DE602004010799T2

DE602004010799T2 - Synthetische bidirektionale promotoren und deren verwendungen

Info

Publication number: DE602004010799T2
Application number: DE602004010799T
Authority: DE
Inventors: Luigi Naldini; Mario Amendola; Elisa Vigna
Original assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
Current assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
Priority date: 2003-04-24
Filing date: 2004-04-21
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2024-04-22
Also published as: ES2298745T3; US8501464B2; DE602004010799D1; WO2004094642A3; US20060200869A1; EP1616012B1; AU2004233315A1; DK1616012T3; WO2004094642A2; JP2006524051A; CA2523138A1; EP1616012A2; CA2523138C; ATE381620T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bidirektionale Promotoren, die eine effiziente und koordinierte Expression von mindestens zwei Genen ermöglichen, Gentransfervektoren, die diese Promotoren enthalten, Partikel, welche die Vektoren in eine Zelle transduzieren, die Verwendung der Vektoren für die Einführung und Expression mehrerer Gene in Zielzellen, auch für die Gentherapie und für die Herstellung von Medikamenten.
STAND DER TECHNIK
Für mehrere Gentransfer- und -therapieanwendungen ist die Expression mehrerer Transgene in denselben Zielzellen erforderlich¹. Genfunktionsstudien werden am besten durchgeführt, indem cDNAs gemeinsam mit einem Markergen exprimiert werden; mit diesem Ansatz lassen sich genetisch modifizierte Zellen identifizieren und in vitro und in vivo nachverfolgen. Entsprechend lassen sich Gentherapieanwendungen durch Reinigung von genkorrigierten Zellen vor der In-vivo-Verabreichung verbessern, wobei man sich die koordinierte Expression selektierbarer Marker zunutze macht. Genetisch modifizierte Zellen können ex vivo oder in vivo amplifiziert werden, indem zusammen mit dem therapeutischen Gen Wachstumsförderungs- bzw. Wirkstoffresistenzgene eingeführt werden, wie kürzlich durch MGMT-vermittelte Selektion transduzierter hämatopoietischer Stammzellen (HSC) gezeigt worden ist²; mit diesem Ansatz lässt sich die Wirksamkeit der Gentherapie steigern und ihre Anwendung potenziell auf ein breites Spektrum von Krankheiten ausdehnen^3,4. Umgekehrt können genetisch modifizierte Zellen, die konditionell zytotoxische Gene zusammen mit dem therapeutischen Gen exprimieren, in vivo eliminiert werden, wenn unerwünschte Ereignisse stattfinden; dieser Ansatz wird zur Kontrolle der Graft-versus-Rost-Krankheit nach Infusion von Spender-T-Lympbhozyten zur Behandlung von Leukämie-Rezidiven verwendet⁵; in Anbetracht des kürzlichen Auftretens von Leukämie in Verbindung mit Vektorintegration in einer erfolgreichen klinischen Studie der Immunschwächekrankheit X-SCID (X-linked Severe Combined Immunodeficiency) könnte er auch eine wichtige Sicherheitsvorkehrung beim HSZ-Gentransfer darstellen⁶. Die koordinierte Expression von mehr als einem Transgen ist essenziell, wenn die durch Gentransfer wiederherzustellende Aktivität von mehreren Untereinheiten abhängt, die von verschiedenen Genen kodiert werden, oder die Synergie separater Moleküle verlangt. Beispielsweise erfordert die Rekonstitution des biosynthetischen Dopaminsignalwegs in striatalen Neuronen bei Patienten mit Morbus Parkinson die Koexpression von Tyrosinhydroxylase mit der GTP-Cyclohydrolase I und/oder DOPA-Decarboxylase⁷; eine Gentherapie gegen Krebs kann die Coexpression mehrerer Antigene und/oder Zytokine in antigenpräsentierenen Zellen für die Immuntherapie und von zwei T-Zellrezeptorketten in T-Zellen erfordern, die gentechnisch für den adoptiven Transfer verändert wurden⁸.
Trotz diesem hinreichend bekannten Bedarf war es eine signifikante Herausforderung für die Gentransfertechnologie, eine koordinierte, hochgradige Expression mehrerer Transgene in der Mehrzahl der Zielzellen zu erreichen. Zwei verschiedene Transgene wurden von zwei separaten Vektoren exprimiert; dennoch wurde nur ein Bruchteil der Zielzellen von beiden Vektoren transduziert, und es wurde eine heterogene Population von Zellen erhalten, die entweder eines oder zwei Gene in verschiedenen Verhältnissen exprimierten, was zuverlässige Studien und/oder wirksame Anwendungen verhinderte. Alternativ wurden mindestens zwei Transgene von verschiedenen Promotoren innerhalb desselben Vektors exprimiert⁹; Dennoch verhinderten unterschiedliche Gewebespezifität und gegenseitige Interferenz zwischen Promotoren häufig eine effiziente Koexpression in denselben Zielzellen¹⁰. Differenzielles Splicing erzeugt mehrere Transkripte vom selben Promotor aus, lässt sich aber schwierig an das Einführen mehrerer Transgene durch Viren anpassen¹¹. Mithilfe des selbst spaltenden Peptids des Maul-und-Klauenseuchevirus 2A sind chimäre Polyproteine erzeugt worden, die eine kotranslationale Selbstprozessierung in separate Komponenten durchführen^12,13 die Anwendung dieser Technologie auf multiplen Gentransfer war jedoch bislang begrenzt, weil sie ausgeklügelte Gentechnik erfordert, beide Proteine auf dasselbe zelluläre Kompartiment begrenzt und Sequenzänderungen einführt, welche die Aktivität, Stabilität und Immunogenität des Proteins beeinflussen könnten.
Der am meisten zufrieden stellende Ansatz für multiplen Gentransfer bislang beruhte auf der Verwendung interner Ribosomeneintrittsstellen (IRES)¹⁴. Diese Sequenzen, die in viralen und zellulären Transkripten identifiziert wurden, kontrollieren die Translation auf ^mRNACap-unabhängige Weise und erlauben die Translation des stromabwärts (downstream)liegenden Gens, wenn sie zwischen zwei Genen in einer bizistronischen Boten-RNA (Messenger-RNA) eingefügt werden. Die Autoren testeten die Leistung verschiedener IRES im Kontext selbst-inaktivierender (SIN) lentiviraler Vekoren (LV) und fanden signifikante Einschränkungen dieses Ansatzes.
WO 02/064804 beschreibt bidirektionale Komplexe mit Doppelpromotor, die die transkriptionale Aktivität von Transgenen bei Pflanzen wirksam verstärken.
Die bidirektionalen Promotoren der Erfindung weisen eine modifizierte Verstärker(Enhancer)-Region mit mindestens zwei Kernpromotoren auf jeder Seite des modifizierten Verstärkers (Enhancers) in divergenter Richtung auf. Die Anwendung betrifft die Genexpression bei Pflanzen. Darüber hinaus erfordert der Ansatz die Duplikation von tandem-ausgerichteten Verstärker(Enhancer)-Sequenzen in einer modifizierten internen Region des Konstruktes, die von zwei identischen bzw. homologen minimalen Promotoren je Seite verknüpft werden. Die vorliegende Erfindung verlangt keine Duplikation von Verstärker(Enhancer)- oder anderen Sequenzen in dem effizienten Promotor des bidirektionalen Konstruktes und auch nicht, dass die Kernpromotoren auf beiden Seiten davon eine Identität von mindestens 30% aufweisen. Schließlich könnte die Tandemduplikation mit dem Einführen durch Retro-/Lentiviren nicht kompatibel sein.
US 6,388,170 beschreibt Pflanzenvektoren, die bidirektionale Promotoren aufweisen, welche einen minimalen Promotor und einen allgemeinen Promotor aufweisen, wobei der minimale Promotor funktionell mit dem allgemeinen Promotor verknüpft ist, sich in entgegen gesetzter Richtung zu dem allgemeinen Promotor und 5' von dem allgemeinen Promotor befindet. Es sind Promotorsequenzen, die aus Pflanzen und Pflanzen infizierenden Viren stammen, beschrieben und in Pflanzenzellen bzw. Pflanzenteilen getestet worden. In Anbetracht der erheblichen evolutionären Distanz zwischen Pflanzen und Tieren lehrt US 6,388,170 nicht, wie man Tierpromotoren für die Genexpression in Tieren und in Tierzellen mithilfe der verfügbaren Gentransferverfahren gentechnisch verändert.
WO 01/34825 beschreibt Zelllinien, Plasmide und Vektoren, die für die Produktion von für die Gentherapie geeigneten rekombinanten Viren, wie Adenoviren, geeignet sind. Die Zelllinien, Plasmide und Vektoren umfassen induzierbare Promotoren, wie beispielsweise bidirektionale Promotoren für die koordinierte Expression bidirektional klonierter Gene. Es sind jedoch nur bidirektionale Tet-regulierte Konstrukte beschrieben.
Die Autoren haben daher nach neuen Strategien gesucht, um Gentransfersysteme wie beispielsweise LV, die eine effiziente Transduktion ex vivo und eine direkte Verabreichung in vivo ermöglichen, in vollem Umfang zu nutzen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Autoren entwickelten ein neuartiges Vektordesign, bei dem synthetische bidirektionale Promotoren die koordinierte Transkription von zwei divergenten RNAs vermitteln. Die Autoren zeigen, dass LV, die bidirektionale Promotoren tragen, zwei Transgene koordiniert in der überwiegenden Mehrzahl der transduzierten Zellen exprimieren und damit die bizistronischen Vektoren deutlich übertreffen. Es wurde die effiziente Leistung der neuen bidirektionalen LV in primären hämatopoietischen zellen, ex vivo und nach der Transplantation untersucht, und in mehreren Geweben in vivo nach direktem Vektortransport oder Transgenese etabliert. Die Erfindung überwindet eine seit langem bestehende Hürde auf der Suche nach verbesserten Werkzeugen zur Genexpression und dürften die Reichweite und Sicherheit der Gentherapie erweitern.
