JP2022534733A - インスリン遺伝子治療 - Google Patents

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Abstract

神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が本明細書に記載される。

Description

本明細書の態様は、哺乳動物、特にヒトにおける神経炎症、神経変性および／または認知機能低下の処置に使用するためのインスリン遺伝子治療を含む医療分野に関係する。
アルツハイマー病（ＡＤ）、糖尿病および肥満は世界的に拡大している流行病であり、平均余命の減少および生活の質の低下につながる（ＩＤＦ Ａｔｌａｓ ２０１５，ｗｗｗ．ｉｄｆ．ｏｒｇ；Ｍａｙｅｕｘ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．２０１２，２：ａ００６２３９）。近年のデータは、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症およびインスリン抵抗性が、糖尿病および肥満だけでなく、ＡＤならびに認知的加齢および認知症の根底にあるその他の神経病理学的プロセスの共通の顕著な特徴であることを示している（Ｄｅ Ｆｅｌｉｃｅ，Ｆ．Ｇ．，２０１３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２３：５３１－５３９；Ｋｕｌｌｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ ９６：１１６９－１２０９；Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ－Ｌｅｇｒｉｓ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４０：２３７－２５３；Ｄｕｔｈｅｉｌ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．４１：１８７４－１８８７）。
中枢神経系（ＣＮＳ）に到達するために鼻腔内経路を使用して組換えインスリンを投与すると、認知障害のある個体と正常な成人の両方で記憶機能が改善されることがいくつかの報告で示されている（Ｃｒａｆｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９：２９－３８；Ｒｅｇｅｒ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，２７：４５１－４５８）。ＡＤのラットモデルでの長期鼻腔内インスリン注入も、認知を改善し、タウ過剰リン酸化を減少させ、ミクログリア活性化を弱め、神経新生を促進する（Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：１－１２）。
しかしながら、経鼻ヒトインスリンスプレーの薬物動態は不十分であり、鼻腔内インスリン投与後、脳脊髄液（ＣＳＦ）においてインスリンのピークがあり、これは６０分後に急速に低下する（Ｂｏｒｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（６）：５１４－５１６）。したがって、このアプローチは複数回投与が必要であり、鼻粘膜のインスリンへの長期曝露のいくつかの局所的副作用がある（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ．２０：１５６３－１５７７）。
神経炎症および神経新生が認知機能低下において役割を果たすことの重要性を考えると、既存の処置の全ての欠点を有さない、ＣＮＳの炎症を軽減し、神経新生を刺激する新たな治療アプローチは、極めて重要であり得る。
ＩＤＦ Ａｔｌａｓ ２０１５，ｗｗｗ．ｉｄｆ．ｏｒｇ；Ｍａｙｅｕｘ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．２０１２，２：ａ００６２３９ Ｄｅ Ｆｅｌｉｃｅ，Ｆ．Ｇ．，２０１３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２３：５３１－５３９ Ｋｕｌｌｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ ９６：１１６９－１２０９ Ｇｕｉｌｌｅｍｏｔ－Ｌｅｇｒｉｓ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４０：２３７－２５３ Ｄｕｔｈｅｉｌ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．４１：１８７４－１８８７ Ｃｒａｆｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９：２９－３８ Ｒｅｇｅｒ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，２７：４５１－４５８ Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：１－１２ Ｂｏｒｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（６）：５１４－５１６ Ｓｃｈｍｉｄ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ．２０：１５６３－１５７７
第１の態様では、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供される。
好ましい実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている。
別の好ましい実施形態では、ユビキタスプロモーターが、ＣＡＧプロモーターおよびＣＭＶプロモーターからなる群から選択され、好ましくは、ユビキタスプロモーターがＣＡＧプロモーターである。
別の好ましい実施形態では、遺伝子構築物が、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくは、マイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列が、哺乳動物の心臓および／または肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される。
別の好ましい実施形態では、遺伝子構築物が、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列および心臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくは、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号８および１６～２０から選択され、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号７および９～１５から選択され、より好ましくは、遺伝子構築物が、マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列（配列番号７）およびマイクロＲＮＡ－１の標的配列（配列番号８）を含む。
別の好ましい実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４、５または６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
（ｃ）遺伝暗号の縮重により、その配列が（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
第２の態様では、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、第１の態様による遺伝子構築物を含む発現ベクターが提供される。
好ましい実施形態では、発現ベクターがウイルスベクターであり、好ましくは、発現ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクター、より好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクターである。
好ましい実施形態では、発現ベクターが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ１０、ｒｈ８、Ｃｂ４、ｒｈ７４、ＤＪ、２／５、２／１、１／２またはＡｎｃ８０のアデノ随伴ウイルスベクター、好ましくは血清型１、２または９のアデノ随伴ウイルスベクター、より好ましくは血清型１または９のアデノ随伴ウイルスベクターである。
第３の態様では、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、第１の態様による遺伝子構築物および／または第２の態様による発現ベクターを１種または複数の薬学的に許容される成分と共に含む医薬組成物が提供される。
神経炎症、神経変性および／または認知障害に関連する疾患または状態が、認知障害、認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、パーキンソン様疾患、パーキンソン症候群、ハンチントン病、外傷性脳損傷、プリオン病、ＨＩＶ感染による認知症／神経認知の問題、加齢による認知症／神経認知の問題、タウオパチー、多発性硬化症およびその他の神経炎症性／神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病および／またはパーキンソン様疾患、より好ましくは、アルツハイマー病またはパーキンソン病からなる群から選択される、第１の態様による使用のための遺伝子構築物および／または第２の態様による使用のための発現ベクターおよび／または第３の態様による使用のための医薬組成物も提供される。
いくつかの実施形態では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物がＣＳＦ内投与によって投与される。
別の態様では、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物であって、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されており、遺伝子構築物が、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくはマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列が、哺乳動物の心臓および／または肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される、遺伝子構築物が提供される。
好ましい実施形態では、遺伝子構築物が、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列および心臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくは、心臓で発現されるマイクロＲＮＡが配列番号８および１６～２０から選択され、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号７および９～１５から選択され、より好ましくは、遺伝子構築物が、マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列（配列番号７）およびマイクロＲＮＡ－１の標的配列（配列番号８）を含む。
別の態様では、好ましくは、発現ベクターがウイルスベクターであり、より好ましくは、発現ベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターであり、最も好ましくは、発現ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、前の態様に定義される遺伝子構築物を含む発現ベクターが提供される。
説明
本発明者らは、神経炎症、神経変性および／または認知機能低下に対抗するために、中枢神経系（ＣＮＳ）に向けられたインスリン遺伝子治療に基づく改善された遺伝子治療戦略を開発した。本発明のベクターの単回ＣＳＦ内投与によって提供されるインスリンの長期的かつ有効な発現は、他の治療法に対する重要な利点となる。特に、実験部で詳述されるように、本発明者らは、脳指向インスリン遺伝子治療の以下の予想外の利点を見出した：
・本明細書に記載される遺伝子構築物およびベクターは、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球を含む脳において、堅牢かつ広範囲の過剰発現を得ることができる（実施例１、２、３、５）。
・広く使用される神経炎症などの加齢性脳病変を伴う老化のマウスモデルにおいて、本発明による遺伝子構築物およびベクターを使用した脳におけるインスリンの発現は、神経炎症の明らかな減少、神経新生の増加および星状細胞数の増加（実施例１）ならびに短期記憶、長期記憶および学習能力の改善（実施例５）をもたらした。
・広く使用される神経炎症および認知機能低下に関連する肥満および糖尿病のマウスモデルにおいて、本発明による遺伝子構築物およびベクターを使用した脳におけるインスリンの発現は、神経炎症の明らかな減少および星状細胞数の増加をもたらした（実施例２）。
したがって、本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、本明細書に論じられる課題および必要性の少なくとも一部を解決する。
遺伝子構築物
第１の態様では、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供される。好ましくは、本明細書に記載される遺伝子構築物は、医薬として使用するためのものである。より好ましくは、本明細書に記載される遺伝子構築物は、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するためのものである。
本明細書に記載される「遺伝子構築物」は、本開示を考慮して当業者によって理解されるその慣習的かつ通常の意味を有する。「遺伝子構築物」は、「発現カセット」または「発現構築物」とも呼ばれ、その発現を制御するプロモーターに作動可能に連結されている、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む、遺伝子または遺伝子群を指す。「一般情報」と題された本出願の部分は、「遺伝子構築物」に関するさらなる詳細を含む。本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、「一般情報」と題された本出願の部分でさらに説明される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物が、哺乳動物における発現に適している。本明細書で使用される場合、「哺乳動物での発現に適している」とは、遺伝子構築物が、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された、発現に使用される哺乳動物宿主細胞に基づいて選択された、１つまたは複数の制御配列を含むことを意味し得る。好ましくは、発現に使用される前記哺乳動物宿主細胞が、ヒト、マウスまたはイヌ細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物が、ＣＮＳ、好ましくは脳、場合により哺乳動物のＣＮＳおよび／または脳で発現されるインスリンをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物が、ＣＮＳ、好ましくは脳での発現に適している。いくつかの実施形態では、脳での遺伝子構築物の発現が、視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球での遺伝子構築物の発現を意味し得る。したがって、脳での遺伝子構築物の発現は、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球からなる群から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは全ての脳領域での遺伝子構築物の発現を意味し得る。発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。
本発明の実施形態の文脈では、ＣＮＳおよび／または脳で発現されるインスリン；ならびにＣＮＳおよび／または脳での発現に適した遺伝子構築物は、他の器官または組織と比較して、ＣＮＳおよび／または脳でのインスリンの優先的または優勢な（少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも１５０％高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高いまたはそれを超える）発現を指す。他の器官または組織は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、精巣などであり得る。好ましくは、他の器官は肝臓および／または心臓である。他の器官はまた骨格筋であり得る。一実施形態では、発現が、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃および／または精巣で検出不能である。好ましい実施形態では、発現が肝臓および／または心臓で検出不能である。別の好ましい実施形態では、発現が骨格筋で検出不能である。いくつかの実施形態では、発現が、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃および精巣からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての器官で検出不能である。発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。
いくつかの実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるユビキタスプロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、β－アクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、初期増殖応答因子１（Ｅｇｒ－１）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ（ｅｌＦ４Ａ）プロモーター、フェリチン重鎖コード遺伝子（ＦｅｒＨ）プロモーター、フェリチン重軽鎖コード遺伝子（ＦｅｒＬ）プロモーター、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＧＲＰ９４プロモーター、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）プロモーター、ユビキチンＢプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ベータ－キネシンプロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーターおよびＰＧＫ－１プロモーターからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、ユビキタスプロモーターが、ＣＡＧプロモーターおよびＣＭＶプロモーターからなる群から選択され得る。好ましい実施形態では、ユビキタスプロモーターがＣＡＧプロモーターである。ＣＡＧプロモーターは、本発明による遺伝子構築物での使用に適していることが実施例において実証されている。
いくつかの実施形態では、ＣＡＧプロモーターが、配列番号２２と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２２の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２２の一部に対して評価され得る。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモーターが、配列番号２３と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２３の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２３の一部に対して評価され得る。
好ましくは、前記ＣＭＶプロモーターが、イントロン配列と一緒に使用される。いくつかの実施形態では、イントロン配列が、配列番号２１と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２１の一部に対して評価され得る。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、ミニＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ミニＣＭＶプロモーターが、配列番号２５と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２５の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２５の一部に対して評価され得る。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＥＦ１αプロモーターが、配列番号２６と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２６の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２６の一部に対して評価され得る。
別の好ましいユビキタスプロモーターは、ＲＳＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＲＳＶプロモーターが、配列番号２７と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２７の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２７の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子構築物が、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含む。いくつかの実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されており、遺伝子構築物が、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含む。
「ユビキタスプロモーター」、「作動可能に連結された」および「マイクロＲＮＡ」の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。本明細書で使用される「組織で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列」または「組織で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列」または「組織で発現されるマイクロＲＮＡの結合部位」は、本明細書の他の場所に記載されているように、前記組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部と相補的または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列が、哺乳動物の心臓および／または肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される。好ましくは、いくつかの実施形態では、遺伝子構築物が、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列および心臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含む。
本明細書で使用される「肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列」または「肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列」または「肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの結合部位」は、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部と相補的または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。同様に、本明細書で使用される「心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列」または「心臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列」または「心臓で発現されるマイクロＲＮＡの結合部位」は、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部と相補的または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を指す。
本明細書に記載される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの一部または心臓で発現されるマイクロＲＮＡの一部は、前記マイクロＲＮＡの少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を意味する。結合部位配列は、発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部との完全な相補性を有することができる（配列が、ミスマッチが発生することなく完全に一致することを意味する）。あるいは、結合部位配列は、発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも一部と部分的に相補的であり得る（４つ、５つ、６つ、または７つの連続するヌクレオチドにおける１つのミスマッチが起こり得ることを意味する）。部分的に相補的な結合部位は、好ましくはマイクロＲＮＡのシード領域との完全なまたはほぼ完全な相補性を含む（マイクロＲＮＡのシード領域とその結合部位との間で、４つ、５つ、６つまたは７つの連続するヌクレオチド当たりミスマッチが起こらない（完全な相補性）か、または１つのミスマッチが起こり得る（ほぼ完全な相互性）ことを意味する）。マイクロＲＮＡのシード領域は、マイクロＲＮＡの約ヌクレオチド２～約ヌクレオチド８までのマイクロＲＮＡの５’領域からなる。本明細書に記載される部分は、好ましくは、前記マイクロＲＮＡのシード領域である。肝臓で発現されるマイクロＲＮＡまたは心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解は、ＲＮＡ干渉経路またはｍＲＮＡの直接翻訳制御（阻害）を介し得る。本発明は、導入遺伝子またはコードタンパク質の発現を阻害する際にｍｉＲＮＡによって最終的に利用される経路によって決して制限されない。
本発明の文脈では、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列が、配列番号７または９～１５と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列が、配列番号７または９～１５の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上のヌクレオチドの連続する伸長と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。
好ましい実施形態では、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が、配列番号７と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列が、配列番号７の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上のヌクレオチドの連続する伸長と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。さらなる実施形態では、本明細書に記載される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１つのコピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。さらなる実施形態では、本明細書に記載される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。好ましい実施形態では、配列ｍｉＲＴ－１２２ａ（配列番号７）の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。本明細書に記載される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の好ましいコピー数は４である。
本明細書で使用される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、当業者に知られているように、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも検出可能なレベルの活性を発揮する。肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の活性は、肝臓で発現されるその同族マイクロＲＮＡに結合し、導入遺伝子に作動可能に連結されると、肝臓での導入遺伝子発現の脱標的化を媒介することである。この活性は、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの当業者に知られている標準的なアッセイによって、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで肝臓での導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価され得る。
本発明の文脈では、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が、配列番号８または１６～２０と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が、配列番号８または１６～２０の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上のヌクレオチドの連続する伸長と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。
好ましい実施形態では、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が、配列番号８と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が、配列番号８の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上のヌクレオチドの連続する伸長と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい。
さらなる実施形態では、本明細書に記載される、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１つのコピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。さらなる実施形態では、本明細書に記載される、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。好ましい実施形態では、ｍｉＲＴ－１をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。本明細書に記載される、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の好ましいコピー数は４である。
本明細書で使用される、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、当業者に知られているように、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも検出可能なレベルの活性を発揮する。心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の活性は、心臓で発現されるその同族マイクロＲＮＡに結合し、導入遺伝子に作動可能に連結されると、心臓での導入遺伝子発現の脱標的化を媒介することである。この活性は、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの当業者に知られている標準的なアッセイによって、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで心臓での導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１つのコピー、および本明細書に記載される、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の少なくとも１つのコピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピー、および本明細書に記載される、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列の２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物中に存在する。さらなる実施形態では、ｍｉＲＴ－１２２ａをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）の１、２、３、４、５、６、７または８コピーおよびｍｉＲＴ－１をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）の１、２、３、４、５、６、７または８コピーが、本発明の遺伝子構築物に組み合わされる。さらなる実施形態では、ｍｉＲＴ－１２２ａをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）の４コピーおよびｍｉＲＴ－１をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）の４コピーが、本発明の遺伝子構築物に組み合わされる。
いくつかの実施形態では、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列および心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号７～２０の配列および／またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記の遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施形態では、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号８および１６～２０から選択され、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号７および９～１５から選択される、上記の遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列（配列番号７）およびマイクロＲＮＡ－１の標的配列（配列番号８）を含む、上記の遺伝子構築物が提供される。
本明細書に記載される、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列および／または心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列は、少なくとも検出可能なレベルの活性を発揮する。マイクロＲＮＡの標的配列の活性は、前記マイクロＲＮＡの標的配列を含むｍＲＮＡの分解であり得る。この分解は、例えば、前記ｍＲＮＡの発現／存在を測定することによって、当業者に知られている任意の技術を使用して評価することができるだろう。発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。
本発明による遺伝子構築物中に存在するインスリンをコードするヌクレオチド配列は、変異インスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列、またはコドン最適化インスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列を含む、任意のインスリン遺伝子またはインスリンコード配列に由来し得る。いくつかの実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、マウス、イヌもしくはヒトのインスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列、マウス、イヌもしくはヒトの変異インスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列、またはマウス、イヌもしくはヒトのコドン最適化インスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列である。いくつかの実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、ヒト、チンパンジー、マウス、ラットもしくはイヌのインスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列；またはヒト、チンパンジー、マウス、ラットもしくはイヌの変異インスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列；またはヒト、チンパンジー、マウス、ラットもしくはイヌのコドン最適化インスリン遺伝子もしくはインスリンコード配列である。ヒト配列が好ましい。
好ましい実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在するインスリンをコードするヌクレオチド配列が、フューリン切断部位を有する操作されたインスリンをコードする。フューリン切断部位を有するこのような操作されたインスリンは、非膵臓組織で成熟インスリンを産生するために極めて効率的な方法で処理されることが知られている。いくつかの実施形態では、フューリン切断部位を有する操作されたインスリンをコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号４１または４２のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４５または４６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
（ｃ）遺伝暗号の縮重により、その配列が（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される。
したがって、いくつかの実施形態では、インスリンをコードする好ましいヌクレオチド配列が、配列番号１～３または４１～４４と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。配列番号１は、ヒトインスリンのアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスインスリンのアミノ酸配列を表す。配列番号３は、イヌインスリンのアミノ酸配列を表す。配列番号４１は、フューリン切断部位を有するヒトインスリンのアミノ酸配列を表す。配列番号４２は、フューリン切断部位を有するヒトインスリン変異体Ｈｉｓ－Ｂ１０－Ａｓｐのアミノ酸配列を表す。配列番号４３は、マウスインスリンのアミノ酸配列を表す。配列番号４４は、チンパンジーインスリンのアミノ酸配列を表す。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号１～３または４１～４４の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号１～３または４１～４４の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４～６または４５～４８からなる群から選択される任意の配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。配列番号４は、ヒトインスリンのヌクレオチド配列を表す。配列番号５は、マウスインスリンのヌクレオチド配列を表す。配列番号６は、イヌインスリンのヌクレオチド配列を表す。配列番号４５は、フューリン切断部位を有するヒトインスリンのヌクレオチド配列を表す。配列番号４６は、フューリン切断部位を有するヒトインスリン変異体Ｈｉｓ－Ｂ１０－Ａｓｐのヌクレオチド配列を表す。配列番号４７は、マウスインスリンのヌクレオチド配列を表す。配列番号４８は、チンパンジーインスリンのヌクレオチド配列を表す。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号４～６または４５～４８の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号４～６または４５～４８の一部に対して評価され得る。
「同一性」または「配列同一性」および「類似性」または「配列類似性」の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、ヒトインスリンをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号４の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号４の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、マウスインスリンをコードするヌクレオチド配列が、配列番号５または４７と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号５または４７の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号５または４７の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、イヌインスリンをコードするヌクレオチド配列が、配列番号６と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号６の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号６の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、ヒトインスリンをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４５または４６と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号４５または４６の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号４５または４６の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、本発明による遺伝子構築物中に存在する、チンパンジーインスリンをコードするヌクレオチド配列が、配列番号４８と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号４８の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号４８の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号１～３または４１～４４のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号４～６または４５～４８のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
（ｃ）遺伝暗号の縮重により、その配列が（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列
からなる群から選択される、本明細書に記載される遺伝子構築物が提供される。
本明細書に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるインスリン（特に、インスリン配列が所与の配列番号と最小の同一性パーセンテージを有すると記載されている場合）は、少なくとも検出可能なレベルのインスリンの活性を発揮する。インスリンの活性は、高血糖の調節であり得る。より適切には、本開示の文脈では、インスリンの活性を、インスリンシグナル伝達カスケードのレベルで評価することができるだろう。例えば、インスリンシグナル伝達カスケードの様々なタンパク質のリン酸化状態、例えば、ＩＲＳ－１／２のチロシンリン酸化、ＡＫＴのリン酸化等を決定することができる。リン酸化状態は、例えば、リン酸化チロシン残基を認識する抗体ならびに／またはＩＲＳ－１／２およびＡＫＴなどのタンパク質のリン酸化形態を特異的に認識する抗体を使用して、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。インスリンの活性はまた、神経炎症を減少させること、神経新生を増加させること、または星状細胞を増加させることであり得る。この活性は、当業者に知られている方法によって、例えば、実験節に記載される、炎症性分子、星状細胞マーカーおよび／または神経原性マーカーの発現レベルを測定することによって評価することができるだろう。
以下の表は、本発明の遺伝子構築物で使用するのに適した代表的な数のインスリン配列についてのＤＮＡおよびタンパク質レベルでの配列同一性を要約している。
Figure 2022534733000001
いくつかの実施形態では、インスリンをコードするヌクレオチド配列が、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されている。好ましい実施形態では、組織特異的プロモーターが、ＣＮＳ特異的プロモーター、より好ましくは脳特異的プロモーターである。本明細書で使用されるＣＮＳ脳特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターはまた、ＣＮＳおよび／または脳の特定の領域または細胞サブセットでの発現を指示するプロモーターを包含する。したがって、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターはまた、海馬特異的プロモーター、小脳特異的プロモーター、皮質特異的プロモーター、視床下部特異的プロモーターおよび／または嗅球特異的プロモーター、あるいはこれらの任意の組み合わせから選択され得る。
「組織特異的プロモーター」の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＮＳ特異的プロモーターが、シナプシン１プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーター、アルファ－インターネキシン（ＩＮＡ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＬ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）プロモーター、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーター、ホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーター、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）プロモーター、およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される脳特異的プロモーターが、シナプシン１プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター、フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）プロモーター、アルファ－インターネキシン（ＩＮＡ）プロモーター、ネスチン（ＮＥＳ）プロモーター、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＬ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）プロモーター、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）プロモーター、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）プロモーター、およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターからなる群から選択される。
好ましい実施形態では、ＣＮＳ脳特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターが、シナプシン１プロモーターである。いくつかの実施形態では、シナプシン１プロモーターが、配列番号２８と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２８の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２８の一部に対して評価され得る。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーターが、配列番号２９と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号２９の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号２９の一部に対して評価され得る。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが、配列番号３０と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号３０の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号３０の一部に対して評価され得る。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、ネスチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、ネスチンプロモーターが、配列番号３１と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号３１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号３１の一部に対して評価され得る。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターは、ホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ホメオボックスタンパク質９（ＨＢ９）プロモーターが、配列番号３２と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号３２の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号３２の一部に対して評価され得る。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーターが、配列番号３３と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号３３の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号３３の一部に対して評価され得る。
別の好ましいＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターが、配列番号３４と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなる。いくつかの実施形態では、同一性が、配列番号３４の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％などの、配列番号３４の一部に対して評価され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターが、ＣＮＳおよび／または脳の少なくとも１つの細胞での前記ヌクレオチド配列の発現を指示する。好ましくは、前記プロモーターが、ＣＮＳおよび／または脳の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％で発現を指示する。本明細書で使用されるＣＮＳ脳特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターはまた、ＣＮＳおよび／または脳の特定の領域または細胞サブセットでの発現を指示するプロモーターを包含する。したがって、本明細書に記載されるＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターはまた、海馬、小脳、皮質、視床下部および／または嗅球の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％で発現を指示し得る。発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。
本明細書で使用されるプロモーター（特に、プロモーター配列が所与の配列番号と最小の同一性パーセンテージを有すると記載される場合）は、少なくとも当業者に知られているプロモーターの活性を発揮するべきである。好ましくは、所与の配列番号と最小の同一性パーセンテージを有すると記載されるプロモーターは、当業者に知られているアッセイで評価した場合に、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列（すなわち、少なくともインスリンをコードするヌクレオチド配列）の転写を制御すべきである。例えば、このようなアッセイは、導入遺伝子の発現を測定することを伴い得る。発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。
