DE69434022T2

DE69434022T2 - Retrovirale vektoren für die transduktion des beta-globingens, sowie derivaten der beta-ort kontrollierten region des beta-orts

Info

Publication number: DE69434022T2
Application number: DE69434022T
Authority: DE
Inventors: Philippe Leboulch; M. Irving LONDON; Dorothy Tuan
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2014-06-11
Also published as: DE69434022D1; ATE277191T1; ES2231774T3; EP0706575A1; JPH09501046A; US5631162A; CA2164953A1; EP0706575B1; WO1994029470A1

Description

Die vorliegende Erfindung stammt aus dem Gebiet der Molekulargenetik, und im einzelnen betrifft sie das Gebiet retroviraler Vektoren und Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren für die Transduktion von Derivaten des β-Globin-Gens und der β-Locus-Kontrollregion.
Hintergrund der Erfindung
β-Thalassämien und die Sichelzellenanämie sind genetische Störungen des β-Globin-Gens beim Menschen, die bei Homozygoten schwere klinische Auswirkungen haben. Derzeit stellt die allogene Knochenmarktransplantation die beste verfügbare Möglichkeit zur Heilung dieser Patienten dar. Unglücklicherweise können nur wenige von ihnen einen normalen, geeigneten Spender mit dem passenden HLA-System finden, und auch wenn ein Spender mit dem passenden HLA-System verfügbar wäre würde es bei vielen zu schweren Komplikationen bei der Knochenmarktransplantation kommen, beispielsweise zu einer Transplantat-Wirt-Abstoßungsreaktion (Parkman, R., Science 232: 1373–1378 (1986)). Aus diesen Gründen stellt die Gentherapie unter Verwendung genetisch modifizierter, autologer, totipotenter hämatopoetischer Stammzellen (THSC) eine attraktive Alternative zur allogenen Knochenmarktransplantationen dar. Da ein Gen-Targeting über eine homologe Rekombination mit THSC technisch noch nicht möglich ist, besteht die realistischste Strategie darin, eine stabile Integration eines normalen humanen β-Globin-Gens und seiner cis-wirkenden regulatorischen Elemente in das THSC-Genom zu erhalten. Das kann über einen durch Retroviren vermittelten Gentransfer erreicht werden, eine effiziente Technik des Gentransfers, die auf diese Zellen anwendbar ist (Fraser et al., Blood 76: 1071–1076 (1990)).
Gentransferexperimente haben kürzlich gezeigt, dass die proximalen cis-wirkenden Elemente des humanen β-Globin-Gens für Anwendungen in der Gentherapie nicht ausreichen, da sie nur eine sehr niedrige, von der Integrationsstelle abhängige Expression des humanen β-Globin-Transgens ermöglichen (weniger als 1 bis 5% des Verhältnisses zwischen der humanen β-Globin-mRNA und der murinen β_maj-Globin-mRNA) (Cone et al., Mol. Cell Biol. 7: 887–897 (1987), Dzierzak et al., Nature 331: 35–41 (1988), Karlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6062–6066 (1988), Miller et al., J. Virol. 62: 4337–4345 (1988), Bender et al., Mol. Cell. Biol. 9: 1426–1434 (1989)). Die Entdeckung von Haupt-Hyperempfindlichkeitsstellen (HS) weit stromaufwärts des Gen-Locus des humanen β-Globin-Gens, die die β-Locus-Kontrollregion (β-Locus Control Region, β-LCR) darstellen, hat neue Hoffnungen für eine erfolgreiche Gen-Therapie von Störungen β-Globin-Gens beim Menschen geweckt (Tuan und London, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2718–2722 (1984), Tuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6384–6388 (1985), Forrester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5439–5443 (1989), Grosveld et al., Cell 51: 975–985 (1987)). LCR-Derivate können eine erythrozytenspezifische, hohe, von der Integrationsstelle unabhängige Expression eines angeknüpften β-Globin-Gens in transgenen Mäusen und in Erythroleukämiezellen der Maus (murine erythroleukemia cells, MEL-Zellen), die eine adulte erythroide Differenzierung nachahmen, bewirken (Grosveld et al., Cell 51: 975–985 (1987)). Da die Aktivität aller HS-Stellen mittlerweile kleinen DNA-Fragmenten zugeordnet werden konnte (US-Patent Nr. 5 126 260, Curtin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7082–7086 (1989), Forrester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5439–5443 (1989), Ryan et al., Gens Dev. 3: 314–323 (1989), Tuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2554–2558 (1989), Collis et al., EMBO J. 9: 233–240 (1990), Ney et al., Gens Dev. 4: 993–1006 (1990), Philipsen et al., EMBO J. 9: 2159–2167 (1990), Talbot et al., EMBO J. 9: 2169–2178 (1990), Pruzina et al., Nucleic Acids Res. 19: 1413–1419 (1991), Walters et al., Nucleic Acids Res. 19: 5385–5393 (1991)), ist es möglich geworden, retrovirale Vektoren zu konstruieren, die β-LCR-Derivate transduzieren, die an das humane β-Globin-Gen und seine proximalen cis-wirkenden Elemente geknüpft sind (Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3386–3390 (1990), Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3107–3110 (1992)). Diese β-Globin/LCR-Retroviren haben jedoch einen niedrigen Titer, sie sind sehr instabil, wobei es nach der Transmission der Provirusstruktur zu multiplen Umlagerungen kommt, und sie bewirken eine relativ mäßige und äußerst variable Verstärkung der Expression des β-Globin-Gens in infizierten Erythroleukämiezellen der Maus (MEL-Zellen) (Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3386–3390 (1990), Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3107–3110 (1992)).
Das US-Patent Nr. 5 126 260 beschreibt gegenüber DNasel hyperempfindliche Stellen, die die β-LCR darstellen, und insbesondere identifiziert es den HS2-Enhancer in der β-LCR-Struktur. Das US-Patent Nr. 5 126 260 beansprucht auch die Verwendung von β-LCR- und HS2-Derivaten in Protokollen eines Gentransfers, einschließlich eines Retrovirus-vermittelten Gentransfers, zur Erzielung einer hohen Expression des humanen β-Globin-Gens. Das US-Patent Nr. 5 126 260 gibt jedoch keine spezifischen Verfahren an, über die eine stabile Provirustransmission von β-Globin/LCR-Retroviren erhalten werden kann.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, retrovirale Vektoren für die stabile Transduktion des β-Globin-Gens und von Derivaten der β-Locus-Kontrollregion sowie von anderen erythrozytenspezifischen Genen bereit zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es werden retrovirale Vektoren, die fähig sind, das humane β-Globin-Gen und Derivate der β-Locus-Kontrollregion (β-LCR) zu transduzieren, und die hier im folgenden als die retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren bezeichnet werden, bereit gestellt. Die retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren erfüllen die folgenden Kriterien, die für eine erfolgreiche Gentherapie erforderlich sind: (1) Stabilität der Provirustransmission, oder geringe Häufigkeit von Umlagerungen ähnlich wie bei den retroviralen Vektoren, die auf diesem Gebiet als stabil erachtet werden, nach der Infektion von Zelllinien und Knochenmarkzellen der Maus; (2) verbesserter Virustiter, wodurch eine erfolgreiche Infektion von Knochenmarkzellen ermöglicht wird, und (3) hohe Expression des transduzierten humanen β-Globin-Gens in Erythrozyten, was hier als ein Wert von über 50% des Verhältnisses der mRNA des humanen β-Globins zur mRNA des murinen β_maj-Globins auf einer Pro-Gen-Basis definiert ist, in Pools von infizierten und mit Dimethylsulfoxid induzierten (DMSO-induzierten) Erythroleukämiezellen der Maus (MEL).
Spezifische Konstrukte, die die oben genannten Kriterien erfüllen, werden detailliert weiter unten beschrieben.
Spezifische Verfahren zur Konstruktion weiterer retroviraler β-Globin/LCR-Vektoren, die diese Kriterien erfüllen, werden ebenfalls beschrieben.
Die verbesserten Vektoren sind für die Behandlung verschiedener Krankheiten, einschließlich der β-Thalassämie und der Sichelzellenanämie, nützlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung des generellen Aufbaus der erfindungsgemäßen retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren.