Daher ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein bidirektionaler Promotor für die Expression von mindestens zwei Kodierungssequenzen in entgegen gesetzter Richtung in Tierzellen bereit, umfassend vom 5'-Ende zum 3'-Ende

a) eine erste minimale Promotorsequenz, die aus dem Genom des Cytomegalievirus (CMV) oder des Mausmammatumorvirus (MMTV) stammt;
b) eine voll effiziente Promotorsequenz, die aus einem Tiergen stammt;

Im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung bedeutet eine voll effiziente Promotorsequenz eine Sequenz, die eine effiziente Transkription eines primären Transkriptes steuert. Vorzugsweise umfasst sie eine Verstärker(Enhancer)-Region und eine minimale Promotorsequenz, entweder getrennt oder überlappend. Mehr bevorzugt stammt die voll effiziente Promotorsequenz von der Phosphoglyceratkinase oder vom Ubiquitinpromotor.
Eine Aufgabe der Erfindung ist eine bidirektionale Expressionskassette, die im Wesentlichen den bidirektionalen Promotor wie oben beschrieben, stromabwärts (downstream) von jedem Promotor positionierte, geeignete Insertionsstellen und (downstream) von jeder Insertionsstelle positionierte Polyadenylierungsstellen aufweist.
Vorzugsweise weist die bidirektionale Expressionskassette des Weiteren mindestens ein stromaufwärts (upstream) von einer oder jeder Polyadenylierungsstelle positioniertes posttranskriptionales regulatorisches Element auf. Mehr bevorzugt weist die bidirektionale Expressionskassette des Weiteren mindestens eine interne Ribosomeneintrittsstellen(IRES)-Sequenz auf, um mindestens drei Gene zu exprimieren.
Eine Aufgabe der Erfindung ist ein Expressionskonstrukt, welches den bidirektionalen Promotor wie oben beschrieben enthält.
Eine Aufgabe der Erfindung ist ein Expressionskonstrukt, welches die bidirektionale Expressionskassette wie oben beschrieben enthält.
Eine Aufgabe der Erfindung ist ein Gentransferexpressionsvektor, welcher das Expressionskonstrukt wie oben beschrieben enthält und des Weiteren lentivirale oder retrovirale Sequenzen aufweist Eine Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung des Gentransferexpressionsvektors für die Herstellung eines Einführungs- und Expressionssystems mehrerer Gene in Tierzellen, vorzugsweise in Tiergewebezellen in vivo, mehr bevorzugt in Gehirnneuronen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist ein In-vitro-Verfahren für die koordinierte Expression zweier exogener Kodierungssequenzen in einer Tierzelle, umfassend die folgenden Schritte:

a) Klonieren der Kodierungssequenzen in den Gentransferexpressionsvektor nach Anspruch 8, wobei jede Kodierungssequenz unter der Kontrolle von einem der beiden Promotoren des bidirektionalen Promotors steht;
b) Transformieren von Tierzellen mittels der Vektoren;
c) Zulassen der Expression des Vektors.

Vorzugsweise handelt es sich bei der Tierzelle um eine menschliche Zelle, mehr bevorzugt handelt es sich bei der menschlichen Zelle um eine retransplantierbare menschliche Zelle, noch mehr bevorzugt handelt es sich bei der retransplantierbaren menschlichen Zelle um eine hämatopoietische Zelle.
Alternativ kann die Transformation von Gewebezellen in vivo durch direktes Einführen des Vektors durchgeführt werden, beispielsweise in Gehirnneuronen.
Eine Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines transgenen, nicht menschlichen Organismus, das den Schritt des Transformierens geeigneter Zellen mit dem Gentransferexpressionsvektor wie oben beschrieben umfasst.
Die Vektoren der Erfindung können vorteilhafterweise für Genfunktions- und Zielvalidierungsstudien in vitro und in vivo; Gentherapie; Expression mehrerer Gene in Tierzellen; Herstellung von transgenen Tieren und schließlich zum Ausschalten (Knockout) mehrerer Gene wie auch zur Herstellung von Medikamenten eingesetzt werden.
FIGURENLEGENDE
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben:
1. Gentransferleistung bizistronischer lentiviraler Vektoren. (a) Schema der proviralen Vektorform. Eine bizistronische Expressionskassette, die eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) enthielt, die entweder vom Enzephalomyokarditisvirus (EMCV), mit der Wildtyp (wt)- oder einer mutierten (mut) Translationsstartstelle, oder von der 5'-untranslatierten NF-kB-Repressionsfaktor-mRNA (NRF) stammte, wurde vom Immediate Early-Promotor des menschlichen Cytomegalievirus (CMV) oder dem Promotor der Phosphoglyceratkinase (PGK) gesteuert. ΔU3, R und U5, LTR-Regionen mit Deletion in U3; SD und SA, Splice-Donor und -akzeptorstelle; ψ, Verkapselungssignal, einschließlich des 5'-Anteils des gag-Gens (GA); RRE, Rev-Response-Element; cPPT, zentraler Polypurintrakt; WPRE, Posttranskriptionales regulatorisches Element des Woodchuck-Hepatitisvirus. (b) Southern-Blot-Analyse von HeLa-Zellen, transduziert mit den angegebenen monozistronischen (CMV) oder bizistronischen Vektoren, die Luciferase (Gen 1) und GFP (Gen 2) vom CMV-Promotor aus exprimieren, mit einer Sonde für die WPRE-Sequenz. Alle Vektoren integrierten mit DNA der erwarteten Länge. Die Vektorkopienzahl wurde relativ zu einer Plasmidstandardkurve ermittelt und verwendet, um Vektorstammlösungen zu normalisieren und für jeden Vektor in einem bestimmten Zielzelltyp in den in c-f gezeigten Experimenten einen ähnlichen Integrationsgrad sicherzustellen. (c–f) Luciferase- und GFP-Expression in menschlichen HeLa-Zellen (c), Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC, d), periphere Blutlymphozyten (PBL, e) und aus Nabelschnurblut stammende CD34+-Vorläufer (f), 5–7 Tage zuvor mit einem monozistronischen (☐, CMV) oder dem angegebenen bizistronischen CMV-Luciferase-GFP-Vektor transduziert. Linke Spalte, Histogramme, welche die Luciferase-Nettoaktivität in Zellextrakten darstellen, Mittelwert +/– Standardabweichung (SD). Rechte Tafel, Dotblots, welche die GFP-Expression durch FACS-Analyse darstellen; es ist die Häufigkeit und mittlere Fluoreszenzintensität (MFI, X) von GFP⁺-Zellen angegeben. Der monozistronische Kontrollvektor exprimierte die Luciferase im Histogramm (☐) und GFP im Dotblot am weitesten links (CMV) für jeden Zelltyp. (g, h) FACS-Analyse der ΔNGFR- und GFP-Expression in 293T-Zellen (g) und CD34⁺-Vorläufer (h), transduziert durch einen EMCV-wt-IRES-Vektor, der ΔNGFR und GFP vom PGK-Promotor aus exprimiert. Die Histogramme in Tafel (h) zeigen die Verteilung der Expression von ΔNGFR in allen analysierten vitalen Zellen (links) und der GFP-Expression in den ΔNGFR+-Zellen nach dem Gating (M1) (rechts). Die gezeigten Experimente geben mindestens drei mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführte Experimente wieder.
2. Gentransferleistung bidirektionaler lentiviraler Vektoren. (a) Schema der proviralen Vektorform. Ein bidirektionaler Promotor, hergestellt aus minimalen Kernpromotorelementen des humanen Cytomegalievirus (mCMV), der stromaufwärts (upstream) und in umgekehrter Richtung mit einem effizienten Promotor verknüpft war, der vom humanen Phosphoglyceratkinase(PGK)- oder Polyubiquitin-UBI-C-Gen stammte, steuerte die divergente Transkription von zwei RNAs. CTE, konstitutives Transportelement des Mason-Pfizer-Monkey-Virus; pA, Polyadenylierungsstelle A des Simian-Virus-40. Weitere Vektormerkmale befinden sich in der Legende zu 1. (b) Luciferase-Nettoaktivität und (c–e) GFP-Expression in HeLa-Zellen, die 5–7 Tage zuvor mit LV transduziert worden sind, welche die angegebenen bidirektionalen bzw. Expressionskontrollkassetten trugen. Die Häufigkeit und MFI (X) von GFP+-Zellen in der FACS-Analyse sind in den Dotblots rechts angegeben. Die Luciferaseaktivität wurde für die beiden markierten Vektoren bestimmt (☐, ∎). (f–j) ΔNGFR- und GFP-Expression in HeLa-Zellen, die 5–7 Tage zuvor mit seriellen 10-Fach-Verdünnungen von LV transduziert worden sind, welche die angegebene Expressionskassette trugen. Die Häufigkeit von ΔNGFR+ (oberer linker Bereich) und ΔNGFR/GFP-doppeltpositiven (obere rechte Region) Zellen, mit dem entsprechenden MFI von ΔNGFR (Y) und GFP (X), sind in den FACS-Dotblots angegeben. Die gezeigten Experimente sind repräsentativ für mindestens drei durchgeführte Experimente mit ähnlichen Ergebnissen.