追加の配列が本発明の遺伝子構築物中に存在してもよい。本明細書で適切な例示的な追加の配列には、末端逆位配列（ＩＴＲ）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号３７）、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号３８）、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２４）が含まれる。本発明の文脈では、「ＩＴＲ」は、それぞれＡＡＶのゲノムに由来する１つの５’ＩＴＲおよび１つの３’ＩＴＲを包含することを意図している。好ましいＩＴＲはＡＡＶ２のものであり、配列番号３５（５’ＩＴＲ）および配列番号３６（３’ＩＴＲ）によって表される。本発明の文脈内では、ＣＭＶエンハンサー配列（配列番号２４）およびＣＭＶプロモーター配列（配列番号２３）を２つの別個の配列または単一の配列（配列番号３９）として使用することが包含される。これらの追加の配列の各々は、本発明による遺伝子構築物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるインスリンをコードするヌクレオチド配列を含み、１つの５’ＩＴＲおよび１つの３’ＩＴＲ、好ましくはＡＡＶ２ ＩＴＲ、より好ましくは配列番号３０（５’ＩＴＲ）および配列番号３１（３’ＩＴＲ）によって表されるＡＡＶ２ ＩＴＲをさらに含む遺伝子構築物が提供される。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナル、好ましくはＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（好ましくは配列番号３２によって表される）および／またはウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（好ましくは配列番号３３によって表される）をさらに含む、本明細書に記載されるインスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供される。
シグナル配列、核移行シグナル、発現エンハンサーなどをコードするヌクレオチド配列などの追加のヌクレオチド配列が、インスリンをコードする（１または複数の）ヌクレオチド配列に作動可能に連結されていてもよい。
いくつかの実施形態では、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列を含まなくてもよい、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される配列同一性または類似性のレベルが、好ましくは７０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
発現ベクター
本明細書に記載される遺伝子構築物は、発現ベクターに配置することができる。したがって、別の態様では、本明細書に記載される遺伝子構築物を含む発現ベクターが提供される。好ましくは、本明細書に記載される発現ベクターは、医薬として使用するためのものである。好ましくは、本明細書に記載される発現ベクターは、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するためのものである。
「発現ベクター」の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。
いくつかの実施形態では、発現ベクターが、ウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターであり得る。好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。
「ウイルス発現ベクター」の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。アデノウイルスベクターはアデノウイルス由来ベクターとしても知られており、アデノ随伴ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス由来ベクターとしても知られており、レトロウイルスベクターはレトロウイルス由来ベクターとしても知られており、レンチウイルスベクターはレンチウイルス由来ベクターとしても知られている。好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。「アデノ随伴ウイルスベクター」の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。
いくつかの実施形態では、ベクターが、血清型１のＡＡＶ（ＡＡＶ１）、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）、血清型３のＡＡＶ（ＡＡＶ３）、血清型４のＡＡＶ（ＡＡＶ４）、血清型５のＡＡＶ（ＡＡＶ５）、血清型６のＡＡＶ（ＡＡＶ６）、血清型７のＡＡＶ（ＡＡＶ７）、血清型８のＡＡＶ（ＡＡＶ８）、血清型９のＡＡＶ（ＡＡＶ９）、血清型ｒｈ１０のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ８のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ８）、血清型Ｃｂ４のＡＡＶ（ＡＡＶＣｂ４）、血清型ｒｈ７４のＡＡＶ（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ＤＪのＡＡＶ（ＡＡＶＤＪ）、血清型２／５のＡＡＶ（ＡＡＶ２／５）、血清型２／１のＡＡＶ（ＡＡＶ２／１）、血清型１／２のＡＡＶ（ＡＡＶ１／２）、血清型Ａｎｃ８０のＡＡＶ（ＡＡＶＡｎｃ８０）からなる群から選択されるアデノ随伴ベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス由来ベクター（ＡＡＶ）である。好ましい実施形態では、ベクターが、血清型１、２または９のＡＡＶ（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２またはＡＡＶ９）である。これらのＡＡＶ血清型は、本発明による発現ベクターとしての使用に適していることが実施例において実証されている。特に好ましい実施形態では、発現ベクターが、血清型９または１のアデノ随伴ウイルスベクターである。
好ましい実施形態では、発現ベクターが、ＡＡＶ１またはＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９であり、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含む、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む。
別の好ましい実施形態では、発現ベクターが、ＡＡＶ１またはＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ１であり、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列を含まなくてもよい、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を含む。
好ましい実施形態では、発現ベクターが、ＣＡＧプロモーターならびにｍｉＲＮＡ標的配列ｍｉＲＴ－１およびｍｉＲＴ－１２２ａに作動可能に連結されたヒトインスリンをコードする遺伝子構築物を含むＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴである。遺伝子構築物が、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナルをさらに含んでもよい。別の好ましい実施形態では、発現ベクターが、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結されたヒトインスリンをコードする遺伝子構築物を含むＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓである。遺伝子構築物が、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナルをさらに含んでもよい。
組成物
さらなる態様では、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または本明細書に記載されるウイルスベクターを、場合により１つまたは複数の薬学的に許容される成分と共に含む組成物が提供される。好ましくは、本明細書に記載される組成物は、医薬として使用するためのものである。好ましくは、本明細書に記載される組成物は、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するためのものである。好ましくは、いくつかの実施形態では、組成物が医薬組成物である。本明細書に記載されるような組成物は、遺伝子治療組成物と呼ばれることもある。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される成分」は、薬学的に許容される担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤および／または賦形剤を含み得る。したがって、１つまたは複数の薬学的に許容される成分は、薬学的に許容される担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤および／または賦形剤からなる群から選択され得る。このような薬学的に許容される担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、ビヒクル、希釈剤および／または賦形剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）に見出され得る。
さらなる化合物が本発明の組成物中に存在してもよい。前記化合物は、組成物の送達に役立ち得る。本文脈における適切な化合物は、細胞膜を通して小胞またはリポソームに複合体化または捕捉される、本明細書に記載される各成分を送達する複合体、ナノ粒子、ミセルおよび／またはリポソームを形成することができる化合物である。これらの化合物の多くは当技術分野で知られている。適切な化合物には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはポリプロピレンイミンもしくはポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）および誘導体を含む同様のカチオン性ポリマー；合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ－１８）；リポフェクチン（商標）；ＤＯＴＡＰが含まれる。当業者であれば、どのタイプの製剤が本明細書に記載される組成物に最も適切であるかを知っているであろう。
方法および使用
さらなる態様では、医薬として使用するための、本明細書に記載される遺伝子構築物が提供される。医薬として使用するための、本明細書に記載される発現ベクターがさらに提供される。医薬として使用するための、本明細書に記載される医薬組成物がさらに提供される。神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、本明細書に記載される遺伝子構築物も提供される。神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、本明細書に記載される発現ベクターがさらに提供される。神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、本明細書に記載される医薬組成物がさらに提供される。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または本明細書に記載される発現ベクターおよび／または本明細書に記載される医薬組成物が、神経炎症の処置および／または予防に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または本明細書に記載される発現ベクターおよび／または本明細書に記載される医薬組成物が、神経変性の処置および／または予防に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または本明細書に記載される発現ベクターおよび／または本明細書に記載される医薬組成物が、認知機能低下の処置および／または予防に使用するためのものである。本発明の文脈では、「神経炎症」、「神経変性」および「認知機能低下」はそれぞれ、「神経炎症またはそれに関連する疾患もしくは状態」、「神経変性またはそれに関連する疾患もしくは状態」および「認知機能低下またはそれに関連する疾患もしくは状態」で置き換えられ得る。
いくつかの実施形態では、神経炎症、神経変性および／または認知機能低下に関連する疾患または状態が、認知障害、認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、パーキンソン様疾患、パーキンソン症候群、ハンチントン病、外傷性脳損傷、プリオン病、ＨＩＶ感染による認知症／神経認知の問題、加齢による認知症／神経認知の問題、タウオパチー、多発性硬化症およびその他の神経炎症性／神経変性疾患であり得る。好ましい実施形態では、神経炎症、神経変性および／または認知機能低下に関連する疾患または状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病および／またはパーキンソン様疾患、好ましくはアルツハイマー病および／またはパーキンソン病であり得る。
したがって、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または本明細書に記載される発現ベクターおよび／または本明細書に記載される医薬組成物は、抗神経炎症薬、抗神経変性薬および／または抗認知機能低下薬と見なされ得る。したがって、これはまた抗老化薬と見なされ得る。
本明細書に開示される実施形態はまた、前記状態のいずれかに関連する神経炎症、神経変性、および／または認知機能低下を処置および／または予防するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される使用のための遺伝子構築物および／または使用のための発現ベクターおよび／または使用のための医薬組成物が、ＣＮＳ、好ましくは脳での遺伝子構築物の発現を伴う。
好ましくは、いくつかの実施形態によると、本明細書に記載される使用のための遺伝子構築物および／または使用のための発現ベクターおよび／または使用のための医薬組成物が、ＣＳＦ内投与によって投与される。
さらなる態様では、本明細書に記載される遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物を投与することを含む処置方法が提供される。好ましくは、処置方法は、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態を処置および／または予防するためのものである。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物を投与することが、治療上有効量の遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを意味する。
さらなる態様では、医薬を製造するための、本明細書に記載される遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物の使用が提供される。好ましくは、いくつかの実施形態では、前記医薬が、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するためのものである。
さらなる態様では、医学的処置のための、本明細書に記載される遺伝子構築物、発現ベクターまたは医薬組成物の使用が提供される。好ましくは、いくつかの実施形態では、前記医学的処置が、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防である。
別の態様では、対象における記憶および／または学習を改善する方法であって、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または本明細書に記載される発現ベクターおよび／または本明細書に記載される組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましい実施形態では、有効量の遺伝子構築物、発現ベクターまたは組成物が投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」は、有益なまたは所望の結果を発揮するのに十分な量である。好ましい実施形態では、処置される対象が、高齢対象ならびに／または代謝障害もしくは疾患、好ましくは肥満および／もしくは糖尿病と診断された対象である。いくつかの実施形態では、記憶が、認識記憶および／または想起記憶、好ましくは認識記憶であり得る。いくつかの実施形態では、記憶が感覚記憶；短期および／または長期記憶、好ましくは短期記憶および／または長期記憶であり得る。いくつかの実施形態では、記憶が、潜在（または手続き）記憶および／または顕在（または陳述）記憶であり得る。好ましい実施形態では、記憶がまた、空間記憶によるものであり得る。いくつかの実施形態では、学習が空間学習であり得る。様々なタイプの記憶のさらなる説明は、「一般情報」と題された節に含まれる。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための組成物、方法および使用による好ましい実施形態では、処置される対象が、高齢対象および／または代謝障害もしくは疾患と診断された対象である。換言すれば、本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための組成物、方法および使用によるいくつかの実施形態では、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態が、加齢および／または代謝障害もしくは疾患に関連する、および／またはこれらによって引き起こされる。代謝障害または疾患の合併症も包含され得る。
本明細書で使用される場合、高齢対象は、好ましくは、５０歳以上、好ましくは５５歳以上、より好ましくは６０歳以上、最も好ましくは６５歳以上の対象を意味し得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための組成物、方法および使用による他の実施形態では、処置される対象が、高齢対象ではない、および／または５０歳以下、４５歳以下、４０歳以下、３５歳以下、３０歳以下、２５歳以下の対象である。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための組成物、方法および使用による他の実施形態では、処置される対象が、代謝障害または疾患と診断されていない対象である。換言すれば、本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための組成物、方法および使用によるいくつかの実施形態では、中枢神経系障害もしくは疾患、またはそれに関連する状態が、加齢および／または代謝障害もしくは疾患に関連しない、および／またはこれらによって引き起こされない。
代謝障害および疾患には、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、肥満関連併存症、糖尿病関連併存症、高血糖、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、脂肪肝、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、内分泌疾患、骨粗鬆症性少筋性肥満症候群（ＯＳＯ）、糖尿病性腎症、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、心肥大、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性ニューロパチー、関節炎、敗血症、眼血管新生、神経変性、認知症が含まれ、うつ病、腺腫、癌腫も含まれ得る。糖尿病には、糖尿病前症、高血糖、１型糖尿病、２型糖尿病、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）、単一遺伝子性糖尿病、新生児糖尿病、妊娠糖尿病、不安定型糖尿病、特発性糖尿病、薬物または化学物質誘発性糖尿病、スティッフマン症候群、脂肪萎縮性糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）が含まれ得る。肥満には、過体重、中枢／上半身肥満、末梢／下半身肥満、病的肥満、骨粗鬆症性少筋性肥満症候群（ＯＳＯ）、小児肥満、メンデル（単一遺伝子性）症候性肥満、メンデル非症候性肥満、多遺伝子性肥満が含まれ得る。好ましい代謝障害または疾患は、肥満および／または糖尿病である。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための組成物、方法および使用によるいくつかの実施形態では、処置される対象が、神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態を発症するリスクがある対象である。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、治療および／または処置および／または医薬が、ＣＮＳ、好ましくは脳での遺伝子構築物の発現を伴い得る。いくつかの実施形態では、ＣＮＳおよび／または脳以外の組織で検出可能な発現がない。いくつかの実施形態では、脳での遺伝子構築物の発現が、視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球での遺伝子構築物の発現を意味し得る。したがって、脳での遺伝子構築物の発現は、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球からなる群から選択される少なくとも１つまたは少なくとも２つまたは少なくとも３つまたは全ての脳領域での遺伝子構築物の発現を意味し得る。いくつかの実施形態では、ＣＮＳおよび／または脳での発現が、ＣＮＳおよび／または脳での特異的発現を意味し得る。一実施形態では、発現が、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃および／または精巣で検出不能である。好ましい実施形態では、発現が肝臓および／または心臓で検出不能である。別の好ましい実施形態では、発現が骨格筋で検出不能である。いくつかの実施形態では、発現が、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、精巣からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての器官での発現を伴わない。ＣＮＳ特異的発現および／または脳特異的発現の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。
発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。「ＣＮＳ」、「脳」、「視床下部」、「海馬」、「小脳」、「皮質」および「嗅球」の説明は、「一般情報」と題された節で提供されている。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物および／または医薬が、ＣＳＦ内（脳脊髄液）投与によって（大槽、髄腔内または脳室内送達を介して）投与され得る。好ましい投与様式、場合によりヒトにおける好ましい投与様式は、脳室内である。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物および／または医薬が、実質内投与によって投与され得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物および／または医薬が、鼻腔内投与によって投与され得る。
本明細書で使用される「ＣＳＦ内投与」、「鼻腔内投与」、「実質内投与」、「大槽内投与」、「髄腔内投与」および「脳室内投与」は、「一般情報」と題された本出願の一部で説明される。
好ましい実施形態では、本明細書に記載される処置または治療または医薬の使用もしくは投与を繰り返す必要がない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処置または治療または医薬の使用もしくは投与が、毎年、または２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年（列挙される値のいずれか２つの間の間隔を含む）毎に繰り返され得る。
処置される対象は、ネコ、齧歯動物（好ましくはマウス、ラット、スナネズミおよびモルモット、より好ましくはマウスおよびラット）、イヌ、またはヒトなどの高等哺乳動物であり得る。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物および／または医薬が、好ましくは、以下の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全てを示す：
－神経炎症の減少；
－神経新生の増加；
－星状細胞数の増加；
－神経変性の減少；
－症状の緩和（本明細書で後述）；および
－パラメータの改善（本明細書で後述）。
神経炎症の減少は、神経組織の炎症が減少することを意味し得る。これは、例えば実験部で行われるように、（神経）炎症マーカーの測定などの当業者に知られている技術を使用して評価することができるだろう。これに関して使用され得る例示的なマーカーは、Ｉｌ－１ｂ、Ｉｌ－６およびＮｆｋＢである。この文脈で、「減少」（それぞれ「改善」）は、実験部で行われるアッセイなどの、当業者に知られているアッセイを使用して少なくとも検出可能な減少（それぞれ検出可能な改善）を意味する。減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の減少であり得る。減少は、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した処置の少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に見られ得る。好ましくは、減少が単回投与後に観察される。いくつかの実施形態では、減少が、好ましくは単回投与後、少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年またはそれ以上の期間観察される。
神経新生の増加は、ニューロンが神経幹細胞によって産生されることを意味し得る。これは、例えば実験部で行われるように、神経新生マーカーの測定などの当業者に知られている技術を使用して評価することができるだろう。これに関して使用され得る例示的なマーカーは、Ｄｃｘ、ＮｃａｍおよびＳｏｘ２である。この文脈で、「増加」（それぞれ「改善」）は、実験部で行われるアッセイなどの、当業者に知られているアッセイを使用して少なくとも検出可能な増加（それぞれ検出可能な改善）を意味する。減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の減少であり得る。増加は、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した処置の少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に見られ得る。好ましくは、増加が単回投与後に観察される。いくつかの実施形態では、増加が、好ましくは単回投与後、少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年またはそれ以上の期間観察される。
星状細胞数の増加は、星状細胞数が増加することを意味し得る。これは、例えば実験部で行われるように、星状細胞マーカーの測定などの当業者に知られている技術を使用して評価することができるだろう。これに関して使用され得る例示的なマーカーは、ＧｆａｐおよびＳ１００ｂである。この文脈で、「増加」（それぞれ「改善」）は、実験部で行われるアッセイなどの、当業者に知られているアッセイを使用して少なくとも検出可能な増加（それぞれ検出可能な改善）を意味する。減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の減少であり得る。増加は、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した処置の少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に見られ得る。好ましくは、増加が単回投与後に観察される。いくつかの実施形態では、増加が、好ましくは単回投与後、少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年またはそれ以上の期間観察される。
神経変性の減少は、ニューロンの死を含むニューロンの構造または機能の喪失が減少することを意味し得る。これは、免疫細胞化学、免疫組織化学などの当業者に知られている技術を使用して、ＭＲＩなどの医療画像技術によって、ニューロン形態およびシナプス変性を研究することによって（シナプスに位置するタンパク質の密度を測定することによって）、またはいくつかの老化および神経変性マーカーの発現レベルを分析することによって評価することができるだろう。この文脈で、「減少」（それぞれ「改善」）は、実験部で行われるアッセイなどの、当業者に知られているアッセイを使用して少なくとも検出可能な減少（それぞれ検出可能な改善）を意味する。減少は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の減少であり得る。増加は、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した処置の少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に見られ得る。好ましくは、増加が単回投与後に観察される。いくつかの実施形態では、増加が、好ましくは単回投与後、少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年またはそれ以上の期間観察される。
症状の緩和は、典型的な症状（例えば、神経炎症、神経変性、認知機能低下、記憶喪失、学習能力の低下、シナプス喪失、タウリン酸化）の進行が、医師によって評価した場合に、個体、前記個体の細胞、組織または器官で減速したことを意味し得る。典型的な症状の減少は、症状発現の進行の減速または症状の完全な消失を意味し得る。症状、したがって症状の減少は、様々な方法、臨床検査および日常的な実験室試験を含む、神経炎症、神経変性、認知機能低下、およびそれに関連する疾患の診断に使用されるのとほぼ同じ方法を使用して評価することができる。臨床検査には、行動試験および認知試験が含まれ得る。実験室試験には、肉眼的方法と顕微鏡的方法の両方、分子的方法、Ｘ線などの放射線撮影法、生化学的方法、免疫組織化学的方法などが含まれ得る。記憶および学習は、例えば、実験部で説明されるように、例えば新規物体認識試験および／またはモリス水迷路試験によって、マウスで評価され得る。症状の緩和は、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した処置の少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に見られ得る。好ましくは、緩和が単回投与後に観察される。いくつかの実施形態では、緩和が、好ましくは単回投与後、少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年またはそれ以上の期間観察される。
パラメータの改善は、行動試験後の結果の改善、血清およびＣＳＦマーカーの発現の改善、アポトーシス／神経新生細胞マーカーの発現の改善等を意味し得る。パラメータの改善は、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した処置の少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に見られ得る。好ましくは、改善が単回投与後に観察される。いくつかの実施形態では、改善が、好ましくは単回投与後、少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年またはそれ以上の期間観察される。
本発明による使用のための遺伝子構築物、使用のための発現ベクター、使用のための医薬組成物、方法および使用の文脈内では、本明細書に記載される遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物が、好ましくは、個体、前記個体の細胞、組織または器官における神経炎症、神経変性および／もしくは認知障害、またはそれに関連する疾患の１つまたは複数の症状を緩和するか、または前記個体の細胞、組織または器官の１つまたは複数の特徴または症状を緩和する。
本明細書に記載される遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物は、好ましくは、本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物を使用した処置の少なくとも１週間、１ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に、患者または前記患者の細胞、組織もしくは器官の症状または特徴が本明細書に記載されるように減少した（例えば、もはや検出不能であるか、または減速した）場合に、前記症状または特徴を緩和することができる。
本明細書に記載される遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物および／または医薬は、神経炎症、神経変性および／もしくは認知障害、またはそれに関連する疾患に罹患しているか、またはこれらを発症するリスクがある個体のインビボの細胞、組織および／または器官に投与するのに適していてもよく、インビボ、エキソビボまたはインビトロで投与され得る。前記遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物および／または医薬は、神経炎症、神経変性および／もしくは認知障害、またはそれに関連する疾患に罹患しているか、またはこれらを発症するリスクがある個体のインビボの細胞、組織および／または器官に直接的または間接的に投与され得、インビボ、エキソビボまたはインビトロで直接的または間接的に投与され得る。
投与様式は、静脈内、筋肉内、髄腔内、脳室内、腹腔内、吸入、鼻腔内、眼内および／または実質内投与であり得る。好ましい投与様式は、鼻腔内、実質内およびＣＳＦ内（大槽、髄腔内または脳室内送達を介する）投与である。ＣＳＦ内投与が最も好ましい。好ましい投与様式、場合によりヒトにおける好ましい投与様式は、脳室内である。
本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物および／または医薬は、当技術分野で知られている適切な手段を使用して直接的または間接的に投与され得る。個体または前記個体の細胞、組織、器官に本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物および／または医薬を提供する手段の改善が、これまでに既に達成されている進歩を考慮すれば、予期される。このような将来の改善は、当然、本発明の言及された効果を達成するために組み込まれ得る。遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物および／または医薬は、個体、前記個体の細胞、組織または器官にそのまま送達することができる。疾患または状態に応じて、前記個体の細胞、組織または器官は、本明細書で前に記載される通りであり得る。本発明の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物および／または医薬を投与する場合、このような遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物および／または医薬を、送達方法と適合性の溶液に溶解することが好ましい。
本明細書に包含されるように、治療上有効量の上記の遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または組成物は、好ましくは単回の固有の投与で投与され、繰り返しの定期的投与が回避される。
一般情報
特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって慣習的および通常に理解され、本開示を考慮して読まれるのと同じ意味を有する。
配列同一性／類似性
本発明の文脈では、インスリンをコードする核酸分子などの核酸分子は、タンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列によって表される。本発明の文脈では、インスリンタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドは、アミノ酸配列によって表される。
所与の配列同一性番号（配列番号）によって本明細書で特定される各核酸分子またはタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドまたは構築物が、開示されるこの特定の配列に限定されないことを理解すべきである。本明細書で特定される各コード配列は、所与のタンパク質断片もしくはポリペプチドもしくはペプチドもしくは誘導ペプチドもしくは構築物をコードするか、またはそれ自体がタンパク質断片もしくはポリペプチドもしくは構築物もしくはペプチドもしくは誘導ペプチドである。本出願を通して、所与のタンパク質断片またはポリペプチドまたはペプチドまたは誘導ペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列 配列番号（例として配列番号Ｘをとる）に言及する度に、これを
ｉ．配列番号Ｘと少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．遺伝暗号の縮重により、その配列が（ｉ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列；または
ｉｉｉ．ヌクレオチド配列 配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性または類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
によって置き換えることができる。
配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは７０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
本出願を通して、特定のアミノ酸配列 配列番号（例として配列番号Ｙをとる）に言及する度に、これをアミノ酸配列 配列番号Ｙと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドによって置き換えることができる。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは７０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは８０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９０％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９５％である。配列同一性または類似性の別の好ましいレベルは９９％である。
それぞれ所与のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列との同一性または類似性パーセンテージによって本明細書に記載される各ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、さらに好ましい実施形態では、それぞれ所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性または類似性を有する。
各非コードヌクレオチド配列（すなわち、プロモーターまたは別の制御領域の）は、特定のヌクレオチド配列 配列番号（例として配列番号Ａをとる）と少なくとも６０％の配列同一性または類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えられ得る。好ましいヌクレオチド配列は、配列番号Ａと少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する。好ましい実施形態では、プロモーターなどのこのような非コードヌクレオチド配列が、当業者に知られているプロモーターの活性などの、少なくともこのような非コードヌクレオチド配列の活性を示すか、または発揮する。例えば、このような活性は、インスリンコード配列などのプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の検出可能な発現を誘導することである。
「相同性」、「配列同一性」、「同一性」などの用語は、本明細書で互換的に使用される。配列同一性は、本明細書では、配列を比較することによって決定される、２つ以上のアミノ酸配列（ペプチドもしくはポリペプチドもしくはタンパク質）または２つ以上の核酸配列（ポリヌクレオチド）の間の関係として記載される。２つのアミノ酸配列間の「類似性」または「配列類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換物を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」および「類似性」は、それだけに限らないが、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ：Ｍｏｄｅｒｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ，Ｘｉａ Ｘ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１８；およびＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍｏｕｎｔ Ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００４に記載されるものを含む、公知の方法によって容易に計算することができる。
配列同一性または類似性は、所与の２つの配列番号の全長またはその一部に基づいて計算することができる。いくつかの実施形態では、その一部が、両配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を意味する。好ましい実施形態では、配列同一性または類似性が、本明細書で特定される配列の全長を比較することによって決定される。本明細書で別段の指示がない限り、所与の配列番号との同一性または類似性は、前記配列の全長に基づく（すなわち、その全長にわたるまたは全体としての）同一性または類似性を意味する。当技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定される、アミノ酸またはヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を指す。
配列同一性または類似性は、２つの配列の長さに応じて、グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムを使用した２つのペプチドまたは２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。類似の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたって最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列される一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列される。次いで、配列は、（例えば、デフォルトパラメータを使用してプログラムＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅまたはＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒによって最適に整列された場合に）配列同一性または類似性（以下に記載される）の少なくとも一定の最小パーセンテージを共有する場合に、「実質的に同一」または「本質的に類似」と呼ばれ得る。
グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合に、配列同一性または類似性を判断するために適切に使用される。配列の全長が大幅に異なる場合は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するようなローカルアラインメントが好ましい。ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列を全長（完全長）にわたってアラインメントし、一致数を最大化し、ギャップ数を最小化する。ＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒは、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎローカルアラインメントアルゴリズムを使用する。一般に、ギャップオープンペナルティ＝１０（ヌクレオチド配列）／１０（タンパク質）およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチド配列）／０．５（タンパク質）の、ＥＭＢＯＳＳ ｎｅｅｄｌｅおよびＥＭＢＯＳＳ ｗａｔｅｒデフォルトパラメータを使用することができる。ヌクレオチド配列の場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはＤＮＡｆｕｌｌであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－９１９）。
あるいは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのアルゴリズムを使用して公開データベースを検索することによって、類似性または同一性パーセンテージを決定することができる。好ましくはデフォルトパラメータを修正することなく、Ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅを使用することもできる（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ）。よって、本発明のいくつかの実施形態のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を「クエリ配列」としてさらに使用して公開データベースに対して検索を行って、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を特定することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施して、本発明の核酸分子に相同な、好ましくはインスリンをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ化アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴｘおよびＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／のワールドワイドウェブでアクセス可能なアメリカ国立生物工学情報センターのホームページを参照されたい。
アミノ酸類似性の程度を決定する際に、当業者はまた、いわゆる保存的アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。
本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。保存的置換のためのアミノ酸残基のクラスの例を以下に示す。
Figure 2022534733000002
代替の保存的アミノ酸残基置換クラスは以下の通りである：
Figure 2022534733000003
アミノ酸残基の代替の物理的および機能的分類：
Figure 2022534733000004
例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリンおよびアスパラギン－グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示される配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸変化が保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれの好ましい保存的置換は以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕまたはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅまたはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐまたはＰｈｅ；およびＶａｌからＩｌｅまたはＬｅｕ。
遺伝子またはコード配列
「遺伝子」は、機能を有する分子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドの配列である。ヌクレオチド配列は、「非コード配列」ならびに「コード配列」を含み得る。（コード配列からの）ＣＤＳとしても知られる「遺伝子」のコード領域は、タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの部分である。非コード配列の例は、本明細書の他の場所に記載されるプロモーターおよびマイクロＲＮＡ標的配列である。「遺伝子」という用語は、適切な制御領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された、細胞内のＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は通常、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、および３’非翻訳配列（３’末端）（例えば、ポリアデニル化および／または転写終結部位を含む）などの、いくつかの作動可能に連結された断片を含む。キメラまたは組換え遺伝子（キメラまたは組換えインスリン遺伝子など）は、例えばプロモーターが転写されるＤＮＡ領域の一部または全部と本質的に関連していない遺伝子などの、通常は自然界には見られない遺伝子である。「遺伝子の発現」は、適切な制御領域、特にプロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ領域が、生物学的に活性であり、例えば、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドに翻訳することができるＲＮＡに転写されるプロセスを指す。
「導入遺伝子」は、本明細書では、細胞に新たに導入されたヌクレオチド配列（すなわち、インスリンをコードする分子）によって表される遺伝子またはコード配列または核酸分子、すなわち、細胞内に存在し得るが、通常は発現され得ないか、または不十分なレベルで発現され得る遺伝子として記載される。本文脈では、「不十分な」とは、前記インスリンが細胞内で発現されるが、本明細書に記載される状態および／または疾患が依然として発症し得ることを意味する。この場合、本発明はインスリンの過剰発現を可能にする。導入遺伝子は、細胞に固有の配列、細胞内に自然に存在しない配列を含み得、両方の組み合わせを含み得る。導入遺伝子は、細胞内のインスリンをコードする配列の発現のための適切な制御配列に作動可能に連結され得る、本明細書で以前に特定されたインスリンおよび／または追加のタンパク質をコードする配列を含み得る。好ましくは、導入遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれていない。
プロモーター
本明細書で使用される場合、「プロモーター」または「転写制御配列」という用語は、１つまたは複数のコード配列の転写を制御するように機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および任意の他のＤＮＡ配列（それだけに限らないが、転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位を含む）、およびプロモーターからの転写の量を制御するように直接的または間接的に作用することが当業者に知られている任意の他のヌクレオチド配列の存在によって構造的に特定される核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的および発達的条件下でほとんどの組織で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、生理学的または発達的にまたは他の方法で、例えば化学誘導剤の適用によって、制御されるプロモーターである。
「ユビキタスプロモーター」は、生物の実質的に全ての組織、器官および細胞で活性である。いくつかの実施形態では、ユビキタスプロモーターが、少なくとも５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なるタイプの組織、器官および／または細胞での発現を駆動する。