2A–D sind Wiedergaben einer Computeranalyse von Southern Blots, die die Provirustransmission der β-Globin/LCR-Retroviren zeigen, wobei eine Neo^R-spezifische Sonde verwendet wurde. 2A zeigt multiple Umlagerungen in Zelllinien, die mit einem β-Globin/LCR/(HS2 + HS3 + HS4)/PGK-Virus infiziert wurden. Die genomische DNA aus infizierten Zellen wurde mit Sac1 verdaut. Die Spur P stellt genomische DNA von Zellen dar, die mit einem Pool von Produzenten infiziert worden waren. Die rechten Spuren stellen genomische DNA von Zellen dar, die mit unabhängigen Produzenten-Klonen infiziert wurden. Die erwartete Position des korrekten Provirus ist durch einen Pfeil bezeichnet. Die 2B zeigt die stabile Provirustransmission in infizierten Zelllinien dar, die mit [β-Globin/LCR]^mut-Vektoren erhalten wurde. Die genomische DNA und Kontrollplasmide wurden mit Sac1 verdaut. Die linken Spuren stellen Plasmide als Größenkontrollen dar, wobei die Spur 1 [β-Globin/HS2/PGK]^mut ist; die Spur 2 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + [4 × CP2 HS4])/PGK]^mut; die Spur 3 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + HS4)/PGK]^mut; die Spur 4 ist [β-Globin/HS2/PGK/Neo^R–]^mut; die Spur 5 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + [4 × CP2 HS4])/PGK/Neo^R–]^mut; die Spur 6 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + HS4)/PGK/Neo^R–]^mut. Die rechten Spuren zeigen genomische DNA aus infizierten Zellen. Ein Pool von Produzenten wurde dazu verwendet, Zellen in den Spuren 1, 2, 3 und 4 zu infizieren, während einzelne Produzentenklone dazu verwendet wurden, die Spuren 5, 6 und 7 zu infizieren. Die Spur 1 ist [β-Globin/HS2/SV40]^mut; die Spuren 2, 5, 6 und 7 sind [β-Globin/HS2/PGK]^mut; die Spur 3 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + [4 × CP2 HS4])/PGK]^mut; und die Spur 4 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + HS4)/PGK]^mut. Eine geringfügige umgelagerte Komponente kommt in der Spur 3 vor. Die 2C zeigt einen Southern Blot, der darauf abzielte, Mikroumlagerungen innerhalb des transduzierten DNA-Inserts über einen Verdau genomischer DNAs mit Sma1 nachzuweisen, die in beiden LTRs sowie zwischen den LCR-Derivaten und der internen PGK/Neo^R-Kassette vorkommt. Die Spuren 1 bis 7 sind mit den rechten Spuren 1 bis 7 in der 2B identisch, außer dass die DNAs mit Sma1 anstelle von Sac1 verdaut wurden. Der mit „a" markierte Pfeil zeigt die korrekte Position für die Spur 1, da dort keine Sma1-Stelle stromaufwärts des SV40-Promotors vorliegt. Der mit „b" markierte Pfeil zeigt eine anormale Bande in der Spur 3, die der geringfügigen umgelagerten Form, die oben beschrieben wurde, entspricht. Der mit „c" markierte Pfeil zeigt die korrekte Provirusstruktur für Konstrukte, die den PGK-Promotor transduzieren. Die 2D zeigt die Provirustransmission nach der Knochenmarktransplantation in Mäuse. Genomische DNAs aus infizierten Milzen (13 Tage nach der Verpflanzung) und aus Zelllinien (als Kontrollen) wurden mit Sac1 verdaut. Die linken Spuren 1 und 2 enthalten Größenkontrollen, die den Spuren 1 und 3 in der 2B entsprechen. Die rechten Spuren HS2 (1, 2, 3) zeigen die Ergebnisse für drei Mäuse, denen [β-Globin/HS2/PGK]^mut, das aus einem Pool von Virusproduzenten erhalten worden war, transplantiert worden war. Die rechten Spuren Zen (1, 2, 3) zeigen die Ergebnisse für drei Mäuse, denen das Zen-Virus als Kontrolle transplantiert worden war. Die Spuren HS2 + HS3 + [4 × CP2 von HS4] (1, 2) zeigen die Ergebnisse für zwei Mäuse, denen (β-Globin/(HS2 + HS3 + [4 × CP2 HS4)/PGK]^mut aus einem Pool von Virusproduzenten transplantiert worden war.
3a–3b sind eine DNA-Sequenzanalyse von β-Globin/LCR-Konstrukten, wobei bezüglich des Vorliegens potentiell schädlicher Sequenzen, wie von 5'-Spleißstellen (5'-SS), 3'-Spleißstellen (3'-SS) und Verzweigungsstellen („Branchpoint Sites", BPS), sowie bezüglich Polyadenylierungssignalen (PolyA) gescreent wurde. Übereinstimmungen oder fehlende Übereinstimmungen mit Konsensussequenzen sind durch Großbuchstaben bzw. kleine Buchstaben gekennzeichnet. Bereiche, die über eine ortsgerichtete Mutagenese oder verwandte Verfahren mutiert wurden, sind durch einen Stern gekennzeichnet.
4a–F sind schematische Darstellungen der Schritte, die in dem Mutageneseverfahren enthalten waren, das zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Retroviruskonstrukte eingesetzt wurde. Das Nummerierungssystem entspricht demjenigen der 3a–3b und 5a–5c. Die 4a zeigt die PCR-vermittelte Deletion des Rsa1-Rsa1-Fragments von 372 bp im Intron 2. Es wurden zwei unabhängige PCR-Reaktionen durchgeführt, wobei zwei Primerpaare verwendet wurden, die mit der intragenischen EcoR1-Stelle (1908) der Rsa1-Stelle (2345), der Rsa1-Stelle (2717) bzw. der BamH1-Stelle (2820) überlappten. Zur Markierung des codierenden Bereiches des Gens für weitere Untersuchungen wurden Mutationen, durch die zwei Aminosäuren des β-Globins durch Aminosäuren des δ-Globins ersetzt wurden, in den EcoR1-Primer eingeführt. Die PCR-Produkte wurden mit EcoR1, BamH1 und Rsa1 verdaut. Eine dreifache Ligation wurde anschließend mit dem parentalen β-Globin-Vektor durchgeführt, der an EcoR1- und BamH1-Stellen geöffnet worden war. Die 4b zeigt, dass der Bereich 1665 bis 1770 durch die Ligation von vier komplementären und überlappenden Oligonucleotiden mit dem LXSN-Vektor, der an EcoR1- und Xba1-Stellen geöffnet worden war, rekonstituiert und mutiert worden war. Es wurde ein Polylinker in die Oligonucleotidsequenz aufgenommen, um die nachfolgenden Schritte der Konstruktion vorzubereiten. Nur zwei der vier Oligonucleotide waren phosphoryliert, um eine Concatemerisierung bei der Ligation zu verhindern. Das Ligationsprodukt wurde vor der Transformation mit XhoI verdaut, um das parentale Plasmid zu eliminieren. Die 4c zeigt, dass der Bereich 1770 bis 2185 durch die PCR-vermittelte Konstruktion rekonstituiert und mutiert worden war. Es wurden Punktmutationen und zusätzliche Restriktionsstellen (Mlu1 und Hind3) in die PCR-Primer eingeführt. Diese neuen Stellen ermöglichten die Ligation mit dem Vektor, der durch die in der 4b gezeigten Schritte erhalten und an Mlu1- und Hind3-Stellen geöffnet worden war. Das Ligationsprodukt wurde vor der Transformation mit BamH1 verdaut, um das parentale Plasmid zu eliminieren. Die 4d zeigt, dass der Bereich 2185 bis 3250 durch die PCR-vermittelte Konstruktion rekonstituiert und mutiert worden war, und zwar über einen Ansatz, der dem in der 4c gezeigten Schritt ähnlich war. Die verwendete Matrize enthielt die intronische Deletion von 372 bp, die bei dem in der 4a gezeigten Schritt erhalten worden war. Nach dem Schneiden des Vektors und des PCR-Fragments mit Sac1 und Nco1 erfolgte eine Ligation mit einem Vektor, der HS2, den β-Globin-Promotor und den ersten Teil des Gens enthielt. Das Ligationsprodukt wurde vor der Transformation mit Sma1 verdaut, um das parentale Plasmid zu eliminieren. Die 4e zeigt, dass das Hind3-Bgl2-Insert aus dem in der 4d gezeigten Konstrukt mit dem Rückgrat des in der 4c gezeigten, mit Hind3 und Bgl2 geöffneten Konstrukts ligiert wurde. Das Ligationsprodukt wurde vor der Transformation mit Cla1 verdaut, um parentale Plasmide und unerwünschte Formen zu eliminieren. Die 4f zeigt, dass das fertige retrovirale [β-Globin/HS2]^mut-Konstrukt durch das Ligieren eines Bgl1-Bgl2-Fragments des in der 4e gezeigten Konstrukts mit einem Bgl2-Bgl1-Fragment, das eine Enhancer/Promotor/Neo^R-Kassette und eine Pvu2-Xba1-deletierte MoMLV-LTR enthielt, erhalten wurde. Das Ligationsprodukt wurde vor der Transformation mit Apa1 verdaut, um parentale Plasmide und unerwünschte Formen zu eliminieren. Die Genauigkeit des Konstrukts wurde über eine DNA-Sequenzierung verifiziert.
5a–5c sind die DNA-Sequenz (Sequence Listing ID No. 1) des retroviral transduzierten humanen β-Globin-Gens in der C/R-Orientierung, von der Base 1665 bis 3325 gemäß dem Nummerierungssystem, das in den 3a–3b dargelegt ist. Die drei Exons, die beiden Introns und der Promotor sind angegeben. Die Rsa1-Rsa2-Deletion von 372 bp im Intron 2 ist unterstrichen. Mutierte PolyA und 3'-SS sind angegeben. Punktmutationen, die über eine Mutagenese eingeführt wurden, sind unter der Wildtyp-Sequenz gezeigt. Codons, die beibehalten oder durch entsprechende Codons des humanen δ-Globin-Gens ersetzt wurden, sind angegeben. Restriktionsstellen, die für die Mutagenese relevant sind, sind durch Kästen gekennzeichnet und nummeriert. Oligonucleotide, die für die Mutagenese verwendet wurden, sind durch Pfeile dargestellt.