3. Vergleich der Leistung bidirektionaler und bizistronischer lentiviraler Vektoren. Die ANGER- und GFP-Expression in 293T-Zellen, die 3 Wochen zuvor mit seriellen 10-Fach-Verdünnungen von LV transduziert wurden, welche die angezeigte Expressionskassette trugen. Der Gesamtanteil von ΔLNGFR-exprimierenden Zellen und von ΔLNGFR/GFP-doppeltpositiven Zellen (in Klammern) ist über den FACS-Dotblots angegeben. In jedem Blot ist die durchschnittliche Anzahl an Vektorkopien je Zelle (CpC) angegeben, wobei die erwartete Häufigkeit transduzierter Zellen der Poisson-Verteilung unabhängiger Zufallsereignisse entspricht. Wenngleich praktisch alle integrierten Vektoren ΔNGFR exprimierten, waren der Expressionsgrad und die Fraktion transduzierter Zellen, die GFP koexprimierten, viel höher bei den zwei getesteten bidirektionalen Vektoren (MA1 und MA4) als bei dem bizistronischen Vektor EMCV-wt-IRES.
4. Doppelgentransfer in hämatopoietische Zellen durch bidirektionale Vektoren. (a–c) Humane CD34⁺-Nabelschnurvorläuferzellen wurden mit dem GFP-ΔNGFR-Vektor MA1 in Gegenwart früh wirkender Zytokine wie beschrieben²³ transduziert und entweder nach 7-tägiger Kultur im selben Medium (a) und nach weiteren 10 Tagen in Medium, das die myeloide Differenzierung fördert (b), oder nach Aussäen in methylcellulosebasiertem klonogenen Medium analysiert. Für (a) und (b) ist ein Dotblot gezeigt, welches die ΔNGFR- und die GFP-Expression in der FACS-Analyse zeigt, zusammen mit Histogrammen, welche die Verteilung der Expression von ANGER in allen analysierten vitalen Zellen (oben) und der GFP-Expression in den ΔNGFR+-Zellen nach dem Gating (M1) (unten) zeigen. Es ist der prozentuale Anteil unreifer Vorläuferzellen, die zum Analysezeitpunkt CD34 exprimieren, und der sich differenzierenden Zellen, welche zum Analysezeitpunkt den myeloiden Marker CD31 exprimieren, gezeigt. Für (c) sind eine repräsentative Licht- (links) und eine Fluoreszenzmikrographie (rechts) des angegebenen Typs von CFC gezeigt. (d, e) Humane periphere Blutlymphozyten wurden entweder nach 2-tätiger Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern (d) oder nach 4-tägiger Behandlung mit Interleukin-7 wie beschrieben²⁴ transduziert und hinsichtlich der ΔNGFR- und der GFP-Expression wie oben beschrieben analysiert. (f, g) Gereinigte(lin-)murine Knochenmarkvorläuferzellen wurden ohne Zytokinstimulation wie beschrieben⁴⁸ transduziert und nach 7 Tagen in Flüssigkultur hinsichtlich der ΔNGFR- und der GFP-Expression analysiert (f) oder sofort in letal bestrahlte syngene Empfänger transplantiert. Die FACS-Analyse des peripheren Blutes einer repräsentativen Maus 2 Monate nach der Transplantation ist in g gezeigt. Die gezeigten Experimente sind repräsentativ für mindestens drei durchgeführte Experimente mit ähnlichen Ergebnissen. In d–f sind Zellen gezeigt, die nach Transduktion niedrige Vektorkopienzahlen aufwiesen, um eine strengere Leistungsanalyse durchzuführen.
5 Doppelgentransfer in vivo mithilfe bidirektionaler Vektoren. Ein hoher Titer von GFP-ΔNGFR-MA1-LV wurde stereotaktisch in das Striatum adulter Mäuse injiziert. Zwei Monate nach der Injektion wurden mit einem Kryostaten Gehirnschnitte angefertigt und mit Immunfluoreszenz und Konfokalmikroskopie analysiert. Es sind repräsentative Bilder des injizierten Bereichs nach Immunfärbung auf ΔNGFR (rot), GFP (grün) und Färbung mit TO-PRO3 auf Kern-DNA (blau) gezeigt. Von einzelnen optischen Schnitten wurden sequenziell Fluoreszenzsignale erhalten, die einzeln und nach Fusion (merge) gezeigt sind. Originalvergrößerung 200-Fach (Maßstabsbalken = 120 μm).
6 Doppelte Transgenese mit einem bidirektionalen Vektor. Durch direkte Injektion von GFP-ΔNGFR-MA1-LV in den perivitellinen Raum von einzelligen Embryonen wurden wie beschrieben¹⁹ transgene Mausstämme hergestellt, und die angegebenen Gewebe wurden durch Immunfluoreszenz und Konfokalmikroskopie auf Gefrierschnitten hinsichtlich der Expression von ANGER (rot) und GFP (grün) analysiert. Die Kerne wurden mit TO-PRO3 (blau) gefärbt. Von einzelnen optischen Schnitten wurden sequenziell Fluoreszenzsignale erhalten, die einzeln und nach Fusion (merge) gezeigt sind. Die gezeigten Bilder stammen von einer F1-Maus, die zwei Vektorgenome in die Keimbahn integriert aufwies. Ähnliche Bilder wurden von einer anderen analysierten transgenen Maus erhalten, die eine ähnliche oder höhere Anzahl an Vektorkopien aufwies. Originalvergrößerung 200-Fach (Milz, Lunge), 400-Fach (Herz, Niere, Gehirn, Leber), 630-Fach (Darm) (Maßstabsbalken = 120 μm).
7a Karte des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt RRL-MA1-lucif/GFP aufweist.
7b Sequenz des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt RRL-MA1-lucif/GFP aufweist.
8a Karte des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA1-GFP/deltaLNGFR aufweist.
8b Sequenz des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA1-GFP/deltaLNGFR aufweist.
9a Karte des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt RRL-MA2-lucif/GFP aufweist.
9b Sequenz des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt RRL-MA2-lucif/GFP aufweist.
10a Karte des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA3-GFP/deltaLNGFR aufweist.
10b Sequenz des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA3-GFP/deltaLNGFR aufweist.
11a Karte des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA4-GFP/deltaLNGFR aufweist.
11b Sequenz des Plasmids, welches das lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA4-GFP/deltaLNGFR aufweist.
BEISPIEL 1
MATERIAL UND VERFAHREN
Plasmidkonstruktion
Alle Transfervektoren entstanden aus Plasmid pCCL.sin.cPPT.PGK.GFP.WPRE¹⁵ unter Verwendung der oben beschriebenen Sequenzelemente: EMCV-IRES mit der stromabwärts (downstream) gelegenen Genkodierungssequenz beginnend am 11. ATG der IRES (wt) oder mit mutiertem 11. ATG der IRES zur Herstellung einer HindIII-Klonierungsstelle und zur Ermöglichung des Translationsstarts am stromabwärts (downstream) gelegenen Transgen-ATG¹⁶ (EMCVmut), der NRF-IRES¹⁸, dem MPMV-CTE²¹, einem minimalen CMV-Kernpromotor²⁰, einem 1226-bp-Fragment des Ubiquitin-C-Promoters¹⁹.
Konstruktion eines lentiviralen Vektors mit bidirektionalen Promotoren
Zur Herstellung des lentiviralen Konstruktes RRL-MA1 wurde ein XhoI-XhoI-Fragment, welches die SV40polyA.CTE.Luciferase.minhCMV-Elemente enthält (von dem lentiviralen pRRL.sin.cPPT.SV4OpolyA.CTE.Luciferase.minhCMV.Tet07.minMMTV.eGFP abstammend), in das lentivirale Vektorkonstrukt pRRL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre (Follenzi et al., 2000) kloniert, das mit demselben Enzym geschnitten war, um RRL-MA1-lucif/GFP (pRRL.sin.cPPT.SV40po1uA.CTE.Luciferase.minhCMV.hPGK.eGFP.Wpre) zu erhalten.
Zur Herstellung des lentiviralen Konstruktes CCL-MA1 wurden zwei Fragmente in das lentivirale Konstrukt pRRL.sin.cPPT.hPGK.ΔLNGFRWpre kloniert, das zuerst mit KpnI geschnitten wurde, die Enden stumpf gemacht wurden, und dann mit XhoI geschnitten wurde, wobei das erste Fragment, welches die minhCMV.eGFP-Elemente enthielt, von dem lentiviralen Konstrukt pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferase.minMMTV.Tet07.minhCMV.eGFP erhalten wurde, das mit KpnI geschnitten wurde, die Enden stumpf gemacht wurden, und dann mit XhoI geschnitten wurde, und das zweite von dem Konstrukt pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.tTA2.Wpre erhalten wurde, das mit BamHI geschnitten wurde, die Enden stumpf gemacht wurden, und anschließend mit NotI geschnitten wurde. Das resultierende lentivirale Konstrukt pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferase.minMMTV.TetO7.m inhCMV.eGFP wurde mit NotI und AvrII geschnitten, und das Fragment, welches cPPT.SV40polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.ΔLNGFRWpre enthielt, wurde in das lentivirale Konstrukt pCCL.sin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre kloniert, das mit denselben Enzymen geschnitten worden warn, um CCL-MA1-GFP/ΔLNGFR (pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.eGFP.minhCMV.hPGK.ΔLNGFRWpre) zu erhalten.
Zur Herstellung des lentiviralen Konstruktes RRL-MA2 wurde ein HindIII-BamHI-Fragment, welches die hPGK.Luciferase-Elemente enthält (von dem lentiviralen Vektorkonstrukt pRRL.sin.cPPT.hPGK.Luciferase.IRES.Wpre abstammend), in das retrovirale Konstrukt SF2-cLCM2G (erhalten von Rainer Loew, Universität Heidelberg, Deutschland) kloniert, welches mit den selben Enzymen geschnitten war, um das Konstrukt cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferase.hPGK.minMMTV.eGFP zu erhalten. Dieses Konstrukt wurde zunächst mit SalI geschnitten, die Enden stumpf gemacht und anschließend mit BamHI geschnitten, und die Fragmente, welche die Luciferase.hPGK.minMMTV.eGFP-Elemente enthielten, wurden in das lentivirale Vektorkonstrukt pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.tTA2.Wpre kloniert, das auf die gleiche Art geschnitten war, um RRL-MA2-lucif/GFP (pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferase.hPGK.minMMTV.eGFP.Wpre) zu erhalten.
