胞质中的细胞微管蛋白和它的RNA聚合酶(L蛋白质)二者驱动外源性基因的表达。这表明，仙台病毒不与宿主细胞的染色体相互作用，其避免比如细胞的癌化和无限增殖化的风险。而且，仙台病毒已知在引起肺炎的啮齿动物中是致病的，但在人中不是致病的，其被显示鼻腔给药野生型仙台病毒不伤害非人灵长类的研究所支持(Hurwitz J.L.等人，Vaccine,1997,15,533-540)。这些特征表明可以在人治疗中利用仙台病毒载体，并且进一步，支持仙台病毒载体可以是有前景的工具的想法，特别用于使人细胞与在人细胞中增大Zscan4表达的试剂(参见例如US 2004/0005296)。因此，在某些实施方式中，病毒载体是仙台病毒载体。在一些实施方式中，仙台载体是热敏仙台载体。例如，TS15热敏仙台载体在35℃下有功能，但当在37℃下培养时可失活(参见例如，Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。进一步热敏仙台载体的实例包括但不限于TS7和TS13仙台载体，其在32℃、35℃和37C下是有功能的；但当在38℃或39℃下培养时可失活(参见例如，Ban等人，ProcNatl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。本领域已知的任何其它变体仙台载体还可用于表达本公开内容的Zscan4。
进一步，还可在本文使用反转录病毒载体(例如，基于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)的载体)(参见例如Takahashi等人，Cell 126:663-666,2006；Takahashi等人，Cell 31:861-872,2007；Okita等人，Nature 313-317,2007；Park等人，Nature 451:141-146；美国专利申请公开号2009/0047263)。利用基于慢病毒的载体的研究(Brambrink等人，Cell StemCell 2:151-159,2008；Wernig等人，Nat Biotechnol 26:916-924,2008；Stadtfeld等人，Science 322:945-949,2008)表明这些载体的优势，如能够感染分裂和非分裂细胞二者，从而提高细胞转导率。此外，慢病毒可以是假型的(pseudotyped)以扩大病毒嗜性。例如，使用水泡性口炎病毒糖蛋白(VSVg)假型包装(pseudotyping)能够感染大范围的细胞类型(Lai等人，J Assist Reprod Genet 28(4):291-301,2011)。慢病毒还允许蛋白质的组成型和诱导型表达二者。Hockmeyer等人(Cell Stem Cell 3:346-353,2008)和Wernig等人(NatBiotechnol 26:916-924，2008)描述了药物诱导型慢病毒表达系统的实例。
慢病毒包括但不限于人免疫缺陷病毒(比如HIV-1和HIV-2)、猫科免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒和猿猴免疫缺陷病毒。其它反转录病毒包括但不限于人T淋巴细胞病毒、猿猴T淋巴细胞病毒、鼠白血病病毒、牛白血病病毒和猫科白血病病毒。本领域已经很好地描述了生成反转录病毒和慢病毒载体的方法和它们的用途(参见，例如，美国专利号7,211,247；6,979,568；7,198,784；6,783,977；和4,980,289)。
非整合病毒载体，比如腺病毒载体，也已经被用于递送编码蛋白质的核酸分子至细胞。例如腺病毒载体，其可以以游离形式保留在细胞中，已经被成功地用于递送蛋白质进入鼠成纤维细胞和肝细胞(Stadtfeld等人，Science 322:945-949,2008)。
在一些实施方式中，使用包含SV40的启动子和增强子区或劳斯肉瘤病毒的长末端重复(LTR)和来自SV40的多腺苷酸化和剪接信号的载体(Mulligan和Berg，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072-6；Gorman等人，1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6777-81)。在一些实施方式中，载体是病毒载体，比如腺病毒载体，比如在美国专利号4,797,368(Carter等人)和在McLaughlin等人(J.Virol.62:1963-73,1988)中描述的腺相关病毒(AAV)、和4型AAV(Chiorini等人的J.Virol.71:6823-33,1997)、和5型AAV(Chiorini等人的J.Virol.73:1309-19,1999)，或反转录病毒载体(比如莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、和来源于反转录病毒比如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒的载体)。还可利用其它病毒转染系统，其包括牛痘病毒(Moss等人，1987,Annu.Rev.Immunol.5:305-24)、牛乳头瘤病毒(Rasmussen等人，1987，Methods Enzymol.139:642-54)或疱疹病毒组的成员比如爱泼斯坦-巴尔病毒(Margolskee等人，1988,Mol.Cell.Biol.8:2837-47)。此外，载体可包含抗生素选择性标记(比如新霉素、潮霉素或霉酚酸)以允许选择呈现稳定、长期表达载体(并因此表达Zscan4核酸)的转染的细胞。
通过使用病毒比如乳头瘤病毒(Sarver等人，1981,Mol.Cell.Biol.1:486)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Sugden等人，1985,Mol.Cell.Biol.5:410)的调控元件，可以在细胞中将载体维持为游离型、自由复制实体。可选地，还可以产生将载体整合入基因组DNA的细胞系。这些类型的细胞系都连续产生基因产物。本领域普通技术人员还可以生产扩增载体的拷贝数(并且因此也扩增cDNA的拷贝数)的细胞系以建立可以产生高水平的基因产物的细胞系。
质粒载体
在一些情况下，使用非病毒载体是可取的，比如避免整合入宿主细胞基因组。因而，可使用一种或多种质粒载体递送Zscan4编码多核苷酸至人细胞。质粒载体是游离维持的，并且通常呈现短期间的基因表达(Lai等人，J Assist Reprod Genet 28(4):291-301,2011)。举一个例子，Okita等人(Science 322:949-953,2008)描述了包含CAG启动子的pCX质粒用于在体细胞中表达蛋白质的用途。
游离型质粒载体是用于将Zscan4-编码多核苷酸引入人细胞的进一步选项。游离型质粒载体能够作为染色体外元件自主地复制其自身，并且因此在靶细胞中呈现长时间基因表达。来源于爱泼斯坦-巴尔病毒的游离型质粒载体(oriP/EBNA1)已经用于在人体细胞中表达蛋白质(Yu等人，Science 324:797-801,2009)。
选择合适的载体完全在本领域普通技术人员的能力内。表达载体通常包含复制起点、启动子、和任选地包括特定基因以允许转化细胞的表型选择(例如抗生素抗性盒)。一般而言，表达载体将包括启动子。启动子可以是诱导型或组成型的。启动子还可以是组织特异的。示例性启动子包括CAG启动子、胸苷酸激酶启动子(TK)、金属硫因I、多面体、神经元特异性烯醇酶、酪氨酸羟化酶、肌动蛋白、CMV即时早期启动子或其它启动子。任选地，还包括增强子元件，并且可以通常位于载体上的任何地方并仍对基因表达具有增强效果。
可以使用任何合适的方法将质粒载体引入人细胞。在一些实施方式中，使用阳离子聚合物的脂质通过转染将载体递送至细胞。在具体的实例中，转染试剂是LIPOFECTAMINETM，或者类似试剂。在其它实例中，使用Nucleofection转染技术(Amaxa,Cologne,Germany)实现递送。此技术基于使用NUCLEOFECTORTM递送装置以将DNA直接引入宿主细胞细胞核的电穿孔技术(Lakshmipathy等人，Stem Cells 22:531-543,2004)。在还另一个实例中，转染试剂包括聚β氨基酯。
转运DNA进入人或其它哺乳动物细胞是常规技术。例如，分离的Zscan4核酸序列(例如作为裸DNA或作为表达载体的一部分)例如可通过磷酸钙(Graham和vander Eb，1973,Virology 52:466)或磷酸锶(Brash等人，1987,Mol.Cell.Biol.7:2013)沉淀、电穿孔(Neumann等人，1982,EMBO J.1:841)、脂质转染(Felgner等人，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413)、DEAE葡聚糖(McCuthan等人，1968,J.Natl.CancerInst.41:351)、显微注射(Mueller等人，1978,Cell 15:579)、原生质体融合(Schafner，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2163-7)或丸枪(pellet gun)(Klein等人，1987,Nature 327:70)可被导入受体细胞。
切除策略
切除来自基因组整合位点的外源性多核苷酸可以是可取的。先前已经描述了两个基于切除的方法：CreloxP重组和piggyBac转座。Soldner等人(Cell 136:964-977,2009)描述了Cre-lox系统的用途。此策略包括在包含Dox可诱导的最小CMV启动子的慢病毒载体的3’LTR定位loxP位点以驱动重编程因子的表达。在前病毒复制期间，loxP被复制入5’LTR，导致基因组整合的重编程因子两侧与两个loxP位点相接。Cre重组酶的瞬时表达导致在序列两侧加上loxP位点的(floxed)重编程因子的切除。
piggyBac转座能够切除其自身而不在细胞基因组中留下外源性DNA的任何残留物(Elick等人，Genetica 98:33-41,1996；Fraser等人，Insect Mol Biol 5:141-151,1996)。使用此方法，通过递送多顺反子构建体，超过两种蛋白质已经成功地在人细胞中产生，所述构建体携带与在piggyBac转座子5’和3’末端重复之间定位的2A肽接头相连的基因。在表达转座酶后，观察到整合的重编程基因的精确切除(Kaji等人，Nature 458:771-775,2009；Wang等人，Proc Natl Acad Sci USA 105:9290-9295,2008；Yusa等人，Nat Methods 6:363-369,2009)。
mRNA
将Zscan4引入人细胞的另一个策略是通过递送编码Zscan4的合成mRNA。已经显示通过将编码蛋白质的合成mRNA转染入细胞可以高效地产生特定的蛋白质(Warren等人，Cell Stem Cell 7(5):618-630,2010)。在Warren等人的研究中，mRNA被修饰以克服先天的抗病毒反应。重复地进行mRNA的转染——每天一次持续多达数周以补偿此方法的瞬时性质，因为mRNA在细胞中快速地降解。此具体特征对Zscan4可以是有利的，它的表达仅需要很短时间(例如，大约几小时和几天)以实现期望的效果(即，延长端粒和增大基因组稳定性)。在某些实施方式中，编码Zscan4的合成mRNA被封装在病毒包膜中。优选地，病毒包膜层包含识别细胞表面受体的包膜蛋白，并且正因如此增大递送合成Zscan4 mRNA进入细胞的效率。在某些实施方式中，编码Zscan4的合成mRNA被封装在涂布有病毒包膜蛋白的纳米颗粒或脂质体中。可以使用本领域已知的任何合适的病毒包膜。在一些实施方式中，病毒包膜是仙台病毒包膜。在病毒包膜或病毒包膜蛋白中封装多核苷酸，比如合成mRNA的方法在本领域中是众所周知的。
包括Zscan4多核苷酸的细胞
本文进一步提供的是包含如本文所述的Zscan4核酸分子或包含Zscan4的载体的分离细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。人细胞的起源可以来自任何合适的人种。人细胞可以包括本文所述的任何类型的人细胞。
Zscan4多肽
在某些实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂是Zscan4多肽。多肽可以是指其中单体是通过酰胺键接合在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-旋光异构体或者D-旋光异构体，L-异构体是优选的。术语“多肽”或“蛋白质”意欲包含任何氨基酸序列并包括修饰序列比如糖蛋白。术语“多肽”具体地意欲覆盖天然出现的蛋白质，以及重组地或合成地产生的那些。
多种Zscan4多肽在本领域中是已知的，并且可用于本文所述的方法。本领域普通技术人员将领会本文所述的多种Zscan4多肽保持Zscan4活性，比如在细胞中增大端粒长度和/或基因组稳定性的能力，可以用于本文所述的方法。
本文提供了示例性Zscan4多肽。例如，鼠Zscan4a多肽的氨基酸序列陈述在SEQ IDNO:11中，鼠Zscan4b多肽的氨基酸序列陈述在SEQ ID NO:12中，鼠Zscan4c多肽的氨基酸序列陈述在SEQ ID NO:13中，鼠Zscan4d多肽的氨基酸序列陈述在SEQ ID NO:14中，鼠Zscan4e多肽的氨基酸序列陈述在SEQ ID NO:15中，鼠Zscan4a多肽的氨基酸序列陈述在SEQ ID NO:11中，和鼠Zscan4f多肽的氨基酸序列陈述在SEQ ID NO:16中。此外，人ZSCAN4多肽的氨基酸序列陈述在SEQ ID NO:17中。
来自多种其它物种的Zscan4氨基酸序列是可公开获取的，其包括狗Zscan4(GenBank登录号XP.sub.--541370.2和XP.sub.--853650.1；SEQ ID NO:18)；牛Zscan4(GenBank登录号XP.sub.--001789302.1；SEQ ID NO:19)；马Zscan4(GenBank登录号XP.sub.--001493994.1；SEQ ID NO:20)；大猩猩Zscan4(UniProt登录号A1YEQ9；SEQ IDNO:31)；倭黑猩猩Zscan4(UniProt登录号A1YFX5的核苷酸序列；SEQ ID NO:32)；婆罗洲猩猩Zscan4(UniProt登录号A2T7G6；SEQ ID NO:33)，苏门答腊猩猩Zscan4(UniProt登录号H2P0E3；SEQ ID NO:34)；大熊猫Zscan4(UniProt登录号G1LE29；SEQ ID NO:35)；猪Zscan4(UniProt登录号F1SCQ2；SEQ ID NO:36)；白颊长臂猿Zscan4(UniProt登录号G1RJD4；SEQID NO:37)；普通猕猴Zscan4(UniProt登录号F7GH55；SEQ ID NO:38)；豚鼠Zscan4(UniProt登录号H0V5E8；SEQ ID NO:39)；和多纹地松鼠(UniProt登录号I3N7T3；SEQ ID NO:40)。每个上面列出的GenBank登录号在本文通过引用并入，因为它出现在2009年8月11日的GenBank数据库中。每个上面列出的UniProt登录号在本文通过引用并入，因为它出现在2013年3月15日的UniProt数据库中。
在一些实施方式中，Zscan4多肽是人ZSCAN4多肽、或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，Zscan4多肽是鼠Zscan4多肽、或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，Zscan4多肽是Zscan4a多肽、Zscan4b多肽、Zscan4c多肽、Zscan4d多肽、Zscan4e多肽或Zscan4f多肽。在一些实施方式中，Zscan4多肽是狗Zscan4多肽、或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，Zscan4多肽是牛Zscan4多肽、或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，Zscan4多肽是马Zscan4多肽、或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，Zscan4多肽包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于来自SEQ ID No:11-20和31-40中的任一个氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，Zscan4多肽是人ZSCAN4多肽、或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，Zscan4多肽包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:17的氨基酸序列的氨基酸序列。
使用分子技术，本领域普通技术人员可以容易地制备Zscan4多肽的片段和变体。多肽片段可以是指呈现至少一个有用表位的多肽的一部分。术语“多肽的功能片段”是指保持多肽活性的多肽的全部片段，比如Zscan4。例如，生物学功能片段的大小可以从能够结合抗体分子的小到像表位一样的多肽片段变化至能够在细胞内参与特性诱导或变型变化的编程的大多肽，包括影响细胞增殖或分化。表位是能够结合响应与抗原接触而生成的免疫球蛋白的多肽的区域。因而，包含Zscan4的生物学活性的较小的肽、或Zscan4的保守变体，因而被包括使用。在一些实施方式中，Zscan4多肽的片段包括Zscan4多肽的至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个连续氨基酸。在一些实施方式中，Zscan4的片段是当转移入感兴趣的细胞时给予Zscan4功能的片段，比如，但不限于增大基因组稳定性和/或增大端粒长度。
Zscan4多肽初级氨基酸序列的较小修饰可产生相对于本文所述的未修饰的对应多肽具有基本上等价活性的肽。这样的修饰可以是有意的，如通过定点突变，或可以是自发的。通过这些修饰产生的全部多肽都包括在本文中。
本领域普通技术人员可以容易地产生包括Zscan4多肽和感兴趣的第二多肽的融合蛋白。任选地，接头可以包括在Zscan4多肽和感兴趣的第二多肽之间。融合蛋白包括但不限于包括Zscan4多肽和标记蛋白的多肽。在一些实施方式中，标记蛋白可用于鉴定或纯化Zscan4多肽。示例性融合蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白、六个组氨酸残基、或myc和Zscan4多肽。
本领域普通技术人员将领会用于公开的方法的这样的Zscan4的变体、片段和融合蛋白是保持Zscan4活性的那些(比如在人细胞中增大基因组稳定性和增大端粒长度或二者的能力)。
本公开内容的各种方面涉及基本上纯化的多肽。基本上纯化的多肽可以是指基本上不含其它蛋白质、脂质、糖类或与其天然相关联的其它物质的多肽。在一个实施方式中，多肽至少50％，例如至少80％不含其它蛋白质、脂质、糖类或与其天然相关联的其它物质。在另一个实施方式中，多肽至少90％不含其它蛋白质、脂质、糖类或与其天然相关联的其它物质。在还另一个实施方式中，多肽至少95％不含其它蛋白质、脂质、糖类或与其天然相关联的其它物质。
本公开内容的多肽，比如Zscan4多肽，还可以包括组成多肽的氨基酸的保守替换。保守替换将一个氨基酸取代为在大小、疏水性等上相似的另一个氨基酸。保守替换的实例在下面显示：
Figure BDA0002549821630000641
Figure BDA0002549821630000651
为了保持编码的蛋白质的功能和免疫同一性，导致氨基酸改变的cDNA序列中的变化，无论是否是保守的，应当被最小化。因而，在几个非限制性实例中，Zscan4多肽包括至多两个、至多五个、至多十个、至多二十个、或至多五十个保守替换。通过测定它是否被抗体识别可以评估蛋白质的免疫同一性；被这样一个抗体识别的变体在免疫学上是保守的。任何cDNA序列变体将优选地将不超过二十个、和优选地少于十个氨基酸替换引入编码的多肽。
在某些实施方式中，本公开内容的Zscan4多肽被封装在病毒包膜中。优选地，病毒包膜层包含识别细胞表面受体的包膜蛋白，并且正因如此增大递送Zscan4多肽进入细胞的效率。在某些实施方式中，Zscan4多肽被封装在涂布有病毒包膜蛋白的纳米颗粒或脂质体中。可以使用本领域已知的任何合适的病毒包膜。在一些实施方式中，病毒包膜是仙台病毒包膜。在病毒包膜或病毒包膜蛋白中封装多肽的方法在本领域中是众所周知的。
包括Zscan4多肽的细胞
本文进一步提供的是包含如本文所述的Zscan4多肽的分离细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。人细胞的起源可以来自任何合适的人种。人细胞可以包括本文所述的任何类型的人细胞。
包括修饰的Zscan4的组合物、载体和细胞
本文提供的是编码修饰Zscan4蛋白的分离核酸分子，其中蛋白质已经被修饰，使得蛋白质的活性是可调控的(即，可诱导的或可抑制的)。例如，Zscan4蛋白可以是包含可诱导的受体或配体结合结构域的融合蛋白。可使用本领域已知的任何可诱导的受体和/或配体结合结构域。在一些实施方式中，可诱导的受体和/或配体结合结构域可包括但不限于雌激素受体(ER)；对三苯氧胺或它的代谢物4-羟基-三苯氧胺(4OHT)敏感的突变的雌激素受体，比如ERT或ERT2；为对米非司酮(MIFEPREX)敏感的糖皮质激素受体的糖皮质激素受体(GR)；药物可调控的配体结合结构域；和类固醇可诱导的受体，比如蜕皮激素可诱导的受体。
在某些实施方式中，本公开内容的分离的核酸分子编码融合蛋白，其中融合蛋白包括融合至ERT2蛋白质的Zscan4蛋白。ERT2是人雌激素受体的配体结合结构域的突变形式(version)。ERT2不在生理浓度下结合它的天然配体(17β-雌二醇)，但是对纳摩尔浓度的三苯氧胺或它的代谢物4-羟基-三苯氧胺(4OHT)高度敏感(Feil等人，Biochem Biophys ResCommun 237(3):752-757,1997)。融合蛋白可以是指包含两个不同的(异源)蛋白质的至少一部分的蛋白质。在一些实例中，这样的蛋白质是通过表达从编码两个不同的(异源)蛋白质的至少一部分的核酸序列改造的核酸序列而生成的。为了形成融合蛋白，核酸序列必须在相同的阅读框中，并且不包含内部终止密码子。
在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子是人ZSCAN4、鼠Zscan4c、鼠Zscan4d或鼠Zscan4f、或其功能片段或变体。编码修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的核酸分子可以包括本文所述的任何Zscan4多核苷酸、或其同系物、片段或变体。例如，Zscan4的功能片段和变体包括保持Zscan4的一种或多种生物活性——比如增大干细胞的全能性、提高基因组稳定性或增大端粒长度的能力——的任何Zscan4片段或变体。
在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子可包括，例如，来自SEQ ID No:1-10和21-30中的任一个的核苷酸序列。在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子是鼠Zscan4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子是人ZSCAN4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子是Zscan4a多核苷酸、Zscan4b多核苷酸、Zscan4c多核苷酸、Zscan4d多核苷酸、Zscan4e多核苷酸或Zscan4f多核苷酸。在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于来自SEQ ID No:1-10和21-30中的任一个的核苷酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子是人ZSCAN4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4部分的核酸分子包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:7的核苷酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码Zscan4-融合蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的核酸分子包括Zscan4和可诱导的受体和/或配体结合结构域序列比如ERT2编码序列之间的接头序列。接头在本领域中是众所周知的，并且合适接头的选择完全在本领域普通技术人员的能力内。接头可以是指充当两个分子之间比如两个核酸分子或两个肽之间(比如在融合蛋白中)的间隔的一个或多个核苷酸或氨基酸。在一些实施方式中，接头是1至100个氨基酸，比如1至50或5至10个氨基酸。在一些实施方式中，接头是至少2个氨基酸(aa)、至少3个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个或至少100个aa，比如2至50或2至10个aa。在一些实施方式中，接头包括氨基酸序列Ala-Ser。
还提供的是包括本文所述的修饰Zscan4比如Zscan4-ERT2编码核酸分子的载体。考虑任何合适的表达载体，比如表达(质粒)载体(例如，pPyCAG-BstXI-IP)、或病毒载体(例如，副粘病毒比如仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或反转录病毒载体)。众多表达载体和病毒载体在本领域中是已知的，并且合适载体的选择完全在本领域普通技术人员的能力内。
本文进一步提供的是如本文所述的包含修饰Zscan4比如Zscan4-ERT2、核酸分子或载体的分离细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。人细胞的起源可以来自任何合适的人种。人细胞可以包括本文所述的任何类型的人细胞。
本文还提供了包括编码修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的核酸分子或载体的组合物。组合物可进一步包括运载体或稀释剂，比如药学上可接受的运载体或稀释剂。进一步提供由本文所述的核酸分子和载体编码的修饰Zscan4蛋白，比如Zscan4-ERT2融合蛋白。
本文还提供的是重组修饰Zscan4蛋白，比如Zscan4-ERT2融合蛋白。在一些实施方式中，重组修饰Zscan4蛋白，比如Zscan4-ERT2融合蛋白是人ZSCAN4、鼠Zscan4c、鼠Zscan4d或鼠Zscan4f、或其功能片段或变体。修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2重组融合蛋白的Zscan4部分可以包括本文所述的任何Zscan4多肽、同系物、直接同源物、片段或变体。Zscan4的功能片段和变体包括，例如，保持Zscan4的一种或多种生物活性——比如增大基因组稳定性或增大端粒长度的能力——的任何Zscan4片段或变体。
在一些实施方式中，修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4蛋白部分是鼠Zscan4多肽或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4蛋白部分是人ZSCAN4多肽或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4蛋白部分是Zscan4a多肽、Zscan4b多肽、Zscan4c多肽、Zscan4d多肽、Zscan4e多肽或Zscan4f多肽。在一些实施方式中，修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4蛋白部分包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于来自SEQ ID No:11-20和31-40中的任一个的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4蛋白部分是人ZSCAN4多肽或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的Zscan4蛋白部分包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:17的氨基酸序列的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可使用分子技术容易地制备Zscan4蛋白的片段和变体。在一些实施方式中，Zscan4蛋白的片段包括Zscan4多肽的至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个连续氨基酸。在进一步实施方式中，Zscan4的片段是给予Zscan4功能的片段，比如，但不限于增大基因组稳定性和/或增大端粒长度。
本文还提供了包括修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的组合物。组合物可进一步包括运载体或稀释剂，比如药学上可接受的运载体或稀释剂，例如盐水。
包括Zscan4-ΔC的组合物、载体和细胞
本文还提供的是编码具有C-末端平截的Zscan4蛋白(在本文也称为Zscan4-ΔC)的分离核酸分子。C-末端平截的Zscan4包括至少一个锌指结构域的缺失。因而，在一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白具有一个、两个、三个或四个锌指结构域的缺失。
在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子是C-末端平截的人ZSCAN4、鼠Zscan4c、鼠Zscan4d或鼠Zscan4f。在一些实施方式中，Zscan4-ΔC蛋白是具有全部四锌指结构域缺失的人ZSCAN4或者是具有全部四锌指结构域缺失的鼠Zscan4c。编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子可包含本文所述的C-末端平截的任何Zscan4多核苷酸。
在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子的Zscan4部分可包括，例如，来自SEQ ID No:1-10和21-30中的任一个的核苷酸序列。在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子的Zscan4部分是鼠Zscan4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子的Zscan4部分是人ZSCAN4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子的Zscan4部分是Zscan4a多核苷酸、Zscan4b多核苷酸、Zscan4c多核苷酸、Zscan4d多核苷酸、Zscan4e多核苷酸或Zscan4f多核苷酸。在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子的Zscan4部分包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于来自SEQ ID No:1-10和21-30中的任一个的核苷酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子的Zscan4部分是人ZSCAN4多核苷酸或其同系物。在一些实施方式中，编码Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子的Zscan4部分包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列。
本文考虑的Zscan4-ΔC核酸序列包括由于遗传密码而是简并的序列。存在20个天然氨基酸，其中大多数被超过一个密码子所规定。因此，包括全部简并核苷酸序列，只要核苷酸序列编码的Zscan4-ΔC多肽的氨基酸序列在功能上没有改变。
还提供的是包括本文所述的Zscan4-ΔC编码核酸分子的载体。考虑任何合适的表达载体，比如表达(质粒)载体(例如，pPyCAG-BstXI-IP)、或病毒载体(例如，副粘病毒比如仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或反转录病毒载体)。众多表达载体和病毒载体在本领域中是已知的，并且合适载体的选择完全在本领域普通技术人员的能力内。
本文进一步提供的是包含如本文所述的Zscan4-ΔC核酸分子或载体的分离细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。人细胞的起源可以来自任何合适的人种。人细胞可以包括本文所述的任何类型的人细胞。
本文还提供了包括编码Zscan4ΔC蛋白的核酸分子或载体的组合物。组合物可进一步包括运载体或稀释剂，比如药学上可接受的运载体或稀释剂。
进一步提供了由本文所述的核酸分子和载体编码的Zscan4-ΔC蛋白。
本文还提供的是重组Zscan4-ΔC蛋白。在一些实施方式中，重组Zscan4-ΔC蛋白是C-末端平截的人ZSCAN4、鼠Zscan4c、鼠Zscan4d或鼠Zscan4f。重组Zscan4-ΔC蛋白的Zscan4部分可包括本文所述的任何Zscan4多肽、同系物、直接同源物、片段或变体。
