JP2010516264A

JP2010516264A - 細胞増殖の改善

Info

Publication number: JP2010516264A
Application number: JP2009546739A
Authority: JP
Inventors: ヒットカウフマン; ローレフローリン; エリックベッカー
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムファルマゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツングウントコンパニーコマンディトゲゼルシャフト
Priority date: 2007-01-24
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2010-05-20
Also published as: BRPI0807798A2; WO2008090148A2; KR20090112725A; EA200900984A1; IL199639A0; MX2009007790A; AU2008208862A1; EA018099B1; AU2008208862B2; IL199639A; WO2008090148A3; EP1953222A1; US20100086967A1; NZ579204A; HK1137482A1; CN101589140B; US8535940B2; CA2675344A1; EP2126061A2; CN101589140A

Abstract

本発明は、細胞培養技術の分野に関する。本発明は、細胞増殖、特にバイオ医薬品産生宿主細胞の増殖を改善する方法に関する。本発明は、さらに、前記の方法により作製された細胞を用いてタンパク質を生産する方法にも関する。

Description

本発明は、細胞培養技術の分野に関する。本発明は、産生宿主細胞株を作製する方法に加えて細胞増殖を改善する方法にも関する。本発明は、さらに、前記の方法により作製された細胞を用いてタンパク質を生産する方法にも関する。

ヒトの治療に使用するバイオ医薬品の市場は急速に拡大を続けており、270の新規バイオ医薬品が臨床研究において評価中であり、2003年予想売上高は300億ユーロである(Werner 2004)。現在、ヒトタンパク質に正しくプロセッシングおよび修飾を行うその能力により、哺乳動物細胞からますます多くのバイオ医薬品が生産されている。従って、哺乳動物細胞からの、首尾良い高収量のバイオ医薬品生産は非常に重要であり、それはそのプロセスに用いられる組換えモノクローナル細胞株の特質によって決まる。

バイオ医薬品生産プロセスにおいて、収量は2つの要素:宿主細胞の特異的生産性(P_spec)およびIVC(所望のタンパク質を生産する生菌の経時的積分値)によって決定される。この相関関係は、次式:Y=P_spec*IVCによって表現される。従って、産物収量を改善するための標準的アプローチは、宿主細胞の生産能力またはバイオリアクター中の生菌濃度を増加させることであることができる。より高いIVCを得るための方法の1つは、細胞の増殖特性を改善すること、すなわち、より早く、より高い最大細胞密度に増殖する細胞を作製することである。

細胞増殖促進は、バイオ医薬品の生産プロセスの複数の側面に強い影響を与える:
-細胞株開発における長期のスケジュール表をもたらす、より短い細胞世代時間;
-単一細胞クローニングおよびその後のより緩慢な増殖後のより高い効率;
-特に大規模バイオリアクターの接種物の場合における、より短いスケールアップ期間;
-IVCと産物収量との間の比例関係による、発酵時間当たりのより高い産物収量。逆に、低いIVCは、より低い収量および/またはより長い発酵時間をもたらす。

酵素ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)は、ヌクレオチド合成の重要な酵素の1つである。この酵素は、プリン合成ブロックおよび他の代謝経路の合成におけるC1単位の一般的な運搬体であるテトラヒドロ葉酸へのジヒドロ葉酸の還元を触媒する。

バイオ医薬品産業および学術研究において、安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択的増殖のための選択および増幅マーカーとしてDHFRは広く使用されている。それに関して、DHFRの発現は、対象遺伝子(GOI)、例えば産物遺伝子の発現カセットの発現に機能的に連結されている。従って、選択条件下でDHFRにより付与される耐性により、間接的にGOI発現細胞が富化される。この機能的カップリングは、通例、両方の遺伝子のバイシストロン性発現または少なくとも同じプラスミドへのそれらの同時配置(co-location)により媒介/構成される。

DHFRは非優性マーカーであるため、この系は、主として内因性DHFR活性を欠く細胞において用いられる。この故に、1980年代において、dhfr陰性チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であるCHO-DG44およびCHO-DUKX(B11)が入手可能になったとき、これらは選り抜きの宿主細胞系へと昇進し、今日では、バイオ医薬品産業における、世界的に最も頻繁に使用される哺乳動物の生産プラットホームとなった。

DHFR酵素は、プリン生合成経路における重要な酵素の1つである。従って、DHFRを欠く細胞は、ヌクレオチド前駆体であるヒポキサンチンおよびチミジン(HT)の培地への添加によりDHFR欠乏を補わない限り生存できない。

驚くべきことに、dhfr欠乏CHO細胞は、HT添加培地においてさえ、親CHO野生型細胞と比較して著しく緩慢かつ低密度に増殖することが本発明において示された(図1)。

dhfr陰性細胞(例えばCHO-DG44細胞)に関して、あるいは大変低い内因性dhfrレベルを有する細胞において、本発明に示すように、このような増殖能の低下は、バイオ医薬品生産プロセスの複数の側面に悪影響を与える:
-細胞株開発における長期のスケジュール表をもたらす、長い細胞世代時間;
-単一細胞クローニングおよびその後のより緩慢な増殖後のより低い効率;
-特に大規模バイオリアクターの接種物の場合における、より長いスケールアップ期間;
-発酵槽運転当たりのより低い産物収量。

これらの不都合は、産生細胞(例えばCHO-DG44またはDUKX(B11))の増殖特性に直接に関連している。これらの不都合は、例えばこれらの細胞が以下の選択および増幅系:グルタミン合成酵素(GS)系、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブレオマイシンなどと共に用いられるとき生じる。

細胞、特にバイオ医薬品産生細胞株における増殖不全を補うために、培養添加物、例えば炭水化物、ヌクレオシド、微量元素、タンパク質加水分解物、植物抽出物などを添加して培地を改善することに大部分の努力が向けられてきた。例えば、培地にタンパク質加水分解物を添加することにより、dhfr陰性細胞の増殖をわずかに増加させることは可能である。しかし、dhfr陰性細胞は野生型細胞の増殖レベルには達しない。

従って、産生宿主細胞、特にCHO-DG44などの内因性DHFRを低〜無発現する産生宿主細胞の増殖特性を改善することが強く必要とされる。さらに、細胞増殖促進、従って発酵におけるより高いIVCは、例えば、短期間の発酵で高産物収量を得るために、細胞内または細胞結合性成分の分離、精製または同定用に高細胞数を採取するために、あるいは細胞株作製、単一細胞クローニングおよび培養のスケールアップのためのスケジュール表を短くするために高バイオマスが必要とされる場合、明らかに有利である。

本発明の全体の目的は、細胞密度すなわち産物収量を増加させるために、バイオ医薬品生産プロセスにおける細胞増殖を改善することである。

産生細胞にDHFR発現カセットを導入することにより、本発明における目的が達成される。このように、驚くべきことに、酵素ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の異種発現により細胞増殖促進が認められることを本発明は明らかにしている。

