DE69920659T2

DE69920659T2 - Rekonstituierender retroviraler vektor (recon vektor) für gezielte genexpression

Info

Publication number: DE69920659T2
Application number: DE69920659T
Authority: DE
Inventors: Walter GÜNZBURG; Dieter Klein; Walter Tabotta; Brian Salmons
Original assignee: Institut fuer Virologie der Veterinaermedizinische Universitaet Wien
Current assignee: Institut fuer Virologie der Veterinaermedizinische Universitaet Wien
Priority date: 1998-01-06
Filing date: 1999-01-03
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-01-04
Also published as: ATE278029T1; DE69920659D1; WO1999035280A1; AU2419599A; EP1045922A1; US6821776B1; ES2229674T3; EP1045922B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuartigen retroviralen Vektor, welcher insbesondere als sicheres Gentransfervehikel für die gezielte Gentherapie anwendbar ist. Der neuartige Vektor ermöglicht die Expression von z.B. toxischen Genen, die Expression von Genen mit einer spezifischen Funktion, die mit einer Virusvektorproduktion inkompatibel ist, und die Expression von Genen, welche Vektorumgruppierungen bewirken, die für spezifische biochemische Operationen notwendig sind.
Hintergrund der Erfindung
Die effizientesten und am besten entwickelten Systeme für die in vivo-Gentherapie beruhen auf Retroviren, da die Verwendung von retroviralen Vektoren (RV) gegenwärtig das Verfahren nach Wahl für den Transfer therapeutischer Gene in einer Vielzahl von anerkannten Protokollen sowohl in den USA als auch in Europa ist (Kotani, H., P.B. Newton, S. Zhang, Y.L. Chiang, E. Otto, L. Weaver, R.M. Blaese, W.F. Anderson und G.J. McGarrity. 1994, Human Gene Therapy 5: 19-28). Retroviren infizieren eine breite Vielfalt von Zellen und sind ideale Werkzeuge für die stabile Abgabe von Genen an Zellen, da das Retrovirus in der Lage ist, die DNA-Form seines Genoms in das Genom der Zielzelle zu integrieren. Somit tragen alle Tochterzellen einer infizierten Zelle die retrovirale Vektor-DNA einschließlich des therapeutischen Gens. Der gegenwärtige effiziente Transfer von therapeutischen Genen erfordert jedoch üblicherweise, dass die Infektion von Zielzellen mit dem die Gene tragenden RV in vitro stattfindet, und erfolgreich infizierte Zellen werden danach wiederum an das betroffene Individuum retourniert (Rosenberg, S.A., Anderson, W.F., Blaese, R.M. et al. 1992, Hum. Gene Ther. 3: 75-90; Anderson, W.F. 1992. Human gene therapy. Science 256:808-813). Solche ex vivo-Gentherapieprotokolle sind ideal für die Verbesserung medizinischer Zustände, bei denen die Zielzellpopulation leicht isoliert werden kann. Zusätzlich ermöglicht die ex vivo-Infektion von Zielzellen die Verabreichung großer Mengen an konzentriertem Virus, welche vor der Verwendung einem strengen Sicherheitstest unterzogen werden können.
Leider umfasst nur ein Bruchteil der möglichen Anwendungen für die Gentherapie Zielzellen, welche leicht isoliert, kultiviert und danach erneut eingebracht werden können. Außerdem schließen die komplizierte Technologie und die damit zusammenhängenden hohen Kosten einer ex vivo-Gentherapie deren weltweit verbreitete Verwendung effektiv aus. Eine zukünftige einfache und kostengünstige Gentherapie erfordert einen in vivo-Ansatz, bei dem der RV oder Zellen, die das rekombinante Virus produzieren, dem Patienten in Form einer Injektion oder einer einfachen Einpflanzung von RV-produzierenden Zellen direkt verabreicht wird bzw. werden.
Diese Art von in vivo-Ansatz bringt natürlich eine Vielzahl neuer Probleme mit sich. Zunächst und vor allem müssen Sicherheitsbedenken angesprochen werden. Das Virus wird möglicherweise durch Einpflanzung virusproduzierender Zellen erzeugt, und es besteht keine Gelegenheit, das produzierte Virus im Vorhinein zu testen. Es ist wichtig, sich des begrenzten Risikos bewusst zu sein, das mit der Verwendung derartiger Systeme einhergeht.
Zur Minimierung dieses Risikos wurde der sogenannte ProCon-Vektor als sicheres Gentransfervehikel für die gezielte Gentherapie entwickelt, wobei das für Retroviren typische Prinzip der Promotorkonversion zur Anwendung kam (PCT/EP95/03445):
Das retrovirale Genom besteht aus einem RNA-Molekül mit der Struktur R-U5-gag-pol-env-U3-R. Während des Vorgangs der Reverse Transcription wird der U5-Bereich am rechten Ende des generierten DNA-Moleküls dupliziert, während der U3-Bereich dupliziert und am linken Ende des generierten DNA-Moleküls platziert wird. Die resultierende Struktur U3-R-U5 wird LTR (lange terminale Sequenzwiederholung) genannt und ist somit an beiden Enden der DNA-Struktur oder des Provirus identisch und wiederholt. Der U3-Bereich am linken Ende des Provirus beherbergt den Promotor. Dieser Promotor steuert die Synthese eines RNA-Transcripts, welches an der Grenze zwischen dem linken U3- und dem R-Bereich beginnt und an der Grenze zwischen dem rechten R- und dem U5-Bereich endet. Diese RNA wird in retroviralen Partikeln verpackt und in die zu infizierende Zielzelle transportiert. In der Zielzelle wird das RNA-Genom wiederum, wie obenstehend beschrieben, reverse-transkribiert.
Im ProCon-Vektor ist der rechte U3-Bereich verändert, die normale linke U3-Struktur ist jedoch beibehalten; der Vektor kann normal in RNA transkribiert werden, wobei der normale, im linken U3-Bereich lokalisierte, retrovirale Promotor verwendet wird. Die generierte RNA enthält jedoch nur die geänderte rechte U3-Struktur. In der infizierten Zielzelle wird diese geänderte U3-Struktur nach einer Reverse Transcription an beiden Enden der retroviralen Struktur platziert.