「器官特異的」または「組織特異的」プロモーターは、それぞれ特定のタイプの器官または組織で活性のプロモーターである。器官特異的および組織特異的プロモーターは、主に１つの器官または組織で１つまたは複数の遺伝子（またはコード配列）の発現を制御するが、他の器官または組織でも検出可能なレベルの（「漏れ」）発現を可能にすることができる。他の器官または組織における漏れ発現は、当業者に知られている標準的なアッセイ（例えば、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ）によってｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで評価した場合、器官特異的または組織特異的発現と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍低いが、依然として検出可能な発現を意味する。漏れ発現が検出され得る器官または組織の最大数は、５、６、７、または８である。
「ＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーター」は、ＣＮＳおよび／または脳で転写を開始することができる一方で、他の（最大５、６、７、または８の）器官および体の一部での漏れ発現を可能にするプロモーターである。ＣＮＳおよび／または脳での転写は、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球などの関連領域、ならびにニューロンおよび／またはグリア細胞などの細胞で検出することができる。
本発明の文脈では、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターは、他の器官または組織と比較して、優先的または優勢な（少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも１５０％高い、少なくとも２００％高いまたはそれ以上の）ＣＮＳおよび／または脳でのインスリンの発現を駆動することができるプロモーターであり得る。他の器官または組織は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓、結腸、造血組織、肺、卵巣、脾臓、胃、精巣などであり得る。好ましくは、他の器官は肝臓および／または心臓である。他の器官はまた骨格筋であり得る。本明細書で使用されるＣＮＳ脳特異的プロモーターおよび／または脳特異的プロモーターはまた、ＣＮＳおよび／または脳の特定の領域または細胞サブセットでの発現を指示するプロモーターを包含する。したがって、ＣＮＳ特異的プロモーターならびに／または脳特異的プロモーターはまた、海馬特異的プロモーター、小脳特異的プロモーター、皮質特異的プロモーター、視床下部特異的プロモーターおよび／もしくは嗅球特異的プロモーター、もしくはこれらの任意の組み合わせから選択され得る。発現は、「一般情報」と題された節で説明される、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの技術を使用して評価され得る。
本出願全体を通して、ＣＮＳ特異的および／または脳特異的が発現の文脈で言及されている場合、ＣＮＳおよび／または脳を構成する（１または複数の）細胞型の細胞型特異的発現もそれぞれ想起される。
作動可能に連結された
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸は、別の核酸分子との機能的な関係に置かれると「作動可能に連結」される。例えば、転写制御配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には隣接しており、必要に応じて、隣接しており、リーディングフレーム内にある２つのタンパク質コード領域を結合することを意味する。連結は、簡便な制限部位またはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって、または遺伝子合成、または当業者に知られている任意の他の方法によって達成され得る。
マイクロＲＮＡ
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉＲ」は、本開示を考慮して当業者によって理解されるその慣習的かつ通常の意味を有する。マイクロＲＮＡは、植物、動物、および一部のウイルスに見られる小さな非コードＲＮＡ分子であり、ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後制御で機能し得る。マイクロＲＮＡの標的配列は、「ｍｉＲＴ」として示され得る。例えば、マイクロＲＮＡ－１またはｍｉＲＮＡ－１またはｍｉＲ－１の標的配列は、ｍｉＲＴ－１として示され得る。
タンパク質およびアミノ酸
「タンパク質」または「ポリペプチド」または「アミノ酸配列」という用語は互換的に使用され、特定の作用様式、サイズ、三次元構造または起源に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。本明細書に記載されるアミノ酸配列では、アミノ酸または「残基」が３文字表記で示される。これらの３文字表記および対応する１文字表記は、当業者に周知であり、以下の意味を有する：Ａ（Ａｌａ）はアラニンであり、Ｃ（Ｃｙｓ）はシステインであり、Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸であり、Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸であり、Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニンであり、Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシンであり、Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジンであり、Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシンであり、Ｋ（Ｌｙｓ）はリジンであり、Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシンであり、Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニンであり、Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギンであり、Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリンであり、Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミンであり、Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニンであり、Ｓ（Ｓｅｒ）はセリンであり、Ｔ（Ｔｈｒ）はスレオニンであり、Ｖ（Ｖａｌ）はバリンであり、Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファンであり、Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシンである。残基は、任意のタンパク質原性アミノ酸であり得るが、Ｄ－アミノ酸および翻訳後修飾によって形成される修飾アミノ酸などの任意の非タンパク質原性アミノ酸、ならびに任意の非天然アミノ酸であり得る。
遺伝子構築物
本明細書に記載される遺伝子構築物は、適切な細胞、例えば共に全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，’’Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ’’，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１，上記）に記載されるような、培養細胞または多細胞生物の細胞で前記インスリンをコードするヌクレオチド配列を発現させる、当業者に知られている、任意のクローニングおよび／または組換えＤＮＡ技術を使用して調製することができるだろう。Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８（部位特異的変異誘発を記載）およびＲｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１－７３４またはＷｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４：３１５（カセット変異導入法を記載）も参照されたい。
発現ベクター
「発現ベクター」または「ベクター」という句は、一般に、このような配列と適合性の宿主での遺伝子またはコード配列の発現をもたらすことができるヌクレオチド配列を指す。発現ベクターは、細胞内でエピソームを安定化および維持することができるゲノムを有する。本発明の文脈内で、細胞は、構築物を作製するために使用される細胞、または構築物が投与される細胞を包含することを意味し得る。あるいは、ベクターは、例えば、相同組換えまたはその他の方法を通して、細胞のゲノムに組み込むことができる。
これらの発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切なプロモーター配列および場合により、転写終結シグナルを含む。発現をもたらすのに必要または有用な追加の因子もまた、本明細書に記載されるように使用することができる。インスリンをコードする核酸またはＤＮＡまたはヌクレオチド配列は、インビトロ細胞培養物で導入および発現することができるＤＮＡ構築物に組み込まれる。具体的には、ＤＮＡ構築物は、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物宿主での複製に適しているか、または培養哺乳動物、植物、昆虫（例えば、Ｓｆ９）、酵母、真菌もしくは他の真核細胞株に導入することができる。
特定の宿主への導入のために調製されたＤＮＡ構築物は、宿主によって認識される複製系、所望のポリペプチドをコードする意図したＤＮＡ断片、ならびにポリペプチドをコードするセグメントに作動可能に連結された転写および翻訳開始ならびに終結制御配列を含み得る。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書で既に説明されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写を刺激する場合、コード配列に作動可能に連結されている。シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は隣接しており、シグナル配列の場合、隣接しておりかつリーディングフレーム内にある。しかしながら、エンハンサーは、転写を制御するコード配列と隣接している必要はない。連結は、簡便な制限部位またはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって、または遺伝子合成、または当業者に知られている任意の他の方法によって達成される。
適切なプロモーター配列の選択は、一般に、ＤＮＡセグメントの発現のために選択された宿主細胞に依存する。適切なプロモーター配列の例としては、当技術分野で周知の原核生物および真核生物プロモーターが挙げられる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１参照）。転写制御配列は、典型的には、宿主によって認識される異種エンハンサーまたはプロモーターを含む。適切なプロモーターの選択は宿主に依存するが、ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖酵素プロモーターなどのプロモーターが知られており、利用可能である（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１参照）。発現ベクターは、ポリペプチドをコードするセグメントの挿入部位と共に、複製系ならびに転写および翻訳制御配列を含む。ほとんどの場合、複製系は、ベクターを作製するために使用される細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）としての細菌細胞）内でのみ機能性である。ほとんどのプラスミドおよびベクターは、ベクターに感染した細胞で複製しない。細胞株および発現ベクターの実行可能な組み合わせの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１，上記）およびＭｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：３１－３６に記載されている。例えば、適切な発現ベクターは、酵母、例えば、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、および細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され得る。よって、細胞は、原核または真核宿主細胞であり得る。細胞は、液体または固体培地での培養に適した細胞であり得る。
あるいは、宿主細胞は、トランスジェニック植物または動物などの多細胞生物の一部である細胞である。
ウイルスベクター
ウイルスベクターまたはウイルス発現ベクターまたはウイルス遺伝子治療ベクターは、本明細書に記載される遺伝子構築物を含むベクターである。
ウイルスベクターまたはウイルス遺伝子治療ベクターは、遺伝子治療に適したベクターである。遺伝子治療に適したベクターは、Ａｎｄｅｒｓｏｎ １９９８，Ｎａｔｕｒｅ３９２：２５－３０；Ｗａｌｔｈｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ，２０００，Ｄｒｕｇｓ６０：２４９－７１；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：３３－４０；Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３－６０４；Ａｍａｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：６７４－６；Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４４８－５３；Ｖｉｇｎａ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２：３０８－１６；Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ３：３９６－４０３；Ｐｅｎｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４５４－７；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：３０４９－６４；Ｒｅｉｓｅｒ，２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：９１０－３；およびこれらに引用されている参考文献に記載されている。遺伝子治療ベクターを説明する追加の参考文献は、Ｎａｌｄｉｎｉ ２０１５，Ｎａｔｕｒｅ ５５２６（７５７３）：３５１－３６０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ１８（５）：３５８－３７８；Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．２０１８Ｓｃｉｅｎｃｅ３５９（６３７２）；Ｌｕｋａｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１６Ｂｉｏｓｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）８１（７）：７００－７０８である。
特に適切な遺伝子治療ベクターには、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる。これらのベクターは、滑膜細胞および肝細胞を含む、幅広い数の分裂細胞および非分裂細胞型に感染する。細胞侵入後のアデノウイルスおよびＡＡＶベクターのエピソームの性質により、これらのベクターは上に示される治療用途に適したものとなる（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：２５７３－２６０４；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，２００５，Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２（１）：４３）。ＡＡＶベクターは、導入遺伝子発現の極めて安定な長期発現（イヌでは最大９年（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９Ｊａｎ２２；１１３（４）：７９７－８０６）、ヒトでは約１０年（Ｂｕｃｈｌｉｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２ Ｍａｒ ２９；１１９（１３）：３０３８－４１））をもたらすことが知られているのでさらにより好ましい。Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０００、上記）によって概説されているように、好ましいアデノウイルスベクターは、宿主応答を低減するように改変されている。ＡＡＶベクターを使用する遺伝子治療法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．Ｍａｒｃｈ ９（Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）、Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．６（５）：４８２－９０およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｙｅ１８（１１）：１０４９－５５、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１Ｄｅｃ２２；３６５（２５）：２３５７－６５、Ａｐｐａｒａｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５Ａｐｒ；１６（４）：４２６－３４によって記載されている。
別の適切な遺伝子治療ベクターには、レトロウイルスベクターが含まれる。本発明での適用のための好ましいレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベースの発現構築物である。レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞のゲノムに感染し、安定に組み込まれる能力を有する（Ａｍａｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，１９９９Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５：６７４－６）。レンチウイルスベースの発現構築物の構築および使用の方法は、米国特許第６，１６５，７８２号明細書、同第６，２０７，４５５号明細書、同第６，２１８，１８１号明細書、同第６，２７７，６３３号明細書および同第６，３２３，０３１号明細書、ならびにＦｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１０：４４８－５３）およびＶｉｇｎａ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ２０００；２：３０８－１６）に記載されている。
他の適切な遺伝子治療ベクターには、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターが含まれる。
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）
本明細書で同義語として使用される「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶ粒子」という用語は、ＡＡＶの少なくとも１つのカプシドタンパク質（好ましくは特定のＡＡＶ血清型の全てのカプシドタンパク質で構成される）およびＡＡＶゲノムのカプセル化ポリヌクレオチドで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が、ＡＡＶ末端逆位配列が隣接する異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノムとは異なるポリヌクレオチド）を含む場合、これらは典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」として知られている。ＡＡＶは、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムの長さはおよそ４．７Ｋｂで、プラスまたはマイナスに検出できる一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。本発明はまた、ｄｓＡＡＶまたはｓｃＡＡＶとも呼ばれる二本鎖ＡＡＶの使用を包含する。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端の末端逆位配列（ＩＴＲ）、および２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐとｃａｐを含む。フレームｒｅｐは、ＡＡＶライフサイクルに必要なタンパク質Ｒｅｐをコードする４つの重複遺伝子で構成されている。フレームｃａｐは、相互作用して二十面体対称のカプシドを形成するカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と重複するヌクレオチド配列を含む（Ｃａｒｔｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ２０００，６（１）：１７－２７およびＧａｏ ｅｔ ａｌ，２００４参照）。
好ましいウイルスベクターまたは好ましい遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶベクターである。本明細書で使用されるＡＡＶベクターは、好ましくは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）を含む。本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で説明されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質のタンパク質シェルにカプシド形成されたＡＡＶゲノムの一部を含む組換えベクターを指す。ＡＡＶゲノムの一部は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５などのアデノ随伴ウイルス血清型に由来する末端逆位配列（ＩＴＲ）を含み得る。好ましいＩＴＲは、配列番号３５（５’ＩＴＲ）および配列番号３６（３’ＩＴＲ）を含むか、から本質的になるか、またはからなる配列によって表されるＡＡＶ２のものである。本発明はまた、好ましくは、５’ＩＴＲとして配列番号３５と少なくとも８０％（または少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有する配列および３’ＩＴＲとして配列番号３６と少なくとも８０％（または少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）の同一性を有する配列の使用を包含する。
カプシドタンパク質で構成されるタンパク質シェルは、任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。タンパク質シェルは、カプシドタンパク質シェルとも呼ばれ得る。ｒＡＡＶベクターは、１つのまたは好ましくは全ての野生型ＡＡＶ遺伝子が欠失していてもよいが、依然として機能的ＩＴＲヌクレオチド配列を含み得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの複製、レスキュー、およびパッケージングに必要である。ＩＴＲ配列は、野生型配列であり得るか、または野生型配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有し得るか、または機能的なままである限り、例えばヌクレオチドの挿入、突然変異、欠失もしくは置換によって変更され得る。本文脈では、機能性とは、ゲノムのカプシドシェルへのパッケージングを指示し、次いで、感染させる宿主細胞または標的細胞での発現を可能にする能力を指す。本発明の文脈では、カプシドタンパク質シェルが、ｒＡＡＶベクターゲノムＩＴＲと異なる血清型のものであり得る。
選択できるヌクレオチド配列によって表される、好ましくはインスリンをコードする核酸分子は、好ましくは、上で特定されたｒＡＡＶゲノムまたはＩＴＲ配列の間に挿入され、例えば発現構築物は、コード配列および３’終結配列と作動可能に連結した発現制御エレメントを含む。前記核酸分子は、導入遺伝子とも呼ばれ得る。
「ＡＡＶヘルパー機能」は、一般に、トランスでｒＡＡＶベクターに供給されるｒＡＡＶ複製およびパッケージングに必要な対応するＡＡＶ機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、ｒＡＡＶベクターにはないＡＡＶ機能を補完するが、ＡＡＶ ＩＴＲ（ｒＡＡＶベクターゲノムによって提供される）を欠いている。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶの２つの主要なＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐコード領域およびｃａｐコード領域、またはこれらの機能的な実質的に同一の配列を含む。ＲｅｐおよびＣａｐ領域は当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ７３（２）：１３０９－１３１９）または米国特許第５，１３９，９４１号明細書を参照されたい。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶヘルパー構築物で提供することができる。ヘルパー構築物の宿主細胞への導入は、例えば、本明細書で特定されるｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムの導入の前またはこれと同時の形質転換、トランスフェクション、または形質導入によって行うことができる。よって、本発明のＡＡＶヘルパー構築物は、一方ではｒＡＡＶベクターのカプシドタンパク質シェル、他方では前記ｒＡＡＶベクター複製およびパッケージングに存在するｒＡＡＶゲノムのための血清型の所望の組み合わせをもたらすように選択され得る。
「ＡＡＶヘルパーウイルス」は、ＡＡＶの複製およびパッケージングに必要な追加の機能を提供する。適切なＡＡＶヘルパーウイルスには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１型および２型など）およびワクシニアウイルスが含まれる。ヘルパーウイルスによって提供される追加の機能は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５３１，４５６号明細書に記載されるように、プラスミドを介して宿主細胞に導入することもできる。
「形質導入」は、ウイルスベクターによるレシピエント宿主細胞へのインスリンの送達を指す。例えば、本発明のｒＡＡＶベクターによる標的細胞の形質導入は、そのベクターに含まれるｒＡＡＶゲノムの形質導入細胞への移入をもたらす。「宿主細胞」または「標的細胞」は、対象の筋細胞などの、ＤＮＡ送達が行われる細胞を指す。ＡＡＶベクターは分裂細胞と非分裂細胞の両方に形質導入することができる。
ＡＡＶベクターの作製
導入遺伝子をベクター化するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の作製は以前に記載されている。Ａｙｕｓｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；１０：４２３－４３６、Ｏｋａｄａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；２０：１０１３－１０２１、Ｚｈａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；２０：９２２－９２９およびＶｉｒａｇ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；２０：８０７－８１７を参照されたい。これらのプロトコルを、本発明のＡＡＶを作製するために使用または適合させることができる。一実施形態では、プロデューサー細胞株を、本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲが隣接する発現カセットを含む）ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードし、ヘルパー機能を提供する（１または複数の）構築物で一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、細胞株がヘルパー機能を安定に供給し、細胞株を本発明のポリヌクレオチド（ＩＴＲが隣接する発現カセットを含む）ならびにｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする（１または複数の）構築物で一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、細胞株がｒｅｐおよびｃａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を安定に供給し、細胞株を本発明のポリヌクレオチドで一過的にトランスフェクトする。別の実施形態では、細胞株がｒｅｐおよびｃａｐタンパク質を安定に供給し、細胞株を本発明のポリヌクレオチドおよびヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドで一過的にトランスフェクトする。さらに別の実施形態では、細胞株が、本発明のポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質、ならびにヘルパー機能を安定に供給する。これらおよび他のＡＡＶ産生系を作製および使用する方法は、当技術分野で説明されている。Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎらの米国特許第５，１３９，９４１号明細書、Ｚｈｏｕ Ｘらの米国特許第５，７４１，６８３号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒらの米国特許第６，０５７，１５２号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒらの米国特許第６，２０４，０５９号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒらの米国特許第６，２６８，２１３号明細書、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊらの米国特許第６，４９１，９０７号明細書、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ Ｓらの米国特許第６，６６０，５１４号明細書、Ｓｈｅｎｋ Ｔらの米国特許第６，９５１，７５３号明細書、Ｓｎｙｄｅｒ Ｒらの米国特許第７，０９４，６０４号明細書、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊらの米国特許第７，１７２，８９３号明細書、Ｍｏｎａｈａｎ Ｐらの米国特許第７，２０１，８９８号明細書、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒらの米国特許第７，２２９，８２３号明細書およびＦｅｒｒａｒｉ Ｆらの米国特許第７，４３９，０６５号明細書を参照されたい。
ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、少なくとも、ＡＡＶ血清型の１つ（好ましくは、本明細書で前に開示される血清型ＡＡＶ２のもの）の末端逆位配列領域（ＩＴＲ）のヌクレオチド配列、またはこれと実質的に同一のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列、および２つのＩＴＲ間に挿入された（適切な制御エレメントの制御下で）インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む。ベクターゲノムは、ｒＡＡＶカプシドへのベクターゲノムの効率的なパッケージングを可能にするために、隣接５’および３’ＩＴＲ配列の使用を必要とする。
いくつかのＡＡＶ血清型および対応するＩＴＲの完全なゲノムが配列決定されている（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２，ｐ１３０９－１３１９）。これらは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒｓ、ＣＡ、米国）によって供給されるオリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して、当技術分野で知られる化学合成によって、または標準的な分子生物学技術によってクローニングまたは作製することができる。ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスゲノムからクローンニングするか、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターから切り出すことができる。ＩＴＲヌクレオチド配列を、標準的な分子生物学技術を使用して、１つもしくは複数の治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかの末端にライゲーションすることができる、またはＩＴＲ間のＡＡＶ配列を所望のヌクレオチド配列で置き換えることができる。
好ましくは、ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐ（複製）またはｃａｐ（カプシド）遺伝子などのウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。このｒＡＡＶゲノムは、例えば、抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（例えば、ｇｆｐ）をコードする遺伝子、あるいは当技術分野で知られている化学的、酵素的または他の方法で検出可能および／または選択可能な産物（例えば、ｌａｃＺ、ａｐｈ等）をコードする遺伝子などのマーカーまたはレポーター遺伝子をさらに含み得る。
前記ｒＡＡＶベクターに存在するｒＡＡＶゲノムは、インスリンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含む。
適切な３’非翻訳配列はまた、インスリンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。適切な３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列に自然に関連するものであり得るか、または例えばＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（配列番号３７）およびウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（配列番号３８）などの異なる遺伝子に由来し得る。
発現
発現は、当業者に知られている任意の方法によって評価され得る。例えば、発現は、ｑＰＣＲ、ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡなどの当業者に知られている標準的なアッセイによって、ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで肝臓での導入遺伝子発現のレベルを測定することによって評価され得る。
発現は、本明細書に記載される遺伝子構築物、発現ベクターまたは組成物の投与後いつでも評価され得る。
本明細書のいくつかの実施形態では、発現が、１日、２日、３日、４日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間または１０週間後すぐに検出され得る。
本明細書のいくつかの実施形態では、発現が、少なくとも４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間、４０週間、４４週間、４８週間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間、１２年間、１５年間、２０年間またはそれ以上続き得る。換言すれば、これは、発現を、投与の４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２８週間、３２週間、３６週間、４０週間、４４週間、４８週間、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１２年、１５年、２０年またはそれ以上後で検出することができることを意味する。
いくつかの実施形態では、この発現が、単回投与後に検出される。
本発明の文脈では、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球特異的発現は、他の器官または組織と比較して、優先的または優勢な（少なくとも１０％高い、少なくとも２０％高い、少なくとも３０％高い、少なくとも４０％高い、少なくとも５０％高い、少なくとも６０％高い、少なくとも７０％高い、少なくとも８０％高い、少なくとも９０％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも１５０％高い、少なくとも２００％高いまたはそれ以上の）ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球でのインスリンの発現を指す。他の器官または組織は、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋、心臓などであり得る。一実施形態では、発現が、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および／または心臓で検出不能である。いくつかの実施形態では、発現が、肝臓、膵臓、脂肪組織、骨格筋および心臓からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または全ての器官で検出不能である。発現は上記のように評価され得る。
本出願全体を通して、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球特異的が発現の文脈で言及される場合、ＣＮＳおよび／または脳および／または視床下部および／または皮質および／または海馬および／または小脳および／または嗅球を構成する（１または複数の）細胞型の細胞型特異的発現もそれぞれ想起される。
投与
本明細書で使用される場合、「ＣＳＦ内投与」は、脳を囲む髄膜のくも膜層と軟膜層との間のくも膜下腔に位置するＣＳＦへの直接投与を意味する。ＣＳＦ内投与は、大槽内、脳室内または髄腔内投与を介して実施することができる。本明細書で使用される場合、「大槽内投与」は、小脳と延髄の背側との間に位置するくも膜下腔の開口部である大槽への投与を意味する。本明細書で使用される場合、「脳室内投与」は、脳の両側脳室のいずれかへの投与を意味する。本明細書で使用される場合、「髄腔内投与」は、脊柱の髄腔内空間内のＣＳＦへの直接投与を伴う。本明細書で使用される場合、「実質内投与」は、脳実質の任意の領域への直接の局所投与を意味する。本明細書で使用される場合、「鼻腔内投与」は、鼻構造による投与を意味する。
好ましい実施形態では、本発明による遺伝子構築物、発現ベクターおよび組成物が、単回投与として投与される。
コドン最適化
本明細書で使用される「コドン最適化」は、既存のコード配列を改変するため、またはコード配列を設計するため、例えば、コードから転写された転写産物ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するため、またはコード配列の転写を改善するために採用されるプロセスを指す。コドン最適化には、それだけに限らないが、発現宿主生物のコドン選好に適合するようにコード配列のためのコドンを選択することを含むプロセスが含まれる。例えば、哺乳動物、好ましくはマウス、イヌ、またはヒト発現宿主のコドン選好に適合するため。コドン最適化はまた、ＲＮＡの安定性および／または翻訳に悪影響を与える可能性のある要素（例えば、終結配列、ＴＡＴＡボックス、スプライス部位、リボソーム侵入部位、反復および／またはＧＣリッチ配列ならびにＲＮＡ二次構造または不安定性モチーフ）を排除する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列が、少なくとも３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上の転写、ＲＮＡ安定性および／または翻訳の増加を示す。
ＣＮＳおよび脳
本明細書で使用される場合、「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、そこに感覚インパルスが伝達され、そこから運動インパルスが出て、神経系全体の活動を調整する、脳および脊髄を含む神経系の部分を指す。
本明細書で使用される場合、「脳」は、神経系の中枢器官を指し、大脳、脳幹および小脳からなる。脳は、体のほとんどの活動を制御し、感覚器官から受け取る情報を処理、統合、調整し、体の残りの部分に送信される指示について決定を下す。
特に、本明細書で使用される場合、「視床下部」は、自律神経系と下垂体の活動の両方を調整し、体温、喉の渇き、空腹、および他の恒常性系を制御し、睡眠および感情的な活動に関与する視床の下の前脳の領域を指す。本明細書で使用される「海馬」は、大脳辺縁系に属し、短期記憶から長期記憶への情報の固定、およびナビゲーションを可能にする空間記憶において重要な役割を果たす。海馬は大脳皮質（不等皮質）の下および霊長類では内側側頭葉に位置している。本明細書で使用される「皮質」または「大脳皮質」は、ヒトおよび他の哺乳動物における脳の大脳の神経組織の外層である。これは、記憶、注意、知覚、認識、思考、言語および意識において重要な役割を果たす。本明細書で使用される「小脳」は、全ての脊椎動物の後脳における主要な特徴を指す。ヒトでは、小脳は運動制御において重要な役割を果たす。小脳はまた、注意および言語などの一部の認知機能、ならびに恐怖および快楽反応の制御にも関与し得る。本明細書で使用される「嗅球」は、嗅覚系（嗅覚に専念する系）の本質的な構造を指す。嗅球は、扁桃体、眼窩前頭皮質（ＯＦＣ）、ならびに感情、記憶および学習で役割を果たす海馬でさらに処理される情報を送信する。
記憶
記憶は一般に、データまたは情報が必要に応じて符号化、保存、および検索される脳の能力であると理解される。様々なタイプまたは記憶が説明されている。１つの考えられる区別は、感覚記憶、短期記憶および長期記憶を伴う。感覚記憶は、物品が認識されてから１秒以内に感覚情報を保持する。短期（ワーキングメモリとも呼ばれる）記憶は、典型的にはリハーサルなしで、数秒から１分の期間の想起を可能にする。それとは逆に、長期記憶は、潜在的に無制限の期間（最大で全寿命）にわたってはるかに大量の情報を保存することができる。
別の区別は、手続き記憶（または潜在記憶）および顕在記憶（または陳述記憶）を伴う。潜在記憶は、情報の意識的な想起に基づいているのではなく、潜在学習、すなわち何かをする方法を覚えていることに基づく。顕在（または陳述）記憶は、事実情報、以前の経験および概念の意識的で意図的な回想である。
想起記憶と認識記憶を区別することもできる。認識とは、イベントまたは情報をなじみのあるものとして「認識する」能力を指し、想起とは、記憶から関連する詳細を検索することを指す。
空間記憶は、自分の環境および空間的配向に関する情報の記録を担う記憶の一形態である。
この文書およびその特許請求の範囲では、「含む」という動詞およびその活用形は、非限定的な意味で使用され、その単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が除外されないことを意味する。さらに、「からなる」とう動詞は、「から本質的になる」によって置き換えることができ、本明細書に記載される遺伝子構築物、発現ベクターまたは組成物が、具体的に特定されたもの以外の（１または複数の）追加の成分を含んでもよく、（１または複数の）前記追加の成分が本発明の固有の特徴を変更しないことを意味する。
不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、要素が１つおよびただ１つだけ存在することを文脈が明確に要求しない限り、１つを超える要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
本明細書で使用される場合、「少なくとも」特定の値は、その特定の値以上を意味する。例えば、「少なくとも２」は、「２以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、．．．等と同じであると理解される。
個々の数値は、値の前に「約」または「およそ」という単語が付いているかのように、近似として明言される。同様に、本出願で指定される様々な範囲の数値は、特に明記しない限り、明言される範囲内の最小値および最大値の両方の前に「約」または「およそ」という単語が付いているかのように近似として明言される。本明細書で使用される場合、数値に言及する場合の「約」および「およそ」という用語は、開示される主題が最も密接に関連する分野または当の範囲もしくは要素に関連する分野の当業者に対して明白で通常の意味を有するものとする。厳密な数値境界からの広がりの量は、多くの因子に依存する。例えば、考慮され得る因子の一部には、要素の重要度および／または所与の量の変動が請求される主題の性能に対して有する効果、ならびに当業者に知られているその他の考慮事項が含まれる。反対の考慮事項がない場合、「約」または「およそ」という単語は、数値に関連して使用される場合（例えば、約１０）、好ましくはその値が１％多いまたは少ない（１０の）所与の値であり得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、明言されるケースの１つまたは複数が、単独で、または明言されるケースの少なくとも１つから明言されるケースの全てまでと組み合わせて起こり得ることを示す。
本明細書に記載される各実施形態は、別段の指示がない限り、本明細書に記載される他の実施形態と組み合わせることができる。
本明細書で引用される全ての特許出願、特許、および印刷された刊行物は、定義、主題のディスクレーマーまたは否認を除いて、かつ組み込まれた資料が本明細書の明示的な開示と矛盾する場合を除いて（この場合は、本開示の文言が優先する）、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
当業者であれば、本発明の実施で使用され得る、本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。
本発明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。
ＳＡＭＰ８マウスの脳でのｈＩｎｓの発現を示す図である。ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）コード配列の発現レベルを、ＳＡＭＰ８マウスの視床下部、皮質、海馬および小脳でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１４週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９動物／群として表す。ＮＤ、不検出。 ＡＡＶ９－ｈＩｎｓベクターで処置されたＳＡＭＰ８マウスの脳炎症の減少を示す図である。炎症性分子（Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６）の発現レベルを、ＳＡＭＰ８マウスの視床下部、海馬および小脳でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１４週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９動物／群として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対未処置マウス。Ｎｆｋｂ、核内因子κＢ；Ｉｌ１ｂ、インターロイキン－１β；Ｉｌ６、インターロイキン－６。 ＡＡＶ９－ｈＩｎｓベクターで処置されたＳＡＭＰ８マウスの脳での星状細胞マーカーの発現増加を示す図である。星状細胞マーカー（ＧｆａｐおよびＳ１００ｂ）の発現レベルを、ＳＡＭＰ８マウスの視床下部、皮質、海馬および小脳でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１４週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９動物／群として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対未処置マウス。Ｇｆａｐ、グリア細胞線維性酸性タンパク質；Ｓ１００ｂ、カルシウム結合タンパク質Ｂ。 ＡＡＶ９－ｈＩｎｓ処置ＳＡＭＰ８マウスの脳における神経新生増加を示す図である。神経原性マーカー（Ｄｃｘ、ＮｃａｍおよびＳｏｘ２）の発現レベルを、ＳＡＭＰ８マウスの皮質でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１４週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９動物／群として表す。＊ｐ＜０．０５対未処置マウス。Ｄｃｘ、ダブルコルチン；Ｎｃａｍ、神経接着分子；Ｓｏｘ２、性決定領域Ｙボックス２。 ｄｂ／ｄｂマウスの脳でのｈＩｎｓの発現を示す図である。ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）コード配列の発現レベルを、ｄｂ／ｄｂマウスの視床下部、皮質、海馬および小脳でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９動物／群として表す。ＮＤ、不検出。 ＡＡＶ９－ｈＩｎｓベクターで処置されたｄｂ／ｄｂマウスの脳炎症の減少を示す図である。炎症性分子（Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６）の発現レベルを、ｄｂ／ｄｂマウスの視床下部、海馬および小脳でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９動物／群として表す。＊＊ｐ＜０．０１対未処置マウス。Ｎｆｋｂ、核内因子κＢ；Ｉｌ１ｂ、インターロイキン－１β；Ｉｌ６、インターロイキン－６。 ＡＡＶ９－ｈＩｎｓベクターで処置されたｄｂ／ｄｂマウスの脳での星状細胞マーカーの発現増加を示す図である。星状細胞マーカー（ＧｆａｐおよびＳ１００ｂ）の発現レベルを、ｄｂ／ｄｂマウスの視床下部、皮質、海馬および小脳でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の１２週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９動物／群として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対未処置マウス。Ｇｆａｐ、グリア細胞線維性酸性タンパク質；Ｓ１００ｂ、カルシウム結合タンパク質Ｂ。 ＡＡＶ１－ｈＩｎｓ、ＡＡＶ２－ｈＩｎｓおよびＡＡＶ９－ｈＩｎｓベクターのＣＳＦ内投与後の脳の形質導入を示す図である。 ＡＡＶ１－ｈＩｎｓ、ＡＡＶ２－ｈＩｎｓおよびＡＡＶ９－ｈＩｎｓベクターのＣＳＦ内投与後の脳の形質導入を示す図である。（Ａ）ベクターゲノムコピー数を、ｈＩｎｓに特異的なプライマーを用いた定量的ＰＣＲによって、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴ、ＡＡＶ２－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴまたはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与の３週間後に、野生型マウスの視床下部、皮質、海馬および小脳から単離されたＤＮＡで決定した。（Ｂ）ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）の発現レベルを、同じ動物の視床下部、皮質、海馬および小脳でＲＴｑＰＣＲによって測定した。結果をＲｐｌｐ０値で正規化した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝５動物／群として表す。ＮＤ、不検出。 ＳＡＭＰ８マウスの脳でのｈＩｎｓの発現を示す図である。ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）コード配列の発現レベルを、ＳＡＭＰ８マウスの視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球でＲＴｑＰＣＲによって測定し、Ｒｐｌｐ０値で正規化した。分析は、それぞれ５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔベクターのＣＳＦ内投与の３４週間後に実施した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝５動物／群として表す。ＮＤ、不検出。 ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐベクターによるＣＳＦ内遺伝子治療後のＳＡＭＰ８マウスの短期記憶の改善を示す図である。 ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐベクターによるＣＳＦ内遺伝子治療後のＳＡＭＰ８マウスの長期記憶の改善を示す図である。（Ａ）短期識別指数および（Ｂ）長期識別指数を、３３週齢のＳＡＭＲ１未処置マウス、ＳＡＭＰ８未処置マウス、ＳＡＭＰ８ ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔ処置マウス、およびＳＡＭＰ８ ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐ処置マウスで新規物体認識試験中に測定し、実施例の一般的手順で説明されているように計算した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝５動物／群として表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対ＳＡＭＰ８未処置マウス。 ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔによるＣＳＦ内遺伝子治療後のＳＡＭＰ８マウスにおける学習能力の改善を示す図である。学習能力を、３９週齢のＳＡＭＲ１未処置マウス、ＳＡＭＰ８未処置マウス、およびＳＡＭＰ８ ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔ処置マウスでモリス水迷路中に測定し、実施例の一般的手順で説明されているように計算した。結果を、平均±ＳＥＭ、ｎ＝５動物／群として表す。
