KR100454016B1 - 항예정사 유전자로 형질전환되고 ｄｈｆｒ 유전자가결핍된 신규한 ｃｈｏ 세포주, 그의 제조 방법 및 상기형질전환된 ｃｈｏ 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산방법 - Google Patents

항예정사 유전자로 형질전환되고 ｄｈｆｒ 유전자가결핍된 신규한 ｃｈｏ 세포주, 그의 제조 방법 및 상기형질전환된 ｃｈｏ 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항예정사 유전자로 형질전환되고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 CHO 세포주, 그의 제조 방법 및 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 1) 혈청 함유 배지에서 부착배양하는 CHOdhfr(-) 세포주를 무혈청배지에서의 부유배양에 적응시키는 단계; 및 2) 무혈청 부유 배양에 적응한 CHOdhfr(-) 세포주에 항예정사 유전자를 포함하는 벡터를 도입한 후 항예정사 단백질을 과발현하는 CHO 숙주 세포주를 선별하는 단계로 구성되는 항예정사 단백질을 과발현하고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 CHO 세포주의 제조 방법, 그로부터 제조되는 형질전환된 CHO 세포주 및 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환된 CHO 세포주는 항예정사 단백질의 과발현으로 인하여 예정사가 억제되어 세포의 생존능력이 뛰어나며, 이러한 세포 생존율의 연장은 목적 단백질의 생산성을 높여줄 뿐만 아니라 세포막의 원형(integrity)을 유지하여 생산된 단백질의 질을 향상시킬 수 있으므로, 원하는 목적단백질의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항예정사 유전자로 형질전환되고 ＤＨＦＲ 유전자가 결핍된 신규한 ＣＨＯ 세포주, 그의 제조 방법 및 상기 형질전환된 ＣＨＯ 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산 방법{Novel DHFR-deficient CHO cell line transfected with anti-apoptotic gene, method for preparation thereof and method for production of target proteins using the same}
본 발명은 항예정사 유전자로 형질전환되고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 CHO 세포주, 그의 제조 방법 및 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 1) 혈청 함유 배지에서 부착배양하는 CHOdhfr(-) 세포주를 무혈청배지에서의 부유배양에 적응시키는 단계; 2) 무혈청 부유 배양에 적응한 CHOdhfr(-) 세포주에 항예정사 유전자를 포함하는 벡터를 도입한 후 항예정사 단백질을 과발현하는 CHO 숙주 세포주를 선별하는 단계로 구성되는 항예정사 단백질을 과발현하고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 CHO 세포주의 제조 방법, 그로부터 제조되는 형질전환된 CHO 세포주 및 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
생물학 또는 의학 분야에 있어서 원하는 목적단백질은 주로 형질전환된 세포주를 배양함으로써 얻어질 수 있으며, 이를 위하여 산업적으로 사용되는 방법으로는 CHO dhfr(-) 세포주, CHO K1, BHK 세포주 및 NS0 등을 이용한 방법이 있다(Ogata, et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol.,1993, 38(4), 520-525; Kratje, et al.,Biotechnol. Prog.,1994, 10(4), 410-20; Peakman, et al.,Hum. Antibodies Hybridomas,1994, 5(1-2), 65-74).
이들 세포주 중에서 DHFR이 결핍된 CHO 세포주는 동물세포를 이용하여 목적 단백질을 산업적으로 대량생산하기 위하여 가장 널리 사용되고 있는 숙주세포주이다. DHFR이 결핍된 CHO 세포주가 산업적으로 선호되는 이유는 다음과 같다.
(1) 단백질의 번역 후 수정과정(posttranslational modification), 즉 글리코실화(glycosylation) 과정이나 인산화(phosphorylation) 과정이 인간 세포와 유사하다.
(2) 부착배양 뿐만 아니라 부유배양이 가능하다.
(3) 무혈청 배지에서 다른 세포에 비하여 상대적으로 고농도 배양이 가능하다.
(4) 미생물에 비하여 현저히 낮은 목적 단백질 생산성을 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)/MTX(methotrexate) 유전자 증폭시스템을 이용하여 증가시킬 수 있다.
(5) 안정성이 검증되어 FDA와 같은 감독기관으로부터 허가를 쉽게 받을 수 있다.
이러한 DHFR이 결핍된 CHO 세포주에 목적 유전자를 형질전환시킴으로써 목적 단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주가 제작된다.
재조합 CHO 세포주를 이용하여 산업적으로 목적 단백질을 대량생산하기 위해서는 재조합 CHO 세포주의 무혈청 부유배양이 필수적이다. 전체 배양공정에서 혈청을 제거하여야 하는 이유는 혈청에는 정의되지 않은 다량의 동물성 단백질이 존재하므로 무혈청 배지를 사용하면 하위 정제 공정의 비용과 노력을 감소할 수 있으며, 또한 최근에는 광우병의 발생으로 FDA와 같은 감독기관에서 전체 공정에서 혈청의 제거를 요구하고 있는 실정이다. 그러나, CHO 세포주의 무혈청 부유배양시에는 예정사로 인한 세포사멸이 발생하게 되어 목적단백질의 생산량이 감소하게 되며(Itoh, et al.,Biotechnol. Bioeng.,1995, 48, 118-122; Suzuki, et al.,Cytotechnology,1997, 23, 55-59; Simpson, et al.,Biotechnol. Bioeng.,1997, 54, 1-16), 예정사로 인한 생존율의 감소는 목적 단백질의 생산성을 감소시킬 뿐아니라 사멸된 세포가 배지에서 분해될 때 세포내에 존재하는 각종 분해효소들이 외부로 분비됨에 따라 목적 단백질의 안정성에 영향을 미치게 되고, 분해된 세포의 DNA, 세포파쇄물 등이 하위공정에서의 정제과정을 더욱 복잡하게 한다. 또한 목적단백질의 발현양을 높이기 위해 부틸산 나트륨(sodium butyrate) 등을 첨가하면 예정사로 인한 세포사멸이 증가되는 문제점이 발생하게 된다.
