KR20090112725A - 세포 성장의 증진방법 - Google Patents

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베링거 잉겔하임 파르마 게엠베하 운트 코 카게
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Abstract

본 발명은 세포 배양 기술의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 세포 성장, 특히 생약제 생산자 숙주 세포의 성장을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기술된 방법에 의해 생성된 세포를 사용하여 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
세포 성장 증진, 생약제 생산 세포, 단백질 생산, DHFR

Description

세포 성장의 증진방법{Improvement of cell growth}
본 발명은 세포 배양 기술의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 세포 성장을 증진시키는 방법 및 생산 숙주 세포주를 생성시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기술된 방법에 의해 생성된 세포를 사용하여 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
사람 치료요법용 생약제 시장은 2003년도에 임상 연구에서 평가되는 270개의 새로운 생약제와 3백억의 예상 판매량으로 높은 속도로 지속하여 성장하고 있다(참조: Werner 2004). 현재, 생약제의 증가하는 수는 사람 단백질을 정확하게 가공하고 변형시키는 이들의 능력으로 인해 포유동물로부터 생산한다. 따라서, 포유동물 세포로부터 성공적이고 높은 수율의 생약제 생산은 중요하며 공정에 사용된 재조합 모노클로날 세포주의 특성에 의존한다.
생약제 생산 과정에서, 수율은 2개의 인자에 의해 결정된다: 숙주 세포의 특이적인 생산성(Pspec) 및 원하는 단백질을 생산하는 시간에 걸친 전체 생 세포인 IVC(Integral of Viable Cells). 이러한 관련성은 다음 식으로 표현된다: Y = Pspec * IVC. 따라서 생성물 수율을 증진시키기 위한 표준 시도는 생물반응기내 숙주 세포의 생산능 또는 생 세포 밀도를 증가시킬 수 있어야 한다. 보다 높은 IVC를 수득하기 위한 하나의 방법은 세포의 성장 특성을 개선시키는 것이며, 이는 보다 빠르고 보다 높은 최대 세포 밀도로 성장하는 세포를 생성시키는 것을 의미한다.
향상된 세포 성장은 생약제 생산 과정의 다수 측면에 심도한 영향을 갖는다:
- 세포주 개발에 있어 연장된 일정을 가져오는, 세포의 보다 짧은 세대 기간(generation time);
- 단일 세포 클로닝 후 보다 높은 효율 및 이후 보다 느린 성장;
- 특히 대규모 생물반응기용 접종의 경우에 규모 확장(scale-up) 동안의 보다 짧은 기간(timeframe);
- IVC와 생성물 수율 사이의 비례적인 관련성으로 인한 발효 시간 당 보다 높은 생성물 수율. 역으로, 낮은 IVC는 보다 낮은 수율 및/또는 보다 긴 발효 시간을 유발한다.
효소 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)는 뉴클레오타이드 합성의 주요 효소들 중 하나이다. 이는, 디-하이드로폴레이트가 퓨린 제조 블록(building block) 및 다른 대사 경로의 합성시 C1-단위의 공통의 전달인자(transmitter)인, 테트라하이드로폴레이트로 환원되는 것을 촉매한다.
생약제 산업 및 학문적 조사에서, DHFR은 안정하게 형질감염된 세포주의 선택적인 성장을 위해 선택 및 증폭 마커로서 광범위하게 사용된다. 이에 의해, DHFR의 발현은 관심 유전자(Gene of Interest: GOI)의 발현, 예를 들면, 생성물 유전자에 대한 발현 카세트와 기능적으로 연결되어 있다. 따라서, GOI-발현 세포는 선택적인 조건하에 DHFR에 의해 부여된 내성을 통해 간접적으로 풍부하게 존재한다. 이러한 기능적 커플링은 일반적으로 유전자 둘다의 바이-시스트로닉(bi-cistronic) 발현 또는 동일한 플라스미드상의 적어도 이들의 공동존재에 의해 매개/구성된다.
DHFR은 비-우성적 마커이므로, 당해 시스템은 대부분 내인성 DHFR 활성을 결여한 세포에서 사용된다. 따라서, 1980년대에 dhfr-음성 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO-DG44 및 CHO-DUKX (B11)가 이용가능해진 이후로, 이들은 선택된 숙주 세포 시스템으로 급속하게 발전되어 왔고 현재 생약제 산업에서 세계적으로 가장 흔히 사용되는 포유동물 생산 플랫폼(platform)이 되고 있다.
DHFR 효소는 퓨린의 생합성 경로에서 주요 효소들 중 하나이다. 따라서, DHFR을 결여하고 있는 세포는, 배양 배지내로 뉴클레오타이드 전구체인 하이포크산틴과 티미딘(HT)이 첨가되어 DHFR-결핍성이 보상되지 않는 한 이용 불가능하다. 놀랍게도, 본 발명에서 HT 보충된 배지에서조차, dhfr-결핍성 CHO 세포는 모 CHO 야생형 세포와 비교하여 현저히 더 느리고 현저히 더 낮은 밀도로 성장함이 밝혀졌다(도 1).
dhfr-음성 세포(예를 들면, CHO-DG44 세포) 또는 매우 낮은 내인성 dhfr-수준을 갖는 세포에서 본 발명에 의해 밝혀진 바와 같이, 이러한 감소된 성장능은 생약제 생산 과정의 다수 측면에 부정적인 영향을 미친다:
- 세포주 개발시 연장된 일정을 가져오는, 세포의 연장된 세대 기간
- 단일 세포 클로닝 후 보다 낮은 효능 및 이후 보다 느린 성장
- 특히 대규모 생산 발효기용 접종의 경우에, 규모 확장(scale-up) 동안 보다 짧은 기간;
- 발효기 작동당 보다 낮은 생산 수율.
이러한 단점들은 생산 세포(예를 들면, CHO-DG44 또는 DUKX(B11))의 성장 특성에 직접적으로 관련되어 있다. 이들은 예를 들면, 이들 세포가 다음 선택 및 증폭 시스템과 관련하여 사용되는 경우 발생한다: 글루타민 신테타제(GS) 시스템, 네오마이신, 퓨로마이신, 블레오마이신 및 기타.
세포, 특히 생약제 생산 세포주에서 성장 결핍성을 보상하기 위해, 대부분은 노력들은 탄수화물, 뉴클레오사이드, 미량 성분, 단백질 가수분해물, 식물 추출물 등과 같은 성장 보충물을 첨가함으로써 성장 배지를 개선시키는 것에 관한 것이었다. 예를 들면, 단백질 가수분해물을 배양 배지에 첨가함으로써 dhfr-음성 세포의 성장을 약간 증가시키는 것이 가능하지만, 이들은 야생형 세포의 성장 수준에 도달하지 않는다.
따라서, 생산자 숙주 세포, 특히 CHO-DG44와 같이 내인성 DHFR 발현이 낮거나 없는 것들의 성장 특성을 개선시키기 위한 강력한 요구가 존재한다. 또한, 향상된 세포 성장 및 이로써 발효 동안 보다 높은 IVC는, 예를 들면, 단기간 발효시 높은 생산물 수율을 수득하거나, 세포내 또는 세포-결합된 성분들의 분리, 정제 또는 특성화를 위한 많은 수의 세포를 수거하거나, 또는 세포주 생성, 단일-세포 클 로닝 및 배양 규모-확장을 위한 일정을 짧게 하기 위하여, 높은 생물량이 요구되는 경우, 명백히 유리하다.
발명의 개요
본 발명의 전체 목적은 생약제 생산 과정 동안 세포 성장을 개선시켜 세포 밀도를 증가시킴으로써 생성물 수율을 증가시키는 것이다.
당해 목적은 본 발명에서 DHFR 발현 카세트를 생산 세포내로 도입시킴에 의해 달성된다. 따라서, 본 발명은 놀랍게도, 향상된 세포 성장이 효소 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 이종 발현에 의해 수득됨을 밝혔다.
본 발명에서, DHFR 유전자는 다른 유전자, 즉 관심 유전자(GOI)에 대한 선택 마커로서의 일반적인 목적을 제공하는 것이 아니라, 세포 성장을 증가시키는 독립적인 기능을 발휘한다. 당해 셋팅에서, DHFR 유전자는 1개 또는 수개의 다른 발현 카세트에 기능적으로 연결/커플링되지 않는다. 따라서, 이는 GOI와 동일한 플라스미드상에 존재하거나 별도의 벡터로부터 발현될 수 있다. 상기 두 유전자가 별개의 벡터 작제물 상에 존재하는 경우, 플라스미드는 공동-형질감염되거나 세포내로 순차적으로 도입될 수 있다.