Zur Herstellung des lentiviralen Konstruktes CCL-MA3 wurden zwei Fragmente in pBLKS+ kloniert, der mit HindIII und XhoI geschnitten war, wobei das erste Fragment, welches die CTE.SV40polyA-Elemente enthielt, von dem lentiviralen Vektorkonstrukt pRRL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.tTA2 stammte, das mit HindIII und XbaI geschnitten war, und das zweite Fragment, welches die minMMTV.GFP-Elemente enthielt, von dem Konstrukt cPPT.SV40polyA.CTE.Luciferase.hPGK.minMMTV.eGFP stammte, das mit XhoI und XbaI geschnitten war, um das Konstrukt pBLKS+minMMTV.GFP.CTE.SV40polyA zu erhalten. Das resultierende Konstrukt wurde mit EcoRV und XhoI geschnitten und das Fragment, welches minMMTV.GFP.CTE.SV40polyA enthielt, wurde in das lentivirale Vektorkonstrukt pCCL.sin.cPPT.hPGK.ΔNGFR.Wpre kloniert, das mit den selben Enzymen geschnitten war, um das endgültige lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA3-GFP/ΔNGFR (pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.GFP.minMMTV.hPGK.ΔNGFR.Wpre) zu erhalten.
Zur Herstellung des lentiviralen Konstruktes CCL-MA4 wurde das Fragment, das von pHR'.UBI-C.eGFP, geschnitten mit PacI, mit stumpf gemachten Enden und mit PstI geschnitten, abstammte und die UBI-C-Promotorsequenz enthielt, in die Stelle des PGK-Promotors in Konstrukt pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.GFP.minCMV.PGK.ΔNGFR, geschnitten mit EcoRV und PstI, eingesetzt, um das endgültige lentivirale Vektorkonstrukt CCL-MA4-GFP/ΔNGFR (pCCL.sin.cPPT.SV40polyA.CTE.GFP.minCMV.UBI-C.ΔNGFR.Wpre) zu erhalten. Die Karten und die Nukleotidsequenzen der Konstrukte RRL-MA1-lucif/GFP, CCL-MA1-GFP/ΔLNGFR, RRL-MA2-lucif/GFP; CCL-MA3-GFP/ΔLNGFR; CCL-MA4-GFP/ΔLNGFR sind in 7a–11a bzw. 7b–11b gezeigt.
Vektorherstellung und -titration
VSV-pseudotypisierte LV der dritten Generation wurden durch transiente 4-Plasmid-Kotransfektion in 293T-Zellen hergestellt und wie beschrieben15 durch Ultrazentrifugation gereinigt, mit der Modifikation, dass den Kulturen für die Vektorernte 1 mM Natriumbutyrat zugegeben wurde⁴⁷. Durch serielle Verdünnung wurde ein Schätzwert des Expressionstiters der GFP- oder /ΔLNGFR-Vektoren in HeLa-Zellen erhalten. Vektorteilchen wurden durch HIV-1-gag-p24-Immunocapture (NEN Life Science Products) gemessen. Die Vektorinfektiosität der Vektoren, die GFP bzw. ΔNGFR exprimierten, wurde als Verhältnis zwischen Titer und Teilchen berechnet. Der Vektorexpressionstiter im Überstand der 293T-Zellen lag im Bereich von 0,7 bis 1 × 10⁷ transduzierenden Einheiten^HeLa (TE)/ml bei dem monozistronischen CMV- oder PGK-Vektor, von 3 bis 8 × 10⁶ TE/ml bei bizistronischen Vektoren und bidirektionalen Vektoren. Die Vektorinfektiosität lag im Bereich von 0,5 bis 1 × 10⁵ TE/ng p24 bei dem monozistronischen CMV- oder PGK-Vektor und bei 2 bis 6 × 10⁴ TE/ng p24 bei bizistronischen Vektoren und bidirektionalen Vektoren.
Zellkulturen
Fortlaufende Kulturen von HeLa- und 293-Zellen wurden in Iscove's Modified Dulbecco's medium (IMDM; Sigma, Mailand, Italien) gehalten, das mit 10% fetalem Kälberserum (FBS; Gibco, Invitrogen Corporation, GB) und einer Kombination von Penicillin-Streptomycin und Glutamin ergänzt war. Es wurden Primärkulturen humaner Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVECs), peripheren Blutlymphozyten und CD34+-Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut erhalten und wie beschrieben¹⁵ gehalten. CD34+-Vorläuferzellen wurden mit 5 × 10 TE/ml LV transduziert und mindestens 7 Tage lang in Gegenwart von rekombinantem humanem Interleukin 6 (rhIL6, 20 ng/ml), rekombinantem humanem Stammzellenfaktor (rhSCF, 100 ng/ml), rekombinantem humanem FLT-3-Liganden (rhFLT-3-Ligand, 100 ng/ml), alle von PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA), und rekombinantem humanem Thrombopoietin (rhTPO, 20 ng/ml; Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) wie beschrieben²³ kultiviert. Zur Schaffung von Differenzierungsbedingungen wurden die transduzierten Vorläuferzellen 10 Tage lang in Gegenwart von 50 ng/ml rhSCF, rekombinantem humanem Granulozyten-Monozytenkolonie-stimulierendem Faktor (rhGM-CSF, 20 ng/ml), rekombinantem humanem Monozytenkolonie-stimulierenden Faktor (rhG-CSF, 20 ng/ml), alle von PeproTech, kultiviert. Für klonogene Assays wurden die transduzierten Zellen in einer Dichte von 800 Zellen/ml in humanem kompletten MethoCult-Medium (StemCell Technologies, Vancouver, CA, USA) ausgesät und 14 Tage später mittels Licht- und Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet.
Humane periphere Blutlymphozyten wurden mit einem Ficoll-Gradienten gereinigt und mit 0,5–5 × 10 TE/ml Vektor entweder nach 2-tägiger Aktivierung mit 30 ng/ml Anti-CD3-Antikörpern (Orthoclone, Mailand, Italien) plus 1 μg/ml Anti-CD28-Antikörper (PharMingen, San Diego, CA, USA) oder nach 4-tägiger Behandlung mit 5 ng/ml Interleukin-7 (Boehringer Mannheim-Roche GmbH, Mannheim, Deutschland) wie beschrieben²⁴ transduziert.
Die Reinigung von abstammungslinienmarkernegativen Zellen aus dem Knochenmark von C57BL/6-Mäusen mit einer magnetischen Zelldepletionstechnik (StemCell Technologies, Vancouver, CA, USA), Ex-vivo-Transduktion in serumfreiem StemSpan-Medium (StemCell Technologies, Vancouver, CA, USA) mit 0,5–2 × 10⁷ TE/ml Vektor und Transplantation in letal bestrahlte syngene Empfänger wurde wie beschrieben⁴⁸ durchgeführt.
Mäuse
CD1-, C57BL/6- und FVB-Mäuse wurden von Charles Rivers Laboratories (Calco, Italien) erworben und unter SPF-Bedingungen gehalten. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom institutionellen Tierhaltungs- und Tierverwendungsausschuss des San Raffaele-Krankenhauses genehmigt waren.
DNA-Analyse: Southern- und Echtzeit-PCR
Die Anzahl der Vektorkopien je Genom wurde mittels Echtzeit-PCR von 300 ng Vorlagen (Template)-DNA quantifiziert, die mit einem kommerziellen Kit (Qiagen) extrahiert war, unter Verwendung eines Satzes von Primern und Sonde, um das LV–Gerüst festzustellen:
LV-Vorwärtsprimer, 5'-TGAAAGCGAAAGGGAAACCA-3';
LV-Rückwärtsprimer, 5'-CCGTGCGCGCTTCAG-3';
LV-Sonde, 5'-(VIC)-CTCTCTCGACGCAGGACT-(TAMRA)-3'.
Die Reaktionen wurden nach den Herstelleranleitungen durchgeführt und mithilfe des Sequenzdetektionssystems ABI Prism 7700 (PE-Applied Biosystem) analysiert. Für die Southern-Blots wurden DNA aus transduzierten Zellen extrahiert, mit Afl-II verdaut, um die Expressionskassette aus der integrierten Vektor-DNA freizusetzen und mit einer WPRE-Sonde analysiert, um Vektorsequenzen festzustellen. Die durchschnittliche Anzahl an integrierten Vektorkopien wurde relativ zu einer Plasmidstandardkurve bestimmt.
Diese Zahlen wurden verwendet, um den Vektorintegrationstiter zu berechnen und die Vektorstammlösungen für alle nachfolgenden Transduktionsexperimente zu normalisieren, um für jeden getesteten Vektor einen ähnlichen Integrationsgrad sicherzustellen.
Experimentelles Design und stereotaktische Injektion.
Neun Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Injektion von 1,25% Tribromethanol (SIGMA) anästhesiert, in einen stereotaktische Rahmen (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) platziert, und der Schädel wurde mittels eines kleinen Einschnitts freigelegt. Zwei μl Vektorkonzentrat (2 × 10⁶ TE/ml) wurden mit einer Hamilton-Spritze mit einer stumpfen 33G-Kanüle (Hamilton, Reno, NV, USA) in einer Rate von 0,2 μl/Min in das Striatum der linken Hemisphäre (stereotaktische Koordinaten in mm ausgehend vom Bregma: AP = +0,74, ML = –1,9 und DV = –3,5 von der Schädeloberfläche) injiziert. Die Kanüle wurde weitere 5 Minuten lang an Ort und Stelle belassen, bevor sie langsam entfernt wurde.