동물세포 배양 중에 발생하는 예정사의 메카니즘은 여러 가지 원인에 의하여 개시 캐스파제(initiator caspase)라는 일종의 단백질 분해 효소가 활성화되면 미토콘드리아의 막전위(membrane potential)가 붕괴되고, 미토콘드리아 내에서 전자전달계에 관여하는 시토크롬(cytochrome) C가 세포질로 분리되어 나오게 된다. 세포질로 분리된 시토크롬 C는 캐스파제 3과 같은 작용 캐스파제(effector caspase)를 활성화시켜 세포막의 인지질의 주요성분인 포스파티딜세린(phophatidylserine)이 세포질 쪽으로 향하는 현상(externalization)을 야기시키고, 이로부터 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 활성화에 의한 DNA 절단 현상이 일어나서 결국 세포가 사멸하게 된다. Bcl-2와 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K 단백질은 이러한 미토콘드리아를 전후하여 일어나는 캐스파제의 활성화를 저해하여 예정사에 의한 세포사멸을 저해하는 기능을 한다(Desagher, et al.,Trends in Cell Biology,2000, 10, 369-376; Reed,et al.,Biochemica et Biophysica Acta,1998, 1366, 127-137; Tsujimoto, et al.,FEBS Letters,2000, 466, 6-10; Li, et al.,Current opinion in cell biology,1999, 11, 261-266).
이에, 본 발명자들은 DHFR이 결핍된 세포주에 항예정사 단백질을 코딩하는 유전자를 형질전환시켜 항예정사 단백질을 과발현하는 CHOdhfr(-) 세포주를 제조하였으며, 상기 세포주를 이용하여 세포사멸을 감소시키고 목표단백질을 대량으로 생산할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항예정사 유전자로 형질전환되고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 CHO 세포주, 그의 제조 방법 및 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포를 이용한 목적단백질의 생산 방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 Bcl-2 유전자를 포함하는 벡터(pIRES-neo-Bcl2)의 유전자지도를 보여주는 개략도이고,
도 1b는 아데노바이러스 유래의 E1B-19K 유전자를 포함하는 벡터(pCDNA3.1-zeo-E1B)의 유전자지도를 보여주는 개략도이고,
도 2의A는 Bcl-2 유전자가 도입되고 DHFR 유전자가 결핍된 CHO 숙주세포에서 Bcl-2 단백질이 과별현되는 것을 보여주는 웨스턴 블롯(Western blot) 사진이고,
도 2의B는 아데노바이러스 유래의 E1B-19K 유전자가 도입되고 DHFR 유전자가 결핍된 CHO 숙주세포에서 E1B-19K 단백질이 과발현되는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이고,
도 3의A는 Bcl-2 단백질을 과발현하고 DHFR이 결핍된 CHO 숙주세포주를 무혈청배지에서 회분식 부유배양하였을 때의 세포의 농도와 생존율을 대조군인 DHFR 결핍된 CHO 숙주세포와 비교한 것을 보여주는 그래프이고,
■ ; bcl2 살아있는 세포, ● ; 대조군 살아있는 세포,
□ ; bcl2 생존율, ○ ; 대조군 생존율
도 3의B는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K 단백질을 과발현하고 DHFR이 결핍된 CHO 숙주세포주를 무혈청배지에서 회분식 부유배양하였을 때의 세포의 농도와 생존율을 대조군인 DHFR 결핍된 CHO 숙주세포와 비교한 것을 보여주는 그래프이고,
▲ ; E1B 살아있는 세포, ● ; 대조군 살아있는 세포,
△ ; E1B 생존율, ○ ; 대조군 생존율
도 4의A는 Bcl-2 단백질을 과발현하고 DHFR이 결핍된 CHO 숙주세포주를 회분배양한 경우, 아크리딘 오랜지(acridine orange)와 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 혼합액의 염색을 통하여 예정사로 죽는 세포의 비율을 보여주는 그래프이고,
■ ; CHO dhfr(-) Bcl2 NVA, ● ; CHO dhfr(-) 대조군 NVA,
□ ; CHO dhfr(-) 대조군 NVN, ○ ; CHO dhfr(-) Bcl2 NVN
도 4의B는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K 단백질을 과발현하고 DHFR이 결핍된 CHO 숙주세포주를 회분배양한 경우, 아크리딘 오랜지와 에티디움 브로마이드 혼합액의 염색을 통하여 예정사로 죽는 세포의 비율을 보여주는 그래프이고,
▲ ; CHO dhfr(-) 대조군 NVA, ● ; CHO dhfr(-) E1B NVA,
△ ; CHO dhfr(-) 대조군 NVN, ○ ; CHO dhfr(-) E1B NVN