본 발명에서, 놀랍게도 처음으로 dhfr-결핍성은 감소된 세포 성장을 초래함이 밝혀졌다. 또한, DHFR의 재-도입은 이러한 문제를 해결할 수 있음이 밝혀질 수 있었다.
DHFR-트랜스유전자(transgene)의 재-도입은 단지 배가 시간(doubling time) 감소를 가져올 뿐 아니라, IVC는 야생형 수준 또는 심지어 그 이상으로 증가된다(도 1). 이러한 성장 향상 효과는 단지 2개의 상이한 DG44 세포주에서 관측될 뿐 아니라, 기능적 DHFR 유전자로 형질감염된 CHO DUKX B11 세포에도 적용된다. 그러나, 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 카세트를 지닌 발현 작제물을 사용한 형질감염은 세포 성장 특성에 있어서의 변화를 초래하지 않는다. 이는, 성장 향상이 안정한 형질감염체의 선택 및/또는 배양에 기인하는 것이 아니라, dhfr-음성 CHO 세포에서 기능적 DHFR 발현의 재-확립에 의해 유발됨을 나타낸다.
또한, DHFR의 이종 발현은 유전자량 효과를 나타내며, 이는 안정한 세포 서브클론의 성장 특성이 활성 DHFR 단백질의 발현에 대해 비례적으로 증가함을 의미한다(도 2a,b). 주목하면, 이러한 효과는, DHFR 유전자가 MTX 처리에 의해 증폭된 세포주에는 적용되는 것으로 여겨지지 않는다(참조: Gu et al, 1992, Pendse et al, 1992). 이는 추가의 성장 향상이 수득되지 않는 활성 DHFR 수준에서의 역치 또는 DHFR 효소의 분자 농도를 초과하는 높은 농도가 dhfr 유전자의 증폭을 능가하여 DHFR 활성에 있어서의 전체적인 감소 및 이로써 감소된 세포 성장을 초래할 억제제 MTX의 보상 효과를 지적할 수 있다.
본 발명은, 내인성 DHFR 발현이 낮거나 없는 세포주, 특히 생산 세포주의 성장을 향상시키는 일반적인 문제에 관한 것이다. 이러한 세포에서, 성장 특성은 DHFR의 이종 발현에 의해 현저히 개선될 수 있다.
dhfr-결핍성 숙주 세포에서 DHFR의 이종 발현은 발효의 확장 및 접종 과정 동안 감소된 기간(time frame), 증가된 IVC, 예를 들면, 생산 과정 및 이로써 보다 높은 생산물 수율을 가져오는 추가의 장점을 갖는다.
본 발명의 숙주 세포 및 방법은 또한 특히 CHO-CG44 또는 CHO-DUKX-B11계 숙주 세포 시스템을 사용하는 경우에, 생약제 생산에 적용가능하다. 또한, 이들은, 예를 들면 연구시 정제/구조적 분석을 위해 재조합 단백질의 높은 수율이 요구되거나, 예를 들면, 핵산 또는 단백질과 같은 세포 성분의 분리/조사를 위해 다량의 세포 생물량이 요구되는 경우 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 숙주 세포 및 방법은 글루타민 신테타제- (GS-) 시스템, 아데노신 데아미나제(ADA), 사이토신 데아미나제(CDA), 퓨로마이신, 네오마이신, 블레오마이신 등과 같은 선택 시스템(들)과 합해질 수 있다. 이는 발효 과정 동안 보다 높은 성장률 및 보다 높은 세포 밀도를 초래할 수 있다.
본 발명은 선행 기술로부터 자명하지 않다.
CHO 세포는 1957년(참조: PUCK, 1957)에 체세포 유전학의 연구를 위해 확립되었다. 원래의 K1 세포주를 돌연변이시킴에 의해, 우를라우브(Urlaub)와 차신(Chasin)은 DHFR-결핍성 "CHO DG44" 세포를 개발하였으며(참조: Urlaub and Chasin, 1980), 당해 세포는 염색체 dhfr-유전자 자리의 동종접합성 결실을 나타낸다(참조: Urlaub et al., 1983). 이러한 새로이 확립된 세포주의 성장 특성은 저자에 의해 조사되지 않았다.
CHO DG44 세포는 관심 유전자(GOI)에 대한 발현 카세트와 함께 기능적 dhfr 유전자를 수반하는 발현 벡터를 사용한 형질감염을 위한 선택방법이 되었다. DHFR 은 비-우성적 선택 마커이므로 DHFR을 결여하는 세포에서 가장 많이 사용된다. 그러나, 이는 또한 예를 들면, 제2 우성 마커(참조: Kaufman et al ., 1986), 또는 돌연변이체 또는 세균성 dhfr 유전자(참조: Simonsen and Levinson, 1983; Asselbergs and Widmer, 1995)를 사용하여 선택함으로써 내인성 DHFR 활성을 함유하는 숙주 세포에서 적용가능함이 밝혀졌다.
선택 조건하에서, 이종 DHFR 발현은 형질감염된 세포가 생존하여 증식할 수 있도록 한다. 그러나, DHFR이 선택 마커로서 및 비-선택적 조건하에 이의 기능과는 독립적인 성장 장점을 부여함은 밝혀지지 않았다.
dhfr 유전자는 증폭 마커에 속하며, 폴레이트 유사체 메토트렉세이트(MTX)로 처리한 후 외부 유전자의 공동-증폭(co-amplification)을 허용한다(참조: Schimke et al ., 1978; Alt et al ., 1978; Pallavicini et al ., 1990). dhfr과 함께 GOI의 공동-증폭이 이들 유전자 둘다가 동일한 플라스미드 상에 함유되어 있는 것과는 별개임이 결론적으로 명백하다(참조: Kaufman and Sharp, 1982). 결과적으로, 재조합체 항체 생산을 위한 발현 방법은, 하나의 쇄 만이 dhfr 발현 카세트와 기능적으로 커플링되거나(참조: Fouser et al ., 1992), dhfr이 별도의 공동-통합 플라스미드 상에서 암호화되어 있는(참조: Wurm and Jordan, 2003), 항체 쇄 둘다가 dhfr 유전자와 함께 동일한 DNA 플라스미드 상에 위치하는 경우에 보고되었다(참조: Page and Sydenham, 1991).
동일한 DNA 플라스미드 상에 dhfr 유전자와 GOI의 구조적 연결은, 상이한 공동-형질감염된 DNA 작제물이 인접한 염색체 위치내로 공동-통합되는 경향이 있기 때문에, 공동-증폭을 위한 필요조건이 아님을 나타내는 보고들이 존재한다(참조: Wurm,F.M. and Jordan,M. 2003. Gene Transfer and Gene Amplification in Mammalian Cells. In: Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, ed. S.C.Makrides Elsevier Science B.V., 309-335). 또한, 당해 보고서에서, DHFR은 구조적 분리에도 불구하고 기능적 연결을 구성하는 외부 GOI에 대한 선택 및/또는 증폭 마커로서 역할을 함을 주목하는 것이 중요하다.
대조적으로, 본 발명은, 이종 DHFR이, GOI에 대한 선택-/증폭 마커로서의 이들의 잘 알려진 기능 외에도, 세포 성장을 증진시키는데 있어서 완전히 별개의 기능을 발휘한다는 관측을 기초로 한다.
흥미롭게도, 높은 DHFR 발현과 감소된 세포 성장을 연결함으로써 이종 유전자 증폭의 바람직한 효과에 반하는 다수의 보고서들이 존재한다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)를 사용한 앞서의 연구는, 증폭된 dhfr 유전자 카피 수가 특정 성장률에 있어서의 감소를 동반하였음을 입증하였다(참조: Bailey et al, 1986). 구(Gu) 등은 MTX 처리에 의해 dhfr-유전자 증폭 후 CHO-DG44 세포를 발현하는 베타-갈락토시다제에 있어서의 감소된 성장률을 나타내었다. 유사한 데이터가 DHFR에 커플링된 바이러스 트랜스유전자를 사용하여 펜드세(Pendse) 등에 의해 밝혀졌다(참조: Pendse et al, 1992). 중요하게도, 연구들 둘다는 DHFR 만을 발현하는 세포를 포함하지 않았으며 사용된 다수의 사용된 트랜스유전자의 개개의 기여에 대해 결론짓는 것을 방지하였다. 중요하게도, 이들은 단지 dhfr을 발현하는 증폭된 세포 및 증폭되지 않은 세포의 성장 특성을 비교하였다. 형질감염되지 않은 CHO-DG44는 포함되지 않았다. 스나프카(Snapka) 등은, NIH3T3-기원 세포에서 dhfr 유전자 카피 수가 증가된 세포의 성장에 있어서의 감소를 입증하였다(참조: Snapka et al, 1997). 흥미롭게도 및 이들의 제안된 메카니즘과는 대조적으로, 이들은 또한 MTX-매개된 dhfr 증폭 후 보다 높은 세포 밀도로 성장한 다른 부착 세포주를 나타내었다. 이들은 현탁액에서 성장하는 세포에 대한 관련성이 없는 감소된 접촉 억제에 대한 이러한 효과에 기여하였다.