在一些实施方式中，重组Zscan4-ΔC蛋白的Zscan4蛋白部分是鼠Zscan4多肽或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，重组Zscan4-ΔC蛋白的Zscan4蛋白部分是人ZSCAN4多肽或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，重组Zscan4-ΔC蛋白的Zscan4蛋白部分是Zscan4a多肽、Zscan4b多肽、Zscan4c多肽、Zscan4d多肽、Zscan4e多肽或Zscan4f多肽。在一些实施方式中，重组Zscan4-ΔC蛋白的Zscan4蛋白部分是包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于来自SEQ ID No:11-20和31-40中的任一个的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方式中，重组Zscan4-ΔC蛋白的Zscan4蛋白部分是人ZSCAN4多肽或其同系物或直接同源物。在一些实施方式中，重组Zscan4-ΔC蛋白的Zscan4蛋白部分是包括至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一于来自SEQ ID NO:17的氨基酸序列的氨基酸序列。
本文进一步提供的是包括本文所述的Zscan4-ΔC蛋白的分离细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。人细胞的起源可以来自任何合适的人种。人细胞可以包括本文所述的任何类型的人细胞。
本文还提供了包括Zscan4-ΔC蛋白的组合物。组合物可进一步包括运载体或稀释剂，比如药学上可接受的运载体或稀释剂，例如盐水。
将Zscan4多肽引入人细胞的方法
通过将各个蛋白质直接递送至细胞，比如人细胞，可能引入Zscan4多肽。例如，可根据标准方法，使用电穿孔、显微注射、阳离子脂质或纳米颗粒完成蛋白质递送。可选地，可通过与细胞穿膜肽(CPP)融合修饰蛋白质以促进蛋白质进入细胞。本文更详细地讨论了CPP和纳米颗粒的使用。
细胞穿膜肽(CPP)
CPP是促进蛋白质、核酸或其它化合物以非受体依赖方式转导穿过膜的多肽家族(Wadia和Dowdy，Curr.Protein Pept.Sci.4(2):97-104,2003)。通常，CPP是短的聚阳离子序列，其可促进它们被连接入细胞的核内体的化合物的细胞摄取。CPP的实例包括聚精氨酸标签和蛋白转导结构域。可以使用本领域已知的任何蛋白转导结构域。合适的蛋白转导结构域的实例包括但不限于HIV Tat、HIV Vpr、HIV Vp22、来自含HD蛋白质的同源域(HD)、和合成的蛋白转导结构域。
某些肽递送蛋白质或核酸进入细胞的能力最初是描述用于HIV编码的Tat蛋白，其被显示穿过膜并起动转录。然后发现需要蛋白质转导的那部分Tat蛋白仅是11个氨基酸的多肽，被称为Tat肽。当与其它蛋白质融合时，已经表明Tat肽递送这些蛋白质——大小从15至120kDa变化——进入组织培养中的细胞(Frankel和Pabo，Cell 55(6):1189-93,1988；Green和Loewenstein，J.Gen.Microbiol.134(3):849-55,1988；Vives等人，J.Biol.Chem.272(25):16010-7,1997；Yoon等人，J.Microbiol.42(4):328-35,2004；Cai等人，Eur.J.Pharm.Sci.27(4):311-9,2006)。
其它已知的CPP包括PENETRATINTM——来源于果蝇触角足同源异型框基因的第三螺旋的16个氨基酸的肽(美国专利号5,888,762；Derossi等人，J.Biol.Chem.269:10444-10450,1994；Schwarze等人，Trends Pharmacol.Sci.21:45-48,2000)；Transportan——27个氨基酸的嵌合肽，其由以下组成：经由赖氨酸连接的来自神经肽甘丙肽的N-末端的12个氨基酸和14个氨基酸的蛋白质——肥大脱粒肽(美国专利号6,821,948；Pooga，FASEBJ.12:67-77,1998；Hawiger，Curr.Opin.Chem.Biol.3:89-94,1999)；来自1型单纯疱疹病毒(HSV)的VP22蛋白的肽(Elliott等人，Cell 88:223-233，1997)；HSV-2的UL-56蛋白(美国授权前公开号2006/0099677)；和HIV-1的Vpr蛋白(美国授权前公开号2005/0287648)。此外，大量人工肽也已知起CPP的作用，比如聚精氨酸、聚赖氨酸等等(参见，例如，美国授权前公开号2006/0106197；2006/0024331；2005/0287648；和2003/0125242；Zhibao等人，Mol.Ther.2:339-347,2000；和Laus等人，Nature Biotechnol.18:1269-1272,2000)。
Zhou等人(Cell Stem Cell 4:381-384,2009)描述了聚精氨酸肽标签的成功使用。此外，Kim等人(Cell Stem Cell 4:472-476,2009)描述了成功使用HIV-TAT蛋白转导结构域递送蛋白质至人胎儿成纤维细胞。
纳米颗粒
纳米颗粒是亚微粒(小于大约1000nm)大小的药物递送媒介，其可以携带封装的药物比如合成小分子、蛋白质、肽、细胞和核酸基的生物治疗药物，用于快速释放或者用于控制释放。可以使用本领域众所周知的工艺有效地将各种分子(例如，蛋白质、肽和核酸分子)封装在纳米颗粒中。封装在纳米颗粒中的分子可以是指包含在纳米颗粒内或者附着至纳米颗粒的表面、或其组合的分子(比如Zscan4核酸或蛋白质)。
在一些实例中，在人细胞中增大Zscan4表达的试剂被纳米颗粒封装以帮助递送至细胞。与公开的方法一起使用的合适的纳米颗粒在本领域中是已知的，并且在下面简要地描述。
与本文所述的方法一起使用的纳米颗粒可以是任何类型的生物相容性纳米颗粒，比如可生物降解的纳米颗粒，比如聚合物纳米颗粒，其包括但不限于聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯、聚乙烯基醚和纤维素醚纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒是由生物相容性并且可生物降解的材料制成的。在一些实施方式中，纳米颗粒包括但不限于包括聚乳酸或聚乙醇酸、或聚乳酸和聚乙醇酸二者的纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒是D,L-乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒。
其它可生物降解的聚合物材料可被考虑与本文所述的方法一起使用，比如聚乳酸(PLA)和聚乙交酯(PGA)。另外有用的纳米颗粒包括可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒(Vauthier等人，Adv.Drug Del.Rev.55:519-48,2003)。
本领域已经很好地描述了多种类型的可生物降解的和生物相容性纳米颗粒、制造包括PLGA纳米颗粒的这样的纳米颗粒的方法、和封装多种合成化合物、蛋白质和核酸的方法(参见，例如，美国公开号2007/0148074；美国公开号20070092575；美国专利公开号2006/0246139；美国专利号5,753,234；美国专利号7,081,489；和PCT公开号WO/2006/052285)。
类维生素A
在某些实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂是类维生素A。类维生素A可以是指化学相关于维生素A的一类化学化合物。主要由于它们调控上皮细胞生长的方式，类维生素A在药品中使用。类维生素A遍及身体具有许多重要和不同的功能，其包括对视力、细胞增殖和分化的调控、骨组织的生长、免疫功能、和肿瘤抑制基因的激活的作用。类维生素A的实例包括但不限于全反式视黄酸(atRA)、9-顺式视黄酸(9-顺式RA)、13-顺式RA和维生素A(视黄醇)。
多种类维生素A在本领域中是已知的，并且可以用于本文所述的方法。类维生素A可包括但不限于全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸或维生素A。
诱导氧化应激的试剂
在某些实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂是诱导氧化应激的试剂。氧化应激可以是指活性氧种类的产生和生物系统容易地解毒活性中间体或修复造成的损害的能力之间的不平衡。干扰组织的正常氧化还原状态可通过产生损害细胞的全部组成——包括蛋白质、脂质和DNA——的过氧化物和自由基而引起毒性效应。在公开的方法的一些实施方式中，诱导氧化应激的试剂是过氧化氢(H2O2)。
诱导氧化应激的各种试剂在本领域中是已知的，并且可以用于本文所述的方法。
增大端粒长度和基因组稳定性
本公开内容的某些方面涉及通过例如使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达(例如，蛋白质表达)的试剂接触，在一种或多种人细胞中增大端粒长度和/或增大基因组稳定性的方法。如本文公开的，瞬时增大表达和/或增大表达仅持续短时间(例如，从大约1小时至大约23小时，或从大约1天至大约10天)足以在人细胞中增大端粒长度和/或增大基因组稳定性。而且，在一些实施方式中，在人细胞中重复瞬时增大Zscan4表达增强增大Zscan4表达的效果。在某些实施方式中，每4小时、每8小时、每12小时、每16小时、每24小时、每32小时、每40小时、每48小时、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每三个月、每四个月、每六个月、每七个月、每八个月、每九个月、每10个月、每11个月、每年、每两年、每三年、每四年、每五年、每六年、每七年、每八年、每九年、每10年、每11年、每12年、每13年、每14年、每15年、每16年、每17年、每18年、每19年、每20年、每21年、每22年、每23年、每24年、每25年、每26年、每27年、每28年、每29年、每30年、每35年、每40年、每45年或每50年重复瞬时增大Zscan4表达。
接触可以是指以直接物理关联放置；包括以固体和液体形式二者。可以可交换地使用“接触”与“暴露”。在一些情况下，“接触”包括转染，比如将核酸分子转染入细胞。测量基因组稳定性和端粒长度的方法在本领域中是常规的，并且公开内容不限于具体方法。本文提供的具体实例是示例性的。
在一些实施方式中，例如，相对于没有与增大Zscan4表达的试剂接触的对应的人细胞中的Zscan4蛋白表达，端粒长度在与在人细胞中增大Zscan4蛋白表达的试剂接触的人细胞中增大至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.15倍、至少2.2倍、至少2.25倍、至少2.3倍、至少2.35倍、至少2.4倍、至少2.45倍、至少2.5倍、至少2.55倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍、至少6.0倍、至少6.5倍、至少7.0倍、至少7.5倍、至少8.0倍、至少8.5倍、至少9.0倍、至少9.5倍、至少10倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍、至少8,000倍、至少9,000倍、至少10,000倍、至少25,000倍、至少50,000倍、至少75,000倍、至少100,000倍、至少125,000倍、至少150,000倍、至少175,000倍、至少200,000倍、至少225,000倍、至少250,000倍、至少275,000倍、至少300,000倍、至少325,000倍、至少350,000倍、至少375,000倍、至少400,000倍、至少425,000倍、至少450,000倍、至少475,000倍、至少500,000倍、至少525,000倍、至少550,000倍、至少575,000倍、至少600,000倍、至少625,000倍、至少650,000倍、至少675,000倍、至少700,000倍、至少725,000倍、至少750,000倍、至少775,000倍、至少800,000倍、至少825,000倍、至少850,000倍、至少875,000倍、至少900,000倍、至少925,000倍、至少950,000倍、至少975,000倍或至少1,000,000倍。可以使用用于测定细胞中的Zscan4蛋白表达或用于定量每个细胞蛋白质的数目(即，蛋白质化学计量学)的本领域已知的和本文公开的任何方法。
在其它实施方式中，在一种或多种人细胞中增大端粒长度和/或基因组稳定性的方法包括使一种或多种人细胞与编码本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白的核酸分子或载体接触。在其它实施方式中，方法包括使人细胞或人细胞群体与本公开内容的修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2融合蛋白接触。
在还其它实施方式中，在一种或多种人细胞中增大端粒长度和/或基因组稳定性的方法包括使人细胞或人细胞群体与编码本文公开的Zscan4-ΔC蛋白的核酸分子或载体接触。在其它实施方式中，方法包括使人细胞或人细胞群体与本文公开的Zscan4-ΔC蛋白接触。
将编码Zscan4-ERT2或Zscan4-ΔC的核酸分子、和Zscan4-ERT2或Zscan4-ΔC蛋白递送至人细胞的方法是本领域已知的，并且在本文被描述。
在一些实施方式中，例如，相对于还没有与修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2或Zscan4-ΔC蛋白、或编码修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2或Zscan4-ΔC蛋白的核酸接触的人细胞(或者与在还没有经历Zscan4的频繁激活的人细胞中预期的值或值的范围相比)，端粒长度在人细胞中增大至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％或至少160％。在一些实施方式中，例如，相对于还没有与修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2或Zscan4-ΔC蛋白、或编码修饰Zscan4蛋白比如Zscan4-ERT2或Zscan4-ΔC蛋白的核酸接触的人细胞(或者与在还没有经历Zscan4的频繁激活的人细胞中预期的值或值的范围相比)，端粒长度在人细胞中增大至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.15倍、至少2.2倍、至少2.25倍、至少2.3倍、至少2.35倍、至少2.4倍、至少2.45倍、至少2.5倍、至少2.55倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍、至少6.0倍、至少6.5倍、至少7.0倍、至少7.5倍、至少8.0倍、至少8.5倍、至少9.0倍、至少9.5倍或至少10倍。
在一些实施方式中，在已经与在人细胞中增大Zscan4表达的试剂接触的一种或多种人细胞中测量端粒长度。在一些实例中，例如，如果相对于没有与增大Zscan4表达的试剂接触的人细胞中的端粒长度，端粒的长度更大，则端粒长度在人细胞中被增大。例如，可以通过荧光原位杂交(FISH)、定量FISH(Q-FISH)或端粒qPCR检测人细胞中的端粒长度。
基因组稳定性
在一些实施方式中，例如，相对于没有与增大Zscan4的表达的试剂接触的对应的人细胞，基因组稳定性在与在人细胞中增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂接触的一种或多种人细胞中增大至少20％、至少40％、至少50％、至少60％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。
测量基因组稳定性的方法在本领域中是常规的，并且公开内容不限于具体方法。本文提供的具体实例是示例性的。
在一些实例中，通过进行核型分析，测量人细胞——比如与增大Zscan4表达的试剂(例如，增大Zscan4比如Zscan4核酸、Zscan4蛋白、Zscan4-ERT或Zscan4-ΔC的表达的试剂)接触的人细胞中的基因组稳定性。如果例如相对于还没有与增大Zscan4的表达的试剂接触的细胞，存在的核型异常(比如染色体融合和片段化)减少或甚至不存在，则基因组稳定性被增大。例如可通过诱导中期停顿，然后制备中期染色体扩散，在人细胞中进行核型分析。
在一些实例中，通过测量姐妹染色单体交换(SCE)测量人细胞比如与Zscan4、Zscan4-ERT或Zscan4-ΔC蛋白或核酸接触的人细胞中的基因组稳定性。如果相对于对照比如还没有经历Zscan4的频繁激活的干细胞，存在的SCE减少，则基因组稳定性被增大。例如，可以通过检测中期扩散中的SCE测量干细胞中的SCE。
Zscan4的治疗用途
本文公开了Zscan4的表达增大端粒长度、增大基因组稳定性、修正基因组和/或染色体异常、保护细胞免受DNA损伤、和/或增强DNA修复。DNA修复可以是指通过其细胞识别和修正对编码它的基因组的DNA分子的损害的处理的集合。因而，本文提供的是涉及在人细胞中增大Zscan4的表达以在人细胞中增大基因组稳定性、保护细胞免受DNA损伤、增强DNA修复、和增大端粒长度的方法。
提供用于治疗需要人细胞治疗的对象，比如具有需要端粒加长或修正端粒和/或染色体异常的人细胞的对象的方法。这些方法可包括使用人细胞。在一些实施方式中，方法可包括使一种或多种人细胞与在人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触。相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4在一种或多种人细胞中诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
提供用于治疗需要端粒加长的对象的方法。在一些实施方式中，方法可包括使对象中的一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大表达的Zscan4诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。在一些实施方式中，方法可包括分离一种或多种人细胞，使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，并且向对象施用接触的一种或多种人细胞。增大Zscan4的表达诱导一种或多种人细胞中的端粒加长。
还提供用于治疗端粒和/或染色体异常关联性疾病或状况的方法。在一些实施方式中，方法可包括向有需要的对象施用在对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达在一种或多种人细胞中诱导端粒加长和/或修正端粒和/或染色体异常以治疗端粒和/或染色体异常相关联性疾病或状况。在一些实施方式中，方法可包括从患有端粒和/或染色体异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞，使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，并且向对象施用接触的一种或多种人细胞以治疗端粒和/或染色体异常关联性疾病或状况。增大Zscan4的表达在一种或多种人细胞中诱导端粒加长和/或修正端粒和/或染色体异常。在一些实施方式中，方法可包括从患有端粒和/或染色体异常关联性疾病或状况的对象分离人骨髓细胞，使人骨髓细胞与在人骨髓细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，并且将接触的人骨髓细胞植入对象以治疗端粒和/或染色体异常关联性疾病或状况。增大Zscan4的表达在人骨髓细胞中诱导端粒加长和/或修正端粒和/或染色体异常。
还提供用于增大一种或多种人细胞的基因组稳定性的方法。在一些实施方式中，方法可包括使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的基因组稳定性。
还提供用于增大一种或多种人细胞的DNA修复能力的方法。在一些实施方式中，方法可包括使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞中的DNA修复能力。
还提供用于复壮一种或多种人细胞和/或延长一种或多种人细胞的寿命的方法。在一些实施方式中，方法可包括使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中相对于没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4复壮和/或延长一种或多种人细胞的寿命。
提供用于复壮对象中的组织或器官和/或延长对象中的组织或器官的寿命的方法。在一些实施方式中，方法可包括向有需要的对象施用在组织或器官中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达复壮和/或延长组织或器官的寿命。
提供用于治疗居民组织干细胞(即，存在于人体的器官和/或组织中的组织干细胞)中的一种或多种缺陷关联性疾病或状况的方法，比如杜兴肌营养不良。在一些实施方式中，方法可包括向有需要的对象中的居民组织干细胞施用在居民组织干细胞中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达防止细胞的恶化。
提供用于复壮有需要的对象和/或延长有需要的对象的寿命的方法。在一些实施方式中，方法可包括向对象施用增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达复壮和/或延长对象的寿命。在某些实施方式中，方法可包括从对象分离一种或多种人细胞；使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达复壮和/或延长一种或多种人细胞的寿命，并且向对象施用接触的一种或多种人细胞以复壮和/或延长对象的寿命。在一些实施方式中，施用增大Zscan4的表达的试剂可包括但不限于：注射试剂至身体的每个器官和组织，注射试剂至对象的血液循环，注射试剂进入对象的脑脊液，注射试剂进入对象的淋巴系统，施用试剂进入对象的肺组织，施用试剂进入包括对象的食管、胃和肠的消化器官和组织，注射试剂进入对象的门静脉，和局部施用试剂至皮肤和皮肤附件，比如毛囊和汗腺，以复壮存在于所治疗器官和/或组织中的组织干细胞、祖细胞和/或终末分化细胞。可以认为所治疗对象中组织干细胞、祖细胞和/或终末分化细胞的复壮的总体效果是复壮对象和/或减慢对象的老化过程。还可以认为所治疗对象中组织干细胞、祖细胞和/或终末分化细胞的复壮将导致对象的寿命延长。
例如，本文提供的是通过向对象施用Zscan4多肽或多核苷酸治疗患有癌症的对象的方法。对象可以是指活着的多细胞脊椎动物生物体——包括人和非人哺乳动物的范畴。在一些实施方式中，方法进一步包括选择需要这样的治疗的患者，比如已经被诊断为患有癌症的对象。癌症可以是指表征为异常或不受控的细胞生长的恶性肿瘤。经常与癌症相关联的其它特征包括转移、干扰相邻细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其它分泌产物和抑制或加剧炎性反应或免疫反应、侵染周围或远处组织或器官，比如淋巴结等。转移性疾病可以是指癌细胞例如经由血流或淋巴系统已经离开原始肿瘤位点并迁移至身体的其它部位。
在本文所述的方法的一些实施方式中，对象被施用Zscan4多核苷酸。在一些实例中，对象被施用包括Zscan4多核苷酸的载体。生成和使用Zscan4表达载体的方法描述在本申请的其它章节。在一些实施方式中，Zscan4多核苷酸(或包括Zscan4多核苷酸的载体)比如通过注射被直接施用至肿瘤细胞或肿瘤组织。
在一些实施方式中，对象被施用Zscan4多肽。在一些实施方式中，本公开内容的Zscan4多核苷酸和/或Zscan4多肽被纳米颗粒封装以帮助递送Zscan4多核苷酸、Zscan4多肽和/或诱导Zscan4表达的试剂至肿瘤细胞。与公开的方法一起使用的合适的纳米颗粒在本领域中是已知的，并且在下面描述。
纳米颗粒是亚微粒(小于大约1000nm)大小的药物递送媒介，其可以携带封装的药物比如合成小分子、蛋白质、肽、细胞和核酸基的生物治疗药物，或者用于快速释放或者用于控制释放。可以使用本领域众所周知的工艺有效地将各种分子(例如，蛋白质、肽和核酸分子)封装在纳米颗粒中。
与本文所述的组合物和方法一起使用的纳米颗粒可以是任何类型的生物相容性纳米颗粒，比如可生物降解的纳米颗粒，比如聚合物纳米颗粒，其包括但不限于聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯、聚乙烯基醚和纤维素醚纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒是由生物相容性并且可生物降解的材料制成的。在一些实施方式中，纳米颗粒包括但不限于包括聚乳酸或聚乙醇酸、或聚乳酸和聚乙醇酸二者的纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒是D,L-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒。
PLGA是FDA批准的生物材料，其已经被用于可吸收的缝合线和可生物降解的植入物。PLGA纳米颗粒还已经被用于经由很多给药途径的各种药物的药物递送系统，所述给药途径包括但不限于皮下、静脉内、经眼(ocular)、口服和肌肉内。给药可以是指通过任何有效的途径向对象提供或给予试剂。示例性给药途径包括但不限于注射(比如皮下、肌肉内、真皮内、腹膜内、静脉内或动脉内)。PLGA降解为它的单体成分——乳酸和乙醇酸，它们是代谢的天然副产物，使得材料是高度生物相容的。此外，PLGA作为用于合成纳米颗粒的临床级材料是商业上可获得的。
考虑其它可生物降解的聚合物材料与本文所述的组合物和方法一起使用，比如聚乳酸(PLA)和聚乙交酯(PGA)。另外有用的纳米颗粒包括可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒(Vauthier等人，Adv.Drug Del.Rev.55:519-48,2003)。使用壳聚糖涂布的聚(丙交酯-乙交酯)纳米颗粒还可以增强口服吸收，其是粘膜粘性(mucoadhesive)阳离子聚合物。例如，Takeuchi等人(Adv.Drug Del.Rev.47:39-54,2001)描述了这样的纳米颗粒的制备。
在当前用于人应用的可生物降解的聚合物中，PLA、PGA和PLGA已知是大体上安全的，因为它们经历体内水解为无害的乳酸和乙醇酸。这些聚合物已经被用于制造不需要手术后移除的缝合线，和用于配制封装的醋酸亮丙瑞林，其已经被FDA批准用于人用途(Langer和Mose，Science 249:1527,1990；Gilding和Reed，Polymer 20:1459,1979；Morris等人，Vaccine 12:5,1994)。这些聚合物的降解速率随乙交酯/丙交酯比率和其分子量变化。因此，通过调节聚合物的分子量和乙交酯/丙交酯比率，以及胶囊制剂的粒径和涂层厚度，封装的分子(比如蛋白质或肽)的释放可以持续数月(Holland等人，J.Control.Rel.4:155,1986)。
在一些实施方式中，与本文所述的组合物和方法一起使用的纳米颗粒的直径在大约50nm至大约1000nm的范围。在一些实施方式中，纳米颗粒小于大约600nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径是大约100至大约600nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径是大约200至大约500nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径是大约300至大约450nm。本领域普通技术人员将容易地认识到纳米颗粒的大小可根据制备方法、临床应用和使用的成像物质而变化。
本领域已经很好地描述了多种类型的可生物降解的和生物相容性纳米颗粒、制造包括PLGA纳米颗粒的这样的纳米颗粒的方法、和封装多种合成化合物、蛋白质和核酸的方法(参见，例如，美国公开号2007/0148074；美国公开号20070092575；美国专利公开号2006/0246139；美国专利号5,753,234；美国专利号7,081,489；和PCT公开号WO/2006/052285)。
在一些实施方式中，一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触。如本文使用的，已经与增大Zscan4的表达的试剂接触的人细胞被称为“Zscan4+人细胞”。如本文公开的，“Zscan4+细胞”包括但不限于瞬时表达Zscan4的细胞。即，Zscan4+细胞没有必要持续接触Zscan4或连续地表达Zscan4。如在本公开内容的一些实施方式中公开的，Zscan4的作用是迅速的并经常仅需要瞬时和短接触(例如，大约数小时至数天)。在端粒的情况下，一旦端粒通过瞬时Zscan4作用被延长，则很长时间不需要Zscan4，因为端粒仅逐渐地变短。因此，“Zscan4+人细胞”可包括与增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂接触的细胞、和曾与增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂接触但不再接触试剂的细胞二者。Zscan4+人细胞可被施用至有需要的对象以治疗紊乱或疾病。
可使用本文提供的方法治疗的对象可包括哺乳动物对象，比如兽医或人对象。对象可包括胎儿、新生儿、婴儿、儿童和/或成人。在一些实施方式中，待治疗的对象是挑选的，比如选择将受益于人细胞治疗的对象，所述细胞治疗具体是包括施用Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的治疗。
可以受益于施用Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的紊乱或疾病的实例包括与端粒缩短相关联的那些紊乱或疾病。可以受益于施用Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的紊乱或疾病的进一步实例包括癌症，自身免疫性疾病，和细胞再生在其中是有利的疾病，比如神经损伤或神经变性疾病，以及失明、耳聋、牙缺失、关节炎、心肌梗塞、骨髓移植、秃发、克罗恩病、糖尿病、肌肉萎缩症、和杜兴肌营养不良。在具体的实例中，选择具有这些紊乱中的一种或多种的对象用于本文公开的治疗。
在一些实施方式中，需要Zscan4治疗的本公开内容的对象患有端粒异常关联性疾病或状况。端粒异常可以是指端粒的任何改变，比如端粒缩短、端粒DNA重复的破坏或端粒DNA突变，其破坏一种或多种端粒功能。可以受益于Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的示例性端粒异常关联性疾病或状况可包括但不限于端粒缩短的疾病、骨髓衰竭综合症、年龄相关性端粒缩短疾病和早熟衰老紊乱。
可以受益于Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的端粒缩短的疾病或状况可包括但不限于先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合症、Revesz综合症、Coats plus综合症、特发性肺纤维变性、肝硬化、胰囊性纤维化和变性疾病，比如阿耳茨海默病和骨性关节炎。
可以受益于Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的骨髓衰竭综合症的疾病或状况可包括但不限于范康尼贫血、无巨核细胞血小板减少、再生障碍性贫血、戴-布二氏贫血，先天性角化不良、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、Pearson综合症、舒-戴二氏综合症、血小板减少和骨髓增生异常综合症。
可以受益于Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的年龄相关性端粒缩短疾病或早熟衰老疾病的疾病或状况可包括但不限于维尔纳综合症、布卢姆综合症、赫-吉二氏早老综合症、柯克凯内综合症、着色性干皮病、运动失调性毛细血管扩张症、罗-汤二氏综合症、毛发低硫营养不良、Juberg-Marsidi综合症和唐氏综合症。
在一些实施方式中，本公开内容的对象患有染色体异常关联性疾病或状况。染色体异常可以是指导致丢失、额外或不规则部分的染色体DNA的染色体中任何的染色体异常、畸变或突变。在某些实施方式中，染色体异常可导致非典型的染色体数目或一条或多条染色体中的结构异常。在某些实施方式中，染色体异常可包括核型异常，比如非整倍性。如本文使用的，非整倍性可以是指异常数目的全部染色体或部分染色体，其包括但不限于，染色体缺体性、染色体单体性、染色体三体性、染色体四体性和染色体五体性。人非整倍性的实例包括但不限于21三体、16三体、18三体(爱德华综合症)、13三体(致帕韬综合症)、X单体性(特纳综合症)、XXX非整倍性、XXY非整倍性和XYY非整倍性。人节段非整倍性的实例包括但不限于1p36重复、17p11.2重复综合症、佩-梅二氏病、22q11.2重复综合症和猫眼综合症。在一些实施方式中，非整倍性可包括性染色体或常染色体的一个或多个缺失，其可导致状况比如猫叫综合症、午-希二氏综合症、威廉斯综合症、夏-马-图三氏病、遗传性压力易感性周围神经病、Smith-Magenis综合症、神经纤维瘤、Alagille综合症、颚心面综合症、迪乔治综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、卡尔曼综合症、线状皮肤缺损小眼畸形、肾上腺发育不全、甘油激酶缺乏症、佩-梅二氏病、Y染色体上的睾丸决定因子、无精子症(因子a)、无精子症(因子b)、无精子症(因子c)或1p36缺失。因此，在某些实施方式中，Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂可用于治疗非整倍性、或非整倍性关联性疾病、紊乱或状况。