Transgenese
Unter Verwendung von LV wurden transgene Mäuse hergestellt, wie von Lois et al. ¹⁹ beschrieben. In Kürze wurden weibliche FVB-Mäuse mit einer Kombination von Serum aus trächtigen Stuten und humanem chorionischem Gonadotropin superovuliert. Durchschnittlich wurden jedem weiblichen Tier zwischen 20 und 30 Embryonen entnommen und am selben Tag mit 10–100 pl 5 × 10⁷ TE/ml LV-Stammlösung in den perivitellinen Raum mikroinjiziert. Die manipulierten Embryonen wurden sofort in den Eileiter scheinträchtiger CD1-Mäuse implantiert. Die Jungen wurden hinsichtlich des Vorhandenseins der GFP-Sequenz mittels PCR-Analyse wie beschrieben⁴⁹ genotypisiert. Positive Mäuse wurden gezüchtet, um die Keimbahntransmission des Transgens zu testen. Aus dem Schwanz wurde DNA extrahiert und verwendet, um die Vektorkopienzahl mittels Echtzeit-PCR in primär transgenen (Founder-)Mäusen und deren F1-Nachkommen quantifizieren.
Durchflusszytometrie und Luciferaseassay
Transduzierte Zellen wurden vor der FACS-Analyse mindestens 4 Tage angezüchtet, um eine GFP-Expression im Gleichgewichtszustand (Steady State) zu erreichen und eine Pseudotransduktion auszuschließen. Vor der FACS-Analyse wurden adhärente Zellen mit 0,05%igem Trypsin-EDTA abgelöst, gewaschen und in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) fixiert, die 1% Paraformaldehyd (PAF) und 2% FBS enthielt. Die in Suspension gewachsenen Zellen wurden gewaschen und in PBS, das 2 μg/ml Propidiumiodid (PI) (BD Bioscience PharMingen, San Diego, CA, USA) und 2% FBS enthielt, resuspendiert. Für die Immunfärbung wurden 10⁵ Zellen in PBS mit 5% Mausserum, 5% Humanserum, 2% FBS für 15 Min. bei 4°C blockiert. Nach dem Blockieren wurden 10 μl R-Phycoerythrin(RPE)-konjugierte Antikörper (Anti-CD34 und Anti-CD13, Dako, Glostrup, Dänemark, und Anti-ΔLNGFR, BD Bioscience PharMingen, San Diego, CA, USA) zugegeben und die Zellen wurden für 30 Minuten bei 4°C inkubiert, mit PI gefärbt und mittels Dreifarben-Durchflusszytometrie analysiert. Für die Analyse wurden nur vitale PI-negative Zellen verwendet. Die Luciferase wurde in Zelllysaten getestet, die wie vom Hersteller beschrieben (Luciferase-Assay-System, Promega) hergestellt wurden. RLU wurden mit einem Lumat LB9507 Luminometer (Berthold) gemessen, nachdem die Zelllysate (normalisiert hinsichtlich des Proteingehaltes mit dem BCA-Proteinassayreagenskit, Pierce) mit Luciferasesubstrat (Promega) gemischt wurden.
Gewebeanalyse
Anästhesierte Mäuse wurden mit 0,9% NaCl und anschließend mit 4% PAF in PBS perfundiert. Es wurden Gewebeproben entnommen, für 48 Std. bei 4°C in 20% Saccharose in PBS äquilibriert und in Optimal-Cutting-Temperature-Verbindung (OCT) zum schnellen Einfrieren eingebettet. Gefrierschnitte mit einer Dicke von 10 μm (bei transgenen Mäusen) und 20 μm (bei stereotaktisch injizierten Mäusen) wurden in PAF nachfixiert und bei –80°C eingefroren. Die Schnitte wurden mit 5% Ziegenserum (Vector Laboratories) in PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton X-100 (PBS-T) enthielt, blockiert und mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-GFP-Antikörper (Molecular Probes) und R-Phycoerythrin(RPE)-konjugiertem monoklonalem Anti-ΔLNGFR-Antikörper (BD Bioscience PharMingen, San Diego, CA, USA) 1 Stunde lang inkubiert, gewaschen und 1 Stunde lang mit AlexaFluor488-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper (Molecular Probes) in PBS-T und 1% BSA gefärbt. Die Zellkerne wurden nach 1-stündiger RNase-Behandlung mit TOPRO-3 (Molecular Probes) gefärbt. Die Schnitte wurden auf Objektträgern eingedeckelt und mit einem Dreifachlaser-Konfokalmikroskop (Radiance 2100; BioRad) analysiert. Es wurden die Fluoreszenzsignale einzelner optischer Schnitte nacheinander erfasst und mit Photoshop 7.0 (Adobe) analysiert.
Bizistronische LV
Um mehr als ein Transgen von einem einzelnen Vektor aus zu exprimieren, untersuchten die Autoren zunächst die Leistung verschiedener IRES im Kontex selbst-inaktivierender LV einer späten Generation¹⁵. Sie verwendeten die starken CMV- und PGK-Promotoren, um die Expression bizistronischer Transkripte zu steuern, welche vom 5'- zum 3'-Ende den Luciferase-Reporter, eine IRES und den zellassoziierten GFP-Marker kodierten (1a). Zwei IRES wurden aus dem Enzephalomyokarditisvirus erhalten, d. h. ein Wildtyp (EMCVwt) und eine mutante (EMCVmut) Form^16,17, die sich in Bezug auf das ATG, von dem aus die Translation stromabwärts (downstream) startet, unterscheiden. Eine weitere IRES stammte aus der 5'-untranslatierten Sequenz der mRNA des NF-kB-Transkriptionsrepressionsfaktors (NRF)¹⁸.
Sie erzeugten VSV-pseudotypisierte Stammlösungen mit hohem Titer aller bizistronischen und monozistronischen Kontrollvektoren und normalisierten sie hinsichtlich der die Integration messenden transduzierenden Aktivität in HeLa-Zellen mittels Southern-Blot (1b). Anschließend verglichen sie die Genexpression in Zellen, die so transduziert worden waren, dass gleiche Vektorkopienzahlen erhalten wurden (1c–f). Obgleich die Luciferaseaktivität in HeLa-Zellen, die mit dem CMV-Luciferasevektor transduziert worden waren, und in Zellen, die mit dem am besten arbeitenden bizistronischen Vektor transduziert worden waren, ähnlich war, exprimierte nur ein kleiner Bruchteil der zuletzt genannten Zellen das IRES-abhängige GFP-Gen mit einem 10-fach niedrigeren Expressionstiter im Vergleich zu Zellen, die mit dem CMV-GFP-Kontrollvektor transduziert worden waren (1c). Darüber hinaus war die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von GFP in Zellen, welche das Protein von der IRES aus exprimierten, signifikant geringer als in Zellen, die es von der ^mRNACap aus exprimierten. Anschließend wurden bizistronische LV in primären Humanzellen getestet, einschließlich Endothelzellen aus der Nabelschnurvene, peripheren Blutlymphozyten und hämatopoietischen CD34⁺-Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut (HPC) (1d–f). Alle Zelltypen wurden effizient transduziert, wie durch die Häufigkeit GFP-positiver Zellen in Kulturen angezeigt wurde, welche mit dem CMV-GFP-Kontrollvektor transduziert worden waren, aber die IRES-abhängige GFP-Expression wurde nur in einem Bruchteil der mit bizistronischen Vektoren transduzierten Zellen beobachtet. Die IRES-Aktivität variierte umfangreich nach Zielzelltyp; nur die NRF-IRES erreichte eine feststellbare Expression der stromabwärts (downstream) liegenden Gene in Lymphozyten, während die EMCVwt-IRES in den anderen Zelltypen am effizientesten war. Darüber hinaus verringerten alle IRES die Expression von stromaufwärts (upstream) liegenden Genen, in manchen Fällen um mehr als eine logarithmische Größenordnung, im Vergleich zu dem CMV-Luciferase-Kontrollvektor.
Sie untersuchten auch IRES-basierte Vektoren durch Expression von zwei zellassoziierten Markern, GFP und einer trunkierten Version des niedrigaffinen NGF-Rezeptors (ΔLNGFR) (1g, h). Unter HeLa-Zellen, die mit einer niedrigen Dosis des am besten arbeitenden bizistronischen Vektors transduziert worden waren, exprimierten nur die Zellen, die große Mengen an ΔLNGFR exprimierten, auch GFP, wobei durchschnittlich eine von vier ΔNGFR-positiven Zellen GFP in feststellbarer Menge exprimierte (1g). Entsprechend exprimierte nur ein kleiner Bruchteil transduzierter CD34⁺-Vorläuferzellen, die ΔNGFR exprimierten, auch GFP in feststellbarer Menge (1h). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass IRES-basierte bizistronische Vektoren keine koordinierte Expression von zwei Transgenen in den meisten getesteten Zielzelltypen gewährleisteten und dass eine Transduktion mehrerer Kopien bzw. die Selektion transduzierter Zellen hinsichtlich der Expression stromabwärts (downstream) gelegener Gene erforderlich war, um eine Population zu erhalten, die in der Mehrzahl der Zellen beide Transgene exprimierte.