도 5는 Bcl-2 단백질을 과발현하고 DHFR 결핍된 CHO 숙주세포주를 이용하여 제조한 목적단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주에서 DHFR/MTX 증폭과정을 통해 비생산성이 증가된 것을 보여주는 그래프이고,
Bcl2-19 ; 실험군 세포주, neo-04 ; 대조군 세포주
도 6은 CHO Bcl2-19-008 세포주와 CHO neo-04-008 세포주를 무혈청 부유배양하였을 때와 무혈청 배지에서 회분식 부유배양하면서 NaBu를 첨가한 경우의 세포생존율과 항체의 생산성을 비교한 그래프이고,
▲; CHO neo-04-008 무혈청부유배양, △; CHO Bcl2-19-008 무혈청부유배양,
■; CHO neo-04-008 무혈청부유배양, □; CHO Bcl2-19-008 무혈청부유배양
도 7은 Bcl-2 단백질을 과발현하고 DHFR 결핍된 CHO 숙주세포주를 이용하여 제조한 목적단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주에서 DHFR/MTX 증폭과정을 거친 후에도 Bcl-2 단백질이 안정적으로 과발현되는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항예정사 유전자로 형질전환되고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 CHO 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포를 이용하여 목적단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항예정사 유전자로 형질전환되고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 CHO 세포주 및 그의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 항예정사 유전자로 형질전환되고 DHFR 유전자가 결핍된 CHO 세포주의 제조 방법은
1) 혈청 함유 배지에서 부착배양하는 CHOdhfr(-) 세포주를 무혈청배지에서의 부유배양에 적응시키는 단계;
2) 무혈청 부유 배양에 적응한 CHOdhfr(-) 세포주에 항예정사 유전자를 포함하는 벡터를 도입한 후 항예정사 단백질을 과발현하는 CHO 숙주 세포주를 선별하는 단계로 구성된다.
단계 1)에 있어서, CHOdhfr(-) 세포주는 세포내 필수성분인 하이폭산틴(hypoxanthine) 및 티미딘(thymidine)의 합성 작용에 관여하는 DHFR 단백질을 발현하지 않는 세포주로서 상업적으로 구입이 가능한 세포주이며(ATCC; CRL 9096) 당업자에게 알려진 통상적인 형질전환 방법을 사용하여 직접 제조할 수도 있다. 상기 형질전환 방법에는 UV 또는 감마선 조사에 의해 유도되는 형질전환방법이 있다. 무혈청 배지에서의 배양에 적응된 세포를 제조하기 위해서는 혈청의 함량을 단계적으로 낮춘 배지를 사용하고 최종적으로는 혈청이 함유되지 않은 배지에서 세포를 배양함으로써 획득될 수 있다.
단계 2)에 있어서, 항예정사 유전자는 Bcl-2, 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K, Bcl-XL, Bcl-W, Mcl-1 및 IAP로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 반드시 여기에 제한되는 것은 아니며 알려진 모든 항예정사 유전자가 사용될 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 Bcl-2 또는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K를 사용하였다.
본 발명자들은 항예정사 유전자로 형질전환되고는 DHFR이 결핍된 CHO 세포주를 제조하기 위하여, 먼저 DHFR 결핍된 CHO 숙주 세포(ATCC: CRL 9096)를 하이폭산틴, 티미딘 및 10%(v/v)의 FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 IMDM 배지에서 부착배양하였다. 부착배양된 세포를 5%(v/v) FBS를 포함하는 IMDM 배지와 CHO-S-SFMⅡ(Gibco, Grand Island, NY) 배지를 혼합한 혼합배지에서 부유배양을 실시하였다. 세포가 대수성장기에 도달했을 때 동일한 배양환경에서 계속 계대 배양하였다. 세포의 성장률이 부착배양시의 세포의 성장률을 회복하면, 하이폭산틴, 티미딘 및 2.5%(v/v) FBS가 첨가된 IMDM 배지와 CHO-S-SFMⅡ 배지를 혼합한 혼합배지에 서 부유배양하였다. 세포가 대수성장기에 도달했을 때 동일한 배양환경에서 계속 계대 배양하였다. 상기와 동일한 방식으로 하이폭산틴, 티미딘 및 1.25% 농도의 FBS를 포함하는 IMDM 배지와 CHO-S-SFMⅡ 배지를 혼합한 혼합배지에서의 부유배양에 세포를 적응시킨 후, 세포의 성장률이 부착배양시의 세포의 성장률을 회복하면,혈청이 첨가되지 않은 하이폭산틴, 티미딘 및 CHO-S-SFMⅡ 배지에서 무혈청 부유배양을 실시하였다.