Der geänderte Bereich trägt anstelle des U3-Bereichs einen Polylinker. Somit kann jeder Promotor, einschließlich jener, die eine gewebespezifische Expression lenken, leicht eingefügt werden. Dieser Promotor wird danach ausschließlich in der Zielzelle für die Expression gekoppelter, vom retroviralen Vektor getragener Gene verwendet. Demgemäß wird die Expression des retroviralen Vektors in der Verpackungszelllinie durch den normalen, im U3-Bereich enthaltenen, unselektiven retroviralen Promotor geregelt. Sobald der Vektor in die Zielzelle eintritt, kommt es jedoch zu einer Promotorkonversion und die therapeutischen und/oder Markergene werden aus einem in den Polylinker eingebrachten gewebespezifischen Promotor nach Wahl exprimiert. Es kann nicht nur geradezu jeder gewebespezifische Promotor im System inkludiert sein, was für das selektive Abzielen auf eine breite Vielfalt von verschiedenen Zellarten sorgt, sondern zusätzlich ähneln die Struktur und die Eigenschaften des retroviralen Vektors nach dem Konversionsvorgang nicht mehr jenen eines Virus. Vom Standpunkt der Sicherheit aus betrachtet, hat dies natürlich äußerst wichtige Konsequenzen, da andere retrovirale Vektoren ohne weiteres eine genetische Rekombination mit dem retroviralen Verpackungskonstrukt und/oder endogenen Retroviren durchmachen, um möglicherweise pathogene Viren zu produzieren. Promotorkonversionsvektoren ähneln Retroviren nicht, da sie nach einer Konversion keine retroviralen U3-Promotoren mehr tragen, wodurch die Möglichkeit einer genetischen Rekombination verringert wird.
Eher als ein gewebespezifischer Promotor kann ein regulierbarer Promotor in den Polylinker eingefügt werden, wodurch die konditionale Expression von Genen, die vom retroviralen Vektor getragen werden, ermöglicht wird.
Keines der derzeitigen Systeme zur Steuerung einer Genexpression ist jedoch absolut, und alle erfordern die zusätzliche Unannehmlichkeit, dass sie das Vorhandensein eines Induktors oder einer Repressorsubstanz oder eines Stimulus benötigen.
Aufgabe der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der weiteren Verbesserung von retroviralen Vektoren für den Gentransfer in Zielzellen, inbesondere um ein System bereitzustellen, welches jegliche Undichtigkeit der Genexpression in den Verpackungszellen vermeidet und eine Expression übertragener Gene nur in der Zielzelle gestattet, vorzugsweise ohne Bedarf an externen Regulatorsubstanzen oder Stimuli.
Zusammenfassung der Erfindung
Um die vorangegangene und andere Aufgaben zu erfüllen, stellt die vorliegende Erfindung einen retroviralen Vektor bereit, umfassend einen oder mehrere Promotoren, die in Antisinnausrichtung im 5' LTR-Bereich eingefügt sind, und eine oder mehrere codierende Sequenzen, die in Antisinnausrichtung im 3' LTR-Bereich eingefügt sind, wobei sowohl der Promotor als auch die codierende Sequenz solcherart eingefügt sind, dass sichergestellt wird, dass der Promotor und die codierende Sequenz während des Vorgangs der Reverse Transcription in einer Zielzelle dupliziert werden und sowohl im 3' als auch im 5' LTR-Bereich des resultierenden Provirus in einer Weise in Erscheinung treten, dass sich der Promotor stromaufwärts von der codierenden Sequenz befindet, was diesem gestattet, die Genexpression anzutreiben (siehe 1).
Erstens gibt es in der Antisinnausrichtung kein Gen, das dem Promotor links (stromabwärts) nachfolgt. Außerdem ist das in die Zielzelle zu übertragende und dort zu exprimierende Gen nicht funktionstüchtig, da sich rechts (stromaufwärts) von ihm kein Promotor befindet.
Zur Erzeugung des retroviralen Partikels bzw. des verpackten Vektors wird das Prinzip eines retroviralen Vektorsystems angewandt. Dieses System besteht aus zwei Komponenten: dem retroviralen Vektor selbst, in dem die Gene, welche die Virusproteine codieren, ersetzt wurden, und einer Verpackungszelllinie, welche das modifizierte Retrovirus mit den fehlenden Virusproteinen versorgt. Diese Verpackungszelllinie wurde mit einem oder mehreren Plasmiden transfiziert, welche jene Gene tragen, die eine Verpackung des modifizierten retroviralen Vektors ermöglichen, ihr fehlt jedoch die Fähigkeit zur Produktion replikationskompetenter Viren.
Nach dem Einbringen des Vektors in die Verpackungszelllinie wird der retrovirale Vektor in RNA transkribiert. Diese Transcription wird durch den normalen, im U3-Bereich von 5' LTR enthaltenen, unselektiven retroviralen Promotor geregelt (siehe oben) und beginnt an der Grenze zwischen dem U3- und dem R-Bereich und endet an der Grenze zwischen dem R- und dem U5-Bereich von 3' LTR. Die RNA, welche das rekombinante retrovirale Genom darstellt, wird von den von der Verpackungszelllinie produzierten Virusproteinen verpackt, um retrovirale Partikel zu bilden, die aus der Zelle knospen. Diese werden zum Infizieren der Zielzelle verwendet.
Nach der Infektion der Zielzelle wird die rekombinante Virus-RNA in DNA reversetranskribiert. Während dieses Vorgangs wird der am 5'-Ende der Virus-RNA in Antisinnausrichtung eingefügte Promotor dupliziert und zum 3'-Ende des generierten DNA-Moleküls transloziert, während die codierende Sequenz bzw. die codierenden Sequenzen vom 3'-Ende der Virus-RNA dupliziert und zum 5'-Ende des DNA-Moleküls transloziert wird bzw. werden (siehe 1).
Infolge dieses Vorgangs sind der Promotor und das Gen zweimal in den Zielzellen vorhanden. Weiters ist jede Kopie des Gens nunmehr an eine Kopie des Promotors gekoppelt, welcher sich im Verhältnis zum codierenden Bereich stromaufwärts befindet, wodurch die Expression des Gens in der Zielzelle gestattet wird. Infolgedessen vermeidet dieses System jegliche Undichtigkeit der Genexpression in den Verpackungszellen und ermöglicht die Expression übertragener Gene in der Zielzelle ohne Bedarf an externen Stimuli.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Promotor im U5-Bereich von 5' LTR eingefügt, wobei er den U5-Bereich vorzugsweise gänzlich oder teilweise ersetzt. Dennoch kann der Promotor auch zwischen dem R- und dem U5-Bereich von 5' LTR eingefügt sein.
Die gencodierenden Sequenzen sind insbesondere im U3-Bereich von 3' LTR eingefügt, wobei sie den U3-Bereich vorzugsweise gänzlich oder teilweise ersetzen. Alternativ können sie zwischen dem R- und dem U3-Bereich von 3' LTR eingefügt sein.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die codierenden Sequenzen heterologe DNA. Der Begriff „heterolog" wird für jegliche Kombination von DNA-Sequenzen verwendet, die in der Natur normalerweise nicht eng verbunden vorgefunden wird.