可以受益于Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的多种类型的疾病、紊乱或状况包括但不限于免疫缺陷、自身免疫性疾病、自身免疫性紊乱、慢性溃疡、动脉粥样硬化、癌症、神经损伤、变性疾病、神经变性疾病、创伤愈合、肌肉修复、心肌修复、软骨置换、关节炎、骨性关节炎、牙齿再生、失明、由于视网膜色素上皮细胞的增殖衰退而造成的年龄相关性失明、耳聋、骨髓衰竭、骨髓移植、糖尿病、肌肉萎缩症、杜兴肌营养不良、遗传疾病、基因突变和DNA损伤。
癌症包括表征为异常或不受控的细胞生长的恶性肿瘤。癌症经常与基因组不稳定性、染色体异常、DNA突变和畸变的端粒调控相关联。基于本文所述的Zscan4活性，比如增大基因组稳定性和修正染色体异常，可以施用本公开内容的Zscan4生物制品(例如，在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂)治疗癌症患者。如本文在实施例17中公开的，本申请人已经显示Zscan4生物制品可以减慢癌细胞的增殖。因此，在一些实施方式中，可以施用在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂防止癌细胞由于基因组不稳定性、染色体异常、DNA突变和/或畸变的端粒调控变得更有攻击性。而且，Zscan4+人细胞，比如免疫细胞，可被施用至癌症患者以增强他们抑制癌细胞生长的体能。在其它实施方式中，Zscan4+人细胞可用于已经移除肿瘤的患者，其中从Zscan4+细胞分化的具体细胞用于重建移除的组织和/或器官。在其它实施方式中，可以施用在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂抑制癌细胞的生长(例如，增殖)。
已知人癌组织(例如，肿瘤)包含癌干细胞，其不积极地增殖并对癌症化学疗法(例如，使用化学治疗剂比如顺铂治疗)有抗性。可以认为癌干细胞可以在化学疗法下存活，并且因而在治疗后导致癌症的复发。还可以认为内源性ZSCAN4表达发生在某些癌干细胞中，因而为细胞提供对化学治疗剂的防护。正因如此，认为减少内源性ZSCAN4的表达的试剂，比如ZSCAN4特异性iRNA或shRNA，可以被施用至正在经历或将经历化学疗法的癌症患者以减少或消除癌干细胞对一种或多种化学治疗剂的抗性，从而提高患者对一种或多种化学治疗剂的应答性。
可以受益于本文提供的Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的示例性癌症包括但不限于心脏(例如，肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)，肺(例如，支气管癌(扁平细胞、未分化小细胞、未分化大细胞、腺癌)、蜂窝状(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤)；消化道(例如，食管(扁平细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)；胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)；胰腺(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽肿瘤)；小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)；大肠(腺癌、管状腺癌、绒毛状腺癌、错构瘤、平滑肌瘤)；泌尿生殖道(例如，肾(腺癌、维尔姆斯肿瘤、肾胚细胞瘤、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(扁平细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睾丸(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺癌、腺瘤样瘤、脂肪瘤))；肝(例如，肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞癌、血管肉瘤、肝细胞腺癌、血管瘤)；骨(例如，成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)；神经系统(例如，颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽瘤、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤、松果体瘤、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓(神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤))；妇科(例如，子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(宫颈癌、肿瘤前宫颈发育异常)、卵巢(卵巢癌、浆液性囊腺癌、粘蛋白性囊腺癌、子宫内膜样肿瘤、布伦纳癌、透明细胞癌、未分类的癌、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞尔托利-莱迪希细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(扁平细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道(透明细胞癌、扁平细胞癌、葡萄状肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、输卵管(癌))；血液(例如，血液(髓细胞性白血病(急性的和慢性的)、急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症)、何杰金病、非何杰金淋巴瘤(恶性淋巴瘤))、皮肤(例如，恶性黑素瘤、基底细胞癌、扁平细胞癌、卡波西肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、脉管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣)；和肾上腺(例如，成神经细胞瘤)的癌症。
在一些实施方式中，选择患有自身免疫性疾病的患者用于治疗。自身免疫性疾病可以是指由畸变免疫反应造成的疾病，比如产生特异于自身抗原或对象自己的细胞或组织的抗体或细胞毒性T细胞。自身免疫性疾病可由身体抵御正常存在于身体中的物质和组织的过度免疫反应造成。在一些实例中，自身免疫性疾病局限于某些器官(例如，在甲状腺炎中)或可以涉及不同位置中的特定组织(例如，可影响肺和肾二者中的基底膜的古德帕斯彻病)。因此，在一些实施方式中，Zscan4+人细胞，比如造血干细胞和/或免疫细胞，和/或在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂，可用于通过修正患有自身免疫性疾病患者的免疫系统在对象中治疗自身免疫性疾病。可以受益于本文提供的Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的示例性自身免疫性疾病包括但不限于风湿性关节炎、少年少关节炎、胶原性关节炎、佐剂性关节炎、斯耶格伦综合症、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎症性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎)、自身免疫性胃萎缩、寻常天疱疮、牛皮癣、白癜风、1型糖尿病、非肥胖型糖尿病、重症肌无力、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性涎腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、古德帕斯彻综合症、阿狄森病、全身性硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血。
在一些实施方式中，选择的对象是已经患有神经损伤或患有神经变性紊乱的对象。神经损伤可以是指对神经系统(比如脑或脊髓或特定神经元)的创伤，其不利地影响被损伤患者的运动和/或记忆。例如，这样的患者可患有发音困难(运动性语言障碍)、轻偏瘫或偏瘫。神经损伤可由对神经系统(比如脑或脊髓或特定神经元)的创伤造成，其不利地影响被损伤患者的运动和/或记忆。这样的创伤可以由传染源(例如，细菌或病毒)、毒、由于跌倒或其它类型的事故造成的损伤、或基因紊乱、或由其它未知原因引起。因此，在一些实施方式中，Zscan4+人细胞，比如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和/或免疫细胞，和/或在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂，可用于通过复壮已经患有神经损伤的患者的神经系统中的组织干细胞在对象中治疗神经损伤，其中复壮神经系统中的组织干细胞产生神经元和神经胶质细胞，从而修复神经系统中的缺陷。在一些实施方式中，患者可以已经患有神经损伤，比如由于事故造成的脑或脊髓损伤，比如汽车事故或潜水事故，或由于中风。
神经变性疾病是其中脑和脊髓的细胞丢失的状况。神经变性疾病由神经元或它们的髓鞘恶化造成，其随时间导致功能紊乱和残疾。导致的状况可引起运动(比如共济失调)和记忆(比如痴呆)相关问题。因此，在一些实施方式中，Zscan4+人细胞，比如造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞和/或免疫细胞，和/或在人细胞中增大Zscan4表达的本公开内容的试剂，可用于通过复壮患有神经变性疾病的患者的神经系统中的组织干细胞在对象中治疗神经变性疾病，其中复壮神经系统中的组织干细胞产生神经元和神经胶质细胞，从而修复神经系统中的缺陷。在一些实施方式中，Zscan4+人细胞和/或试剂复壮对象的神经系统并使疾病的变性状况恢复。可以受益于本文提供的Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的示例性神经变性疾病包括但不限于：脑白质肾上腺萎缩症(ALD)、酒精中毒、亚历山大病、阿耳珀病、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬化(卢伽雷病)、运动失调性毛细血管扩张症、巴腾病(也称为施-伏-斯-巴四氏病)、疯牛病(BSE)、卡纳万病、大脑性麻痹、柯克凯内综合症、皮质基底节变性、克-雅二氏病、家族性致死性失眠症、额颞叶变性、亨廷顿舞蹈病、HIV关联性痴呆、肯尼迪病、克腊比病、Lewy小体痴呆、神经包柔螺旋体病、马查多-约瑟夫病(脊髓小脑性共济失调3型)、多系统萎缩、多发性硬化、昏睡病、尼-皮二氏病、帕金森病、佩-梅二氏病、皮克病、原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性核上麻痹、雷弗素姆病、山德霍夫病、谢耳德病、恶性贫血继发性脊髓亚急性联合变性、施-伏-斯-巴四氏病(也称为巴腾病)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、斯-里-奥三氏病、脊髓痨、中毒性脑病。
可以使用本文所述的方法获得或生成Zscan4+人细胞。将Zscan4+人细胞施用至哺乳动物对象的方法在本领域中是已知的。例如，经由注射比如皮下、肌肉内、真皮内、腹膜内、静脉内或动脉内给药，将Zscan4+人细胞施用至需要这样的治疗的对象。在一些实施方式中，将Zscan4+人细胞直接施用至需要治疗的区域，比如癌性器官或组织，或者脑或脊髓。在一些实施方式中，Zscan4+人细胞被单独施用、存在药学上可接受的运载体(比如被封装在合适的聚合物中)、或存在其它治疗剂。在一些实施方式中，对象被施用至少20,000个Zscan4+人细胞，比如至少50,000个、至少100,000个、至少500,000个、至少1,000,000个或至少2,000,000个Zscan4+人细胞。
在一些方面，本公开内容的方法涉及使用治疗量的增大Zscan4的表达的试剂。试剂的治疗量可以是指治疗剂足以实现预期目的的量。例如，治疗端粒异常关联性疾病或状况的Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的治疗量是足以减少疾病或状况或疾病或状况的一种或多种症状的量。一些实例中的治疗量可以不100％治疗疾病或状况或疾病或状况的症状。然而，任何疾病或状况的已知特征或症状减少，比如减少至少10％、至少15％、至少25％、至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少85％、至少95％或更大，可以是治疗性的。给定的治疗剂的治疗量可将随因素比如试剂的性质、给药途径、接受治疗剂的对象的体积和/或年龄和给药目的而变化。本领域普通技术人员可以根据本领域中建立的方法以经验确定每个个案中的治疗量，而无需过度实验。
在一些方面，本公开内容的方法涉及使用药剂。药剂可以是指化学化合物、小分子或其它组合物，比如Zscan4+人细胞，当其适当地施用至对象或细胞时能够诱导期望的治疗或预防效果。“温育”包括药物与细胞相互作用的充足时间量。“接触”包括以细胞温育固体或液体形式的药物。
用于本公开内容的药学上可接受的运载体是常规的。Easton,Pa.的Mack出版公司，E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences第15版(1975)描述了适于药学递送Zscan4蛋白、Zscan4核酸分子、类维生素A、诱导氧化应激的试剂、和本文公开的细胞的组合物和制剂。一般而言，运载体的性质将取决于采用的具体的给药模式。例如，肠胃外制剂经常包括可注射的流体，其包括作为媒介的药学上和生理学上可接受的流体比如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液(aqueous dextrose)、甘油等。对于固体组合物(例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒性固体运载体可包括，例如，医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性运载体之外，待施用的药学组合物可包含较小量的无毒性的辅助物质，比如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如，醋酸钠或山梨糖醇酐单月桂酸酯。
在一个实例中，Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂被封装入半透性聚合物膜，并且聚合物膜被移入宿主对象的组织位点。这样的方法可以实现局部的、长期的、慢性的递送治疗物质，而且具有调控物质的释放的能力。参见美国专利号5,573,528，用于说明化合物和细胞的封装。在一个实施方式中，Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂被封装在聚合物膜内。封装的聚合物膜然后被移入宿主对象的组织位点。在一个实施方式中，组织位点是中枢神经系统，比如脑或脊髓。
半透性聚合物膜可以是合成的或天然的。可以使用的聚合物的实例包括聚醚砜(PES)、丙烯腈-氯乙烯共聚物(P[AN/VC])、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。递送在聚合物膜内封装的Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂可避免对细胞的宿主排斥和免疫反应、和与排斥和炎症相关联的问题。此外，聚合物膜内包含的细胞被聚合物的壁(即，单个纤维、纤丝、薄膜、喷雾、液滴、颗粒等的壁)隔离而免于免疫监督，同时仍维持细胞成活力并允许转运分子、营养和代谢产物通过聚合物壁。Aebischer等人，1991,Transplant,111:269-275已经开发出聚合物封装的细胞的移植，并且已经成功地用于非人灵长类和人类二者(Aebischer等人，1994,Transplant,58:1275-1277)。也参见美国专利号6,110,902。
在一个实施方式中，通过首先将它们包埋入任一胶原、琼脂糖或PVA(聚乙烯醇)的基质而封装Zscan4+人细胞。随后，包埋的细胞被注入由聚丙烯腈∶聚氯乙烯60∶40共聚物的聚丙烯制成的中空纤维。纤维被切成片并末端密封用于植入。在一个实施方式中，封装的细胞具有大约20,000至大约2,000,000个Zscan4+人细胞。
在一些实例中，Zscan4+人细胞是外源性起源的。外源性细胞可以是指从不同于在其中它们被植入用于治疗的对象的来源获得的细胞。外源性细胞可以来自相同的物种的其它生物体(比如人源细胞用于人患者)。外源性细胞还可以来自异源来源，即，来自与待医疗对象不同的物种(比如鼠细胞用于人)。Zscan4+人细胞还可以采集自同源来源，即，来自将要接受细胞的对象。在从对象收获细胞后，细胞可被遗传修饰(例如，引入编码Zscan4的核酸)或选择/富集Zscan4+人细胞，然后重新移植回对象。因为细胞是同源的，预期不发生免疫反应。
在一个方面，Zscan4+人细胞是无限增殖化的。例如但并不是限制，通过本领域中众所周知的方法，细胞可以是条件性无限增殖化的(以便于细胞在降低的温度下的组织培养中良好生长，但是一旦植入患者并维持在37℃下则停止分裂)或组成性无限增殖化的(例如，以表达大的T抗原的构建体转染，或通过爱泼斯坦-巴尔病毒无限增殖)。将Zscan4+人细胞递送入宿主对象的另一个方法是直接将细胞植入组织位点的目标区域。一旦被植入，这些细胞存活、迁移并无缝地整合入宿主组织。在一个实施方式中，Zscan4+人细胞被直接植入宿主对象的神经系统，比如发育中(developing)神经系统或已经患有创伤或在患有神经紊乱的对象中的神经系统。当被植入发育中神经系统时，Zscan4+人细胞将参与正常发育的过程并将响应宿主的发育信号。被植入的神经前体细胞将沿着建立的迁移路径迁移，将广泛地扩散入神经系统的侵染性区域，并且将与宿主发育程序一致以暂时地和区域性地适当的方式分化为来自神经元和神经胶质谱系二者的子代。植入的Zscan4+人细胞能够非破坏性的掺混宿主神经前体细胞以及分化细胞。植入的细胞可以替代特定的缺陷神经元或神经胶质细胞群体，恢复缺陷功能并可以以广泛分布表达外源基因。
Zscan4+人细胞还可被植入成熟(developed)神经系统。植入的神经前体细胞可形成稳定的移植物、在宿主神经系统内迁移、掺混宿主神经前体细胞和分化细胞并与其相互作用。它们可以替代特定的缺陷神经元或神经胶质细胞群体，恢复缺陷功能并在宿主的神经系统中激活再生和治愈过程。在一个实施方式中，稳定的移植物是在中枢神经系统或外周神经系统中建立的移植物。
类似的方法可用于将Zscan4+人细胞直接植入需要人细胞治疗的任何区域。这样的细胞可以是未分化的或者在体外分化为期望的细胞类型(然后施用至有需要的对象)。例如，在器官再生是期望的情况，例如用于置换为治疗癌症而移除的、或因为其它原因而失去的器官或组织(例如，牙齿、毛发、耳或眼的细胞、皮肤或肌肉)。在一个实施方式中，Zscan4+人细胞被直接植入心脏，例如用于再生由于心肌梗塞而失去的心脏组织或细胞。在一个实施方式中，Zscan4+人细胞被直接植入胰腺，例如用于在患有糖尿病的对象中再生细胞。在一个实施方式中，Zscan4+人细胞被直接植入骨或全身施用，例如用于患有癌症的对象中再生骨髓细胞。
最适合患者治疗的治疗剂量和给药方案将随着待治疗的疾病或状况并且根据患者的重量和其它参数而变化。可以通过常规手段确定有效剂量和治疗方案：在实验动物中从低剂量开始，并且然后增大剂量，同时监测效果，并且系统性改变给药方案。当确定用于给定对象的最佳剂量时，可由临床医生考虑众多因素。因素包括患者的体积、患者的年龄、患者的一般状况、被治疗的具体疾病、疾病的严重程度、在患者中存在其它药物等。在考虑动物研究的结果和临床文献后将选择试验剂量。
因此，Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂被施用至对象，以便于减少或改善与特定紊乱相关联的症状，特别是与端粒异常相关联的那些。癌症治疗的治疗终点可以包括肿瘤的大小或体积减小、肿瘤的血管生成减少、或肿瘤的转移减少。如果肿瘤已经被移除，另一个治疗终点可以是移除的组织或器官的再生。可以使用本领域中的方法测量癌症治疗的疗效，例如肿瘤成像或检测存在肿瘤的肿瘤标记物或其它指示物。自身免疫性疾病治疗的治疗终点可包括自身免疫反应减少。可以使用本领域中的方法测量自身免疫性疾病治疗的疗效，例如测量自身免疫抗体，其中比如治疗的对象中的抗体减少指示治疗成功。神经变性紊乱治疗的治疗终点可包括神经变性相关性不足减少，例如，运动、记忆或行为不足增强的减少。可以使用本领域中的方法测量治疗神经变性紊乱的疗效，例如通过测量认知缺损，其中治疗的对象中这样的缺损减少指示治疗成功。神经损伤治疗的治疗终点可包括损伤相关性不足减少，例如，运动、记忆或行为不足增强的减少。可以使用本领域中的方法测量治疗神经损伤的疗效，例如通过测量运动能力和灵活性，其中治疗的对象中这样的增强指示治疗成功。治疗不需要100％的疗效。例如相对于不存在使用Zscan4+人细胞和/或在人细胞中增大Zscan4表达的试剂的治疗，疾病(或其症状)减少至少大约10％、大约15％、大约25％、大约40％、大约50％或更大被认为是有效的。
在一些实例中，Zscan4+人细胞在鼠或其它小型哺乳动物中以大约1×104个细胞至大约1×107个细胞的剂量，或者在人或其它大型哺乳动物中以大约1×104个细胞至大约1×1010个细胞的剂量施用。在一个具体的非限制性实施方式中，治疗有效量是大约1×106个细胞。为了在被治疗的对象中实现期望的效果，可以联合其它治疗剂(例如，化学化合物、小分子或肽)以治疗有效剂量施用Zscan4+人细胞(例如在不久前或不久后、或同时地)。可以以单剂量或者以多剂量——例如，在疗程期间每天——施用有效量的Zscan4+人细胞。然而，本领域普通技术人员将领会Zscan4+人细胞的有效量将取决于应用的试剂、被治疗的对象、病痛的严重程度和类型和试剂的给药方式。
增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于通过例如向对象的皮肤应用增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂，在有需要的对象中复壮皮肤、治疗特应性皮炎或皮肤损害。
增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于通过例如向对象的头皮应用增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂，在有需要的对象中通过刺激毛发生长治疗脱发。增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于通过向头皮应用增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂，以在毛囊中的黑素干细胞——其功能紊乱引起白发——中增大端粒长度和/或基因组稳定性，从而在有需要的对象中预防和治疗头发花白。
如本文公开的，角膜缘干细胞再生角膜，并且正因如此，可以认为通过增大Zscan4的表达在角膜缘干细胞中增大端粒长度和/或基因组稳定性将复壮有需要的对象中的角膜。在角膜中增大Zscan4的表达还可用于治疗有需要的对象中的干眼症。因此，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于通过例如向对象的角膜应用增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂，在有需要的对象中复壮角膜和/或治疗干眼症。
如本文公开的，特发性肺纤维变性已知由端粒缩短引起。因此，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于通过例如配制增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂(例如，本公开内容的Zscan4多核苷酸)，以便于它可被为治疗特发性肺纤维变性的对象吸入，从而在有需要的对象中治疗特发性肺纤维变性。
增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于在有需要的对象中治疗动脉粥样硬化和/或冠心病，通过例如向对象的血流施用本公开内容的试剂，以便于试剂接触血管内皮细胞并增大其端粒长度和/或基因组稳定性，从而在对象中治疗动脉粥样硬化和/或冠心病。
增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于在一种或多种人细胞和/或有需要的对象中提供对一种或多种遗传毒性剂的抗性，通过例如使一种或多种人细胞与增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂(例如本公开内容的Zscan4多核苷酸)接触，或向有需要的对象施用这种试剂，以便于增大表达的Zscan4增大一种或多种人细胞或对象对一种或多种遗传毒性剂的抗性。有利地，Zscan4表达可用于提供对任何已知的遗传毒性剂或药物的抗性，包括但不限于，丝裂霉素C和顺铂。
已知在iPS细胞的基因组中存在其中DNA甲基化模式不同于人胚胎干(ES)细胞的区域，其被认为在iPS细胞中引起问题(例如，参见Ohi,Y等人，Nat Cell Biol.2011May；13(5):541-9)。不希望受限于理论，可以认为增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂将通过诱导更相似于人ES细胞的人iPS细胞中的DNA甲基化模式改进iPS细胞。可以进一步认为在人iPS中诱导更人ES细胞样的DNA甲基化模式可使得这样的细胞更安全地用于治疗用途。因此，在某些实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂可用于在一种或多种人诱导多能干(iPS)细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式，这通过例如使一种或多种人iPS细胞与增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂(例如，本公开内容的Zscan4多核苷酸)接触，以便于增大表达的Zscan4在一种或多种人iPS细胞中诱导人胚胎干细胞样DNA甲基化模式。
增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于在卵母细胞和体外受精卵母细胞二者，比如受精卵或一细胞期和胚泡期之间的植入前胚胎中，复壮老化卵母细胞和修正核型异常，以增大体外受精(IVF)的成功率；例如，在高龄女性中增大健康足月妊娠的成功率；修正核型异常，比如非整倍性；并且减小发育紊乱比如唐氏综合症的风险。这样的治疗可以特别用于体外受精(IVF)和IVF临床。因此，在某些实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于复壮一种或多种人卵母细胞、增大一种或多种人卵母细胞中的基因组稳定性、和/或修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常，这通过例如使一种或多种人卵母细胞与增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂(例如，本公开内容的Zscan4多核苷酸)接触，以便于增大表达的Zscan4复壮一种或多种人卵母细胞、增大一种或多种人卵母细胞中的基因组稳定性、和/或修正一种或多种人卵母细胞中的一种或多种核型异常。在一些实施方式中，在与增大Zscan4的表达的试剂接触之前，从对象分离一种或多种人卵母细胞。在其它实施方式中，一旦已经使用增大Zscan4的表达的试剂治疗一种或多种人卵母细胞，则细胞经历体外受精。
在其它实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂还可用于在一种或多种受精的人卵母细胞中增大基因组稳定性和/或修正一种或多种核型异常，这通过例如使一种或多种受精的人卵母细胞与增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂(例如，本公开内容的Zscan4多核苷酸)接触，以便于增大表达的Zscan4在一种或多种受精的人卵母细胞中增大基因组稳定性和/或修正一种或多种核型异常。在一些实施方式中，在与增大Zscan4的表达的试剂接触之前，一种或多种受精的人卵母细胞已经通过体外受精而受精。在其它实施方式中，在受精之前，从对象分离一种或多种人卵母细胞。在还其它实施方式中，一种或多种受精卵母细胞是一细胞期和胚泡期之间的植入前胚胎。
在某些实施方式中，增大Zscan4的表达的本公开内容的试剂修正一种或多种核型异常，其包括但不限于非整倍性，比如21三体(唐氏综合症)、16三体、18三体(爱德华综合症)、13三体(致帕韬综合症)、X单体性(特纳综合症)、XXX非整倍性、XXY非整倍性和XYY非整倍性；节段非整倍性，比如1p36重复、17p11.2重复综合症、佩-梅二氏病、22q11.2重复综合症和猫眼综合症；和状况比如猫叫综合症、午-希二氏综合症、威廉斯综合症、夏-马-图三氏病、遗传性压力易感性周围神经病、Smith-Magenis综合症、神经纤维瘤、Alagille综合症、颚心面综合症、迪乔治综合症、类固醇硫酸酯酶缺乏症、卡尔曼综合症、线状皮肤缺损小眼畸形、肾上腺发育不全、甘油激酶缺乏症、佩-梅二氏病、Y染色体上的睾丸决定因子、无精子症(因子a)、无精子症(因子b)、无精子症(因子c)和1p36缺失。
如本文公开的，人基因SERPINB4、DNMT3L和DUX4是标记基因，当Zscan4基因在人细胞中表达时它的表达是未调控的。正因如此，可以认为SERPINB4、DNMT3L和DUX4可被用作用于人细胞中Zscan4的效果的标记物。因此，在一些实施方式中，提供用于在一种或多种人细胞中测定一种或多种Zscan4诱导效应的方法，例如，通过使一种或多种人细胞与在一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触；测量一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平；和将一种或多种人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平与没有与试剂接触的一种或多种对应的人细胞中的SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平进行比较，其中一种或多种人细胞中SERPINB4、DNMT3L和/或DUX4的表达水平的增大表明在一种或多种人细胞中存在一种或多种Zscan4诱导效应。
在一些实施方式中，本公开内容的对象是非人动物。非人动物可以是指除人以外的全部动物。非人动物包括但不限于非人灵长类；家畜比如猪、牛和家禽；竞技动物(sportanimal)或宠物比如狗、猫、马、仓鼠；啮齿动物，比如小鼠；或动物园动物比如狮、虎或熊。在一个实施方式中，非人动物是鼠。
除非另外说明，本文使用的全部技术和科学术语具有与如本公开内容所属领域普通技术人员所一般理解的相同的含义。单数术语“一个(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确指明。类似地，词语“或”意欲包括“和”，除非上下文另外明确指出。因此“包括A或B”意思是包括A或B、或者A和B。应当进一步理解，为核酸或多肽给出的全部碱基大小或氨基酸大小和全部分子量或分子质量值是近似的，并且提供用于说明。虽然类似或等价于本文所述的那些的方法和材料可用于本公开内容的实践或测试，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的全部出版物、专利申请、专利和其它参考文献以它们的全部通过引用并入。在冲突的情况下，以包括术语解释的本说明书为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并且不意欲是限制性的。
提供以下实施例说明某些具体特征和/或实施方式。这些实施例不应当被解释为将公开内容限制为描述的具体特征或实施方式。
实施例
实施例1：Zscan4表达修正鼠胚胎干细胞中的染色体异常
此实施例描述了Zscan4的表达——通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体——可修正鼠胚胎干(ES)中的染色体异常的发现。此实施例还表明编码Zscan4的合成mRNA和表达Zscan4的仙台病毒载体可被用作生物制品。
材料和方法
细胞培养