종합하면, 본 발명에서는 최초로, DHFR의 이종 발현이 CHO 세포, 특히 CHO DG44 및 CHO DUXX-(B11) 세포에 있어서 성장 특성의 증진을 초래함을 입증하였다. DHFR의 이러한 작용을 또한 사용하여 다른 dhfr-음성 또는 dhfr-감소된 세포주에서 세포 성장률을 향상시킬 수 있다.
도 1: 이종 DHFR에 의한 증진된 성장
(a) 공급 배치 과정(fed-batch process)에서 세포 성장 곡선. 세포를 5일 동안 진탕-플라스크 속에서 성장시키고 3일째부터 24시간마다 영양을 공급하였다. 생 세포 수를 매일 CEDEX 시스템을 사용하여 측정하였다. 다음 세포를 비교하였다: 야생형(WT) CHO 세포(-●-; n=4); dhfr-음성 DUX-B11 (-△-; n=2) 및 상이한 공급원으로부터의 2개의 DG44 세포주(-■-; n=4); DG44 세포 혼주물을 네오마이신(n=6, 데이터는 나타내지 않음) 또는 퓨로마이신((n=6, 데이터는 나타내지 않음) 내성 유전자 또는 dhfr 유전자(-◆-, n=9)를 지닌 벡터로 안정하게 형질감염시켰다. 5개의 별도의 실험의 대표적인 성장 곡선을 나타낸다.
(b) (a)에서 나타낸 세포의 상대적인 IVC. 5일째에 전체 세포 면적을 계산하여 100%로 설정한 WT 수준에 대해 상대적으로 플롯팅하였다. 오차 막대는 적어도 3개의 독립된 실험의 표준 편차를 나타낸다.
(c) 장기간 배양 동안 성장 특성. 세포를 0.3 내지 2.5 E06 세포/ml의 세포 밀도에서 유지시키고 8회의 계대배양에 걸쳐 2 내지 3일마다 분할하였다. 성장률(검정색 막대) 및 배가 시간(빗금친 막대)을 계산하여 야생형 CHO, DG44 및 dhfr-형질감염된 DG44 세포에 대해 플롯팅하였다.
도 2: 용량-의존성 성장 향상
(a) DHFR-형질감염된 서브클론에서 향상된 세포 성장. 6개의 안정한 DHFR-형질감염된 세포 혼주물을 DHFR 발현 카세트의 CHO DG44 세포내로의 이종 도입에 의해 생성시켰다. 이로부터, 클로날 세포 집단을 FACS-계 단일-세포 클로닝으로 수득하고 공급 배치 발효에 적용시켰다. 6일째에 DHFR 클론의 IVC를 계산하고 1로 설정한 모 DG44 세포주의 IVC에 대해 상대적으로 플로팅하였다.
(b) 상대적인 DHFR 발현. 총 RNA를 위에서 언급한 세포로부터 분리하고 정량적인 실시간 PCR을 수행하여 DHFR-특이적인 mRNA 전사체를 측정하였다. 베타-튜불린을 정규화에 사용하였다.
정의
일반적인 양태에서 "포함하는" 또는 "포함한"은 보다 특수한 양태인 "~으로 이루어진"을 포함한다. 또한, 단일 및 다수 형태가 제한된 방식으로 사용되지 않는다.
본 발명의 과정중에 사용된 용어들은 다음 의미를 갖는다:
용어 "DHFR-결핍성"은 "DHFR-음성"과 동일한 의미를 갖는다. 이는 DHFR 효소를 기능적으로 발현하지 않는 세포를 기술한다. 이는 DHFR 유전자의 동종접합 결실 또는 돌연변이에 의해 유발될 수 있다.
용어 "DHFR-감소된"은 낮은 내인성 DHFR 수준을 갖는 세포, 예를 들면, DHFR 유전자에 대해 이종접합인 세포를 의미한다.
용어 "시간에 걸친 전체 생 세포 농도(IVC)"는 시간에 걸쳐 플롯팅된 세포의 성장 곡선 아래의 면적을 의미하며 예를 들면, 수일 내지 수주에 걸쳐 수행된 생산 과정에서 세포의 성장 수행력을 기술하기 위해 일반적으로 사용된 매개변수이다.
용어 "세포 배양물"은 세포의 성장에 적합한 조건하에 하나의 용기 속에서 배양된 다수의 세포를 의미한다.
본 발명의 의미에서 "숙주 세포"는 햄스터 세포와 같은 세포, 바람직하게는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1, 및 CHO-DG44 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/후손이다. CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21이 특히 바람직하며, CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 보다 더 바람직하다. 본 발명의 추가의 양태에서, 숙주 세포는 또한 흑색종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/후손을 의미한다. 본 발명의 의미에서 사용될 수 있는 쥐 및 햄스터 세포의 예는 또한 표 1에 요약되어 있다. 그러나, 이들 세포의 유도체/후손, 사람, 마우스, 랫트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는 기타 포유동물 세포, 또는 효모, 곤충 및 식물세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵 세포 또한 본 발명의 의미에서, 특히 생약제 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다.
햄스터 및 쥐 생산 세포주
세포주 주문 번호
NS0 ECACC No. 85110503
Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-1581
BHK21 ATCC CCL-10
BHK TK- ECACC No. 85011423
HaK ATCC CCL-15
2254-62.2 (BHK-21 유도체) ATCC CRL-8544
CHO ECACC No. 8505302
CHO-K1 ATCC CCL-61
CHO-DUKX (= CHO duk-, CHO/dhfr-) ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B11 ATCC CRL-9010
CHO-DG44 Urlaub et al., Cell 33[2], 405-412, 1983
CHO Pro-5 ATCC CRL-1781
V79 ATCC CCC-93
B14AF28-G3 ATCC CCL-14
CHL ECACC No. 87111906
무혈청 조건하에서 및 임의로 동물 기원의 특정 단백질/펩타이드가 없는 배지속에서 확립되고, 적응되어 완전히 배양된 경우, 숙주 세포가 가장 바람직하다. 햄스 F12(Ham's F12)[제조원: 시그마(Sigma), 독일 다이센호펜 소재], RPMI-1640(제조원: 시그마), 둘베코스 개질된 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM; 제조원: 시그마), 최소 필수 배지(MEM; 제조원: 시그마), 이스코브 개질된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM; 제조원: 시그마), CD-CHO[제조원: 인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드 소재], CHO-S(제조원: 인비트로젠), 무혈청 CHO 배지(제조원: 시그마) 및 단백질 미함유 CHO 배지(제조원: 시그마)가 예시적으로 적절한 영양 용액이다. 임의의 배지는 경우에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염(예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충제(예를 들면, HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들면, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코즈 또는 기타 동일한 에너지 공급원, 항생제, 미량 성분으로 예시되는 각종 화합물로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수적인 보충물도 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 본 발명에서, 무혈청 배지의 사용이 바람직하나, 적합한 양의 혈청이 보충된 배지도 또한 숙주 세포의 배양에 사용될 수 있다. 선택가능한 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 세포의 성장 및 선택을 위해, 적절한 선택제를 배양 배지에 가할 수 있다.
용어 "단백질"은 아미노산 잔기 서열 또는 폴리펩타이드와 상호교환적으로 사용되며 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 말한다. 이들 용어들은 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화 또는 단백질 프로세싱을 포함하나, 이에 한정되지 않는 반응을 통해 해독후에 변형된 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은, 분자가 자체의 생물학적 작용 활성을 유지하는 동안 폴리펩타이드의 구조내에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환은 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산 암호화 서열내에서 이루어질 수 있으며 유사한 특성을 가진 단백질이 수득될 수 있다.
관심 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 갖는 발현 벡터는 또한 선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다.
용어 "선택적 조건"은 상응하는 선택 마커를 함유하지 않는 세포의 성장 또는 생존을 허용하지 않는 조건을 말한다. 선택적인 조건은 항생제와 같은 첨가제를 함유하거나 필수적인 성장 성분들을 결여하고 있는 배지를 사용하여 생성할 수 있다.
