EA018099B1

EA018099B1 - Улучшение клеточного роста

Info

Publication number: EA018099B1
Application number: EA200900984A
Authority: EA
Inventors: Хитто Кауфманн; Лоре Флорин; Эрик Беккер
Original assignee: Бёрингер Ингельхайм Фарма Гмбх Унд Ко. Кг
Priority date: 2007-01-24
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2013-05-30
Also published as: WO2008090148A3; IL199639A0; IL199639A; BRPI0807798A2; NZ579204A; AU2008208862B2; EP2126061A2; CA2675344A1; HK1137482A1; AU2008208862A1; EA200900984A1; KR20090112725A; CN101589140B; WO2008090148A2; JP2010516264A; MX2009007790A; US20100086967A1; CN101589140A; US8535940B2; EP1953222A1

Abstract

Изобретение относится к области технологии культивирования клеток. В изобретении описан способ улучшения клеточного роста, прежде всего роста клеток-хозяев, которые продуцируют биофармацевтический продукт. В изобретении описан также способ получения белков с помощью клеток, созданных посредством описанного способа.

Description

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области технологии культивирования клеток. Оно относится к способу улучшения клеточного роста, а также к способу создания продуктивной линии клеток-хозяев. Изобретение относится также к способу получения белков с помощью клеток, созданных посредством описанного способа.

Известный уровень техники

Рынок биофармацевтических средств, предназначенных для применения в терапии человека, продолжает увеличиваться с высокой скоростью, при этом в 2003 г. в клинических условия прошли оценку 270 новых биофармацевтических средств, и их примерная стоимость составила 30 млрд (Асгпсг. 2004). В настоящее время все возрастающее количество биофармацевтических средств получают в клетках млекопитающих благодаря их способности осуществлять правильный процессинг и модификацию человеческих белков. Таким образом, успешное производство биофармацевтических средств в клетках млекопитающих с высоким выходом имеет решающее значение и зависит от характеристик рекомбинантной моноклональной клеточной линии, применяемой в этом процессе.

В процессах получения биофармацевтических продуктов выход определяется двумя факторами: удельная продуктивность (Р,_|)ес, клетки-хозяина и 1УС, общее количество жизнеспособных клеток в различные моменты времени, которые продуцируют требуемый белок. Эту корреляцию выражают следующей формулой: Υ = Р_8ресх1УС. Таким образом, стандартные подходы повышения выхода продукта могут быть основаны на повышении как производительной способности (продуктивности) клетки-хозяина, так и плотности жизнеспособных клеток в биореакторе. Один из путей повышения 1УС состоит в улучшении характеристик клеточного роста, что предусматривает создание клеток, которые растут быстрее, и повышение максимальной клеточной плотности.

Усиленный клеточный рост оказывает заметное воздействие на несколько аспектов процесса получения биофармацевтических продуктов:

укорачивает период размножения, что приводит к пролонгированному времени развития клеточной линии;

повышает эффективность после одноклеточного клонирования и замедляет последующий рост;

укорачивает временные рамки в процессе масштабного производства, прежде всего в случае инокулята для биоректора, предназначенного для крупномасштабного производства;

повышает выход продукта в течение времени ферментации в результате пропорциональной корреляции между 1УС и выходом продукта. И, наоборот, низкие уровни 1УС снижают выход и/или удлиняют время ферментации.

Фермент дигидрофолатредуктаза (ΌΗΡΚ) является одним из основных ферментов нуклеотидного синтеза. Он катализирует восстановление дигидрофолата с образованием тетрагидрофолата, универсального медиатора С1-единиц при синтезе конструктивных элементов пурина и других метаболических путях.

В производстве биофармацевтических продуктов и в академических исследованиях ΌΗΡΚ широко применяют в качестве маркера селекции и амплификации для выращивания в условиях селекции стабильно трансфектированных клеточных линий. При этом экспрессия ΌΗΡΚ. функционально связана с экспрессией представляющего интерес гена (СО1), например, в экспрессионной кассете для продукта гена. Таким образом, путем придания устойчивости к селективным условиям с помощью ΌΗΡΚ опосредованно увеличивают количество СО1-экспрессирующих клеток. Эту функцию, как правило, опосредуют/создают с помощью бицистронной экспрессии обоих генов или, по меньшей мере, их совместной локализации на одной и той же плазмиде.

Поскольку ΌΗΡΚ является не доминантным маркером, то эту систему в основном применяют в клетках, лишенных эндогенной ΌΗΡΚ-активности. С тех пор как в 1980 г. стали доступны бЫгнегативные клетка яичника китайского хомячка (СИО), такие как СИО-БС44 и ΤΉΟ-ΌυΚΧ (В11), они быстро превратились в наиболее предпочтительную систему клеток-хозяев и в настоящее время их наиболее часто применяют во всем мире в биофармацевтической индустрии в качестве производственной базы, основанной на клетках млекопитающих.

Фермент ΌΗΡΚ является одним из имеющих решающее значение ферментов в пути биосинтеза пуринов. Таким образом, клетки, в которых отсутствует ΌΗΡΚ, являются нежизнеспособными, если дефицит ΌΗΡΚ не компенсируют путем добавления нуклеотидных предшественников гипоксантина и тимидина (ΗΤ) в культуральную среду.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что даже в дополненной ΗΤ среде СЫОклетки, дефектные по бМг, растут существенно медленнее и имеют значительно меньшую плотность по сравнению с родительскими СЯО-клетками дикого типа (фиг. 1).

Указанная пониженная способность к росту, что продемонстрировано в настоящем изобретении для бЫг-негативных клеток (таких как клетки СВО-БС44) или клеток с очень низким уровнем эндогенного бЫг, оказывает отрицательное воздействие на некоторые аспекты получения биофармацевтических продуктов:

- 1 018099 удлиняет период размножения, что приводит к пролонгированному времени развития клеточной линии;

снижает эффективность после одноклеточного клонирования и замедляет последующий рост;

удлиняет временные рамки в процессе масштабного производства, прежде всего в случае инокулята для производственного ферментера, предназначенного для крупномасштабного производства;

снижает выход продукта в одном цикле ферментера.

Эти недостатки непосредственно связаны с характеристиками роста клеток-продуцентов (например, СНО-ОС44 или ЭиКХ (В11)). Они имеют место, например, когда эти клетки применяют в сочетании со следующими системами селекции и амплификации: система на основе глутаминсинтетазы (С8), неомицина, пуромицина, блеомицина и других.

Для компенсации дефицита роста в этих клетках, прежде всего применяемых для получения биофармацевтических средств клеточных линий, наибольшие усилия были направлены на улучшение культуральной среды путем введения способствующих росту добавок, таких как углеводы, нуклеозиды, микроэлементы, белковые гидролизаты, растительные экстракты и т.д. Можно, например, несколько повышать рост бЫг-негативных клеток путем добавления белковых гидролизатов в культуральную среду, но при этом не достигается уровень роста, характерный для клеток дикого типа.

Таким образом, существует большая необходимость в улучшении ростовых характеристик клетокхозяев, которые являются продуцентами, прежде всего клеток с низким уровнем экспрессии ΌΗΡΚ или клеток, у которых отсутствует эндогенная экспрессия ΌΗΡΚ, таких как клетки линии СНО-ОО44.

Кроме того, очевидно, что повышенный клеточный рост и в результате более высокий уровень ГУС в процессе ферментации имеет преимущество, когда требуется большая биомасса, например, для получения высокого выхода продукта при кратковременной ферментации, для сбора большего количества клеток для выделения, очистки или характеризации внутриклеточных или связанных с клеткой компонентов или для укорочения продолжительности периода размножения, одноклеточного клонирования и масштабного культивирования.

Краткое изложение сущности изобретения

Основной задачей, положенной в основу настоящего изобретения, является улучшения клеточного роста в процессе получения биофармацевтического продукта с целью увеличения клеточной плотности и в результате выхода продукта.

Эта задача согласно настоящему изобретению решается путем интродукции кассеты экспрессии ΌΗΡΚ. в клетки-продуценты. Таким образом, при создании изобретения неожиданно было установлено, что усиленный клеточный рост получают в результате гетерологичной экспрессии фермента дигидрофолатредуктазы (ΌΗΡΚ).

В настоящем изобретении ген ΌΗΡΚ не служит общепринятой цели в качестве маркера селекции для другого гена, т.е. представляющего интерес гена (СО1), а обладает независимой функцией повышения клеточного роста. В этом системе ген ΌΗΡΚ не требуется функционально связывать/сшивать с одной или несколькими другими кассетами экспрессии. Он может находиться на той же плазмиде, что и ОО1, или его можно экспрессировать из другого вектора. Если оба гена находятся в различных векторных конструкциях, плазмидами можно котрансфектировать клетку или их можно последовательно вносить в клетку.

При создании настоящего изобретения неожиданно впервые было установлено, что дефект бЫг приводит к пониженному клеточному росту. Таким образом, можно продемонстрировать, что реинтродукция ΌΗΡΚ может решать указанную проблему.

Реинтродукия ΌΗΡΚ-трансгена не только приводит к снижению времени дупликации, но также к увеличению ГУС до уровня дикого типа или даже сверх него (фиг. 1). Это усиливающее рост действие можно обнаруживать не только для двух различных клеточных линий ΌΟ44, но также для клеток линии СИО ΌΌΚΧ В11, трансфектированных функциональным геном ΌΗΡΚ. Однако трансфекция экспрессионными конструкциями, несущими кассеты, обусловливающие устойчивость к пуромицину или неомицину, не приводит к изменениям характеристик клеточного роста. Это свидетельствует о том, что повышение роста не является следствием селекции и/или культивирования стабильных трансфектантов, а вызывается воссозданием функциональной экспрессии ΌΗΡΚ в бЫг-негативных СΗО-клетках.