이러한 무혈청 부유 배양에 적응한 DHFR이 결핍된 CHO 숙주 세포주를 하이폭산틴, 티미딘 및 10%(v/v)의 FBS를 포함하는 IMDM 배지에서 배양시킨 후 상기 세포주에 Bcl-2 과발현 벡터(pIRES-neo-Bcl2,도 1a참조) 또는 아데노 바이러스 E1B-19K를 과발현 벡터(pCDNA3.1-zeo-E1B,도 1b참조)를 각각 도입하였다. 벡터를 도입한 이후 Bcl-2 과발현 세포주는 G418 항생제로, 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K과발현 세포주는 제오신(Zeocin) 항생제를 처리하여 각각 2 내지 3주동안 96 웰 플레이트에서 배양시켜 각각의 항생제에 저항성을 갖는 세포를 선별하였다. 각각의 항생제에 저항성을 갖는 세포를 선별한 후, 본 발명자들은 웨스턴 블롯(Western blot)을 통하여 Bcl-2 단백질과 아데노 바이러스 E1B-19K 단백질을 과발현하는 세포주를 선별하였다.
본 발명자들은 상기에서 제조한 Bcl-2 또는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K 유전자로 형질전환된 DHFR이 결핍된 CHO 숙주 세포주를 2001년 12월 29일부로 각각 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10142BP; KCTC 10143BP).
본 발명자들은 상기에서 제조한 각각 Bcl-2 또는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K를 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 숙주 세포주에 있어서의 예정사에 의한 세포사멸이 무혈청 부유배양에서 억제되는지 여부를 알아보았다. 이를 위하여, 대조군 세포 및 본 발명의 형질전환 세포를 회분배양한 후 세포의 생존율을 구하였다. 또한, 각각의 세포들을 아크리딘 오랜지(acridine orange)와 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, EtBr)의 혼합염색약에 염색한 후, 형광현미경(epifluorescence microscope)을 이용하여 살아있는 세포와 예정사에 의하여 죽은 세포 및 괴사(necrosis)에 의하여 죽은 세포의 수를 구하였고, 전체 세포 중 예정사에 의해 죽은 세포(NVA; nonviable apoptotic cell)의 비율과 괴사에 의해 죽은 세포(NVN; nonviable necrotic cell)의 비율을 측정하였다.
그 결과, 무혈청 배지에서 회분 배양한 결과 대조군의 세포주는 접종 후 24시간부터 2일간 대수성장기를 거친 후 급격히 세포 생존율이 감소하였으며 배양 5일에는 약 50%의 세포가 사멸하였고, 배양 7일에는 약 30%의 세포 생존율을 나타내었다. 이와 비교하여, CHOdhfr(-) Bcl2는 대조군과 유사하게 접종 후 24시간부터 2일간 대수성장기를 나타내었으나, 배양 5일에는 약 80%의 세포 생존율을 나타내었고, 배양 7일에는 약 70%의 세포 생존율을 나타내었다(도 3참조). 예정사에 의해 사멸하는 세포의 비율도 배양 3일까지는 두 세포주 모두 비슷한 비율을 차지하다가, 배양 6일에는 대조군이 전체 세포중 예정사로 사멸한 세포가 40% 이상의 비율을 차지한 반면, CHOdhfr(-) Bcl2는 배양 6일에 약 25% 정도가 예정사로 사멸함을 보여주었다(도 4참조). 결론적으로, CHOdhfr(-) Bcl2의 경우 Bcl2의 과별현에 의한 예정사 억제를 통하여 세포의 생존율이 연장됨을 확인하였다.
CHOdhfr(-) E1B-19K 세포주의 회분배양 결과, 세포 생존율이 배양 5일까지 80% 이상 유지되었으며, 배양 7일에는 세포 생존율이 약 60%로 대조군에 비하여 세포 생존율이 연장됨을 볼 수 있었다. 전체 세포 중 예정사에 의하여 사멸하는 세포의 비율도 배양 3일까지는 대조군과 유사한 비율을 차지하다가 배양 6일에는 대조군이 전체 세포중 예정사로 사멸한 세포가 40% 이상의 비율을 차지한 반면, CHOdhfr(-) E1B-19K는 배양 6일에 약 25% 정도가 예정사로 사멸함을 보여주었다. 결론적으로, CHOdhfr(-) E1B-19K는 E1B-19K의 과발현을 통해 예정사가가 억제되어 세포 생존율의 연장함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 CHOdhfr(-) Bcl2 또는 CHOdhfr(-) E1B-19K 숙주 세포주는 무혈청 배지에서의 부유배양이 가능한 세포주이며, 무혈청 배지에서 예정사를 억제함으로써 세포의 생존율을 연장시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포를 이용하여 목적단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
목적단백질을 생산하는 방법은 상기 형질전환된 CHO 숙주 세포주에 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환시킴으로써 획득된다. 목적단백질은 인간화항체, 인간 인터페론-감마(inteferon-gamma), 제 8인자(factor Ⅷ), 에리스로포이에틴(erythropoietin) 및 트롬보포이에틴(thrombopoietin)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나 반드시 여기에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 목적단백질로 인간화항체를 사용한 경우를 예시하였다.