용어 "선택가능한 마커" 또는 "선택 마커"는 선택적 조건하에서 세포의 성장/생존을 허용하는 마커에 사용된다. 선택가능한 마커 퓨로마이신 N-아세틸 트랜스퍼라제(PAC)의 예에서, PAC 유전자를 함유하는 세포만이 항생제 퓨로마이신을 함유하는 선택 배지 속에서 생존할 것이다.
용어 "증폭가능한 마커" 또는 "증폭 마커"는 선택제의 존재하에 또는 선택제[예: 메토트렉세이트(MTX)]로 처리시 증폭되어(예를 들면, 2배, 3배, 수배), 마커(예: DHFR)의 유전자 카피 수 및 주변 DNA 영역을 증가시키는 유전자에 사용된다.
"선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자"는 일반적으로 상기 조건하에서 진핵 세포의 성장에 요구되는 효소를 암호화한다. 예를 들어, 선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자는 선택제, 메토트렉세이트(MTX)의 존재하에 이로 형질감염된 숙주 세포가 성장하는 경우 증폭되는 DHFR을 암호화할 수 있다. 표 3에서 비-제한적인 예시적 선택가능한 유전자도 또한 증폭가능한 마커 유전자이며, 이는 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 표 3에 나열된 선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자의 고찰의 위해서는, 참조로 인용된 문헌[참조: Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990)]을 참고한다. 따라서, 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 유전적으로 변형된 숙주 세포는 본 발명에 포함되며, 여기서, 선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(HDFR), 글루타민 신테타제, CAD, 아데노신 데아미나제, 아데닐레이트 데아미나제, UMP 신테타제, IMP 5'-데하이드로게나제, 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, HGPRTase, 티미딘 키나제, 티미딜레이트 신테타제, P 당단백질 170, 리보뉴클레오타이드 리덕타제, 아스파라긴 신테타제, 아르기노석시네이트 신테타제, 오르니틴 데카복실라제, HMG CoA 리덕타제, 아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제, 트레오닐-tRNA 신테타제 또는 Na+K+-ATPase의 작용을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
바람직한 선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자는 퓨린의 생합성에 필수적인 디하이드로폴레이트 리덕타제(HDFR)를 암호화하는 유전자이다. DHFR 유전자를 결여하고 있는 세포는 퓨린을 결여하고 있는 배지에서 성장하지 않을 것이다. 따라서, DHFR 유전자는 퓨린을 결여하고 있는 배지 속에서 성장하는 이러한 세포 속에서 유전자를 선택하고 증폭시키기 위한 우성 선택가능 마커로서 유용하다. DHFR 유전자와 함께 사용된 선택제는 메토트렉세이트(MTX)이다.
용어 "DHFR 유전자" 또는 "dhfr"은 활성인 디하이드로폴레이트 리덕타제 단백질을 암호화하는 임의의 핵산을 의미한다. 이는 하나 이상의 인트론, cDNA 서열 또는 DHFR 조절 서열 및 암호화 서열과 함께 인트론을 포함하거나 포함하지 않는, 소위 "미니유전자(minigene)"를 함유하는 게놈 DHFR 서열을 포함한다.
선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자
선택가능하고 증폭가능한 마커 유전자 등록 번호 선택제
디하이드로폴레이트 리덕타제 M19869 (햄스터) E00236 (마우스) 메토트렉세이트 (MTX)
메탈로티오네인 D10551 (햄스터) M13003 (사람) M11794 (랫트) 카드뮴
CAD (카바모일-포스페이트 신테타제:아스파르테이트 트랜스카르바밀라제:디하이드로오로타제) M23652 (햄스터) D78586 (사람) N-포스포아세틸-L-아스파르테이트
아데노신 데아미나제 K02567 (사람) M10319 (마우스) Xyl-A- 또는 아데노신, 2' 데옥시코포르마이신
AMP (아데닐레이트) 데아미나제 D12775 (사람) J02811 (랫트) 아데닐, 아자세린, 코포르마이신
UMP 신타제 J03626 (사람) 6-아자우리딘, 피라조푸란
IMP 5' 데하이드로게나제 J04209 (햄스터) J04208 (사람) M33934 (마우스) 마이코페놀산
크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 X00221 (이.콜라이) 크산틴이 제한된 마이코페놀산
돌연변이체 HGPRTase 또는 돌연변이체 티미딘 키나제 J00060 (햄스터) M13542, K02581 (사람) J00423, M68489(마우스) M63983 (랫트) M36160 (헤르페스바이러스) 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT)
티미딜레이트 신테타제 D00596 (사람) M13019 (마우스) L12138 (랫트) 5-플루오로데옥시우리딘
P-당단백질 170 (MDR1) AF016535 (사람) J03398 (마우스) 다중 약물, 예를 들면, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 콜히친
리보뉴클레오타이드 리덕타제 M124223, K02927 (마우스) 아피디콜린
글루타민 신테타제 AF150961 (햄스터) U09114, M60803 (마우스) M29579 (랫트) 메티오닌 설폭스이민(MSX)
아스파라긴 신테타제 M27838 (햄스터) M27396 (사람) U38940 (마우스) U07202 (랫트) β-아스파르틸 하이드록사메이트, 알비찐, 5' 아자사이티딘
아르기니노석시네이트 신테타제 X01630 (사람) M31690 (마우스) M26198 (소) 카나바닌
오르니틴 데카복실라제 M34158 (사람) J03733 (마우스) M16982 (랫트) α-디플루오로메틸오르니틴
HMG-CoA 리덕타제 L00183, M12705 (햄스터) M11058 (사람) 콤팩틴
N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 M55621 (사람) 투니카마이신
트레오닐-tRNA 신테타제 M63180 (사람) 보렐리딘
Na+K+-ATPase J05096 (사람) M14511 (랫트) 오우아바인
선택가능한 증폭 마커로서 DHFR 암호화 유전자를 사용하기에 적합한 숙주 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 쥐 흑색종 또는 햄스터 세포이다. DHFR 활성이 결여된 CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) 및 CHO-DG44(참조: Urlaub et al., Cell 33[2], 405-412, 1983) 세포가 보다 바람직하다. DHFR 증폭 방법을 다른 세포 유형으로 확장시키기 위해서는, 메토트렉세이트에 대해 민감성이 감소된 단백질을 암호화하는 돌연변이체 DHFR 유전자를 내인성 야생형 DHFR 유전자의 정상의 수를 함유하는 숙주 세포와 함께 사용할 수 있다(참조: Simonsonet al., 1983; Wigler et al., 1980; Haberet al., 1982).
본 발명은 생약제 폴리펩타이드/단백질의 생산을 위한 숙주 세포를 생성시키기에 적합하다. 본 발명은, 세포 생산성이 향상된 세포에 의한 다수의 상이한 관심 유전자의 고-수율 발현에 특히 적합하다.
"관심 유전자(GOI)", "선택된 서열", 또는 "생성물 유전자"는 본원에서 동일한 의미를 가지며 용어 "원하는 생성물"에 의해 언급된 "관심 단백질" 또는 관심 생성물을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 선택된 서열은 완전한 길이이거나 절두된(truncated) 유전자, 융합체 또는 태그된 유전자일 수 있으며 cDNA, 게놈성 DNA 또는 DNA 단편, 바람직하게는 cDNA일 수 있다. 이는 본래의 서열, 예를 들면, 천연적으로 존재하는 형태(들)일 수 있거나 경우에 따라 돌연변이되거나 또한 변형될 수 있다. 이들 변형은 코돈 최적화를 포함함으로써 선택된 숙주 세포, 사람화 또는 태깅(tagging)에서 코돈 사용을 최적화한다. 선택된 서열은 분비된, 세포질성, 핵성, 막 결합된 또는 세포 표면 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
"관심 단백질"은 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편, 펩타이드를 포함하며, 이들 모두는 선택된 숙주 세포내에서 발현될 수 있다. 원하는 단백질은 예를 들면, 항체, 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편, 및 효능제 또는 길항제로 제공될 수 있고/있거나 치료적 또는 진단적 용도를 지닌 임의의 다른 폴리펩타이드일 수 있다. 원하는 단백질/폴리펩타이드에 대한 예가 또한 하기에 제공된다. 모노클로날 항체와 같은 보다 복잡한 분자의 경우에, GOI는 2개의 항체 쇄 중 하나 또는 둘다를 암호화한다.
"목적 생성물"은 또한 안티센스 RNA일 수 있다.