Die codierenden Sequenzen sind vorzugsweise eines oder mehrere Elemente der Gruppe, bestehend aus Markergenen, therapeutischen Genen, antiviralen Genen, Antitumorgenen, Cytokin-Genen und/oder Toxin-Genen, beschränken sich jedoch nicht auf diese.
Diese Marker- und therapeutischen Gene sind vorzugsweise ausgewählt aus einem oder mehreren Elementen der Gruppe, bestehend aus β-Galactosidase-Gen, Neomycin-Gen, Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-Gen, Puromycin-Gen, Cytosindesaminase-Gen, Hygromycin-Gen, dem sekretierte-alkalische-Phosphatase-Gen, Guaninphosphoribosyltransferase (gpt)-Gen, Alkoholdehydrogenase-Gen, Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT)-Gen, dem grünfluoreszierenden Protein (gfp)-Gen, Cytochrom P450-Gen und/oder Toxin-Genen wie z.B. der α-Untereinheit von Diphtherie, Pertussis-Toxin, Tetanus-Toxoid.
Zusätzlich kann der retrovirale Vektor ein oder mehrere Elemente umfassen, welche die Expression der codierenden Sequenzen regulieren.
Der eingefügte Promotor ist vorzugsweise ein starker, konstitutiver Promotor wie z.B. jener des Cytomegalovirus, Affenvirus 40, Rous-Sarcoma-Virus, oder der Ubiquitin C-Promotor oder bei einer weiteren Ausführungsform ein Promotor, der die zielzellspezifische Expression steuert und durch transagierende Moleküle regulierbar sein kann.
Ohne darauf beschränkt zu sein, sind die zielzellspezifischen Regulationselemente und Promotoren vorzugsweise eines oder mehrere Elemente der Gruppe, bestehend aus dem Molkesäureprotein (WAP), dem Maus-Mamma-Tumorvirus (MMTV), β-Lactoglobulin- und Casein-spezifischen Regulationselementen und Promotoren, welche zum Abzielen auf menschliche Brusttumore verwendet werden können, Pankreas-spezifischen Regulationselementen und Promotoren, einschließlich Carbonatdehydrase II- und β-Glucokinase-Regulationselementen und Promotoren, Lymphozyten-spezifischen Regulationselementen und Promotoren, einschließlich des menschlichen Immunschwächevirus (HIV), Immunglobulin und MMTV-Lymphozyten-spezifischen Regulationselementen und Promotoren und MMTV-spezifischen Regulationselementen und Promotoren wie z.B. ^MMTVP2, welcher eine Ansprechempfindlichkeit gegenüber Glucocorticoidhormonen verleiht oder die Expression zur Brustdrüse lenkt, T-zellspezifischen Regulationselementen und Promotoren wie z.B. dem T-Zell-Rezeptorgen und CD4-Rezeptor-Promotor, B-zellspezifischen Regulationselementen und Promotoren wie z.B. dem Immunglobulin-Promotor oder mb1. Diese Regulationselemente und Promotoren regulieren vorzugsweise die Expression von zumindest einer der codierenden Sequenzen des retroviralen Vektors.
Außerdem ist der retrovirale Vektor besonders replikationsdefekt und basiert vorzugsweise auf einem Vektor der pLXSN-Familie und/oder einem Promotorkonversionsvektor (siehe oben).
Die LTR-Bereiche sind vorzugsweise ausgewählt aus zumindest einem Element der Gruppe, bestehend aus LTRs des Mäuseleukämievirus (MLV), Maus-Mamma-Tumorvirus (MMTV), Maus-Sarcomavirus (MSV), Affen-Immunschwächevirus (SIV), menschlichen Immunschwächevirus (HIV), menschlichen T-Zell-Leukämievirus (HTLV), Katzen-Immunschwächevirus (FIV), Katzen-Leukämievirus (FELV), Rinder-Leukämievirus (BLV) und Mason-Pfizer-Affenvirus (MPMV), ohne darauf beschränkt zu sein.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein retrovirales Vektorsystem vorgesehen, umfassend einen obenstehend beschriebenen retroviralen Vektor als erste Komponente und eine Verpackungszelllinie, die zumindest ein retrovirales und/oder rekombinantes retrovirales Konstrukt beherbergt, welches Proteine codiert, die zum Verpacken des retroviralen Vektors notwendig sind.
Die Verpackungszelllinie beherbergt retrovirale oder rekombinante retrovirale Konstrukte, welche jene retroviralen Proteine codieren, die nicht im retroviralen Vektor codiert sind. Ohne darauf beschränkt zu sein, ist die Verpackungszelllinie vorzugsweise ausgewählt aus einem Element der Gruppe, bestehend aus psi-2, psi-Crypt, psi-AM, GP+E-86, PA317, GP+envAM-12, Fly A13, BOSC 23, BING, Fly RD 18, ProPak-X, -A.52 und -A.6, oder aus irgendeinem von diesen, welche mit rekombinanten Konstrukten supertransfiziert sind, die eine Expression von Oberflächenproteinen aus anderen komplexen Viren ermöglichen.
Nach dem Einbringen des obenstehend beschriebenen erfindungsgemäßen retroviralen Vektors in eine retrovirale Verpackungszelllinie wird ein retrovirales Partikel bereitgestellt, welches das rekombinante retrovirale Genom umfasst.
Die Erfindung umfasst auch ein retrovirales Provirus, mRNA eines erfindungsgemäßen retroviralen Provirus, jegliche RNA, die aus einem erfindungsgemäßen retroviralen Vektor resultiert, und cDNA davon, sowie Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen retroviralen Partikel infiziert sind.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zum Einbringen von homologen und/oder heterologen Nucleotidsequenzen in Zielzellen (wie z.B. CRFK, NIH/3T3, T-47D, RAT2, MV 1 LU (NBL-7), T-24, PG13, PA317, A20, HT-1080, PANC-1, MIA PA CA-2, HEP G2, 293, MCF-7, CV-1, COS 1, COS 7, FLY2A1) bereit, umfassend das in vivo- und in vitro-Infizieren einer Zielzellpopulation mit rekombinanten retroviralen Partikeln, die von der Verpackungszelllinie produziert wurden. Die Nucleotidsequenzen sind ausgewählt aus einem oder mehreren Elementen der Gruppe, bestehend aus Genen oder Teilen von Genen, welche Proteine, Regulationssequenzen und Promotoren codieren.
Der retrovirale Vektor, das retrovirale Vektorsystem und das retrovirale Provirus sowie RNA davon werden zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die in vivo- und in vitro-Gentherapie bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, verwendet. Zudem werden sie für die gezielte Integration in homologen Zellsequenzen verwendet.