6A–D sind Wiedergaben einer Computeranalyse von RNA-Protection-Assays. Die linken und rechten Spalten einer jeden Spur enthalten eine mausspezifische β-Globin-Sonde bzw. eine für den Menschen spezifische β-Globin-Sonde. Die Positionen spezifischer geschützter Fragmente sind durch kleine Buchstaben rechts von jedem Blot angegeben. Die Bande für das humane β- ist „a", die für das β_maj- der Maus ist „b" und die für das β_min- der Maus ist „c". Die linken Spuren M und H der 6A zeigen die Positionen unverdauter Sonden der Maus (M) und des Menschen (H). Die Spur 1 ist RNA, die aus einem Pool (> 100) elektroporierter (Durchschnitt von drei Kopien pro Zelle), mit G418 selektierter und mit DMSO induzierter MEL-Zellen unter Verwendung des β-Globin/HS2/PGK-Konstrukts extrahiert worden war. Die Spuren 2 bis 5 sind RNAs, die aus einem Pool (> 100) infizierter (ein Provirus pro Zelle), mit G418 selektierter und mit DMSO induzierter MEL-Zellen extrahiert worden waren, wobei die Spur 2 [β-Globin/HS2/SV40]^mut ist, die Spur 3 ist [β-Globin/HS2/PGK]^mut, die Spur 4 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + [4 × CP2 HS4])/PGK]^mut, und die Spur 5 ist [β-Globin/(HS2 + HS3 + HS4)/PGK]^mut. Die 6B ist eine Wiedergabe eines RNA-Protection-Assays unter Verwendung von RNA, die aus Zellen extrahiert worden war, die in In-vitro-Klonogenitätsassays nach der Infektion von Knochenmarkzellen der Maus mit [β-Globin/HS2/PGK]^mut erhalten worden waren. Die 6C zeigt die Wirkung heterologer Enhancer, wobei die RNA aus einem Pool (> 100) infizierter (ein Provirus pro Zelle), mit G418 selektierter und mit DMSO induzierter MEL-Zellen extrahiert worden war, und wobei die Spur 1 [β-Globin/(HS2 + [4 × 23 bp HS2])/F441 Py]^mut ist, die Spur 2 ist [β-Globin/HS2/F441 Py]^mut die Spur 3 ist [β-Globin/HS2/SV40]^mut, die Spur 4 ist [β-Globin/HS2/PGK]^mut und Spur 5 ist [β-Globin/SV40]^mut. Die 6D zeigt RNA-Protection-Assays, die darauf abzielten, die positionsabhängige Variabilität der Expression zu messen. Die Spuren 1 bis 6 zeigen RNA, die aus einzelnen Klonen infizierter (ein Provirus pro Zelle), mit G418 selektierter und mit DMSO induzierter MEL-Zellen extrahiert wurde, wobei das [β-Globin/HS2/PGK]^mut-Konstrukt verwendet wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines retroviralen Vektors für die Transduktion von β-Globin-Genen und β-LCR-Sequenzen bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen eines retroviralen Vektors in Kombination mit einem β-Globin-Gen oder einem Derivat von diesem sowie eines wirksamen Abschnitts des HS2-Enhancers der β-LCR, mit oder ohne zusätzliche(n) β-LCR-Stellen, um eine Transduktion und Expression des β-Globin-Gens oder Derivats von diesem zu erreichen, und
(b) Eliminieren über eine Mutation des A/T-reichen Abschnitts im zweiten Intron des β-Globin-Gens, der komplementären/reversen Spleiß-Signale und eines Polyadenylierungssignals im retroviralen Vektor zur Bildung eines retroviralen Vektors, der gekennzeichnet ist durch
i) die Stabilität der Provirus-Transmission nach einer Infektion von Zelllinien und von Knochenmarkzellen der Maus,
ii) einen Virustiter, der bezüglich der Erzielung einer Infektion von Knochenmarkzellen wirksam ist, und
iii) eine hohe Expression des transduzierten humanen β-Globin-Gens in Erythrozyten.

Es werden retrovirale Vektoren, die gemäß diesem Verfahren hergestellt werden und die imstande sind, Derivate des humanen β-Globin-Gens und der β-Locus-Kontrollregion (β-LCR) (die retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren) zu transduzieren, für die Behandlung von Erkrankungen wie der β-Thalassämie und der Sichelzellanämie mittels einer Gentherapie sowie Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren bereit gestellt. Diese retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren sind den derzeit verfügbaren retroviralen Vektoren insofern überlegen, als sie (1) eine stabile Provirustransmission mit einer niedrigen Häufigkeit von Umlagerungen nach der Infektion von Zelllinien und Knochenmarkzellen der Maus zeigen, (2) höhere Virustiter erzeugen, wodurch sie eine erfolgreiche Infektion von Knochenmarkzellen ermöglichen, was hier als mehr als 10⁵ G418-resistente NIH-3T3-Kolonien pro ml Virusüberstand unter Standardbedingungen definiert ist, und (3) eine hohe Expression des transduzierten humanen β-Globin-Gens in Erythrozyten hervorrufen, was hier als ein Verhältnis, auf einer pro-Gen-Basis, der mRNA des humanen β-Globins zur mRNA des murinen_maj Globins in Pools infizierter und Dimethylsulfoxid-induzierter (DMSO-induzierter) Erythroleukämiezellen der Maus (MEL-Zellen) von über 50% definiert ist.
Strukturen, von denen angenommen wird, dass sie für die Provirusinstabilität und den niedrigen Titer von retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren, die derzeit verfügbar sind, verantwortlich sind, sind nun identifiziert worden. Zu diesen Strukturen gehören ein A/T-reicher Abschnitt im zweiten Intron des humanen β-Globin-Gens und verschiedene komplementäre/reverse (C/R) Polyadenylierungssignale und Spleißstellen. Eine extensive Mutagenese des transduzierten β-Globin-Gens, die zur Elimination dieser Strukturen führt, macht die Provirustransmission nach einer Infektion von Zelllinien und Knochenmarkstammzellen der Maus stabil, erhöht den Virustiter 10-fach und stört die Expression des transduzierten β-Globin-Gens nicht nennenswert. Die hier beschriebenen optimierten retroviralen Vektoren haben die Untersuchung der Expressionseigenschaften verschiedener retroviral transduzierter β-LCR-Derivate in DMSO-induzierten MEL-Zellen und die Erzielung von Verhältnissen, auf einer pro-Gen-Basis, der mRNA des humanen β-Globins zur mRNA des murinen_maj Globins von über 50% ermöglicht. Das Problem der positionsunabhängigen Expression nach der chromosomalen Integration wurde ebenfalls bearbeitet. Der Einfluss heterologer Enhancer/Promotoren auf die Expression des retroviral transduzierten β-Globin-Gens bei einer cis-Verknüpfung mit β-LCR-Derivaten wurde ebenfalls analysiert.
Ein Retrovirus ist, so wie der Begriff hier verwendet wird, ein Tiervirus, das zur Virusfamilie der Retroviridae gehört, wobei beliebige Typen, Unterfamilien, Genera oder Tropismen eingeschlossen sind.
Retrovirale Vektoren werden allgemein bei Verma, I. M., Retroviral vectors for gene transfer, in MICROBIOLOGY-1985, American Society for Microbiology, S. 229–232, Washington, 1985, beschrieben, und diese Literaturstelle wird hier mit der entsprechenden Quellenangabe aufgenommen.
Identifizierung von DNA-Sequenzen, die für die Stabilität und den Titer von β-Globin/LCR-Retroviren schädlich sind
Die Strukturen, von denen angenommen wird, dass sie für die Provirusinstabilität und den niedrigen Titer verantwortlich sind, wurden mittels des folgenden Verfahrens identifiziert. Es wurde eine Computersuche nach DNA-Sequenzen in β-Globin-Gen- und β-LCR-Derivaten, die potentielle Ursachen für Umlagerungen des Retrovirus sein könnten, durchgeführt. Zwei allgemeine Mechanismen für eine Retrovirusinstabilität sind beschrieben worden: (1) Ein falsches Spleißen oder eine falsche Polyadenylierung, das bzw. die zu Deletionen in der viralen genomischen RNA führen, und/oder (2) Umlagerungen während der Schritte der reversen Transkription, die oft durch verschiedene Typen repetitiver Sequenzen ausgelöst werden. Es wurde deshalb eine Computersuche nach einem virtuellen Concatemer durchgeführt, das ein DNA-Segment von 5 kb repräsentierte und das, von 5' nach 3', besteht aus dem hybrid-verlängerten Verpackungssignal (Ψ+) von 814 bp, dem Fragment von 2748 bp, das das humane β-Globin-Gen und seinen Promotor in komplementärer/reverser (C/R) Orientierung enthält, dem HS2-Fragment von 374 bp in C/R-Orientierung, dem HS3-Fragment von 287 bp in direkter Orientierung, dem HS4-Fragment von 243 bp in C/R-Orientierung und dem murinen Phosphoglyceratkinase-1-Promotor (PGK-Promotor) von 583 bp in direkter Orientierung. Elemente stromaufwärts oder stromabwärts dieses Segments von 5 kb wurden nicht in diese Suche aufgenommen, da Umlagerungen in LTRs oder Markern für eine Antibiotikumresistenz (Neo^R) höchstwahrscheinlich nicht mit einer Virustransmission einer Resistenz gegen G418 kompatibel wären.