本発明において、DHFR遺伝子は、他の遺伝子である対象遺伝子(GOI)ための選択マーカーとしての通常の目的の役には立たないが、細胞増殖を増加させる独立した機能を発揮する。この場合において、DHFR遺伝子は、1〜数個の他の発現カセットに機能的に連結/結合されていない。従って、DHFR遺伝子は、GOIと同じプラスミドに位置することもでき、あるいは異なるベクターから発現されることもできる。2つの遺伝子が異なるベクター構築物にある場合、これらのプラスミドは同時トランスフェクトされることもできるし、順次に(sequentially)細胞に導入されることもできる。

驚くべきことに、本発明において、dhfr欠乏が細胞増殖の低下をもたらすことが初めて明らかにされた。さらに、DHFRの再導入がこの問題を解決できることを明らかにすることができた。

DHFR導入遺伝子の再導入は、倍加時間の減少をもたらすばかりでなく、IVCを野生型レベルもしくはそれ以上までも増加させる(図1)。この増殖促進作用は、2つの異なるDG44細胞株において観察できるばかりでなく、機能性DHFR遺伝子でトランスフェクトされたCHO DUKX B11細胞にも適用できる。しかしながら、ピューロマイシンまたはネオマイシン耐性カセットを含む発現構築物でのトランスフェクションは、細胞増殖特性の変化をもたらさない。このことは、増殖促進が、安定なトランスフェクタントの選択および/または培養によるものではなく、dhfr陰性CHO細胞における機能性DHFR発現の回復により引き起こされることを示している。

さらにまた、DHFRの異種発現は遺伝子量効果を示す。すなわち、安定な細胞サブクローンの増殖特性は、活性DHFRタンパク質の発現に比例して増加する(図2a、b)。

特に、この効果は、MTX処理によりDHFR遺伝子が増幅された細胞株には適用されないと考えられる(Gu et al, 1992, Pendse et al, 1992)。これについては、さらなる増殖促進が認められない上記の活性DHFRレベルの閾値または、DHFR酵素の分子濃度を超える高い濃度ではdhfr遺伝子の増幅をアウトバランスし、DHFR活性の純減、すなわち細胞増殖の低下をもたらす、阻害薬MTXの代償性作用を指摘することができる。

本発明は、細胞株、特に低〜無内因性DHFR発現を示す産生細胞株の増殖を促進する一般的な問題を扱う。これらの細胞において、DHFRの異種発現により、増殖特性を著しく改善することができる。

dhfr欠乏宿主細胞におけるDHFRの異種発現は、発酵の増殖および接種プロセスにおける期限の低減、生産プロセスなどにおけるIVCの増加およびそれによるより高い産物収量というさらなる利点を有する。

本発明の宿主細胞および方法は、さらに、バイオ医薬品生産に、特にCHO-DG44またはCHO-DUKX-B11をベースとする宿主細胞系を用いる場合に適用できる。さらに、高収量の組換えタンパク質が望ましい場合はいつも、例えば研究における精製/構造解析のために、あるいは例えば核酸またはタンパク質などの細胞成分の分離/研究のために多量の細胞バイオマスが必要な場合、本発明の宿主細胞および方法を用いることができる。

本発明の好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞および方法は、グルタミン合成酵素(GS)系、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、シトシンデアミナーゼ(CDA)、ピューロマイシン、ネオマイシン、ブレオマイシンなどの選択系(単数または複数)と組み合わせることができる。このことにより、発酵プロセスにおいてより高い増殖速度およびより高い細胞密度をもたらすことができる。

本発明は、先行技術からは明らかではない。

CHO細胞は、1957年に、体細胞遺伝学の研究のために樹立された(PUCK, 1957)。元のK1細胞株の突然変異誘発により、UrlaubおよびChasinは、染色体dhfr遺伝子座のホモ接合型欠失(Urlaub et al., 1983)を示すDHFR欠乏 “CHO DG44” 細胞 (Urlaub and Chasin, 1980)を開発した。この新規樹立細胞株の増殖特性は、該著者らによっては研究されなかった。

CHO DG44細胞は、直ちに、対象遺伝子(GOI)の発現カセットと共に機能性dhfr遺伝子を含む発現ベクターの使用を用いるトランスフェクションの選択法となった。DHFRは非優性選択マーカーであり、従ってDHFRを欠く細胞において用いられるのが最善である。しかしながら、例えば第2優性マーカー(Kaufman et al., 1986)または変異体もしくは細菌dhfr遺伝子(Simonsen and Levinson, 1983;Asselbergs and Widmer, 1995)を用いて選択することにより、内因性DHFR活性を含む宿主細胞にも適用できることが明らかにされた。

選択条件下で、異種DHFR発現はトランスフェクトされた細胞が生存し増殖するのを可能にする。しかしながら、DHFRが非選択条件下で選択マーカーとしてのその機能と独立した増殖の利点を付与することは明らかにされていない。

dhfr遺伝子は、葉酸アナログであるメトトレキサート(MTX)で処理した後の異種遺伝子の共増幅を可能にする増幅マーカーに属する(Schimke et al., 1978; Alt et al., 1978; Pallavicini et al., 1990)。dhfrとGOIとの共増幅は、両方の遺伝子が同じプラスミドに含まれるかどうかにはよらないという決定的な証拠がある(Kaufman and Sharp, 1982)。その結果として、両方の抗体鎖がdhfr遺伝子(Page and Sydenham, 1991)と共に同じDNAプラスミドにあるが、片方の鎖のみがdhfr発現カセットに機能的に結合されている(Fouser et al., 1992)か、またはdhfrが、異なる同時に組み込まれたプラスミドにコードされている(Wurm and Jordan, 2003)かのいずれかによる組換え抗体生産の発現戦略が報告されている。

異なる同時トランスフェクト細胞構築物は、隣接する染色体遺伝子座に同時に組み込まれる傾向があるため、dhfr遺伝子とGOIとの、同じDNAプラスミドにおける構造的連結は共増幅の必要条件ではないことを示す報告がある(Wurm,F.M. and Jordan,M. 2003. Gene Transfer and Gene Amplification in Mammalian Cells. In: Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, ed. S.C.Makrides Elsevier Science B.V., 309-335)。この場合においては、DHFRは、構造的な分離にもかかわらず機能的連関を構成する異種GOIの選択および/または増幅マーカーとして役立つことに注目することが重要である。

対照的に、本発明は、異種DHFRが、GOIの選択/増幅マーカーとしてのその公知の機能のほかにも、細胞増殖の改善においてまったく独立した機能を発揮するという観察に基づく。