Kurzfassung der Erfindung
Die Erfindung umfasst Folgendes, allein oder in Kombination:
einen retroviralen Vektor, umfassend einen oder mehrere Promotoren, die in Antisinnausrichtung im 5' LTR-Bereich eingefügt sind, und eine oder mehrere codierende Sequenzen, die in Antisinnausrichtung im 3' LTR-Bereich eingefügt sind, wobei sowohl der Promotor als auch die codierende Sequenz solcherart eingefügt sind, dass sichergestellt wird, dass der Promotor und die codierende Sequenz während des Vorgangs der Reverse Transcription in einer Zielzelle dupliziert werden und sowohl im 3' als auch im 5' LTR-Bereich des resultierenden Provirus in einer Weise in Erscheinung treten, dass sich der Promotor stromaufwärts von der codierenden Sequenz befindet, was diesem gestattet, die Genexpression anzutreiben;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei der Promotor im U5-Bereich von 5' LTR eingefügt ist;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei die codierende Sequenz im U3-Bereich von 3' LTR eingefügt ist;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei die codierende Sequenz heterologe DNA umfasst;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei die codierende Sequenz ausgewählt ist aus einem oder mehreren Elementen der Gruppe, bestehend aus Markergenen, therapeutischen Genen, antiviralen Genen, Antitumorgenen, Cytokin-Genen und/oder Toxin-Genen;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei der Promotor ein starker, konstitutiver Promotor ist;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei der retrovirale Vektor replikationsdefekt ist;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei der retrovirale Vektor auf einem Vektor der pLXSN-Familie basiert;
den obenstehenden retroviralen Vektor, wobei der retrovirale Vektor auf einem Promotorkonversionsvektor basiert;
ein rekombinantes retrovirales Vektorsystem, umfassend einen obenstehenden retroviralen Vektor als erste Komponente und eine Verpackungszelllinie, die zumindest ein retrovirales und/oder rekombinantes retrovirales Konstrukt beherbergt, welches Proteine codiert, die zum Verpacken des retroviralen Vektors notwendig sind;
ein retrovirales Partikel, hergestellt durch Transfizieren einer Verpackungszelllinie eines obenstehenden retroviralen Vektorsystems mit dem obenstehenden retroviralen Vektor;
ein retrovirales Provirus, hergestellt durch Infektion von Zielzellen mit einem obenstehenden rekombinanten retroviralen Partikel;
mRNA eines obenstehenden retroviralen Provirus;
RNA eines obenstehenden retroviralen Vektors;
eine Wirtszelle, die mit einem obenstehenden retroviralen Partikel infiziert ist;
eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines obenstehenden rekombinanten retroviralen Partikels und/oder eines obenstehenden rekombinanten retroviralen Vektorsystems;
ein Verfahren zum Einbringen von homologen und/oder heterologen Nucleotidsequenzen in Zielzellen, umfassend das Infizieren der Zielzellen mit obenstehenden rekombinanten retroviralen Partikeln;
die Verwendung eines obenstehenden rekombinanten retroviralen Vektors und/oder eines obenstehenden rekombinanten retroviralen Vektorsystems und/oder eines obenstehenden retroviralen Partikels zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Gentherapie.
Beispiele
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter. Es ist für den Fachmann gut verständlich, dass die dargelegten Beispiele keineswegs in einer Weise interpretiert werden sollten, welche die Anwendbarkeit der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Technologie auf diese Beispiele beschränkt.
I. Konstruktion eines auf ProCon basierenden Expressionsvektors mit einem verlängerten Verpackungssignal
Der auf ProCon basierende Expressionsvektor (siehe PCT-Anmeldung Nr. PCT/EP95/03445) pLX125 wurde durch Ligasierung des Fragments, das die MLV-5'LTR sowie das verlängerte Verpackungssignal von pLXSN enthielt (Miller und Rosman (1989) Biotechniques 7: 980-990), mit dem Fragment konstruiert, welches das Neomycin-Gen unter der Kontrolle des SV40-Promotors und die MMTV-3'LTR eines mit p125.6 bezeichneten Vektors enthielt (siehe auch PCT-Anmeldung Nr. PCT/EP95/03445).
Der Vektor pLXSN wurde mit den Restriktionsenzymen AflIII und BamHI aufgeschlossen, was zu einem 3545 bp-Fragment führte, und p125.6 wurde mit den Restriktionsenzymen AflII und BamHI aufgeschlossen, was zu einem 4263 bp-Fragment führte. Die DNA-Fragmente beider Aufschlussprodukte wurden durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, die DNA-Bänder wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert. Nach einer Ethanolfällung wurden die DNA-Fragmente in Wasser resuspendiert.
40 ng des 3545 bp AflIII/BamHI-Fragments vom Vektor pLXSN und 100 ng des 4263 bp AflIII/BamHI-Fragments vom Vektor p125.6 wurden vermischt und unter Verwendung von T4-Ligase (Boehringer) 1 h lang bei Raumtemperatur ligasiert. Bei 12°C wurden unter Verwendung des Klenow-Enzyms 12 h lang Nucleotide eingefügt, gefolgt von einer 14-stündigen Ligasierung der glatten Enden bei 14°C unter Verwendung der T4-Ligase (Boehringer). Die Enzyme wurden 20 Minuten lang bei 65°C inaktiviert. Die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt, in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen EcoRI, AflII, StuI, BssHII und KpnI aufgeschlossen. Der endgültige korrekte ProCon-Vektor wurde mit pLX125 bezeichnet.
II. Konstruktion des auf ProCon basierenden Expressionsvektors pLXPCMTV
Der ProCon-Expressionsvektor pLXPCMTV – welcher nur eine einzige SacII-Restriktions-Schnittstelle enthält – wurde konstruiert, indem die SacII-Restriktions-Schnittstelle stromaufwärts von 5'LTR im Expressionsvektor pLX125 durch teilweisen Restriktionsaufschluss entfernt wurde. pLX125 wurde mit dem Restriktionsenzym SacII teilweise aufgeschlossen und bei 65°C 20 Minuten lang durch Hitze inaktiviert. Für eine Ligasierung glatter Enden wurden die Nucleotidenden mit T4-Polymerase (New England BioLabs) 20 Minuten lang bei 12°C abgeschnitten. Die DNA wurde durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das 7810 bp-Fragment-DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert. Nach einer Ethanolfällung wurde die DNA in Wasser resuspendiert. 10 ng des DNA-Fragments wurden unter Verwendung von T4-Ligase (Boehringer) 12 h lang bei 4°C ligasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen MluI und SacII aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Plasmid wurde mit pLXPCMTV bezeichnet.