Bidirektionale LV
Zur Überwindung der Einschränkungen bizistronischer Vektoren untersuchten die Autoren ein neues Promotordesign für die koordinierte Transgenexpression. Sie verknüpften einen minimalen Kernpromotor stromaufwärts (upstream) und in entgegen gesetzter Richtung mit einem effizienten Promotor. Dieses Design wurde damit begründet, dass stromaufwärts (upstream) gelegene Elemente in dem effizienten Promotor, wenn auf beiden Seiten von Kernpromotoren dicht flankiert, die transkriptionale Aktivität in beiden Richtungen steuern könnten. Sollte eine solche bidirektionale Aktivierung stattfinden, würde die Expression beider Transkripte koordiniert reguliert. Sie testeten zwei ubiquitär exprimierte Promotoren, für die zuvor gezeigt worden war, dass sie eine robuste und effiziente Transgenexpression in LV steuern; das oben erwähnte 516-bp-Fragment des humanen Phosphoglyceratkinasepromotors (PGK)¹⁵ und ein 1226-bp-Fragment des humanen Ubiquitin-C-Promotors (UBI-C)¹⁹. Sie verknüpften diese mit einem minimalen Kernpromotor aus dem Cytomegalievirus (minCMV), der zuvor entwickelt worden war, um die Initiation eukaryotischer Expression mit Tetracyclin (Tc)-abhängigen Operatoren zu koppeln²⁰. Sie flankierten den bidirektionalen Promotor mit zwei Expressionskassetten, die für die LV-vermittelte Einführung von Genen optimiert waren (2a). Die stromaufwärts (upstream) gelegene Kassette – in Antisense-Richtung relativ zum LTR des Vektors – umfasste das konstitutive Transportelement (CTE) des Mason-Pfizer-Virus²¹ und eine Polyadenylierungsstelle des Simian-Virus-40 (SV40). Die stromabwärts (downstream) gelegene Kassette umfasste das posttranskriptionale regulatorische Element des Woodchuck-Hepatitisvirus (WPRE)²² und die SIN-HIV-1-LTR-Polyadenylierungsstelle.
Wie oben für bizistronische LV beschrieben, prüften sie den korrekten Transfer und normalisierten die Transduktion jedes Vektors mittels Southern-Blot-Analyse und Echtzeit-PCR transduzierter Zellen. Es wurden hohe Titer von LV, die bidirektionale Expressionskassetten trugen, mit hoher Infektiosität produziert, ähnlich den mit Standardvektoren (siehe Verfahren) erhaltenen. Das bidirektionale Design verstärkte die Transkription von dem stromaufwärts (upstream) gelegenen minimalen Promotor aus signifikant, ohne die stromabwärts (downstream) gelegene Expression von dem effizienten Promotor aus zu beeinflussen (2b–h). Beispielsweise war die Luciferase-Expression vom minCMV-Promotor aus um mindestens eine logarithmische Größenordnung erhöht, wenn er stromaufwärts (upstream) mit dem PGK-Promotor fusioniert war (2b). Bemerkenswerterweise erlaubte der bidirektionale PGK-Promotor die Feststellung von GFP (bzw. ΔLNGFR, nicht gezeigt) mit derselben Häufigkeit und mit ähnlichem Expressionsgrad in Zellen, die mit dem bidirektionalen Vektor transduziert wurden und das Protein von jeder Seite des Promotors aus exprimieren (2c, d), wie in Zellen, die mit dem PGK-Kontrollvektor transduziert worden waren (2e). Unter Verwendung von zwei zellassoziierten Markern ΔLNGFR und GFP zeigten sie eine stabile, effiziente und koordinierte Expression bidirektionaler LV, sowohl bei hoher als auch bei niedriger Kopienzahl (2f). Bei hohem Vektoreintrag erreichten sie eine hochgradige Expression beider Transgene in praktisch jeder Zielzelle. Bei geringem Vektoreintrag, wenn die meisten transduzierten Zellen eine provirale Kopie tragen, zeigten sie die Koexpression des Transgens in praktisch jeder markierten Zelle, was anzeigt, dass eine divergente Transkription von dem bidirektionalen Promotor aus stattfindet. Unter beiden Umständen wurde die Transgenexpression in Zellen, die zu einem frühen und späten Zeitpunkt nach der Transduktion analysiert wurden, in ähnlichem-Maß beibehalten (nicht gezeigt und 3 unten). Transgen-exprimierende Zellen neigten im Zweifarben-FACS-Plot zur Verteilung entlang einer Diagonallinie, was darauf hindeutet, dass die Expression der beiden Transgene koordiniert reguliert wird.
Erstaunlicherweise beobachteten sie eine koordinierte bidirektionale Expression, wenngleich mit signifikant geringerer Effizienz auf der stromaufwärts (upstream) als auf der stromabwärts (downstream) gelegenen Seite, wenn sie den alleinigen PGK-Promotor im Kontext mit der von ihnen entwickelten bidirektionalen Expressionskassette testeten (2g). Sie reproduzierten dieses Ergebnis nach dem Vertauschen der Position der beiden Transgene auf den beiden Seiten des PGK-Promotors (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transkriptionsaktivierungselemente in dem PGK-Promotor intrinsisch in der Lage sind, eine divergente Transkription auszulösen und stellen daher die hauptsächliche Steuerungskraft für die Doppelgenexpression in dem neuen LV dar, was eine koordinierte Regulierung der Transkription auf beiden Seiten des bidirektionalen Promotors sicherstellt. Hinzufügen des minCMV-Kernpromotors, der an sich eine sehr niedrige Aktivität aufweist (2h und 2b oben), verstärkte möglicherweise die Transkription stromaufwärts (upstream) von dem PGK-Promotor aufgrund der effizienteren Initiation (vergleiche 2g und 2f). Wenn sie PGK als steuernden Promotor in bidirektionalen Vektor mit UBI-C vertauschten, reproduzierten sie die mit dem PGK-Promotor beobachteten Ergebnisse (2i). Sie stellten eine intrinsiche bidirektionale Aktivität des UBI-C-Promotors (2j) fest, die durch die Addition des minCMV-Promotors stromaufwärts (upstream) signifikant verstärkt wurde.
Anschließend stellten sie einen direkten Vergleich der Leistung bidirektionaler und bizistronischer Vektoren in Bezug auf die Anzahl der integrierten Kopien, gemessen durch Echtzeit-PCR, an (3). Durch Analyse von 293T-Zellen, die mit steigenden Vektordosen transduziert waren, wiesen sie nach, dass die überwiegende Mehrzahl an integrierten bidirektionalen Vektoren auf Basis des PGK (MA1)- oder UBI-C(MA4)-Promotors beide Transgene effizient exprimierte, was den besten IRES-basierten bizistronischen Vektor deutlich übertraf.
Doppelgentransfer ex vivo und in vivo Anschließend untersuchten sie die Leistung des bidirektionalen LV MA1 in relevanteren Zielen für Gentherapieanwendungen und mit verschiedenen Einführungsstrategien. Sie transduzierten humane Nabelschnur-HPC und PBL mit ΔLNGFR-GFP-MA1-LV ex vivo nach den zuvor optimierten Protokollen^23,24 (4). Sowohl in Gegenwart früh wirkender Zytokine (4a) als auch nach Differenzierung in Flüssigkultur (4b) oder im klonogenen Assay (4c, nur GFP) wurden beide Genprodukte von einem großen Anteil von als unreife Zellen beurteilten HPC koordiniert in hohem Maß exprimiert. Entsprechend erhielten sie eine koordinierte Expression von ΔLNGFR und GFP in PBL, die unter Standardproliferationsbedingungen transduziert worden waren, ausgelöst durch CD3/CD28-Kostimulation (4d), und bei nicht-proliferierenden Zellen, die nur mit IL-7 behandelt worden waren, um die Eigenschaften der unbehandelten (naiven) Zellen zu erhalten (4e). Sie führten ferner Transplantationsstudien mit transduzierten murinen HPC durch, die durch negative Selektion aus dem Knochenmark angereichert wurden, um die stabile Expression beider Gene in den Nachkommen von langfristig neu besiedelnden HSC zu beweisen (4f). In den ex-vivo-transduzierten Zellen vor der Transplantation und in den Leukozyten der Mäuse mit langfristigem Einwachsen des Transplantats wurden ΔLNGFR und GFP in ähnlichem Maß koordiniert exprimiert. Insgesamt validierten diese Ergebnisse den neuen LV für effizienten doppelten Gentransfer in primitiven, determinierten und differenzierten hämatopoietischen Zellen.
Sie injizierten konzentrierten ΔLNGFR-GFP-MA1-LV in das Striatum adulter Mäuse und analysierten die Transgenexpression 4 Wochen nach der Injektion durch Konfokalmikroskopie von Gehirnschnitten nach Immunfärbung auf GFP und ΔLNGFR (5). Sie beobachteten eine robuste Koexpression beider Transgene in dem Gehirgewebe in der Umgebung der Injektionsstelle. Wie zuvor nach striataler Injektion von VSV-pseudotypisiertem LV angegeben^25–27, wies die überwiegende Mehrzahl der Zellen, welche die Marker exprimierten, die typische Morphologie striataler Neuronen auf. Der neue bidirektionale LV ermöglichte also einen effizienten Doppelgentransfer in vivo.