Кроме того, для гетерологичной экспрессии ΌΗΡΚ характерна зависимость от дозы гена, что свидетельствует о том, что характеристики роста стабильных клеточных субклонов возрастают пропорционально экспрессии активного белка ΌΗΡΚ (фиг. 2(а), (б)).

Важно отметить, что это действие, вероятно, не относится к клеточным линиям, у которых происходит амплификация гена ΌΗΡΚ в результате обработки метотрексатом (МТХ) (Си и др., 1992, Репбке и др., 1992). Это может быть результатом либо достижения пороговых уровней, выше которых активный ΌΗΡΚ более не вызывает усиление роста, либо компенсирующим действием ингибитора МТХ, который в высоких концентрациях, превышающих молекулярную концентрацию фермента ΌΗΡΚ, должен перевешивать амплификацию гена бЫг, что приводит к снижению чистой активности ΌΗΡΚ и, как следствие, пониженному клеточному росту.

Настоящее изобретение относится к общей проблеме усиления роста клеточных линий, прежде все

- 2 018099 го продуцирующих клеточных линий, которые имеют низкий уровень экспрессии ΌΗΕΚ или у которых отсутствует эндогенная экспрессия ΌΗΕΚ. В этих клетках характеристики роста могут существенно улучшаться с помощью гетерологичной экспрессии ΌΗΕΚ

Гетерологичная экспрессия ΌΗΕΚ в клетках-хозяевах, дефектных по бЫт, имеет дополнительные преимущества, которые проявляются в снижении временных рамок, требуемых для процесса размножения и инокуляции при ферментации, и в повышении уровня 1УС, например, в производственных процессах, и в результате к большему выходу продукта.

Клетки-хозяева и способы, предлагаемые в изобретении, можно применять также при получении биофармацевтических средств, прежде всего, в которых используют системы клеток-хозяев, основанные на 0Η0-0044 или ί.Ή0-0υΐ<Χ-Β11. Кроме того, их можно применять в том случае, когда не требуются высокие выходы рекомбинантного белка, например, для очистки/структурного анализа при исследованиях, или когда требуется большая клеточная биомасса, например, для выделения/изучения клеточных компонентов, таких как нуклеиновые кислоты или белки.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно объединять с системой(ами) селекции, таким как система на основе глутаминсинтетазы (08), аденозиндеаминазы (ΛΌΆ), цитозиндеаминазы (СЭЛ), пуромицина, неомицина, блеомицина и т.д. Это может приводить к повышению скоростей роста и более высокой клеточной плотности в процессе ферментации.

Настоящее изобретение не является очевидным из существующего уровня техники.

СИО-клетки были приняты для изучения генетики соматических клеток в 1957 г. (РИСК, 1957). Путем мутагенеза исходной клеточной линии К1 Иг1аиЬ и СЫазт создали клетки, дефектные по ΌΗΕΚ линии 0Η0 Ό044 (Иг1аиЬ и С11а$т, 1980), у которых имелась гомозиготная делеция хромосомного бЫтлокуса (Иг1аиЬ и др., 1983). Указанными авторами не были изучены особенности роста этой вновь созданной клеточной линии.

Клетки линии СНО ЭС44 вскоре стали применять в качестве предпочтительных клеток в методе трансфекции, для осуществления которого использовали экспрессионные векторы, несущие функциональный ген бЫГг в сочетании с кассетой экспрессии для представляющего интерес гена (СО1). ΌΗΕΚ представляет собой не доминантный селектирующий маркер и поэтому наиболее пригоден для применения в клетках, в которых отсутствует ΌΗΕΚ Однако было установлено, что его можно применять также в клетках-хозяевах, которые обладают эндогенной ΌΗΕΚ-активностью, например, путем селекции с помощью второго доминантного маркера (КаиГтап и др., 1986), или мутантных или бактериальных генов бЫт (81топзеп и Ьеутзоп, 1983; Аззейегдз и \У|бтег, 1995).

В условиях селекции гетерологичная экспрессия ΌΗΕΚ позволяет трансфектированным клеткам выживать и размножаться. Однако не было установлено, что ΌΗΕΚ придает преимущество с позиций роста вне зависимости от его функции в качестве маркера селекции и в неселективных условиях.

Ген бЫг принадлежит к маркерам амплификации, позволяющим осуществлять совместную амплификацию чужеродных генов после обработки фолатным аналогом метотрексатом (МТХ) (8сЫтке и др., 1978; ЛИ и др., 1978; РаПаИст и др., 1990). Из этого следует, что совместная амплификация 001 и бЫГг не зависит от того находятся ли оба гена на одной и той же плазмиде (КаиГтап и 8йагр, 1982). После этого были опубликованы стратегии осуществления экспрессии для производства рекомбинантных антител, в которых либо обе цепи антитела локализованы на одной и той же плазмидной ДНК вместе с геном бЫг (Раде и 8убепйат, 1991), при этом только одна цепь функционально связана с кассетой экспрессии бЫг (Еоизег и др., 1992), либо бЫГг кодируется отдельной применяемой для совместной интеграции плазмидой (АУигт и 1огбап, 2003).

Известны публикации, свидетельствующие о том, что наличие структурной связи гена бЫг и 001 на одной и той же плазмидной ДНК не является предпосылкой для коамплификации, поскольку различные ДНК-конструкции, применяемые для котрансфекции, имеют тенденцию к совместной интеграции в соседние хромосомные локусы (Уигт ЕМ. и 1огбап М., Оепе ТгапзГег апб Оепе Атрййсайоп т Маттайап Се11з в Оепе ТгапзГег апб Ехргеззюп т Маттайап Се11з, изд-во 8.С. Макпбез Е1зеу1ег 8с1епсе Β.ν., 2003, с. 309-335). В этом плане важно отметить также, что ΌΗΕΕ служит в качестве маркера селекции и/или амплификации для чужеродного 001, с которым он имеет функциональную связь, несмотря на структурное разобщение.

В противоположность этому настоящее изобретение основывается на том факте, что гетерологичный ΌΗΕΕ, помимо его хорошо известной функции в качестве маркера селекции/амплификации для 001, обладает совершенно независимой функцией улучшения клеточного роста.

Важно отметить, что известны многочисленные публикации о связи высокого уровня экспрессии ΌΗΕΕ с пониженным клеточным ростом, что является противоположным требуемому действию амплификации гетерологичного гена. В проведенных ранее исследованиях на ЕзсйепсЫа сой и 8ассйаготусез сегеу151ае продемонстрировано, что увеличение количества копий гена бЫГг сопровождалось снижением удельной скорости роста (Вайеу и др., 1986). Ои с соавторами обнаружили понижение скорости роста экспрессирующих бета-галактозидазу клеток линии 0Η0-0044 после амплификации гена бЫг в результате обработки МТХ (Ои и др., 1992). Аналогичные данные получены Репбзе с соавторами при использо

- 3 018099 вании вирусного трансгена, сшитого с ΟΗΕΚ (Репбке и др., 1992). Важно отметить, что в обоих этих исследованиях не использовали клетки, экспрессирующие только ΟΗΕΚ, что не позволяет сделать заключение об индивидуальном вкладе применяемых нескольких трансгенов. Следует учитывать, что в этих исследованиях только сравнивали характеристики роста экспрессирующих бЫт амплифицированных и неамплифицированных клеток. Нетрансфектированные клетки СНО-ЭС44 не были включены в исследования. 3парка с соавторами выявили снижение клеточного роста по мере увеличения количества копий гена бЫг в клетках, выведенных из линии ΝΙΗ3Τ3 (Зпарка и др., 1997). Важно отметить, что в отличие от предполагаемого в указанной публикации механизма, эти исследователи обнаружили также другую прикрепленную линию клеток, которые росли до достижения более высокой клеточной плотности после опосредуемой ΜΤΧ амплификации бйГг. Эти исследователи предположили, что это явление связано с пониженным ингибированием контакта, однако такое предположение является неуместным для клеток, растущих в суспензии.