III. Konstruktion eines egfp-exprimierenden ProCon-Vektors
Der ProCon-Expressionsvektor pLXPCEGFP (= pLESNm1P) wurde als Kontrollvektor für das ReCon-System durch Ligasierung des Fragments, welches das egfp-Gen enthielt, das aus dem Plasmid pEGFP-1 (Clontech) erhalten wurde, mit dem pLXPCMTV-Grundgerüst konstruiert.
Das pLXPCMTV-Grundgerüst wurde mit dem Restriktionsenzym HpaI aufgeschlossen, was ein 7800 bp-Fragment ergab. Für die Isolierung des egfp-Gens wurde das Plasmid pEGFP mit den Restriktionsenzymen HpaI und SmaI aufgeschlossen, was ein 860 bp-Fragment ergab. Die Aufschlussmischungen wurden auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt. Das 7800 bp- und das 860 bp-Fragment wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaex-Protokolls (Qiagen) eluiert.
40 ng des pLXPCMTV-Grundgerüsts und 50 ng des HpaI/SmaI-Fragments wurden vermischt und unter Verwendung von T4-Ligase (Promega) 14 Stunden lang bei 16°C ligasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen KpnI, SpeI oder BamHI/XhoI aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Plasmid wurde mit pLXPCEGFP (= pLESNm1P) bezeichnet.
IV. Konstruktion eines Expressionsvektors, enthaltend das inverse egfp-Gen im 3'LTR-Bereich
Der Expressionsvektor pLXPCEGFP.r wurde durch Ligasierung des Fragments, welches das egfp-Gen enthielt, das aus dem Plasmid pEGFP-1 (Clontech) erhalten wurde, mit dem auf ProCon basierenden pLXPCMTV-Grundgerüst konstruiert, so wie obenstehend beschrieben (siehe Punkt II).
Das pLXPCMTV-Grundgerüst wurde mit den Restriktionsenzymen MluI und SacII aufgeschlossen, was ein 6599 bp-Fragment mit dem eliminierten MMTV U3-Bereich ergab.
Das egfp.pA-Gen einschließlich der polyA-Stelle wurde unter Anwendung des PCR-Verfahrens aus dem Plasmid pEGFP-1 isoliert. Der linke Primer (5'-ATAGTAACGCGTGGTCGCCACCATGGTGAG-3') war spezifisch für den Beginn des egfp-Gens, der auch eine neue MluI-Restriktions-Schnittstelle (unterstrichen) bildete, und der rechte Primer (5'-GCGATCCGCGGTGGACAAACCACAACTAGA-3') war spezifisch für das Ende des egfp-Gens, das auch eine neue SacII-Restriktions-Schnittstelle (unterstrichen) bildete. Eine PCR führte zu einem 978 bp-Fragment. Das Fragment wurde durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert. Das egfp-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen MluI und SacII aufgeschlossen, und die Aufschlussmischung wurde auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaex-Protokolls (Qiagen) eluiert.
320 ng des pLXPCMTV-Grundgerüsts und 80 ng des MluI/SacII-Fragments wurden vermischt und unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 14 Stunden lang bei 16°C ligasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen HpaI aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Plasmid wurde mit pLXPCEGFP.r bezeichnet.
V. ReCon-Expressionsvektor pRC1UbpshEGFP
1. Konstruktion des ReCon-Expressionsvektors pRC1UbpshEGFP, enthaltend das inverse egfp-Gen in 3'LTR und den inversen Ubiquitin-Promotor in 5'LTR
Der ReCon-Expressionsvektor pRC1UbpshEGFP wurde durch Ligasierung des Fragments, welches den Ubiquitin-Promotor enthielt, der aus dem Plasmid pTEJ-8 (Johansen et al. (1990) FEBS Lett. 267:289-294) erhalten wurde, mit dem pLXPCEGFP.r-Grundgerüst konstruiert. Zu diesem Zweck musste der Ubiquitin-Promotor zunächst subkloniert werden.
Für die Subklonierung des Ubiquitin-Promotors musste der Vektor pLPCMTV aus pLXPCMTV generiert werden, indem ein XhoI/XhoI-Fragment, das die vollständige SV40neo-Kassette enthielt, entfernt wurde. Der Vektor pLXPCMTV wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI aufgeschlossen, was ein 2266 bp- und ein 5544 bp-Fragment ergab.
Die Aufschlussmischung wurde auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das 5544 bp-Fragmentband wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
20 ng des 5544 bp-Grundgerüsts wurden unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 14 Stunden lang bei 16°C religasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen SacII, EcoRI, ScaI und SpeI aufgeschlossen. Das endgültige korrekte Zwischenplasmid wurde mit pLPCMTV bezeichnet.
Das Plasmid pTEJ-8 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und NheI aufgeschlossen. Die Aufschlussmischung wurde auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt. Das 1586 bp-Fragmentband wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert. Bei 30°C wurden mit dem Klenow-Enzym (Promega) 30 Minuten lang Nucleotide eingefügt. Nach 30-minütiger Inaktivierung des Klenow-Enzyms bei 70°C wurde das 1590 bp-Fragment durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
Der Vektor pLPCMTV wurde mit dem Restriktionsenzym PshAI aufgeschlossen, und die aufgeschlossene DNA wurde bei 50°C 60 Minuten lang mit alkalischer Phosphatase (Promega) dephosphoryliert. Nach 60-minütiger Inaktivierung der Phosphatase bei 65°C wurde die DNA durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
100 ng des pLPCMTV-Grundgerüsts und 100 ng des HindIII/NheI-Fragments wurden vermischt und unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 14 Stunden lang bei 16°C ligasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillinresistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen StuI, AvrII, BgII und SacI aufgeschlossen. Das endgültige korrekte Zwischenplasmid wurde mit pRC1psh.sub bezeichnet.
Um den aus dem Plasmid pRC1 psh.sub erhaltenen Ubiquitin-Promotor in den von ProCon abgeleiteten Expressionsvektor pLXPCEGFP.r zu klonieren, wurden beide Plasmide mit den Restriktionsenzymen SspI und BstEII aufgeschlossen, was ein 6044 bp-Grundgerüst bzw. ein 3103 bp-Fragment ergab. Die Aufschlussmischungen wurden auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt. Das 6044 bp-Grundgerüstfragment und das 3103 bp-Fragmentband wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
100 ng des pLXPCEGFP.r-Grundgerüsts und 75 ng des 3103 bp-Fragments wurden vermischt und unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 1 h lang bei Raumtemperatur ligasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen StuI und AvrII aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Plasmid wurde mit pRC1UbpshEGFP bezeichnet.