［実施例］
ＡＡＶベクターを使用して、脳で過剰発現した場合の脳に対するインスリンの影響を試験すること。３つの異なる実験を実施した：
・ＳＡＭＰ８マウスのＡＡＶ９－Ｉｎｓによる処置。使用量：５ｘ１０１０ｖｇ／マウス（実施例１）。
・ｄｂ／ｄｂマウスのＡＡＶ９－Ｉｎｓによる処置。使用量：５ｘ１０１０ｖｇ／マウス（実施例２）。
・ＳＡＭＰ８マウスのＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔによる処置。使用量：５ｘ１０１０ｖｇ／マウス（実施例５）。
さらに、野生型マウスのＣＳＦ内投与後のＡＡＶ１－ｈＩｎｓ、ＡＡＶ２－ｈＩｎｓおよびＡＡＶ９－ｈＩｎｓベクターによる脳形質導入効率も調べた（実施例３）。
実施例の一般的手順
対象の特徴
雄ＳＡＭＰ８／ＴａＨｓｄ（ＳＡＭＰ８）、ＢＫＳ．Ｃｇ－＋Ｌｅｐｒｄｂ／＋Ｌｅｐｒｄｂ ＯｌａＨｓｄ（ｄｂ／ｄｂ）、およびＣ５７Ｂｌ／６Ｊ（野生型）マウスを使用した。実施例５については、ＳＡＭＲ１／ＴａＨｓｄ（ＳＡＭＲ１）を使用した。マウスに標準的な食餌（２０１８Ｓ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔｓ（登録商標）、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を自由に与え、１２時間の明暗サイクル（午前８時に点灯）および安定した温度（２２℃±２）下で維持した。組織のサンプリングのために、マウスを吸入麻酔薬イソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ、米国）によって麻酔し、脱頭した。目的の組織を切除し、分析まで－８０℃で保存した。全ての実験手順は、バルセロナ自治大学の動物および人体実験のための倫理委員会によって承認された。
組換えＡＡＶベクター
血清型１、２および９の一本鎖ＡＡＶベクターを、標準的な方法（Ａｙｕｓｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：４２３－３６）に従ってＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションによって作製した。実施例１～３については、細胞を１０個のローラーボトル（８５０ｃｍ２、平底；Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）においてＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ中で８０％コンフルエンスまで培養し、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号４０）が隣接する発現カセットを有するプラスミド、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびそれぞれ血清型１、２または９のＡＡＶのｃａｐ遺伝子を有するヘルパープラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミドを用いてリン酸カルシウム法によってコトランスフェクトした。使用した導入遺伝子は、発現カセットの３’非翻訳領域にクローニングされるｍｉＲＴ－１２２ａ配列（５’ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ３’、配列番号７）の４つのタンデムリピートおよびｍｉＲＴ－１配列（５’ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ３’、配列番号８）の４つのタンデムリピートを付加した、初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号２２）によって駆動されるヒトインスリンコード配列（配列番号４６）であった。実施例５については、細胞を、ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号４９または配列番号５０）が隣接する発現カセットを有するプラスミド、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子および血清型１のＡＡＶを有するヘルパープラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミドでコトランスフェクトした。使用した導入遺伝子は、ぞれぞれ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター（配列番号２２）によって駆動される、フューリン切断部位を含むヒトインスリンアスパラギン酸コード配列（配列番号４６）またはフューリン切断部位を含むヒトインスリン野生型コード配列（配列番号４５）であった。ＡＡＶを、ポリエチレングリコール沈殿ステップおよび２つの連続した塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配に基づく最適化された方法で精製した。この第２世代のＣｓＣｌベースのプロトコルは、空のＡＡＶカプシドならびにＤＮＡおよびタンパク質不純物を劇的に減少させた（Ａｙｕｓｏ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：４２３－３６）。精製したＡＡＶベクターをＰＢＳに対して透析し、濾過して－８０℃で保存した。ウイルスゲノムの力価を、標準曲線として線形化プラスミドＤＮＡを使用して、ＡＡＶ２参照標準物質について記載されるプロトコルに従った定量的ＰＣＲによって決定した（Ｌｏｃｋ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１：１２７３－１２８５）。ベクターを、当技術分野で周知の分子生物学技術に従って構築した。
ＡＡＶベクターのインビボＣＳＦ内投与
ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射でマウスを麻酔し、耳の後ろからおおよそ肩甲骨の間まで、後頭部の皮膚を剪毛し、エタノールですすいだ。マウスを腹臥位に保ち、頭はわずかに下向きに傾けた。２ｍｍの吻側尾側切開を行い、ハミルトン注射器を４５～５５°の角度で大槽内に、後頭とＣ１椎骨との間に導入し、５μｌのベクター希釈液を投与した。ＣＮＳがベクター送達の主な標的コンパートメントであることを考えて、体重（５ｘ１０１０ｖｇ／マウス）に関係なく、マウスに同じ数のベクターゲノム（ｖｇ）／マウスを投与した。
ＲＮＡ分析
全ＲＮＡを、視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球から、Ｔｒｉｐｕｒｅ分離試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、米国）、および海馬試料用のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＫｉｔまたはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ、ＮＬ）を使用して取得した。残留ウイルスゲノムを排除するために、全ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（Ｑｉａｇｅｎ ＮＶ、Ｖｅｎｌｏ、ＮＬ）で処理した。ＲＴ－ＰＣＲ分析では、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（０４３７９０１２００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して１μｇのＲＮＡ試料を逆転写した。リアルタイム定量ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ、フランス）を使用して実施した。データをＲｐｌｐ０値で正規化し、以前記載されたように分析した（Ｐｆａｆｆｌ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１；２９（９）：ｅ４５）。
ベクター体内分布
視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球をプロテイナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍＬ）で一晩消化した。全ＤＮＡを、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を使用して単離した。ベクターゲノムコピー数を、ヒトインスリンに特異的なプライマーおよびプローブを使用したＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって２０ｎｇのゲノムＤＮＡで決定した。試料当たりのベクターゲノムを、２０ｎｇの非形質導入ゲノムＤＮＡにスパイクされた標的配列を有する線形化プラスミドの段階希釈によって作成された標準曲線から内挿した。
新規物体認識試験．
新規物体認識試験を、オープンフィールドボックスで行った。オープンフィールド試験を使用して、マウスを箱に順応させた。翌日、最初の試行を行うために、２つの同一の物体（ＡおよびＢ）をボックスの右上および左上の象限に配置し、次いで、マウスを両物体の後方に配置した。１０分の探索後、マウスを箱から取り出し、１０分間休憩させた。第２の試行では、同一の物体の一方（ＡまたはＢ）を物体Ｃ（新たな物体）に置き換えた。次いで、マウスをさらに１０分間探索させるためにボックスに戻して、短期記憶を評価した。第２の試行の２４時間後に、物体Ｃを新たな物体（Ｄ）に置き換えて第３の試行を実施した。次いで、マウスをさらに１０分間探索させるためにボックスに戻して、長期記憶を評価した。動物が新たな物体を探索するのに費やした時間を記録し、ビデオ追跡システム（ＳＭＡＲＴ Ｊｕｎｉｏｒ；Ｐａｎｌａｂ）を使用して評価した。新規物体認識試験記憶の評価を、以下の式に従って計算した識別比のパーセンテージとして表した。識別比（％）＝（Ｎ－Ｆ）／（Ｎ＋Ｆ）×１００％（式中、Ｎは新たな物体の探索に費やした時間を表し、Ｆは同じ物体の探索に費やした時間を表す）。
モリス水迷路．
マウスを、泳ぎと外部の目に見える手がかりに頼ることによって、水槽（直径１ｍ、温度２６～２８℃）内の水中プラットホーム（直径１０ｃｍ）を見つけるように訓練した。５日手順：習熟（１日目）、マウスを目に見えるプラットホームに置き、次いで、３０秒間自由にさせた。次いで、２回の連続した試行で、マウスを２つの異なる出発点から迷路に入れた。マウスが６０秒以内にプラットホームに到達しなかった場合は、プラットホームに誘導した。目に見えるプラットホームに到達するまでの潜時を測定した；訓練（２～４日目）では、マウスを様々な迷路象限に無作為に配置した。隠されたプラットホーム（「正しい」象限に配置されている）に到達するまでの潜時を、６０秒のカットオフを用いて、１日２セッション（セッション間１時間）で、セッション毎に２回の試行で測定した。試験（５日目）では、訓練の最後のセッションに続いてプローブ試行を行った。隠されたプラットホームを除去し、マウスをプールの中央に置き、プラットホームが位置していた領域を横切るまでの潜時を、ビデオ追跡システム（Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ、フランス）を使用して測定した；
実施例１～４では、フューリン切断部位を有するヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリン変異体Ｈｉｓ－Ｂ１０－Ａｓｐのヌクレオチド配列（ｈＩｎｓＡｓｐ；配列番号４６）を使用する。実施例５では、フューリン切断部位を有するヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリン変異体Ｈｉｓ－Ｂ１０－Ａｓｐのヌクレオチド配列（ｈＩｎｓＡｓｐ；配列番号４６）とフューリン切断部位を有するヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリン野生型のヌクレオチド配列（ｈＩｎｓｗｔ；配列番号４５）の両方を使用する。
遺伝子操作されたフューリンエンドプロテアーゼ切断部位は、非膵臓組織での成熟インスリンの非常に効率的な産生を可能にする；総インスリン産生の８５～９３％が成熟インスリンである（Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９７Ｄｅｃ１０；８（１８）：２２４９－５９；Ｇｒｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９Ｍａｙ１；１０（７）：１２０７－１７およびＲｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００２Ｍａｒ；５１（３）：７０４－１１）。フューリンは、様々な脳領域に存在することが知られており（Ｆｏｔｉ ｅｔ ａｌ．ｚｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１６（１１）：１３１４－１３１９）、この器官でフューリン切断部位を含む配列から成熟インスリンを効率的に産生することが可能になる。
［実施例１］
ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与によるＳＡＭＰ８マウスにおける神経炎症の減少および神経新生の増加
神経炎症および神経新生に対するインスリンによる脳のＡＡＶ媒介遺伝子工学の治療の可能性を評価した。この目的のために、神経炎症などの加齢性脳病態を伴う、広く使用される老化のマウスモデルである、老化促進モデルマウス（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ－ｐｒｏｎｅ ８）（ＳＡＭＰ８）マウスを使用した（Ｔａｋｅｄａ Ｔ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００９，３４（４）：６３９－６５９；Ｇｒｉｎａｎ－Ｆｅｒｒｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２０１６，５３（４）：２４３５－２４５０）。
７週齢の雄ＳＡＭＰ８マウスに、肝臓特異的ｍｉＲ１２２および心臓特異的ｍｉＲ１の標的部位を含むＣＡＧユビキタスプロモーター（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴ）の制御下で、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのヒトインスリンをコードするＡＡＶ９ベクターを、大槽を通してＣＳＦ内に局所投与した。対照として、未処置ＳＡＭＰ８動物を使用した。２１週齢で、動物を安楽死させ、分析のために組織試料を採取した。
ＳＡＭＰ８マウスの視床下部、皮質、海馬および小脳などの脳の様々な領域でのヒトインスリンの発現レベルの増加によって証明されるように、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与は、脳内のインスリンの広範な過剰発現を媒介した（図１）。
神経炎症は、脳の様々な領域での炎症誘発性分子Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６の発現を通して分析した。注目すべきことに、これらの炎症誘発性分子の発現は、分析した全ての脳領域で減少した（図２）。
星状細胞マーカーＧｆａｐおよびＳ１００ｂの発現を分析した。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターでＣＳＦ内処置したＳＡＭＰ８マウスは、視床下部、皮質、海馬および小脳でのＧｆａｐの発現増加（図３）、ならびに皮質でのＳ１００ｂの発現増加（図３）を示した。星状細胞は神経伝達物質とＡＴＰを分泌することができ、これらは近くのニューロンの活動を調節することができる（Ｃａｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１８，１２８（７）：２９１４－２９２６）。したがって、星状細胞数の増加は、ニューロン活動を支持し、抗不安効果および抗うつ作用をもたらし得る。さらに、星状細胞マーカーの増加に伴う炎症誘発性マーカーの減少は、インスリン遺伝子治療処置後に増加する星状細胞の集団が、「Ａ２星状細胞」とも呼ばれる「有益な星状細胞」の集団であることをさらに示している。
ＳＡＭＰ８処置マウスの神経新生を試験するために、神経原性マーカーのリアルタイムＰＣＲを実施した。ダブルコルチン（Ｄｃｘ）、神経接着分子（Ｎｃａｍ）および性決定領域Ｙボックス２（Ｓｏｘ２）の発現が、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴ処置マウスの皮質で増加した（図４）。
［実施例２］
ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与によるｄｂ／ｄｂマウスにおける神経炎症の減少
ｄｂ／ｄｂマウスにおける肥満および／または糖尿病に関連する神経炎症に対するインスリンの効果を評価した。ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチンシグナル伝達の欠損を特徴とする、広く使用される肥満および糖尿病の遺伝的マウスモデルである。さらに、これらのマウスは、脂肪組織および肝臓などの末梢組織だけでなく、脳にも炎症を示す（Ｄｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｍｕｎｏｌ．２０１４）。
この目的のために、７週齢の雄ｄｂ／ｄｂマウスに、大槽を通して、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターをＣＳＦ内投与した。対照として、未処置ｄｂ／ｄｂ動物を使用した。１９週齢で、動物を安楽死させ、分析のために組織試料を採取した。
ＳＡＭＰ８マウスでなされた観察と同様に、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与は、ｄｂ／ｄｂマウスの視床下部、皮質、海馬および小脳でのインスリンの強力な過剰発現を媒介した（図５）。
インスリンをコードするベクターで処置されたｄｂ／ｄｂマウスでは、炎症誘発性分子Ｎｆｋｂ、Ｉｌ１ｂおよびＩｌ６の発現が、分析した全ての脳領域で減少した（図６）。さらに、ｄｂ／ｄｂ処置マウスは、視床下部、皮質および海馬における星状細胞マーカーＧｆａｐの発現増加、ならびに皮質における星状細胞マーカーＳ１００ｂの発現増加を示した（図７）。星状細胞は神経伝達物質とＡＴＰを分泌することができ、これらは近くのニューロンの活動を調節することができる（Ｃａｉ Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１８，１２８（７）：２９１４－２９２６）。したがって、星状細胞数の増加は、ニューロン活動を支持し、抗不安効果および抗うつ作用をもたらし得る。さらに、星状細胞マーカーの増加に伴う炎症誘発性マーカーの減少は、インスリン遺伝子治療処置後に増加する星状細胞の集団が、「Ａ２星状細胞」とも呼ばれる「有益な星状細胞」の集団であることをさらに示している。
［実施例３］
ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴ、ＡＡＶ２－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴベクターのＣＳＦ内投与後の脳形質導入．
様々なＡＡＶ血清型が脳を効率的に形質導入できるかどうかを調べるために、野生型マウスを、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２ａおよび心臓特異的ｍｉＲ－１の標的部位を含むＣＡＧユビキタスプロモーターの制御下、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのヒトインスリンコード配列をコードするＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９ベクター（それぞれＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴ、ＡＡＶ２－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴ）でＣＳＦ内処置した。対照として、未処置野生型マウスを使用した。
ＡＡＶベクターのＣＳＦ内投与の３週間後、脳試料を採取し、ベクターゲノムコピー数およびヒトインスリン発現を測定した。図８に示されるように、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９のＣＳＦ内投与後、視床下部、皮質、海馬および小脳の形質導入（図８Ａ）ならびに同じ脳領域でのｈＩｎｓの発現（図８Ｂ）が見られた。
［実施例４］
アルツハイマー病マウスモデルにおけるＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓベクターのＣＳＦ内投与．
アルツハイマー病に対するインスリンによる脳のＡＡＶ媒介遺伝子工学の治療可能性を評価するために、３ｘＴｇ－ＡＤ（Ｂ６；１２９Ｔｇ（ＡＰＰＳｗｅ、タウＰ３０１Ｌ）１Ｌｆａ Ｐｓｅｎ１ｔｍ１Ｍｐｍ）マウスモデルを使用する。３ｘＴｇ－ＡＤは、広く使用されるアルツハイマー病のマウスモデルであり、３つの変異対立遺伝子全てでホモ接合性、Ｐｓｅｎ１変異でホモ接合性、同時注入されたＡＰＰＳｗｅおよびｔａｕＰ３０１Ｌ導入遺伝子でホモ接合性である（Ｂｅｌｆｉｏｒｅ，Ｒ．，Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．２０１９，１８（１）：ｅ１２８７３）。
３ｘＴｇ－ＡＤマウスに、ＣＡＧユビキタスプロモーターの制御下で、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのヒトインスリンをコードするＡＡＶ１ベクターを、大槽を通してＣＳＦ内に局所投与する。対照として、未処置３ｘＴｇ－ＡＤ動物を使用する。Ｙ迷路、オープンフィールドおよびモリス水迷路などのいくつかの行動試験をこれらのマウスで実施する。１２月齢で、動物を安楽死させ、分析のために血清および組織試料を採取する。
これらの試料の分析には、神経新生（Ｓｏｘ２、ＮｅｕＮおよびＤｃｘなどのニューロンマーカーの発現）、神経炎症（ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１およびいくつかのサイトカインレベルの発現）、アミロイドβ（可溶性アミロイドおよびプラーク）のレベルに関する試験、シナプス変性（シナプトフィジンのタンパク質レベルおよび脊柱密度）、タウリン酸化のレベルに関する試験が含まれる。
［実施例５］
ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔベクターのＣＳＦ内投与によるＳＡＭＰ８マウスにおける短期および長期記憶ならびに学習能力の改善
認知機能低下に対するインスリンによる脳のＡＡＶ媒介遺伝子工学の治療の可能性を評価した。この目的のために、８～１２月齢までに認知機能低下を示すＳＡＭＰ８マウスモデルを使用した（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｅｈａｖ．１９８６；３８（３）：３９９－４０６；Ｍａｒｋｏｗｓｋａ，ＡＬ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｅｈａｖ．１９９８；６４（１）：１５－２６）。
７週齢の雄ＳＡＭＰ８マウスに、ＣＡＧユビキタスプロモーターの制御下で、５ｘ１０１０ｖｇ／マウスのヒトインスリンアスパラギン酸またはヒトインスリン野生型コード配列をコードするＡＡＶ１ベクター（ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔベクター）を、大槽を通してＣＳＦ内に局所投与した。対照として、未処置ＳＡＭＰ８動物および未処置ＳＡＭ／耐性１（ＳＡＭＲ１）動物を使用した。
４１週齢のＳＡＭＰ８マウスの視床下部、皮質、海馬、小脳および嗅球などの脳の様々な領域でのヒトインスリンの発現レベルの増加によって証明されるように、ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐベクターおよびＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓｗｔベクターのＣＳＦ内投与は、脳内のインスリンの広範な過剰発現を媒介した（図９）。
記憶に対するインスリンをコードするウイルスベクターによるＣＳＦ内処置の効果を試験するために、新規物体認識試験を３３週齢で実施した。ＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐをコードするベクターまたはＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔをコードするベクターのいずれかで処置されたＳＡＭＰ８マウスは、未処置ＳＡＭＰ８コホートよりも著しく良好に機能し（図１０）、それらの識別指数は、最初の試行の１０分後（図１０Ａ）と２４時間後（図１０Ｂ）の両方でＳＡＭＲ１未処置対照マウスと同様であり、遺伝子治療後の短期および長期記憶の増加を示している。
学習能力を、３９週齢のＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔマウスでモリス水迷路試験を使用して評価したところ、遺伝子治療処置後のＳＡＭＰ８マウスでは、処置マウスのプラットホームに最初に入るまでの潜時が短縮され（図１１）、ＣＮＳへのＡＡＶ１－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔ投与が、ＳＡＭＰ８マウスの学習能力を高めることを示している。
Figure 2022534733000005
Figure 2022534733000006
ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリンのヌクレオチド配列（配列番号４）
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＧ
ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリンのアミノ酸配列（配列番号１）
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
フューリン切断部位を有するヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリンのヌクレオチド配列（配列番号４５）
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＣＧＡＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＧ
フューリン切断部位を有するヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリンのアミノ酸配列（配列番号４１）
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＲＴＫＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＲＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
フューリン切断部位を有するヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリン変異体（Ｈｉｓ－Ｂ１０－Ａｓｐ）のヌクレオチド配列（配列番号４６）
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣＧＣＧＡＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＧ
フューリン切断部位を有するヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）インスリン変異体（Ｈｉｓ－Ｂ１０－Ａｓｐ）のアミノ酸配列（配列番号４２）
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＲＴＫＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＲＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
マウス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）インスリンのヌクレオチド配列（配列番号５）
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＣＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＡＣＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＡＧ
マウス（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）インスリンのアミノ酸配列（配列番号２）
ＭＡＬＷＭＲＦＬＰＬＬＡＬＬＦＬＷＥＳＨＰＴＱＡＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＭＳＲＲＥＶＥＤＰＱＶＡＱＬＥＬＧＧＧＰＧＡＧＤＬＱＴＬＡＬＥＶＡＱＱＫＲＧＩＶＤＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
ラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）インスリンのヌクレオチド配列（配列番号４７）
ａｔｇｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃｃｔｇｃｔｃａｔｃｃｔｃｔｇｇｇａｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｇｃｔｔｔｔｇｔｃａａａｃａｇｃａｃｃｔｔｔｇｔｇｇｔｔｃｔｃａｃｔｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｃｔａｃｃｔｇｇｔｇｔｇｔｇｇｇｇａｇｃｇｔｇｇａｔｔｃｔｔｃｔａｃａｃａｃｃｃａｔｇｔｃｃｃｇｃｃｇｃｇａａｇｔｇｇａｇｇａｃｃｃａｃａａｇｔｇｇｃａｃａａｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｇｇａｇｇｃｃｃｇｇｇｇｇｃａｇｇｔｇａｃｃｔｔｃａｇａｃｃｔｔｇｇｃａｃｔｇｇａｇｇｔｇｇｃｃｃｇｇｃａｇａａｇｃｇｃｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａｔｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｇｃｔｃｔｃｔｃｔａｃｃａａｃｔｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａａｃｔａｇ
ラット（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）インスリンのアミノ酸配列（配列番号４３）
ＭＡＬＷＩＲＦＬＰＬＬＡＬＬＩＬＷＥＰＲＰＡＱＡＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＭＳＲＲＥＶＥＤＰＱＶＡＱＬＥＬＧＧＧＰＧＡＧＤＬＱＴＬＡＬＥＶＡＲＱＫＲＧＩＶＤＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
イヌ（Ｃ．ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）インスリンのヌクレオチド配列（配列番号６）
ａｔｇｇｃｃｃｔｃｔｇｇａｔｇｃｇｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃｃｔｃｔｇｇｇｃｇｃｃｃｇｃｇｃｃｃａｃｃｃｇａｇｃｃｔｔｃｇｔｔａａｃｃａｇｃａｃｃｔｇｔｇｔｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔａｇａｇｇｃｔｃｔｇｔａｃｃｔｇｇｔｇｔｇｃｇｇｇｇａｇｃｇｃｇｇｃｔｔｃｔｔｃｔａｃａｃｇｃｃｔａａｇｇｃｃｃｇｃｃｇｇｇａｇｇｔｇｇａｇｇａｃｃｔｇｃａｇｇｔｇａｇｇｇａｃｇｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｇｇｇｇｃｇｃｃｔｇｇｃｇａｇｇｇｃｇｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇａｇｇｇｇｇｃｃｃｔｇｃａｇａａｇｃｇａｇｇｃａｔｃｇｔｇｇａｇｃａｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｇｃｔｃｃｃｔｃｔａｃｃａｇｃｔｇｇａｇａａｔｔａｃｔｇｃａａｃｔａｇ
イヌ（Ｃ．ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）インスリンのアミノ酸配列（配列番号３）
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＡＰＡＰＴＲＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡＲＲＥＶＥＤＬＱＶＲＤＶＥＬＡＧＡＰＧＥＧＧＬＱＰＬＡＬＥＧＡＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）インスリンのヌクレオチド配列（配列番号４８）
ａｔｇｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｇｃｇｃｃｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｃｃｔｃｔｇｇｇｇａｃｃｔｇａｃｃｃａｇｃｃｔｃｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇａａｃｃａａｃａｃｃｔｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｃａｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｔｃｔｃｔａｃｃｔａｇｔｇｔｇｃｇｇｇｇａａｃｇａｇｇｃｔｔｃｔｔｃｔａｃａｃａｃｃｃａａｇａｃｃｃｇｃｃｇｇｇａｇｇｃａｇａｇｇａｃｃｔｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｃａｇｇｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｃｇｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇｃａｇｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｔｔｇｇｃｃｃｔｇｇａｇｇｇｇｔｃｃｃｔｇｃａｇａａｇｃｇｔｇｇｔａｔｃｇｔｇｇａａｃａａｔｇｃｔｇｔａｃｃａｇｃａｔｃｔｇｃｔｃｃｃｔｃｔａｃｃａｇｃｔｇｇａｇａａｃｔａｃｔｇｃａａｃｔａｇ
チンパンジー（Ｐ．ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）インスリンのアミノ酸配列（配列番号４４）
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＶＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＳＡＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
ＣＡＧプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２２）
ｇａｃａｔｔｇａｔｔａｔｔｇａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｃｇａｇｇｔｇａｇｃｃｃｃａｃｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｃａｔｃｔｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａａｔｔｔｔｇｔａｔｔｔａｔｔｔａｔｔｔｔｔｔａａｔｔａｔｔｔｔｇｔｇｃａｇｃｇａｔｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｃｇｇａｇａｇｇｔｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｃａａｔｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｃｔｃｃｇａａａｇｔｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｔａｔａａａａａｇｃｇａａｇｃｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｇｔｃｇｃｔｇｃｇｔｔｇｃｃｔｔｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｇｃｇｃｃｇｃｃｔｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃｃｇｇｃｔｃｔｇａｃｔｇａｃｃｇｃｇｔｔａｃｔｃｃｃａｃａｇｇｔｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｃｇｇｃｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃｃｇｇｇｃｔｇｔａａｔｔａｇｃｇｃｔｔｇｇｔｔｔａａｔｇａｃｇｇｃｔｔｇｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｇｔｇｇｃｔｇｃｇｔｇａａａｇｃｃｔｔｇａｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｇａｇｇｇｃｃｃｔｔｔｇｔｇｃｇｇｇｇｇｇａｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇｇｔｇｃｇｔｇｃｇｔｇｔｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｇａｇｃｇｃｃｇｃｇｔｇｃｇｇｃｔｃｃｇｃｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃｇｇｃｔｇｔｇａｇｃｇｃｔｇｃｇｇｇｃｇｃｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｔｔｇｔｇｃｇｃｔｃｃｇｃａｇｔｇｔｇｃｇｃｇａｇｇｇｇａｇｃｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｔｇｃｃｃｃｇｃｇｇｔｇｃｇｇｇｇｇｇｃｔｇｃｇａｇｇｇｇａａｃａａａｇｇｃｔｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｇｇｇｇｇｇｔｇａｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｔｇｇｇｃｇｃｇｔｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇｃａａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｃａｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃｇａｇｔｔｇｃｔｇａｇｃａｃｇｇｃｃｃｇｇｃｔｔｃｇｇｇｔｇｃｇｇｇｇｃｔｃｃｇｔａｃｇｇｇｇｃｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｔｃｇｃｃｇｔｇｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｔｇｇｃｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇｇｔｇｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇｇｃｃｇｇｇｇａｇｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｃｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｃｃｇｇａｇｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｔｇｔｃｇａｇｇｃｇｃｇｇｃｇａｇｃｃｇｃａｇｃｃａｔｔｇｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｔａａｔｃｇｔｇｃｇａｇａｇｇｇｃｇｃａｇｇｇａｃｔｔｃｃｔｔｔｇｔｃｃｃａａａｔｃｔｇｔｇｃｇｇａｇｃｃｇａａａｔｃｔｇｇｇａｇｇｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｃｃｃｃｃｔｃｔａｇｃｇｇｇｃｇｃｇｇｇｇｃｇａａｇｃｇｇｔｇｃｇｇｃｇｃｃｇｇｃａｇｇａａｇｇａａａｔｇｇｇｃｇｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｔｃｇｔｇｃｇｔｃｇｃｃｇｃｇｃｃｇｃｃｇｔｃｃｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｃｇｇｇｇｃｔｇｔｃｃｇｃｇｇｇｇｇｇａｃｇｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇｇｇｇｇｇｇａｃｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｇｇｇｇｔｔｃｇｇｃｔｔｃｔｇｇｃｇｔｇｔｇａｃｃｇｇｃｇｇｃｔｃｔａｇａｇｃｃｔｃｔｇｃｔａａｃｃａｔｇｔｔｃａｔｇｃｃｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔｃｃｔａｃａｇ
ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２３）
ｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｃｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｇｃｇａｔｃｇｃｃｃｇｃｃｃｃｇｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔ
ＣＭＶエンハンサーのヌクレオチド配列（配列番号２４）
ｇｇｃａｔｔｇａｔｔａｔｔｇａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔｃｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇ
ＣＭＶプロモーターおよびＣＭＶエンハンサー配列（配列番号３９）
ｇｇｃａｔｔｇａｔｔａｔｔｇａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔｃｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｃｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｇｃｇａｔｃｇｃｃｃｇｃｃｃｃｇｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔ
切断型ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（配列番号３５）
ｇｃｇｃｇｃｔｃ ｇｃｔｃｇｃｔｃａｃ ｔｇａｇｇｃｃｇｃｃ ｃｇｇｇｃａａａｇｃ ｃｃｇｇｇｃｇｔｃｇ ｇｇｃｇａｃｃｔｔｔ ｇｇｔｃｇｃｃｃｇｇ ｃｃｔｃａｇｔｇａｇ ｃｇａｇｃｇａｇｃｇ ｃｇｃａｇａｇａｇｇ ｇａｇｔｇｇｃｃａａ ｃｔｃｃａｔｃａｃｔ ａｇｇｇｇｔｔｃｃｔ
切断型ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ（配列番号３６）
ａｇｇａａｃｃｃｃｔ ａｇｔｇａｔｇｇａｇ ｔｔｇｇｃｃａｃｔｃ ｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇ ｃｇｃｔｃｇｃｔｃｇ ｃｔｃａｃｔｇａｇｇ ｃｃｇｇｇｃｇａｃｃ ａａａｇｇｔｃｇｃｃ ｃｇａｃｇｃｃｃｇｇ ｇｃｔｔｔｇｃｃｃｇ ｇｇｃｇｇｃｃｔｃａ ｇｔｇａｇｃｇａｇｃ ｇａｇｃｇｃｇｃ
ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（３’ＵＴＲおよびポリＡシグナルを含むウサギβグロビンの隣接領域）（配列番号３８）
ｇａｔｃｔｔｔｔｔｃｃｃｔｃｔｇｃｃａａａａａｔｔａｔｇｇｇｇａｃａｔｃａｔｇａａｇｃｃｃｃｔｔｇａｇｃａｔｃｔｇａｃｔｔｃｔｇｇｃｔａａｔａａａｇｇａａａｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔｇｃａａｔａｇｔｇｔｇｔｔｇｇａａｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃａｃｔｃｇｇａａｇｇａｃａｔａｔｇｇｇａｇｇｇｃａａａｔｃａｔｔｔａａａａｃａｔｃａｇａａｔｇａｇｔａｔｔｔｇｇｔｔｔａｇａｇｔｔｔｇｇｃａａｃａｔａｔｇｃｃｃａｔａｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｇａａｃａａａｇｇｔｔｇｇｃｔａｔａａａｇａｇｇｔｃａｔｃａｇｔａｔａｔｇａａａｃａｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃａｔｔｃｃｔｔａｔｔｃｃａｔａｇａａａａｇｃｃｔｔｇａｃｔｔｇａｇｇｔｔａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔａｔａｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｔｔｔｔｃｔｔｔａａｃａｔｃｃｃｔａａａａｔｔｔｔｃｃｔｔａｃａｔｇｔｔｔｔａｃｔａｇｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇａｃｔａｃｔｃｃｃａｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｃｃｃｔｃｔｔｃｔｃｔｔａｔｇｇａｇａｔｃ
ｍｉＲＴ配列
ｍｉＲＴ－１２２ａ（配列番号７）：５’ ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１２２ａ（ｍｉＲＢａｓｅデータベースへのアクセッション番号ＭＩ００００４４２）の標的。
ｍｉＲＴ－１５２（配列番号９）：５’ ＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＣＴＧＡ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１５２（ＭＩ００００４６２）の標的。
ｍｉＲＴ－１９９ａ－５ｐ（配列番号１０）：５’ ＧＡＡＣＡＧＧＴＡＧＴＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＧＧ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ １９９ａ（ＭＩ００００２４２）の標的。
ｍｉＲＴ－１９９ａ－３ｐ（配列番号１１）：５’ ＴＡＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＧＴ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１９９ａ（ＭＩ００００２４２）の標的。
ｍｉＲＴ－２１５（配列番号１２）：５’ ＧＴＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＴ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ－２１５（ＭＩ００００２９１）の標的。
ｍｉＲＴ－１９２（配列番号１３）：５’ ＧＧＣＴＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＡＧＧＴＣＡＧ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１９２（ＭＩ００００２３４）の標的。
ｍｉＲＴ－１４８ａ（配列番号１４）：５’ ＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＧＴＧＣＡＣＴＧＡ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１４８ａ（ＭＩ００００２５３）の標的。
ｍｉＲＴ－１９４（配列番号１５）：５’ ＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＡＣＡ ３’、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１９４（ＭＩ００００４８８）の標的。
ｍｉＲＴ－１３３ａ（配列番号１６）：５’ ＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡ ３’、心臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１３３ａ（ＭＩ００００４５０）の標的。
ｍｉＲＴ－２０６（配列番号１７）：５’ ＣＣＡＣＡＣＡＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ ３’、心臓で発現されるマイクロＲＮＡ－２０６（ＭＩ００００４９０）の標的。
ｍｉＲＴ－１（配列番号８）：５’ ＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ ３’、心臓で発現されるマイクロＲＮＡ－１（ＭＩ００００６５１）の標的。
ｍｉＲＴ－２０８ａ－５ｐ（配列番号１８）：５’ ＧＴＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＣ ３’、心臓で発現されるマイクロＲＮＡ－２０８ａ（ＭＩ００００２５１）の標的。
ｍｉＲＴ－２０８ａ－３ｐ（配列番号１９）：５’ ＡＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴ ３’、心臓で発現されるマイクロＲＮＡ－２０８ａ（ＭＩ００００２５１）の標的。
ｍｉＲＴ－４９９－５ｐ（配列番号２０）：５’ ＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＡＡ ３’、心臓で発現されるマイクロＲＮＡ－４９９（ＭＩ０００３１８３）の標的。
ミニＣＭＶ：ｃｍｖ中間初期プロモーター（配列番号２５）
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ＥＦ１αプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２６）
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ＲＳＶプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２７）
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シナプシン１プロモーター（配列番号２８）
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カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター（配列番号２９）
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グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（配列番号３０）
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ネスチンプロモーター（配列番号３１）
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ホメオボックスタンパク質９プロモーター（ＨＢ９）プロモーター（配列番号３２）
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チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）プロモーター（配列番号３３）
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ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター（配列番号３４）
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ＳＶ４０ポリＡシグナル（配列番号３７）
ｔａａｇａｔａｃａｔ ｔｇａｔｇａｇｔｔｔ ｇｇａｃａａａｃｃａ ｃａａｃｔａｇａａｔ ｇｃａｇｔｇａａａａｔｔｔｇｔｇａａａｔ ｔｔｇｔｇａｔｇｃｔ ａｔｔｇｃｔｔｔａｔ ｔｔｇｔａａｃｃａｔ ｔａｔａａｇｃｔｇｃ ａａｔａａａｃａａｇｔｔ
ヒトβ－グロビンのイントロンおよび免疫グロブリン重鎖遺伝子で構成されるキメライントロン（配列番号２１）