В целом, в настоящем изобретении впервые продемонстрировано, что гетерологичная экспрессия ΟΗΕΚ приводит к улучшению характеристик роста СНО-клеток, прежде всего клеток линии СНО 0044 и ΟΗΟ Όυχχ-(ΒΙΙ). Эту функцию ΟΗΕΚ можно применять также для усиления скорости клеточного рост в других бЫг-негативных или имеющих пониженный уровень бЫГг клеточных линиях.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - улучшенный рост под воздействием гетерологичного фермента ΟΗΕΚ;

на фиг. 1(а) - кривые клеточного роста при использовании периодических процессов с подпиткой. Клетки выращивали во встряхиваемых колбах в течение 5 дней и подпитывали каждые 24 ч, начиная со дня 3. Количество жизнеспособных клеток (УСС) определяли ежедневно с помощью системы ΟΕΌΕΧ. Сравнивали следующие клетки: СΗΟ-клетки дикого типа (^Т) (“*^_; п=4); бЫг-негативные клетки линии Όυχ-Β11 (-Δ-; п=2) и две линии клеток 0044 из различных источников (^и_; п=4); пулы 0044-клеток, стабильно трансфектированных векторами, которые несут гены, обусловливающие устойчивость к неомицину (п=6, данные не представлены) или пуромицину (п=6, данные не представлены), или ген бЫг ^~; п=9). Представлена репрезентативная кривая, построенная по пяти независимым экспериментам;

на фиг. 1(б) - относительные уровни 1УС клеток, указанных в (а). Рассчитывали общую занятую клетками площадь в день 5 и строили график зависимости от уровней \УТ-клеток. который принимали за 100%. Усы представляют собой стандартные отклонения, полученные по меньшей мере по трем независимым экспериментам;

на фиг. 1(в) - характеристики роста в процессе продолжительного культивирования. Клетки поддерживали при клеточной плотности от 0,3 до 2,5x10 клеток/мл и расщепляли каждые 2-3 дня, осуществляя 8 пассажей. Рассчитывали скорость роста (черные прямоугольники) и время дупликации (затемненные прямоугольники) и строили график зависимости от уровня этих показателей в ΟΗΟ-клетках дикого типа, 0044 и трансфектированных бПГг 0044-клетках;

на фиг. 2 - зависимость усиления роста от дозы;

на фиг. 2(а) - усиленный клеточный рост трансфектированных ΟΗΕΚ субклонов. Шесть стабильных трансфектированных ΟΗΕΚ клеточных пулов создавали путем гетерологичной интродукции кассеты экспрессии ΟΗΕΚ в клетки линии СИО 0044. Из них получали клональные клеточные популяции с помощью основанного на ЕАСЗ одноклеточного клонирования и подвергали ферментации с периодической подпиткой. Рассчитывали 1УС ΟΗΕΚ-клонов в день 6 и строили график зависимости от уровня 1УС родительской клеточной линии 0044, который принимали за 1;

на фиг. 2(б) - относительные уровни экспрессии ΟΗΕΚ. Общую РНК выделяли из вышеуказанных клеток и осуществляли количественную оценку с помощью ПЦР в реальном времени для определения ΟΗΕΚ-специфических транскриптов мРНК. Для стандартизации применяли бета-тубулин.

Подробное описание изобретения

Определения.

В целом, в вариантах осуществления изобретения понятие содержит или содержащий включает более конкретное понятие состоящий из. Кроме того, формы в единственном и множественном числе не следует рассматривать как ограничивающие.

Понятия, которые применяют при описании настоящего изобретения, имеют указанные ниже значения.

Понятие дефектные по ΟΗΕΚ имеет такое же значение, что и ΟΗΕΚ-негативный. Оно относится к клеткам, в которых отсутствует функциональная экспрессия фермента ΟΗΕΚ. Это может быть обусловлено либо гомозиготной делецией, либо мутацией гена ΟΗΕΚ.

Понятие с пониженным уровнем ΟΗΕΚ относится к клеткам с низкими уровнями эндогенного ΟΗΕΚ, например к клеткам, гетерозиготным по гену ΟΗΕΚ.

Понятие общая концентрация жизнеспособных клеток в течение времени (1УС) означает площадь под кривой роста клеток в зависимости от времени и, как правило, понятие применяют для описания характеристики роста клеток, например, в производственных процессах, которые проходят в течение от

- 4 018099 нескольких дней до недель.

Понятие клеточная культура означает множество клеток, культивируемых в одном контейнере в условиях, пригодных для роста клеток.

Понятие клетка-хозяин согласно настоящему изобретению относится к клеткам, таким как клетки хомячка, предпочтительно клетки ВНК21, ВНК ТК^-, СНО, СНО-К1, СНО-ΌυΚΧ, СНО-ΌυΚΧ В1 и СНО-ОО44, или производным/потомству любой из указанных клеточных линий. Наиболее предпочтительными являются клетки СНО-ОО44, СНО-ОиКХ, СНО-К1 и ВНК21 и еще более предпочтительно клетки СНО-ОО44 и СНО-ОПКХ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения понятие клетки-хозяева относится также к клеткам мышиной миеломы, предпочтительно клеткам N80 и 8р2/0, или производным/потомству любой из указанных клеточных линий. Примеры мышиных клеток и клеток хомячка, которые можно применять согласно изобретению, обобщены также в табл. 1. Однако согласно настоящему изобретению, прежде всего для получения биофармацевтических белков, можно применять также производные/потомство этих клеток, других клеток млекопитающих, включая, но не ограничиваясь только ими, клеточные линии человека, мышей, крыс, обезьян и грызунов, или эукариотические клетки, включая, но не ограничиваясь только ими, клетки дрожжей, насекомых и растений.

Таблица 1

Линии клеток хомячка и мыши, применяемые в качестве клеток-продуцентов

Клеточная линия	Порядковый номер
N80	ЕСАСС Νο. 85110503
8р2/0-А₈14	АТСС СКЬ-1581
ВНК21	АТСС ССЬ-10
ВНК ТК^-	ЕСАСС Νο. 85011423
НаК	АТСС ССЬ-15
2254-62.2 (производная ВНК.-21)	АТСС СК.Ь-8544
СНО	ЕСАСС Νο. 8505302
СНО-К1	АТСС ССЬ-61
сно-ϋυκχ (= СНО 4ик, СНО/сГЬГг)	АТСС СКЬ-9096
сно-ϋυκχ вп	АТСС СК.Ь-9010
СНО-ОО44	иг1аиЬ и др,, СеП 33[2], 1983, сс. 405-412
СНО Рго-5	АТСС СВ.Ь-1781
У79	АТСС ССС-93
В14АР28-ОЗ	АТСС ССЬ-14
СНЬ	ЕСАСС Νο. 87111906

Наиболее предпочтительными являются клетки-хозяева, которые созданы так, что они адаптированы и их можно полностью культивировать в бессывороточных условиях и необязательно в средах, которые не содержат каких-либо белков/пептидов животного происхождения. В продажу поступают такие среды, как среда Хэма Е12 (фирма 81дша, Дейзенхофен, Германия), ΚΡΜΙ-1640 (фирма 81дта), модифицированная по методу Дульбекко среда Игла (ΌΜΕΜ; фирма 81дта), минимальная поддерживающая среда (ΜΕΜ; фирма 8щта). среда Дульбекко, модифицированная по методу Исков (ΙΜΌΜ; 81дта), ΟΌСНО (фирма 1иуйгодеи, Карлсбад, шт. Калифорния), СНО-8-1пу11тодеи, бессыворотчная СНО-среда (фирма 8щта) и не содержащая белки СНО-среда (фирма 81дта), которые являются примерами питательных растворов. Любую из сред можно дополнять при необходимости различными соединениями, примерами которых являются гормоны и/или другие факторы роста (такие как инсулин, трансферрин, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста), соли (такие как хлорид натрия, фосфат кальция, магния), буферы (такие как НЕРЕ8), нуклеозиды (такие как аденозин, тимидин), глутамин, глюкоза или другие эквивалентные источники энергии, антибиотики, микроэлементы. Можно включать также любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, которые известны специалистам в данной области. В настоящем изобретении предпочтительно применяют бессывороточную среду, но для культивирования клеток-хозяев можно применять также среды, дополненные приемлемым количеством сыворотки. Для выращивания и селекции генетически модифицированных клеток, экспрессирующих селектируемый ген, в культуральную среду добавляют приемлемый селектирующий агент.

Понятие белок применяют взаимозаменяемо с понятием аминокислотные последовательности или полипептид, и оно относится к полимерам аминокислот любой длины. Эти понятия включают также белки, которые подвергнуты посттрансляционным модификациям с помощью реакций, которые включают, но не ограничиваясь только ими, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование или процессинг белков. Модификации и изменения, например, слияния с другими белками, замены, делеции или инсерции в аминокислотной последовательности можно осуществлять в структуре полипептида так, чтобы молекула сохраняла при этом ее биологическую функциональную активность. Например, можно осуществлять определенные замены в аминокислотной последовательности в полипептиде или в кодирующей его нуклеотидной последовательности и получать белок с аналогичными свойствами.

Экспрессионный вектор, который несет представляющий интерес ген, кодирующий представляющий интерес белок, может содержать также селектируемый амплифицируемый маркерный ген.

Понятие селективные условия относится к условиям, в которых не могут расти или выживать

- 5 018099 клетки, не содержащие соответствующий селектирующий маркер. Селективные условия можно создавать, используя среду, содержащую добавки, такие как антибиотики, или лишенную компонентов, имеющих решающее значение для роста.

Понятие селектируемый маркер или селектирующий маркер (маркер для селекции) относится к маркерам, которые позволяют расти/выживать клеткам в селективных условиях. Например, в случае применения в качестве селектируемого маркера пуромицин-Ы-ацетилтрансферазы (РАС) только клетки, которые содержат ген РАС, могут выживать в селективных средах, содержащих антибиотик пуромицин.

Понятие амплифицируемый маркер или маркер для амплификации относится к генам, которые амплифицируются (например, удваиваются, утраиваются, многократно увеличиваются) в присутствии агента для селекции или после обработки агентом для селекции (например, метотрексатом (МТХ)), что приводит к увеличению количества копий маркера (например, ΌΗΡΚ) и окружающих областей ДНК.