先前报道了MC1ZE鼠ES细胞系(Amano等人，Nat Commun,2013；4:1966)。MC1ZE细胞被用作典型的鼠ES细胞，其显示由于长期培养(传代数33)的不良核型(即，仅大约20％的细胞携带整倍体)，和外源性基因的整合。在37℃下，5％CO2中，如先前所述的完全ES培养基中培养细胞(Amano等人，Nat Commun,2013；4:1966.)：DMEM(Gibco)、15％FBS(AtlantaBiologicals)、1000U/ml白血病抑制因子(LIF)(ESGRO,Chemicon)、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)、2mM GlutaMAX、0.1mMβ-巯基乙醇和青霉素/链霉素(50U/50μg/ml)。每天更换培养基，并且例行地每2至3天传代细胞。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
仙台病毒载体
表达鼠Zscan4c(SeV18+mZscan4/ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4”或“SeVhZSCAN4”。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。这些仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的鼠Zscan4c(SeV18+mZERT2/ΔF)或者表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的人ZSCAN4(SeV18+hZERT2/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZERT2”或“SeVhZERT2”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
此外，表达鼠Zscan4(SeV18+mZscan4/TS15ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)的热敏仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4-TS15”或“SeVhZSCAN4-TS15”。这些仙台载体在35℃下有功能，并且在37℃下失活(Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。此载体在本文被称为“SeVAG-TS15”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
核型分析
通过如Amano等人，Nat Commun,2013；4:1966中所述实施的G显带技术，进行核型分析。
结果
编码鼠或人ZSCAN4的合成mRNA修正鼠胚胎干细胞中的染色体异常
图1A显示实验过程：MC1ZE鼠ES细胞(第33代)以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且使用5μl的Lipofectamine(RNAiMAX：Life Technologies,California,USA)转染1μg的合成GFP mRNA(对照)或1μg的合成人ZSCAN4 mRNA中的任一个。除转染GFP mRNA的细胞外，还使用不转染的细胞作为对照。每2-3天传代细胞，然后使用合成mRNA转染。在第33代(一次转染后3天)、第34代(三次转染后3天)、第36代(4次转染后3天)和第40代(七次转染后3天)时实施细胞的核型分析。
如图1B中所示，鼠ES细胞转染人ZSCAN4的合成mRNA修正染色体异常和增大具有正常核型(整倍性)的细胞的数目。虽然一次转染足以看出显著水平的修正，重复转染(例如，七次)进一步从大约20％至40％增大具有整倍性的细胞的数目。这些结果表明将人ZSCAN4mRNA引入细胞可修正染色体数的异常。
表达人ZSCAN4的仙台病毒载体修正鼠胚胎干细胞中的染色体异常
图2A显示了在使用表达鼠Zscan4c或者表达人ZSCAN4的仙台病毒载体治疗鼠ES细胞后核型分析的概述。MC1ZE鼠ES细胞(第33或34代)以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且使用图2A中所指示的MOI下的SeVAG(对照)、SeVmZscan4或SeVhZSCAN4中的任一种治疗。作为额外的对照，使用不进行任何治疗的MC1ZE细胞。3天后，分析细胞的核型。如图2A中所示，通过接触SeVmZscan4或SeVhZSCAN4可以显著地改进鼠ES细胞的核型。有趣地，结果显示人ZSCAN4比鼠Zscan4c更有效。
图2B显示了在使用表达鼠Zscan4c-ERT2融合蛋白或者表达人ZSCAN4-ERT2融合蛋白的仙台病毒载体治疗鼠MC1ZE ES细胞后核型分析的概述。已知通过在细胞培养基中存在三苯氧胺(Tmx)可以激活与ERT2结构域融合的蛋白质。MC1ZE鼠ES细胞(第33或34代)以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且使用图2B中所指示的MOI下的SeVmZERT2或SeVhZERT2中的任一种治疗。作为对照，使用不进行任何治疗的MC1ZE细胞。如图2B中所示，使用SeVmZERT2或SeVhZERT2中的任一种治疗可以修正染色体异常，甚至不需要Tmx。然而，添加Tmx进一步增强SeVmZERT2和SeVhZERT2修正染色体异常的能力。结果还显示人ZSCAN4比鼠Zscan4c更有效：融合蛋白——人ZSCAN4-ERT2——在存在Tmx的情况下增大具有整倍性的细胞的数目15％至53％。
图3显示了在使用表达鼠Zscan4c或者表达人ZSCAN4的热敏仙台病毒载体治疗MC1ZE鼠ES细胞后核型分析的概述。MC1ZE鼠ES细胞(第33或34代)以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且使用图3中所指示的MOI下的SeVAG-TS15(对照)、SeVmZscan4-TS15或SeVhZSCAN4-TS15中的任一种治疗。作为额外的对照，使用不进行任何治疗的MC1ZE细胞。在使细胞与这些载体接触后，细胞在35℃下培养三天(图3A)，在35℃下培养六天(图3B)，和在35℃下培养三天，然后在37℃下培养三天(图3C)。通过使细胞与SeVmZscan4-TS15或SeVhZSCAN4-TS15中的任一种接触，在全部三种条件中观察到染色体异常的修正。惊人地，人ZSCAN4被发现在修正染色体异常方面比鼠Zscan4c更有效。因而，这些结果表明即使在鼠细胞中，人ZSCAN4产生惊人的比鼠Zscan4c更优越的结果。的确，最好的结果是通过使用人ZSCAN4(即，SeVhZSCAN4-TS15)治疗细胞，并且将细胞在35℃下培养三天，然后在37℃下培养三天而获得的：治疗增大了具有整倍性的细胞的数目19％至53％。在这些实验中，在35℃的许可温度下培养使用热敏仙台载体治疗的细胞三天，然后在37℃的失活温度下培养三天，代表Zscan4的瞬时表达。与此相反，在35℃的许可温度下培养使用热敏仙台载体治疗的细胞全部六天代表持续的Zscan4表达。基于这些条件，结果表明瞬时表达的Zscan4在修正染色体异常方面比持续表达的Zscan4更有效。
实施例2：Zscan4生物制品对鼠胚胎干细胞的作用
先前已经显示来自整合入鼠基因组的质粒载体的外源性鼠Zscan4c的强制表达诱导表达一组独特的基因，其包括Tmem92、Stra8和内源性Zscan4基因(Amano等人，NatCommun,2013；4:1966)。
此实施例表明Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4，或者通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)在鼠胚胎干(ES)细胞中施加相同的功能。
材料和方法
细胞培养
MC1鼠胚胎干(ES)细胞系先前被用作典型的鼠多能干细胞以表明外源导入的Zscan4c基因的功能，其被整合入鼠基因组(Amano等人，Nat Commun,2013；4:1966.)。在37℃下，5％CO2中，如先前所述的完全ES培养基中培养MC1细胞(Amano等人，Nat Commun,2013；4:1966.)：DMEM(Gibco)、15％FBS(Atlanta Biologicals)、1000U/ml白血病抑制因子(LIF)(ESGRO,Chemicon)、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)、2mM GlutaMAX、0.1mMβ-巯基乙醇和青霉素/链霉素(50U/50μg/ml)。每天更换培养基，并且例行地每2至3天传代细胞。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物以增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
仙台病毒载体
表达鼠Zscan4c(SeV18+mZscan4/ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4”或“SeVhZSCAN4”。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。这些仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的鼠Zscan4c(SeV18+mZERT2/ΔF)或者表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的人ZSCAN4(SeV18+hZERT2/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZERT2”或“SeVhZERT2”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
此外，表达鼠Zscan4(SeV18+mZscan4/TS15ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)的热敏仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4-TS15”或“SeVhZSCAN4-TS15”。这些仙台载体在35℃下有功能，并且在37℃下失活(Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。此载体在本文被称为“SeVAG-TS15”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
结果
图4A显示qRT-PCR分析的结果，其在以合成mRNA转染MC1鼠ES细胞后监测Tmem92、Stra8、Actb(肌动蛋白对照)和内源性Zscan4基因的表达水平。与GFP mRNA转染的对照细胞相比，人ZSCAN4 mRNA增大内源性鼠Zscan4基因的表达。
图4B显示qRT-PCR分析的结果，其在使MC1鼠ES细胞与表达鼠Zscan4c或者表达人ZSCAN4的仙台病毒载体接触后监测Tmem92、Stra8、Actb(肌动蛋白对照)和内源性Zscan4基因的表达水平。与接触空仙台载体(SeVAG)的对照细胞相比，SeVmZscan4和SeVhZSCAN4二者增大Tmem92、Stra8和内源性Zscan4基因的表达。SeVmZERT2和SeVhZERT2还在存在Tmx的情况下起作用。类似地，表达鼠Zscan4c或者表达人ZSCAN4的热敏仙台载体也作用于MC1细胞(图4C)。
这些结果指示表达Zscan4或合成Zscan4 mRNA的仙台载体形式的Zscan4生物制品可以以类似于整合入鼠基因组的鼠Zscan4c转基因的方式作用于鼠ES细胞。不希望受限于理论，认为Zscan4生物制品作为用于鼠细胞的试剂和用于人细胞的疗法具有优势，因为容易使用和消除不需要的DNA整合入基因组。而且，不花费大量时间对细胞进行遗传改造，Zscan4生物制品仅需要将Zscan4生物制品添加至细胞培养基的简单的步骤。
实施例3：Zscan4生物制品对人诱导多能干细胞的作用
基因SERPINB4、DNMT3L和DUX4被认定为标记基因，当鼠Zscan4c或人ZSCAN4基因通过基于转基因的基因表达系统过表达时其被上调。
此实施例表明Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——或者通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)可以以类似于在鼠多能干细胞中使用的基于转基因的Zscan4过表达系统的方式作用于人iPS细胞。此实施例还表明编码人ZSCAN4的合成mRNA和表达人ZSCAN4的仙台病毒载体可被用作治疗人多能干细胞的治疗用生物制品。
材料和方法
细胞培养
根据制造商的使用说明，在有丝分裂失活的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和补充有20％knockout血清替代品和10ng/ml bFGF(Life Technologies,CA,USA)的培养基上培养人包皮成纤维细胞源诱导多能干(hiPS)细胞(System Biosciences,CA,USA)。每天更换培养基，并且每7天使用accutase传代细胞。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
仙台病毒载体
表达鼠Zscan4c(SeV18+mZscan4/ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4”或“SeVhZSCAN4”。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。这些仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的鼠Zscan4c(SeV18+mZERT2/ΔF)或者表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的人ZSCAN4(SeV18+hZERT2/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZERT2”或“SeVhZERT2”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
此外，表达鼠Zscan4(SeV18+mZscan4/TS15ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)的热敏仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4-TS15”或“SeVhZSCAN4-TS15”。这些仙台载体在35℃下有功能，并且在37℃下失活(Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。此载体在本文被称为“SeVAG-TS15”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
结果
图5A显示编码人ZSCAN4的合成mRNA可诱导SERPINB4的表达。图5B显示SeVmZscan4、SeVhZSCAN4、SeVmZERT2(Tmx+条件)和SeVhZERT2(Tmx+条件)可诱导SERPINB4的表达，在一定程度上，诱导DNMT3L和DUX4的表达。类似地，表达鼠Zscan4c或者表达人ZSCAN4的热敏仙台载体可诱导DNMT3L的表达(图5C)。
这些结果指示表达Zscan4或合成Zscan4 mRNA的仙台载体的形式的Zscan4生物制品可作用于人多能干细胞，例如，人iPS细胞，因为Zscan4诱导Zscan4对人iPS细胞的作用的标记物(例如，SERPINB4、DNMT3L和DUX4)。这些标记物还可以用于测量Zscan4生物制品的质量和效果(质量控制[QC])。
实施例4：Zscan4表达提高人多能干细胞的质量
此实施例描述Zscan4生物制品可以提高人多能干细胞的质量的发现，所述人多能干细胞包括但不限于人胚胎干(ES)细胞和诱导多能干(iPS)细胞，其通过利用Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——或者通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)修正一种或多种染色体异常和修正一种或多种表观遗传错误。具体而言，已经显示Zscan4生物制品通过使通过其它方法难以脱甲基的数个DNA区域瞬间脱甲基，可以在人iPS细胞中修正错误的DNA甲基化模式。例如，在基因组中存在其中DNA甲基化模式在人iPS细胞和人ES细胞之间不同的区域。因而，在人iPS细胞中修正这样错误的DNA甲基化模式是重要的。认为Zscan4生物制品通过仅仅将人iPS细胞暴露于Zscan4生物制品而修正DNA甲基化问题的能力可以是提高用于医疗用途的人iPS细胞的安全性的关键技术。Zscan4生物制品在人iPS细胞中修正DNA甲基化问题的能力还将允许改进存在的人iPS细胞。实施例5：Zscan4表达延长人先天性角化不良成纤维细胞的寿命并延长人先天性角化不良成纤维细胞中的端粒长度
此实施例描述了人ZSCAN4的表达——或者通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体——诱导人先天性角化不良成纤维细胞的寿命延长并还诱导人先天性角化不良成纤维细胞中的端粒长度延长的发现。此实施例还表明编码人ZSCAN4的合成mRNA和表达人ZSCAN4的仙台病毒载体可被用作治疗用生物制品。
材料和方法
细胞培养
从患有先天性角化不良(DKC：X染色体连锁的)的患者分离的成纤维细胞是从Coriell Cell Repository(产品目录号AG04646)购买的。根据Coriell产品目录信息，细胞供体，11岁男性白种人，受影响并呈现出皮疹、贫血、指甲营养不良和食管异常。家族史是阴性。活组织检查采取来自不涉及皮肤的死前检查。使用切碎组织的外植体在2/21/81开始培养。细胞形态是成纤维细胞样。群体倍增水平(PDL)在冷冻下是5.41且传代数是5。
在从Coriell Cell Repository接收DKC细胞后，细胞再培养几代。在CoriellCell Repository推荐的条件下培养细胞：具有Earle盐和非必需氨基酸的Eagle极限必需培养基，补充15％胎牛血清(未灭活的)。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA，合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物以增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
仙台病毒载体
表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&BiologicalLaboratories Co,LTD)定制。载体在本文被称为“SeVhZSCAN4”。此仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。10的MOI(感染复数)被用于实验。
端粒DNA印迹分析
根据制造商的使用说明，使用TeloTAGGG端粒长度检测试剂盒(Roche AppliedSciences,Indiana,USA)，通过DNA印迹分析测量细胞的端粒长度。
结果
编码人ZSCAN4的合成mRNA延长人先天性角化不良成纤维细胞的寿命
DKC细胞以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且然后使用5μl的Lipofectamine(RNAiMAX：Life Technologies,California,USA)转染1μg的合成mRNA。第二天更换培养基。每周以1∶2的比率传代细胞，并且在50ng/ml B18R(I型IFN抑制剂：eBiosciences,Inc.,California,USA)的存在下转染合成mRNA。一式三份制备样品。使用自动细胞计数器Moxi Z(ORFLO Technologies,Idaho,USA)对细胞数进行计数。细胞数被转换为PDL(群体倍增水平)，起始于PDL＝0(根据来自Coriell Cell Repository的信息，从第9代归一化，相当于近似PDL＝9)。
图6显示了60天内细胞生长检测的结果。在对照实验中，重复转染GFP mRNA不改变DKC细胞的生长模式：培养基中约20天后(近似PDL＝2)，细胞停止增殖并经历细胞衰老。相比之下，重复转染人ZSCAN4 mRNA延长DKC细胞的寿命，并且细胞继续生长直到～40天(～PDL＝4)。重要的是注意到hZSCAN4治疗没有将细胞转化为具有无限增殖能力的肿瘤样细胞。这些结果指示hZSCAN4治疗可以延长来自DKC患者的细胞的寿命，而不将细胞转化为肿瘤。
表达人ZSCAN4的仙台病毒载体延长人先天性角化不良成纤维细胞的寿命
DKC细胞以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且6小时后细胞以10的MOI接触SeVhZSCAN4载体24小时。作为对照，以相同方式培养DKC细胞的第二样品，但是不暴露于SeVhZSCAN4载体。每一或二周传代细胞。通过自动细胞计数器Moxi Z(ORFLOTechnologies,Idaho,USA)对细胞数进行计数。细胞数被转换为PDL(群体倍增水平)，起始于PDL＝0(根据来自Coriell Cell Repository的信息，从第9代归一化，相当于近似PDL＝9)。
图7A显示了细胞生长检测的结果。在对照实验中，DKC细胞显示典型的生长模式：培养约25天后(近似PDL＝2)，细胞停止增殖并经历细胞衰老。相比之下，与SeVhZSCAN4载体接触的DKC细胞显示增大的细胞寿命。重要的是注意到SeVhZSCAN4治疗没有将细胞改变为具有无限增殖能力的肿瘤样细胞。
图7B显示了第28天的细胞形态。SeVhZSCAN4治疗的细胞比未治疗的对照细胞显示更好的形态。
这些结果指示SeVhZSCAN4治疗可以延长来自DKC患者的细胞的寿命，而不将细胞转化为肿瘤。
编码人ZSCAN4的合成mRNA延长人先天性角化不良成纤维细胞中的端粒长度
图8A显示了实验的过程。DKC细胞以1×105个细胞/10cm培养皿的浓度铺板在10cm培养皿中。每个10cm培养皿中的细胞然后使用25μl的Lipofectamine(RNAiMAX：LifeTechnologies,California,USA)转染5μg的合成mRNA。第二天更换培养基。第7天收获1个皿的细胞，并且提取基因组DNA。以1∶2的比率传代另一个皿的细胞，并且然后使用25μl的Lipofectamine转染5μg的合成mRNA。第15天收获细胞，并且提取基因组DNA。基因组DNA然后进行端粒长度检测。
图8B显示了端粒长度检测的结果。如先前所报道的(Wong J.M.,Collins K.GenesDev.(2006),20(20),2848-2858)，DKC成纤维细胞的端粒长度比正常细胞的短，并且当培养DKC细胞时其快速地变得甚至更短。在对照实验中，转染GFP mRNA不改变DKC细胞的端粒长度缩短模式。相比之下，转染人ZSCAN4 mRNA延长DKC细胞的端粒长度，并且阻止端粒长度变得更短。这些结果指示DKC细胞的端粒长度缩短——DKC疾病表型的主因——可以通过使用hZSCAN4-mRNA治疗细胞而被挽救。
实施例6：Zscan4表达延长人维尔纳综合症细胞的寿命
WS患者表征为早熟衰老的外表。培养的WS患者的细胞呈现出较高比率的染色体断裂、易位和缺失。因而，WS患者需要可增强基因组和/或染色体稳定性的治疗。
此实施例表明编码Zscan4的合成mRNA可延长从维尔纳综合症(WS)患者分离的成纤维细胞的寿命。此实施例还表明编码人ZSCAN4的合成mRNA可被用作治疗用生物制品。
材料和方法
细胞培养
从患有维尔纳综合症(WS)的患者分离的成纤维细胞是从Coriell CellRepository(产品目录号AG03141)购买的。根据Coriell产品目录信息，“供体是30岁女性白种人，并且具有早熟衰老、色素性与萎缩皮肤、白内障与V型高脂血症的特征。活组织检查在9/20/78进行死前检查。使用切碎皮肤组织的外植体开始培养。细胞形态是成纤维细胞样。核型是46、XX，而且检验的80％的细胞显示随机的染色体异常。WRN基因中的核苷酸2476处的C至T纯合子转换(2476C>T)，导致748{Gln748TER(Q748X)}处的终止密码子。群体累积倍增水平(PDL)在冷冻下是17.97且传代数是11”。在从Coriell Cell Repository接收WS细胞后，细胞再培养几代。在Coriell Cell Repository推荐的条件下培养细胞：具有Earle盐的Eagle极限必需培养基——Dulbecco改良MEM，补充15％胎牛血清(未灭活的)。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物以增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
结果
WS细胞以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且然后在第0天使用5μl的Lipofectamine(RNAiMAX：Life Technologies,California,USA)转染1μg的合成mRNA。第二天更换培养基。第3天实施相同mRNA的二次转染。取决于细胞的生长，每1或2周以1∶2的比率传代细胞。一式三份制备样品。细胞数被转换为PDL，起始于PDL＝0(近似地相当于19的累积PDL，其根据来自Coriell Cell Repository的信息，接近细胞衰老)。
图9显示了细胞生长检测的结果。转染合成GFP mRNA的WS细胞被用作对照。如图9中所示，转染合成GFP mRNA的WS细胞遭遇细胞衰老并停止增殖。相比之下，向WS细胞转染合成hZSCAN4 mRNA提供给WS细胞超过两个PDL，并且因而延长WS细胞的寿命(图9)。重要地，结果表明合成hZSCAN4 mRNA不提供无限细胞生长，因为细胞最终停止增殖。类似于合成hZSCAN4 mRNA的结果，还在与表达人ZSCAN4的SeVhZSCAN4或SeVhZSCAN4-TS15仙台病毒载体接触的细胞中观察到WS细胞的寿命延长。不希望受限于理论，认为ZSCAN4用作治疗用生物制品似乎不引起细胞转化和/或治疗的细胞中的癌症。这些结果指示hZSCAN4治疗可以延长来自WS患者的细胞的寿命，而不将细胞转化为肿瘤。
实施例7：Zscan4表达在患者中治疗端粒缩短
图10图解了使用Zscan4的一个治疗模式。此过程非常类似于骨髓移植过程，其在医院中常规进行以治疗患有骨髓衰竭和白血病的患者。将从患者抽出包括造血干细胞和间充质干细胞的骨髓，并且然后立刻暴露于Zscan4(例如，携带人ZSCAN4的仙台载体)。此暴露于Zscan4将是短暂的并持续短时间。不希望受限于理论，当骨髓细胞被施用回至患者时，认为Zscan4的表达将消失。可选地，可以使用热敏仙台载体，因为Zscan4的表达可以通过转换温度而关闭。可选地，可以使用携带融合蛋白hZSCAN4-ERT2的仙台载体，其可通过添加三苯氧胺开启并可通过移除三苯氧胺而关闭。可选地，可以使用合成mRNA比如hZSCAN4-mRNA，因为由于合成mRNA有限的半衰期，蛋白的产生是短暂的。因而Zscan4复壮的骨髓细胞将然后再生患者的骨髓和造血区室(compartment)。基于此瞬时Zscan4接触的长期效果，并且不希望受限于理论，认为此过程仅需要一次或以长间隔时间(例如，许多年)定期需要。不希望受限于理论，认为Zscan4复壮的骨髓细胞将胜出并因而置换生病的骨髓细胞。因此，认为辐射骨髓以消除生病的骨髓细胞——其在标准骨髓移植期间进行——将不是必需的。
实施例8：Zscan4表达延长人成纤维细胞中的端粒
此实施例描述了Zscan4过表达诱导人成纤维细胞中的端粒延长的发现。
材料和方法
细胞培养
从成人皮肤(～30岁)分离的原代成人真皮成纤维细胞(HDFa)是从LifeTechnologies(产品目录号C-013-5C)购买的。从范康尼贫血、互补群A(FANCA)患者分离的成纤维细胞(GM01309)是从Coriell Cell Repository购买的。在标准培养条件下维持这些细胞：DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)，补充10％胎牛血清。
通过qPCR的端粒定量
使用先前所述的过程实施通过qPCR的端粒定量(Cawthon,R.M.Nucleic AcidsRes.2002May 15；30(10):e47；和Callicott,RJ等人Comparative Medicine,2006)。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从>5×105个成纤维细胞提取基因组DNA。使用Nanodrop评估gDNA样品的质量。具有大于1.8的A260/280吸光度比率和大约2的A260/230吸光度比率的基因组DNA样品被用于qPCR以测定端粒长度。
用于端粒PCR的引物如下：
tel1b：5′-CGGTTT(GTTTGG)5GTT-3′(SEQ ID NO:41)；和
tel2b：5′-GGCTTG(CCTTAC)5CCT-3′(SEQ ID NO:42)
以300nM的终浓度使用每个引物。
用于单拷贝基因PCR的引物如下：
36B4u：5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3'(SEQ ID NO:43)；和
36B4d：5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3'(SEQ ID NO:44)
以300nM的终浓度使用36B4u引物，并且以500nM的终浓度使用36B4d引物。
最终20μl qPCR反应发生在96孔板的一个孔中，并且包括20ng gDNA、引物和1×Power SYBR green(Applied Biosystems)。用于Tel1b/2b PCR的端粒PCR热循环程序是：95℃ 10分钟，95℃ 15s 40个循环，和56℃ 1分钟。用于36B4 PCR的端粒PCR热循环程序是：95℃ 10分钟，95℃ 15s 40个循环，和58℃ 1分钟。StepOne Plus qPCR机器(AppliedBiosystems)用于处理样品。设置阈值水平以获得20-22附近的样品Ct值。ΔΔCt方法用于计算相对的端粒/单拷贝基因比(相对的T/S比率)，用于评价每个样品中的端粒长度。
仙台病毒载体
表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&BiologicalLaboratories Co,LTD)定制。此仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，JVirol.77:23238-3246,2003)。
结果
人ZSCAN4的过表达迅速地在正常成人成纤维细胞中增大端粒长度
在标准培养条件下培养成人真皮成纤维细胞(HDFa)。在传代细胞那天后，收获一个细胞样品用于基因组DNA提取(没有治疗对照)。第二细胞样品以SvhZSCAN4仙台病毒载体转导。
转导2天(SeVhZSCAN4治疗第2天)或3天(SeVhZSCAN4治疗第3天)后收获转导细胞。然后通过qRT-PCR测量收获细胞的端粒长度，并且计算相对于对照——未治疗对照细胞——的端粒长度(T/S比率)。
如图11中所示，端粒的平均长度在第2天和第3天后增大。具体而言，转导ZSCAN4后2天，HDFa细胞具有大约1.4的T/S比率，而对照细胞具有1.0的T/S比率(图11)。类似地，转导ZSCAN4后3天，HDFa细胞具有大约1.4的T/S比率(图11)。这些结果指示转导ZSCAN4后两天，相对于没有转导ZSCAN4的对照细胞，HDFa细胞相对端粒长度增大大约40％。
人ZSCAN4的过表达迅速地在从患有范康尼贫血，互补群A的患者分离的成人成纤维细胞中增大端粒长度
在标准培养条件下培养从FANCA患者分离的GM01309成纤维细胞。在传代细胞那天后，收获一个细胞样品用于基因组DNA提取(没有治疗对照)。第二细胞样品转导SvhZSCAN4仙台病毒载体。
转导2天(SeVhZSCAN4治疗第2天)或3天(SeVhZSCAN4治疗第3天)后收获转导细胞。然后通过qRT-PCR测量收获细胞的端粒长度，并且计算相对于对照——未治疗对照细胞——的端粒长度(T/S比率)。
如图12中所示，端粒的平均长度在第2天后轻微地增大并在第3天后显著地增大。具体而言，转导ZSCAN4后2天，GM01309细胞具有大约1.1的T/S比率，而对照细胞具有1.0的T/S比率(图12)。此结果指示转导ZSCAN4后2天，相对于没有转导ZSCAN4的对照细胞，GM01309细胞相对端粒长度增大大约10％。
转导ZSCAN4后三天，GM01309细胞具有大约2.6的T/S比率(图12)。此结果指示转导ZSCAN4后三天，相对于没有转导ZSCAN4的对照细胞，GM01309细胞相对端粒长度增大大约160％。
实施例9：Zscan4表达延长人成纤维细胞的寿命
此实施例描述了编码人ZSCAN4的合成mRNA可以延长从健康成人分离的真皮成纤维细胞的寿命的发现。此实施例还表明编码人ZSCAN4的合成mRNA可被用作治疗用生物制品。
材料和方法
细胞培养