興味深いことに、DHFR高発現と、異種遺伝子増幅の望ましい効果を妨げる細胞増殖の低下とを結びつける多数の報告が存在する。大腸菌(Escherichia coli)およびサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)を用いたこれまでの研究で、dhfr遺伝子コピー数の増幅には、比増殖速度の低下が付随して起こることが明らかにされた(Bailey et al, 1986)。Guらは、MTX処理によるdhfr遺伝子増幅後の、β-ガラクトシダーゼ発現CHO-DG44細胞における増殖速度の低下を明らかにした(Gu et al, 1992)。Pendseらにより、DHFRに結合されたウイルス導入遺伝子を用いて同様なデータが発表された(Pendse et al, 1992)。特に、2つの研究は、DHFR単独を発現する細胞を含まなかったが、このことは、用いられた複数の導入遺伝子の個別の寄与について結論することを妨げている。重要なことに、彼等は、dhfrを発現する増幅細胞と非増幅細胞の増殖特性を比較しただけである。トランスフェクトしていないCHO-DG44は含まれなかった。

Snapkaらは、NIH3T3由来細胞において、dhfr遺伝子コピー数の増加に伴う細胞増殖の低下を明らかにした(Snapka et al, 1997)。興味深いことに、提案された機構とは対照的に、彼等はまた、MTX媒介dhfr増幅後により高い細胞密度に増殖する他の付着細胞株を明らかにした。彼等は、この効果を、懸濁液で増殖する細胞とは関連しない、接触阻止の低下に帰した。

総合すれば、DHFRの異種発現が、CHO細胞、特にCHO DG44およびCHO DUXX-(B11)細胞における増殖特性の改善をもたらすことが、本発明において初めて明らかにされた。DHFRのこの機能は、他のdhfr陰性またはdhfr減少細胞株における細胞増殖速度を高めるためにも使用できると考えられる。

異種DHFRによる増殖の改善を示す図である。(a)流加プロセスにおける細胞増殖曲線を示す図である。振盪フラスコ内で細胞を5日間増殖させ、3日目からは24時間ごとに培養液を添加した。CEDEX装置を用いて、毎日生菌数を測定した。以下の細胞を比較した:野生型(WT)CHO細胞(-●-;n=4);dhf陰性DUX-B11(-△-;n=2)および異なる供給元からの2つのDG44細胞株(-■-;n=4);ネオマイシン(n=6、データは示さず)もしくはピューロマイシン(n=6、データは示さず)耐性遺伝子またはdhfr遺伝子を含むベクターで安定的にトランスフェクトされたDG44細胞プール(-◆-、n=9)。独立した5つの実験からの代表的な増殖曲線を示す。(b)(a)で示した細胞の相対IVCを示す図である。5日目における積分細胞面積を算出し、100%として設定したWTレベルに対してプロットした。エラーバーは、少なくとも3つの独立した実験の標準偏差値を示す。(c)長期培養における増殖特性を示す図である。細胞を0.3〜2.5E06細胞/mlの細胞密度に維持し、2〜3日ごとに、8継代培養にわたって分割した。増殖速度(黒い棒)および倍加時間(陰影棒)を算出し、野生型CHO細胞、DG44細胞およびdhfrでトランスフェクトされたDG44細胞に対してプロットした。用量依存的増殖促進を示す図である。(a)DHFRでトランスフェクトされたサブクローンにおける細胞増殖促進を示す図である。DHFR発現カセットのCHO DG44細胞への異種導入により、DHFRでトランスフェクトされた安定な6つの細胞プールを作製した。これらから、FACSベース単一細胞クローニングによりクローン細胞集団を得、流加発酵にかけた。6日目におけるDHFRクローンのIVCを算出し、1として設定した親DG44細胞株のIVCに対してプロットした。(b)相対DHFR発現を示す図である。前記の細胞から全RNAを分離し、定量的リアルタイムPCRを行って、DHFR特異的mRNA転写産物を測定した。正規化のためにβチューブリンを用いた。

発明の詳細な説明
定義
一般的な実施形態“含む(comprising)”または“含まれる(comprised)”は、より具体的な実施形態“からなる(consisiting of)”を含む。さらにまた、単数形および複数形は、限定の意味では用いられない。

本発明において用いられる用語は、以下の意味を有する。

用語“DHFR欠乏”は“DHFR陰性”と同じ意味である。これは、DHFR酵素を機能的に発現しない細胞を説明している。これは、DHFR遺伝子のホモ接合型欠失または変異のいずれかにより引き起こすことができる。

用語“DHFR減少”は、低い内因性DHFRレベルを有する細胞、例えばDHFR遺伝子に関してヘテロ接合型の細胞を意味する。

用語”生菌濃度の経時的積分値“(IVC)は、経時的にプロットした細胞の増殖曲線下の面積を意味し、例えば数日から数週間運転する生産プロセスにおける細胞の増殖性能を説明するために一般的に用いられるパラメータである。

用語“細胞培養”は、細胞の増殖に適した条件下で1つの容器に培養した多数の細胞を意味する。

本発明の目的における“宿主細胞”は、細胞、例えばハムスター細胞、好ましくはBHK21、BHK TK^-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1およびCHO-DG44細胞またはこれらの細胞株のいずれかの亜株/子孫である。CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1およびBHK21が特に好ましく、CHO-DG44およびCHO-DUKX細胞がよりさらに好ましい。本発明の他の実施形態において、宿主細胞は、マウス骨髄腫細胞、好ましくはNS0およびSp2/0細胞またはこれらの細胞株のいずれかの亜株/子孫を意味する。本発明の目的に用いることができるマウスおよびハムスター細胞の例はまた、表1に要約されている。しかしながら、これらの細胞の亜株/子孫、他の哺乳動物細胞(ヒト、マウス、ラット、サルおよびげっ歯類細胞株を含むが限定されない)または真核細胞(酵母、昆虫および植物細胞を含むが限定されない)もまた、本発明の目的、特に生物医薬品タンパク質の生産に用いることができる。

樹立され、適応され、無血清条件で、場合により動物起源のタンパク質/ペプチドを含まない培地中で完全に培養した宿主細胞が最も好ましい。ハムF12培地(Sigma, Deisenhofen, Germany)、RPMI-1640(Sigma)、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM; Sigma)、最小必須培地(MEM; Sigma)、イスコフ修飾ダルベッコ培地(IMDM; Sigma)、CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad, CA)、CHO-S-Invtirogen)、CHO無血清培地(Sigma)およびCHO無タンパク質培地(Sigma)などの市販培地が典型的で適切な培養液である。いずれの培地にも、必要に応じて種々の化合物を添加することができる。添加物の例には、ホルモンおよび/または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン様成長因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩)、緩衝液(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン、チミジン)、グルタミン、グルコースまたは他の同等のエネルギー源、抗生物質、微量元素がある。任意の他の必要な添加物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含むことができる。本発明において、無血清培地の使用が好ましいが、適切な量の血清を添加した培地もまた、宿主細胞の培養に用いることができる。選択遺伝子を発現する遺伝子改変細胞の増殖および選択のために、適切な選択剤が培地に添加される。