Es wurden fünf C/R AATAAA-Signale für eine Spaltung/Polyadenylierung (PolyA) identifiziert, die alle Im β-Globin-Gen lokalisiert waren, wie in den 3a–3b und 5a–5c gezeigt ist. Es wurde für die meisten von ihnen kein starkes stromabwärts liegendes PolyA-Element wie [T]n [GT]n oder YGTGTTYY nachgewiesen, außer für PolyA in der Position 1704 in der 3a, auf das neun T in einem Abschnitt von 11 bp unmittelbar stromabwärts folgen, bezüglich der Spleißsignale die Konsensus-Sequenz, die für Wirbeltiere beschrieben und von Krainer und Maniatis (1988) in Hames, B. D. und Glover, D. M. (Hrsg.), TRANSCRIPTION AND SPLICING (IRL Press, Oxford), S. 131–206) berichtet wurde:
C₃₈/A₃₉A₆₂G₇₇G₁₀₀T₁₀₀A₆₀A₇₄G₈₄T₅₀ für 5'-SS,
Y₇₇Y₇₈Y₈₁Y₈₃Y₈₉Y₈₅Y₈₂Y₈₁Y₈₆Y₉₁Y₈₇NY₉₇A₁₀₀G₁₀₀ für 3'-SS und
Y_13/16NY_16/16T_14/16R_13/16A_16/16Y_15/16 für Verzweigungsstellen (branchpoint sites, BPS), und zwar 2 bis 21 bp stromaufwärts einer vermutlichen 3'-SS. Außerdem wurden potentielle 5'-SS gemäß den folgenden fünf Klassen, die von Krainer und Maniatis, siehe oben, beschrieben wurden (1988), in Gruppen zusammengefasst: Klasse I = AGGTA, Klasse II = GTAAG, Klasse III = RGGTGAG und Klasse IV = AGGTNNGT.
Es wurden achtzehn potentielle 5'-SS mit zwei oder weniger Fehlpaarungen und zweiunddreißig potentielle 3'-SS mit drei oder weniger Fehlpaarungen identifiziert, wie in den 3a–3b und 5a–5c gezeigt ist. Bezüglich direkter Repeats wurde ein Bereich, der sehr A/T-reich war und degenerierte, in Tandemform vorliegende direkte Repeats von Motiven wie [AAAAT]n oder der Variante [AAAAN]n einschloss, im Intron 2 festgestellt, wie in den 5a–5c gezeigt ist. Drei der C/R PolyA-Stellen kommen in dieser A/T-reichen Region vor, von der auch von Miller et al., J. Virol. 62: 4337–4345 (1988) berichtet wurde, dass sie einen möglichen schädlichen Effekt auf die Vermehrung der retroviralen β-Globin-Vektoren hat. Ein weiteres ausgedehntes direktes Tandem-Repeat ATTTATATGCAGAAATATT (Sequence Listing ID No. 2) fand sich im Intron 2, wie in den 5a–5c gezeigt ist. Es wurde keine Homologie mit konstitutiven retroviralen Elementen wie Ψ+, der tRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS) oder dem LTR einschließlich des Integrationsmotivs (IN) gefunden. Es wurde keine ausgeprägte Homologie mit dem Polypurin-Bereich für die RNase-H-Spaltung der viralen genomischen RNA und die Initiation des Positiv-Strangs-„strong-stop" gefunden, auch wenn zwei Polypurin-Abschnitte im Intron 2 identifiziert wurden: GGAGAAGAAAAAAAAAGAAAG (Sequence Listing ID No. 3) und AGAAAAGAAGGGGAAAGAAAA (Sequence Listing ID No. 4), wie in den 5a–5c gezeigt ist. Es wurden keine ausgedehnten umgekehrten Repeats gefunden.
Beschreibung spezifischer retroviraler β-Globin/LCR-Konstrukte, die für die Gentherapie nützlich sind
Die allgemeine Konstruktion der erfindungsgemäßen retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren wird in der 1 beschrieben. Das β-Globin-Gen wird in umgekehrter Orientierung bezüglich der Richtung der Transkription des Provirus insertiert, um ein Spleißen der β-Globin-Introns in der viralen genomischen RNA vor der reversen Transkription zu verhindern. Alle Konstrukte in diesen Beispielen leiten sich vom LXSN-Vektor ab (Miller und Rosman, BioTechniques 7: 980–990 (1989), wobei der Inhalt dieser Arbeit mit der entsprechenden Quellenangabe hier aufgenommen wird), aber es kann jeder beliebige andere, auf einem Retrovirus basierende Vektor verwendet werden.
Zu den grundsätzlichen Merkmalen von LXSN (Dusty Miller, The Fred Hutchinson Center, Seattle, Washington) gehören von 5' nach 3': das linke LTR des Moloney Murine Sarcoma Virus (MoMSV), die tRNA-Primer-Bindungsstelle (PBS) des MoMSV, ein hybrid-verlängetes Verpackungssignal (Ψ+), das unten beschrieben wird, ein Polylinker für die DNA-Insertion, ein interner SV-Enhancer/früher Promotor, der ein Neo^R-Gen reguliert, der Polypurin-Bereich des Moloney Murine Leukemia Virus (MoMLV) und das rechte LTR des MoMLV. Ψ+ erstreckt sich in den gag-Bereich, damit Viren mit hohem Titer erzeugt werden. Um die Expression der gp85- und p65-gag-Proteine des MoMLV zu verhindern, ist das p65-gag-Startcodon dieses Vektors zu einem Stoppcodon mutiert, und der stromaufwärts liegende Teil des Vektors (linkes LTR bis zum 5'-Teil von Ψ+) ist durch homologe Sequenzen des MoMSV, der kein gp85-gag exprimiert, substituiert. Dieser Bereich enthält auch ein hybrides Intron mit der 5'-SS des MoMSV und eine kryptische 3'-SS des MoMLV.
Die 5'-Grenze des humanen β-Globin-Promotors ist die SnaB1-Stelle, die 266 bp stromaufwärts der CAP-Stelle liegt. Die 3'-Grenze wurde optimiert, indem der größte Teil der 3'-flankierenden Region des humanen β-Globin-Gens entfernt wurde. Lediglich 30 bp stromaufwärts des Gens wurden beibehalten, um eine normale Spaltung/Polyadenylierung des humanen β-Globin-Gens zu ermöglichen. Das rechte LTR wurde intakt gehalten, oder es wurde ein sich selbst inaktivierender Vektor konstruiert, indem in dem 3'-LTR vom LXSN eine Pvu2-Xbal1-Deletion von 176 bp erzeugt wurde, die für pZipNeoSV(X)1 von Cone et al., Mol. Cell. Biol. 7: 887–897 (1987) und Dzierzak et al., Nature 331: 35–41 (1988) beschrieben wurde, wobei der Inhalt dieser Arbeiten mit der entsprechenden Quellenangabe hier aufgenommen wird.
Bezüglich der LCR-Derivate enthalten alle Konstrukte ein Hind3-Xba1-Fragment von 374 bp, das den HS2-Enhancer enthält, wie im US-Patent Nr. 5 126 260, dessen Inhalt hier mit aufgenommen wird, beschrieben wird.
Zusätzlich zum HS2-Enhancer enthält ein Konstrukt ein HS3-Fragment von 287 bp, das durch eine PCR erhalten wurde, die 21 bp stromaufwärts [AGACCCT ...] des Hph1-Fnu4H1-Kerns des HS2, wie er von Philipsen et al., EMBO J. 9: 2159–2167 (1990) beschrieben wurde, begann und 41 bp stromabwärts [... CCTATAC] endete, sowie ein HS4-Fragment von 243 bp, das durch eine PCR erhalten wurde, die 27 bp stromabwärts [GGGTATA ...] der Ava1-Stelle des Sst1-Ava1-Kernfragments des HS4, das von Pruzina et al., Nucleic Acid. Res. 19: 1413–1419 (1991) beschrieben wurde, begann und an ihm endete. Ein weiteres Konstrukt enthält nur das oben beschriebene HS4-Fragment in unmittelbarer Nähe des HS2-Enhancer-Fragments ohne HS3.
Der SV40-Enhancer/frühe Promotor, der das NeoR des LXSN reguliert, wurde durch die F441-Py-Enhancer/TK-Promotor/NeoR-Kassette von PMC1neo (Stratagene, San Diegeo, Kalifornien) oder eine Phosphoglyceratkinase-Promotor (PGK-1-Promotor)/NeoR-Kassette der Maus (erhalten von Rudolf Jaenisch, The Whitehead Institute, Cambridge, Massachusetts) ersetzt. Bei einigen Konstrukten war die Kassette aus dem heterologen Enhancer/NeoR deletiert, um den Virustiter zu erhöhen, auch wenn nun keine Selektion möglich war.
Zu Selektionsmarkern, die in die retroviralen Vektoren insertiert werden können, gehören zusätzlich zum Gen für die Neomycin/G418-Resistenz ein Gen für Hygromycin-Resistenz, ein Gen für die Puromycin-Resistenz, ein Gen für Phleomycin-Resistenz, ein Dihydrofolat-Reduktase-Gen und ein Multidrug-Resistance-Gen. Zu weiteren Mackern, die verwendet werden können, gehört jedes beliebige Molekül, beispielsweise das Gen, das für die β-Galactosidase codiert, das mit einem Substrat in Wechselwirkung tritt und dadurch eine gefärbte Zelle erzeugt, oder ein Molekül, das an der Zellmembran exprimiert wird und in einem Cell-Sorting-Verfahren eingesetzt wird, zum Beispiel über die Wechselwirkung mit einem spezifischen Antikörper.