从成人皮肤分离的原代人真皮成纤维细胞(HDFa)是从Life Technologies购买的。根据制造商的信息，HDFa细胞能够至少12次群体倍增(PDL)。根据制造商的使用说明培养HDFa细胞。在接收HDFa细胞后，培养细胞许多代，以便于细胞不指数生长并接近细胞衰老。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物以增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
结果
接近细胞衰老阶段的HDFa细胞以1×105个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中，并且然后在第0天使用5μl的Lipofectamine(RNAiMAX：Life Technologies,California,USA)转染1μg的合成mRNA。第二天更换培养基。第3天实施相同mRNA的二次转染。取决于细胞的生长，每1或2周以1∶2的比率传代细胞。一式三份制备样品。细胞数被转换为PDL，起始于PDL＝0。
图13显示了细胞生长检测的结果。转染合成GFP mRNA的HDFa细胞被用作对照。2周后，转染合成GFP mRNA的HDFa细胞遭遇细胞衰老并缓慢增殖(图13)。相比之下，转染合成hZSCAN4 mRNA的HDFa细胞生长额外的2至3个PDL，并且因而，延长在细胞衰老附近的HDFa细胞的寿命(图13A和13B)。合成鼠Zscan4 mRNA似乎不提供寿命延长。此结果指示人ZSCAN4比鼠Zscan4c更有效延长HDFa细胞的寿命(图13C)。然而，合成hZSCAN4 mRNA不提供无限细胞生长，因为细胞减慢或最终停止增殖。类似于合成hZSCAN4 mRNA的结果，还在与表达人ZSCAN4的SeVhZSCAN4或SeVhZSCAN4-TS15仙台病毒载体接触的细胞中观察到HDFa细胞的寿命延长。因而，未观察到ZSCAN4用作治疗用生物制品引起细胞转化和/或治疗的细胞中的癌症。这些结果指示hZSCAN4治疗可以延长HDFa细胞的寿命，而不将细胞转化为肿瘤。
实施例10：通过Zscan4生物制品的人间充质干(MS)细胞中的端粒长度延长
此实施例描述了表达人ZSCAN4的热敏仙台病毒载体可以延长人间充质干(MS)细胞中的端粒长度的发现。此实施例还表明表达人ZSCAN4的仙台病毒载体可被用作生物制品以改进成体干细胞治疗，其包括但不限于骨髓移植。
材料和方法
细胞培养
人脂肪源间充质干细胞(MSC)是从Life Technologies(CA,USA)购买的。根据制造商的使用说明，ADSC已经表明表型和功能特性非常相似于骨髓源间充质干细胞。在它们失去生长或分化为全部潜在表型的能力前，它们可以扩增4-5代。在制造商推荐的条件下培养细胞。
仙台病毒载体
表达鼠Zscan4(SeV18+mZscan4/TS15ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)的热敏仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4-TS15”或“SeVhZSCAN4-TS15”。这些仙台载体在35℃下有功能，并且在37℃下失活(Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。作为对照，使用相同的热敏仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。此载体在本文被称为“SeVAG-TS15”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
端粒DNA印迹分析
根据制造商的使用说明，使用TeloTAGGG端粒长度检测试剂盒(Roche AppliedSciences,Indiana,USA)，通过DNA印迹分析测量细胞的端粒长度。
结果
第2代人脂肪源间充质干细胞(MSC)以1.5×105个细胞的密度铺板在10cm皿中，并且以10的MOI接触热敏仙台载体(第0天)。细胞在包含10μM H2O2的培养基中温育并保持在35℃下3天，然后在37℃下培养。细胞在第7天以1∶2的比率传代。在第10天的另一次传代后，细胞以10的MOI再次接触热敏仙台载体并在35℃下温育3天，然后在37℃下培养。随后，细胞在第14天(第3代)、第20天、第27天、第42天、第62天(第7代)传代。细胞在包含10μM H2O2的培养基中温育，使得端粒长度比在典型细胞培养条件下更快变短。
图14显示了端粒长度检测的结果。根据制造商的方案基于DNA印迹分析评估平均端粒长度(图例中所示的)。如图14中所示，人ZSCAN4(SeVhZSCAN4-TS15)增大人MSC的端粒长度，然而鼠Zscan4(SeVmZscan4-TS)似乎不影响端粒长度。这些结果指示可通过使用人ZSCAN4生物制品治疗细胞，挽救人MSC中的端粒长度缩短。不希望受限于理论，认为本文所述的人ZSCAN4的作用可以应用于培养的其它人组织干细胞。还认为人ZSCAN4生物制品也可在存在于人组织(即，体内)中的人组织干细胞中延长端粒长度(例如，细胞复壮)。
实施例11：Zscan4表达治疗在居民组织干细胞中具有缺陷的患者
存在由居民组织干细胞(即，存在于人体的器官和/或组织中的组织干细胞)中的一种或多种缺陷引起的许多疾病。例如，杜兴肌营养不良已知与肌肉干细胞(卫星细胞)的早熟衰老相关联。基于Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——或者通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)可以复壮组织干细胞的本文所述的结果，认为居民组织干细胞中的Zscan4表达可以在细胞中修正缺陷关联性疾病。在杜兴肌营养不良的情况下，可以想到Zscan4表达可用于治疗患有杜兴肌营养不良的患者，其通过将Zscan4生物制品施用至患有杜兴肌营养不良的患者的肌细胞，特别是肌肉干细胞，以阻止肌肉细胞的早期恶化。
实施例12：Zscan4表达治疗患有糖尿病的患者
已经表明人ZSCAN4在人胰腺中的一些组织干细胞中天然地(虽然很少)表达。基于Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)可以复壮组织干细胞和终末分化细胞的本文所述的结果，可以认为ZSCAN4表达可用于治疗患有糖尿病的患者，其通过将Zscan4生物制品施用至患有糖尿病的患者的胰腺细胞，特别是居民胰腺组织干细胞，以阻止胰腺细胞进一步恶化，并且从而促进产生β细胞。
实施例13：Zscan4表达治疗患有特应性皮炎和其它皮肤损害的患者
基于Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)可以复壮组织干细胞和终末分化细胞的本文所述的结果，可以认为ZSCAN4表达可用于治疗患有特应性皮炎或其它皮肤损害的患者，其通过将Zscan4生物制品暴露(例如，通过局部施用)至患有特应性皮炎或其它皮肤损害的患者的皮肤，特别是居民皮肤组织干细胞，以阻止皮肤组织干细胞和皮肤细胞进一步恶化，并且从而促进产生新的皮肤组织干细胞和皮肤细胞。实施例14：Zscan4表达用于复壮个体，或者用于通过复壮包括终末分化细胞、祖细胞或居民组织干细胞的体内细胞减慢个体的老化过程
认为人体中的几乎全部器官和组织是由存在于体内器官和组织中的居民组织干细胞维持的。例如，肠是通过从存在于肠的隐窝中的肠干细胞持续产生成熟和分化细胞而维持的。类似地，皮肤是通过从皮肤干细胞持续产生真皮上皮细胞而维持的，而毛发是由毛囊干细胞维持的。与以相对快的速度老化和恶化的完全分化细胞相比，组织干细胞倾向于例如通过维持端粒长度(图15)维持它们的质量和年轻度。然而，甚至组织干细胞逐渐地失去它们的年轻度(图15)。因此，一般老化以及年轻外表和功能的逐渐损失可以认为是居民组织干细胞老化和恶化的结果。
基于Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)可以复壮胚胎干(ES)细胞和间充质干细胞(MSC)的本文所述的结果，可以认为Zscan4表达在存在于人体的每个器官和/或组织中的组织干细胞中可被复壮，并且因而将器官和/或组织恢复至正常(即，年轻)外表和功能。这基于人ZSCAN4在人胰腺中的一些组织干细胞中天然地(虽然很少)表达的观察。而且，基于Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)可以复壮终末分化细胞比如皮肤成纤维细胞的本文所述的结果，可以认为Zscan4表达在存在于人体的每个器官和/或组织中的组织干细胞中可被复壮，并且因而将器官和/或组织恢复至正常(即，年轻)外表和功能。
此实施例描述了在存在于人体的器官和组织中的组织干细胞、终末分化细胞和/或祖细胞中表达Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)以复壮并因而恢复身体正常(即，年轻)外表和功能的过程。具体而言，通过直接注射Zscan4生物制品至体内每个器官和组织或者通过注射Zscan4生物制品至对象的血液循环，将如本文所述的Zscan4生物制品施用至有需要的对象，从而将Zscan4生物制品递送至体内全部器官和组织。可选地或额外地，Zscan4生物制品可被注射入脑脊液，从而将Zscan4生物制品递送至体内全部神经器官和组织。可选地或额外地，Zscan4生物制品可被注射入淋巴系统，从而将Zscan4生物制品递送至体内全部淋巴器官和组织。可选地或额外地，Zscan4生物制品可被吸入肺组织，从而将Zscan4生物制品递送至肺组织。可选地或额外地，Zscan4生物制品可被摄取，从而将Zscan4生物制品递送至全部消化器官和组织，包括体内食管、胃和肠。可选地或额外地，Zscan4生物制品可被注射入门静脉，从而将Zscan4生物制品递送至体内肝脏。可选地或额外地，Zscan4生物制品可被局部地应用至皮肤和头皮，从而将Zscan4生物制品递送至皮肤和皮肤附件，比如体内毛囊和汗腺。这些过程将暴露对象的每个器官和/或组织中的组织干细胞、祖细胞和终末分化细胞至Zscan4生物制品并从而复壮存在于被治疗器官和/或组织中的组织干细胞、祖细胞和/或终末分化细胞。可以认为被治疗对象中的组织干细胞、祖细胞和/或终末分化细胞的复壮的总体效果是复壮对象和/或减慢对象的老化过程。还认为复壮被治疗对象中的组织干细胞、祖细胞和/或终末分化细胞将导致对象的寿命延长。
实施例15：Zscan4表达在从唐氏综合症患者分离的人成纤维细胞中修正21三体
此实施例描述了人ZSCAN4的表达——通过编码ZSCAN4的合成mRNA或者通过表达ZSCAN4的仙台病毒载体——可以修正从唐氏综合症患者分离的成纤维细胞的21三体核型的发现。此实施例还表明编码人ZSCAN4的合成mRNA和表达人ZSCAN4的仙台病毒载体可被用作治疗用生物制品。
材料和方法
细胞培养
从患有唐氏综合症(DS，21三体)的患者分离的成纤维细胞是从Coriell CellRepository(产品目录号AG06872)购买的。根据Coriell产品目录信息，供体是1岁女性白种人。供体具有唐氏综合症(21三体)的典型特征。皮肤活组织检查在5/19/83进行死前检查。使用切碎皮肤组织的外植体开始培养。核型是47、XX、+21。细胞形态是成纤维细胞样。群体累积倍增水平(PDL)在冷冻下是10.5且传代数是5。在从Coriell Cell Repository接收DS细胞后，细胞再培养几代。在Coriell Cell Repository推荐的条件下培养细胞：具有Earle盐和非必需氨基酸的Eagle极限必需培养基，补充10％胎牛血清(未灭活的)。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA，合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物以增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
仙台病毒载体
表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&BiologicalLaboratories Co,LTD)定制。载体在本文被称为“SeVhZSCAN4”。此仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。10的MOI(感染复数)被用于实验。
此外，表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)的热敏仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。此载体在本文被称为“SeVhZSCAN4-TS15”。此仙台载体在35℃下有功能，并且在37℃下失活(Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。此仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，JVirol.77:23238-3246,2003)。25的MOI(感染复数)被用于此实验。
核型分析
除通过G显带技术进行普通核型分析外，使用特异性杂交至21号染色体的着丝粒区的探针(CHR21-10-GR：Empire Genomics,New York,USA)通过荧光原位杂交(FISH)计数存在于每个培养细胞中的21号染色体的拷贝。在间期细胞核中，检测到3个荧光点指示21三体(唐氏综合症)，反之检测到2个荧光点指示正常拷贝数的21号染色体(正常)。
结果
编码人ZSCAN4的合成mRNA在从唐氏综合症患者(21三体)分离的成纤维细胞中修正染色体异常
第7代唐氏综合症(DS)成纤维细胞以5×105个细胞/孔的浓度铺板在10cm培养皿中，并且然后使用25μl的Lipofectamine(RNAiMAX：Life Technologies,California,USA)转染5μg的合成mRNA(hZSCAN4或GFP)。除转染GFP mRNA的细胞外，未转染的细胞也被用作对照。在一个实验(1×转染)中，第5天传代全部细胞并且在第10天分析核型(第9代)。在另一个实验(2×转染)中，在第5天传代细胞后，实施GFP mRNA或者hZSCAN4 mRNA的二次转染，并且然后在第10天分析核型(第9代)。
图16A显示了在实施具有21号染色体探针的FISH后细胞核的代表性图像。每个点指示存在于细胞核中的21号染色体的数目。两个点指示正常二体性的21号染色体，反之三个点指示三体性的21号染色体。图16B显示了1×转染实验中的21号染色体计数的概述：在转染人ZSCAN4 mRNA后10天，14％的细胞现在具有正常数目的21号染色体。图16C显示了2×转染实验中的21号染色体计数的概述：转染人ZSCAN4 mRNA两次使得17％的细胞携带正常数目的21号染色体。相比之下，未转染的细胞和转染GFP mRNA的细胞二者都显示仅小部分(<3％)细胞具有明显正常的21号染色体。这些在误差范围内。这些结果指示将人ZSCAN4mRNA引入细胞可修正染色体数目异常。
表达人ZSCAN4的仙台病毒载体在从唐氏综合症患者(21三体)分离的成纤维细胞中修正染色体异常
图17A显示了实验过程。第8代唐氏综合症成纤维(DS)细胞以5×104个细胞/孔的浓度铺板在6孔皿中(第0天)。一天后，在25的MOI下使用SeVhZSCAN4-TS15治疗细胞并在35℃下持续3天。然后，皿被转移至37℃并在37℃下持续剩下的实验。在第9天、第12天和第15天传代细胞。在第15天传代细胞后，在10的MOI下使用SeVhZSCAN4治疗细胞。随后，在第18天和第21天传代细胞。在第21天传代细胞后，在10的MOI下使用SeVhZSCAN4治疗细胞。在第24天通过FISH进行核型分析(图17B)。在第30天传代细胞后，在10的MOI下使用SeVhZSCAN4治疗细胞。在第39天传代细胞后，在10的MOI下使用SeVhZSCAN4治疗细胞。在第42天通过FISH进行核型分析(图17C)。平行培养而不接触仙台病毒载体的细胞(不治疗)或平行培养且与表达GFP变体的对照仙台载体接触的细胞被用作对照。由两个有经验的研究者独立地评分FISH图像：2个荧光点(2×21号染色体：正常)；3个荧光点(3×21号染色体：21三体——唐氏综合症)。
图17B显示了在对照细胞中和在使用SeVhZSCAN4-TS15一次和使用SeVhZSCAN4两次治疗(3×治疗)的细胞中的21号染色体计数的概述。结果表明使用表达人ZSCAN4的仙台病毒载体治疗唐氏综合症成纤维细胞诱导修正将近30％的细胞的21三体。
图17C显示了在未治疗的对照细胞中、在使用对照仙台载体治疗的对照细胞中、和在使用SeVhZSCAN4-TS15一次和使用SeVhZSCAN4四次治疗(5×治疗)的细胞中的21号染色体计数的概述。结果指示使用表达人ZSCAN4的仙台病毒载体重复治疗的唐氏综合症成纤维细胞诱导修正将近55％的细胞的21三体。
这些结果指示将人ZSCAN4导入细胞可修正异常染色体数目异常。实施例16：Zscan4表达在卵母细胞和植入前胚胎中复壮卵母细胞并修正染色体异常
在母体老化期间，胜任成功受精的卵母细胞显著地下降且流产和出生缺陷的风险增大。最近的研究已经揭示母体老化相关性流产和出生缺陷主要是由卵母细胞中的染色体分离错误引起的。在这一点上，没有通过防止或修正染色体分离错误成功地逆转老化的卵母细胞的能力的报道。
在鼠植入前胚胎的正常发育中，内源性Zscan4在2细胞期胚胎中瞬时和高度表达(Falco等人，Dev Biol.2007；307:539-50)。我们已经显示Zscan4表达对正常发育至关重要(Falco等人，Dev Biol.2007；307:539-50)。类似地，人ZSCAN4在人6至8细胞期胚胎中瞬时表达(Vassena等人，Development.2011；138:3699-709)。由于合子基因组激活发生在鼠中的2细胞期和人中的6至8细胞期，可以认为Zscan4表达对人植入前胚胎发育是必需的。
此实施例描述了Zscan4生物制品可以在鼠植入前胚胎中复壮卵母细胞和修正染色体异常的过程。基于此专利申请中显示的鼠Zscan4和人ZSCAN4基因之间的功能相似性和甚至人ZSCAN4基因的优越性，可以认为鼠胚胎结果可被直接应用至人胚胎。这些过程可以在体外受精(IVF)临床中实施。这些过程可以为全部年龄的女性减小唐氏综合症和其它核型问题的风险，根据妊娠风险指南，其可尤其有利于年龄超过35岁的那些。
材料和方法
卵母细胞采集
老年小鼠(即，超过45周龄的小鼠)和幼年小鼠(8周龄)是从Jackson Laboratory购买的。从老年和幼年小鼠采集胚泡状态的卵母细胞(GV卵母细胞)。来自幼年小鼠的卵母细胞被用作对照。
合成mRNA
对于修饰的mRNA的合成，如Warren等人先前报道的进行mRNA合成(Warren等人，Cell Stem Cell,2010 Nov 5；7(5):618-30)。使用来自Warren等人的这些方案，通过体外转录编码人ZSCAN4或绿色荧光蛋白(GFP)的模板DNA，合成mRNA，使用修饰的dNTP的混合物以增大RNA稳定性以及在哺乳动物细胞中的翻译效率。使用以下修饰的dNTP：3′-0-Me-m7G(5′)ppp(5′)G ARCA帽类似物、5-三磷酸甲基胞苷和三磷酸假尿苷。
仙台病毒载体
表达鼠Zscan4c(SeV18+mZscan4/ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4”或“SeVhZSCAN4”。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。这些仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的鼠Zscan4c(SeV18+mZERT2/ΔF)或者表达融合至三苯氧胺可控制的ERT2结构域的人ZSCAN4(SeV18+hZERT2/ΔF)的仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZERT2”或“SeVhZERT2”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
此外，表达鼠Zscan4(SeV18+mZscan4/TS15ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)的热敏仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4-TS15”或“SeVhZSCAN4-TS15”。这些仙台载体在35℃下有功能，并且在37℃下失活(Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。此载体在本文被称为“SeVAG-TS15”。这些仙台载体也缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
结果
胚泡状态的卵母细胞(GV卵母细胞)被采集并经历体外成熟(IVM)用于随后进展朝向减数分裂I和II。在IVM期间，卵母细胞与Zscan4生物制品(例如，或者是编码Zscan4的合成mRNA或者是表达Zscan4的仙台病毒载体)接触，并且随后使用精子体外受精。可选地，一细胞(受精卵)期和胚泡期之间的受精卵母细胞/植入前胚胎与Zscan4生物制品(例如，或者是编码Zscan4的合成mRNA或者是表达Zscan4的仙台病毒载体)接触。接触的方法可包括以病毒感染表达Zscan4的仙台病毒载体标准Lipofectamine转染合成mRNA Zscan4，并且通过显微操作器胞质内注射Zscan4生物制品。
Zscan4治疗和受精的卵母细胞然后在37℃、5％CO2下在KSOM培养基中培养96小时。
不希望受限于理论，可以认为Zscan4治疗将导致来自老年小鼠的卵母细胞在可以成功发育至胚泡期的受精卵的数目方面比得上来自幼年小鼠的卵母细胞。生成的囊胚被转移至受体雌性鼠以检查健康幼崽的出生率。可以认为使用Zscan4生物制品的治疗通过改进胚胎的核型和质量，提高来自老年卵母细胞的适当胚胎发育的成功率。
不希望受限于理论，还可以认为上面的方法可被应用至人卵母细胞和受精卵母细胞/植入前胚胎以提高来自老年卵母细胞的适当胚胎发育的成功率，并且改进胚胎的核型和质量(图18)。
实施例17：Zscan4表达抑制人癌细胞的生长
此实施例描述了表达鼠Zscan4或者表达人ZSCAN4的热敏仙台病毒载体可以抑制癌细胞的增殖的发现。此实施例还表明了表达Zscan4的仙台病毒载体可被用作治疗用生物制品。
材料和方法
细胞培养
HCT116人结肠直肠癌细胞是从American Type Culture Collection(ATCC)购买的。HCT116细胞来源于人成年男性的结肠直肠癌。根据ATCC，“干系染色体数目接近具有45(62％)的众数的二倍体和以6.8％出现的多倍体。此系在ras原癌基因的13位密码子中具有突变”。根据ATCC的推荐培养HCT116细胞。
仙台病毒载体
表达鼠Zscan4(SeV18+mZscan4/TS15ΔF)或者表达人ZSCAN4(SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)的热敏仙台载体由MBL(Medical&Biological Laboratories Co,LTD)定制。这些载体在本文分别被称为“SeVmZscan4-TS15”或“SeVhZSCAN4-TS15”。这些仙台载体在35℃下有功能，并且在37℃下失活(Ban等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(34):14234-14239)。作为对照，使用相同的仙台载体，但是载体表达绿色荧光蛋白变体，而不是Zscan4。此载体在本文被称为“SeVAG-TS15”。这些仙台载体缺乏F蛋白，并且因而是不可传染的(Inoue等人，J Virol.77:23238-3246,2003)。
结果
以8×104个细胞/孔的浓度培养HCT116细胞(第9代)样品。使用以下仙台载体之一治疗细胞样品：20MOI下的SeVAG-TS15(对照)、SeVmZscan4-TS15或SeVhZSCAN4-TS15，并且在35℃下温育(第0天)。一式三份制备三个治疗样品中的每个。第3天，每个治疗样品被传代并使用相同的仙台载体治疗。使用自动细胞计数器Moxi Z(ORFLO Technologies,Idaho,USA)对细胞数进行计数。第7天，每个治疗样品被传代并使用相同的仙台载体治疗。细胞数进行计数(第7天)。第10天，每个治疗样品被传代并使用相同的仙台载体治疗。细胞数进行计数(第10天)。第14天，每个治疗样品被传代并使用相同的仙台载体治疗。细胞数进行计数(第14天)。贯穿实验在35℃下培养细胞。细胞数被转换为PDL，在第0天起始于0的PDL。
图19显示了HTC116细胞样品的生长曲线。与对照组(即，为治疗组和SeVAG-TS15治疗组)相比，使用SeVmZscan4-TS15或者使用SeVhZSCAN4-TS15的治疗抑制HTC116细胞的增殖。如图19中所示，人ZSCAN4在抑制癌细胞生长中惊人地好于鼠Zscan4。因而，这些结果表明人ZSCAN4产生惊人地优于鼠Zscan4c的结果。这些结果进一步指示hZSCAN4治疗可抑制癌细胞的生长。不希望受限于理论，可以认为Zscan4表达试剂可被用于癌症治疗。
实施例18：用于增大人细胞或个体的DNA修复能力的Zscan4表达
此实施例描述了Zscan4生物制品可以增大人细胞的DNA修复能力的发现。已知遗传毒性剂，比如丝裂霉素C或顺铂，以剂量依赖性方式杀死人细胞。暴露于遗传毒性剂，并且然后使用Zscan4生物制品(例如，表达Zscan4——通过编码Zscan4的合成mRNA或者通过表达Zscan4的仙台病毒载体)治疗的细胞变得抵御遗传毒性剂。已经发现Zscan4生物制品抵御遗传毒性剂是由于在细胞中由Zscan4表达诱导的DNA修复的提高的能力。因而，Zscan4生物制品可用于：(1)提高患有DNA修复缺陷关联性疾病的患者的DNA修复能力；(2)保护特定的组织和/或器官比如生殖腺免受由遗传毒性剂造成的损害，比如癌症疗法；和(3)保护组织、器官和/或个体免于危险环境，比如存在有毒化学物质或核微粒。
实施例19：在某些癌干细胞中抑制Zscan4以治疗癌症
已知癌组织(例如，肿瘤)包含癌干细胞，其不积极增殖并抵御癌症化学疗法(例如，使用遗传毒性剂比如顺铂治疗)。可以认为癌干细胞可以存活于使用化学疗法的治疗，并且因而导致治疗后癌症的复发。由于Zscan4的存在可以提供细胞对遗传毒性剂的抗性，可以认为内源性Zscan4表达发生在某些癌干细胞中，因而向细胞提供免于遗传毒性剂的保护。正因如此，可以认为减小内源性Zscan4的表达的试剂，比如特异于Zscan4的iRNA或shRNA，可用于在患有癌症的患者中治疗癌干细胞以减小或消除癌干细胞对遗传毒性剂的抗性，并且因而提高患者对癌症治疗的应答。
序列表
<110> 伊利克斯根公司
M·S·H·科
<120> 使用Zscan4复壮人细胞的方法
<130> 699442000840
<140> 还没有分配
<141> 与此同时
<150> US 61/800,668
<151> 2013-03-15
<160> 44
<170> FastSEQ的Windows版本4.0
<210> 1
<211> 2275
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 1
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gtggaggaat aggtaaactt cccttcctag tggtcttgaa tgtcttttac agtacatcca 120
tcaactgtta gcattttcgt aaagtcacaa aacagatatt aaactactat agttgaatct 180
ttcacaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240
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<210> 2
<211> 1774
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 2
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<210> 3
<211> 2275
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 3
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atcatgaggc aaacttacca tgtgaaagtc atcaaaagag attctgtaga gatgccaaac 1380
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gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600
aagctctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660
aatctgcaac aaggccaaca ccagataatg agcagatgcc agtagacacc acacaagata 720
gattattggc cacaggacaa gaaaacagtg aaaatgaatg caacaactct tgtaatgcta 780
ctgaagcaaa tgttggtgaa agctgtagtg gaaatgaaat ggactccctt cttattatcc 840
agaaagaaca gcaccctgag catgaagagg ggaatgttgt ttttcaattc cctcttgatg 900
ccagaagagc aagtcaaggc aactccagtc atcatgtaga cttccggagt gctccgactc 960
ctgcggatgt ccccatggag gaacaaccaa aggatttatc cagagaaaac atctctgagg 1020
acaagaacaa ttgctataac acttccagga atgcagctac tcaagtatat agaagtgata 1080
atattcccag gaaaaagaca gactcccttt ccattaacaa gagaatatat cattctgagc 1140
ctgaggaggg agatattcct tatggagttc ctcaggattc tacaagagca agtcaaggaa 1200
catctacatg cttgcaagag tcacttgggg aatgtttttc tgaaaaagac cctagggagc 1260
taccagggtt ggagtctagg caagaggagc ctatctctga tcctgtcttt cttggtaagg 1320
atcatgaggc aaacttacca tgtgaaagtc atcaaaagag attccgtaga gatgccaaac 1380
tattcaagtg tgaagaatgt tctaggatgt tcaaacatgc caggagcctt tcgtcccacc 1440
agagaactca cctgaataag aagagtgaat tgctttgtgt cacctgtcag aaaatgttca 1500
aacgagtctc tgaccgccga acccatgaga tcatacacat gccagaaaag cctttcaagt 1560
gcagcacatg tgaaaagtcc ttcagccaca agaccaacct gaagtctcat gagatgattc 1620
acacaggaga aatgccttat gtctgttccc tatgtagccg tcgctttcgc caatcatcca 1680
cttaccatcg tcacctgagg aattaccaca gatctgactg aagtatctaa catcctcagc 1740
agagactggt agggcttcag cctcagtatg tcatcttcaa agagagaaga atgttgcaag 1800
taaattgtac tgtcccaata atgatataac atgcttgtgg attgccactt ttatgttttg 1860
ttttttattg tgtgtgtgtg tgtatgtaat tttttgtctg taatttccat agttccacag 1920
cataagttat tagaatactt tgctgttaat tcttgagttg cttcttgctt ttagacagtg 1980
tctttctggt tggcagcttt atacacctgt ctttctggca ctagagtttc caaacatttt 2040
ctgatctcca cttttattct ctacagtggt cctgacagag gcctgccatt ccctctgaca 2100
ttttttaaca tgttggggtt tcatcccaag tcttagggtt gcaagttaaa tgcattgcct 2160
cttcagacat ctcatgtcat gtctactgct tacagttcaa gaatatttct ctacattact 2220
agaatgacgt tcaaagtgga ataataaata aaaaaataat caacaatt 2268
<210> 5
<211> 1774
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 5
cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca ccattgaagt tcactggaga aagaggtgag 60