用語“タンパク質”は、アミノ酸残基配列またはポリペプチドと同義で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーのことを言う。これらの用語はまた、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化またはタンパク質プロセシングを含む反応により翻訳後修飾を受けるタンパク質を含む。分子が、その生物機能活性を維持したままで、ポリペプチドの構造に修飾および改変、例えば他のタンパク質への融合、アミノ酸配列置換、欠失または挿入を行うことができる。例えば、ポリペプチドまたはその基礎をなす核酸コード配列に特定のアミノ酸配列置換を行って、同様な性質を示すタンパク質を得ることができる。

対象タンパク質をコードする対象遺伝子を有する発現ベクターもまた、選択増幅マーカー遺伝子を含むことができる。

用語“選択条件”は、対応する選択マーカーを含まない細胞の増殖または生存を可能にしない条件のことを言う。添加剤例えば抗生物質を含む培地または必須の増殖成分を欠く培地を用いることにより、選択条件を作成することができる。

用語“選択マーカー(selectable markerまたはselection marker)”は、選択条件下で細胞の増殖/生存を可能にするマーカーに用いられる。選択マーカーピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(PAC)の例において、PAC遺伝子細胞のみが、抗生物質ピューロマイシンを含有する選択培地で生存する。

用語“増幅マーカー(amplifiable markerまたはamplification marker)”は、マーカー(例えばDHFR)および周辺DNA領域の遺伝子コピー数の増加をもたらす選択剤の存在下または選択剤(例えばメトトレキサート(MTX))での処理により増幅される(例えば2倍、3倍、多数倍)遺伝子に用いられる。

“選択増幅マーカー遺伝子(selectable amplifiable marker gene)”は、通例、これらの条件下で真核細胞の増殖に必要な酵素をコードする。例えば、選択増幅マーカー遺伝子は、それによりトランスフェクトされた宿主細胞が選択剤であるメトトレキサート(MTX)の存在下で増殖するとき遺伝子が増幅されるDHFRをコードすることができる。表3における、限定するものではない典型的な選択遺伝子もまた増幅マーカー遺伝子であり、本発明を実施するためにこれらを使用できる。表3に列挙した選択増幅マーカー遺伝子の概説については、Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-566 (1990) を参照のこと(参照により本願に組み込まれる)。よって、選択増幅マーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)、グルタミン合成酵素、CAD、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、UMP合成酵素、IMP5'-脱水素酵素、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、HGPRTase、チミジンキナーゼ、チミジル酸合成酵素、P-糖タンパク質170、リボヌクレオチドレダクターゼ、アスパラギン合成酵素、アルギニノコハク酸合成酵素、オルニチンデカルボキシラーゼ、HMG-CoAレダクターゼ、アセチルグルコサミン転移酵素、スレオニルtRNA合成酵素またはNa⁺K⁺-ATPアーゼの機能を有するポリペプチドをコードする、本明細書記載の任意の方法により遺伝子改変された宿主細胞が本発明に含まれる。

好ましい選択増幅マーカー遺伝子は、プリンの生合成に必要なジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードする遺伝子である。DHFR遺伝子を欠く細胞は、プリン欠乏培地では増殖しない。従って、プリン欠乏培地で増殖する細胞における遺伝子を選択し増幅するための優性選択マーカーとしてDHFR遺伝子は有用である。DHFR遺伝子と共に用いられる選択剤はメトトレキサート(MTX)である。

用語“DHFR遺伝子”または“dhfr”は、活性ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質をコードする任意の核酸を意味する。これには、1以上のイントロン、cDNA配列または、イントロンの有り無しでのDHFR調節配列およびコード配列を含むいわゆる“ミニ遺伝子”を含むゲノムDHFR配列を含む。

選択増幅マーカーとしての、DHFRをコードする遺伝子を用いるための適切な宿主細胞は哺乳動物細胞であり、好ましくはマウス骨髄腫またはハムスター細胞である。DHFR活性が欠損したCHO-DUKX(ATCC CRL-9096)およびCHO-DG44(Urlaub et al., Cell 33[2], 405 - 412, 1983)細胞がより好ましい。DHFR増幅法を他の細胞型に広げるために、メトトレキサートへの感受性が低下したタンパク質をコードするDHFR変異体遺伝子を、内因性野生型DHFR遺伝子を正常数含む宿主細胞と共に用いることができる(Simonsonet al., 1983; Wigler et al., 1980; Haberet al., 1982)。

本発明は、バイオ医薬品ポリペプチド/タンパク質の生産のための宿主細胞を作製するのに適している。本発明は、細胞生産性の向上した細胞による、多数の異なる対象遺伝子の高収量発現に特に適している。

“対象遺伝子”(GOI)、“選択配列”または“産物遺伝子”は、本明細書において同じ意味を有し、対象産物または“対象タンパク質”をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指し、用語”所望産物“を用いて言及することもある。選択配列は完全長または短縮型遺伝子、融合またはタグ付き遺伝子であることができ、cDNA、ゲノムDNAまたはDNAフラグメントであることができ、好ましくはcDNAであることができる。選択配列は、天然配列、すなわち天然に存在する形(単数または複数)であることもでき、望ましい変異または他の修飾を受けたものであることもできる。これらの修飾は、選択された宿主細胞、ヒト化またはタグ化におけるコドン使用を最適化するためのコドン最適化を含む。選択配列は、分泌、細胞質、核内、膜結合型または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。

“対象タンパク質”は、タンパク質、ポリペプチド、それらのフラグメントであるペプチドを含み、それらのすべては選択された宿主細胞内で発現できる。所望のタンパク質は、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用できる、かつ/または治療もしくは診断用途を有する、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体およびそれらの誘導体またはフラグメントならびに任意の他のポリペプチドであることができる。所望のタンパク質/ポリペプチドの例を以下にも示す。

モノクローナル抗体などのより複雑な分子の場合、GOIは、2つの抗体鎖の1つまたは両方をコードする。

“対象産物”は、アンチセンスRNAであることもできる。

対象タンパク質または所望のタンパク質は、上で述べたものである。特に、所望のタンパク質/ポリペプチドまたは対象タンパク質は、例えば、限定するものではないが、インスリン、インスリン様成長因子、hGH、tPA、サイトカイン、例えばインターロイキン(IL)、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、インターフェロン(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNωまたはIFNτ、腫瘍壊死因子(TNF)、例えばTNFαおよびTNFβ、TNFγ、TRAIL;G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1およびVEGFである。エリスロポエチンまたは任意の他のホルモン・増殖因子の生産もまた含まれる。本発明記載の方法は、抗体またはそのフラグメントの生産にも好都合に使用できる。このようなフラグメントは、例えばFabフラグメント(抗原結合フラグメント=Fab)を含む。Fabフラグメントは、隣接する定常領域により結合されている両方の鎖の可変領域からなる。これは、例えばパパインを用いるプロテアーゼ消化により通常の抗体から得ることができるが、他方では、遺伝子工学により同様なFabフラグメントを製造することもできる。さらなる抗体フラグメントにはF(ab‘)2フラグメントを含み、これはペプシンを用いるタンパク質切断により製造することができる。