Charakteristika der Derivate des modifizierten transduzierten β-Globin-Gens und der β-LCR
Die oben genannten Modifikationen des transduzierten β-Globin-Gens und der β-LCR-Derivate verursachten einen erhöhten Virustiter, eine wiederhergestellte Stabilität der Provirustransmission in Zelllinien und Knochenmarkstammzellen, und sie beeinträchtigten die Expression des transduzierten β-Globin-Gens nicht.
Zunächst wurde versucht, die DNA-Abschnitte, die für den Titer und die Stabilität potentiell schädlich waren, und die wahrscheinlich neutral bezüglich der Expression des β-Globin-Gens waren, zu entfernen. Es wurde ein Fragment des Introns 2 von 372 bp zwischen zwei Rsa1-Stellen, die bei +580 bzw. +952 von der Cap-Stelle des humanen β-Globins lokalisiert waren, deletiert. Dieses deletierte Fragment enthält den größten Teil des A/T-reichen Abschnitts, der einer Satelliten-DNA ähnlich ist, drei der fünf potentiellen PolyA-Stellen und einen der Polypurin-Bereiche. Dieser deletierte Abschnitt ist deutlich von essentiellen intronischen Strukturen entfernt, wie der normalen 5'-SS und 3'-SS, dem Verzweigungspunkt und dem intragenischen Enhancer. Da an Rsa1-Stellen häufig geschnitten wird, erfolgte diese Deletion durch rekombinante PCR, wie in den 4a und 5a–5c gezeigt ist.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Deletion von 372 bp im Intron 2 und die Verkürzung der 3'-flankierenden Region den Virustiter der β-Globin/LCR-Konstrukte 10-fach erhöhen (Tabelle I), dass sie als solche aber nicht imstande ist, die Instabilität der Provirustransmission in Gegenwart komplexer β-LCR-Derivate, wie HS2 + HS3 + HS4, zu verhindern.
Tabelle I: Vergleich der Transmissions- und Expressionseigenschaften von β-Globin/LCR)-Retroviren
Es wurde auch eine ausgedehntere Deletion von 774 bp im Intron 2 durchgeführt, und zwar mit ähnlichen Ergebnissen. Die Sequenz dieses neuen Introns, das über eine Oligonucleotid-vermittelte Konstruktion konstruiert wurde, ist
CTGTGGGAGGAAGATAAGAGGGATGAACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACGCGTCATCA AGGGTCCCATAGACTCAC (dargestellt in komplementärer/reverser Orientierung; Basen, die substituiert oder eingeführt wurden, sind unterstrichen) (Sequence Listing ID No. 5).
Bei einem weiteren Ansatz zur Stabilisierung der Provirustransmission von retroviralen β-Globin/LCR-Vektoren wurde eine ausgedehnte ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt, um andere komplementäre/reverse potentielle SS- und PolyA-Signale zu eliminieren. Da Hinweise vorlagen, dass die meisten Umlagerungen im transduzierten β-Globin-Gen erfolgten, wurde auf potentielle SS-Stellen abgezielt, die im β-Globin-Gen selbst lokalisiert waren, und die erste Phase der Mutagenese wurden auf 3'-SS begrenzt. Bei diesem Prozess wurde darauf geachtet, keine bekannten cis-wirkenden Merkmale und codierende Bereiche zu verändern. Demgemäß wurden 7 der 10 potentiellen C/R 3'-SS, die im β-Globin-Gen lokalisiert waren, über Punktmutationen in AG zerstört, wie in den 5a–5c gezeigt ist. Im einzelnen wurden alle potentiellen 3'-SS, die eine oder zwei Fehlpaarung(en) enthielten, mutiert. Außerdem wurde eine Punktmutation in der Position 1704 des PolyA erzeugt, wie in den 3a–3b gezeigt ist, auf das eine starke stromabwärts liegende GT/T-Region folgt. Insgesamt wurden in dieser ersten Phase der Mutagenese über ein kompliziertes Konstruktionsverfahren aus mehreren Schritten, das in der 4 beschrieben, ist 20 Punktmutationen eingeführt.
Diese zusätzlichen Mutationen stellten die Stabilität der Provirustransmission in Zelllinien und Knochenmarkstammzellen wieder her, und sie beeinflussten die Expression des transduzierten β-Globin-Gens nicht. Diese optimierten β-Globin/LCR-Retroviren werden hier im Folgenden als [β-Globin/LCR]^mut bezeichnet.
Um die Provirustransmission bei einigen Konstrukten weiter zu stabilisieren, wurde das BamH1-Xho1-Fragment von 340 bp von pZiNeoSV(X)1, das die 3'-SS des Moloney MLV, die zur Erzeugung des subgenomischen „ENV"-Transkripts verwendet wurde, enthielt, in einige Konstrukte eingeführt. Dieses Fragment wirkte in Abhängigkeit vom verwendeten Konstrukt entweder neutral, nützlich oder schädlich.
Stabilität der Provirustransmission nach Infektion von Zelllinien und Knochenmarkstammzellen der Maus
Die Provirustransmission von [β-Globin/LCR]^mut-Viren wurde nach der Infektion von NIH-3T3- und MEL-Zellen mit dem Überstand von Produzenten, die mit diesen Konstrukten erzeugt worden waren, getestet. Eine Southern-Blot-Analyse genomischer DNA aus infizierten und mit G418 selektierten Zellen demonstrierte eine stabile Provirustransmission mit allen Konstrukten, sogar in Gegenwart von [HS2 + HS3 + HS4]-Derivaten und wenn die Infektion mit einem Pool von Produzenten durchgeführt wurde, wie durch die 2B gezeigt wird. Es wurde nur eine geringfügige umgelagerte Komponente (weniger als 10%) in einem Pool infizierter Zellen nachgewiesen, die mit Viren erzeugt wurden, die (HS2 + HS3 + [4 × CP2 von HS4]) enthielten. Wenn unabhängige Klone von Produzenten analysiert wurden, dann exprimierten die meisten eine nicht-umgelagerte Form. Zum Nachweis von Mikroumlagerungen, die möglicherweise dieser Analyse entgangen sein konnten, wurde genomische DNA von infizierten und mit G418 selektierten Zellen mit Sma1 verdaut, die in beiden LTRs sowie zwischen den β-LCR-Derivaten und der internen PGK/NeoR-Kassette lokalisiert ist. Die interne Sma1-Stelle war immer konserviert, was das Fehlen einer Mikrodeletion in diesem Provirusbereich bestätigte, wie in der 2C gezeigt ist. Zwar haben Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3386–3390 (1990) und Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3107–3110 (1992) berichtet, dass retrovirale β-Globin/LCR-Konstrukte dazu neigen, nach multiplen Passagen der Produzenten weitere Umlagerungen zu durchlaufen, aber es wurden keine derartigen Umlagerungen beobachtet, sogar nach mehreren Wochen kontinuierlicher Kultivierung.
Um die Stabilität der mutierten Vektoren weiter zu überprüfen wurde eine intakte rechte LTR in das [β-Globin/HS2/PGK]^mut-Konstrukt eingeführt, und es wurde eine „Ping-Pong"-Infektion durch die zweiwöchige Kokultivierung von amphotropen Ψcrip- und ecotropen Ψcre-Produzenten durchgeführt. Es wurde keine Umlagerung nach dieser Herausforderung beobachtet. Die Verpackungszellen Ψcre und Ψcrip (Danos und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464 (1988)), die von Richard Mulligan (Whitehead Institute und MIT, Cambridge, Massachusetts) zur Verfügung gestellt worden waren, wurden bei 37°C in 5% CO₂/95% Luft in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), das mit 10% Kälberserum, 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin supplementiert war, gezüchtet. Plasmid-DNAs, die für die Transfektion verwendet wurden, wurden mittels des Quiagen-Verfahrens nach dem Protokoll, das vom Hersteller (Quiagen Inc., Chatsworth, Kalifornien) mitgeliefert wurde, präpariert. Da selbst-inaktivierende Vektoren verwendet wurden, wurden die Plasmid-DNAs nach der Linearisierung des Plasmids außerhalb der Provirusstruktur (Nde1-Stelle) mittels eines Calciumphosphat-Verfahrens (5prime: 3prime Inc.) direkt in die Verpackungszellen transfiziert. Nach der Selektion mit G418 (500 mg/ml der aktiven Fraktion) (Gibco, BRL, Gaithersburg, Maryland) wurden Pools von Produzenten oder unabhängige Klone von Produzenten isoliert und vermehrt. Im Falle von „Ping-Pong"-Experimenten unter Verwendung von nicht-selbstinaktivierenden Vektoren wurden Ψcre- und Ψcrip-Produzenten gemischt und 10 Tage lang kokultiviert. Produzentenzellen wurden direkt zur Infektion über eine Kokultivierung eingesetzt, oder es wurden Viren über eine Filtration des Überstands durch ein Millipore-Filter von 0,45 μm präpariert, wie es von Danos und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464 (1988) beschrieben worden war.