gtggagaagt aggtaaactt ccctttcttg tggtcttgaa tgtcttttac agtacatccg 120
tcaactgtta gcattttcct aaagtcacaa aacagatact aaactgctat agttgaatct 180
ttcagaccat tgtcaccaca atggcttcac agcaggcacc agcaaaagac cttcagacca 240
acaatttaga gtttactcca actgatagtt ctggtgtgca gtgggcagaa gacatctcta 300
actcaccaag tgctcagcta aacttttccc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360
agctgcaaag tctctggaag atgttcaact cctggttgca gccagaaaag cagactaagg 420
agcagatgat ttctcaactg gtcttggagc agtttctcct cactgggcac tgcaaggaca 480
agtatgcttt gacagagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540
gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600
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aatctgcaac aaggccaata ccagataatg agcagatgcc agtagacacc acacaagata 720
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actggtaggg cttcagcctc agtatgtcat cttc 1774
<210> 6
<211> 2273
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 6
cacagtgcct ccctgggctt cttggcatca cccttgaagt tcactggaga aagaggtgag 60
gtggaggaat aggtaaactt tccttcctag tggtcttgaa tgtcttttac agtacatcca 120
tcaactgtta gcattttcgt aaagtcacaa aacagatatt aaactactat agttgaatct 180
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acaatttaga gtttactcca actgatagtt ctggtgtgca gtgggcagaa gacatctcta 300
actcaccaag tgctcagcta aacttttccc caagtaacaa tggctgctgg gcaactcagg 360
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agcagatgat ttctcaactg gtcttggagc agtttctcct cactgggcac tgcaaggaca 480
agtatgcttt gactgagaag tggaaagcca gtggtagcga tatgaggaga ttcatggaga 540
gtctgactga tgagtgcttg aagcctcctg tcatggtcca tgtttcaatg caaggacaag 600
aagccctctt ttctgaaaac atgccattaa aagaagtcat caagcttttg aaacaacagc 660
aatctgcaac aaggccaaca ccagataatg agcagatgcc agtagacacc acacaagata 720
gattattggc cacaggacaa gaaaacagtg aaaatgaatg caacaactct tgtaatgcta 780
ctgaagcaaa tgttggtgaa agctgtagtg gaaatgaaat ggactccctt cttattatgc 840
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ccagaagagc aagtcaaggc acccccagtc atcatgtaga cttcccgagt gctccgacta 960
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catctacatg cctgcaagag tcacttgggg aatgtttttc tgaaaaagac cctagggagg 1260
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taaattgtac tgtcccaata atgatataac atgcttgtgg attgccactt ttatgttttg 1860
ttttgttttt tattttgtgt gtgtgtgtat gtaatttttt gtctgtattt ccatagttcc 1920
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ttttctgatc tccactttta ttctctacag tgttcttgac agaagcctgg cattccctct 2100
gacatttttc tacatgttgg ggttttcatc ccaagtctta gggttgcaag ttaaatgcat 2160
tgcctcttca gacatctcat gccctgtcta ctgcttacag ttcaagaata tttctctaca 2220
ttactagaac gacattcaaa gtggaataat aaataaataa ataatcaaca att 2273
<210> 7
<211> 2260
<212> DNA
<213> 人类
<400> 7
ccttgtaatt cataaatctc tgaaaactta aaagtttgag caaaagtttg tcatgtttct 60
atgagtaatt tataataaaa cttgatcaga atttgtgaga ctaacgtttg tctttatatt 120
ttcctttttt tttttttttt ttttgagaca cagtctcgct ctgtcgtcca ggctggagtg 180
ccgtggcgta atctcggctc actgcaacct ctgcctcctg gattcaaaca attcttctgc 240
ctcagcctcc tgagtagctg ggattacagg accagtgatg gtatagaaca ctgtattaga 300
gacatggagc tggggctgga tgaagattcc atcagtaatt caatcaacag acaagtgtta 360
tccaatcacg tctttaaatc aatcactgac atggagctgg ggctggatga agattccatc 420
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agtcacacat cagctcagtg ttcggcccgg gattacccag tcaaccaagg agcttgcagt 600
tttaaagaat ccaccaactg ttgaaacaaa tccctagaga cacaaggcaa gagactgaat 660
catcaaagta aagtctctct gagaattatt gctaagaatg gctttagatc taagaaccat 720
atttcagtgt gaaccatccg agaataatct tggatcagaa aattcagcgt ttcaacaaag 780
ccaaggacct gctgttcaga gagaagaagg gatttctgag ttctcaagaa tggtgctcaa 840
ttcatttcaa gacagcaata attcatatgc aaggcaggaa ttgcaaagac tttataggat 900
ctttcactca tggctgcaac cagaaaagca cagcaaggat gaaattattt ctctattagt 960
cctggagcag tttatgattg gtggccactg caatgacaaa gccagtgtga aagagaaatg 1020
gaaatcaagt ggcaaaaact tggagagatt catagaagac ctgactgatg acagcataaa 1080
tccacctgcc ttagtccacg tccacatgca gggacaggaa gctctctttt ctgaggatat 1140
gcccttaaga gatgtcattg ttcatctcac aaaacaagtg aatgcccaaa ccacaagaga 1200
agcaaacatg gggacaccct cccagacttc ccaagatact tccttagaaa caggacaagg 1260
atatgaagat gaacaagatg gctggaacag ttcttcgaaa actactcgag taaatgaaaa 1320
tattactaat caaggcaatc aaatagtttc cctaatcatc atccaggaag agaacggtcc 1380
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agtcactgct agatctcagg aagggtccat aaatggaatc actttccaag gtgtccctat 1500
ggtgatggga gcagggtgta tctctcaacc agagcagtcc tcccctgagt ctgcccttac 1560
ccaccagagc aatgagggaa attccacatg tgaggtacat cagaaaggat cccatggagt 1620
ccaaaaatca tacaaatgtg aagaatgccc caaggtcttt aagtatctct gtcacttatt 1680
agctcaccag agaagacaca ggaatgagag gccatttgtt tgtcccgagt gtcaaaaagg 1740
cttcttccag atatcagacc tacgggtgca tcagataatt cacacaggaa agaagccttt 1800
cacatgcagc atgtgtaaaa agtccttcag ccacaaaacc aacctgcggt ctcatgagag 1860
aatccacaca ggagaaaagc cttatacatg tcccttttgt aagacaagct accgccagtc 1920
atccacatac caccgccata tgaggactca tgagaaaatt accctgccaa gtgttccctc 1980
cacaccagaa gcttcctaag ctgctggtct gataatgtgt ataaatatgt atgcaagtat 2040
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caatttattg tcttgcttca ttaaaatgta aggctaagga gagcatggaa tttgtcagtt 2160
ttgttcacta aagtattcca agtggttggg aaagtggaac atttccaaga accaataaat 2220
ttctgttgaa taaatgaatg aatccaaaaa aaaaaaaaaa 2260
<210> 8
<211> 1302
<212> DNA
<213> 狗
<400> 8
atggcttcag atatcagaat atcatttcag ggagaaccat ctatgaatga tcctgggtca 60
gaaaacctag agcataaact tagccaagga ccagccattc aggaggaaga cgagatctat 120
gagttcccaa gcactcagct cactttattg caaaacagta actcaagtgc aaggcaggaa 180
ctgcaaaatc tctataagtt atttcactca tggctgcaac cagagaaaca cagcaaggat 240
gagattattt ctcatctggt cttggaacag tttatgatca atggccactg cagtgacagg 300
tccatgttga aaaagaaatg gaatgcaagt ggcaggaacc tggagaaatt catggaagat 360
ctgactgatg atggcatgaa gctacctgga ttagtccacg tccacatgaa gggccaggac 420
gccctctttt ctgagaatat gcccttaaga gaagtcatcg ttcatttcat gaaacaattg 480
tcagcaggaa ccccaacaga agagaacatg gggacaccct cctggacttc ccaagatact 540
tccctggaaa caggacaagg tgagtgggat aaagcaaatg gctacaacat ttatcacaat 600
gacggtacta ctagtcaagg caatgcagta ccttccctgt tcattgtcca tgaggaggac 660
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ggtctaggta cgtccaattc ccaggaaggg tgcctgcaag gacgcccata tcaagatgtc 780
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tctacccacc aaaaaaccga ggggaattcc acatgtgggg gacaccaaga aagattccgt 900
gacgcccaaa actcctacag atgtgaaaaa tgtcccagga tctttaggta tttctctcag 960
ctaaaagccc atcagagaag acacaacaat gagaggacat tcatttgtgc tgagtgtaac 1020
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cctttcaggt gcagcacatg tgaaaaatcc ttcagccaca aaaccaacct tctggcccat 1140
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ccttccacat cagaagcttc ctcagctgta gcctcagtgt aa 1302
<210> 9
<211> 1251
<212> DNA
<213> 牛
<400> 9
atggatttag gtttcagagc atcatttcag catgaaccat ccaatgagga cccaaagtca 60
gcaaatacag gctttatccc cagtcgagga cccactctgc aaacagcaga ggatatctct 120
cagttgcaaa acactcagcc cggcttattg caaaatggta ataactcacg tgcaaggcag 180
gaactgcaaa gactctataa gtcatttcac ttatggctgc agccagaaaa acacagcaag 240
catgaaatta tttttcaact tgccctggaa caatttatga tcaataagca ctgcagtgaa 300
aagtctactt tgaaagagaa atggaaagca agtggtggag acctggagaa attcacagaa 360
gacctgcatg atgactgcat aaagctacct gatttggtcc atgtccactt gcaggggcag 420
gaagccctct tttcagaaaa tatgtcctta aaagaaatca tctttcatct aaccaatcag 480
ttgtcaacag gaggggtgaa catgggaact ccgtcctgga ccatgcaaga tacatccctg 540
gaaacaggac aaagaaatga aggtaaagaa aatgatggca acatttctgt gaaaagtgac 600
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ctgaggctgg aagaaggagg tgtttctctg gagaatccac ggaactccag aagaggagca 720
ggcccaggcc cctccaggcc tcaggatgga tccctgaaag gaccctcctc tcaagatgtc 780
ctcatggaag tggaacgaga ccaggtcacc cctgggcctg tttctaccct ccagagctct 840
gaggggactt ctgcacgtgg gaaacaccag gaaagatccc tcagagcccc agaagtatac 900
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tgtgaaatgg ccttcaccca caaaaccaac cttcgggctc acgagagaac ccacacggga 1140
gagaagccct atgagtgttc cctctgccag agacgcttcc gccagtcctc cacctaccac 1200
cgccatctta ggtttcacca gaaaactacc ctcaaaagtg ctccacacta a 1251
<210> 10
<211> 1713
<212> DNA
<213> 马
<400> 10
atggctttag atctcagaat ctcatttcaa ggtgaaccat ccaggaatga tcctgggtca 60
gaaaatcatg agtttaatcc ccgtcaagta cctgctgtcc aggatgggga gaggatctcc 120
aagttcccga gcactcaaca cagcttattt caaaatggca agaattcatg tgcaaggcag 180
gaactgcaaa gactctataa gttatttcac tcctggctac agccagaaaa acacagcaag 240
gatgaaatga tttctcgttt ggtcctggag caatttatga tcaatggcta ctgcagtgac 300
aggtccatgt tgaaagagaa atgggaatca agtggcagaa acctggagaa attcatggaa 360
gatctgactg atgatggcat gaagccacct ggcttagtcc acgtctgcat gcaggggcag 420
gaagctctct tttctgagaa tatgccctta agagaagtca tagttcacct caggaaacag 480
ttctcaacag gaacccaaac tggagagaac atggggaccc ctttccagac tcccaaagat 540
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tttaggtatc tgtctcggtt aaaagcccat caaagaagac acaataatga gaggacattt 1020
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attcacacag gagagaaacc tttcaagtgc agcacatgtg aaatgtcctt cagccacaaa 1140
accaaccttc gggctcatga gagaatccac acaggggaga agccctatgt gtgttccctt 1200
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attgccttca aaagtgttcc ctctaggggg ctgtggcagc ataccagttc atggatcccc 1320
acacagcaga ttcccacaac tgtaagagga ggtgaggaca gcatgaccgg aaaacacttt 1380
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tacactgagt ggcggtggct cccctccacc ctagcacagt gcaggcaaga aggtgccctg 1500
cccgctcaga aggtgcccct gtctgcagag cacagtagcc agaaggatcc acagagtggt 1560
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cggctcagcc tctacatagc ctgcagcagc taa 1713
<210> 11
<211> 360
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu
1 5 10 15
Glu Phe Thr Pro Thr Asp Ser Ser Gly Val Gln Trp Ala Glu Asp Ile
20 25 30
Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly
35 40 45
Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser
50 55 60
Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu
65 70 75 80
Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Thr Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala
85 90 95
Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met
100 105 110
Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val
115 120 125
Ser Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys
130 135 140
Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Thr
145 150 155 160
Pro Asp Asn Ala Gln Met Pro Val Asp Thr Thr Gln Asp Arg Leu Leu
165 170 175
Ala Thr Gly Gln Glu Asn Ser Glu Asn Glu Cys Asn Thr Ser Cys Asn
180 185 190
Ala Thr Glu Gly Asn Val Gly Glu Ser Cys Ser Gly Asn Glu Met Asp
195 200 205
Ser Ser Leu Ile Ile Gln Lys Glu Gln Tyr Pro Glu His Glu Glu Gly
210 215 220
Asn Val Val Cys Gln Phe Pro Leu Asp Ala Arg Arg Ala Ser Gln Gly
225 230 235 240
Thr Ser Ser His His Val Asp Phe Leu Ser Ala Leu Thr Thr Ala Asp
245 250 255
Val Pro Met Glu Glu Gln Pro Lys Asp Leu Ser Arg Glu Asn Ile Ser
260 265 270
Glu Asp Lys Asn Asn Cys Tyr Asn Thr Ser Arg Asn Ala Ala Thr Lys
275 280 285
Val Tyr Ser Gly Asp Asn Ile Pro Arg Lys Lys Thr Asp Ser Leu Ser
290 295 300
Ile Asn Lys Arg Ile Tyr His Pro Glu Pro Glu Val Gly Asp Ile Pro
305 310 315 320
Tyr Gly Val Pro Gln Asp Ser Thr Arg Ala Ser Gln Gly Thr Ser Thr
325 330 335
Cys Leu Gln Glu Ser Leu Gly Gly Cys Phe Ser Glu Lys Asp Pro Arg
340 345 350
Glu Val Pro Gly Leu Gln Ser Arg
355 360
<210> 12
<211> 195
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 12
Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu
1 5 10 15
Glu Phe Thr Pro Thr Asp Ser Ser Gly Val Gln Trp Ala Glu Asp Ile
20 25 30
Ser Asn Ser Pro Ser Ala Gln Leu Asn Phe Ser Pro Ser Asn Asn Gly
35 40 45
Cys Trp Ala Thr Gln Glu Leu Gln Ser Leu Trp Lys Met Phe Asn Ser
50 55 60
Trp Leu Gln Pro Glu Lys Gln Thr Lys Glu Gln Met Ile Ser Gln Leu
65 70 75 80
Val Leu Glu Gln Phe Leu Leu Thr Gly His Cys Lys Asp Lys Tyr Ala
85 90 95
Leu Thr Glu Lys Trp Lys Ala Ser Gly Ser Asp Met Arg Arg Phe Met
100 105 110
Glu Ser Leu Thr Asp Glu Cys Leu Lys Pro Pro Val Met Val His Val
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Glu Val Ile Lys Leu Leu Lys Gln Gln Gln Ser Ala Thr Arg Pro Ile
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165 170 175
Ala Thr Gly Lys Lys Thr Val Lys Met Asn Ala Thr Pro Leu Ala Met
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Leu Leu Lys
195
<210> 13
<211> 506
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Met Ala Ser Gln Gln Ala Pro Ala Lys Asp Leu Gln Thr Asn Asn Leu
1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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500 505
<210> 14
<211> 506
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 14
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
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<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 16
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<210> 17
<211> 433
<212> PRT
<213> 人类
<400> 17
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<211> 433
<212> PRT
<213> 狗
<400> 18
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Val
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<212> PRT
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<211> 570
<212> PRT
<213> 马
<400> 20
Met Ala Leu Asp Leu Arg Ile Ser Phe Gln Gly Glu Pro Ser Arg Asn
1 5 10 15
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Met Thr Ser Gln Gly Asn Gln Thr Pro Ser Leu Leu Ile Ile Gln Gly
210 215 220
Glu Asn Arg Pro Gly Pro Gly Glu Gly Gly Val Pro Leu Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Ser Ser Arg Arg Ala Gly Leu Gly Ser Cys Arg Ser Gln Glu Glu
245 250 255
Ser Leu Lys Gly Pro Pro Tyr Gln Asp Val Leu Ile Glu Val Arg Pro
260 265 270
Gly Phe Leu Ser Arg Pro Asn Gln Val Thr Pro Glu Arg Val Pro Thr
275 280 285
His Gln Ser Ile Glu Gly Asn Ser Ala Cys Gly Gly His Gln Glu Arg
290 295 300
Ser Gln Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Lys Cys Pro Arg Ile
305 310 315 320
Phe Arg Tyr Leu Ser Arg Leu Lys Ala His Gln Arg Arg His Asn Asn
325 330 335
Glu Arg Thr Phe Ile Cys Gly Gln Cys Asp Lys Gly Phe Phe Gln Ala
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Met His Gln Lys Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe
355 360 365
Lys Cys Ser Thr Cys Glu Met Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ala His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Val Cys Ser Leu
385 390 395 400
Cys Gln Arg Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Leu Arg
405 410 415
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420 425 430
Gln His Thr Ser Ser Trp Ile Pro Thr Gln Gln Ile Pro Thr Thr Val
435 440 445
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450 455 460
His Gly Arg Ala Gln His Ala Ile Val Ala Leu Pro Val Glu Met Leu
465 470 475 480
Tyr Thr Glu Trp Arg Trp Leu Pro Ser Thr Leu Ala Gln Cys Arg Gln
485 490 495
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565 570
<210> 21
<211> 528
<212> DNA
<213> 大猩猩
<220>
<221> 未归类特征
<222> 18, 19, 80, 211, 212, 519, 520, 521, 522