対象タンパク質は、好ましくは、分泌ポリペプチドとして培地から回収されるが、分泌シグナルを持たないで発現される場合、宿主細胞溶解物から回収することができる。対象タンパク質の実質的に均一な調製物が得られる方法で、他の組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質から対象タンパク質を精製する必要がある。第1ステップとして、細胞および/または細胞破片が培地または溶解物から除去される。その後、例えばイムノアフィニティまたはイオン交換カラム分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、Sephadexクロマトグラフィー、シリカまたは陽イオン交換樹脂(例えばDEAE)クロマトグラフィーにより、混入物質である可溶性タンパク質、ポリペプチドおよび核酸から対象産物が精製される。一般に、宿主細胞により発現される異種タンパク質を精製する方法を当業者に教える方法は当該分野で公知である。このような方法は、例えば、Harris and Angal, Protein Purification Methods, in Rickwood and Hames eds., The Practical Approach Series, IRL Press (1995) またはRobert Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag (1988) に記載されている(共に参照により本願に組み込まれる)。

遺伝子工学手法を用いれば、H鎖(VH)およびL鎖(VL)の可変領域のみからなる短縮抗体フラグメントを製造することが可能である。これらはFvフラグメント(フラグメント可変(Fragment variable)=可変部分のフラグメント)と呼ばれる。これらのFvフラグメントは、定常鎖のシステインによる2本鎖の共有結合を欠くため、Fvフラグメントは多くの場合安定化されている。H鎖とL鎖の可変領域を、短いペプチドフラグメント、例えば10〜30アミノ酸、好ましくは15アミノ酸で連結することは有利である。この方法により、ペプチドリンカーにより連結されたVHおよびVLからなる一本のペプチド鎖が得られる。この種の抗体タンパク質は一本鎖Fv(scFv)として知られる。先行技術で既知のこの種のscFv抗体タンパク質の例は、Hustonら(1988, PNAS 16: 5879-5883)に記載されている。

近年、多量体誘導体としてscFvを製造するための種々の戦略が開発されてきた。このことは、特に、結合アビディティの増加に加えて、薬物動態学的性質および生体内分布特性の改善を示す組換え抗体を導くことを目的としている。scFvの多量体化を達成するために、多量体化ドメインを有する融合タンパク質としてscFvが製造された。多量体化ドメインは、例えばIgGのCH3領域またはコイルドコイル構造(らせん構造体)、例えばロイシンジッパードメインであることができる。しかしながら、scFvのVH/VL領域間の相互作用を多量体化(例えばダイアボディ、トリアボディおよびペンタボディ)に用いる戦略もある。ダイアボディにより、当業者は二価のホモ二量体のscFv誘導体を意味する。scFv分子におけるリンカーの5〜10アミノ酸への短縮は、鎖間VH/VL重ね合わせが生じているホモダイマーの形成をもたらす。ジスルフィド架橋の取り込みによりダイアボディをさらに安定化させることができる。先行技術でのダイアボディ-抗体タンパク質の例は、Perisicら(1994, Structure 2: 1217-1226)において見出すことができる。

ミニボディにより、当業者は二価のホモ二量体のscFv誘導体を意味する。ミニボディは、二量体化領域として免疫グロブリン、好ましくはIgG、最も好ましくはIgG1のCH3領域を含む、ヒンジ領域(例えば同様にIgG1由来の)およびリンカー領域を介してscFvに連結された融合タンパク質からなる。先行技術でのミニボディ-抗体タンパク質の例は、Huら(1996, Cancer Res. 56: 3055-61)において見出すことができる。

トリアボディにより、当業者は三価のホモ三量体のscFv誘導体(Kortt et al. 1997 Protein Engineering 10: 423-433)を意味する。リンカー配列なしで直接にVH-VLが融合されたScFv誘導体は三量体の形成をもたらす。

二価、三価または四価構造を有し、scFv由来であるいわゆるミニ抗体もまた当業者には公知であろう。多量体化は、二量体、三量体または四量体コイルドコイル構造により行われる(Pack et al., 1993 Biotechnology 11:, 1271-1277; Lovejoy et al. 1993 Science 259: 1288-1293; Pack et al., 1995 J. Mol. Biol. 246: 28-34)。

定義により、宿主細胞に導入された任意の配列または遺伝子は、導入された配列または遺伝子が宿主細胞の内因性配列または遺伝子と同一だとしても、宿主細胞に関しては“異種配列”または“異種遺伝子”または“導入遺伝子”と呼ぶ。

異種遺伝子配列は、“発現ベクター”、好ましくは真核発現ベクター、より好ましくは哺乳動物発現ベクターにより標的細胞に導入できる。ベクターの構築に用いられる方法は当業者に公知であり、種々の出版物に記載されている。特に、プロモーター、エンハンサーなどの機能的構成要素、終結およびポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点ならびにスプライシングシグナルの記載を含む、適切なベクターを構築するための技術は、Sambrookら(1989)およびその引用文献にかなり詳細に概説されている。ベクターは、限定するものではないが、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工/ミニ染色体、またはウイルスベクター例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージを含むことができる。真核発現ベクターは、一般的には、細菌内でのベクターの増殖を促進する原核性配列、例えば複製起点および細菌の選択のための抗生物質耐性遺伝子も含む。ポリヌクレオチドが機能的に連結されたクローニング部位を含む種々の真核発現ベクターが当該分野で公知であり、一部は例えばStratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WIまたはBD Biosciences Clontech, Palo Alto, CAなどの会社から市販されている。

好ましい実施形態において、発現ベクターは、ペプチド/ポリペプチド/対象タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写および翻訳に必要な調節配列である少なくとも1つの核酸配列を含む。

本明細書において、用語“発現”は、宿主細胞内での異種核酸配列の転写および/または翻訳のことを言う。宿主細胞での所望の産物/対象タンパク質の発現レベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量または、本実施例の場合のような、選択配列によりコードされる所望のポリペプチド/対象タンパク質の量のいずれかに基づいて測定できる。例えば、選択配列から転写されたmRNAは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼRNAプロテクション、細胞RNAへのin situハイブリダイゼーションまたはPCRにより定量できる(Sambrook ら(1989); Ausubelら(1987)(改訂版)を参照のこと)。選択配列によりコードされるタンパク質は、種々の方法、例えばELISAウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物活性のアッセイ、FACS分析に続くタンパク質の免疫染色(Sambrook ら(1989); Ausubelら(1987)(改訂版)を参照のこと)またはホモジニアス時間分解蛍光法(HTRF)アッセイにより定量できる。