본 발명자들은 상기에서 제조한 본 발명의 항예정사 단백질을 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 세포주를 목적 단백질의 생산에 이용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기에서 제조한 항예정사 단백질을 과발현하는 세포주를 10%(v/v)의 FBS를 포함하는 IMDM 배지에 접종하여 배양한 후 목적 단백질의 유전자를 포함하는 벡터를 상기 세포에 형질전환시켰다. 다음으로, 10%(v/v)의 투석된(dialyzed) FBS를 함유하는 IMDM 배지에서 선별 항생제를 넣어 형질전환된 세포주를 선별하였다. 2 내지 3주가 경과한 후 생존하는 세포중에서 단위세포당 생산량이 많은 고생산성 세포주를 선별하였다. 이러한 방법으로 확립된 세포주를 양친 세포주(parental cellline)라 하며, 상기 양친 세포주의 비생산성을 구하였고 비생산성이 양친 세포주에 비해 증가된 세포주를 배양 접시에 접종한 후, 메쏘트렉세이트(MTX)가 함유된 10%(v/v)의 투석된 FBS를 함유하는 IMDM 배지에서 2-3 주간 목적 단백질의 유전자 증폭을 수행하였으며, 유전자 증폭 후 회분배양을 통하여 비생산성을 구하였다(도 5참조). 이러한 방식으로 배지 내의 메쏘트렉세이트 농도를 증가시키면 유전자 증폭에 의해 비생산성을 증가시킬 수 있다. 유전자 증폭 과정을 거친 세포주는 다양성(heterogeneity)을 나타나게 되므로, 제한희석(limiting dilution) 과정을 통해 가장 비생산성이 높은 재조합 CHO 세포주를 확립할 수 있다. 예측한 바와 같이, 제조된 목적단백질을 생산하는 재조합 CHO 세포주는 무혈청 부유배양이 가능하고, 웨스턴 블롯에서 확인할 수 있는 것처럼 Bcl-2의 과별현을 통해 예정사 억제 능력을 갖는다는 것을 알 수 있다(도 7참조).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 항예정사 단백질을 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 세포주의 제조
본 발명자들은 항예정사 단백질을 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 세포주를 제조하기 위하여, 먼저 DHFR 결핍된 CHO DUKX 숙주 세포(ATCC: CRL 9096)를 100 μM 하이폭산틴(hypoxanthine), 16 μM 티미딘(thymidine) 및 10%(v/v)의FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 IMDM 배지(Gibco, Grand Island , NY)에서 부착배양하였다. 부착배양된 세포를 100 μM 하이폭산틴, 16 μM 티미딘 및 5%(v/v) FBS를 포함하는 IMDM 배지와 CHO-S-SFMⅡ(Gibco, Grand Island, NY) 배지를 1:1(v/v)로 혼합한 혼합배지 50 ㎖에 초기농도 3×105세포/㎖로 접종한 후 스피너 플라스크(spinner flask)에 넣어 부유배양을 실시하였다. 3 내지 4일이 경과한 후 세포가 대수성장기에 도달했을 때, 동일한 배양환경에서 계속 계대 배양하였다. 세포의 성장률이 부착배양시의 세포의 성장률을 회복하면, 100 μM 하이폭산틴, 16 μM 티미딘, 2.5%(v/v) FBS가 첨가된 IMDM 배지와 CHO-S-SFMⅡ 배지를 1:1(v/v)로 혼합한 혼합배지 50 ㎖에 초기농도 3×105세포/㎖로 접종한 후 스피너 플라스크에 넣어 부유배양하였다. 3 내지 4일이 경과한 후 세포가 대수성장기에 도달했을 때, 동일한 배양환경에서 계속 계대 배양하였다. 상기와 동일한 방식으로 1.25% 농도의 FBS, 100 μM 하이폭산틴 및 16 μM 티미딘을 포함하는 IMDM 배지와 CHO-S-SFMⅡ 배지를 1:1(v/v)로 혼합한 혼합배지에서의 부유배양에 세포를 적응시킨 후, 세포의 성장률이 부착배양시의 세포의 성장률을 회복하면, 100 μM 하이폭산틴 및 16 μM 티미딘을 포함하는 CHO-S-SFMⅡ 배지에서 무혈청 부유배양을 실시하였다.