Селектируемый амплифицируемый маркерный ген, как правило, кодирует фермент, который необходим для роста эукариотических клеток в указанных условиях. Например, селектируемый амплифицируемый маркерный ген может кодировать ΌΗΡΚ, ген которой амплифицируется, когда клеткухозяина, трансфектированную им, выращивают в присутствии селектирующего агента, т.е. метотрексата (МТХ). Приведенные в табл. 3 в качестве примеров, не ограничивающих объем изобретения, селектируемые агенты представляют собой также амплифицируемые маркерные гены, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения. Обзор селектируемых амплифицируемых маркерных генов, представленных в табл. 3, см. у КаиГтап. МсЙюШ ίη Епхуто1оду. 185, 1990, с. 537-566, публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки. Таким образом, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, генетически модифицированным согласно любому представленному в настоящем описании методу, где селектируемый амплифицируемый маркерный ген кодирует полипептид, который обладает функцией дигидрофолатредуктазы (ΌΗΡΚ), глутаминсинтетазы, САЭ, аденозиндеаминазы, аденилатдеаминазы, иМР-синтетазы, 1МР-5'-дегидрогеназы, ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы, НОРК-тазы, тимидинкиназы, тимидилатсинтетазы, Р-гликопротеина 170, рибонуклеотидредуктазы, аспарагинсинтетазы, аргининосукцинатсинтетазы, орнитиндекарбоксилазы, НМО-СоАредуктазы, ацетилглюкозаминилтрансферазы, треонил-тРНК-синтетазы или Ыа⁺К⁺-АТФазы.

Предпочтительным селектируемым амплифицируемым маркерным геном является ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ΌΗΡΚ), которая необходима для биосинтеза пуринов. Клетки, в которых отсутствует ген ΌΗΡΚ, не могут расти на среде, лишенной пуринов. Таким образом, ген ΌΗΡΚ можно применять в качестве доминантного селектируемого маркера для селекции и амплификации генов в таких клетках, выращиваемых в среде, лишенной пуринов. Селектирующий агент, который применяют в сочетании с геном ΌΗΡΚ, представляет собой метотрексат (МТХ).

Понятие ген ΌΗΡΡ или бЫт относится к любой нуклеиновой кислоте, кодирующей активный белок дигидрофолатредуктазу. Под понятие подпадают геномные последовательности ΌΗΡΚ, которые содержат один или несколько интронов, последовательности кДНК или так называемые минигены, содержащие регуляторные последовательности и кодирующие последовательности ΌΗΡΚ в сочетании с интронами или без них.

- 6 018099

Таблица 3

Селектируемые амплифицируемые маркерные гены

Селектируемый амплифицируемый маркерный ген Дигндрофолатредуктаза	Регистрационный номер М19869 (хомячок) £00236 (мышь)	Селектирующий агент Метотрексат (МТХ)
Металл отионеин	010551 (хомячок) Μ13ΟΟ3 (человек) М11794 (крыса)	Кадмий
САР (карбамоилфосфатсинтетаза:аспартатгранскарба милаза:дигидрооротаза)	М23652 (хомячок) 078586 (человек)	Ν-фосфоацетил-Ь-аспартат
Аденозиндеаминаза	К02567 (человек) М10319 (мышь)	Ху1-А-или аденозин, 2 'дезоксикоформицин
АМР(аденилат)деаминаза	Р12775 (человек) 102811 (крыса)	Аденин, азасерин, коформицин
иМР-синтаза	103626 (человек)	6-азауридин, пиразофуран
ΙΜΡ-5 '-дегидрогеназа	104209 (хомячок) Ю4208 (человек) М33934 (мышь)	Микофенольная кислота
Ксанти н-гуан инфосфорибознл-трансфераза	Х00221 (£. οοΐι)	Мнкофеиольная кислота при ограничении ксантина
Мутантная НСРКТаза или мутантная тимидинкиназа	100060 (хомячок) М13542, К02581 (человек) 100423, М68489(мышь) М63983 (крыса) М36160 (вирус герпеса)	Гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ)
Тимидилатсинтетаза	Р00596 (человек) М13019 (мышь) Ы2138 (крыса)	5-фтордезоксиуредин
Р-гликопротеин 170 (ΜϋΚ.1)	АР016535 (человек) ЮЗ398 (мышь)	Несколько лекарственных средств, например, адриамицин, вннкристин, КОЛХИЦИН
Рибонуклеотидредуктаза	М124223, К.02927 (мышь)	Афидиколин
Глутаминсинтетаза	АР 150961 (хомячок) и09114, М60803 (мышь) М29579 (крыса)	Метионина сульфоксимин (М5Х)
Аспарагинсинтетаза	М27838 (хомячок)	В -асп арти л гидроксамат,
	М27396 (человек) 1Л 8940 (мышь) и07202 (крыса)	албиззиин, 5-азацитидин
Аргининосукцинатсинтетаза	Х01630 (человек) М31690 (мышь) М26198 (бык)	Канаванин
Орнитиндекарбоксилаза	М34158 (человек) 103733 (мышь) М16982 (крыса)	а-Дифторметилорнитин
НМС-СоА-редуктаза	С00183, М12705 (хомячок) М1 1058 (человек)	Компактин
Ν-Ацетилглюкозамииил трансфераза	М55621 (человек)	Туникамицин
Треонил-тРНК-еинтетаза	М63180 (человек)	Боррелидин
+ + N3 К -АТФаза	105096 (человек) М14511 (крыса)	Оубаин

Приемлемыми клетками-хозяевами для гена, кодирующего ΌΗΤΚ, в качестве селектируемого амплифицируемого маркера являются клетки млекопитающих, предпочтительно клетки мышиной миеломы или хомячка. Наиболее предпочтительными являются клетки СНО-ΌυΚΧ (АТСС СКЬ-9096) и СНОΌΟ44 (иг1аиЬ и др., Се11 33,2, 1983, с. 405-412) с дефицитом активности ΌΗΤΚ Для переноса метода амплификации ΌΗΤΚ на другие типы клеток можно применять мутантный ген ΌΗΤΚ, который кодирует белок, обладающий пониженной чувствительностью к метотрексату, в сочетании с клетками-хозяевами, которые содержат нормальный уровень эндогенного гена ΌΗΤΚ дикого типа (81шои8оие1 др., 1983; ^1д1ег и др., 1980; ШЬеге! и др., 1982).

Настоящее изобретение можно применять для создания клеток-хозяев, предназначенных для производства биофармацевтических полипептидов/белков. Прежде всего, изобретение можно применять для

- 7 018099 экспрессии высоких уровней многочисленных различных представляющих интерес генов клетками, для которых выявлена повышенная клеточная продуктивность.

Представляющий интерес ген (СО1), выбранная последовательность или генный продукт имеют одинаковое значение в контексте настоящего описания и относятся к полинуклеотидной последовательности любой длины, которая кодирует представляющий интерес продукт или представляющий интерес белок, под это понятие подпадает также требуемый продукт.

Выбранная последовательность может представлять собой полноразмерный или укороченный ген, слитый или меченый ген и может представлять собой кДНК, геномную ДНК или фрагмент ДНК, предпочтительно представляет собой кДНК. Она может иметь нативную последовательность, т.е. встречающуюся/встречающиеся в естественных условиях форму/формы, или может быть при необходимости мутантной или иным образом модифицированной. Эти мутации представляют собой усовершенствование кодонов с целью оптимизации наиболее часто встречающихся кодонов в отобранной клетке-хозяине, гуманизацию или мечение. Выбранная последовательность может кодировать секретируемый, цитоплазматический, ядерный, связанный с мембраной или находящийся на клеточной поверхности полипептид.

Представляющий интерес белок включает белки, полипептиды, их фрагменты, пептиды, которые все могут экспрессироваться в отобранной клетке-хозяине. Требуемые белки могут представлять собой, например, антитела, ферменты, цитокины, лимфокины, адгезионные молекулы, рецепторы и их производные или фрагменты и любые другие полипептиды, которые могут служить агонистами или антагонистами и/или которые можно применять в терапевтических или диагностических целях. Примеры требуемого белка/полипептида представлены также ниже.

В случае более сложных молекул, таких как моноклональные антитела, СО1 кодирует одну или обе цепи антитела.

Представляющий интерес продукт может являться также антисмысловой РНК.

Представляющие интерес белки или требуемые белковые продукты указаны выше. Прежде всего, требуемые белки/представляющие интерес полипептиды или белки, включают, но не ограничиваясь только ими, инсулин, инсулиноподобный фактор роста, ИОН, ίΡΆ, цитокины, такие как интерлейкины (1Ь), например 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-14, 1Ь-15, 1Ь16, 1Ь-17, 1Ь-18, интерферон (ΙΡΝ) альфа, ΙΡΝ-бета, ΙΡΝ-гамма, ΙΡΝ-омега или ΙΡΝ-тау, фактор некроза опухоли (ΤΝΡ), такой как ΤΝΡ-альфа и ΤΝΡ-бета, ΤΝΡ-гамма, ТКАГО; О-С8Р, ОМ-С8Р, М-С8Р, МСР-1 и ΥΕΟΡ. Под объем изобретения подпадает также производство эритропоэтина или любых других гормональных ростовых факторов. Способ, предлагаемый в изобретении, целесообразно применять также для производства антител или их фрагментов. Такие фрагменты представляют собой, например, РаЬфрагменты (Ргадшеи! апйдеп-Ьшйшд (антигенсвязывающий фрагмент) = РаЬ). РаЬ-фрагменты состоят из вариабельных областей обеих цепей, которые удерживаются вместе примыкающей константной областью. Их можно получать путем расщепления протеазами, например папаином, из обычных антител, но, кроме того, РаЬ-фрагменты можно получать также с помощью генетической инженерии. К фрагментам антител относятся также Р(аЬ')₂-фрагменты, которые можно получать протеолитическим расщеплением пепсином.