遺伝子改変細胞またはトランスジェニック細胞をもたらす、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターでの真核宿主細胞の“トランスフェクション”は、当該分野で公知の任意の方法で実施でき、例えばSambrookら(1989)またはAusubelら(1987)(改訂版)に記載されている。トランスフェクション法は、限定するものではないが、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、ポリカチオン(例えばDEAE-デキストラン)媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染およマイクロインジェクションを含む。好ましくは、トランスフェクションは安定なトランスフェクションである。特定の宿主細胞株および細胞型における異種遺伝子の最適のトランスフェクション頻度および発現を与えるトランスフェクション法が好ましい。常法により適切な方法を決定できる。安定なトランスフェクタントに関して、構築物は、宿主細胞内で安定に維持されるために、宿主細胞のゲノムまたは人工染色体/ミニ染色体に組み込まれるか、あるいはエピソームに保持される。

特記しない限り、本発明の実施には、当該技術分野で公知の細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの慣用法を用いる。これらの技術は、最新の文献に十分に開示されている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Presss (1995); Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Puhler ed., VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.) およびHarlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987)を参照のこと。

本発明は、細胞株の細胞増殖を改善する方法であって、前記細胞株のDHFR活性が増強されることを特徴とする前記方法に関する。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、細胞株がDHFR欠乏またはDHFR減少細胞株であることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、DHFRをコードする遺伝子と所望の産物をコードする対象遺伝子(GOI)が前記細胞株に順次導入されることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、DHFR発現カセットが、前記順次DHFR導入ステップ中に前記細胞株に導入される唯一の哺乳動物の発現ユニットであることを特徴とする。

本発明の他の特定の実施形態において、本方法は、所望の産物をコードする対象遺伝子の選択が、メトトレキサート(MTX)の非存在下で行われることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、DHFRの遺伝子量が増加されることを特徴とする。

本発明のさらなる特定の実施形態において、本方法は、前記細胞株の細胞が、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3つのDHFR遺伝子コピーを含むことを特徴とする。

本発明のさらなる特定の実施形態において、本方法は、前記細胞株の細胞が、少なくとも5つ、少なくとも10または少なくとも25のDHFR遺伝子コピーを含むことを特徴とする。

本発明の他の特定の実施形態において、本方法は、DHFRの発現レベルが増加されることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、DHFRの発現レベルが少なくとも2倍増加されることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、DHFRの発現レベルが少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍または20倍増加されることを特徴とする。

本発明の特定の実施形態において、本方法は、異種DHFR遺伝子、DHFRミニ遺伝子、DHFR変異体または他の細胞株種からのDHFRをコードする配列を導入することによりDHFR活性が増強されることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、前記細胞株が対象遺伝子(GOI)によりすでにトランスフェクトされていることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、前記細胞株がCHO細胞株などの哺乳動物細胞株であることを特徴とする。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、細胞株がCHO-DG44またはCHO-DUKX-B11であり、好ましくはCHO-DG44であることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、所望の産物をコードする対象遺伝子の選択が、ヒポキサンチンおよびチミジン(HT)の存在下かつMTXの非存在下で行われることを特徴とする。

本発明の他の特定の実施形態において、本方法は、細胞株の、所望の産物をコードする対象遺伝子とは異なるプラスミドにDHFRがトランスフェクトされ、DHFRが対象遺伝子の選択および/または増幅マーカーとして機能しないことを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、DHFRを含むプラスミドが、対象遺伝子を含むプラスミドと順次または同時にトランスフェクトされることを特徴とする。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、DHFRを含むプラスミドが、対象遺伝子を含むプラスミドと順次にトランスフェクトされることを特徴とする。

本発明の他の好ましい実施形態において、本方法は、前記細胞株が、DHFR以外の選択マーカーに機能的に結合された対象遺伝子を含む第1プラスミドであらかじめ(previously)トランスフェクトされていることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、前記細胞株が、異種DHFRおよび少なくとも1つの他の増幅マーカー、例えばグルタミン合成酵素(GS)、アデノシンデアミナーゼ(ADA)またはシトシンデアミナーゼ(CDA)を含むことを特徴とする。

本発明のさらなる特定の実施形態において、本方法は、前記細胞株が異種DHFRおよびGSを含むことを特徴とする。

本発明の他の特定の実施形態において、本方法は、前記細胞株が異種DHFRおよび少なくとも1つの他の選択マーカー、例えばピューロマイシン、ネオマイシンまたはブレオマイシンを含むことを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、対象遺伝子に機能的に結合された選択マーカーを用いることにより、安定的にトランスフェクトされた細胞が選択されることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、対象遺伝子に機能的に結合された、DHFRではない選択マーカーを用いることにより、安定的にトランスフェクトされた細胞が選択されることを特徴とする。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、前記安定的にトランスフェクトされた細胞株が達する細胞密度が、対応するトランスフェクトしていない細胞株の細胞密度より少なくとも2倍高いことを特徴とする。

さらにまた、本発明は、
(a)DHFR以外の選択および/または増幅マーカーに機能的に結合された、少なくとも1つの第1プラスミドに所望の産物をコードする少なくとも1つの対象遺伝子で宿主細胞をトランスフェクトし、
(b)ステップaのプラスミドとは異なるプラスミドに位置するDHFR発現カセットを導入し、
(c)ステップaの選択マーカーを用いて、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択する
ステップを特徴とする、産生宿主細胞株を作製する方法であって、前記細胞が達する増殖特性および細胞密度が、対応するトランスフェクトしていない細胞株の増殖特性および細胞密度と比較して優れ、かつ、より高い前記方法に関する。

好ましくは、本発明は、
(a)DHFR以外の選択および/または増幅マーカーに機能的に結合された、少なくとも1つの第1プラスミドに所望の産物をコードする少なくとも1つの対象遺伝子でDHFR欠乏またはDHFR減少宿主細胞をトランスフェクトし、
(b)ステップaのプラスミドとは異なるプラスミドに位置するDHFR発現カセットを導入し、
(c)ステップaの選択マーカーを用いて、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択する
ステップを特徴とする、産生宿主細胞株を作製する方法であって、前記細胞が達する増殖特性および細胞密度が、対応するトランスフェクトしていない細胞株の増殖特性および細胞密度と比較して優れ、かつ、より高い前記方法に関する。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、ステップaとステップbの順序が入れ替わっていることを特徴とする。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、ステップaとステップbの順序が反対になることを特徴とする。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、DHFRが、ステップb中に前記細胞株に導入される唯一の哺乳動物の発現ユニットであることを特徴とする。

さらにまた、本発明は、上記の方法のいずれか1つにより得ることが可能な宿主細胞に関する。

本発明の特定の実施形態において、本方法は、細胞が、CHO細胞などの哺乳動物宿主細胞であることを特徴とする。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、細胞がCHO-DG44またはCHO-DUKX-B11であることを特徴とする。