2. Produktion von retroviralen Partikeln, enthaltend das egfp-Gen und den Ubiquitin-Promotor, unter Verwendung des ReCon-Expressionsvektors pRC1UbpshEGFP
Für die Transfektion von Verpackungszelllinien (PA317) wurden 5 × 10⁵ Zellen in 6-Mulden-Schalen mit einem Durchmesser von 35 mm geimpft. Am Tag der Transfektion wurden 10 μg pRC1UbpshEGFP transfiziert, wobei das Calciumphosphat-Protokoll Cellfect Kit (Pharmacia) gemäß den Instruktionen der Herstellers verwendet wurde.
18 h nach der Transfektion wurde das Medium gewechselt, und 24 h nach der Transfektion wurde das retrovirale Partikel enthaltende Medium entfernt und für die Infektion von Ziel zellen verwendet. 48 h nach der Infektion wurde der Ubiquitin/EGFP-Transfer mittels einer FACS-Analyse der Zielzellen untersucht. Ein neues Medium wurde zu den G418-Geneticin enthaltenden, transfizierten Verpackungszellen hinzugefügt, um stabile transfizierte Zellpopulationen auszuwählen.
3. Infektion von Zielzellen mit retroviralen Partikeln, welche zu einer egfp-Genexpression führt, die nach einer Reverse Transcription durch den Ubiquitin-Promotor geregelt wird
Für die Infektion von Zielzellen (NIH/3T3) wurden 5 × 10⁵ Zellen in 10 ml Medium in Kulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm geimpft. Am Tag der Infektion wurden 2 ml des Vektorvirus enthaltenden Überstands (siehe obenstehender Punkt 2.) und 2 μl Polybren (endgültige Konzentration 8 μg/ml) zu den Zellen hinzugefügt und inkubiert. Nach 6 Stunden wurden 8 ml Kulturmedium hinzugefügt, und 24 h später wurde die EGFP-Expression mittels einer FACS-Analyse untersucht. Ein neues, G418-Geneticin enthaltendes Medium wurde zu den infizierten Zellen hinzugefügt, um stabile infizierte Zellen auszuwählen.
VI. ReCon-Expressionsvektor pRC2UbpacEGFP
1. Konstruktion des ReCon-Expressionsvektors pRC2UbpacEGFP, enthaltend das inverse egfp-Gen in 3'LTR und den inversen Ubiquitin-Promotor zwischen dem R- und dem U5-Bereich von 5'LTR
Der Vektor pRC2pacEGFP wurde konstruiert, indem zwischen dem R- und dem U5-Bereich innerhalb von 5'LTR des Expressionsvektors pLXPCEGFP.r eine einzige PacI-Restriktions-Schnittstelle eingebracht wurde.
Die PacI-Restriktions-Schnittstelle wurde unter Anwendung des PCR-Verfahrens eingebracht. Bei der ersten PCR-Reaktion (PCR 1) war der linke Primer (5'-GGCGACACGGAAATGTTGAA-3') spezifisch für den U3-Bereich und der rechte Primer (5'-GCGGGTTAATTAATCGGATGCAAACAGCAAGAG-3') spezifisch für den Beginn des U5-Bereichs, der auch die neue PacI-Restriktions-Schnittstelle (unterstrichen) bildete. Die PCR führte zu einem 936 bp-Fragment. Bei der zweiten PCR-Reaktion (PCR 2) war der linke Primer (5'-CATCCTTAATTAAGAATCGTGGTCTCGCTGTT-3') spezifisch für den Beginn des U5-Bereichs, der auch die neue PacI-Restriktions-Schnittstelle bildete, und der rechte Primer (5'-GCCTGGTTGCTGACTAATTG-3') war spezifisch für das Ende des SV40ori. Die PCR führte zu einem 1095 bp-Fragment. Die Fragmente beider PCR-Reaktionen wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel gereinigt, die DNA-Bänder wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
Der Vektor pLXPCEGFP.r wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SspI aufgeschlossen, die Fragmente von PCR 1 wurden mit den Restriktionsenzymen PacI und Ssp1 aufgeschlossen, und das Fragment von PCR 2 wurde mit den Restriktionsenzymen PacI und BamHI aufgeschlossen. Die Aufschlussmischungen wurden durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, die DNA-Bänder wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
25 ng des pLXPCEGFP.r-Grundgerüsts, 100 ng des PacI/SspI-Fragments von PCR 1 und 75 ng des BamHI/PacI-Fragments von PCR 2 wurden vermischt. Für die Ligasierung wurde die Temperatur um 1 °C pro Stunde von 10°C auf 21 °C angehoben, und danach wurde unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 5 Stunden lang bei 22°C inkubiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde unter Anwendung des CaCl₂-Verfahrens in DH5α-Bakterien (Gibco) transfiziert. Ampicillin/Kanamycinresistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen XmnI/StuI und XmnI/PacI aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Zwischenplasmid wurde mit pRC2pacEGFP bezeichnet.
Der ReCon-Expressionsvektor pRC2UbpacEGFP wurde durch Ligasierung des Fragments, welches den Ubiquitin-Promotor enthielt, der aus dem Plasmid pTEJ-8 (Johansen et al. (1990) FEBS Lett. 267:289-294) erhalten wurde, mit dem pRC2pacEGFP-Grundgerüst konstruiert.
Der Vektor pRC2pacEGFP wurde mit dem den Vektor linearisierenden Restriktionsenzym PacI aufgeschlossen, und das Plasmid pTEJ-8 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und NheI aufgeschlossen, was ein 1586 bp-Fragment ergab. Die Aufschlussmischungen wurden durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, die DNA-Bänder wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
Für eine Ligasierung glatter Enden wurden die überhängenden Nucleotidenden des pRC2pacEGFP-Grundgerüsts mit T4-Polymerase (New England BioLabs) 20 Minuten lang bei 12°C abgeschnitten. Nach 10-minütiger Inaktivierung der T4-Polymerase bei 75°C wurde die DNA durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert. Schlussendlich wurde die gereinigte DNA unter Verwendung der alkalischen Phosphatase (Promega) bei 50°C 60 Minuten lang dephosphoryliert, und die alkalische Phosphatase wurde bei 65°C 60 Minuten lang inaktiviert.
Das 1586 bp HindIII/NheI-Fragment wurde mit dem Klenow-Enzym (New England BioLabs) behandelt, um bei 30°C 30 Minuten lang Nucleotide für die Ligasierung glatter Enden einzufügen. Nach 30-minütiger Inaktivierung des Klenow-Enzyms bei 70°C wurde die DNA durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
175 ng des pRC2pacEGFP-Grundgerüsts und 75 ng des 1590 bp HindIII/NheI-Fragments wurden vermischt und unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 14 h lang bei 16°C ligasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen StuI, XhoI und AvrII aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Plasmid wurde mit pRC2UbpacEGFP bezeichnet.