Die mit diesen Vektoren erhaltenen Virustiter sind in der obigen Tabelle I dargestellt. Um zu testen, ob die [β-Globin/LCR]^mut-Vektoren imstande sind, die korrekte Provirusstruktur auf hämatopoetische Stammzellen zu übertragen, wurden Knochenmarkzellen der Maus mit einem Pool von Produzenten aus Spendermäusen, die mit 5-Fluoruracil (5-FU) behandelt worden waren, infiziert. Es wurden zwei Konstrukte ausgewählt: [β-Globin/HS2/PGK]^mut aufgrund des hohen Titers und [β-Globin/(HS2 + HS3 + [4 × CP2 von HS4])/PGK]^mut, da die geringfügige umgelagerte Komponente, die für dieses Konstrukt beobachtet worden war, eine Tendenz zur Instabilität anzeigen und eine zusätzliche Herausforderung darstellen könnte. Ein „leerer" Zen-Vektor (Titer größer als 10⁶/ml) (beschrieben von Fraser et al., Blood 76: 1071–1076 (1991)) wurde als Kontrolle verwendet. Das infizierte Knochenmark wurde für In-vitro-Klonogenitätsassays ausplattiert, um die Wirksamkeit des Gentransfers abzuschätzen, oder es wurde in letal bestrahlte syngene Mäuse transplantiert. Die Effizienz des Gentransfers wurde über den Vergleich der Zahl makroskopischer erythroider CFU-Mix-Kolonien in Gegenwart und in Abwesenheit von G418 ermittelt.
Es wurden Knochenmarkzellen aus erwachsenen männlichen (C57BL/6J × C3H/HeJ)F1-Mäusen isoliert, denen 4 Tage vorher 5-FU (150 mg/kg) intravenös injiziert worden war. Für die Infektion wurden 6 × 10⁶ Knochenmarkzellen zu 90% konfluenten, bestrahlten (15 Gy Röntgenstrahlen), virusproduzierenden Zellen in 100-mm-Petrischalen in α-Medium gegeben, das 10% FKS, 5% KS (für von Ψcre stammende Produzenten von β-Globin-Viren) oder 5% Serum von neugeborenen Kälbern (für von GP-E86 stammende Produzenten von JZenNeo-Viren), 5% konditioniertes Medium von mit Kermesbeere-Mitogen stimulierten Milzzellen, 100 ng/ml murinen Steel-Faktor (Immunex, Seattle, Washington) und 4 μg/ml Polybren^TM (Sigma, St. Louis, Missouri) enthielt. Die Kokultivierung erfolgte über zwei Tage, und zwar mit oder ohne Selektion (vor dem Test) in G418 (500 (aktive) μg/ml) für einen weiteren Tag. Die nicht-adhärenten und die adhärenten Zellen, die durch Trypsinieren gewonnen wurden, wurden für Tests auf klonogene Vorläufer oder für die Transplantation in bestrahlte (9,5 Gy ¹³⁷Cs) Empfängermäuse vereinigt. Die Empfänger der Transplantate erhielten 2 × 10⁶ vor der Infektion ermittelte Zelläquivalente intravenös appliziert, und drei Wochen später wurden sie für die Isolierung der DNA aus der Milz getötet. Für die Tests auf klonogene Vorläufer wurden die Zellen in einer Dichte von 1,5 × 10⁴ vor der Infektion ermittelte Zelläquivalente in 35-mm-Petrischalen in 1,1 ml eines Kulturmediums ausplattiert, das 0,8% Methylcellulose, 30% FKS, 1% Rinderserumalbumin, 10^–4 M β-Mercaptoethanol, 3 Einheiten/ml menschliches Erythropoietin, 2% konditioniertes Medium von mit Kermesbeere-Mitogen stimulierten Milzzellen und 10% konditioniertes Medium von mit Agar stimulierten humanen Leukozyten (Media Preparation Service, Terry Fox Laboratory, Vancouver, Kanada) mit oder ohne G418 (0,8 (aktive) μg/ml) enthielt. Nach einer Inkubation für 18 Tage wurden makroskopisch erythroide Kolonien unter Einsatz von Standardkriterien bewertet, die bei Humphries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3629–3633 (1981) beschrieben wurden. Die Platten wurden dann mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) versehen, und die Zellen wurden mittels Zentrifugation für eine nachfolgende RNA-Isolierung und -Analyse gewonnen.
Die Effizienz des Gentransfers wurde zu ungefähr 60% für den Zen-Vektor und zu ungefähr 40% für die [β-Globin/LCR]^mut-Vektoren ermittelt. Die genomische DNA aus den ganzen Milzen rekonstituierter Tiere wurde am Tag 13 nach der Transplantation präpariert. Eine anschließend durchgeführte Southern-Blot-Analyse zeigte, dass bei allen transplantierten Mäusen ein Gentransfer in hämatopoetische Stammzellen erhalten worden war, wie in der 2D gezeigt ist. Die korrekte Provirustransmission ohne eine nachweisbare Umlagerung wurde für die drei Mäuse beobachtet, die den [HS2/β-Globin/PGK]^mut-Vektor erhalten hatten. Die beiden Mäuse, die [β-Globin/(HS2 + HS3 + [4 × CP2 von HS4])/PGK]^mut erhalten hatten, zeigten unterschiedliche Verhältnisse der beiden Formen, wie nach einer Infektion von Zelllinien mit diesem Virus beobachtet wurde. Dieser Unterschied bezüglich des Verhältnisses ist basierend auf Ergebnissen, die von Lemischka et al., Cell 45: 917–927 (1986) und Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1968–1972 (1992) erhalten wurden, wahrscheinlich eine Konsequenz der Oligoklonalität der Knochenmarkrekonstitution nach der Transplantation. Es wurde keine weitere umgelagerte Form nachgewiesen.
Mutationen sind bezüglich der Expression des transduzierten β-Globin-Gens neutral
Als nächstes wurde bestimmt, ob die ausgedehnte Mutagenese für die Expression des β-Globin-Gens schädlich war. RNA-Protection-Assays mit geeigneten Sonden zeigten, dass die mutierte humane mRNA des β-Globins in infizierten MEL-Zellen richtig initiiert und gespleißt wurde, wie in der 6A gezeigt ist. Die mRNA des mutierten humanen β-Globins in Zellen, die aus In-vitro-Klonogenitätsassays nach der Infektion von Knochenmarksstammzellen der Maus erhalten wurden, erschien ebenfalls korrekt initiiert und gespleißt, wie in der 6B gezeigt ist. Weiterhin war das Ausmaß der Expression des humanen β-Globin-Transgens in DMSO-induzierten MEL-Zellen, die mit den [β-Globin/LCR]^mut-Viren infiziert worden waren, ähnlich dem Ausmaß der Genexpression, das mit nicht-mutierten β-Globin/LCR-Konstrukten, die durch Elektroporation in MEL-Zellen eingeführt worden waren, wie in der 6A gezeigt ist.