Представляющий интерес белок предпочтительно выделяют из культуральной среды в виде секретируемого полипептида или его можно выделять из лизатов клеток-хозяев, если его экспрессия происходит без секреторного сигнала. Необходимо очищать представляющий интерес белок от других рекомбинантных белков и белков клетки-хозяина так, чтобы получать практически гомогенные препараты представляющего интерес белка. На первой стадии клетки и/или состоящий из частиц клеточный дебрис удаляют из культуральной среды или лизата. Затем представляющий интерес продукт очищают от загрязнителей в виде растворимых белков, полипептидов и нуклеиновых кислот, например, путем фракционирования или иммуноаффинности или с помощью ионообменных колонок, путем осаждения этанолом, ЖХВР с обращенной фазой, хроматографии на сефадексе, хроматографии на силикагеле или на катионообменной смоле, такой как ДЭАЭ ((диацетиламино)этилцеллюлоза). В целом, в данной области хорошо известны методы очистки гетерологично экспрессируемых в клетке-хозяине белков. Такие методы описаны, например, у Натк и Апда1, Рго1еш РигШсайоп МеШойк, в: Л1е Ргасйса1 Арргоасй 8ег1ек под ред. Ктскмюой и Натек, изд-во ΙΡΣ Ргекк, 1995 или КоЬей 8сорек, Рго1еш РигШсайои, изд-во 8ргшдег-Уег1ад, 1988, обе публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки.

С помощью методов генной инженерии можно получать укороченные фрагменты антител, которые состоят только из вариабельных областей тяжелой (УН) и легкой (УЪ) цепи. Их обозначают как Ρνфрагменты (Ргадтеп! νа^^аЬ1е, т.е. фрагмент вариабельных областей). Поскольку у этих Ρν-фрагментов отсутствует ковалентное связывание двух цепей остатками цистеина константных областей цепей, то Ρνфрагменты часто стабилизируют. Целесообразно связывать вариабельные области тяжелой и легкой цепи коротким пептидным фрагментом, например, состоящим из 10-30 аминокислот, предпочтительно 15 аминокислот. Таким образом, получают одну пептидную цепь, состоящую УН и УЪ, которые связаны пептидным линкером. Белок антитела такого типа обозначают как одноцепочечный Ρν (ксРу). Примеры белков ксРу антител такого типа известны в данной области, см., например, Ник1оп и др., ΡΝΑ8 16:, 1988, с. 5879-5883).

- 8 018099

В последние годы разработаны различные стратегии получения зсРу в виде мультимерного производного. Это должно приводить, в частности, к получению рекомбинантных антител с улучшенными фармакокинетическими свойствами и особенностями биораспределения, а также обладающих повышенной авидностью к связыванию. Для достижения мультимеризации зсРу получали зсРу в виде слитых белков с мультимеризованными доменами. Мультимеризованные домены могут представлять собой, например, СН3-участок 1дС или структуру типа свернутой спирали (сойеб сой) (спиралевидная структура), такие как домены в виде лейциновой молнии. Однако известны также стратегии, при использовании которых для мультимеризации применяют взаимодействие между УН/УЪ-областями зсРу (например, двойные, тройные антитела и пентаантитела). Под двойными антителом специалист в данной области подразумевает двухвалентное гомодимерное производное зсРу. Укорочение линкера в молекуле зсРу до 5-10 аминокислот приводит к образованию гомодимеров, в которых имеет место межцепочечное УН/УЪналожение. Двойные антитела можно дополнительно стабилизировать путем введения дисульфидных мостиков. Примеры белков двойных антител, известных из существующего уровня техники, представлены у РегШс и др., 81гис1иге 2, 1994, с. 1217-1226.

Под миниантителом специалист в данной области подразумевает двухвалентное гомодимерное производное зсРу. Оно состоит из слитого белка, который содержит СНЗ-участок иммуноглобулина, предпочтительно 1дО. наиболее предпочтительно 1дС1, в качестве области димеризации, которая соединена с 8сРу через шарнирную область (например, также из 1дС1) и линкерную область. Примеры белков антител в виде миниантител можно найти у Ни и др., Сапсег Вез. 56, 1996, с. 3055-3061.

Под тройными антителом специалист в данной области подразумевает трехвалентное гомотримерное производное зсРу (Когй и др., Рго1еш Епдшееппд 10, 1997, с. 423-433). Производные зсРу, в которых УН-УЪ слиты непосредственно без линкерной последовательности, позволяют получать тримеры.

Специалисту в данной области известны также так называемые миниантитела, которые имеют двух-, трех- или четырехвалентную структуру и которые выведены из зсРу. Мультимеризацию осуществляют с помощью двух-, трех- или четырехмерных структур типа свернутой спирали (Раск и др., Вю1ес1шо1оду 11, 1993, с. 1271-1277; Ьоус|оу и др., 8с1епсе 259, 1993, с. 1288-1293; Раск и др., 1. Мо1. Вю1. 246, 1995, с. 28-34).

Любые последовательности или гены, интродуцированные в клетку-хозяина, обозначают как гетерологичные последовательности или гетерологичные гены или трансгены относительно клеткихозяина, даже, если интродуцированная последовательность или ген идентичны эндогенной последовательности или гену клетки-хозяина.

Гетерологичные генные последовательности можно интродуцировать в клетку-мишень с помощью экспрессионного вектора, предпочтительно эукариотического и еще более предпочтительно экспрессионного вектора млекопитающих. Методы, применяемые для конструирования векторов, хорошо известны специалистам в данной области и описаны в различных публикациях. Конкретные методики создания приемлемых векторов, включая описание функциональных компонентов, таких как промоторы, энхансеры, сайты терминации и сигналы полиаденилирования, маркеры для селекции, сайты инициации репликации и сигналы сплайсинга, обобщены более конкретно у 8атЬгоок и др., 1989 и в приведенных в этом руководстве ссылках. Векторы могут представлять собой, но не ограничиваясь только ими, плазмидные векторы, фагмиды, космиды, искусственные/минихромосомы или вирусные векторы, такие как векторы на основе бакуловируса, ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса герпеса простого, ретровируса, бактериофагов. Эукариотические экспрессионные векторы должны, как правило, содержать также прокариотические последовательности, которые облегчают размножение вектора в бактерии, такие как сайт инициации репликации и гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам для селекции в бактериях. Различные эукариотические экспрессионные векторы, содержащие сайт клонирования, в котором можно функционально связывать полинуклеотид, хорошо известны в данной области и некоторые из них поступают в продажу от таких компаний, как фирма 81га1адепе, Ла-Джолла, шт. Калифорния; фирма 1пуйгодеп, Карлсбад, шт. Калифорния; фирма Рготеда, Мэдисон, шт. Висконсин или фирма ΒΌ Вюзшепсез С1оп1есй, Пало-Альто, шт. Калифорния.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения экспрессионный вектор содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, которая представляет собой регуляторную последовательность, необходимую для транскрипции и трансляции нуклеотидных последовательностей, которые кодируют представляющий интерес пептид/полипептид/белок.

Понятие экспрессия в контексте настоящего описания относится к транскрипции и/или трансляции гетерологичной нуклеотидной последовательности внутри клетки-хозяина. Уровень экспрессии требуемого продукта/представляющего интерес белка в клетке-хозяине можно определять на основе либо количества соответствующей мРНК, присутствующей в клетке, либо количества требуемого полипептида, представляющего интерес белка, кодируемого выбранной последовательностью, как описано в примерах, представленных в настоящем описании. Например, мРНК, транскрибируемую с выбранной последовательности, можно оценивать количественно гибридизацией нозерн-блоттингом, защитой РНК от рибонуклеазы, гибридизацией ш зйи с клеточной РНК или ПЦР (см. 8атЬгоок и др., 1989; Аи8иЬе1 и др., 1987, пересмотренное и дополненное издание). Белок, кодируемый выбранной последовательностью,

- 9 018099 можно количественно оценивать различными методами, например с помощью ЕЬ18А, вестернблоттинга, радиоиммуноанализов, иммунопреципитации, путем оценки биологической активности белка, с помощью иммуноокрашивания белка после ЕАС8-анализа (см. 8атЬтоок и др., 1989; АикиЬе1 и др., 1987, пересмотренное и дополненное издание) или путем анализов гомогенной флуоресценции с временным разрешением (НТКЕ).

Трансфекцию эукариотических клеток-хозяев полинуклеотидом или экспрессионным вектором, которая приводит к получению генетически модифицированных клеток или трансгенных клеток, можно осуществлять любым методом, хорошо известным в данной области и описанным, например, у 8ашЬтоок и др., 1989 или АикиЬе1 и др., 1987 (пересмотренное и дополненное издание). Методы трансфекции включают, но не ограничиваясь только ими, опосредуемую липосомой трансфекцию, совместное осаждение с фосфатом кальция, электропорацию, опосредуемую поликатионом (таким как ДЭАЭ-декстран) трансфекцию, слияние протопластов, вирусные заражения и микроинъекцию. Предпочтительно трансфекция представляет собой стабильную трансфекцию. Предпочтительным является такой метод трансфекции, который обеспечивает оптимальную частоту трансфекции и экспрессию гетерологичных генов в конкретной линии клеток-хозяев. Приемлемые методы можно определять общепринятыми путями. Для получения стабильных трансфектантов конструкции либо интегрируют в геном клетки-хозяина, либо в искусственную хромосому/минихромосому, либо локализуют эписомально, так чтобы они стабильно поддерживались в клетке-хозяине.