<223> n = A,T,C或G
<400> 21
aatggaatca ctttccanng tgtccctatg gtgatgggag cagggtgtat ctctcaacca 60
gagcagtcct cccctgagtn tgcccttacc caccagagca atgagggaaa ctccacatgt 120
gaggtacatc agaaaggatc ccatggagtc cgaaaatcat acaaatgtga agaatgcccc 180
aaggtcttta agtatcactg tcacttatta nntcaccaga gaagacacag gaatgagagg 240
ccatttgttt gtcccgagtg tcaaaaaggc ttcttccaga tatcagacct acgggtgcat 300
cagataattc acacaggaaa gaagcctttc acatgcagca tgtgtaaaaa gtccttcagc 360
cacaaaacca acctgcggtc tcatgagaga atccacacag gagaaaagcc ttatacatgt 420
cccttttgta agacaagcta ccgccagtca tccacatacc accgccatat gaggactcat 480
gagaaaatta ccctgccaag tgttccctcc acaccagann nntcctaa 528
<210> 22
<211> 1302
<212> DNA
<213> 倭黑猩猩
<400> 22
atggctttag atctaagaac catatttcag tgtgaaccat ccgagaataa tcttggatca 60
gaaaattcag cgtttcaaca aagccaagga cctgctgttc agagagaaga agggatttct 120
gagttctcaa gaatggtgct caattcattt caagacagca ataattcata tgcaaggcag 180
gaattgcaaa gactttatag gatctttcac tcatggctgc aaccagaaaa gcacagcaag 240
gatgaaatta tttctctatt agtcctggag cagtttatga ttggtggcca ctgcaatgac 300
aaagccggtg tgaaagagaa atggaaatca agtggcaaaa acttggagag attcatagaa 360
gacctgactg atgacagcat aaatccacct gccttagtcc acgtccacat gcagggacag 420
gaagctctct tttctgagga tatgccctta agagatgtca ttgttcatct cacaaaacaa 480
gtgaatgccc aaaccacaag agaagcaaac atggggacac cctcccagac ttcccaagat 540
acttccttag aaacaggaca aggatatgaa gatgaacaag atggctggaa cagttctttg 600
aaaactactc aagtaaatga aaatattact aatcaaggcg atcaaatagt ttccctaatc 660
atcatccagg aagagaacag tcctaggcct gaagagggag gtgtttcttc tgacaaccca 720
tacaactcaa aaagagcaga gctagtcact gctagatctc aggaagggtc cataaatgga 780
atcactttcc aaggtgtccc tatggtgatg ggagcagggt gtatctctca accagagcag 840
tcctcccctg agtctgccct tacccaccag agcaatgagg gaaactccac atgtgaggta 900
catcagaaag gatcccatgg agtccgaaaa tcatacaaat gtgaagaatg ccccaaggtc 960
tttaagtatc tctgtcactt attagctcac cagagaagac acaggaatga gaggccattt 1020
gtttgtcccg agtgtcaaaa aggcttcttc cagatatcag acctacgggt gcatcagata 1080
attcacacag gaaagaagcc tttcacatgc agcatatgta aaaagtcctt cagccacaaa 1140
accaacctgc ggtctcatga gagaatccac acaggagaaa agccttatac atgtcccttt 1200
tgtaagacaa gctaccgcca gtcatccaca taccaccgcc atatgaggac tcatgagaaa 1260
attaccgtgc caagtgttcc ctccacacca gaagcttcct aa 1302
<210> 23
<211> 1302
<212> DNA
<213> 婆罗洲猩猩
<400> 23
atggctttag atctaagaac catatttcag tgtgaaccat ccgagaataa tcttggatca 60
gaaaattcag agtttcgaca aagccaagga cctgctgttc agagagaaga agggatttct 120
gagttctcaa gaatggtgct caattcattt caagacagca ataattcata tgcaaggcag 180
gaattgcaga gactttatag gatctttcac tcatggctgc aaccagaaaa gcacagcaag 240
gatgaaatta tttctctatt agtcctggag cagtttatga ttggtggcca ctgcaatgac 300
aaagccagtg tgaaagagaa atggaaatca agtggcaaaa acttggagag attcatggaa 360
gacctgactg atgacagcat aaatccacct gccttagtcc atgtccacat gcagggacag 420
gaagctctct tttctgagga tatgccctta aaagatgtca ttgttcatct cacaaaacaa 480
gtgtctgccc aaaccccaag agaagcaaat atggggacac cctcccagac ttcccaagat 540
acttccttag aaacaggaga aggatgtgaa gatgaacaag atggctgcaa cagttctttg 600
aaaactactc aagtaaatga aaatattact aatcaaggca atcaaatagt ttccctaatc 660
atcatccagg aagagaacgg tcctaggtct gaagagggag gtgtttcttc tgacaatcca 720
aacaactcaa aaagagcaga gctagtcact gctagatctc aggaagggtc cataaacgga 780
atcacttttc aaggtgtccc tatggagatg ggagcagggt gtatctctca gccagagcag 840
tcctcccctg agtctgccct tacccaccag agcaatgagg gaaactccac atgtgaggta 900
catcagaaag gatcccatgg agtccgaaaa tcctacaaat gtgaagaatg ccctaaggtc 960
tttaagtatc tctgtcactt attagctcac cagagaagac acaggaatga gaggccattt 1020
gtttgtcccg agtgtcaaaa aggcttcttc cagatatcag acctacgcgt gcatcagata 1080
attcacacag gaaagaagcc tttcacatgc agcatgtgtg aaaagtcctt cagccacaaa 1140
accaacctgc ggtctcatga gagaatccac acaggagaaa agccttatac atgtcccttt 1200
tgtaagacaa gctaccgcca gtcatccaca taccaccgcc atatgaggac tcatgagaaa 1260
attaccccgc caagtgttcc ctccacacca gaagcttcct aa 1302
<210> 24
<211> 1640
<212> DNA
<213> 苏门答腊猩猩
<400> 24
tccaccaact gttgaaacaa atccctagag acacaaggca agagactgaa tcatcaaagt 60
aaagtctctc tgagaattat tgctaagaat ggctttagat ctaagaacca tatttcagtg 120
tgaaccatcc gagaataatc ttggatcaga aaattcagag tttcgacaaa gccaaggacc 180
tgctgttcag agagaagaag ggatttctga gttctcaaga atggtgctca attcatttca 240
agacagcaat aattcatatg caaggcagga attgcagaga ctttatagga tctttcactc 300
atggctgcaa ccagaaaagc acagcaagga tgaaattatt tctctattag tcctggagca 360
gtttatgatt ggtggccact gcaatgacaa agccagtgtg aaagagaaat ggaaatcaag 420
tggcaaaaac ttggagagat tcatggaaga cctgactgat gacagcataa atccacctgc 480
cttagtccat gtccacatgc agggacagga agctctcttt tctgaggata tgcccttaaa 540
agatgtcatt gttcatctca caaaacaagt gtctgcccaa accccaagag aagcaaatat 600
ggggacaccc tcccagactt cccaagatac ttccttagaa acaggagaag gatgtgaaga 660
tgaacaagat ggctgcaaca gttctttgaa aactactcaa gtaaatgaaa atattactaa 720
tcaaggcaat caaatagttt ccctaatcat catccaggaa gagaacggtc ctaggtctga 780
agagggaggt gtttcttctg acaatccaaa caactcaaaa agagcagagc tagtcactgc 840
tagatctcag gaagggtcca taaacggaat cacttttcaa ggtgtcccta tggagatggg 900
agcagggtgt atctctcagc cagagcagtc ctcccctgag tctgccctta cccaccagag 960
caatgaggga aactccacat gtgaggtaca tcagaaagga tcccatggag tccgaaaatc 1020
ctacaaatgt gaagaatgcc ctaaggtctt taagtatctc tgtcacttat tagctcacca 1080
gagaagacac aggaatgaga ggccatttgt ttgtcccgag tgtcaaaaag gcttcttcca 1140
gatatcagac ctacgcgtgc atcagataat tcacacagga aagaagcctt tcacatgcag 1200
catgtgtgaa aagtccttca gccacaaaac caacctgcgg tctcatgaga gaatccacac 1260
aggagaaaag ccttatacat gtcccttttg taagacaagc taccgccagt catccacata 1320
ccaccgccat atgaggactc atgagaaaat taccccgcca agtgttccct ccacaccaga 1380
agcttcctaa gctgctggtc tgataatgtg tataaatatg tatgcaagta tgtatattcc 1440
catagtattt atcgacttag gatataagat ataatttcct gattatgctt tcaatttatt 1500
gtcttgcttc attaaaatgt aaggctaagg agagcatgga atttgtcagt tttgttcact 1560
aaagtattcc aagtggttgg gaaagtggaa catttccaag aaccaataaa tttctgttga 1620
ataaatgaat gaatccaaaa 1640
<210> 25
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 35的逆向翻译
<400> 25
ctgaaaattg atagctttct gtgcgaactg agcatggatg atccgggcag caaaaacaaa 60
gattttaaac cgagccaggg cccggcgctg cagaaagcgg aagaaattag cgaatttcag 120
gatagccagc atagcctgtt tcaggatggc aacaacagcc atgcgaaaca ggaactgcag 180
cgcctgtata aaagctttta tagctggctg cagccggaaa aacatagcaa agatgaaatt 240
atttttcagg tggtgctgga acagtttatg attaaccgcc attgcagcgg ccgcagcacc 300
ctgaaaaaaa aatgggaaag cagcggccgc aacctggaaa aatttatgga aagcctgagc 360
gaaagcagcc tgaaaccgcc ggatctggtg catgtgcata tgcagggcca ggaagcgctg 420
tttagcgaaa acatgccgct gaaagaagtg attgtgcatc tgaccaaaca gctgagcgtg 480
ggcagcccga ccggcaccga tatggaaacc ccgagctgga ccccgcagga taccagcctg 540
gaaaccggcc agggcgaatg gggcaaaaaa gaaaacggcg ataacattta tcatattaac 600
gatagcatta ccagccaggg caacgaaatt ccgagcctgc tgattattcg cgaagaagat 660
tatccgcgcc cggaagaaga tagcgtgagc ctgaaaaacc cgctgagcag ccgcaaagcg 720
ggcctgggca tgagcggcag ccaggaaggc agcctgaaag gcccgagcta tcaggatgtg 780
ctgatggaag gcggcccggg ctttctgagc cagagcattc aggtgagccc ggaaccggtg 840
ccgacccatc agcgcaccga aggcaacagc acccgcggcg gccatcagga acgctgccgc 900
gaagcgcaga acagctatcg ctgcgaaaaa tgcccgaaaa tttttcgcta ttttagccag 960
ctgaaagcgc atcagcgccg ccataacaac gaacgcacct tt 1002
<210> 26
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 36的逆向翻译
<400> 26
atggatctgg atctgcgcct gagctttcag ggcgaaccga gccgcaacga tccgggcagc 60
gaaaacctgg cgctgaaagc gagccagggc tatgtgattc gcgatggcga aggcattagc 120
gaatttccga acacccgcct gagcctgttt cagaacagca gcaacagctt tgcgcgccgc 180
gaactgcagc gcctgtataa cctgtttcat agctggctgc agccggaaaa acgcagcaaa 240
gatgaaatga ttagctgcct ggtgctggaa cagtttgtga ttaacggcca ttgcagcgat 300
cgcagcaccc tgcaggaaaa atggaacgcg agcggccgca acctggaaaa atttatggaa 360
gatctgaccg atgatggcat gaaacagccg ggctttgtgc atgtgcatat gcagggccag 420
gaagcgctgt ttagcgaaaa catgccgctg cgcgaagtgc tggtgcattt tcgcaaacat 480
ctggcgaccg cgaccccgcg cggcgaaaac accaaagcgc cgctgtggac cccgcgcgat 540
gcgagcctgg aaaccggcca ggaaagcgaa ggcaaagaat gcggcggcaa caccagccgc 600
aaaacctgcc cggtgaccga aagcctgacc tggcagggca gccagacccc gtttctgctg 660
attattccgg aagaaacctg cccgggcctg gaagaagcgg gcgtgagccc ggaaaacccg 720
ctgggcagcc gcaccgcgga accgggcctg gcggtgagcc aggaaggcag cccggaaggc 780
ccgtttggcg gcgatgtgca tctggaagcg gaaccgggct ttctgagccg cccggatcag 840
gtgaccctgg aaccggtgag cgcgcatccg agcctggaag gcaacccggc gcgcggcaaa 900
agcccggaag gcctgccggg cgcgcagaaa gtgtttccgt gcgaaaaatg cagccaggtg 960
tttcgctatc tgagccgcct gaaagtgcat cagcgccgcc ataacgatga acgcccgttt 1020
gtgtgcgcga aatgcaaaaa aggctttttt cagaccagcg atctgcgcgt gcatcagcgc 1080
attcatacca aagaaaaacc gtttcgctgc agcacctgca aacgcccgtt tagccataaa 1140
accaacctgc gcgcgcatga acgcattcat accggcgaaa aaccgtatct gtgcagcctg 1200
tgccagcgcc gctatcgcca gagcagcacc tataaccgcc atctgaaaag ccatcagaaa 1260
ctggcgctga aaggcgatct gagcggcgtg ccggtggtgg cgcagcgcaa acgcatt 1317
<210> 27
<211> 1656
<212> DNA
<213> 白颊长臂猿
<400> 27
agattgcagt tttaaagaat ccaccaactg ttgaaacaaa tccctagaga cacaaggcaa 60
gagactgaat catcaaagtt aagtctctct gagaattatt gctaagaatg gctttagagc 120
taagaaccat atttcagtgt gaaccatccg agaataatct tggatcagaa aattcagagt 180
ttcgacaaag ccaaggacct gctgttcaga gagaagaagg gatttctgag ttctcaagaa 240
tggtgctcaa ttcatttcaa gacagcaata aatcatatgc aaggcaggaa ttgcaaagac 300
tttataggat ctttcactca tggctgcaac cagaaaagca cagcaaggat gaaattattt 360
ctctattagt cctggagcag tttatgattg gtggccactg caatgacaaa accagtgtga 420
aagagaaatg gaaatcaagt ggcaaaaact tggagagatt catggaagac ctgactgatg 480
acagcataaa tccacctgcc ttagtccacg tccacatgca gggacaggaa gctctctttt 540
ctgaggatat gcccttaaaa gatgtcattg ttcatctcac aaaacaagtg tctgcccaaa 600
tcccaagaga agcaaacatg gggacaccct tccagacttc ccaagatact tccttagaaa 660
caggacaagg acgtgaagat gaacaagatg gctgcaacag ttctttgaaa actactcaag 720
taaatgaaaa tattactaat caaggcaatc aaatagtttc cctaatcatc atccaggaag 780
agaatggtcc taggcctgaa gagggaggtg tttcttctga caacccatgc aactcaaaaa 840
gagcagagct agtcactgct agatcccagg aagggtccat aaacggaatc acttttcaag 900
gtgtccctat ggagatggga gcagggtgta tctctcagcc agagcagtcc tcccctgagt 960
ctgcccctac ccaccagagc aatgagggaa actccacatg tgaggtacat cagaaaggat 1020
cccatggagt ccgaaaatca tacaaatgtg aagaatgccc caaggtcttt aagtatctct 1080
gtcacttatt agctcaccag aggagacaca ggaatgagag gccatttgtt tgtcccgagt 1140
gtcagaaagg cttcttccag acatcagacc tacgcgtgca tcaggtgatt cacacaggaa 1200
agaagccttt cacatgcagc atgtgtgaaa agtccttcag ccacaaaacc aacctgcggt 1260
cccatgagag aatccacaca ggagaaaagc cttatacatg tccctattgt aagacaagct 1320
accgccagtc atccacatac caccgccata tgaggactca tgagaaaatt acctcaccaa 1380
gtgttccctc cacgccagaa gcttcctaag ctgctggtct gataatgtgt ataaatgtgt 1440
atgcaagtat gtatattccc atagtattta tctacttagg atataagata taatttcctg 1500
attatgcttt caatttattg tctgcttcat taaaatgtaa ggctaaggag agcatggaat 1560
ttgtcagttt tgctcactaa agtattccaa gtggttggga aagtgggaac atttccaaga 1620
accaataaat ttctgttgaa taaatgaatg aatcca 1656
<210> 28
<211> 1299
<212> DNA
<213> 普通猕猴
<400> 28
atggctttag atctaagaac catatttcag catgaaccat ccgagaataa tcttggatca 60
gaaaattcag agtttcgacg aagtcaagga cctgctgttc agacagaaga agggatttct 120
gagttctcaa gaatgatgct caattcattt caagacagca ataattcata tgcaaggcag 180
gaattgcaaa gactttatag gatctttcac tcatggctgc aaccagaaaa gcacagcaag 240
gatgaaatta tttctctatt agtcctggag cagtttatga ttggtggcca ctgcaatgac 300
aaagccactg tgaaagagaa atggaaatca agtggcaaaa acctggagag attcatggaa 360
gacctgactg atgacatcat aaatccacct gccttagtcc atgtccacat gcagggacag 420
gaagctctct tttctgacaa tatgccctta aaagatgtca ttgttcatct cacaaaacaa 480
gtgtctgcca aaactccaag agaagcaaac atggggacac ccttccagac ttcccaagac 540
acttcctcag aaacaggaca aggacgtgaa gatgaacaag atggctgcaa cagttctttg 600
aaaactactc aagtaaatga aagtaatact aatcaagaca atccaatagt ttctctaatc 660
atccaggaag agaatggccc taggcctaaa gagggaggtg tttcttctga caacccatac 720
aattcaagaa gaacagagct agacactgct agatcccagg aagggtccac gaacggaatt 780
atttttcaag gtgtccctat ggagatggga gcagggttta tctctcagcc agagcagtca 840
tcccctgagt ctgcccctac ccaccagagc aataagggga actccacatg tgaggtacat 900
cagaaaggat cccatggagt ccgaaaatca tacaaatgtg aagaatgccc caaggtcttt 960
aagtatctct gtcacttatt agctcaccag agaagacaca ggaatgagag gccatttgtt 1020
tgtcccaagt gtcaaaaagg cttcttccag atatcagacc tacgtgtgca tcagataatt 1080
cacacaggag agaaaccttt tacatgcagc atgtgtgaaa agtccttcag ccacaaaacc 1140
aacctgcggt ctcatgagag aatccacaca ggagaaaagc cttatacatg tccctattgt 1200
aagagaagct accgccagtc atccacatac caccgccata tgaggactca taagaaaatt 1260
actctgccaa ctgttccctc cacaccagaa gcttcctaa 1299
<210> 29
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 39的逆向翻译
<400> 29
atggcgctgg atctgcgcaa aagcttttgc caggaactga gcagcaacaa cctggaaagc 60
gaagatctgg aatttagcag cacccagggc tttgcggtgc cgaaacgcga aattagcgcg 120
tttagcagca ttcagctgaa cagcctgcag tatagcgata acagcgaagc gcgcaaagaa 180
ctgcagcgcc tgtatgaatt ttttcatagc tggctgcagc cggaaaacca tagcaaagat 240
cagattattg cgcagctggc gatggaacag tttatgctga gcggccgctg ccgcgataaa 300
agcattctga aaaaaaaatg ggaaagcagc ggcaaaaacc tggaaaaact gctggaagat 360
ctgaccgatg attgcatgaa accgccggtg ctggtgcatg tgtgcatgca gggccaggaa 420
gcgctgttta gcgaagatat gccgctgaaa gaagtgattg cgcatctgac caaacagagc 480
agcgcgaaaa cctttaccgc gggcatgggc accgcgcatc aggtgagcca gaacgcgccg 540
ctgggcaccc gccagggcaa cgaacatgaa gaagatggct gcaccagcag ctgggaagtg 600
acccaggtga acgattatat taccaacccg ggcaaagaaa ttgtgagcct gctgattatt 660
ccggaagcga acgatccgac cccggtggaa gaaagcgcga gctgggaaaa cacccatagc 720
agccgcaaag cgcgcccggt gatttgcggc ctgcaggaag aaagccagaa aggcccgagc 780
tatcaggatg tgccgatgga tgtgggcccg ggcagcagca gcctgccgca tcagagcagc 840
agcgaaccgg tgagcaacca tcattgcagc gaaggcaaca gcgcgtgcga agaaagccag 900
gaacgctttc atgaaagccc gaaaagctat aaatgcgaag aatgcccgaa aacctttaaa 960
tatctgagcc attttctggc gcatcagcgc tgccatcgca gctttcgc 1008
<210> 30
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO: 40的逆向翻译
<400> 30
atgccgagca acctgaccaa cagctgccag tgcaaaacca gccagaacga ttttgaactg 60
ggcaacaccg aatttcgccg cacccagggc agcgcggtgc agaacggcga aatttttagc 120
gaatttagca gcagccagct gaacagcctg ccggataacg gcaacagcaa cgcgcgcaaa 180
gaactgcagc gcctgcatgg catttttcat agctggctgc agccggaaaa acatagcaaa 240
gatgaaatta ttagccgcct ggtgctggaa cagtttatga ttaacggcaa ctgccgcgat 300
cgcagcattc tgaaagaaaa atgggaaagc agcggccgca acctggaaaa actgatggaa 360
gatctgaccg atgattgcat ggaaccgccg gtgctggtgc gcgtgcatat gcagggccag 420
gaagcgctgt ttagcgaaaa catgccgctg aaagaagtga ttgtgcatct gaaaaaacag 480
ctgagcgcgg aaaacaccac cggcgaaaac aaaggcatga gcctgcaggc gccgcaggat 540
accccgctgg aaacccgcca gggcaacgaa gataaagaaa acgcgtgcaa caacttttgg 600
aaaaacaccc aggtggatga tagcattacc tgccagggca cccagacccc gagcctgctg 660
attattcagg aagatcattg cctgcgcctg gaagatggcg gcgcgagctg cgaaaacccg 720
cataacagcc gccgcggcgt gaccagccat agcgaaaaag gcccgctgga aggcccgagc 780
tatcagaaca ttccggtggg cgaacagccg gaatttctgc cgaccagcga tcagagcagc 840
agcgaatttg tgccggcgca tcagagcaac aaaggcgata gcacctgcgg cggccatcat 900
gaaaaatatc gcggcgcgca gaaaagctat aaatgcaaag aatgcccgaa aatttttcgc 960
tatctgtgcc attttctggc gcatcagcgc 990
<210> 31
<211> 175
<212> PRT
<213> 大猩猩