Hohe und erythroide Expression des transduzierten humanen β-Globin-Gens in infizierten und DMSO-induzierten MEL-Zellen
Um vorläufige Informationen über die Genexpression zu erhalten wurden linearisierte Plasmide, die verschiedene β-Globin/LCR-Inserts im Kontext einer Provirusstruktur enthielten, in MEL-Zellen elektroporiert. Semiadhärente (APRT-)MEL-Zellen, die von Paul-Henri Romeo (INSERM U91, Paris, Frankreich) zur Verfügung gestellt worden waren, wurden bei 37°C in 5% CO₂/95% Luft in DMEM gezüchtet, das mit 12% Pferdeserum, 4,5 μg/ml Glucose, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin supplementiert war. Die Elektroporationen wurden mit ungefähr 10⁷ MEL-Zellen/ml in DMEM und 20 μg der Plasmid-DNA, die mit Nde1 linearisiert worden war, unter Verwendung des Zellporators (BRL) mit den folgenden Einstellungen durchgeführt: niedriger Widerstand, Kapazitanz 1180 μF und im Bereich von 250–350 V. Die Infektionen von MEL-Zellen wurden mit 3 ml filtriertem Überstand von Virusproduzenten in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren^TM (Sigma, St. Louis, Missouri) wie oben beschrieben durchgeführt. Die elektroporierten oder infizierten MEL-Zellen wurden anschließend in Medium, das 500 μg/ml (aktives) G418 enthielt, ausgesät. Es wurden einzelne Kolonien oder Pools von resistenten Kolonien isoliert und vermehrt. Die MEL-Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂/95% Luft in DMEM, das mit 15% fötalem Kälberserum, 4,5 mg/ml Glucose, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2% Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, St. Louis, Missouri) supplementiert war, 5 Tage induziert. Die Gesamt-RNA wurde mittels des RNAzol-B-Verfahrens nach dem Protokoll extrahiert, das vom Hersteller mitgeliefert wurde (Biotecx Laboratories Inc., Houston, Texas). Quantitative RNA-Protection-Assays wurden mit gleichmäßig markierten RNA-Sonden durchgeführt, die in vitro mit SP6-Polymerase (Promega, Madison, Wisconsin) in Gegenwart von [α-³²P]UTP (Amersham, Arlington Heights, Illinois) transkribiert worden waren. Eine für den Menschen spezifische Sonde wurde von Tom Maniatis (Harvard University, Cambridge, Massachusetts) bereit gestellt. Das spezifische geschützte Fragment ist 350 bp lang und entspricht dem ersten und zweiten Exon der β-Globin-mRNA bis zur exonischen BamH1-Stelle. Eine für die Maus spezifische Sonde wurde so konstruiert, dass ein Fragment von 145 bp, das dem ersten Exon der β-Globin-mRNA entspricht, geschützt ist. Die ersten Exons der β_maj- und _min-Globin-Gene der Maus weisen stromabwärts des „ATG" eine ausgedehnte Homologie auf, aber sie weichen in ihrer Leader-Sequenz stark voneinander ab. Aufgrund dieses Homologiemusters und der Bedingungen in unseren RNA-Protection-Assays schützt die für die Maus spezifische Sonde auch ein Fragment von 115 bp der β_min-Globin-mRNA der Maus. Der RNA-Protection-Assay wurde durchgeführt, wie es bei Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual – 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben wird, und zwar mit den folgenden Bedingungen: 10 μg Gesamt-RNA, mehr als 5 × 10⁵ cpm einer jeden Sonde in separaten Reaktionsansätzen, Hybridisierung bei 52°C für 16 Stunden in 40 mM PIPES, pH 6,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA und 80% Formamid, Verdau mit 20 μg/ml RNase A (Sigma, St. Louis, Missouri) und 2 μg/ml RNase T1 (Sigma) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Unter diesen Bedingungen werden keine raren Fehlpaarungen wie diejenigen, die im mutierten humanen β-Globin-Gen oder zwischen homologen Bereichen der β_maj- und β_min-Globin-mRNA der Maus vorkommen, gefunden. Radioaktive Banden, die den spezifischen geschützten Fragmenten entsprachen, wurden mittels eines Phosphor-Imagers (Molecular Dynamics, Evry Cedex, Frankreich) gescannt, und/oder es wurden Autoradiogramme mit einem Ultrascan-Laserdensitometer 2202 (LKB Instruments Inc., Gaithersburg, Maryland) analysiert. Die Verhältnisse zwischen den mRNAs des humanen β-Globins und des murinen β-Globins wurden bezüglich der Zahl der Uridin-Reste in jeder Sonde (Faktor 2,5) und auf einer Pro-Gen-Basis korrigiert. Es wird zwar angenommen, dass das ursprüngliche Isolat der aneuploiden semiadhärenten (APRT-)MEL-Zellen pseudotetraploid ist (Chao et al., Cell 32: 483–493 (1983), aber eine Southern-Blot-Analyse legt nahe, dass die in dieser Untersuchung eingesetzten MEL-Zellen eher pseudodiploid bezüglich der endogenen β-Globin-Gene der Maus sind. Es wurde deshalb eine Korrektur (Faktor 2) durchgeführt, um dieses Verhältnis zu berücksichtigen: Durchschnitt von zwei β_maj- und zwei β_min-Globin-Genen und nur ein Provirus pro Zelle. Globale Berechnungen wurden wie folgt durchgeführt:
Es wurden RNA-Protection-Assays und eine Southern-Blot-Analyse mit einem Pool elektroporierter, mit G418 selektierter und DMSO-induzierter MEL-Zellen durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Experiments legen nahe, dass Derivate von [2 × HS2], [HS2 + HS3] und (HS2 + [2 × HS3]) die Expression des β-Globin-Gens nicht über die mit HS2 allein erhaltene erhöhen. Im Gegensatz dazu erhöhte offenbar der Zusatz von HS4-Derivaten zu HS2 und HS3 die Expression des β-Globin-Gens signifikant. Dementsprechend wurde die Infektionsstudie auf die folgenden β-LCR-Kombinationen beschränkt: HS2, [HS2 + [(4 × 23 bp von HS2)], [HS2 + (4 × 23 bp von HS2) + HS3], [HS2 + HS3 + HS4] und [HS2 + HS3 + (4 × CP2 von HS4)]. Diese verschiedenen β-LCR-Derivate wurden in den mutierten Vektor eingeführt, der für eine stabile Provirustransmission optimiert war. Ein Kontrollvektor, der den SV40-Enhancer ohne β-LCR enthielt, wurde ebenfalls mitgeführt. Die MEL-Zellen wurden mit dem Überstand von Produzenten unter experimentellen Bedingungen infiziert, die bis zu ein integriertes Provirus pro Zelle ergaben, und anschließend wurden sie mit G418 selektiert. Pools infizierter und selektierter MEL-Zellen mit wenigstens 10² Klonen wurden fünf Tage lang mit DMSO induziert und anschließend bezüglich der Expression humaner β-Globin mRNA und muriner β-Globin-mRNA mittels RNA-Protection-Assays analysiert. Die Verhältnisse zwischen der mRNA des transduzierten humanen β-Globins und des murinen β-Globins wurden auf einer Pro-Gen-Basis berechnet, wobei entsprechende Korrekturen vorgenommen wurden. Die Korrekturen wurden bezüglich der spezifischen Aktivität der Sonden durchgeführt und auf der Basis, dass die aneuploiden MEL-Zellen bezüglich der endogenen Gene des murinen β-Globins pseudodiploid erscheinen, während sie nach der Infektion und der Selektion mit G418 nur eine Kopie des integrierten Provirus pro Zelle enthalten. Die Zelltypspezifität der Expression wurde über eine Infektion von NIH-3T3-Zellen verifiziert: Es wurde keine Expression des transduzierten β-Globin-Gens nachgewiesen. Auch war die Expression des transduzierten humanen β-Globin-Gens in nicht-induzierten MEL-Zellen niedrig. Die mit den verschiedenen Konstrukten erhaltenen Ergebnisse sind in der 6A und der Tabelle I dargestellt.
Eine weitere Auswirkung der Mono- oder Oligoklonalität der Knochenmarkrekonstitutionen hinsichtlich von Protokollen zur Gentherapie ist die Notwendigkeit, Empfängern nur transduzierte THSC zu verpflanzen, so dass eine vollständige und anhaltende Rekonstitution mit infizierten Zellen bei 100% der transplantierten Individuen erreicht wird. Da ein signifikanter Anteil der THSC sogar mit retroviralen Vektoren mit hohem Titer nicht infiziert wird, wie von Lemischka et al., Cell 45: 917–927 (1986), Dzierzak et al., Nature 331: 35–41 (1988), Karlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6062–6066 (1988), Bender et al., Mol. Cell. Biol. 9: 1426–1434 (1984) und Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1968–1972 (1991) berichtet wurde, kann es deshalb wünschenswert sein, vor der Transplantation einen Schritt zur Selektion der infizierten Knochenmarkzellen einzufügen. Unglücklicherweise wird davon ausgegangen, dass Enhancer/Promotoren, die NeoR regulieren (z. B. LTR, SV40), in THSC reprimiert sind, wie es für andere Stammzellen beobachtet wird, beispielsweise embryonale Stammzellen (ES-Zellen), wie von Hawley et al., Plasmid 22: 120–131 (1989) berichtet wurde. Demgemäß wurden interne Enhancer/Promotoren, die in ES-Zellen nicht reprimiert sind, in die [β-Globin/LCR]^mut-Vektoren insertiert, um NeoR zu regulieren. Zu diesen Enhancern/Promotoren gehören der F441-Polyoma (F441 Py) Enhancer/Thymidinkinase (TK) Promotor und der murine Phosphoglyceratkinase-1 (PGK) Promotor. Außerdem wurde bei einigen Konstrukten die Leader-Sequenz des Tabakmosaikvirus (TMV), die ein wirkungsvoller Enhancer der Translation ist (Gallie et al., Nucleic Acids Res. 15: 3257–3273 (1987)) eingefügt.
Es wurden die Titer dieser unterschiedlichen Vektoren nach der Selektion infizierter 3T3-Zellen mit G418 verglichen. NIH-3T3-Zellen, die von Jane-Jane Chen (Harvard-MIT HST, MIT, Cambridge, Massachusetts) zur Verfügung gestellt worden waren, wurden bei 37°C in 5% CO₂/95% Luft in DMEM kultiviert, das mit 10% Kälberserum, 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin supplementiert war. Die NIH-3T3-Zellen wurden mit verschiedenen Verdünnungen des filtrierten Virusüberstands in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren^TM (Sigma, St. Louis, Missouri) infiziert, wie es von Danos und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464 (1988) beschrieben wurde. Die Zellen wurden anschließend in Medium ausgesät, das 500 μg/ml (aktives) G418 enthielt. Es wurden die resistenten Kolonien gezählt, und die Titer wurden mittels Standardberechnungen, wie sie früher beschrieben wurden (Danos und Mulligan, siehe oben, 1988), bestimmt. Die Provirustransmission wurde über eine Southern-Blot-Analyse getestet (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989), und zwar mit NeoR- und β-Globin-spezifischen Sonden und entsprechenden Kontrollen.
Es zeigte sich, dass die Titer für SV40, F441 PY/TK und F441 Py/TK/TMV ähnlich waren. Im Gegensatz dazu erhöhte PGK den Virustiter mehr als 5-fach gegenüber der ersten Gruppe (Tabelle I). Da diese heterologen Enhancer in [β-Globin/LCR]^mut-Vektoren in unmittelbarer Nähe zu LCR-Derivaten angeordnet sind, wurde auch der mögliche Einfluss, der von diesen heterologen Enhancern auf die β-LCR-Derivate bezüglich der Transkription des transduzierten β-Globin-Gens ausgeübt wird, untersucht. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass heterologe Enhancer für die Expression des β-Globins nicht neutral sind, wenn sie mit HS2 verknüpft sind. Das globale Ausmaß der Verstärkung, die durch die Kombination [HS2 + heterologe Enhancer] bereit gestellt wird, steigt in der folgenden Reihenfolge an: SV40, PGK und F441 Py/TK (6C und Tabelle I).