Для воплощения настоящего изобретения на практике можно применять, если не указано иное, общепринятые методики клеточной биологии, молекулярной биологии, клеточного культивирования, иммунологии и т.п., известные в данной области. Эти методики полностью описаны в современной литературе (см., например, 8ашЬтоок и др., Мо1еси1аг С1опшд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2-е изд., изд-во Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1989; АикиЬе1 и др., Ситтеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1987 (пересмотренное и дополненное издание); Еккепйа1 Мо1еси1аг Вю1оду, под ред. Вго\\'п. изд-во ШЬ Ргекк, 1991; Пепе Ехртеккюп Тес1по1оду, под ред. Соеббе1, изд-во Асабетк Ргекк, 1991; Мебюбк Тот С1опшд апб Апа1укк о! Еикатуобс Сепек, под ред. Во!1тее11 и др., изд-во ВатИей РиЬ1., 1990; КесотЫпап! ΌΝΑ Ме!1обо1оду, под ред. Аи и др., изд-во Асабетк Ргекк, 1989; Кгкд1ег, Сепе ТгапкГег апб Ехртеккюп, изд-во 8!оск!оп Ргекк, 1990; МсРйеткоп и др., РСК: А Ртас!ка1 Арртоасй, изд-во ШЬ Ргекк а! ОхГогб Ишуеткйу Ргекк, 1991; Ойдопис1ео!1бе 8уп!йекк, под ред. Сай, 1984; Сепе ТгапкГег Уес!огк Гог Маттайап Се11к, под ред. М111ег и Са1ок, 1987; Маттайап Се11 Вю!есйпо1оду, под ред. Вийег, 1991; Ашта1 Се11 Си1!иге, под ред. Ро11агб и др., изд-во Нитап Ргекк, 1990; СиЙиге оГ Ашта1 Се11к, под ред. Егекйпеу и др., издво А1ап К. Ь1кк, 1987; Се11 Сготе!1 апб Арор!окк, А Ргас!ка1 Арртоасй, под ред. 81ибх1пкк1, изд-во ШЬ Ргекк а! ОхГогб Ишуеткйу Ргеккк, 1995; Иоте Су!оте!гу апб 8огйпд, под ред. Ме1атеб и др., изд-во Айеу-Ькк, 1990; Сиггеп! Рго!осо1к ш Су!оте!гу, изд-во 1оЬп А11еу & 8опк, 1пс. (пересмотренное и дополненное издание; А1йй и Наикег, Сепейс Епдшеейпд оГ Атта1к Се11к, в Вю!есйпо1оду, т. 2, под ред. РиЫет, УСН, Аешйет 663-744; серии Ме!1обк оГ Еп/уто1оду, изд-во Асабетк Ргекк, 1пс., и АпйЬобкк: А ЬаЬога!огу Мапиа1, под ред. Наг1оте и др., 1987).

Изобретение относится к способу улучшения клеточного роста линии клеток, отличающемуся тем, что повышают активность ИНЕК в указанной линии клеток.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточная линия представляет собой клеточную линию, дефектную по ИНЕК или с пониженным уровнем ИНЕК.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что ген, кодирующий ИНЕК, и представляющий интерес ген (СО1), кодирующий требуемый продукт, последовательно интродуцируют в указанную клеточную линии.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что кассета экспрессии ИНЕК представляет собой экспрессионную единицу только млекопитающего, которую интродуцируют в клеточную линию во время последующей стадии интродукции.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что селекцию представляющего интерес гена, кодирующего требуемый продукт, осуществляют в отсутствии метотрексата (МТХ).

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что увеличивают количество гена ИНЕК.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клетки указанной клеточной линии содержат по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 3 копии гена ИНЕК.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клетки указанной клеточной линии содержат по меньшей мере 5, по меньшей мере 10 или по меньшей мере 25 копий гена ИНЕК.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что уровень экспрессии ИНЕК повышают.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что уровень

- 10 018099 экспрессии ΌΗΡΚ повышают по меньшей мере в 2 раза.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что уровень экспрессии ΌΗΡΚ повышают по меньшей мере в 3-10, 15 или 20 раз.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что активность ΌΗΡΚ повышают путем интродукции гетерологичного гена ΌΗΡΚ, минигена ΌΗΡΚ, мутанта ΌΗΡΚ или кодирующей последовательности ΌΗΡΚ. из видов, отличных от рассматриваемой клеточной линии.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что указанная клеточная линия уже трансфектирована представляющим интерес геном (ΟΟΙ).

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что указанная клеточная линия представляет собой линию клеток млекопитающего, такую как клеточная линия ΟΗΟ.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточная линия представляет собой ΟΗΟ-ΌΟ44 или ί.’ΗΟ-Όυΐ<Χ-Β11. предпочтительно ΟΗΟ-ΌΟ44.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что селекцию представляющего интерес гена, кодирующего требуемый продукт, осуществляют в присутствии гипоксантина и тимидина (ΗΤ) и в отсутствии ΜΤΧ.

В следующем конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточную линию трансфектируют ΌΗΡΚ, который находится на плазмиде, отличной от плазмиды, которая содержит кодирующий требуемый продукт представляющий интерес ген, и поэтому ΌΗΡΚ не служит в качестве маркера селекции и/или амплификации для представляющего интерес гена.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что трансфекцию плазмидой, содержащей ΌΗΡΚ, осуществляют последовательно или одновременно с трансфекцией плазмидой, которая содержит представляющий интерес ген.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что трансфекцию плазмидой, содержащей ΌΗΡΚ, осуществляют последовательно с трансфекцией плазмидой, которая содержит представляющий интерес ген.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточная линия была предварительно трансфектирована первой плазмидой, которая содержит представляющий интерес ген, функционально связанный с маркером селекции, отличным от ΌΗΡΚ.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточная линия содержит гетерологичный ΌΗΡΚ и по меньшей мере один другой маркер амплификации, такой как глутаминсинтетаза (С8), аденозиндеаминаза (ΆΌΆ) или цитозиндеаминаза (СОЛ).

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточная линия содержит гетерологичный ΌΗΡΚ и 08.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточная линия содержит гетерологичный ΌΗΡΚ и по меньшей мере один другой маркер селекции, такой как ген, обусловливающий устойчивость к пуромицину, неомицину или блеомицину.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что стабильно трансфектированные клетки отбирают с помощью селектирующего маркера, функционально связанного с представляющим интерес геном.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что стабильно трансфектированные клетки отбирают с помощью селектирующего маркера, функционально связанного с представляющим интерес геном, который не представляет собой ΌΗΡΚ.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клеточная плотность, достигаемая при использовании указанной стабильно трансфектированной клеточной линии, по меньшей мере в 2 раза выше по сравнению с соответствующей нетрансфектированной клеточной линией.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения линии клеток-хозяев, отличающемуся тем, что:

а) трансфектируют клетку-хозяина по меньшей мере одним представляющим интерес геном, кодирующим требуемый продукт, который находится по меньшей мере на одной первой плазмиде и функционально связан с маркером селекции/амплификации, отличным от ΌΗΡΚ;

б) интродуцируют кассету экспрессии ΌΗΡΚ, локализованную на плазмиде, которая отлична от плазмиды, указанной на стадии а);

в) отбирают стабильно трансфектированные клетки с помощью селектирующего маркера, указанного на стадии а), где характеристики роста и клеточной плотности, полученные у указанной клетки, лучше и выше, чем у соответствующей нетрансфектированной клеточной линии.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу получения линии клеток-хозяев, отличающемуся тем, что:

а) трансфектируют клетку-хозяина, дефектную по ΌΗΡΚ или с пониженным уровнем ΌΗΡΚ, по меньшей мере одним представляющим интерес геном, кодирующим требуемый продукт, который нахо

- 11 018099 дится по меньшей мере на одной первой плазмиде и функционально связан с маркером селекции/амплификации, отличным от ΌΗΕΚ;

б) интродуцируют кассету экспрессии ΌΗΕΚ, локализованную на плазмиде, которая отлична от плазмиды, указанной на стадии а);

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что порядок осуществления стадий а) и б) меняют.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что порядок осуществления стадий а) и б) является обратным.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что ΌΗΡΚ представляет собой экспрессионную единицу только млекопитающего, которую интродуцируют в указанную клеточную линию на стадии б).

Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, которую можно получать любым из указанных способов.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клетка представляет собой клетку-хозяина млекопитающих, такую как СНО-клетка.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клетка представляет собой С.ПО-ОС44 или СНО-ΌυΚΧ-ΒΙΙ.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения белка в клеточной линии, например клеточной линии млекопитающего, отличающемуся тем, что:

(а) создают клетку-хозяина с помощью одного из описанных выше способов, которая содержит представляющий интерес ген, кодирующий представляющий интерес белок;

(б) культивируют клетку в условиях, пригодных для пролиферации клетки;

(в) собирают представляющий интерес белок, например, путем отделения клеток от супернатанта и (г) очищают представляющий интерес белок.

Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу получения белка с использованием линии клеток, дефектной по ΌΗΡΒ или с пониженным уровнем ΌΗΡΚ, например линии клеток млекопитающих, отличающемуся тем, что:

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что представляющий интерес белок является секретируемым белком.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что клетка дополнительно содержит трансген, который кодирует внутриклеточный или расположенный в мембране белок.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что трансген локализуют на той же плазмиде, что и кассету экспрессии ΌΗΡΒ.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ отличается тем, что трансген кодирует антиапоптозный ген или фактор транскрипции.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения способы/клетки-хозяева отличаются тем, что их осуществляют/выращивают в суспензионной культуре.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способы/клетки-хозяева отличаются тем, что их осуществляют/выращивают в бессывороточной культуральной среде.