<220>
<221> 变体
<222> 6, 7, 27, 71, 173, 174
<223> Xaa = 任意氨基酸
<400> 31
Asn Gly Ile Thr Phe Xaa Xaa Val Pro Met Val Met Gly Ala Gly Cys
1 5 10 15
Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Xaa Ala Leu Thr His Gln
20 25 30
Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly Ser His
35 40 45
Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val Phe Lys
50 55 60
Tyr His Cys His Leu Leu Xaa His Gln Arg Arg His Arg Asn Glu Arg
65 70 75 80
Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile Ser Asp
85 90 95
Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe Thr Cys
100 105 110
Ser Met Cys Lys Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg Ser His
115 120 125
Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe Cys Lys
130 135 140
Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg Thr His
145 150 155 160
Glu Lys Ile Thr Leu Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Xaa Xaa Ser
165 170 175
<210> 32
<211> 433
<212> PRT
<213> 倭黑猩猩
<400> 32
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Gly Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asp Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Ser Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Ile Cys Lys Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe
385 390 395 400
Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg
405 410 415
Thr His Glu Lys Ile Thr Val Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala
420 425 430
Ser
<210> 33
<211> 433
<212> PRT
<213> 婆罗洲猩猩
<400> 33
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Ser Ala Gln Thr Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Glu Gly Cys Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Ser Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Asn Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe
385 390 395 400
Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg
405 410 415
Thr His Glu Lys Ile Thr Pro Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala
420 425 430
Ser
<210> 34
<211> 433
<212> PRT
<213> 苏门答腊猩猩
<400> 34
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Ser Ala Gln Thr Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Glu Gly Cys Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Ser Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Asn Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe
385 390 395 400
Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg
405 410 415
Thr His Glu Lys Ile Thr Pro Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala
420 425 430
Ser
<210> 35
<211> 334
<212> PRT
<213> 大熊猫
<400> 35
Leu Lys Ile Asp Ser Phe Leu Cys Glu Leu Ser Met Asp Asp Pro Gly
1 5 10 15
Ser Lys Asn Lys Asp Phe Lys Pro Ser Gln Gly Pro Ala Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Glu Glu Ile Ser Glu Phe Gln Asp Ser Gln His Ser Leu Phe Gln
35 40 45
Asp Gly Asn Asn Ser His Ala Lys Gln Glu Leu Gln Arg Leu Tyr Lys
50 55 60
Ser Phe Tyr Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys Asp Glu Ile
65 70 75 80
Ile Phe Gln Val Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Asn Arg His Cys Ser
85 90 95
Gly Arg Ser Thr Leu Lys Lys Lys Trp Glu Ser Ser Gly Arg Asn Leu
100 105 110
Glu Lys Phe Met Glu Ser Leu Ser Glu Ser Ser Leu Lys Pro Pro Asp
115 120 125
Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser Glu Asn
130 135 140
Met Pro Leu Lys Glu Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln Leu Ser Val
145 150 155 160
Gly Ser Pro Thr Gly Thr Asp Met Glu Thr Pro Ser Trp Thr Pro Gln
165 170 175
Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Glu Trp Gly Lys Lys Glu Asn
180 185 190
Gly Asp Asn Ile Tyr His Ile Asn Asp Ser Ile Thr Ser Gln Gly Asn
195 200 205
Glu Ile Pro Ser Leu Leu Ile Ile Arg Glu Glu Asp Tyr Pro Arg Pro
210 215 220
Glu Glu Asp Ser Val Ser Leu Lys Asn Pro Leu Ser Ser Arg Lys Ala
225 230 235 240
Gly Leu Gly Met Ser Gly Ser Gln Glu Gly Ser Leu Lys Gly Pro Ser
245 250 255
Tyr Gln Asp Val Leu Met Glu Gly Gly Pro Gly Phe Leu Ser Gln Ser
260 265 270
Ile Gln Val Ser Pro Glu Pro Val Pro Thr His Gln Arg Thr Glu Gly
275 280 285
Asn Ser Thr Arg Gly Gly His Gln Glu Arg Cys Arg Glu Ala Gln Asn
290 295 300
Ser Tyr Arg Cys Glu Lys Cys Pro Lys Ile Phe Arg Tyr Phe Ser Gln
305 310 315 320
Leu Lys Ala His Gln Arg Arg His Asn Asn Glu Arg Thr Phe
325 330
<210> 36
<211> 439
<212> PRT
<213> 野猪
<400> 36
Met Asp Leu Asp Leu Arg Leu Ser Phe Gln Gly Glu Pro Ser Arg Asn
1 5 10 15
Asp Pro Gly Ser Glu Asn Leu Ala Leu Lys Ala Ser Gln Gly Tyr Val
20 25 30
Ile Arg Asp Gly Glu Gly Ile Ser Glu Phe Pro Asn Thr Arg Leu Ser
35 40 45
Leu Phe Gln Asn Ser Ser Asn Ser Phe Ala Arg Arg Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Asn Leu Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys Arg Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Met Ile Ser Cys Leu Val Leu Glu Gln Phe Val Ile Asn Gly
85 90 95
His Cys Ser Asp Arg Ser Thr Leu Gln Glu Lys Trp Asn Ala Ser Gly
100 105 110
Arg Asn Leu Glu Lys Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Gly Met Lys
115 120 125
Gln Pro Gly Phe Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asn Met Pro Leu Arg Glu Val Leu Val His Phe Arg Lys His
145 150 155 160
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Arg Gly Glu Asn Thr Lys Ala Pro Leu Trp
165 170 175
Thr Pro Arg Asp Ala Ser Leu Glu Thr Gly Gln Glu Ser Glu Gly Lys
180 185 190
Glu Cys Gly Gly Asn Thr Ser Arg Lys Thr Cys Pro Val Thr Glu Ser
195 200 205
Leu Thr Trp Gln Gly Ser Gln Thr Pro Phe Leu Leu Ile Ile Pro Glu
210 215 220
Glu Thr Cys Pro Gly Leu Glu Glu Ala Gly Val Ser Pro Glu Asn Pro
225 230 235 240
Leu Gly Ser Arg Thr Ala Glu Pro Gly Leu Ala Val Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Pro Glu Gly Pro Phe Gly Gly Asp Val His Leu Glu Ala Glu Pro
260 265 270
Gly Phe Leu Ser Arg Pro Asp Gln Val Thr Leu Glu Pro Val Ser Ala
275 280 285
His Pro Ser Leu Glu Gly Asn Pro Ala Arg Gly Lys Ser Pro Glu Gly
290 295 300
Leu Pro Gly Ala Gln Lys Val Phe Pro Cys Glu Lys Cys Ser Gln Val
305 310 315 320
Phe Arg Tyr Leu Ser Arg Leu Lys Val His Gln Arg Arg His Asn Asp
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Ala Lys Cys Lys Lys Gly Phe Phe Gln Thr
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Arg Ile His Thr Lys Glu Lys Pro Phe
355 360 365
Arg Cys Ser Thr Cys Lys Arg Pro Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ala His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Ser Leu
385 390 395 400
Cys Gln Arg Arg Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr Asn Arg His Leu Lys
405 410 415
Ser His Gln Lys Leu Ala Leu Lys Gly Asp Leu Ser Gly Val Pro Val
420 425 430
Val Ala Gln Arg Lys Arg Ile
435
<210> 37
<211> 433
<212> PRT
<213> 白颊长臂猿
<400> 37
Met Ala Leu Glu Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Lys Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Thr Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Ser Ala Gln Ile Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Phe Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Arg Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Cys Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Pro Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Thr
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Val Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Tyr
385 390 395 400
Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg
405 410 415
Thr His Glu Lys Ile Thr Ser Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala
420 425 430
Ser
<210> 38
<211> 432
<212> PRT
<213> 普通猕猴
<400> 38
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln His Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Glu Phe Arg Arg Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Thr Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Met Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Thr Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ile Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Asp Asn Met Pro Leu Lys Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Ser Ala Lys Thr Pro Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Phe Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Ser Glu Thr Gly Gln Gly Arg Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Cys Asn Ser Ser Leu Lys Thr Thr Gln Val Asn Glu Ser
195 200 205
Asn Thr Asn Gln Asp Asn Pro Ile Val Ser Leu Ile Ile Gln Glu Glu
210 215 220
Asn Gly Pro Arg Pro Lys Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro Tyr
225 230 235 240
Asn Ser Arg Arg Thr Glu Leu Asp Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly Ser
245 250 255
Thr Asn Gly Ile Ile Phe Gln Gly Val Pro Met Glu Met Gly Ala Gly
260 265 270
Phe Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Pro Thr His
275 280 285
Gln Ser Asn Lys Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly Ser
290 295 300
His Gly Val Arg Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val Phe
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn Glu
325 330 335
Arg Pro Phe Val Cys Pro Lys Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile Ser
340 345 350
Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Thr
355 360 365
Cys Ser Met Cys Glu Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg Ser
370 375 380
His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Tyr Cys
385 390 395 400
Lys Arg Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg Thr
405 410 415
His Lys Lys Ile Thr Leu Pro Thr Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala Ser
420 425 430
<210> 39
<211> 336
<212> PRT
<213> 豚鼠
<400> 39
Met Ala Leu Asp Leu Arg Lys Ser Phe Cys Gln Glu Leu Ser Ser Asn
1 5 10 15
Asn Leu Glu Ser Glu Asp Leu Glu Phe Ser Ser Thr Gln Gly Phe Ala
20 25 30
Val Pro Lys Arg Glu Ile Ser Ala Phe Ser Ser Ile Gln Leu Asn Ser
35 40 45
Leu Gln Tyr Ser Asp Asn Ser Glu Ala Arg Lys Glu Leu Gln Arg Leu
50 55 60
Tyr Glu Phe Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Asn His Ser Lys Asp
65 70 75 80
Gln Ile Ile Ala Gln Leu Ala Met Glu Gln Phe Met Leu Ser Gly Arg
85 90 95
Cys Arg Asp Lys Ser Ile Leu Lys Lys Lys Trp Glu Ser Ser Gly Lys
100 105 110
Asn Leu Glu Lys Leu Leu Glu Asp Leu Thr Asp Asp Cys Met Lys Pro
115 120 125
Pro Val Leu Val His Val Cys Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe Ser
130 135 140
Glu Asp Met Pro Leu Lys Glu Val Ile Ala His Leu Thr Lys Gln Ser
145 150 155 160
Ser Ala Lys Thr Phe Thr Ala Gly Met Gly Thr Ala His Gln Val Ser
165 170 175
Gln Asn Ala Pro Leu Gly Thr Arg Gln Gly Asn Glu His Glu Glu Asp
180 185 190
Gly Cys Thr Ser Ser Trp Glu Val Thr Gln Val Asn Asp Tyr Ile Thr
195 200 205
Asn Pro Gly Lys Glu Ile Val Ser Leu Leu Ile Ile Pro Glu Ala Asn
210 215 220
Asp Pro Thr Pro Val Glu Glu Ser Ala Ser Trp Glu Asn Thr His Ser
225 230 235 240
Ser Arg Lys Ala Arg Pro Val Ile Cys Gly Leu Gln Glu Glu Ser Gln
245 250 255
Lys Gly Pro Ser Tyr Gln Asp Val Pro Met Asp Val Gly Pro Gly Ser
260 265 270
Ser Ser Leu Pro His Gln Ser Ser Ser Glu Pro Val Ser Asn His His
275 280 285
Cys Ser Glu Gly Asn Ser Ala Cys Glu Glu Ser Gln Glu Arg Phe His
290 295 300
Glu Ser Pro Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Thr Phe Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Ser His Phe Leu Ala His Gln Arg Cys His Arg Ser Phe Arg
325 330 335
<210> 40
<211> 330
<212> PRT
<213> 地松鼠
<400> 40
Met Pro Ser Asn Leu Thr Asn Ser Cys Gln Cys Lys Thr Ser Gln Asn
1 5 10 15
Asp Phe Glu Leu Gly Asn Thr Glu Phe Arg Arg Thr Gln Gly Ser Ala
20 25 30
Val Gln Asn Gly Glu Ile Phe Ser Glu Phe Ser Ser Ser Gln Leu Asn
35 40 45
Ser Leu Pro Asp Asn Gly Asn Ser Asn Ala Arg Lys Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu His Gly Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Arg Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Asn Gly
85 90 95
Asn Cys Arg Asp Arg Ser Ile Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ser Ser Gly
100 105 110
Arg Asn Leu Glu Lys Leu Met Glu Asp Leu Thr Asp Asp Cys Met Glu
115 120 125
Pro Pro Val Leu Val Arg Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asn Met Pro Leu Lys Glu Val Ile Val His Leu Lys Lys Gln
145 150 155 160
Leu Ser Ala Glu Asn Thr Thr Gly Glu Asn Lys Gly Met Ser Leu Gln
165 170 175
Ala Pro Gln Asp Thr Pro Leu Glu Thr Arg Gln Gly Asn Glu Asp Lys
180 185 190
Glu Asn Ala Cys Asn Asn Phe Trp Lys Asn Thr Gln Val Asp Asp Ser
195 200 205
Ile Thr Cys Gln Gly Thr Gln Thr Pro Ser Leu Leu Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Asp His Cys Leu Arg Leu Glu Asp Gly Gly Ala Ser Cys Glu Asn Pro
225 230 235 240
His Asn Ser Arg Arg Gly Val Thr Ser His Ser Glu Lys Gly Pro Leu
245 250 255
Glu Gly Pro Ser Tyr Gln Asn Ile Pro Val Gly Glu Gln Pro Glu Phe
260 265 270
Leu Pro Thr Ser Asp Gln Ser Ser Ser Glu Phe Val Pro Ala His Gln
275 280 285
Ser Asn Lys Gly Asp Ser Thr Cys Gly Gly His His Glu Lys Tyr Arg
290 295 300
Gly Ala Gln Lys Ser Tyr Lys Cys Lys Glu Cys Pro Lys Ile Phe Arg
305 310 315 320
Tyr Leu Cys His Phe Leu Ala His Gln Arg
325 330
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
cggtttgttt gggtttgggt ttgggtttgg gtttgggtt 39
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
ggcttgcctt acccttaccc ttacccttac ccttaccct 39
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
cccattctat catcaacggg tacaa 25

Claims (10)

1.在一种或多种人细胞中增大端粒长度的方法，其包括使所述一种或多种人细胞与在所述人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中相对于没有与所述试剂接触的一种或多种对应的人细胞，增大表达的Zscan4在所述一种或多种人细胞中诱导端粒加长。
2.治疗需要端粒加长的对象的方法，其包括使所述对象中的一种或多种人细胞与在所述一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大表达的Zscan4在所述一种或多种人细胞中诱导端粒加长。
3.治疗需要端粒加长的对象的方法，其包括：
i.从所述对象分离需要端粒加长的一种或多种人细胞；
ii.使所述一种或多种人细胞与在所述一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达在所述一种或多种人细胞中诱导端粒加长；和
iii.向所述对象施用所述接触的一种或多种人细胞。
4.治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法，其包括向有需要的对象施用在所述对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达在所述一种或多种人细胞中诱导端粒加长以治疗所述端粒异常关联性疾病或状况。
5.治疗端粒异常关联性疾病或状况的方法，其包括：
i.从患有端粒异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；
ii.使所述一种或多种人细胞与在所述一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达在所述一种或多种人细胞中诱导端粒加长；和
iii.向所述对象施用所述接触的一种或多种人细胞以治疗所述端粒异常关联性疾病或状况。
6.治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法，其包括向有需要的对象施用在所述对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达在所述一种或多种人细胞中诱导修正所述染色体异常以治疗所述染色体异常关联性疾病或状况。
7.治疗染色体异常关联性疾病或状况的方法，其包括：
i.从患有染色体异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；
ii.使所述一种或多种人细胞与在所述一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达在所述一种或多种人细胞中诱导修正所述染色体异常；和
iii.向所述对象施用所述接触的一种或多种人细胞以治疗所述染色体异常关联性疾病或状况。
8.治疗核型异常关联性疾病或状况的方法，其包括向有需要的对象施用在所述对象中的一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂，其中增大Zscan4的表达在所述一种或多种人细胞中诱导修正核型异常以治疗所述核型异常关联性疾病或状况。
9.治疗核型异常关联性疾病或状况的方法，其包括：
i.从患有核型异常关联性疾病或状况的对象分离一种或多种人细胞；
ii.使所述一种或多种人细胞与在所述一种或多种人细胞中增大Zscan4的表达的试剂接触，其中增大Zscan4的表达在所述一种或多种人细胞中诱导修正所述核型异常；和
iii.向所述对象施用所述接触的一种或多种人细胞以治疗所述核型异常关联性疾病或状况。
10.权利要求8或权利要求9的方法，其中所述核型异常选自染色体缺体性、染色体单体性、染色体三体性、染色体四体性和染色体五体性。
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