JP2006503555A - タンパク質産生方法および使用するための改変細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、真核生物細胞によるタンパク質産生に関する。
本発明は、タンパク質が細胞によって天然に産生されるタンパク質であるか、またはタンパク質が細胞に対して異種のタンパク質であるかに関わらず、細胞のタンパク質産生を増強するための手段として、細胞寿命を延長するための方法を提供する。
本明細書中で引用される特許および科学的文献は、当業者に利用可能である知識を確立する。本明細書中で引用されるGenBankデータベース配列を含む発行された米国特許、認可された出願、公開された外国出願、および参考文献が、各々が具体的にかつ個別に参考として援用されるように示されるのと同じ程度に、参考として本明細書により援用される。
(高められたCHO細胞宿主の作製)
異種タンパク質の改善された発現のために潜在的に使用され得る、改善した増殖特性を有するCHO宿主を作製するために、Bcl−xLを、CHO細胞中で発現させた。
(高められたCHO細胞宿主の改善した増殖)
実施例Iに記載されるこれらのBcl−xLトランスフェクト化細胞の細胞死速度論(kinetics)を、次に元の改変されていない宿主細胞と比較した。
(増強したCHO細胞宿主のさらなる特徴付け)
アポトーシスを検出し定量するための1つの手段は、サンプル溶解物におけるカスパーゼ−3のタンパク質分解活性の測定によるものである。カスパーゼ−3は、細胞のタンパク質分解性の分解によってアポトーシスの実行において重要な役割を果たす1つのカスパーゼである。アポトーシスを阻害することに対するBcl−xLの公知の能力を考慮して、次に、Bcl−xLでトランスフェクトしたCHO細胞を、カスパーゼ−3アッセイを使用してカスパーゼ活性について試験した。
(異種タンパク質を分泌するBcl−xLトランスフェクト細胞株の作製)
上記の実施例は、細胞中に抗アポトーシス遺伝子であるBcl−xLを発現することによる細胞死の遅延を介して、延長した細胞生存率を有するより強力なCHO宿主を生成することの実行可能性を確立した。Bcl−xLの用途をさらに拡大するために、次なる目標は、Bcl−xL遺伝子を用いて異種タンパク質を発現する確立したCHO−DG44細胞株をトランスフェクトし、そして予期された延長した生存率に起因する異種タンパク質の増加した生成について、Bcl−xLトランスフェクト細胞を試験することであった。
Bcl−xL−zeoプラスミドでトランスフェクトした100AB−37細胞を、600μg/mlのゼオシンの存在下で培養した。次に、ウシ胎仔血清(FBS)の非存在下で培養したトランスフェクト体のプール、および選択的ゼオシンの存在下で培養したトランスフェクト体のプールを、AQC2分泌について分析した。フローサイトメトリー分析を、結合抗体を使用してAQC2に対して実施した。図7Bに示したように、Bcl−xLトランスフェクト体から分泌されたAQC2(太い黒のヒストグラム)を、トランスフェクトしていない親(灰色)のAQC2およびコントロール(黒色)のAQC2と比較した。図7Bに示した結果は、AQC2を発現しかつ分泌する能力は、Bcl−xLの存在によって抑制されなかったことを実証した。上記の細胞からサンプリングした馴化培地のELISAによる力価分析は、フローサイトメトリーのデータを追認した。実際に、生産性は、改変していない親株(2.1×106細胞/ml)について105μg/mlであったのに対して、100AB−37/Bcl−xLプール(2.24×106/mlの細胞)について150μg/mlで、Bcl−xLトランスフェクト細胞について高かった。
(異種タンパク質を分泌するBcl−xLトランスフェクト細胞株のさらなる特徴づけ)
100AB−37.21/Bcl−xL分離株(#21)を、クローンであると確認しなかったので、ΔBcl−xL100AB−37分離株とこの100AB−37.21/Bcl−xL分離株(#21)との両方をさらにサブクローニングすると、このΔBcl−XL100AB−37分離株は、トランスフェクトされていない親100AB−37細胞株でのサブクローンであった。これを行ったのは、各々の細胞から最も所望されるサブクローンの比較によって、Bcl−xL分離株とΔBcl−xL分離株との間のより厳密の比較が提供されるからである。これを行うために、等価な数のサブクローンを、細胞株の各々についてスクリーニングした。生成し、そして、より優れた増殖性および高い力価を生じる能力にしたがって順位付けした、選択されたサブクローンについて比活性を決定した(データ示さず)。次いで、このリードサブクローンBcl−XL分離株#21、すなわち、21.15を、スピナー管(spinners vessel)中の非改変親100AB−37のリードサブクローン37.32に対して、評価および比較した。この評価のために選択された増殖培地は、殆ど動物由来成分を有さない化学規定増殖培地(chemically defined growth media;CDM)であった。CDMは、規定されていない成分の除去、原料の変化量の低減、下流プロセスの複雑性の低減、および動物起源の潜在的な夾雑物の除去のために、大規模製造に所望される(Jayme and Smith,Cytotechnology 33:27−36,2000)。さらに、タンパク質含有量が著しく低減された環境によって、細胞を前処理してアポトーシスさせることが可能である(Moore A.ら、Cytotechnology 17:1−11,1995 and Zhangiら、Biotech Bioeng.64:108−119,1999)。したがって、Bcl−xL発現の存在によって、このような培地条件の下でも頑強であることが維持される細胞株を提供し得る。
(酪酸ナトリウムを含む培地中で培養された、異種タンパク質を分泌する細胞株をトランフェクトしたBcl−xLの増加した生産性および生存率)
酪酸ナトリウム(NaBu)を、試みとして一般的に使用して、転写を増大することによって、特定の異種タンパク質発現を増大させる(Changら、Free Rad.Es.30:85−91,1999;Palermoら、J.Biotech.19:35−47,1991;およびLaubach,V.E.ら、Biochem.Biophy.Res.Commun.218:802−807,1996)。しかし、増大した発現に必要なNaBuの高い濃度に対する重大な欠点は、CHO細胞中に生じることが公知のアポトーシスの迅速な誘発のネガティブな競合的効果である(Changら、Free Rad Es 30:85−91,1999;ならびにKimおよびLee,Biotech.Bioeng.71:184−193,2000−2001)。この結果について、NaBuは、全ての細胞株において増大した力価に一般的に効果的でない。