이러한 무혈청 부유 배양에 적응한 DHFR이 결핍된 CHO DUKX 숙주 세포주를 100 μM 하이폭산틴, 16 μM 티미딘 및 10%(v/v)의 FBS를 포함하는 IMDM 배지 5 ㎖이 담긴 60 ㎜ 배양 접시에 105세포/㎖의 농도로 접종하였다. 24시간동안 배양시킨 후, pIRES-neo 벡터(Invitrogen) 또는 pCDNA3.1-zeo 벡터(Clontech)를 사용하여제조한 Bcl-2 과발현 벡터(pIRES-neo-Bcl2,도 1a참조) 또는 아데노 바이러스 E1B-19K를 과발현 벡터(pCDNA3.1-zeo-E1B,도 1b참조)를 상기 세포주에 각각 리포좀(liposome)을 이용하여 도입하였다. 벡터를 도입한 이후 정확하게 48시간이 지난 다음, Bcl-2 과발현 세포주는 550 ㎍/㎖ G418 항생제(Gibco)로, 아데노 바이러스 E1B-19K 과발현 세포주는 550 ㎍/㎖ 제오신(Zeocin, Invitrogen) 항생제를 처리하여 각각 2 내지 3주동안 96 웰 플레이트에서 배양시켜 각각의 항생제에 저항성을 갖는 세포를 선별하였다. 각각의 항생제에 저항성을 갖는 세포를 선별한 후, 본 발명자들은 웨스턴 블롯(Western blot)을 통하여 Bcl-2 단백질과 아데노 바이러스 E1B-19K 단백질을 과발현하는 세포주를 선별하였다. 이 때 각각의 단백질을 발현하지 않는 벡터를 도입하여 항생제 함유 배양 배지에서 선별한 세포를 대조군 세포로 사용하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 대수성장기에 있는 CHOdhfr(-) Bcl-2군과 대조군의 세포 107개를 1% NP-40, 0.1% SDS(sodium dodecylsulfate), 0.02% NaN3, 50 mM Tris(pH 8.0), 150 mM NaCl, 100 ㎎/㎗ PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride) 및 1 ㎍/㎖ 아프로토닌(aprotonin)을 함유하는 1 ㎖의 용해버퍼(lysis buffer)에 4℃에서 30분간 반응시킨 후, 원심분리기를 이용하여 4℃에서 16,000 g로 5분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이러한 각각의 상등액을 15% SDS PAGE 젤에서 전기영동을 수행한 후, 이를 hybond-enhanced chemiluminescence nitrocellulose(Amersham Pharmacia Biotech, Picataway, NJ)로 40 V에서 12시간 전달시켰다. 니트로셀룰로스 막으로 이동된 단백질을 5% 탈지유에서 1시간동안 블록시킨 후, 항-인간 Bcl-2 마우스 단일클론 항체(Sigma)를 일차항체로 사용하고, 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)와 결합된 항-마우스 IgG 염소 다클론 항체(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)를 이차항체로 이용하여 ECL 웨스턴 블롯 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 시각화하였다. CHOdhfr(-)E1B-19K군의 경우에도 상기와 동일한 방법을 사용하여 웨스턴 블롯으로 시각화하였다.
그 결과, CHOdhfr(-) Bcl-2 세포주는 26 kDa의 Bcl-2 단백질을 안정적으로 발현하였으나, 반면에 대조군은 Bcl-2를 발현하지 않았다. 이러한 까닭은 CHO 세포 자체에 Bcl-2가 존재하지만 과발현된 Bcl-2가 인간유래의 Bcl-2로서 일차항체로 인간 Bcl-2와 특이적으로 결합하는 항체를 사용하였기 때문이다. 또한 CHOdhfr(-) 세포주는 21 kDa의 아데노바이러스 유래 E1B-19K 단백질을 안정적으로 발현하였다. 이에 비해 대조군은 어떠한 아데노바이러스 E1B-19K단백질도 발현하지 않았다(도 2).
본 발명자들은 상기에서 제조한 Bcl-2 또는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K 유전자로 형질전환된 DHFR이 결핍된 CHO 숙주 세포주를 2001년 12월 29일부로 각각 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호; KCTC 10142BP, KCTC 10143BP).
<실시예 2> 항예정사 단백질을 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 세포주에 있어서 세포사멸 억제 활성 측정
본 발명자들은 각각 Bcl-2 또는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K를 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 숙주 세포주(이하, 각각 "CHOdhfr(-) Bcl2" 또는 "CHOdhfr(-) E1B-19K"라 약칭함)에 있어서의 예정사에 의한 세포사멸이 무혈청 부유배양에서 억제되는지 여부를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. CHOdhfr(-) Bcl2 또는 CHOdhfr(-) E1B-19K 세포주를 각각 100 μM 하이폭산틴 및 16 μM 티미딘을 포함하고 혈청을 함유하지 않는 CHO-S-SFMⅡ 배지 50 ㎖에 초기농도 105세포/㎖로 접종한 후 스피너 플라스크에 넣어 회분배양하였다. 대조군 세포주도 동일한 배양조건에서 회분배양을 실시하였다. 접종 후 24시간마다 1 ㎖에 함유된 세포를 취하여 트리판 블루(trypan blue) 염색을 통하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 헤마사이토미터(hemacytometer)로 구별하여 세포의 생존률을 구하였다. 또한, 각각의 세포들을 1.5 ㎍/㎖ 아크리딘 오랜지와 7.5 ㎍/㎖ 에티디움 브로마이드의 혼합염색약에 염색한 후, 형광현미경(epifluorescence microscope, Nikon Microphot-FXA)을 이용하여 살아있는 세포와 예정사에 의하여 죽은 세포 및 괴사(necrosis)에 의하여 죽은 세포의 수를 구하였고, 전체 세포 중 예정사에 의해 죽은 세포(NVA; nonviable apoptotic cell)의 비율과 괴사에 의해 죽은 세포(NVN; nonviable necrotic cell)의 비율을 측정하였다.