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ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＩｎｓ－ｄｍｉＲＴ（配列番号４０）
１ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡ ＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣ ＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧ
５１ ＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴ ＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧ ＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣ ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧ ＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴ
１０１ ＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣ ＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧ ＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣ ＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧ
１５１ ＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣ ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧ ＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴ
２０１ ＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡ ＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡ ＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧ ＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣ
２５１ ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴ ＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣ ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧ ＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡ ＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡ
３０１ ＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣ ＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧ ＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡ ＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡ ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣ
３５１ ＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴ ＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣ ＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣ ＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧ ＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣ
４０１ ＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡ ＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣ ＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴ ＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴ
４５１ ＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣ ＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡ ＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧ ＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧ ＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡ
５０１ ＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴ ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣ ＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡ ＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣ ＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴ
５５１ ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡ ＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧ ＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧ ＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡ ＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡ
６０１ ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧ ＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡ ＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣ ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴ ＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧ
６５１ ＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧ ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴ ＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡ ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ ＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡ
７０１ ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧ ＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴ ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣ ＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴ ＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡ
７５１ ＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴ ＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧ ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣ ＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡ ＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴ
８０１ ＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣ ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡ ＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧ ＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ ＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧ
８５１ ＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴ ＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧ ＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧ ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ ＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡ
９０１ ＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡ ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ ＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡ ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴ
９５１ ＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴ ＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡ ＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣ ＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴ ＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴ
１００１ ＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣ ＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣ ＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡ ＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣ ＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡ
１０５１ ＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣ ＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴ ＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣ ＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡ
１１０１ ＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧ ＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧ ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣ ＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴ ＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡ
１１５１ ＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡ ＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡ ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧ ＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣ ＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧ
１２０１ ＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡ ＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧ ＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴ ＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴ ＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣ
１２５１ ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴ ＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣ ＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴ ＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧ
１３０１ ＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴ ＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴ ＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧ ＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴ ＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡ
１３５１ ＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣ ＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ ＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧ
１４０１ ＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡ ＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡ ＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡ ＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴ ＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧ
１４５１ ＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴ ＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡ ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧ ＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴ ＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧ
１５０１ ＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧ ＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡ ＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴ ＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴ ＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧ
１５５１ ＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧ ＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴ ＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡ ＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡ ＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡ
１６０１ ＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣ ＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴ ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴ ＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡ ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧ
１６５１ ＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡ ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡ ＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣ ＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣ ＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧ
１７０１ ＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣ ＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴ ＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴ ＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣ
１７５１ ＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡ ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴ ＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴ ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴ
１８０１ ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧ ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧ ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴ ＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡ ＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧ
１８５１ ＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧ ＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴ ＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴ ＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴ
１９０１ ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡ ＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴ ＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡ ＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴ ＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴ
１９５１ ＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡ ＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴ ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧ ＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣ ＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴ
２００１ ＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣ ＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡ ＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴ ＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡ ＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡ
２０５１ ＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧ ＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧ ＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴ
２１０１ ＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡ ＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧ ＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧ ＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ
２１５１ ＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣ ＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣ ＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡ ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡ ＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧ
２２０１ ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧ ＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴ ＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡ ＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧ
２２５１ ＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣ ＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧ ＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧ ＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡ
２３０１ ＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣ ＡＧＧＣＧＡＴＴＣＣ ＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴ ＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡ ＧＧＣＡＡＧＧＣＡＡ
２３５１ ＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡ ＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡ ＡＴＡＡＡＧＣＣＴＣ ＡＧＡＧＣＡＴＡＡＡ ＧＣＴＡＡＡＴＣＧＧ
２４０１ ＴＴＧＴＡＣＣＡＡＡ ＡＡＣＡＴＴＡＴＧＡ ＣＣＣＴＧＴＡＡＴＡ ＣＴＴＴＴＧＣＧＧＧ ＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴ
２４５１ ＡＴＴＴＣＡＡＣＧＣ ＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡ ＡＴＴＴＴＴＡＧＡＡ ＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡ ＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣ
２５０１ ＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧ ＴＡＡＴＧＴＧＴＡＧ ＧＴＡＡＡＧＡＴＴＣ ＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡ ＧＡＡＡＧＧＣＣＧＧ
２５５１ ＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡ ＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡ ＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴ ＣＡＡＣＣＧＴＴＣＴ ＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡ
２６０１ ＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＡＧＣ ＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧ ＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣ ＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣ
２６５１ ＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣ ＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴ ＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡ ＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡ ＴＧＡＡＣＧＧＴＡＡ
２７０１ ＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴ ＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡ ＴＣＡＴＡＴＧＴＡＣ ＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴ ＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡ
２７５１ ＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡ ＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴ ＧＴＡＴＡＡＧＣＡＡ ＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴ ＴＧＴＡＡＧＣＧＴＴ
２８０１ ＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴ ＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣ ＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴ ＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡ ＧＣＴＣＡＴＴＴＴＴ
２８５１ ＴＡＡＣＣＡＡＴＡＧ ＧＣＣＧＡＡＡＴＣＧ ＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣ ＴＴＡＴＡＡＡＴＣＡ ＡＡＡＧＡＡＴＡＧＡ
２９０１ ＣＣＧＡＧＡＴＡＧＧ ＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴ ＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴ ＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧ ＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡ
２９５１ ＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧ ＡＣＴＣＣＡＡＣＧＴ ＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡ ＡＡＡＡＣＣＧＴＣＴ ＡＴＣＡＧＧＧＣＧＡ
３００１ ＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡ ＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴ ＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣ ＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧ ＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴ
３０５１ ＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣ ＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧ ＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧ ＡＴＴＴＡＧＡＧＣＴ
３１０１ ＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡ ＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡ ＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡ ＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡ ＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡ
３１５１ ＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣ ＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴ ＡＧＣＧＧＴＣＡＣＧ ＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡ
３２０１ ＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴ ＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣ ＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣ ＧＴＡＣＴＡＴＧＧＴ
３２５１ ＴＧＣＴＴＴＧＡＣＧ ＡＧＣＡＣＧＴＡＴＡ ＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣ ＣＴＣＧＴＴＡＧＡＡ ＴＣＡＧＡＧＣＧＧＧ
３３０１ ＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧ ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴ ＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴ ＴＡＧＡＣＡＧＧＡＡ ＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡ
３３５１ ＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧ ＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴ ＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧ ＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡ ＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴ
３４０１ ＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡ ＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡ ＣＣＧＴＴＧＴＣＧＣ ＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴ ＴＧＡＴＴＡＧＴＡＡ
３４５１ ＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡ ＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡ ＡＡＣＴＡＴＣＧＧＣ ＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡ
３５０１ ＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡ ＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣ ＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴ ＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴ ＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣ
３５５１ ＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴ ＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴ ＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣ ＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣ
３６０１ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＣ ＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣ ＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧ ＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡ
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３７０１ ＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡ ＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣ ＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡ ＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣ ＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡ
３７５１ ＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣ ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡ ＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴ ＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴ ＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ
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４００１ ＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴ ＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴ ＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣ ＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧ ＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴ
４０５１ ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡ ＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡ ＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣ ＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧ ＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴ
４１０１ ＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧ ＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡ ＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡ ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡ ＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧ
４１５１ ＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴ ＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧ ＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴ ＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣ ＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣ
４２０１ ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴ ＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣ ＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴ ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴ
４２５１ ＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧ ＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧ ＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧ
４３０１ ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧ ＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡ ＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧ ＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡ
４３５１ ＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡ ＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴ ＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴ ＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧ ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧ
４４０１ ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡ ＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣ ＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧ
４４５１ ＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣ ＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣ ＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣ
４５０１ ＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣ ＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴ ＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣ
４５５１ ＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧ ＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴ ＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧ ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴ
４６０１ ＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴ ＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣ ＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣ ＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧ ＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣ
４６５１ ＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧ ＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧ ＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧ ＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧ ＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣ
４７０１ ＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣ ＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ ＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣ ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧ
４７５１ ＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣ ＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧ ＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣ ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣ
４８０１ ＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧ ＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧ ＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣ ＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧ
４８５１ ＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴ ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡ ＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧ ＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣ ＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧ
４９０１ ＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣ ＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣ ＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴ ＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧ ＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣ
４９５１ ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧ ＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧ ＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣ ＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ
５００１ ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧ ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣ ＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣ
５０５１ ＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴ ＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧ ＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣ ＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ
５１０１ ＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡ ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴ ＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡ ＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡ
５１５１ ＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧ ＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧ ＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴ ＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣ ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧ
５２０１ ＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣ ＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣ ＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣ
５２５１ ＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧ ＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧ ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴ ＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧ ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣ
５３０１ ＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧ ＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴ ＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧ ＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣ
５３５１ ＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧ ＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧ ＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣ ＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣ ＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧ
５４０１ ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡ ＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡ ＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡ ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣ ＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣ
５４５１ ＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧ ＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧ ＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣ ＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡ ＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡ
５５０１ ＧＡＡＴＴＧＡＴＴＡ ＡＴＴＣＧＡＧＣＧＡ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＧ ＴＣＧＣＴＣＧＧＴＡ ＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴ
５５５１ ＴＧＡＡＴＴＧＧＣＣ ＴＣＧＡＧＣＧＣＡＡ ＧＣＴＴＧＡＧＣＴＡ ＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧ ＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴ
５６０１ ＧＴＧＧＡＴＧＣＧＣ ＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣ ＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴ ＧＣＴＧＧＣＣＣＴＣ ＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧ
５６５１ ＡＣＣＣＡＧＣＣＧＣ ＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧ ＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣ ＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣ ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧ
５７０１ ＧＡＡＧＣＴＣＴＣＴ ＡＣＣＴＡＧＴＧＴＧ ＣＧＧＧＧＡＡＣＧＡ ＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴ ＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧ
５７５１ ＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧ ＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧ ＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴ ＧＧＧＧＣＡＧＧＴＧ ＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧ
５８０１ ＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧ ＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣ ＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴ ＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡ ＧＧＧＧＴＣＧＣＧＡ
５８５１ ＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧ ＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡ ＡＣＡＡＴＧＣＴＧＴ ＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴ ＧＣＴＣＣＣＴＣＴＡ
５９０１ ＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧ ＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡ ＡＣＴＡＧＡＣＧＣＡ ＧＣＣＧＴＣＧＧＣＣ ＧＣＴＡＡＴＴＣＴＡ
５９５１ ＧＡＴＣＧＣＧＡＡＣ ＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴ ＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣ ＡＧＴＡＴＡＣＡＣＡ ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧ
６００１ ＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ ＧＡＴＡＴＣＡＣＡＡ ＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴ ＣＡＣＡＣＴＣＣＡＡ ＧＧＣＧＡＡＣＡＡＡ
６０５１ ＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣ ＡＣＡＣＴＣＣＡＡＧ ＧＣＴＡＴＴＣＴＡＧ ＡＴＣＧＣＧＡＡＴＴ ＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴ
６１０１ ＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡ ＧＴＡＴＡＣＡＴＴＡ ＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴ ＴＡＣＡＴＴＣＣＡＧ ＡＴＡＴＣＡＴＴＡＣ
６１５１ ＡＴＡＣＴＴＣＴＴＴ ＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧ ＧＣＧＡＡＴＴＡＣＡ ＴＡＣＴＴＣＴＴＴＡ ＣＡＴＴＣＣＡＡＧＧ
６２０１ ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧ ＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡ ＣＣＴＣＴＴＡＡＴＴ ＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣ ＡＴＧＧＧＣＣＴＴＣ
６２５１ ＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣ ＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡ ＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣ ＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣ ＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣ
６３０１ ＡＧＧＣＴＧＣＣＴＡ ＴＣＡＧＡＡＧＧＴＧ ＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧ ＴＧＧＣＣＡＡＴＧＣ ＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣ
６３５１ ＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴ ＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴ ＴＣＣＣＴＣＴＧＣＣ ＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧ ＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴ
６４０１ ＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴ ＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡ ＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡ ＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡ ＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡ
６４５１ ＴＴＧＣＡＡＴＡＧＴ ＧＴＧＴＴＧＧＡＡＴ ＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣ ＴＣＴＣＡＣＴＣＧＧ ＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴ
６５０１ ＧＧＧＡＧＧＧＣＡＡ ＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡ ＡＣＡＴＣＡＧＡＡＴ ＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧ ＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴ
６５５１ ＧＧＣＡＡＣＡＴＡＴ ＧＣＣＣＡＴＡＴＧＣ ＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴ ＧＡＡＣＡＡＡＧＧＴ ＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡ
６６０１ ＧＡＧＧＴＣＡＴＣＡ ＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡ ＣＡＧＣＣＣＣＣＴＧ ＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣ ＣＴＴＡＴＴＣＣＡＴ
６６５１ ＡＧＡＡＡＡＧＣＣＴ ＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧ ＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴ ＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴ ＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴ
６７０１ ＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴ ＴＴＡＡＣＡＴＣＣＣ ＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣ ＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴ ＴＴＡＣＴＡＧＣＣＡ
６７５１ ＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴ ＣＣＴＣＴＣＣＴＧＡ ＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ ＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴ ＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣ
６８０１ ＴＴＡＴＧＧＡＧＡＴ ＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴ ＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧ ＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡ ＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣ
６８５１ ＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡ ＴＴＡＡＣＴＡＣＡＡ ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡ ＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴ ＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣ
６９０１ ＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣ ＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣ ＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣ ＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡ ＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣ
６９５１ ＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧ ＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧ ＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧ ＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧ ＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣ
７００１ ＴＧＧＣＧＴＡＡ
ＡＡＶ２ ５’ ＩＴＲ：３６１２～３７４２ｂｐ
ＣＡＧプロモーター：３７７９～５４２３ｂｐ
ｈインスリン（ｈＩｎｓ）：５５８６～５９３２ｂｐ
ｄｍｉＲＴ（ｍｉＲＴ－１２２ａの４つのコピーおよびｍｉＲＴ－１の４つのコピー）：５９４３～６２０３ｂｐ
ウサギβ－グロビンポリＡシグナル（３’ＵＴＲおよびポリＡシグナルを含むウサギβグロビンの３’隣接領域）：６２９３～６８１１ｂｐ
ＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ：６８７０～７０００ｂｐ
ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＡｓｐ（配列番号４９）
１ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡ ＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣ ＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧ ＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴ
６１ ＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧ ＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣ ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧ ＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴ ＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣ ＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧ
１２１ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧ ＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣ ＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧ ＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣ ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧ
１８１ ＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴ ＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡ ＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡ ＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧ
２４１ ＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣ ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴ ＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣ ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧ ＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡ ＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡ
３０１ ＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣ ＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧ ＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡ ＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡ ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣ ＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴ
３６１ ＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣ ＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣ ＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧ ＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣ ＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡ ＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣ
４２１ ＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴ ＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴ ＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣ ＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡ ＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧ
４８１ ＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧ ＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡ ＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴ ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣ ＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡ ＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣ
５４１ ＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴ ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡ ＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧ ＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧ ＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡ ＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡ
６０１ ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧ ＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡ ＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣ ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴ ＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧ ＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧ
６６１ ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴ ＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡ ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ ＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡ ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧ ＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴ
７２１ ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣ ＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴ ＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡ ＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴ ＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧ ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣ
７８１ ＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡ ＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴ ＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣ ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡ ＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧ ＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ
８４１ ＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴ ＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧ ＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧ ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ ＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡ
９０１ ＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡ ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ ＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡ ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴ ＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴ
９６１ ＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡ ＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣ ＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴ ＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴ ＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣ ＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣ
１０２１ ＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡ ＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣ ＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡ ＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣ ＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴ
１０８１ ＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣ ＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡ ＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧ ＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧ ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣ ＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴ
１１４１ ＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡ ＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡ ＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡ ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧ ＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣ ＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧ
１２０１ ＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡ ＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧ ＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴ ＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴ ＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣ ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴ
１２６１ ＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣ ＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴ ＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧ ＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴ ＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴ
１３２１ ＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧ ＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴ ＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡ ＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣ ＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ
１３８１ ＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧ ＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡ ＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡ ＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡ ＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴ
１４４１ ＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧ ＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴ ＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡ ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧ ＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴ ＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧ
１５０１ ＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧ ＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡ ＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴ ＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴ ＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧ ＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧ
１５６１ ＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴ ＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡ ＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡ ＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡ ＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣ ＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴ
１６２１ ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴ ＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡ ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧ ＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡ ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡ ＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣ
１６８１ ＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣ ＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧ ＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣ ＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴ ＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴ
１７４１ ＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣ ＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡ ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴ ＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴ ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴ
１８０１ ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧ ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧ ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴ ＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡ ＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧ ＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧ
１８６１ ＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴ ＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴ ＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴ ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡ ＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴ
１９２１ ＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡ ＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴ ＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴ ＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡ ＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴ ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧ
１９８１ ＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣ ＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴ ＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣ ＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡ ＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴ ＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡ
２０４１ ＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡ ＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧ ＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧ ＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴ
２１０１ ＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡ ＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧ ＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧ ＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ ＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣ
２１６１ ＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣ ＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡ ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡ ＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧ ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧ ＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴ
２２２１ ＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡ ＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧ ＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣ ＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧ ＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧ
２２８１ ＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡ ＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣ ＡＧＧＣＧＡＴＴＣＣ ＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴ ＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡ
２３４１ ＧＧＣＡＡＧＧＣＡＡ ＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡ ＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡ ＡＴＡＡＡＧＣＣＴＣ ＡＧＡＧＣＡＴＡＡＡ ＧＣＴＡＡＡＴＣＧＧ
２４０１ ＴＴＧＴＡＣＣＡＡＡ ＡＡＣＡＴＴＡＴＧＡ ＣＣＣＴＧＴＡＡＴＡ ＣＴＴＴＴＧＣＧＧＧ ＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴ ＡＴＴＴＣＡＡＣＧＣ
２４６１ ＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡ ＡＴＴＴＴＴＡＧＡＡ ＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡ ＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣ ＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧ ＴＡＡＴＧＴＧＴＡＧ
２５２１ ＧＴＡＡＡＧＡＴＴＣ ＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡ ＧＡＡＡＧＧＣＣＧＧ ＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡ ＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡ ＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴ
２５８１ ＣＡＡＣＣＧＴＴＣＴ ＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡ ＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＡＧＣ ＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧ ＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣ
２６４１ ＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣ ＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣ ＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴ ＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡ ＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡ ＴＧＡＡＣＧＧＴＡＡ
２７０１ ＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴ ＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡ ＴＣＡＴＡＴＧＴＡＣ ＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴ ＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡ ＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡ
２７６１ ＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴ ＧＴＡＴＡＡＧＣＡＡ ＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴ ＴＧＴＡＡＧＣＧＴＴ ＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴ ＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣ
２８２１ ＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴ ＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡ ＧＣＴＣＡＴＴＴＴＴ ＴＡＡＣＣＡＡＴＡＧ ＧＣＣＧＡＡＡＴＣＧ ＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣ
２８８１ ＴＴＡＴＡＡＡＴＣＡ ＡＡＡＧＡＡＴＡＧＡ ＣＣＧＡＧＡＴＡＧＧ ＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴ ＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴ ＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧ
２９４１ ＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡ ＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧ ＡＣＴＣＣＡＡＣＧＴ ＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡ ＡＡＡＡＣＣＧＴＣＴ ＡＴＣＡＧＧＧＣＧＡ
３００１ ＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡ ＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴ ＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣ ＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧ ＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴ ＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣ
３０６１ ＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧ ＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧ ＡＴＴＴＡＧＡＧＣＴ ＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡ ＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡ
３１２１ ＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡ ＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡ ＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡ ＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣ ＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴ
３１８１ ＡＧＣＧＧＴＣＡＣＧ ＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡ ＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴ ＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣ ＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣ
３２４１ ＧＴＡＣＴＡＴＧＧＴ ＴＧＣＴＴＴＧＡＣＧ ＡＧＣＡＣＧＴＡＴＡ ＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣ ＣＴＣＧＴＴＡＧＡＡ ＴＣＡＧＡＧＣＧＧＧ
３３０１ ＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧ ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴ ＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴ ＴＡＧＡＣＡＧＧＡＡ ＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡ ＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧ
３３６１ ＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴ ＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧ ＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡ ＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴ ＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡ ＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡ
３４２１ ＣＣＧＴＴＧＴＣＧＣ ＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴ ＴＧＡＴＴＡＧＴＡＡ ＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡ ＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡ
３４８１ ＡＡＣＴＡＴＣＧＧＣ ＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡ ＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡ ＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣ ＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴ ＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴ
３５４１ ＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣ ＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴ ＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴ ＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣ ＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣ
３６０１ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＣ ＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣ ＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧ ＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡ ＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴ
３６６１ ＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴ ＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣ ＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧ ＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡ ＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣ
３７２１ ＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡ ＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣ ＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡ ＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣ ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡ ＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴ
３７８１ ＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴ ＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ ＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧ ＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡ ＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴ ＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣ
３８４１ ＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧ ＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴ ＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴ ＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧ ＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧ ＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣ
３９０１ ＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣ ＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣ ＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧ ＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣ ＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣ ＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧ
３９６１ ＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴ ＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧ ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴ ＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡ ＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴ ＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴ
４０２１ ＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣ ＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧ ＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴ ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡ ＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡ ＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣ
４０８１ ＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧ ＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴ ＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧ ＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡ ＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡ ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡ
４１４１ ＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧ ＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴ ＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧ ＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴ ＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣ ＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣ
４２０１ ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴ ＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣ ＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴ ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴ ＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧ
４２６１ ＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧ ＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧ
４３２１ ＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡ ＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧ ＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡ ＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡ ＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴ ＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴ
４３８１ ＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧ ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡ ＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣ ＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
４４４１ ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧ ＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣ ＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣ ＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣ
４５０１ ＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣ ＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴ ＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣ ＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧ
４５６１ ＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴ ＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧ ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴ ＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴ ＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣ
４６２１ ＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣ ＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧ ＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣ ＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧ ＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧ ＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧ
４６８１ ＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧ ＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣ ＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣ ＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ ＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣ
４７４１ ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧ ＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣ ＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧ ＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣ ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣ
４８０１ ＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧ ＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧ ＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣ ＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧ ＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴ
４８６１ ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡ ＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧ ＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣ ＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧ ＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣ ＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣ
４９２１ ＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴ ＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧ ＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣ ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧ ＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧ ＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣ
４９８１ ＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧ ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣ
５０４１ ＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣ ＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴ ＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧ ＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣ ＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ
５１０１ ＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡ ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴ ＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡ ＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡ ＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧ
５１６１ ＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧ ＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴ ＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣ ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧ ＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣ
５２２１ ＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣ ＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣ ＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧ ＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧ ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴ
５２８１ ＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧ ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧ ＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴ ＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧ
５３４１ ＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣ ＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧ ＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧ ＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣ ＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣ ＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧ
５４０１ ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡ ＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡ ＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡ ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣ ＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣ ＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧ
５４６１ ＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧ ＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣ ＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡ ＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡ ＧＡＡＴＴＧＡＴＴＡ ＡＴＴＣＧＡＧＣＧＡ
５５２１ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＧ ＴＣＧＣＴＣＧＧＴＡ ＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴ ＴＧＡＡＴＴＧＧＣＣ ＴＣＧＡＧＣＧＣＡＡ ＧＣＴＴＧＡＧＣＴＡ
５５８１ ＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴ ＴＣＴＧＣＣＡＴＧＧ ＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴ ＧＣＧＣＣＴＣＣＴＧ ＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧ ＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣ
５６４１ ＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡ ＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧ ＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴ ＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡ ＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧ ＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴ
５７０１ ＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴ ＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧ ＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡ ＡＣＧＡＧＧＣＴＴＣ ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣ ＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡ
５７６１ ＧＣＧＧＧＡＧＧＣＡ ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣ ＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡ ＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧ ＧＧＣＧＧＧＧＧＣＣ ＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧ
５８２１ ＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧ ＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣ ＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣ ＧＣＧＡＣＡＧＡＡＧ ＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧ ＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧ
５８８１ ＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣ ＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣ ＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴ ＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣ ＴＧＣＡＡＣＴＡＧＡ ＣＧＣＡＧＣＣＧＴＣ
５９４１ ＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣ ＣＴＡＡＣＴＧＧＣＣ ＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴ ＴＣＣＧＣＴＣＡＣＴ ＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣ
６００１ ＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡ ＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧ ＣＣＡＧＴＣＡＧＧＴ ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣ ＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧ ＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧ
６０６１ ＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡ ＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴ ＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧ ＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡ
６１２１ ＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣ ＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣ ＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴ ＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣ ＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡ ＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴ
６１８１ ＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡ ＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡ ＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧ ＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣ ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴ ＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣ
６２４１ ＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡ ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴ ＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴ ＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴ ＡＴＧＣＣＣＡＴＡＴ
６３０１ ＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣ ＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧ ＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡ ＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴ ＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡ ＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣ
６３６１ ＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴ ＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣ ＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣ ＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡ ＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴ ＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴ
６４２１ ＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧ ＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴ ＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣ ＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴ ＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧ ＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣ
６４８１ ＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣ ＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴ ＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣ ＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴ ＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣ ＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧ
６５４１ ＡＴＣＣＣＴＣＧＡＣ ＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡ ＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴ ＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧ ＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴ ＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣ
６６０１ ＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣ ＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡ ＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣ ＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣ ＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧ
６６６１ ＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣ ＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣ ＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧ ＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣ ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ
６７２１ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ ＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡ
ＡＡＶ２ ５’ ＩＴＲ：３６０１～３７４２ｂｐ
ＣＡＧプロモーター：３７７９～５４２３ｂｐ
ｈインスリンアスパラギン酸（ｈＩｎｓＡｓｐ）：５５９０～５９３６ｂｐ
ウサギβ－グロビンポリＡシグナル（３’ＵＴＲおよびポリＡシグナルを含むウサギβグロビンの３’隣接領域）：６０２５～６５４３ｂｐ
ＡＡＶ２ ３’ ＩＴＲ：６６０２～６７４３ｂｐ
ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＩｎｓＷｔ（配列番号５０）
１ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ ＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡ ＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣ ＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧ ＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴ
６１ ＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧ ＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣ ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧ ＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴ ＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣ ＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧ
１２１ ＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧ ＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣ ＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧ ＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣ ＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧ
１８１ ＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧ ＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴ ＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡ ＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡ ＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡ ＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧ
２４１ ＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣ ＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴ ＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣ ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧ ＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡ ＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡ
３０１ ＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣ ＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧ ＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡ ＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡ ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣ ＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴ
３６１ ＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣ ＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣ ＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧ ＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣ ＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡ ＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣ
４２１ ＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴ ＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴ ＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴ ＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣ ＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡ ＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧ
４８１ ＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧ ＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡ ＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴ ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣ ＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡ ＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣ
５４１ ＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴ ＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡ ＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧ ＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧ ＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡ ＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡ
６０１ ＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧ ＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡ ＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣ ＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴ ＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧ ＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧ
６６１ ＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴ ＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡ ＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣ ＡＣＴＡＧＡＡＧＡＡ ＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧ ＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴ
７２１ ＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣ ＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴ ＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡ ＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴ ＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧ ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣ
７８１ ＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡ ＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴ ＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣ ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡ ＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧ ＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ
８４１ ＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴ ＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧ ＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧ ＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡ ＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡ
９０１ ＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡ ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ ＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡ ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴ ＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴ
９６１ ＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡ ＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣ ＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴ ＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴ ＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣ ＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣ
１０２１ ＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡ ＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣ ＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡ ＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣ ＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣ ＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴ
１０８１ ＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣ ＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡ ＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧ ＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧ ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣ ＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴ
１１４１ ＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡ ＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡ ＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡ ＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧ ＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣ ＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧ
１２０１ ＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡ ＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧ ＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴ ＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴ ＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣ ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴ
１２６１ ＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴ ＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣ ＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴ ＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧ ＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴ ＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴ
１３２１ ＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧ ＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴ ＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡ ＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴ ＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣ ＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣ
１３８１ ＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣ ＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧ ＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡ ＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡ ＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡ ＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴ
１４４１ ＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧ ＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴ ＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡ ＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧ ＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴ ＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧ
１５０１ ＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧ ＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡ ＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴ ＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴ ＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧ ＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧ
１５６１ ＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴ ＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡ ＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡ ＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡ ＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣ ＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴ
１６２１ ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴ ＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡ ＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧ ＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡ ＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡ ＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣ
１６８１ ＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣ ＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧ ＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣ ＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴ ＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴ ＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴ
１７４１ ＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣ ＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣ ＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡ ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴ ＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴ ＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴ
１８０１ ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧ ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧ ＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴ ＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡ ＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧ ＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧ
１８６１ ＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡ ＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴ ＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴ ＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴ ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡ ＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴ
１９２１ ＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡ ＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴ ＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴ ＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡ ＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴ ＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧ
１９８１ ＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣ ＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴ ＧＣＣＡＣＣＴＧＡＣ ＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡ ＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴ ＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡ
２０４１ ＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡ ＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴ ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ ＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧ ＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧ ＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴ
２１０１ ＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴ ＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡ ＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧ ＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧ ＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡ ＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣ
２１６１ ＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣ ＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡ ＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡ ＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧ ＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧ ＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴ
２２２１ ＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ ＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡ ＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧ ＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣ ＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧ ＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧ
２２８１ ＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡ ＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣ ＡＧＧＣＧＡＴＴＣＣ ＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴ ＡＡＡＴＣＡＴＡＣＡ
２３４１ ＧＧＣＡＡＧＧＣＡＡ ＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡ ＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡ ＡＴＡＡＡＧＣＣＴＣ ＡＧＡＧＣＡＴＡＡＡ ＧＣＴＡＡＡＴＣＧＧ
２４０１ ＴＴＧＴＡＣＣＡＡＡ ＡＡＣＡＴＴＡＴＧＡ ＣＣＣＴＧＴＡＡＴＡ ＣＴＴＴＴＧＣＧＧＧ ＡＧＡＡＧＣＣＴＴＴ ＡＴＴＴＣＡＡＣＧＣ
２４６１ ＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡ ＡＴＴＴＴＴＡＧＡＡ ＣＣＣＴＣＡＴＡＴＡ ＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣ ＡＡＴＧＣＣＴＧＡＧ ＴＡＡＴＧＴＧＴＡＧ
２５２１ ＧＴＡＡＡＧＡＴＴＣ ＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡ ＧＡＡＡＧＧＣＣＧＧ ＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡ ＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡ ＡＴＡＴＧＡＴＡＴＴ
２５８１ ＣＡＡＣＣＧＴＴＣＴ ＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡ ＴＴＣＡＴＧＣＣＧＧ ＡＧＡＧＧＧＴＡＧＣ ＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧ ＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣ
２６４１ ＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣ ＡＧＧＴＣＡＴＴＧＣ ＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴ ＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡ ＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡ ＴＧＡＡＣＧＧＴＡＡ
２７０１ ＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴ ＡＧＣＡＴＧＴＣＡＡ ＴＣＡＴＡＴＧＴＡＣ ＣＣＣＧＧＴＴＧＡＴ ＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡ ＧＣＣＣＣＡＡＡＡＡ
２７６１ ＣＡＧＧＡＡＧＡＴＴ ＧＴＡＴＡＡＧＣＡＡ ＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴ ＴＧＴＡＡＧＣＧＴＴ ＡＡＴＡＴＴＴＴＧＴ ＴＡＡＡＡＴＴＣＧＣ
２８２１ ＧＴＴＡＡＡＴＴＴＴ ＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡ ＧＣＴＣＡＴＴＴＴＴ ＴＡＡＣＣＡＡＴＡＧ ＧＣＣＧＡＡＡＴＣＧ ＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣ
２８８１ ＴＴＡＴＡＡＡＴＣＡ ＡＡＡＧＡＡＴＡＧＡ ＣＣＧＡＧＡＴＡＧＧ ＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴ ＧＴＴＣＣＡＧＴＴＴ ＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧ
２９４１ ＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡ ＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧ ＡＣＴＣＣＡＡＣＧＴ ＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡ ＡＡＡＡＣＣＧＴＣＴ ＡＴＣＡＧＧＧＣＧＡ
３００１ ＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡ ＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴ ＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣ ＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧ ＧＧＧＴＣＧＡＧＧＴ ＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣ
３０６１ ＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧ ＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＧ ＡＴＴＴＡＧＡＧＣＴ ＴＧＡＣＧＧＧＧＡＡ ＡＧＣＣＧＧＣＧＡＡ
３１２１ ＣＧＴＧＧＣＧＡＧＡ ＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡ ＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡ ＡＧＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣ ＴＧＧＣＡＡＧＴＧＴ
３１８１ ＡＧＣＧＧＴＣＡＣＧ ＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡ ＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＴ ＡＡＴＧＣＧＣＣＧＣ ＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣ
３２４１ ＧＴＡＣＴＡＴＧＧＴ ＴＧＣＴＴＴＧＡＣＧ ＡＧＣＡＣＧＴＡＴＡ ＡＣＧＴＧＣＴＴＴＣ ＣＴＣＧＴＴＡＧＡＡ ＴＣＡＧＡＧＣＧＧＧ
３３０１ ＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧ ＧＡＧＧＣＣＧＡＴＴ ＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴ ＴＡＧＡＣＡＧＧＡＡ ＣＧＧＴＡＣＧＣＣＡ ＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧ
３３６１ ＡＡＧＴＧＴＴＴＴＴ ＡＴＡＡＴＣＡＧＴＧ ＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡ ＧＴＡＡＡＡＧＡＧＴ ＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡ ＣＧＣＡＡＡＴＴＡＡ
３４２１ ＣＣＧＴＴＧＴＣＧＣ ＡＡＴＡＣＴＴＣＴＴ ＴＧＡＴＴＡＧＴＡＡ ＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴ ＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡ ＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡ
３４８１ ＡＡＣＴＡＴＣＧＧＣ ＣＴＴＧＣＴＧＧＴＡ ＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡ ＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣ ＧＣＣＡＧＣＣＡＴＴ ＧＣＡＡＣＧＧＡＡＴ
３５４１ ＣＧＣＣＡＴＴＣＧＣ ＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴ ＧＣＧＣＡＡＣＴＧＴ ＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣ ＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ ＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣ
３６０１ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＣ ＡＧＣＴＧＣＧＣＧＣ ＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ ＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧ ＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡ ＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴ
３６６１ ＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴ ＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣ ＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧ ＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧ ＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡ ＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣ
３７２１ ＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡ ＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣ ＣＴＴＧＴＡＧＴＴＡ ＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣ ＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡ ＣＴＴＡＴＣＴＡＣＴ
３７８１ ＣＧＡＣＡＴＴＧＡＴ ＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ ＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧ ＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡ ＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴ ＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣ
３８４１ ＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧ ＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴ ＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴ ＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧ ＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧ ＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣ
３９０１ ＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣ ＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣ ＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧ ＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣ ＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣ ＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧ
３９６１ ＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴ ＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧ ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴ ＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡ ＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴ ＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴ
４０２１ ＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣ ＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧ ＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴ ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡ ＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡ ＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣ
４０８１ ＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧ ＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴ ＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧ ＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡ ＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡ ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡ
４１４１ ＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧ ＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴ ＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧ ＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴ ＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣ ＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣ
４２０１ ＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴ ＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣ ＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴ ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴ ＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴ ＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧ
４２６１ ＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ ＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧ ＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧ ＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧ
４３２１ ＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡ ＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧ ＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡ ＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡ ＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴ ＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴ
４３８１ ＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧ ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡ ＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣ ＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
４４４１ ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧ ＣＧＴＴＧＣＣＴＴＣ ＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣ ＣＣＧＣＴＣＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧ ＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣ
４５０１ ＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣ ＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴ ＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧ ＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣ ＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣ ＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧ
４５６１ ＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴ ＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴ ＴＴＡＡＴＧＡＣＧＧ ＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴ ＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴ ＧＣＧＴＧＡＡＡＧＣ
４６２１ ＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣ ＴＣＣＧＧＧＡＧＧＧ ＣＣＣＴＴＴＧＴＧＣ ＧＧＧＧＧＧＡＧＣＧ ＧＣＴＣＧＧＧＧＧＧ ＴＧＣＧＴＧＣＧＴＧ
４６８１ ＴＧＴＧＴＧＴＧＣＧ ＴＧＧＧＧＡＧＣＧＣ ＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣ ＴＣＣＧＣＧＣＴＧＣ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ ＴＧＡＧＣＧＣＴＧＣ
４７４１ ＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧ ＣＧＧＧＧＣＴＴＴＧ ＴＧＣＧＣＴＣＣＧＣ ＡＧＴＧＴＧＣＧＣＧ ＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣ ＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣ
４８０１ ＧＧＴＧＣＣＣＣＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＧＧＧ ＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧ ＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣ ＴＧＣＧＴＧＣＧＧＧ ＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴ
４８６１ ＧＧＧＧＧＧＧＴＧＡ ＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧ ＴＧＧＧＣＧＣＧＴＣ ＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧ ＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣ ＴＧＣＡＣＣＣＣＣＣ
４９２１ ＴＣＣＣＣＧＡＧＴＴ ＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧ ＧＣＣＣＧＧＣＴＴＣ ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＧ ＣＴＣＣＧＴＡＣＧＧ ＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣ
４９８１ ＧＧＧＧＣＴＣＧＣＣ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧ ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧ ＧＴＧＣＣＧＧＧＣＧ ＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣ
５０４１ ＧＣＣＴＣＧＧＧＣＣ ＧＧＧＧＡＧＧＧＣＴ ＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧ ＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣ ＣＣＣＣＧＧＡＧＣＧ ＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧ
５１０１ ＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧ ＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡ ＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴ ＴＴＴＡＴＧＧＴＡＡ ＴＣＧＴＧＣＧＡＧＡ ＧＧＧＣＧＣＡＧＧＧ
５１６１ ＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧ ＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴ ＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣ ＧＡＡＡＴＣＴＧＧＧ ＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＣＡＣＣＣＣＣＴＣ
５２２１ ＴＡＧＣＧＧＧＣＧＣ ＧＧＧＧＣＧＡＡＧＣ ＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣ ＣＧＧＣＡＧＧＡＡＧ ＧＡＡＡＴＧＧＧＣＧ ＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴ
５２８１ ＴＣＧＴＧＣＧＴＣＧ ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧ ＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴ ＧＴＣＣＧＣＧＧＧＧ
５３４１ ＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣ ＣＴＴＣＧＧＧＧＧＧ ＧＡＣＧＧＧＧＣＡＧ ＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣ ＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣ ＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧ
５４０１ ＣＧＧＣＴＣＴＡＧＡ ＧＣＣＴＣＴＧＣＴＡ ＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡ ＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣ ＴＴＴＴＴＣＣＴＡＣ ＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧ
５４６１ ＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧ ＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣ ＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡ ＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡ ＧＡＡＴＴＧＡＴＴＡ ＡＴＴＣＧＡＧＣＧＡ
５５２１ ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＧ ＴＣＧＣＴＣＧＧＴＡ ＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴ ＴＧＡＡＴＴＧＧＣＣ ＴＣＧＡＧＣＧＣＡＡ ＧＣＴＴＧＡＧＣＴＡ
５５８１ ＧＣＧＴＣＧＡＧＧＧ ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧ ＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴ ＧＣＧＣＣＴＣＣＴＧ ＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧ ＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣ
５６４１ ＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡ ＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧ ＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴ ＴＧＴＧＡＡＣＣＡＡ ＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧ ＧＣＴＣＡＣＡＣＣＴ
５７０１ ＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴ ＣＴＣＴＡＣＣＴＡＧ ＴＧＴＧＣＧＧＧＧＡ ＡＣＧＡＧＧＣＴＴＣ ＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣ ＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡ
５７６１ ＧＣＧＧＧＡＧＧＣＡ ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣ ＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡ ＧＧＴＧＧＡＧＣＴＧ ＧＧＣＧＧＧＧＧＣＣ ＣＴＧＧＴＧＣＡＧＧ
５８２１ ＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧ ＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣ ＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣ ＧＣＧＡＣＡＧＡＡＧ ＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧ ＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧ
５８８１ ＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣ ＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣ ＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴ ＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣ ＴＧＣＡＡＣＴＡＧＧ ＴＣＧＡＣＣＣＣＴＣ
５９４１ ＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣ ＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣ ＣＴＡＡＣＴＧＧＣＣ ＴＣＡＴＧＧＧＣＣＴ ＴＣＣＧＣＴＣＡＣＴ ＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣ
６００１ ＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡ ＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧ ＣＣＡＧＴＣＡＧＧＴ ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣ ＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧ ＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧ
６０６１ ＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣ ＡＣＡＡＡＴＡＣＣＡ ＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴ ＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧ ＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡ
６１２１ ＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣ ＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣ ＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴ ＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣ ＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡ ＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴ
６１８１ ＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡ ＧＴＧＴＧＴＴＧＧＡ ＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧ ＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣ ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴ ＡＴＧＧＧＡＧＧＧＣ
６２４１ ＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡ ＡＡＡＣＡＴＣＡＧＡ ＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴ ＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴ ＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴ ＡＴＧＣＣＣＡＴＡＴ
６３０１ ＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣ ＡＴＧＡＡＣＡＡＡＧ ＧＴＴＧＧＣＴＡＴＡ ＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴ ＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡ ＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣ
６３６１ ＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴ ＴＣＣＴＴＡＴＴＣＣ ＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣ ＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡ ＧＧＴＴＡＧＡＴＴＴ ＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴ
６４２１ ＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧ ＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴ ＣＴＴＴＡＡＣＡＴＣ ＣＣＴＡＡＡＡＴＴＴ ＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧ ＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣ
６４８１ ＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣ ＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴ ＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣ ＡＧＴＣＡＴＡＧＣＴ ＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣ ＴＣＴＴＡＴＧＧＡＧ
６５４１ ＡＴＣＣＣＴＣＧＡＣ ＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡ ＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴ ＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧ ＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴ ＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣ
６６０１ ＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣ ＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡ ＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴ ＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣ ＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣ ＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧ
６６６１ ＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣ ＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣ ＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧ ＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣ ＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣ ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧ
６７２１ ＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡ ＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡ
ＡＡＶ２ ５’ ＩＴＲ：３６０１～３７４２ｂｐ
ＣＡＧプロモーター：３７７９～５４２３ｂｐ
ｈインスリン野生型（ｈＩｎｓＷｔ）：５５９７～５９２９ｂｐ
ウサギβ－グロビンポリＡシグナル（３’ＵＴＲおよびポリＡシグナルを含むウサギβグロビンの３’隣接領域）：６０２５～６５４３ｂｐ
ＡＡＶ２ ３’ ＩＴＲ：６６０２～６７４３ｂｐ

Claims (15)

  1. 神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物。
  2. 前記インスリンをコードするヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の使用のための遺伝子構築物。
  3. 前記ユビキタスプロモーターが、ＣＡＧプロモーターおよびＣＭＶプロモーターからなる群から選択され、好ましくは、前記ユビキタスプロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項１または２に記載の使用のための遺伝子構築物。
  4. 前記遺伝子構築物が、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくは、前記マイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列が、哺乳動物の心臓および／または肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  5. 前記遺伝子構築物が、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列および心臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくは、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号８および１６～２０から選択され、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号７および９～１５から選択され、より好ましくは、前記遺伝子構築物が、マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列（配列番号７）およびマイクロＲＮＡ－１の標的配列（配列番号８）を含む、請求項４に記載の使用のための遺伝子構築物。
  6. 前記インスリンをコードするヌクレオチド配列が、
    （ａ）配列番号１、２または３のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号４、５または６のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；および
    （ｃ）遺伝暗号の縮重により、その配列が（ｂ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列
    からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
  7. 神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、請求項１から６のいずれか一項に定義される遺伝子構築物を含む発現ベクター。
  8. ウイルスベクターであり、好ましくは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターであり、より好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項７に記載の使用のための発現ベクター。
  9. 血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、ｒｈ１０、ｒｈ８、Ｃｂ４、ｒｈ７４、ＤＪ、２／５、２／１、１／２またはＡｎｃ８０のアデノ随伴ウイルスベクターであり、好ましくは血清型１、２または９のアデノ随伴ウイルスベクターであり、より好ましくは血清型１または９のアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項８に記載の使用のための発現ベクター。
  10. 神経炎症、神経変性および／もしくは認知機能低下、またはそれに関連する疾患もしくは状態の処置および／または予防に使用するための、請求項１から６のいずれか一項に定義される遺伝子構築物および／または請求項７から９のいずれか一項に定義される発現ベクターを１種または複数の薬学的に許容される成分と共に含む医薬組成物。
  11. 前記神経炎症、神経変性および／または認知障害に関連する疾患または状態が、認知障害、認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、パーキンソン様疾患、パーキンソン症候群、ハンチントン病、外傷性脳損傷、プリオン病、ＨＩＶ感染による認知症／神経認知の問題、加齢による認知症／神経認知の問題、タウオパチー、多発性硬化症およびその他の神経炎症性／神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病および／またはパーキンソン様疾患、より好ましくは、アルツハイマー病またはパーキンソン病からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物および／または請求項７から９のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクターおよび／または請求項１０に記載の使用のための医薬組成物。
  12. 遺伝子構築物および／または発現ベクターおよび／または医薬組成物がＣＳＦ内投与によって投与される、請求項１から７および１１のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物および／または請求項７から９および１１のいずれか一項に記載の使用のための発現ベクターおよび／または請求項１０または１１に記載の使用のための医薬組成物。
  13. インスリンをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物であって、前記インスリンをコードするヌクレオチド配列が、ユビキタスプロモーターに作動可能に連結されており、遺伝子構築物が、インスリンの発現を防止したい組織で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくは前記マイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列が、哺乳動物の心臓および／または肝臓で発現されるマイクロＲＮＡに結合する標的配列から選択される、遺伝子構築物。
  14. 遺伝子構築物が、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列および心臓で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも１つの標的配列を含み、好ましくは、心臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号８および１６～２０から選択され、肝臓で発現されるマイクロＲＮＡの標的配列が配列番号７および９～１５から選択され、より好ましくは、遺伝子構築物が、マイクロＲＮＡ－１２２ａの標的配列（配列番号７）およびマイクロＲＮＡ－１の標的配列（配列番号８）を含む、請求項１３に記載の遺伝子構築物。
  15. 好ましくは、発現ベクターがウイルスベクターであり、より好ましくは、発現ベクターがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターであり、最も好ましくは、発現ベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１３または１４に定義される遺伝子構築物を含む発現ベクター。
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