Die β-Globin-Expression ist teilweise unabhängig vom Ort der chromosomalen Integration
Da eine Mono- oder Oligoklonalität häufig in langfristig rekonstituierten hämatopoetischen Systemen beobachtet wird (Lemischka et al., Cell 45: 917–927 (1986), Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1968–1972 (1991)) ist es essentiell, eine Expression des transduzierten β-Globin-Gens zu erhalten, die relativ unabhängig vom Ort der chromosomalen Integration ist, so dass eine konsistente und anhaltende Expression des β-Globin-Gens erreicht wird. Grosveld et al., Cell 51: 975–985 (1987), Collis et al., EMBO J. 9: 233–240 (1990), Philipsen et al., EMBO J. 9: 2159–2167 (1990), Talbot et al., EMBO J. 9: 2169–2178 (1990) und Pruzina et al., Nucleic Acids Res. 19: 1416–1419 (1991) haben berichtet, dass alle HS-Stellen, einzeln oder assoziiert, imstande sind, in MEL-Zellen und in transgenen Mäusen eine Unabhängigkeit von der Position zu bewirken, obwohl auch eine unvollständige Unabhängigkeit von der Position von Curtin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 7082–7086 (1989), Forrester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 5439–5443 (1989), Ryan et al., Genes Dev. 3: 314–323 (1989) und Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 3386–3390 (1990) berichtet wurde. Deshalb wurde die Variabilität der Expression der β-Globin-mRNA in sechs unabhängigen MEL-Zellklonen nach der Infektion und der Selektion mit G418 getestet. [β-Globin/HS2/PGK]^mut stand im Mittelpunkt der Untersuchung, und zwar aufgrund der Annahme, dass die Unabhängigkeit von der Position durch zusätzliche HS-Fragmente erhöht würde, wenn sie mit einer isolierten HS-Stelle beobachtet wurde.
Es wurde keine vollständige Unabhängigkeit von der Position beobachtet, aber die Variation scheint relativ mäßig zu sein, wie durch die 6D und die Tabelle II gezeigt wird. Tabelle II: Variabilität der Expression des transduzierten humanen β-Globin-Gens in unabhängigen MEL-Zellklonen, die mit β-Globin/HS2/PGK infiziert wurden
Unabhängige Klone nach der Infektion und der Selektion mit G418; Werte korrigiert bezüglich der spezifischen Aktivitäten der Sonden und einer Pro-Gen-Basis (eine Proviruskopie pro Zelle in pseudodiploiden MEL-Zellen)
Behandlung von β-Globin-Erkrankungen über einen Gentransfer
Der hier beschriebene retrovirale Vektor ist für die Behandlung von β-Globin-Erkrankungen, wie von β-Thalassämien und der Sichelzellanämie, über einen Gentransfer nützlich.
Der Gentransfer wird über die Infektion autologer totipotenter hämatopoetischer Stammzellen (THSC) mit dem retroviralen Vektor mittels Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, erreicht.
Für Fachleute auf diesem Gebiet werden Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sowie retrovirale Vektoren für die Transduktion von Derivaten des humanen β-Globin-Gens und der β-Locus-Kontrollregion anhand der obigen detaillierten Beschreibung offensichtlich sein. Derartige Modifikationen und Variationen sollen im Umfang der beigefügten Ansprüche mit eingeschlossen sein.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines retroviralen Vektors für die Transduktion von β-Globin-Genen und β-LCR-Sequenzen, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines retroviralen Vektors in Kombination mit einem β-Globin-Gen oder einem Derivat von diesem sowie eines wirksamen Abschnittes des HS2-Enhancers der β-LCR, mit oder ohne zusätzliche(n) β-LCR-Stellen, um eine Transduktion und Expression des β-Globin-Gens oder Derivates von diesem zu erreichen, und (b) Eliminieren über eine Mutation des A/T-reichen Abschnittes im zweiten Intron des β-Globin-Gens, der komplementären/reversen Spleiß-Signale und eines Polyadenylierungssignals im retroviralen Vektor zur Bildung eines retroviralen Vektors, der gekennzeichnet ist durch i) die Stabilität der Provirus-Transmission nach einer Infektion von Zelllinien und von Knochenmarkszellen der Maus, ii) einen Virustiter, der bezüglich der Erzielung einer Infektion von Knochenmarkszellen wirksam ist, und iii) eine hohe Expression des transduzierten humanen β-Globin-Gens in Erythrozyten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der wirksame Virustiter bei über 10⁵ resistenten Kolonien pro ml Virusüberstand unter Standardbedingungen liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hohe Expression in Erythrozyten höher als 50% des Verhältnisses der mRNA des menschlichen β-Globins zur mRNA des β_maj-Globins der Maus ist, wie es in Dimethylsulfoxid-induzierten MEL-Zellen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der retrovirale Vektor umfasst: (a) ein linkes und ein rechtes Long Terminal Repeat (LTR), (b) eine Bindungsstelle für einen tRNA-Primer für die Initiation der Synthese des viralen Minus-Stranges-⌷strong-stop⌷ (c) eine Bindungsstelle für einen Polypurin-Track-Primer für die Initiation der Synthese des viralen Plus-Stranges-⌷strong-stop⌷ und (d) ein Verpackungssignal.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei sich das Verpackungssignal in eine gag-Region erstreckt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der retrovirale Vektor ein Spleißvektor ist, der funktionelle Spleißsignale umfasst, die zu genomischen und subgenomischen Transkripten führen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der retrovirale Vektor kein Spleißvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der retrovirale Vektor einen selektierbaren Marker enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mutationen aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Deletionen, Additionen und Substitutionen von Nucleotiden in der DNA-Sequenz des zweiten Introns des β-Globin-Gens, der komplementären Spleißsignale und der Polyadenylierungssignale des transduzierten β-Globin-Gens oder LCR.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der selektierbare Marker von einem internen Enhancer/Promotor gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der selektierbare Marker vom linken LTR gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der selektierbare Marker in einen retroviralen Spleißvektor eingefügt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der selektierbare Marker aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus dem Gen für die Resistenz gegen Neomycin/G418, einem Gen für die Resistenz gegen Hygromycin, einem Gen für die Resistenz gegen Puromycin, einem Gen für die Resistenz gegen Phleomycin, einem Gen der Dihydrofolat-Reduktase, einem Multidrug-Resistance-Gen und einem Gen für ein Enzym.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der selektierbare Marker ein Molekül ist, das mit einem Substrat unter Bildung einer gefärbten Zelle reagiert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der selektierbare Marker ein Molekül ist, das an der Zellmembran exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der selektierbare Marker das für die β-Galactosidase codierende Gen ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das rechte LTR eine Deletion in einer U3-Region aufweist, wodurch bei einer reversen Transkription ein sich selbst inaktivierender Vektor erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das β-Globin-Gen im zweiten Intron des β-Globin-Gens mutiert ist, wobei das korrekte Spleißen des Introns sowie die normale Expression des β-Globin-Transgens im Vergleich zu dem β-Globin-Gen, das das nicht-deletierte Intron 2 enthält, aufrecht erhalten bleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das transduzierte β-Globin-Gen oder β-LTR partielle Deletionen, Substitutionen, Mutationen oder Modifikationen wenigstens einer der komplementären/reversen 5⌷-Spleißstellen oder 3⌷-Spleißstellen an Verzweigungspunkt-Signalen oder Polyadenylierungssignalen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stabilität der Provirus-Transmission über ein Modifizieren der Lokalisation, der Position, der Orientierung eines beliebigen der β-LCR-Abschnitte erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein transkriptionell aktives HS2-Segment in einzelner oder duplizierter Form oder in Assoziation mit anderen β-LCR- oder heterologen Enhancer-Sequenzen inkorporiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein transkriptionell aktives HS3-Segment in einzelner oder duplizierter Form oder in Assoziation mit anderen β-LCR-Derivaten oder heterologen Enhancer-Sequenzen inkorporiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein transkriptionell aktives HS4-Segment in einzelner oder duplizierter Form oder in Assoziation mit anderen β-LCR- oder heterologen Enhancer-Sequenzen inkorporiert ist.
Retroviraler Vektor, der mittels des Verfahrens nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 23 erhalten werden kann.
Retroviraler Vektor nach Anspruch 24, wobei der wirksame Virustiter bei über 10⁵ resistenten Kolonien pro ml Virusüberstand unter Standardbedingungen liegt und die hohe Expression in Erythrozyten höher als 50% des Verhältnisses der mRNA des menschlichen β-Globins zur mRNA des β_maj-Globins der Maus ist, wie es in Dimethylsulfoxid-induzierten MEL-Zellen bestimmt wird.
Vektor nach Anspruch 24 für den Einsatz in der Medizin.
Verwendung des Vektors nach Anspruch 24 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer genetisch bedingten Erkrankung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus β-Thalassämien und der Sichelzellanämie besteht.
Vektor nach Anspruch 24 für den Einsatz beim Transduzieren des β-Globin-Gens und von β-LCR-Derivaten.
Vektor nach Anspruch 24, wobei die infizierte Zelle eine Knochenmarkszelle ist.