그 결과, 무혈청 배지에서 회분 배양한 결과 대조군의 세포주는 접종 후 24시간부터 2일간 대수성장기를 거친 후 급격히 세포 생존율이 감소하였으며 배양 5일에는 약 50%의 세포가 사멸하였고, 배양 7일에는 약 30%의 세포 생존율을 나타내었다. 이와 비교하여, CHOdhfr(-) Bcl2는 대조군과 유사하게 접종 후 24시간부터 2일간 대수성장기를 나타내었으나, 배양 5일에는 약 80%의 세포 생존율을 나타내었고, 배양 7일에는 약 70%의 세포 생존율을 나타내었다(도 3). 예정사에 의해 사멸하는 세포의 비율도 배양 3일까지는 두 세포주 모두 비슷한 비율을 차지하다가, 배양 6일에는 대조군이 전체 세포중 예정사로 사멸한 세포가 40% 이상의 비율을 차지한 반면, CHOdhfr(-) Bcl2는 배양 6일에 약 25% 정도가 예정사로 사멸함을 보여주었다(도 4). 결론적으로, CHOdhfr(-) Bcl2의 경우 Bcl2의 과별현에 의한 예정사 억제를 통하여 세포의 생존율이 연장됨을 확인하였다.
CHOdhfr(-) E1B-19K 세포주의 회분배양 결과, 세포 생존율이 배양 5일까지 80% 이상 유지되었으며, 배양 7일에는 세포 생존율이 약 60%로 대조군에 비하여 세포 생존율이 연장됨을 볼 수 있었다. 전체 세포 중 예정사에 의하여 사멸하는 세포의 비율도 배양 3일까지는 대조군과 유사한 비율을 차지하다가 배양 6일에는 대조군이 전체 세포중 예정사로 사멸한 세포가 40% 이상의 비율을 차지한 반면, CHOdhfr(-) E1B-19K는 배양 6일에 약 25% 정도가 예정사로 사멸함을 보여주었다. 결론적으로, CHOdhfr(-) E1B-19K는 E1B-19K의 과발현을 통해 예정사가가 억제되어 세포 생존율의 연장함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 CHOdhfr(-) Bcl2 또는 CHOdhfr(-) E1B-19K 숙주 세포주는 무혈청 배지에서의 부유배양이 가능한 세포주이며, 무혈청 배지에서예정사를 억제함으로써 세포의 생존율을 연장시킬 수 있음을 확인하였다.
<실시예 3> 항예정사 단백질을 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 세포주를 이용한 목적 단백질의 생산
본 발명자들은 상기에서 제조한 본 발명의 항예정사 단백질을 과발현하는 DHFR이 결핍된 CHO 세포주를 목적 단백질의 생산에 이용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 100 μM 하이폭산틴, 16 μM 티미딘 및 10%(v/v)의 FBS를 포함하는 IMDM 배지 5 ㎖가 있는 60 ㎜ 배양 접시에 105세포/㎖의 농도로 세포를 접종하였다. 24시간이 지난 후, 상기 실시예 1에서 제조한 항예정사 유전자로 형질전환된 세포주에 추가로 목적 단백질의 유전자를 포함하는 벡터를 리포좀과 혼합하여 세포에 도입하였다. 정확히 48시간 후에 하이폭산틴/티미딘을 포함하지 않고 10%(v/v)의 투석된(dialyzed) FBS를 함유하는 IMDM 배지에서 선별 항생제를 넣어 형질전환된 세포주를 선별하였다. 2 내지 3주가 경과한 후에 선별된 세포를 96 웰 플레이트에 복수로 분주한 다음 MTT 분석으로 살아있는 세포의 수를 측정하고, 이때 배지는 회수하여 목적단백질에 대한 ELISA 분석을 수행하였다. ELISA와 MTT 분석을 통하여 단위세포당 생산량이 많은 고생산성 세포주를 선별하였다. 이러한 방법으로 확립된 세포주를 양친 세포주(parental cell line)라 하며, 상기 양친 세포주의 비생산성을 구하였다. 구체적으로, 양친 세포주를 100 ㎜ 배양 접시에 초기농도 105세포/㎖이 되게 접종한 후 20 nM메쏘트렉세이트(methotrexate) 및 10%(v/v)의 투석된 FBS를 함유하는 IMDM 배지에서 2 내지 3주간 목적 단백질의 유전자 증폭을 수행하였으며, 2-3주 후 선별된 세포들의 비생산성을 구하였다. 비생산성이 양친 세포주에 비해 증가된 세포주를 100 ㎜ 배양 접시에 초기농도 105세포/㎖이 되게 접종한 후, 80 nM 메쏘트렉세이트가 함유된 10%(v/v)의 투석된 FBS를 함유하는 IMDM 배지에서 2-3 주간 목적 단백질의 유전자 증폭을 수행하였으며, 유전자 증폭 후 회분배양을 통하여 비생산성을 구하였다(도 5). 이러한 방식으로 배지 내의 메쏘트렉세이트 농도를 320 nM, 1 μM 까지 증가시키면 유전자 증폭에 의해 비생산성을 증가시킬 수 있다. 유전자 증폭 과정을 거친 세포주는 다양성(heterogeneity)을 나타나게 되므로, 96 웰 플레이트에서 0.4 내지 0.8 세포/웰 로 분리 배양하는 제한희석(limiting dilution) 과정을 통해 가장 비생산성이 높은 재조합 CHO 세포주를 확립할 수 있다.