さらにまた、本発明は、細胞株、例えば哺乳動物細胞株においてタンパク質を生産する方法であって、
(a)上記の方法の1つで、対象タンパク質をコードする対象遺伝子を含む宿主細胞を作製し、
(b)細胞の増殖を可能にする条件下で細胞を培養し、
(c)例えば、上清から細胞を分離することにより対象タンパク質を採取し、
(d)対象タンパク質を精製する
ステップを特徴とする前記方法に関する。

好ましくは、本発明は、
DHFR欠乏またはDHFR減少細胞株、例えば哺乳動物細胞株においてタンパク質を生産する方法であって、
(a)上記の方法の1つで、対象タンパク質をコードする対象遺伝子を含む宿主細胞を作製し、
(b)細胞の増殖を可能にする条件下で細胞を培養し、
(c)例えば、上清から細胞を分離することにより対象タンパク質を採取し、
(d)対象タンパク質を精製する
ステップを特徴とする前記方法に関する。

本発明の特定の実施形態において、本方法は、対象タンパク質が分泌タンパク質であることを特徴とする。

本発明の他の実施形態において、本方法は、細胞が、細胞内または膜貫通タンパク質(membrane standing protein)をコードする導入遺伝子をさらに含むことを特徴とする。

本発明の好ましい実施形態において、本方法は、導入遺伝子がDHFR発現カセットと同じプラスミドに位置することを特徴とする。

本発明のさらに好ましい実施形態において、本方法は、導入遺伝子が抗アポトーシス遺伝子または転写因子をコードすることを特徴とする。

本発明の特定の好ましい実施形態において、本方法/宿主細胞は、それらが浮遊培養で実施/増殖されることを特徴とする。

本発明の特定の好ましい実施形態において、本方法/宿主細胞は、それらが無血清培地で実施/増殖されることを特徴とする。

上記に一般的に記載した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解されるが、これらは、単に本発明の特定の実施形態を説明するために本願に含まれるものであって、本発明をなんら限定するものではない。

材料および方法
細胞培養
生産規模および開発規模で用いられるすべての細胞株は、5%CO₂を含有する大気中、37℃の温度で、インキュベーター(Thermo, Germany)内の表面通気T-フラスコ(Nunc, Denmark)中に、または振盪フラスコ(Nunc, Denmark)中に連続種培養物として維持する。

種培養物(seedstock culture)は、2〜3E5細胞/mLの播種密度で2〜3日ごとに継代培養する。すべての培養物において、血球計を用いて細胞密度を測定する。生存率はトリパンブルー排除法で評価する。すべてのCHO産生細胞はBI(登録商標)培地で培養するが、その組成は明らかにできない。

流加培養
125ml振盪フラスコ中、抗生物質またはMTX(Sigma-Aldrich, Germany)を含まないBI(登録商標)生産培地30mlに、細胞を3E05細胞/mlで播種する。培養物を37℃、5%CO₂において120rpmで撹拌し、3日目以後は5%CO₂は2%に低下させる。pH、pO₂、pCO₂、グルコース、乳酸およびグルタミン濃度を含む培養パラメータを毎日測定し、必要に応じてNaCO₃を用いてpHをpH7.0に調節する。BI(登録商標)培養液を、24時間おきに30ml/L*dで添加する。CEDEX自動細胞測定装置(Innovatis)を用いて、トリパンブルー排除により細胞密度および生存率を測定する。

単一細胞選別
分析および細胞選別のために、パルス処理、選択強調モジュールおよび自動細胞分取ユニットを備えたFACS Vantage(Becton Dickinson)フローサイトメーターを用いる。前方散乱および側方散乱(FSC/SSC)のドットプロットに関して、単一の生細胞にゲートを設定する。自動細胞分取ユニットを用いて選別された細胞を、増殖培地200μLを含む96ウェルマイクロタイタープレートに1細胞/ウェルで分取する。滅菌選別のために、以下の溶液:0.1N NaOH;0.1%トリトン-X-100;70%エタノールのそれぞれを1時間シース液として通過させることにより、セルソーターの流路を洗浄し滅菌する。続いて、PBSを含有する滅菌シースタンクをセルソーターに接続する。

RNAの分離およびRT-PCR
製造業者の使用説明書に従ってTRIzol(登録商標)試薬(Invitrogen, Germany)を用いて増殖している細胞からRNAを分離し、次いでDNase Iを用いて37℃で30分間処理する。全RNA3μgおよびオリゴ(dT)オリゴヌクレオチドから出発して、Cloned AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen, Germany)を用いて第一鎖cDNA(first strand cDNA)合成を行う。Absolute(登録商標)QPCR SYBR(登録商標)Green Fluorescein Mix(ABgene, Surrey, UK)および、MyIQ Real Time Detectionソフトウェア(BioRad, Germany)により制御されるサーマルサイクラーを用いるリアルタイムPCRによりdhfr転写産物レベルにおける量的差異を測定する。すべての実験を3連で行う。DHFR特異的増幅物を作製し、以下のオリゴヌクレオチド:dhfr(センス)配列番号15-ATG-GTT-CGA-CCG-CTG-AAC-TGC-3’;dhfr(アンチセンス)配列番号25’-CCA-CTG-AGG-AGG-TGG-TGG-TCA-TT-3’;チューブリン(センス)配列番号35’-CTC-AAC-GCC-GAC-CTG-CGC-AAG-3’およびチューブリン(アンチセンス)配列番号45’-ACT-CGC-TGG-TGT-ACC-AGT-GC-3’を用いて、チューブリン発現レベルと比較して定量する。

異種DHFR発現は細胞増殖を促進する
DHFR欠乏CHO-DG44(Urlaub & Chasin, Cell 33, 405-412; 1983)およびCHO DUKX-B11(ATCC CRL-9010)を、それぞれピューロマイシンおよびネオマイシンについての選択マーカーを含むDNA構築物またはDHFR遺伝子の発現プラスミドで安定的にトランスフェクトする。それぞれの抗生物質(ピューロマイシンまたはジェネティシン)を含む培地またはHTを含まない選択培地で細胞を選択する。

次いで、得られる安定な細胞プールの増殖特性を、種培養物および、発酵/生産プロセスの確立された縮小モデルを代表する振盪フラスコでの流加培養において比較する[Liu C and Hong L; Biochem. Eng. J. (2001) 7:121-125]。

驚くべきことに、CHO欠乏DG44細胞は、親CHO野生型(wt)細胞と比較して強い増殖低下を示す(図1)。流加培養物において、CHO欠乏DG44細胞はより緩慢に増殖し、より低い最大細胞密度に到達する(図1a、b)。このことは、種培養における増殖速度の低下と一致する(図1c)。