2. Produktion von retroviralen Partikeln, enthaltend das egfp-Gen und den Ubiquitin-Promotor, unter Verwendung des ReCon-Expressionsvektors pRC2UbpacEGFP
Für die Transfektion von Verpackungszelllinien (PA317) wurden 5 × 10⁵ Zellen in 6-Mulden-Schalen mit einem Durchmesser von 35 mm geimpft. Am Tag der Transfektion wurden 10 μg pRC2UbpacEGFP transfiziert, wobei das Calciumphosphat-Protokoll Cellfect Kit (Pharmacia) gemäß den Instruktionen der Herstellers verwendet wurde.
18 h nach der Transfektion wurde das Medium gewechselt, und 24 h nach der Transfektion wurde das retrovirale Partikel enthaltende Medium entfernt und für die Infektion von Zielzellen verwendet. 48 h nach der Infektion wurde der Ubiquitin/EGFP-Transfer mittels einer FACS-Analyse der Zielzellen untersucht. Ein neues, G418-Geneticin enthaltendes Medium wurde zu den transfizierten Verpackungszellen hinzugefügt, um stabile transfizierte Zellpopulationen auszuwählen.
3. Infektion von Zielzellen mit retroviralen Partikeln, welche zu einer egfp-Genexpression führt, die nach einer Reverse Transcription durch den Ubiquitin-Promotor geregelt wird
Für die Infektion von Zielzellen (NIH/3T3) wurden 5 × 10⁵ Zellen in 10 ml Medium in Kulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm geimpft. Am Tag der Infektion wurden 2 ml des rekombinante retrovirale Partikel enthaltenden Überstands (siehe obenstehender Punkt 2) und 2 μl Polybren (endgültige Konzentration 8 μg/ml) zu den Zellen hinzugefügt und inkubiert. Nach 6 Stunden wurden 8 ml Kulturmedium hinzugefügt, und 24 h später wurde die EGFP-Expression mittels einer FACS-Analyse untersucht. Die Zellen wurden in Kulturmedium 1:50, 1:100 und 1:200 verdünnt und in Kulturschalen geimpft. 12 h später wurde ein neues, G418-Geneticin enthaltendes Medium hinzugefügt, um infizierte Zellklone auszuwählen.
VII. Recon-Expressionsvektor pRC2UbpacpmeEGFP
1. Konstruktion des ReCon-Expressionsvektors pRC2UbpacpmeEGFP, enthaltend das inverse egfp-Gen in 3'LTR und den inversen Ubiquitin-Promotor sowie eine zusätzliche einzige PmeI-Restriktions-Schnittstelle für einen leichteren Promotorenaustausch zwischen dem R- und dem U5-Bereich in 5'LTR
Der Vektor pRC2pacpmeEGFP wurde konstruiert, indem zwischen dem R- und dem U5-Bereich von 5'LTR des Vektors pRC2pacEGFP eine einzige PmeI-Restriktions-Schnittstelle eingebracht wurde.
Die PmeI-Restriktions-Schnittstelle wurde unter Anwendung des PCR-Verfahrens eingebracht. Bei der ersten PCR-Reaktion (PCR 1) war der linke Primer (5'-GGCGACACGGAAATGTTGAA') spezifisch für den U3-Bereich und der rechte Primer (5'-GAGCTTTGTTTAAACCCAAGGAACAGCGAGACCAC-3') spezifisch für das Zentrum des U5-Bereichs, das auch die neue PmeI-Restriktions-Schnittstelle (unterstrichen) bildete. Die PCR führte zu einem 970 bp-Fragment. Bei der zweiten PCR-Reaktion (PCR 2) war der linke Primer (5'-GAGCTTTGTTTAAACCCTTGGGAGGGTCTCCTCTG-3') spezifisch für das Zentrum des U5-Bereichs, das auch die neue PmeI-Restriktions-Schnittstelle bildete, und der rechte Primer (5'-GCCTGGTTGCTGACTAATTG-') war spezifisch für das Ende des SV40ori. Die PCR führte zu einem 1078 bp-Fragment. Die Fragmente beider PCR-Reaktionen wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel gereinigt, die DNA-Bänder wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
Der Vektor pRC2pacEGFP wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SspI aufgeschlossen, was zu einem 5711 bp-Fragment führte, das Fragment von PCR 1 wurde mit den Restriktionsenzymen PmeI und SspI aufgeschlossen, und das Fragment von PCR 2 wurde mit den Restriktionsenzymen PmeI und BamHI aufgeschlossen. Die Aufschlussmischungen wurden durch Laufen auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, die DNA-Bänder wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
25 ng des pRC2pacEGFP-Grundgerüsts, 100 ng des PmeI/SspI-Fragments von PCR 1 und 75 ng des BamHI/PmeI-Fragments von PCR 2 wurden vermischt. Für die Ligasierung wurde die Temperatur um 1 °C pro Stunde von 10°C auf 21 °C angehoben, und danach wurde unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 5 Stunden lang bei 22°C inkubiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde unter Anwendung des CaCl₂-Verfahrens in DH5α-Bakterien (Gibco) transfiziert. Ampicillin/Kanamycinresistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen XmuI/StuI und XmuI/PmeI aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Zwischenplasmid wurde mit pRC2pacpmeEGFP bezeichnet.
Der ReCon-Expressionsvektor pRC2UbpacpmeEGFP wurde durch Ligasierung des Fragments, welches den Ubiquitin-Promotor enthielt, der durch das PCR-Verfahren aus pTEJ-8 (Johansen et al. (1990) FEBS Lett. 267:289-294) erhalten wurde, mit dem pRC2pacpmeEGFP-Grundgerüst konstruiert.
Bei der PCR-Reaktion war der linke Primer (5'-GAGCCTTGTTTAAACGAGCTCGCGAAAGCTAGC-3') spezifisch für den Beginn des Ubiquitin-Promotor-Gens, der auch eine PmeI-Restriktions-Schnittstelle (unterstrichen) bildete, und der rechte Primer (5'-GCGGTTAATTAACGTCGACCTGCAGCCAAGCT-3') war spezifisch für das Ende des Ubiquitin-Promotor-Gens, das auch eine PacI-Restriktions-Schnittstelle (unterstrichen) bildete. Eine PCR führte zu einem 1647 bp-Fragment. Das Fragment wurde auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert. Das PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen PacI und PmeI aufgeschlossen, was ein 1628 bp-Fragment ergab. Die Aufschlussmischung wurde auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
Das pRC2pacpmeEGFP-Grundgerüst wurde mit den Restriktionsenzymen PacI und PmeI aufgeschlossen, was ein 7549 bp-Fragment ergab. Die Aufschlussmischung wurde auf einem 0,8 %igen Agarosegel gereinigt, das DNA-Band wurde herausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des Qiaquick-Protokolls (Qiagen) eluiert.