이를 확인하기 위하여, 먼저 본 발명자들은 CHOdhfr(-) Bcl-2 세포주로부터 확립된 인간화항체를 생산하는 CHO Bcl2-19-008 세포주와 CHOdhfr(-) 대조군으로부터 확립된 인간화항체를 생산하는 세포주인 CHO neo-04-008 세포주를 무혈청배지에서 초기농도 2×105세포/㎖로 회분식 부유배양하였다. 매일 0.5 ㎖의 배지를 모아서 트리판 블루 배제법(Tryphan Blue Exclusion method)으로 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 측정하였다. 남은 배지는 ELISA 방법을 통하여 염소 항-인간 IgG(Sigma)를 코팅 항체로 이용하였으며, 과산화효소와 결합된 염소 항-인간IgG(Sigma)를 효소 항체 결합체(conjugate)로 사용하여 생산되는 인간화된 항체의 양을 정량하였다. 또한 세포예정사를 유발함과 동시에 전사 활성인자로 작용하는 5 mM NaBu(sodium butyrate)를 배양 3일째에 첨가한 후 항체생산량을 회분식 무혈청 부유배양의 경우와 비교하였다( Kim, et al.,Biotechnol. Bioeng.,2000/2001, 71, 184-193). CHO Bcl2-19-008 세포주와 CHO neo-04-008 세포주는 각각 다른 숙주세포로부터 확립된 세포주이므로 비생장속도(specific growth rate)와 비항체생산속도가 다르므로 세포예정사 억제로 인한 항체생산성을 무혈청배지에서 회분식 부유배양하였을 때와 무혈청 배지에서 회분식 부유배양하면서 배양 3일째에 5 mM NaBu를 첨가하였을 경우를 비교하였다.
그 결과, CHO neo-04-008 세포주는 무혈청 부유배양시에 배양 3일째부터 급격한 생존세포수의 감소를 나타내었으며, 세포생존율 또한 급격히 감소하였다(도 6). 배양 6일째에는 약 40%의 세포생존율을 나타내었으며 최종항체의 농도는 1 ㎍/㎖을 나타내었다. 5 mM NaBu 첨가시에는 세포생존율이 보다 급격히 감소하였으며 배양 6일째에 세포생존율은 5% 미만이었다. 5 mM NaBu 첨가시 최종항체의 농도는 1.5 ㎍/㎖로 무혈청부유배양보다 약 1.5 배정도 증가하였다. 이는 NaBu에 의해 전사가 활성화되는 정도와 세포생존율의 급격한 감소가 상쇄되었기 때문으로 추측된다. 반면에 CHO Bcl2-19-008은 무혈청부유배양에서 배양 6일까지 90% 이상의 세포생존율을 유지하였으며, 최종항체의 농도는 10 ㎍/㎖을 보였다. 또한 NaBu 첨가시에도 배양 6일째에 약 80%의 세포생존율을 나타내었으며, 이때 최종항체농도는50 ㎍/㎖로 무혈청부유배양보다 약 5배 가량 증가하였다. 상기 결과로부터, 제조된 목적단백질로서 인간화항체를 생산하는 본 발명의 재조합 CHO 세포주는 무혈청 부유배양이 가능하고, 웨스턴 블롯에서 확인할 수 있는 것처럼 Bcl-2의 과발현을 통해 예정사 억제 능력을 갖는다는 것을 알 수 있으며(도 7), 이러한 최종항체농도의 증가는 CHO Bcl2-19-008이 Bcl-2 단백질을 과발현하여 세포예정사 억제 능력을 갖고 있기 때문임을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 형질전환된 CHO 세포주는 항예정사 단백질의 과발현으로 인하여 예정사가 억제되어 세포의 생존능력이 뛰어나며, 이러한 세포 생존율의 연장은 목적 단백질의 생산성을 높여줄 뿐만 아니라 세포막의 원형(integrity)을 유지하여 생산된 단백질의 질을 향상시킬 수 있으므로, 원하는 목적단백질의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K, Bcl-XL, Bcl-W, Mcl-1 및 IAP로 구성된 군으로부터 선택되는 항예정사 유전자로 형질전환되고 DHFR 유전자가 결핍된 신규한 형질전환된 CHO 세포주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 항예정사 유전자는 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K인 것을 특징으로 하는 형질전환된 CHO 세포주(수탁번호; KCTC 10143BP).
  5. 1) 혈청 함유 배지에서 부착배양하는 CHOdhfr(-) 세포주를 무혈청배지에서의 부유배양에 적응시키는 단계; 및
    2) 무혈청 부유 배양에 적응한 CHOdhfr(-) 세포주에 아데노 바이러스 유래의 E1B-19K, Bcl-XL, Bcl-W, Mcl-1 및 IAP로 구성된 군으로부터 선택된 항예정사 유전자를 포함하는 벡터를 도입한 후 항예정사 단백질을 과발현하는 CHO 숙주 세포주를 선별하는 단계로 구성되는 제 1항의 형질전환된 CHO 세포주를 제조하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1항의 형질전환된 CHO 숙주 세포주에 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환시킨 후 상기 형질전환된 CHO 세포주를 이용하여 목적단백질을 생산하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 목적단백질은 인간화항체, 인간 인터페론감마(inteferon-gamma), 제 8인자(factor Ⅷ), 에리스로포이에틴(erythropoietin) 및 트롬보포이에틴(thrombopoietin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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