관심 단백질 또는 원하는 단백질은 위에서 언급한 것들이다. 특히, 원하는 단백질/폴리펩타이드 또는 관심 단백질은 예를 들면, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, hGH, tPA, 인터루킨(IL), 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마와 같은 종양 괴사 인자(TNF), TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF와 같은 사이토카인이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한 에리트로포이에틴 또는 임의의 다른 호르몬 성장 인자의 생산이 또한 포함된다. 본 발명에 따른 방법은 또한 항체 또는 이의 단편을 생산하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 단편은 예를 들면, Fab 단편(단편 항원-결합 = Fab)을 포함한다. Fab 단편은 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는 쇄 둘다의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 예를 들면 파파인을 사용한 프로테아제 분해에 의해 통상의 항체로부터 형성될 수 있으나, 유사한 Fab 단편도 한편 유전 공학에 의해 생산될 수 있다. 또한 항체 단편은 F(ab')2 단편을 포함하며, 이는 펩신을 사용한 단백질분해적 절단으로 제조할 수 있다.
관심 단백질은 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 바람직하게 회수되거나 분비 시그날의 부재하에 발현된 경우 숙주 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 다른 재조합체 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 관심 단백질의 실질적으로 균질한 제제가 수득되도록 하는 방식으로 관심 단백질을 정제하는 것도 필수적이다. 제 1 단계로서, 세포 및/또는 입자화된 세포 파편을 배양 배지 또는 분해물로부터 회수한다. 이후에 목적 생성물을 오염된 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터, 예를 들면, 면역친화성 또는 이온-교환 컬럼상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 세파덱스 크로마토그래피, 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지상에서 크로마토그래피에 의해 정제한다. 일반적으로, 숙주 세포에 의해 이종 발현된 단백질을 정제하는 방법을 숙련가에게 교시하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 둘다 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Harris and Angal, Protein Purification Methods, in Rickwood and Hames eds., The Practical Approach Series, IRL Press (1995) 또는 Robert Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag (1988)]에 기술되어 있다.
유전 공학 방법을 사용하여 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역으로만 이루어진 짧아진 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편(가변성 단편 = 가변성 부위의 단편)으로 언급된다. 이러한 Fv-단편은 불변 쇄의 시스테인에 의해 2개 쇄의 공유 결합을 결실하고 있으므로, Fv 단편은 흔히 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 예를 들면, 10 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 15개 아미노산의 짧은 펩타이드 단편으로 연결하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 방식에서 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일쇄 펩타이드가 수득된다. 이러한 유형의 항체 단백질은 단일쇄 Fv(scFv)로 공지되어 있다. 당해 분야로부터 공지된 이러한 유형의 scFv-항체 단백질의 예는 문헌[참조: Huston et al. (1988, PNAS 16: 5879-5883]에 기술되어 있다.
최근에, 다량체성 유도체로서 scFv를 제조하기 위한 각종 방법이 개발되고 있다. 이는 특히 약력학 및 생분포 특성이 개선되고 결합력(binding avidity)이 증가된 재조합체 항체를 이끄는 것으로 의도된다. scFv의 다량체화를 달성하기 위하여, scFv를 다량체화 도메인과의 융합 단백질로서 제조하였다. 다량체화 도메인은 예를 들면, 루이신-지퍼(Leucin-zipper) 도메인과 같이 코일된 코일 구조(coiled coil structure: 나선형 구조) 또는 IgG의 CH3 영역일 수 있다. 그러나, scFv의 VH/VL 영역 사이에서의 상호작용을 다량체화(예를 들면, 디아-, 트리- 및 펜타바디)에 사용하는 방법 또한 존재한다. 디아바디란, 숙련가들에게는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자내 링커를 5 내지 10개 아미노산으로 짧게 하는 것은 동종이량체의 형성을 가져오며, 여기서, 쇄내 VH/VL-중첩이 발생한다. 디아바디는 추가로 디설파이드 브릿지의 혼입에 의해 안정화될 수 있다. 선행 분야로부터 디아바디-항체 단백질의 예는 문헌[참조: Perisic et al. (1994, Structure 2: 1217-1226)]에서 찾을 수 있다.
미니바디란, 숙련가에게는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. 이는 면역글로불린의 CH3 영역, 바람직하게는, IgG, 보다 바람직하게는 IgG1을 scFv에 힌지 영역(예를 들면, 또한 IgG1으로부터) 및 링커 영역을 통해 연결되어 있는 이량체화 영역으로서 함유하는 융합 단백질로 이루어져 있다. 선행 분야로부터 미니바디-항체의 예는 문헌[참조: Hu et al. (1996, Cancer Res. 56: 3055-61)]에서 찾을 수 있다.
트리바디란, 숙련가에게는 3가 동종삼량체성 scFv 유도체를 의미한다(참조: Kortt et al. 1997 Protein Engineering 10: 423-433). VH-VL이 링커 서열의 부재하에 직접 융합된 scFv 유도체가 삼량체의 형성을 가져온다.
숙련가는 또한 이가-, 삼가- 또는 사가 구조를 갖고 scFv로부터 기원한 소위 미니항체에 친숙할 것이다. 다량체화는 이량체성-, 삼량체성- 또는 사량체성 코일된 코일 구조에 의해 수행된다[참조: Pack et al., 1993 Biotechnology 11:, 1271-1277; Lovejoy et al. 1993 Science 259: 1288-1293; Pack et al., 1995 J. Mol. Biol. 246: 28-34).
정의에 의해 세포내로 도입된 임의의 서열 또는 유전자는, 도입된 서열 또는 유전자가 숙주 세포내의 내인성 서열 또는 유전자와 동일하더라도, 숙주 세포와 관련하여, "이종 서열" 또는 "이종 유전자" 또는 "트랜스유전자"로 불린다.
이종 유전자 서열은 "발현 벡터", 바람직하게는 진핵세포성, 및 심지어 보다 바람직하게는 포유동물 발현 벡터를 사용함에 의해 표적 세포내로 도입될 수 있다. 벡터를 작제하는데 사용된 방법은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며 각종 문헌에 기술되어 있다. 특히 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그날, 선택 마커, 복제 오리진 및 스플라이싱 시그날과 같은 작용성 성분의 기술을 포함하는, 적합한 벡터를 작제하기 위한 특수 기술은 문헌(참조: Sambrook et al., 1989) 및 이들 문현에 인용된 문헌들에서 고찰된다. 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 인공/미니-염색체, 또는 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 단성 바이러스, 레트로바이러스, 박테리오파지와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 진핵세포 발현 벡터는 통상적으로 또한 세균 속에서 벡터의 증식을 촉진시키는 원핵세포 서열, 예를 들면, 복제 오리진 및 세균속에서 선택을 위한 항생제 내성 유전자를 함유할 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 작동적으로 연결될 수 있는 클로닝 부위를 포함하는, 각종의 진핵세포 발현 벡터가 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 이들 중 일부는 스트라타젠(Stratagene, 캘리포니아주 라 졸라 소재); 인비트로겐(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스바드 소재); 프로메가(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 비디 바이오사이언시즈 클론테크(BD Biosciences Clontech, 캘리포니아주 팔로 알토 소재)와 같은 회사로부터 상업적으로 입수가능하다.
바람직한 양태에서, 발현 벡터는 목적 펩타이드/폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 해독에 필수적인 조절 서열인 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 숙주 세포내에서 이종 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 말한다. 숙주 세포내에서 원하는 생성물/관심 단백질의 발현 수준은 세포내 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 본 예에서와 같이 선택된 서열에 의해 암호화된 바람직한 폴리펩타이드/관심 단백질의 양을 기준으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 원위치 하이브리드화 또는 PCR에 의해 정량화할 수 있다(참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987 updated). 선택된 서열에 의해 암호화된 단백질은 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사면역검정, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성에 대한 검정, 단백질의 면역염색에 이은 FACS 분석(참조: Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987 updated) 또는 균일 시간 분해 형광(homogeneous time-resolved fluorescence: HTRF) 검정에 의해 다양한 방법으로 정량화할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 사용한 진핵 숙주 세포의 "형질감염"으로 유전적으로 변형된 세포 또는 유전자삽입 세포를 생성하는 것은 당해 분야에 익히 공지되고 문헌(참조: Sambrook et al., 1989 또는 Ausubel et al., 1987 updated)에 기술된 어떠한 방법으로도 수행할 수 있다. 형질감염 방법은 리포좀-매개된 형질감염, 인산칼슘 공동-침전, 전기영동, 다양이온(DEAE-덱스트란)-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 바이러스 감염 및 미세주사를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 형질감염은 안정한 형질감염이다. 특정 숙주 세포주 및 유형에서 이종 유전자의 최적 형질감염 횟수 및 발현을 제공하는 형질감염 방법이 선호된다. 적합한 방법은 통상의 과정으로 측정할 수 있다. 안정한 형질감염체를 위해, 작제물은 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/미니-염색체내로 통합시키거나 에피좀내에 위치시킴으로써 숙주 세포내에 안정하게 유지시킬 수 있다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야의 숙련가의 기술내에 있는 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학 등의 통상의 기술을 사용할 것이다. 이들 기술은 현재의 문헌에 완벽하기 기술되어 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Presss (1995); Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Puhler ed., VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), 및 Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987)].