当業者は、通常の実験法しか使用せずに、本明細書中に詳細に記載される特定の実施形態に対する多数の等価物を、認識するかまたは確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
Claims (34)
- 増加した量のBcl−xLを含む細胞であって、該細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない、細胞。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、昆虫細胞または両生類細胞である、請求項1に記載の細胞。
- 前記細胞が、ヒト細胞、マウス細胞またはハムスター細胞である、請求項2に記載の細胞。
- 前記細胞が、ハムスター細胞である、請求項3に記載の細胞。
- 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項4に記載の細胞。
- 前記細胞が、懸濁液中での増殖のために適応される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、無血清培養液中での増殖のために適応される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記培養液がブチレートを含む、請求項7に記載の細胞。
- 前記Bcl−xLタンパク質が、細胞中へと導入される発現ベクターから発現される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記Bcl−xLタンパク質が、前記細胞以外の異なる種である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記Bcl−xLタンパク質がヒトである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記細胞が、ポリペプチドをコードする第1の発現ベクターをさらに含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記ポリペプチドが分泌されたタンパク質である、請求項12に記載の細胞。
- 前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖または重鎖、請求項12に記載の細胞。
- 前記第1の発現ベクターが、前記抗体の前記軽鎖および前記重鎖の両方をコードする、請求項14に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記抗体の前記軽鎖または前記重鎖をコードする第2の発現ベクターをさらに含み、前記第1のおよび該第2の発現ベクターが、該細胞中で該抗体を一緒に発現する、請求項14に記載の細胞。
- ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞を培養する工程および細胞培養物から該ポリペプチドを精製する工程を包含する、方法。
- ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下:
増大した量のBcl−xLタンパク質を含む細胞を提供する工程であって、該細胞が、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない、工程;
ポリペプチドをコードする第1の発現ベクターを該細胞中に導入する工程;および
該細胞中で該ポリペプチドを発現する工程
を包含する、方法。 - 前記細胞の培養物から前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項18に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、前記細胞培養物の培地から単離される、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、昆虫細胞または両生類細胞である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞、マウス細胞またはハムスター細胞である、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞が、ハムスター細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞が、培養液中での増殖のために適応される、請求項18〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、無血清培養液中での増殖のために適応される、請求項18〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養液が、ブチレートを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記Bcl−xLタンパク質が、前記細胞中へと導入される発現ベクターから発現される、請求項18〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Bcl−xLタンパク質が、前記細胞以外の異なる種である、請求項18〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Bcl−xLタンパク質がヒトである、請求項18〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、分泌されたタンパク質である、請求項18〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖または重鎖である、請求項18〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の発現ベクターが、前記抗体の前記軽鎖および前記重鎖の両方をコードする、請求項32に記載の方法。
- 前記抗体の軽鎖または重鎖をコードする第2の発現ベクターを細胞中に導入する工程をさらに包含し、前記第1および該第2の発現ベクターが、該細胞中で該抗体を一緒に発現する、請求項32に記載の方法。
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