Doppelte Transgenese
Sie untersuchten, ob der neue bidirektionale LV die Erzeugung doppelt transgener Mauslinien ermöglicht. Wie zuvor von Lois et al. beschrieben¹⁹, mikroinjizierten sie den ΔNGFR-GFP-LV in den perivitellinen Raum von einzelligen Embryonen und implantierten diese in scheinträchtige Weibchen. Wir erhielten transgene Mäuse mit einer hohem Häufigkeit, wie durch Vorhandensein von Vektor-DNA (über 50% der Neugeborenen) bestimmt wurde, und bewiesen die Vektorintegration in die Keimbahn durch Kreuzen von Founder-Mäusen und analysierten deren Nachkommen hinsichtlich des Vektor-DNA-Gehalts und der Expression des Transgens (6). In den beiden analysierten F1-Mäusen, die 2 und 5 Vektorkopien im Genom tragen, fanden sie eine bemerkenswert einheitliche Expression beider Transgene in praktisch jeder Zelle der untersuchten Gewebe wie Gehirn, Leber, Milz, Darm, Herz, Skelettmuskel und Niere. Auch im Knochenmark und im peripheren Blut derselben Mäuse war eine Vektorexpression hinreichend feststellbar, wenngleich in weniger als 100% der Zellen und deutlicher für ΔNGER als für GFP (nicht gezeigt). Diese Daten wiesen darauf hin, dass die Transgenese mittels eines bidirektionalen LV ein schnelles und effizientes Verfahren ist, um eine robuste, stabile und koordinierte Expression von zwei Transgenen in gentechnisch veränderten Mäusen zu erhalten. Darüber hinaus zeigen sie, dass der bidirektionale minCMV-PGK-Promotor, den sie entwickelten, in der Mehrzahl der differenzierten Gewebe der Maus eine Expression des doppelten Transgens steuert und die Expression nach Vererbung über die Keimbahn beibehält.
DISKUSSION
Auf der Suche nach Strategien, die einen effizienten Transfer zweier Gene ermöglichen, gab es zu Anfang erhebliche Beschränkungen in Bezug auf IRES-basierten Ansätze. Bei Testung im Kontext eines bizistronischen LV war die IRES-abhängige Genexpression signifikant schwächer als in Abhängigkeit von der ^mRNACap und erforderte die Transduktion mehrerer Kopien für die Koexpression des stromabwärts (downstream) gelegenen Gens in einem beträchtlichen Bruchteil der transduzierten Zellen. Darüber hinaus verringerten die IRES die Expression des stromaufwärts (upstream) gelegenen Gens in dem Transkript und zeigten eine Aktivität mit signifikanter zelltypabhängiger Variation. Ähnliche Einschränkungen wurden berichtet, wenn IRES in andere Arten von Gentransfervektoren integriert wurden^14,28-32 Daher ist wahrscheinlich eine Selektion hinsichtlich der Expression stromabwärts (downstream) gelegener Genen erforderlich, wenn IRES verwendet werden, um eine Koexpression in allen Zielzellen sicherzustellen. Selektionsprotokolle sind zwar mit einigen Ex-vivo-Gentransfer- und -therapieanwendungen kompatibel, könnten aber die biologischen Eigenschaften genkorrigierter Zellen negativ beeinflussen, insbesondere, wenn die Expression selektierbarer Marker nicht effizient ist. Tatsächlich können eine längere Kultur ex vivo und eine beschränkte Größe oder klonale Zusammensetzung der transduzierten Zellpopulation das Einwachsen (Engraftment), das langfristige Überleben und die Gewebeneubesiedelung nach der Transplantation reduzieren³³. Noch wichtiger ist, dass die Ineffizienz der IRES-abhängigen Expression die meisten Anwendungen bizistronischer Vektoren beim direkten Gentransfer in vivo verhindert. Die Autoren haben daher neuartige Strategien untersucht, um Gentransfersysteme wie LV, welche eine effiziente Transduktion ex vivo und eine direkte Verabreichung in vivo ermöglichen³⁹, umfassend zu nutzen.
Sie haben ein neues Promotordesign basierend auf der Nebeneinanderstellung von Kernpromotorelementen stromaufwärts (upstream) und in entgegen gesetzter Richtung von einem effizienten Promotor entwickelt. Die bidirektionale Anordnung steuerte eine divergente Transkription, was darauf hinweist, dass stromaufwärts (upstream) gelegene Verstärker (Enhancer)/Promotorelemente in dem effizienten Promotor die Transkription in einer richtungsabhängigen Weise und gleichzeitig von beiden Seiten unterstützen können. Nach Einbau dieser Promotoren in LV erzielten sie effizienten Transfer von zwei Genen und eine koordinierte Expression in kontinuierlichen Zelllinien und primären Zellen ex vivo. Da beide Transgene in der überwiegenden Mehrzahl transduzierter Zellen exprimiert wurden, mussten die Zellen nicht selektiert werden, um eine Koexpression der Transgene sicherzustellen. Die Autoren zeigten nach direkter Injektion des bidirektionalen LV in das ZNS die koordinierte Expression von zwei Transgenen in neuralen Zellen in vivo. Darüber hinaus erlaubte der bidirektionale LV eine robuste zweifache Transgenese, was zu einer panzellulären Expression beider Transgene in allen untersuchten Geweben führte. All diese Ergebnisse konnten bislang mithilfe derzeit verfügbarer Technologien nicht erzielt werden.
Durch Überwachung der transduzierten Zellen, die eine einzelne Vektorkopie tragen, bewiesen die Autoren, dass von einem einzelnen bidirektionalen Promotor aus eine divergente Transkription stattfand, dass die Expression beider Transgene funktionell verknüpft und koordiniert reguliert war und dass bidirektionale Promotoren in allen Typen von getesteten Krebszellen einheitlich aktiv waren, ohne in einer Transkriptionsrichtung stumm geschaltet oder zufällig fixiert zu sein, selbst nach zellulärer Differenzierung. Obgleich sie nicht kartierten, wie nahe sich die beiden entgegen gesetzten Kernpromotoren sein müssen, damit eine funktionelle Verknüpfung gegeben ist, dürfte zu erwarten sein, dass ein enges Nebeneinanderstellen des fusionierten minimalen Kernpromotors mit einem der stromaufwärts (upstream) gelegenen Elemente in dem effizienten Promotor erforderlich ist, wie es in natürlichen Promotoren zwischen Kern- und Upstream-Elementen beobachtet wird. Sowohl der in dieser Arbeit getestete PGK- als auch der getestete UBI-C-Promotor steuerte die divergente Transkription, wenn sie mit einem minimalen Kernpromotor in der entgegengesetzten Richtung fusioniert waren. Bemerkenswerterweise wurde gezeigt, dass diese beiden Promotoren intrinsisch in der Lage sind, trotz der geringeren Effizienz auf der stromaufwärts (upstream) gegenüber der stromabwärts (downstream) gelegenen Seite, eine divergente Transkription zu fördern, wenn sie in die bidirektionale Expressionskassette eingebaut wurden, die sie entwickelt haben. Diese überraschende Beobachtung könnte ein spezifisches Merkmal einer Klasse von ubiquitär exprimierten Haushalts-Promotoren anzeigen, möglicherweise in Zusammenhang mit ihrem Gehalt an CpG-Inseln (siehe unten und^35-37). Es sollte allerdings nicht vergessen werden, dass sowohl die Promotorplatzierung zwischen zwei effizienten Expressionskassetten, die mit posttranskriptionalen regulatorischen Elementen ausgestattet sind, welche die Translation verstärken, als auch die LV-vermittelte Integration, von der gezeigt wurde, dass sie vorzugsweise transkribierte Gene im Chromatin ansteuert, dazu beitragen könnte, latente transkriptionale Aktivität aufzudecken. Obgleich die intrinsische bidirektionale Aktivität der getesteten Haushalts-Promotoren ohne die Anordnung der in dieser Arbeit beschriebenen Kernpromotorelementen stromaufwärts (upstream) für eine Nutzung an sich nicht ausreichend sein könnte, bildet sie die Basis für die koordinierte Regulierung der durch unsere neuen Vektoren erzielte Expression von zwei Genen. Andererseits sollte die Neigung dieser Promotoren zur Steuerung einer divergenten Transkription berücksichtigt werden, wenn Vektoren gentechnisch hergestellt und transduzierte Zellen oder Gewebe analysiert werden³⁸, und könnte einen möglichen Mechanismus für die häufig beobachtete Interferenz zwischen nahe beieinander liegenden Promotoren im selben Vektorkonstrukt liefern^10,39. Es ist möglich, dass das hier beschriebene bidirektionale Design erfolgreich auf gewebespezifische Promotoren angewandt werden kann, um eine koordinierte Expression von zwei Transgenen in spezifischen Geweben zu erhalten. Darüber hinaus könnte man durch Kombination bidirektionaler Promotoren mit bizistronischen Iranskripten mehr als zwei Transgene in derselben Zelle exprimieren, wenngleich mit den oben für IRES-abhängige Vektoren beschriebenen Einschränkungen. Induzierbare bidirektionale Promotoren wurden ursprünglich in Tet-regulierten Expressionssystemen entwickelt, indem ein minimaler Promotor auf beiden Seiten einer Reihe von Tet-Operatorwiederholungen dupliziert wurde, um eine exogen regulierte Expression von zwei Transgenen zu erhalten^36,40,41. Dieses Design wurde kürzlich auf andere Systeme angewandt, die auch prokaryotische Verstärker(Enhancer)-Ememente mit chimären Transaktivatoren kombinieren, um die Genexpression zu regulieren⁴². Obgleich diese induzierbaren Expressionssysteme leistungsstarke Hilfsmittel für Genfunktionsstudien darstellen, sind sie von der Koexpression und funktionellen Aktivität von Proteintransaktivatoren abhängig und bergen mehrere Herausforderungen, wenn sie auf die vektorbasierte Einführung und Applikationen in vivo angewandt werden. Kürzlich wurde ein konstitutiver bidirektionaler Promotor in der Pflanzenbiotechnologie auf exogene Genexpression getestet⁴³. Unsere Ergebnisse liefern die erste Beschreibung synthetischer bidirektionaler Promotoren, welche die endogene Transkriptionsmaschinerie nutzen, wie sie in den meisten Tierzelltypen zur Verfügung steht, um eine robuste und konstitutive Expression zweier divergenter Transkripte zu steuern. In der Natur sind bis vor kurzem wenige Fälle bidirektionaler Promotoren dokumentiert. Bemerkenswerterweise wies ein vor kurzem durchgeführter Überblick über das menschliche Genom auf eine Fülle divergent transkribierter Genpaare hin, deren Transkriptionsstartstellen weniger als 1 kb auseinander liegen^44,45. Es ist wahrscheinlich, dass viele der zwischen diesen Genpaaren zu gefundenen Promotorelementen beide Gene regulieren⁴⁶. Die synthetischen bidirektionalen Promotoren, die sie entwickelt haben, könnten daher ein gut dargestelltes und evolutionär konserviertes Merkmal eukaryotischer Transkription nachahmen, welches eine strukturelle Basis für ihre robuste Leistung bildet. Die neuen lentiviralen Vektoren, die um diese bidirektionalen Promotoren herumgebaut sind, dürften die Reichweite und Sicherheit der Gentherapie, die Aussagekraft der Genfunktions- und Zielvalidierungsstudien und die Anwendungen der Transgenese bei Tieren voranbringen. Bei Anpassung an die Expression kurzer interferierender RNA könnten sie auch ein koordiniertes Ausschalten (Knockout) mehrerer Gene ermöglichen.