본 발명은, 상기 세포주의 DHFR 활성이 증가되어 있음을 특징으로 하는 세포주의 세포 성장을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 세포주가 DHFR-결여된 또는 DHFR-감소된 세포주임을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, DHFR을 암호화하는 유전자 및 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자(GOI)가 상기 세포주 내로 순차적으로 도입됨을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에서, 당해 방법은, DHFR 발현 카세트가 당해 순차적인 도입 단계동안 상기 세포내로 도입되는 유일한 포유동물 발현 단위임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특정 양태에서, 당해 방법은, 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자에 대한 선택이 메토트렉세이트(MTX)의 부재하에서 수행됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, DHFR의 유전자량이 증가됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 당해 방법은, 상기 세포주의 세포가 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 3개 카피의 DHFR 유전자를 함유함을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 당해 방법은, 상기 세포주의 세포가 적어도 5개, 적어도 10개 또는 적어도 25개의 DHFR 유전자 카피를 함유함을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특정 양태에서, 당해 방법은, DHFR의 발현 수준이 증가됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, DHFR의 발현 수준이 적어도 2배 증가됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, DHFR의 발현 수준이 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배 또는 20배로 증가됨을 특징으로 한다.
본 발명의 특정 양태에서, 당해 방법은, DHFR 활성이 이종 DHFR 유전자, DHFR 미니유전자, DHFR 돌연변이체 또는 상기 세포주와 다른 종으로부터의 DHFR 암호화 서열을 도입시킴에 의해 증가됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, 상기 세포주가 관심 유전자(GOI)로 이미 형질감염됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은 상기 세포주가 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포주임을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 세포주가 CHO-DG44 또는 CHO-DUKX-B11, 바람직하게는 CHO-DG44임을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에서, 당해 방법은 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자에 대한 선택이 하이포크산틴 및 티미딘(HT)의 존재 및 MTX의 부재하에 수행됨을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특정 양태에서, 당해 방법은, DHFR이 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자와는 별개의 플라스미드상에서 세포주내로 형질감염됨으로써 DHFR이 관심 유전자에 대한 선택 및/또는 증폭 마커로서 역할을 하지 않음을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, DHFR을 함유하는 플라스미드가 관심 유전자를 함유하는 플라스미드와 순차적으로 또는 동시에 형질감염됨을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은 DHFR을 함유하는 플라스미드가 관심 유전자를 함유하는 플라스미드와 순차적으로 형질감염됨을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 상기 세포주가 DHFR 이외의 선택 마커에 기능적으로 커플링된 관심 유전자를 함유하는 제1 플라스미드로 이미 형질감염되어 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, 상기 세포주가 글루타민 신테타제(GS), 아데노신 데아미나제(ADA) 또는 사이토신 데아미나제(CDA)와 같은 적어도 하나의 다른 증폭 마커 및 이종 DHFR을 함유함을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 당해 방법은, 상기 세포주가 이종 DHFR 및 GS를 함유함을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특정 양태에서, 당해 방법은, 상기 세포주가 퓨로마이신, 네오마이신 또는 블레오마이신과 같은 적어도 하나의 다른 선택 마커 및 이종 DHFR을 함유함을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, 안정하게 형질감염된 세포가 관심 유전자에 기능적으로 커플링된 선택 마커를 사용함에 의해 선택됨을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, 안정하게 형질감염된 세포가 DHFR이 아닌 관심 유전자에 기능적으로 커플링된 선택 마커를 사용함에 의해 선택됨을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 상기 안정하게 형질감염된 세포주에 의해 도달된 세포 밀도가 상응하는 형질감염되지 않은 세포주보다 적어도 2배 더 높음을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
a. 숙주 세포를 DHFR 이외의 선택 및/또는 증폭 마커에 기능적으로 커플링된 적어도 하나의 제1 플라스미드 상의 원하는 생성물을 암호화하는 적어도 하나의 관심 유전자로 형질감염시키는 단계,
b. 단계 a에서와는 별개의 플라스미드 상에 위치한 DHFR 발현 카세트를 도입시키는 단계,
c. 단계 a의 선택 마커를 사용하여, 안정하게 형질감염된 세포를 선택하는 단계를 특징으로 하는 생산 숙주 세포주를 생성하는 방법에 관한 것이며, 이로써 상기 세포에 의해 도달된 성장 특징 및 세포 밀도는 상응하는 형질감염되지 않은 세포주보다 더 우수하고 더 높다.
바람직하게는, 본 발명은
a. DHFR-결여된 또는 DHFR-감소된 숙주 세포를, DHFR 이외의 선택 및/또는 증폭 마커에 기능적으로 커플링된 적어도 하나의 제1 플라스미드 상의 원하는 생성물을 암호화하는 적어도 하나의 관심 유전자로 형질감염시키는 단계,
b. 단계 a에서와는 별개의 플라스미드상에 위치한 DHFR 발현 카세트를 도입시키는 단계,
c. 단계 a의 선택 마커를 사용하여, 안정하게 형질감염된 세포를 선택하는 단계를 특징으로 하는 생산 숙주 세포주의 생성 방법에 관한 것이며, 이로써 상기 세포에 의해 도달된 성장 특징 및 세포 밀도는 상응하는 형질감염되지 않는 세포주보다 더 우수하고 더 높다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 단계 a 및 b의 순서가 바뀜을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 단계 a 및 b의 순서가 역전됨을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, DHFR이 단계 b 동안 상기 세포주내로 도입되는 유일한 포유동물 발현 단위임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 수득가능한 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 특정 양태에서, 당해 방법은, 세포가 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포임을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 세포가 CHO-DG44 또는 CHO-DUKX-B11임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
(a) 상기 기술한 방법 중 하나를 사용하여 관심 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 함유하는 숙주 세포를 생성시키는 단계,
(b) 세포를 당해 세포의 증식을 허용하는 조건하에 배양하는 단계,
(c) 예를 들면, 상청액으로부터 세포를 분리시킴에 의해, 관심 단백질을 수거하는 단계, 및
(d) 관심 단백질을 정제하는 단계를 특징으로 하는, 세포주, 예를 들면, 포유동물 세포주에서 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은
(a) 상기 기술된 방법 중 하나를 사용하여 관심 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 함유하는 숙주 세포를 생성시키는 단계,
(b) 세포를 당해 세포의 증식이 허용되는 조건하에 배양하는 단계,
(c) 예를 들면, 상청액으로부터 세포를 분리시킴에 의해, 관심 단백질을 수거하는 단계, 및
(d) 관심 단백질을 정제하는 단계를 특징으로 하는, DHFR-결여된 또는 DHFR-감소된 세포주, 예를 들면, 포유동물 세포주에서 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특정 양태에서, 당해 방법은, 관심 단백질이 분비되는 단백질임을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 당해 방법은, 세포가 세포내 또는 막 고정 단백질(membrane standing protein)을 암호화하는 트랜스유전자를 추가로 함유함을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 트랜스유전자가 DHFR 발현 카세트와 동일한 플라스미드 상에 위치함을 특징으로 한다.
본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 당해 방법은, 트랜스 유전자가 항-아폽토시스 유전자 또는 전사 인자를 암호화함을 특징으로 한다.
본 발명의 특수한 바람직한 양태에서, 방법/숙주 세포는, 이들이 현탁액 배양물에서 수행/성장됨을 특징으로 한다.
본 발명의 특수한 바람직한 양태에서, 방법/숙주 세포는, 이들이 무혈청 배양 배지에서 수행/성장됨을 특징으로 한다.
상기 일반적으로 기술된 본 발명은, 본 발명의 특정 양태를 단지 예시하기 위한 목적으로 본원에 포함되나 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조로 보다 용이하게 이해될 것이다.
재료 및 방법
세포 배양
생산 및 개발 규모에서 사용된 모든 세포주는 항온처리기[제조원: 터모(Thermo), 독일 소재] 또는 진탕 플라스크[제조원: 눈크(Nunc), 덴마크 소재] 속에서 표면-통기된 T-플라스크(제조원: 눈크, 덴마크 소재) 속에서 37℃의 온도로 5% CO2를 함유하는 대기 속에서 일련의 종균 배양물 속에 유지시킨다.