С целью лучшего понимания изобретения, описанного в целом выше, ниже представлены ссылки на конкретные примеры, которые включены в настоящее описание только для иллюстрации определенных вариантов осуществления настоящего изобретения и никоим образом не направлены на ограничение его объема.

Примеры

Материалы и методы.

Клеточные культуры.

Все клеточные линии, применяемые на этапах производства и разработки, поддерживали в виде серийных маточных культур для посева в Т-колбах с поверхностной аэрацией (фирма Кипе, Дания) в термостатах (фирма Т11СГШО. Германия) или встряхиваемых колбах (фирма Νικία, Дания) при температуре 37°С и в атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Маточные культуры для посева пересевали каждые 2-3 дня с плотностью посева 2-3Е5 клеток/мл. Концентрацию клеток определяли во всех культурах с помощью гемоцитометра. Жизнеспособность оце

- 12 018099 нивали методом исключения трипанового синего. Все продуктивные СНО-клетки культивировали в являющихся собственностью фирмы-заявителя (ΒΣ) средах и их состав не имел решающего значения.

Культивирование методом периодической подпитки.

Клетки высевали из расчета 3x10 клеток/мл в 125-миллилитровые встряхиваемые колбы в 30 мл являющейся собственностью ΒΙ среды для получения без антибиотиков или с МТХ (фирма 5>фта-А1йпе11. Германия). Культуры перемешивали при 120 об/мин при 37°С и 5% СО₂, содержание которого снижали до 2% через 3 дня. Параметры культивирования, такие как рН, рО₂, рСО₂, концентрации глюкозы, лактата и глутамина определяли ежедневно и при необходимости доводили значение рН до 7,0 с помощью №1СО₃. Являющийся собственностью ΒΙ подпитывающий раствор добавляли каждые 24 ч из расчета 30 мл/л/день. Плотность и жизнеспособность клеток определяли методом исключения трипанового синего с помощью автоматической системы для подсчета клеток СЕЭЕХ (фирма ΙηηοναΙίδ).

Сортировка индивидуальных клеток.

Для анализа и сортировки клеток использовали проточный цитометр типа ЕАС8 Уайаде (фирма ВесЮи П1скт8ои), снабженный устройством для импульсной обработки, модулем для ускорения сортировки и автоматическим устройством для внесения клеток. С использованием точечного графика рассеяния в прямом и боковом направлении (Е8С/88С) устанавливали дискриминационное окно вокруг индивидуальных живых клеток. Отсортированные клетки по одной клетку на лунку помещали в 96-луночный титрационный микропланшет, содержащий 200 мкл среды для роста, с помощью автоматического устройства для внесения клеток. Для обеспечения стерильности сортировки систему труб клеточного сортера очищали и стерилизовали, пропуская в качестве защитой жидкости в течение 1 ч каждый из следующих растворов: 0,1н. ЫаОН; 0,1% Ттйои-Х-100; 70% этанола. Затем стерильный защитный резервуар с ЗФР соединяли с клеточным сортером.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР.

РНК из растущих клеток выделяли с помощью реагента ΤΚΙζοΙ® (фирма 1иуйтодеи, Германия) согласно инструкциям производителя с последующей обработкой ДНКазой I в течение 30 мин при 37°С. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с помощью набора С1оией АМУ Е1Г51-§1гаиО οΩΝΑ ЗупФейх (фирма 1иуйтодеи, Германия), используя для начала процесса 3 мкг общей РНК и олиго(йТ) олигонуклеотиды. Различия в количестве транскриптов йШт определяли с помощью ПЦР в реальном времени, используя смесь АЬ§о1и1е™ фРСВ 8УВВ® Сгееи Е1иоге8сет Μίχ (фирма АВдеие, Суррей, Великобритания) и термоячейку, контролируемую с помощью программного обеспечения Му1ф Веа1 Т1те Ое1ес11ои (фирма ВюВаб, Германия). Все эксперименты проводили в трех повторностях. Создавали ЭНЕВспецифические амплификаты (ампликоны) и оценивали количественно относительно уровней экспрессии тубулина с помощью следующих олигонуклеотидов: йШт (смысловой) 8Еф ΙΌ NО: 1 5АТООТТСОАССОСТОААСТОС-3'; йЫт (антисмысловой) 8ЕО ГО ΝΘ: 2 5'ССАСТОАООАООТООТООТСАТТ-3'; тубулин (смысловой) 8ЕО ГО ΝΘ: 3 5'СТСААСОССОАССТОСОСААО-3' и тубулин (антисмысловой) 8ЕО ГО ΝΘ: 4 5'АСТСОСТООТОТАССАОТОС-3'.

Пример 1.

Г етерологичная экспрессия ЭНЕВ повышает клеточный рост.

Клетки, дефектные по ЭНЕВ линии СНОГОО44 (иг1аиЬ и Сйакт, Се11 33, 1983, с. 405-412) и СНО ЭЕКХ-В11 (АТСС СВЬ-9010), стабильно трансфектировали конструкциями ДНК, несущими селектирующие маркеры, обусловливающие устойчивость к пуромицину и неомицину соответственно, и/или экспрессионную плазмиду для гена ЭНЕВ. Клетки селектировали в среде, содержащей соответствующий антибиотик (пуромицин или генетицин), или в селективной среде без НТ.

Затем характеристики роста образовавшихся пулов стабильных клеток сравнивали в маточных культурах для посева и в культурах в процессе культивирования с периодической подпиткой во встряхиваемых колбах, что является принятой моделью для маломасштабных процессов ферментации/производства (Ь1и С. и Ноид Ь., Вюсйет. Еид. 1. 7, 2001, с. 121-125).

При создании изобретения неожиданно было установлено, что СНО-клетки, дефектные по ЭНЕВ линии ЭО44, обладали в значительной степени ухудшенными характеристиками роста по сравнению с родительскими СНО-клетками дикого типа (χνΐ) (фиг. 1). В культурах с периодической подпиткой они росли медленнее и достигали более низкой максимальной клеточной плотности (фиг. 1(а), (б)), что согласуется с пониженной скоростью роста, оцененной при культивировании маточных культур для посева (фиг. 1(в)).

Важно отметить, что восполнение дефекта у клеток ЭО44 йЫг-/- с помощью гетерологичной экспрессии ЭНЕВ (8ЕЦ ГО NО: 5-6) полностью восстанавливало (приводило в норму) этот фенотип. Реинтродукция ЭНЕВ-трансгена не только приводила к снижению времени дупликации, но повышала также уровень 1УС до уровней дикого типа или даже превышающих их уровней. Это усиливающее рост действие можно наблюдать не только при использовании двух различных клеточных линий ЭО44, но это имеет место также в случае СНО-клеток линии ЭИКХ В11, трансфектированных функциональным геном ЭНЕВ. Однако трансфекция экспрессионными конструкциями, несущими кассеты, обусловливающие

- 13 018099 устойчивость к пуромицину или неомицину, не приводила к изменению характеристики клеточного роста. Это свидетельствует о том, что усиление роста не является результатом селекции и/или культивирования стабильных трансфектантов, а вызывается восстановлением функциональной экспрессии ΌΗΕΚ в ббГг-негативных СНО-клетках.

Пример 2.

ΌΗΕΚ повышает клеточный рост в зависимости от дозы.

Для оценки зависимости опосредуемого реинтродукцией ΌΗΕΚ воздействия на рост создавали стабильно экспрессирующие ΌΗΕΚ (8ЕО ΙΌ N0: 5-6) субклоны и подвергали их основанному на применении РАС8 клонированию индивидуальных клеток для получения клональных популяций с гомогенной экспрессией ΌΗΕΚ. Затем анализировали особенности роста этих ΌΗΕΚ-клонов с использованием циклов ферментации с периодической подпиткой. Как видно из фиг. 2(а), трансфектированные ΌΗΕΚ субклоны достигали существенно более высоких уровней 1УС по сравнению с клетками линии С.ПО-ОС44. при этом различия составляли 2,5-6 раз в течение 6 дней.

Для решения вопроса о том, коррелируют ли увеличенные уровни 1УС с повышенным количеством транскриптов ΌΗΕΚ, общую РНК выделяли из ΌΗΕΚ-субклонов, а также из родительской клеточной линии ΠΗ0-0044 и осуществляли количественную ПЦР для анализа уровня экспрессии ΌΗΕΚ (фиг. 2(б)). Примерно у 80% проанализированных клонов оцененные уровни 1УС точно коррелировали с уровнем экспрессии ΌΗΕΚ, это означает, что клоны с наибольшим количеством транскриптов ΌΗΕΚ имели наиболее высокие уровни 1УС в процессе ферментации. Эти данные позволяют предположить, что экспрессия гетерологичного гена ΌΗΕΚ в клетках линии СΗО-^С44 повышает клеточный рост в зависимости от дозы.

Перечень ссылок.

А11 Р.У., Ке11етв КБ., Вейшо БК. и 8сб1тке К.Т. 8е1есбуе нийбрбсабоп оГ бШубгоГокИс гебнс1аве деиев ίη те1йо1геха1е-гев1в1аи1 уапагИв оГ сийитеб тштие се11в. ί. Вю1. Сбет. 253, 1978, с. 1357-1370.

Авве1Ьегдв Р.А и У1бтег К. Иве оГ Не Евсбепсбаа сой сбготовота1 ΌΗΡΚ деие ав ве1есйоп тагкег ίη таттайаи се11в. 1. Вю1есЬио1. 43, 1995, с. 133-138.