BEZUGSVERWEISE

1. Kay, M. A., Glorioso, J. C. & Naldini, L. Nat Med 7, 33–40 (2001).
2. Neff, T. et al. J Clin Invest 112, 1581–1588 (2003).
3. Bordignon, C. & Roncarolo, M. G.. Nat. Immunol. 3, 318–321 (2002).
4. Sadelain, M.. J Gene Med 4, 113–121 (2002).
5. Bonini, C. et al. Science 276, 1719–1724 (1997).
6. Hacein-Bey-Abina, S. et al.. Science 302, 415–419 (2003).
7. Burton, E. A., Glorioso, J. C. & Fink, D. J Gene Ther 10, 1721–1727 (2003).
8. Sadelain, M., Riviere, I. & Brentjens, R.. Nat Rev Cancer 3, 35–45 (2003).
9. Miller, A. D. in Retroviruses. (eds. J. Coffin, S. H. Hughes & H. E. Varmus) 437–474 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview; 2000).
10. Emerman, M. & Temin, H. M. Mol Cell Biol 6, 792–800 (1986).
11. Zhu, Y., et al.. Mol. Ther. 4, 375–382 (2001).
12. Klump, H. et al. Gene Ther. 8, 811–817 (2001).
13. Furler, S., et al.. Gene Ther 8, 864–873 (2001).
14. Martinez-Salas, E.. Curr. Opin. Biotechnol. 10, 458–464 (1999).
15. Follenzi, A., et al.. Nat Genet 25, 217–222 (2000).
16. Ghattas, I. R, Safes, J. R. & Majors, J. E.. Mol. Cell Biol. 11, 5848–5859 (1991).
17. Qiao, J., et al.. Hum Gene Ther 13, 881–887 (2002).
18. Oumard, A., et al.. 20, 2755–2759 (2000).
19. Lois, C., et al.. Science 295, 868–872 (2002).
20. Baron, U. & Bujard, H.. Methods Enzymol. 327, 401–421 (2000).
21. Bray, M. et al. Proc Natl Acad Sci USA 91, 1256–1260 (1994).
22. Zufferey, R., et al.. J. Virol. 73, 2886–2892 (1999).
23. Ailles, L. et al.. Mol Ther 6, 615–626 (2002).
24. Cavalieri, S. et al.. Blood 102, 497–505 (2003).
25. Naldini, L., et al. Proc Natl Acad Sci USA 93, 11382–11388 (1996).
26. Baekelandt, V. et al. Hum Gene Ther 13, 841–853 (2002).
27. Deglon, N. et al.. Hum. Gene Ther. 11, 179–190 (2000).
28. Sokolic, R. A. et al. Blood 87, 42–50 (1996).
29. Wong, E. T., Ngoi, S. M. & Lee, C. G. Gene Ther 9, 337–344 (2002).
30. Kozak, M.. Gene 318, 1–23 (2003).
31. Mizuguchi, H., et al.. Mol Ther 1, 376–382 (2000).
32. Hennecke, M. et al.. Nucleic Acids Res 29, 3327–3334 (2001).
33. Mazurier, F., et al. Blood 103, 545–552 (2004).
34. Vigna, E. & Naldini, L.. J Gene Med 2, 308–316 (2000).
35. Gardiner-Garden, M. & Frommer, M.. J Mol Biol 196, 261–282 (1987).
36. Lavia, P., Macleod, D. & Bird, A.. EMBO J6, 2773–2779 (1987).
37. Johnson, P. & Friedmann, T.. Gene 88, 207–213 (1990).
38. Scacheri, P. C. et al. Genesis 30, 259–263 (2001).
39. Vigna, E. et al.. Mol Ther 5, 252–261 (2002).
40. Baron, U., et al.. Nucleic. Acids. Res. 23, 3605–3606 (1995).
41. Unsinger, J., et al.. Mol Ther 4, 484–489 (2001).
42. Fux, C. et al.. J Gene Med 5, 1067–1079 (2003).
43. Xie, M., He, Y. & Gan, SNat Biotechnol 19, 677–679 (2001).
44. Trinklein, N. D. et al.. Genome Res 14, 62–66 (2004).
45. Takai, D. & Jones, P. A. Mol Biol Evol 21, 463–467 (2004).
46. Adachi, N. & Lieber, M. R.. Cell 109, 807–809 (2002).
47. Farson, D. et al. Hum Gene Ther 12, 981–997 (2001).
48. De Palma, M., et al.. Nat Med 9, 789–795 (2003).
49. Follenzi, A., et al. Hum Gene Ther 13, 243–260 (2002).

Claims

Bidirektionaler Promotor für die Expression von mindestens zwei Kodierungssequenzen in entgegen gesetzter Richtung in Tierzellen, umfassend vom 5'-Ende zum 3'-Ende: a) eine erste minimale Promotorsequenz, die aus dem Genom des Zytomegalievirus (ZMV) oder des Mausmammatumorvirus (MMTV) stammt; b) eine Promotorsequenz, die aus einem Tiergen stammt und die eine Verstärker(Enhancer)-Region und eine zweite minimale Promotorsequenz aufweist; wobei die beiden Promotorsequenzen eine koordinierte Transkription der Kodierungssequenzen in entgegen gesetzter Richtung steuern.
Bidirektionaler Promotor nach Anspruch 1, wobei die voll effiziente Promotorsequenz aus ubiquitär exprimierten Genen stammt, welche das Phosphoglyceratkinasegen oder das Ubiquitingen umfassen.
Bidirektionale Expressionskassette, die im Wesentlichen den bidirektionalen Promotor nach den vorherigen Ansprüchen, stromabwärts (downstream) von jedem Promotor positionierte, geeignete Insertionsstellen und (downstream) von jeder Insertionsstelle positionierte Polyadenylierungsstellen aufweist.
Bidirektionale Expressionskassette nach Anspruch 3, die des Weiteren mindestens ein stromaufwärts (upstream) von einer oder jeder Polyadenylierungsstelle positioniertes posttranskriptionales regulatorisches Element aufweist.
Bidirektionale Expressionskassette nach Anspruch 3 oder 4, die des Weiteren mindestens eine interne Ribosomeneintrittsstellen(IRES)-Sequenz aufweist, um mindestens drei Gene zu exprimieren.
Expressionskonstrukt, welches den bidirektionalen Promotor nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
Expressionskonstrukt, welches die bidirektionale Expressionskassette nach Anspruch 3–5 enthält.
Gentransferexpressionsvektor, welcher das Expressionskonstrukt nach Anspruch 6 oder 7 enthält und des Weiteren lentivirale oder retrovirale Sequenzen aufweist.
Verwendung des Gentransferexpressionsvektors nach Anspruch 8 für die Herstellung eines Einführungs- und Expressionssystems in Tierzellen.
Verwendung des Gentransferexpressionsvektors nach Anspruch 9, wobei Tierzellen Tiergewebezellen in vivo sind.
Verwendung des Gentransferexpressionsvektors nach Anspruch 10, wobei Tiergewebezellen Gehirnneuronen umfassen.
In-vitro-Verfahren für die koordinierte Expression zweier exogener Kodierungssequenzen in eine Tierzelle, umfassend die folgenden Schritte: a) Klonieren der Kodierungssequenzen in den Gentransferexpressionsvektor nach Anspruch 8, wobei jede Kodierungssequenz unter der Kontrolle von einem der beiden Promotoren des bidirektionalen Promoters steht; b) Transformieren von Tierzellen mittels der Vektoren; c) Zulassen der Expression des Vektors.
In-vitro-Verfahren für die koordinierte Expression zweier exogener Kodierungssequenzen nach Anspruch 12, wobei die Tierzelle eine menschliche Zelle ist.
In-vitro-Verfahren für die koordinierte Expression zweier exogener Kodierungssequenzen nach Anspruch 13, wobei menschliche Zelle einer retransplantierbare menschliche Zelle ist.
In-vitro-Verfahren für die koordinierte Expression zweier exogener Kodierungssequenzen nach Anspruch 14, wobei die retransplantierbare menschliche Zelle eine hämatopoietische Zelle ist.
Verfahren zum Herstellen eines transgenen, nicht menschlichen Organismus, das den Schritt des Transformierens geeigneter Zellen mit einem Expressionskonstrukt, das die bidirektionale Kassette nach Anspruch 6 oder 7 enthält, umfasst.
Verfahren zum Herstellen eines transgenen, nicht menschlichen Organismus, das den Schritt des Transformierens geeigneter Zellen mittels des Gentransferexpressionsvektors nach Anspruch 8 umfasst.