종균 배양물을 2 내지 3E5 세포/mL의 접종 밀도로 2 내지 3일마다 계대배양한다. 세포 농도는 혈구계를 사용함으로써 모든 배양물 속에서 측정한다. 생존성은 트리판 블루 배제 방법에 의해 평가한다. 모든 CHO 생산 세포를 BI-독점 배지(proprietary media) 속에서 배양하며 이의 성분은 공개되지 않을 수 있다.
공급 배치 배양
세포를 3E05 세포/ml에서 항생제 또는 MTX[제조원; 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich), 독일 소재]를 함유하지 않는 30ml의 BI-독점 생산 배지 속에서 125ml의 진탕 플라스크내로 접종한다. 배양물을 120 rpm에서 37℃ 및 3일 후 2%로 감소되는 5% CO2 속에서 교반시킨다. pH, pO2, pCO2, 글루코즈, 락테이트 및 글루타민 농도를 포함하는 배양 매개변수를 매일 측정하고 pH를 필요에 따라 NaCO3를 사용하여 pH 7.0으로 조절한다. BI-독점 공급물 용액을 24시간마다 30 ml/L*d에서 가한다. 세포 밀도 및 생존성은 자동화된 CEDEX 세포 정량화 시스템[제조원: 이노바티 스(Innovatis)]을 사용하여 트리판-블루 배제로 측정한다.
단일 세포 분류
펄스 프로세싱, 분류 향상 모듈 및 자동화 세포 침착 장치가 장착된 FACS 벤티지(Vantage([제조원: 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)] 유동 세포계산기를 분석 및 세포 분류에 사용한다. 전면 및 측면 스캐터(scatter)(FSC/SSC)의 도트 플롯 상에서 게이트를 단일의 생 세포 주변에 고정시킨다. 분류된 세포를 200μL의 성장 배지를 함유하는 96-웰 미세역가 플레이트내로 1개 세포/웰로 자동 세포 침착 장치를 사용하여 침착시킨다. 멸균 분류를 위해, 세포 분류기의 튜브를 세정하고 각각의 다음 용액을 1시간 동안 시스액(sheath fluid)으로서 공급하여 멸균시킨다: 0.1N NaOH; 0.1% 트리톤-X-100; 70% 에탄올. 후속적으로 PBS가 들어있는 멸균 시스 탱크를 세포 분류기에 연결한다.
RNA 분리 및 RT-PCR
성장하는 세포로부터의 RNA를 TRIzol® 시약[제조원: 인비트로겐, 독일 소재]을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 DNase I으로 30분 동안 37℃에서 처리함으로써 분리한다. 제1 쇄 cDNA 합성은 클로닝된 AMV 제1 쇄 cDNA 합성 키트(제조원: 인비트로겐, 독일 소재)를 사용하여 3㎍의 총 RNA와 올리고(dT) 올리고뉴클레오타이드로 출발함으로써 수행한다. dhfr 전사체 수준의 정량적 차이를 실시간 PCR에 의해 AbsoluteTM QPCR SYBR® 그린 플루오레세인 믹스(Green Fluorescein Mix)[제조원: 에이비젠(ABgene), 영국 서레이 소재] 및 MyIQ 실시간 검출 소프트웨어[제조원: 바이오라드(BioRad) 독일 소재]로 조절된 열 순환기를 사용하여 측정한다. 모든 실험을 3회 수행한다. DHFR-특이적인 증폭물을 생성하고 다음 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 튜불린 발현 수준에 대해 상대적으로 정량한다: dhfr(센스) 서열번호 1 5'-ATGGTTCGACCGCTGAACTGC-3'; dhfr(안티-센스) 서열번호 2 5'-CCACTGAGGAGGTGGTGGTCATT-3'; 튜불린(센스) 서열번호 3 5'-CTCAACGCCGACCTGCGCAAG-3' 및 튜불린(안티-센스) 서열번호 4 5'-ACTCGCTGGTGTACCAGTGC-3'.
실시예 1:
세포 성장을 향상시키는 이종 DHFR 발현
DHFR-결여된 CHO-DG44(참조: Urlaub & Chasin, Cell 33, 405-412; 1983) 및 CHO DUKX-B11(ATCC CRL-9010)을 퓨로마이신 및 네오마이신 각각에 대한 선택 마커를 지닌 DNA 작제물, 또는/및 DHFR 유전자용 발현 플라스미드로 안정하게 형질감염시킨다. 세포를 각각의 항생제(퓨로마이신 또는 제네티신)을 함유하는 배지 또는 HT가 없는 선택성 배지 속에서 선택한다.
생성된 안정한 세포 혼주물의 성장 특성은 종균 배양물 속에서 및 발효/생산 과정에 대한 확립된 다운-스케일 모델(down-scale model)을 나타내는 진탕 플라스크내에서 공급 배치 배양 동안 비교한다[참조: Liu C and Hong L; Biochem. Eng. J. (2001) 7:121-125].
놀랍게도, CHO-결여된 DG44 세포는 모 CHO 야생형(wt) 세포와 비교하여 강력하게 약화된 성장을 나타낸다(도 1). 공급 배치 배양물 속에서, 이들은 느리게 성장하며 보다 낮은 최대 세포 밀도에 도달하며(도 1a,b), 이는 종균 배양 동안 측정된 감소된 성장률과 일치한다(도 1c).
흥미롭게도, 이종 DHFR(서열번호 5+6) 발현에 의한 DG44 dhfr-/- 세포의 보상은 이러한 표현형을 완전하게 회복한다. DHFR-트랜스유전자의 재-도입은 배가 시간의 감소로 이어질 뿐 아니라, IVC가 야생형 수준 또는 그 이상으로 증가한다. 이러한 성장 향상 효과는 2개의 상이한 DG44 세포주에서 관측될 뿐 아니라, 또한 기능적 DHFR 유전자로 형질감염된 CHO DUKX B11 세포에도 적용된다. 그러나, 퓨로마이신 또는 네오마이신 내성 카세트를 지닌 발현 작제물을 사용한 형질감염은 세포 성장 특성의 변화를 초래하지 않는다. 이는, 성장 향상이 안정한 형질전환체의 선택 및/또는 배양에 기인하는 것이 아니라, dhfr-음성 CHO 세포에서 기능적 DHFR 발현의 재-확립에 의해 일어남을 나타낸다.
실시예 2:
용량-의존적 방식으로 세포 성장을 향상시키는 DHFR
DHFR의 재-도입에 의해 매개된 성장 효과가 용량 의존성인지를 시험하기 위하여, 서브클론을 발현하는 안정된 DHFR(서열번호 5+6)을 생성시키고 FACS-계 단일-세포 클로닝에 적용시켜 동종 DHFR 발현을 갖는 클론성 집단을 수득한다. 후속적 으로, 이들 DHFR 클론의 성장 특성을 공급 배치 발효 수행시 분석하였다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 서브클론으로 형질감염된 DHFR은 CHO-DG44 세포와 비교하여 훨씬 높은 IVC 수준에 도달하였으며, 차이는 6일내에 2.5 내지 6배의 범위였다.
상승된 IVC 수준이 향상된 DHFR 전사체 수준과 관련되는지에 대한 의문을 해결하기 위하여, 총 RNA를 DHFR 서브클론 및 모 CHO-DG44 세포주로부터 분리하고 정량적 PCR을 수행하여 DHFR 발현을 분석하였다(도 2b). 분석된 클론의 80% 이상에서, 측정된 IVC는 DHFR 발현의 강도와 높은 상관관계가 있었으며, 이는, 가장 높은 DHFR 전사체 수준을 가진 클론이 발효 과정에서 가장 높은 IVC를 나타내었음을 의미한다. 이들 데이터는, CHO-DG44 세포에서 이종 DHFR의 발현이 용량-의존적 방식으로 세포 성장을 증가시킴을 시사한다.