Вайеу ЕЕ., Эа 8бса Ν.Α., Регей1 8.У., 8ео Ι.Η. и 8пепс Р. 81нб1ев оГ 1юв1-р1авннб б'Иегасбопв ίη гесотЬтаШ тютоогдатвтв. Αηη. Ν.Υ. Асаб. 8сЕ 469, 1986, с. 194-211.

Роивег Б.А., 8\\'апЬегд 8.Б., Бт ВТО., Вепебк! М., Ке11ебег К., Ситттд Ό.Α., К1ебе1 С.Е. Шдй 1еуе1 ехргеввюп оп а сббтепс апб-дапдбов1бе СЭ2 аийЬобу: деиотк карра вес.|иепсев нпргосе ехргеввюп ίη СОЗ апб С11О се11в. Вю1ееЬио1о§у (Ν.Υ.) 10, 1992, с. 1121-1127.

Си М.В., Кет БА., Тобб Р. и Котра1а Ό.8. ЕГГес! оГ атрййсайоп оГ бПГг аиб 1ас Ζ деиев оп дго\\1б апб Ье1а-да1ас1ов1баве ехргеввюп ίη виврепвюп сийитев оГ гесотЬшапС МО се11в. Су1о1есбпо1оду 9, 1992, с. 237-245.

КаиГтап К.1. 8е1есбоп аиб соатрбйсабоп оГ бе!его1одопв деиев ίη таттайаи се11в. Ме1бобв ЕпхутоГ 185, 1990, с. 537-566.

КаиГтап К.1. и 8багр Р.А. Атрййсайоп аиб ехргеввюп оГ вецпепсев со!гапвГес1еб \\йб а тоби1аг б1бубгоГо1а!е тебисСаве сотр1етеп1агу биа деие. 1. Мо1. Вю1. 159, 1982, с. 601-621.

КаиГтап К.Б, Мийба Р., 1пдойа Э.Е., Υеиηд СТО. и Ке11етв К.Е. 8е1есбоп апб атрбПсабоп оГ бе1его1одоив деиев епсобтд абеповте беат1паве ίη таттайаи се11в. Ргос. №11. Асаб. 8сГ И.8.А. 83, 1986, с. 3136-3140.

Раде М.1. и 8убепбат М.А. Мдб 1еуе1 ехргеввюп оГ 1бе бптатхеб тоиос1опа1 аийЬобу СатраИ-ΙΗ ίη Сбтеве батв1ег оуагу се11в. Вю1есбио1оду (Ν.Υ.) 9, 1991, с. 64-68.

РаПаугебй М.С., Пе1етева Р.З., Кове11е С., Сгау БУТО, Уигт Р.М. ЕГГес1в оГ те1йо1теха1е оп 1гапвГес1еб ΩΝΛ в1аЫб1у ίη таттайаи се11в. Мо1. Се11 Вю1. 10, 1990, с. 401-404.

Репбве С.Б, Кагкаге δ. и Вайеу БЕ. ЕГГес1 оГ с1оиеб деие боваде ои се11 дго\\1б апб йераййв В вигГасе апбдеп вуп!бев1в апб весгейои ίη гесотЬтаП СТО се11в. Вк1есбио1оду апб Вкепдтеейпд, 40, 1992, с. 119-129.

Риск Т.Т. Тбе депейсв оГ вотайс таттайаи се11в. Абу. Вю1. Меб. Рбув. 5, 1957, с. 75-101.

8сб1тке К.Т., КаиГтап КБ, А11 Р.У. и Ке11етв К.Р. Сепе атрййсайоп апб бгид гев1в1аисе ίη сийигеб типе се11в. 8с1еисе 202, 1978, с. 1051-1055.

81топвеп С. и Беутвоп А.Э. 1во1айоп апб ехргеввюп оГ ап а11егеб тоиве б1бубгоГо1а1е гебис1аве с^NΑ. Ргос. №Й. Асаб. 8ст Ц.8.А. 80, 1983, с. 2495-2499.

Зпарка К.М., Се 8., Тгавк 1. и КоЬейвоп Р. ипЬа1аисеб дго\\1б ίη тоиве се11в \\йб атрббеб ббГг деиев. Се11 РгойГ. 30, 1997, с. 385-399.

Иг1аиЬ С. и Сбавт Б.А. 1во1айоп оГ Сбтеве батв1ег се11 тн!ап1в бейаей ίη б1бубгоГо1а1е гебис1аве асйуйу. Ргос. №Й. Асаб. 8ст Ц.8.А. 77, 1980, с. 4216-4220.

Иг1аиЬ С., Кав Е., Саго1бегв А.М. и Сбавт Б.А. Эе1ебоп оГ 1бе б1р1о1б б1бубгоГо1а1е гебис1аве 1осив Ггот си11игеб таттайаи се11в. Се11 33, 1983, с. 405-412.

Уегпег К.С. Есопотю аврес1в оГ соттегс1а1 таииГас1ше оГ Ькрбагтасеийса1в. 1. Вю1есбио1. 113, 2004, с. 171-182.

Уигт Р.М. и 1огбаи М. Сепе ТгапвГег апб Сепе Атрййсайоп ίη Маттайап Се11в, в: Сепе ТгапвГег апб Ехргеввюп ίη Маттайап Се11в, под ред. 8.С. Макйбев, изд-во Е1веу1ег 8с1епсе В.У., 2003, с. 309-335.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ улучшения клеточного роста клеточной линии яичников китайских хомячков, где рост клеточной линии повышают путем встраивания гетерологичного гена ИИРК, минигена ИИРК, мутанта ИИРК или кодирующей последовательности ИИРК из вида, отличного от вида, из которого получена клеточная линия, отличающийся тем, что повышают активность дегидрофолатредуктазы (ИИРК) в клеточной линии, в которой ИИРК не служит селективным маркером и/или маркером амплификации для гена-мишени, а клеточная линия представляет собой клеточную линию, дефектную по ИИРК или со сниженным уровнем ИИРК, причем клеточная линия, дефектная по ИИРК, является клеточной линией, которая функционально не экспрессирует ИИРК фермент, а клеточная линия со сниженным уровнем ΌΗΕΚ является клеточной линией с низкими уровнями эндогенного ИИРК.
2. Способ по п.1, в котором ген, кодирующий ИИРК, и ген-мишень (СО1), кодирующий целевой продукт, последовательно встраивают в клеточную линию, и кассета экспрессии ИИРК, включающая ИИРК ген, предпочтительно представляет собой предпочтительно экспрессионную единицу только млекопитающего, которую встраивают в клеточную линию во время последующей стадии встраивания ИИРЯ, и/или селекцию гена-мишени, который кодирует целевой продукт, осуществляют в отсутствии метотрексата (МТХ).
3. Способ по пп.1, 2, в котором клетки клеточной линии содержат по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 3 копии гена ИИРК.
4. Способ по пп.1-3, в котором клеточная линия уже трансфицирована геном-мишени (ОО1).
5. Способ по пп.1-4, в котором клеточная линия представляет собой клеточную линию млекопитающего, такую как клеточная линия 0Η0, предпочтительно клеточная линия представляет собой ΟΗΟИО44 или 0ΗΟ-θυΚΧ-Β11, предпочтительно №0-0044.
6. Способ по пп.3-5, в котором селекцию гена-мишени, который кодирует целевой продукт, осуществляют в присутствии гипоксантина и тимидина (ΗΤ) и в отсутствие МТХ.
7. Способ по пп.1-6, в котором ИИЕК. встраивают в клеточную линию с помощью плазмид, отличной от плазмиды с геном-мишенью, кодирующим целевой продукт.
8. Способ по п.7, в котором трансфекцию плазмидой, содержащей ИИЕК, осуществляют последовательно или параллельно с плазмидой, содержащей ген-мишень.
9. Способ по п.8, в котором трансфекцию плазмидой, содержащей ИИЕК, осуществляют последовательно с плазмидой, содержащей ген-мишень, причем клеточную линию предварительно трансфицируют первой плазмидой, которая содержит ген-мишень, функционально связанный с селективным маркером, отличным от ОИРК.
10. Способ по пп.1-9, в котором клеточная линия содержит по меньшей мере один другой маркер амплификации, такой как глутаминсинтетаза (08), аденозиндеаминаза (АОА) или цитозиндеаминаза (СИА) и/или по меньшей мере один другой селективным маркер, такой как ген, обусловливающий устойчивость к пуромицину, неомицину или блеомицину.
11. Способ создания продуктивной линии клеток-хозяев, отличающийся тем, что (а) трансфицируют клетку-хозяина, дефектную по ОИРК или с пониженным уровнем ИИЕК, по меньшей мере одним геном-мишени, кодирующим целевой продукт, который находится по меньшей мере на одной первой плазмиде и функционально связан с селективным маркером/амплификации, отличным от ОИРК, (б) встраивают кассету экспрессии ОИРК, локализованную на плазмиде, отличной от плазмиды, указанной на стадии (а), (в) отбирают стабильно трансфицированные клетки с помощью селективного маркера, указанного на стадии (а), где характеристики роста и клеточной плотности, полученные у указанной клетки, лучше и выше, чем у соответствующей нетрансфицированной клеточной линии, причем клеточная линия, дефектная по ОИРК, является клеточной линией, которая функционально не экспрессирует ΟΗΕΚ фермент, а клеточная линия со сниженным уровнем ИИРК является клеточной линией с низкими уровнями эндогенного ИИРК.
12. Способ по п.11, в котором порядок стадий (а) и (б) изменяют и/или ИИРК представляет собой единицу, которая экспрессируется только в клетках млекопитающего, которую встраивают в клеточную линию на стадии (б).