25 ng des pRC2pacpmeEGFP-Grundgerüsts und 100 ng des PacI/PmeI-Fragments wurden vermischt und unter Verwendung von T4-Ligase (New England BioLabs) 14 Stunden lang bei 16°C ligasiert. Die Ligase wurde bei 65°C 20 Minuten lang inaktiviert, und die DNA wurde mit einem 10-fachen Volumen an Butanol butanolgefällt. Die präzipitierte DNA wurde in Wasser resuspendiert und in DH10B-Bakterien (Gibco) elektroporiert. Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt, DNA wurde präpariert und testweise mit den Restriktionsenzymen StuI, HindIII und AvrII aufgeschlossen und sequenziert. Das endgültige korrekte Plasmid wurde mit pRC2UbpacpmeEGFP bezeichnet.
2. Produktion von retroviralen Partikeln, enthaltend das egfp-Gen und den Ubiquitin-Promotor, unter Verwendung des ReCon-Expressionsvektors pRC2UbpacpmeEGFP
Für die Transfektion von Verpackungszelllinien (PA317) wurden 5 × 10⁵ Zellen in 6-Mulden-Schalen mit einem Durchmesser von 35 mm geimpft. Am Tag der Transfektion wurden 10 μg pRC2UbpacpmeEGFP transfiziert, wobei das Calciumphosphat-Protokoll Cellfect Kit (Pharmacia) gemäß den Instruktionen der Herstellers verwendet wurde.
18 h nach der Transfektion wurde das Medium gewechselt, und 24 h nach der Transfektion wurde das retrovirale Partikel enthaltende Medium entfernt und für die Infektion von Zielzellen verwendet. 48 h nach der Infektion wurde der Ubiquitin/EGFP-Transfer mittels einer FACS-Analyse von Zielzellen untersucht. Ein neues, G418-Geneticin enthaltendes Medium wurde zu den transfizierten Verpackungszellen hinzugefügt, um stabile transfizierte Zellpopulationen auszuwählen.
3. Infektion von Zielzellen mit retroviralen Partikeln, welche zur egfp-Genexpression führt, die nach einer Reverse Transcription durch den Ubiquitin-Promotor geregelt wird
Für die Infektion von Zielzellen (NIH/3T3) wurden 5 × 10⁵ Zellen in 10 ml Medium in Kulturschalen mit einem Durchmesser von 10 cm geimpft. Am Tag der Infektion wurden 2 ml des rekombinante retrovirale Partikel enthaltenden Überstands (siehe obenstehender Punkt 2) und 2 μl Polybren (endgültige Konzentration 8 μg/ml) zu den Zellen hinzugefügt und inkubiert. Nach 6 Stunden wurden 8 ml Kulturmedium hinzugefügt, und 24 h später wurde die EGFP-Expression mittels einer FACS-Analyse untersucht. Die Zellen wurden in Kulturmedium 1:50, 1:100 und 1:200 verdünnt und in Kulturschalen geimpft. 12 h später wurde ein G418-Geneticin enthaltendes Medium zu den infizierten Zellen hinzugefügt, um stabile infizierte Zellklone auszuwählen.

Claims

Retroviraler Vektor, umfassend einen oder mehrere Promotoren, die in Antisinnausrichtung im 5' LTR-Bereich eingefügt sind, und eine oder mehrere codierende Sequenzen, die in Antisinnausrichtung im 3' LTR-Bereich eingefügt sind, wobei sowohl der Promotor als auch die codierende Sequenz solcherart eingefügt sind, dass sichergestellt wird, dass der Promotor und die codierende Sequenz während des Vorgangs der Reverse Transcription in einer Zielzelle dupliziert werden und sowohl im 3' als auch im 5' LTR-Bereich des resultierenden Provirus in einer Weise in Erscheinung treten, dass sich der Promotor stromaufwärts von der codierenden Sequenz befindet, was diesem gestattet, die Genexpression anzutreiben.
Retroviraler Vektor gemäß Anspruch 1, wobei der Promotor im U5-Bereich von 5' LTR eingefügt ist.
Retroviraler Vektor gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die codierende Sequenz im U3-Bereich von 3' LTR eingefügt ist.
Retroviraler Vektor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die codierende Sequenz heterologe DNA umfasst.
Retroviraler Vektor gemäß Anspruch 4, wobei die codierende Sequenz ausgewählt ist aus einem oder mehreren Elementen der Gruppe, bestehend aus Markergenen, therapeutischen Genen, antiviralen Genen, Antitumorgenen, Cytokin-Genen und/oder Toxin-Genen.
Retroviraler Vektor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein starker, konstitutiver Promotor ist.
Retroviraler Vektor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der retrovirale Vektor replikationsdefekt ist.
Retroviraler Vektor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der retrovirale Vektor auf einem Vektor der pLXSN-Familie basiert.
Retroviraler Vektor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der retrovirale Vektor auf einem Promotorkonversionsvektor basiert.
Rekombinantes retrovirales Vektorsystem, umfassend einen retroviralen Vektor gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1-9 als erste Komponente und eine Verpackungszelllinie, die zumindest ein retrovirales und/oder rekombinantes retrovirales Konstrukt beherbergt, welches Proteine codiert, die zum Verpacken des retroviralen Vektors notwendig sind.
Retrovirales Partikel, hergestellt durch Transfizieren einer Verpackungszelllinie eines retroviralen Vektorsystems gemäß Anspruch 10 mit dem retroviralen Vektor gemäß Anspruch 10.
Retrovirales Provirus, hergestellt durch Infektion von Zielzellen mit einem rekombinanten retroviralen Partikel gemäß Anspruch 11.
mRNA eines retroviralen Provirus gemäß Anspruch 12.
RNA eines retroviralen Vektors gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1-9.
Wirtszelle, die mit einem retroviralen Partikel gemäß Anspruch 11 infiziert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten retroviralen Partikels gemäß Anspruch 11 und/oder eines rekombinanten retroviralen Vektorsystems gemäß Anspruch 10.
In vitro-Verfahren zum Einbringen von homologen und/oder heterologen Nucleotidsequenzen in Zielzellen, umfassend das Infizieren der Zielzellen mit rekombinanten retroviralen Partikeln gemäß Anspruch 11.
Verwendung eines rekombinanten retroviralen Vektors gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1-9 und/oder eines rekombinanten retroviralen Vektorsystems gemäß Anspruch 10 und/oder eines retroviralen Partikels gemäß Anspruch 11 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Gentherapie.