참고문헌 목록
Figure 112009051326448-PCT00001
Figure 112009051326448-PCT00002
Figure 112009051326448-PCT00003
<110> Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG <120> Improvement of cell growth <130> P01-2177 <150> EP 07101070.6 <151> 2007-01-24 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> dhfr (sense) <400> 1 atggttcgac cgctgaactg c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> dhfr (anti-sense) <400> 2 ccactgagga ggtggtggtc att 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tubulin (sense) <400> 3 ctcaacgccg acctgcgcaa g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> tubulin (anti-sense) <400> 4 actcgctggt gtaccagtgc 20 <210> 5 <211> 798 <212> DNA <213> Cricetulus sp. <400> 5 aatttcgcgc caaacttggg ggaagcacag cgtacaggct gcctaggtga tcgctgctgc 60 tgtcatggtt cgaccgctga actgcatcgt cgccgtgtcc cagaatatgg gcatcggcaa 120 gaacggagac cttccctggc caatgctcag gaacgaattc aagtacttcc aaagaatgac 180 caccacctcc tcagtggaag gtaaacagaa cttggtgatt atgggccgga aaacctggtt 240 ctccattcct gagaagaatc gacctttaaa ggacagaatt aatatagttc tcagtagaga 300 gctcaaggaa ccaccacaag gagctcattt tcttgccaaa agtctggacg atgccttaaa 360 acttattgaa caaccagagt tagcagataa agtggacatg gtttggatag ttggaggcag 420 ttccgtttac aaggaagcca tgaatcagcc aggccatctc agactctttg tgacaaggat 480 catgcaggaa tttgaaagtg acacgttctt cccagaaatt gatttggaga aatataaact 540 tctcccagag tacccagggg tcctttctga agtccaggag gaaaaaggca tcaagtataa 600 atttgaagtc tatgagaaga aaggctaaca gaaagatact tgctgattga cttcaagttc 660 tactgctttc ctcctaaaat tatgcatttt tacaagacca tgggacttgt gttggcttta 720 gatctatgag ttattctttc tttagagagg gatagttagg aagatgtatt tgttttgtgg 780 taccagagat ggaacctg 798 <210> 6 <211> 1047 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ggggcggggc cttagctgcg caagtggtac acagctcagg gctgcgattt cgcgccaaac 60 ttcacggcaa tcctagcgtg aaggctggta ggattttatc cccgctgcca tcatggttcg 120 accattgaac tgcatcgtcg ccgtgtccca aaatatgggg attggcaaga acggagaccg 180 accctggcct ccgctcagga acgagttcaa gtacttccaa agaatgacca caacctcttc 240 agtggaaggt aaacagaatc tggtgattat gggtaggaaa acctggttct ccattcctga 300 gaagaatcga cctttaaagg acagaattaa tatagttctc agtagagaac tcaaagaacc 360 accacgagga gctcattttc ttgccaaaag tttggatgat gccttaagac ttattgaaca 420 accggaattg gcaagtaaag tagacatggt ttggatagtc ggaggcagtt ctgtttacca 480 ggaagccatg aatcaaccag gccacctcag actctttgtg acaaggatca tgcaggaatt 540 tgaaagtgac acgtttttcc cagaaattga tttggggaaa tataaacttc tcccagaata 600 cccaggcgtc ctctctgagg tccaggagga aaaaggcatc aagtataagt ttgaagtcta 660 cgagaagaaa gactaacagg aagatgcttt caagttctct gctcccctcc taaagctatg 720 catttttata agaccatggg acttttgctg gctttagatc tatgagtaat tatttcttta 780 gggaggggta gttggaagaa ttgtttgttt tgtgatcttg gggatggaac ctaagaccca 840 gtgcgtgctg agcaaatgct atactgctga gccaccccaa ccctagcccc tatataattc 900 taaacaatat gttgtcattt cccagtaatc taacaaggta tagtaaaagt gccttaagaa 960 atgtcacttg ctataaaggt ctcagtgccc ctcccatgag acctcaagtc cccccccccc 1020 cccccccccc cccccccccc ccccccc 1047

Claims (34)

  1. 세포주의 DHFR 활성이 증가됨을 특징으로 하는, 세포주의 세포 성장을 증진시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포주가 DHFR-결여된 또는 DHFR-감소된 세포주인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, DHFR을 암호화하는 유전자 및 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자(GOI; gene of interest)가 세포주내로 순차적으로 도입되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, DHFR 발현 카세트가 상기 순차적인 DHFR 도입 단계 동안에 상기 세포주내로 도입되는 유일한 포유동물 발현 단위인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자에 대한 선택이 메토트렉세이트(MTX)의 부재하에 수행되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, DHFR의 유전자량이 증가되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주의 세포가 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 3개 카피의 DHFR 유전자를 함유하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, DHFR의 발현 수준이 증가되는 방법.
  9. 제8항에 있어서, DHFR의 발현 수준이 적어도 2배 증가되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, DHFR 활성이 이종 DHFR 유전자, DHFR 미니유전자, DHFR 돌연변이체 또는 상기 세포주와 다른 종으로부터의 DHFR 암호화 서열을 도입시킴에 의해 증가되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 관심 유전자(GOI)로 이미 형질감염된 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포주인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 세포주가 CHO-DG44 또는 CHO-DUKX-B11, 바람직하게는 CHO-DG44인 방법.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자에 대한 선택이 하이포크산틴 및 티미딘(HT)의 존재하에 및 MTX의 부재하에 수행되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, DHFR이 원하는 생성물을 암호화하는 관심 유전자와는 별개의 플라스미드상에서 세포주내로 형질감염됨으로써 DHFR이 상기 관심 유전자에 대한 선택 및/또는 증폭 마커로서 역할을 하지 않는 방법.
  16. 제15항에 있어서, DHFR을 함유하는 플라스미드가 관심 유전자를 함유하는 플라스미드와 순차적으로 또는 동시에 형질감염되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, DHFR을 함유하는 플라스미드가 관심 유전자를 함유하는 플라스미드와 순차적으로 형질감염되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 세포주가 DHFR 이외의 선택 마커에 기능적으로 커플링된 관심 유전자를 함유하는 제1 플라스미드로 미리 형질감염된 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 이종 DHFR 및 글루타민 신테타제(GS), 아데노신 데아미나제(ADA) 또는 사이토신 데아미나제(CDA)와 같 은 적어도 하나의 다른 증폭 마커를 함유하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 세포주가 이종 DHFR 및 GS를 함유하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 이종 DHFR 및 퓨로마이신, 네오마이신 또는 블레오마이신과 같은 적어도 하나의 다른 선택 마커를 함유하는 방법.
  22. 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 안정하게 형질감염된 세포가 관심 유전자에 기능적으로 커플링된 선택 마커를 사용함에 의해 선택되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 안정하게 형질감염된 세포주에 의해 도달된 세포 밀도가 상응하는 형질감염되지 않은 세포주보다 적어도 2배 더 높은 방법.
  24. (a) DHFR-결여되거나 DHFR-감소된 숙주 세포를, DHFR 이외의 선택 및/또는 증폭 마커에 기능적으로 커플링된 적어도 하나의 제1 플라스미드 상의 원하는 생성물을 암호화하는 적어도 하나의 관심 유전자로 형질감염시키는 단계,
    (b) 단계 a에서와는 별개의 플라스미드 상에 위치한 DHFR 발현 카세트를 도입시키는 단계, 및
    (c) 단계 a의 선택 마커를 사용하여, 안정하게 형질감염된 세포를 선택하는 단계를 특징으로 하며,
    이로써, 상기 세포에 의해 도달된 성장 특징 및 세포 밀도가 상응하는 형질감염되지 않은 세포주보다 더 우수하고 더 높은,
    생산 숙주 세포주를 생성시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 단계 a 및 b의 순서가 바뀌는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, DHFR이 단계 b 동안 상기 세포주내로 도입되는 유일한 포유동물 발현 단위인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 숙주 세포.
  28. 제27항에 있어서, 세포가 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포인 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 세포가 CHO-DG44 또는 CHO-DUKX-B11인 숙주 세포.
  30. (a) 관심 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 함유하는 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 생성시키는 단계,
    (b) 세포의 증식을 허용하는 조건하에 상기 세포를 배양하는 단계,
    (c) 예를 들면, 세포를 상청액으로부터 분리시킴에 의해, 관심 단백질을 수거하는 단계, 및
    (d) 상기 관심 단백질을 정제하는 단계
    를 특징으로 하는, DHFR-결여되거나 DHFR 감소된 세포주, 예를 들면, 포유동물 세포주내에서 단백질을 생산하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 관심 단백질이 분비되는 단백질인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 세포가 세포내 또는 막 고정 단백질(membrane standing protein)을 암호화하는 트랜스유전자(transgene)를 추가로 함유하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 트랜스유전자가 DHFR 발현 카세트와 동일한 플라스미드 상에 위치하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 트랜스유전자가 항-아폽토시스 유전자 또는 전사 인자를 암호화하는 방법.
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Class et al. Patent application title: PRODUCTION HOST CELL LINES Inventors: Hitto Kaufmann (Ulm, DE) Hitto Kaufmann (Ulm, DE) Lore Florin (Biberach, DE) Lore Florin (Biberach, DE) Eric Becker (Hochdorf, DE) Eric Becker (Hochdorf, DE) Joey M. Studts (Biberach, DE) Assignees: BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH & CO. KG

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