興味深いことに、異種DHFR(配列番号5+6)発現によるDG44dhfr-/-細胞の補完は、完全にこの表現型を救出する。DHFR導入遺伝子の再導入は、倍加時間の減少をもたらすばかりでなく、IVCを野生型レベルもしくはそれ以上までも増加させる。この増殖促進作用は、2つの異なるDG44細胞株において観察できるばかりでなく、機能性DHFR遺伝子でトランスフェクトされたCHO DUKX B11細胞にも適用できる。しかしながら、ピューロマイシンまたはネオマイシン耐性カセットを含む発現構築物でのトランスフェクションは、細胞増殖特性の変化をもたらさない。このことは、増殖促進が、安定なトランスフェクタントの選択および/または培養によるものではなく、dhfr陰性CHO細胞における機能性DHFR発現の回復により引き起こされることを示している。

DHFRは用量依存的に細胞増殖を促進する
DHFRの再導入により媒介される増殖効果が用量依存的かどうかを研究するために、安定にDHFR(配列番号5+6)を発現するサブクローンを作製し、FACSベース単一細胞クローニングにかけて均一なDHFR発現を示すクローン集団を得た。続いて、流加発酵運転において、これらのDHFRクローンの増殖特性を分析した。図2aに示すように、DHFRでトランスフェクトされたサブクローンは、CHO-DG44細胞と比較してはるかに高いIVCレベルに到達し、その差は、6日目までに2.5〜6倍となる。

IVCレベルの増加がDHFR転写産物レベルの促進と関連していたかどうかという問題に取り組むことができるように、親CHO-DG44細胞株に加えてDHFRサブクローンからの全RNAを分離し、定量PCRを行ってDHFR発現を分析した(図2b)。分析したクローンの80%以上において、IVC測定値はDHFR発現強度とよく相関した。このことは、最も高いDHFR転写産物レベルを示したクローンが、発酵プロセスにおいて最も高いIVCを示したことを意味する。これらのデータは、CHO-DG44細胞における異種DHFRの発現が、用量依存的に細胞増殖を増加させることを示唆している。

引用文献リスト

Claims

細胞株の細胞増殖を改善する方法であって、前記細胞株のDHFR活性が増強されることを特徴とする前記方法。
前記細胞株が、DHFR欠乏またはDHFR減少細胞株である、請求項１記載の方法。
DHFRをコードする遺伝子と所望の産物をコードする対象遺伝子(GOI)が前記細胞株に順次導入される、請求項１または２記載の方法。
DHFR発現カセットが、前記順次DHFR導入ステップ中に前記細胞株に導入される唯一の哺乳動物の発現ユニットである、請求項３記載の方法。
所望の産物をコードする対象遺伝子の選択が、メトトレキサート(MTX)の非存在下で行われる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
DHFRの遺伝子量が増加される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
前記細胞株の細胞が、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3つのDHFR遺伝子コピーを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
DHFRの発現レベルが増加される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
DHFRの発現レベルが少なくとも2倍増加される、請求項８記載の方法。
異種DHFR遺伝子、DHFRミニ遺伝子、DHFR変異体または他の細胞株種からのDHFRをコードする配列を導入することによりDHFR活性が増強される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
前記細胞株が対象遺伝子(GOI)によりすでにトランスフェクトされている、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
前記細胞株がCHO細胞株などの哺乳動物細胞株である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
前記細胞株がCHO-DG44またはCHO-DUKX-B11であり、好ましくはCHO-DG44である、請求項１２記載の方法。
所望の産物をコードする対象遺伝子の選択が、ヒポキサンチンおよびチミジン(HT)の存在下かつMTXの非存在下で行われる、請求項２〜１３のいずれか１項記載の方法。
細胞株の、所望の産物をコードする対象遺伝子とは異なるプラスミドにDHFRがトランスフェクトされ、DHFRが対象遺伝子の選択および/または増幅マーカーとして機能しない、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
DHFRを含むプラスミドが、対象遺伝子を含むプラスミドと順次または同時にトランスフェクトされる、請求項１５記載の方法。
DHFRを含むプラスミドが、対象遺伝子を含むプラスミドと順次にトランスフェクトされる、請求項１６記載の方法。
前記細胞株が、DHFR以外の選択マーカーに機能的に結合された対象遺伝子を含む第1プラスミドであらかじめトランスフェクトされている、請求項１７記載の方法。
前記細胞株が、異種DHFRおよび少なくとも1つの他の増幅マーカー、例えばグルタミン合成酵素(GS)、アデノシンデアミナーゼ(ADA)またはシトシンデアミナーゼ(CDA)を含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
前記細胞株が異種DHFRおよびGSを含む、請求項１９記載の方法。
前記細胞株が異種DHFRおよび少なくとも1つの他の選択マーカー、例えばピューロマイシン、ネオマイシンまたはブレオマイシンを含む、請求項１〜２０のいずれか１項記載の方法。
対象遺伝子に機能的に結合された選択マーカーを用いることにより、安定的にトランスフェクトされた細胞が選択される、請求項３〜２１のいずれか１項記載の方法。
前記安定的にトランスフェクトされた細胞株が達する細胞密度が、対応するトランスフェクトしていない細胞株の細胞密度より少なくとも2倍高い、請求項２２記載の方法。
(a)DHFR以外の選択および/または増幅マーカーに機能的に結合された、少なくとも1つの第1プラスミドに所望の産物をコードする少なくとも1つの対象遺伝子でDHFR欠乏またはDHFR減少宿主細胞をトランスフェクトし、
(b)ステップaのプラスミドとは異なるプラスミドに位置するDHFR発現カセットを導入し、
(c)ステップaの選択マーカーを用いて、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択する
ステップを特徴とする、産生宿主細胞株を作製する方法であって、前記細胞が達する増殖特性および細胞密度が、対応するトランスフェクトしていない細胞株の増殖特性および細胞密度と比較して優れ、かつ、より高い前記方法。
ステップaとステップbの順序が入れ替わっている、請求項２４記載の方法。
DHFRが、ステップb中に前記細胞株に導入される唯一の哺乳動物の発現ユニットである、請求項２４または２５記載の方法。
請求項１〜２６記載の方法のいずれか1つにより得ることが可能な宿主細胞。
細胞が、CHO細胞などの哺乳動物宿主細胞である、請求項２７記載の宿主細胞。
細胞がCHO-DG44またはCHO-DUKX-B11である、請求項２８記載の宿主細胞。
DHFR欠乏またはDHFR減少細胞株、例えば哺乳動物細胞株においてタンパク質を生産する方法であって、
(a)対象タンパク質をコードする対象遺伝子を含む、請求項２７〜２９のいずれか1つに記載の宿主細胞を作製し、
(b)細胞の増殖を可能にする条件下で細胞を培養し、
(c)例えば上清から細胞を分離することにより、対象タンパク質を採取し、
(d)対象タンパク質を精製する
ステップを特徴とする前記方法。
対象タンパク質が分泌タンパク質である、請求項３０記載の方法。
細胞が、細胞内または膜貫通タンパク質をコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項３０または３１記載の方法。
導入遺伝子がDHFR発現カセットと同じプラスミドに位置する、請求項３２記載の方法。
導入遺伝子が抗アポトーシス遺伝子または転写因子をコードする、請求項３２または３３記載の方法。