JPH10509027A

JPH10509027A - 抗鎌状化β−グロビン蛋白質、組成物及び鎌状赤血球疾患を治療する方法

Info

Publication number: JPH10509027A
Application number: JP8511019A
Authority: JP
Inventors: レボウルク，フィリップ; エム．ロンドン，アービング
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1998-09-08
Also published as: CA2199832C; GR3031229T3; EP0783575B1; US6051402A; ATE181361T1; DE69510356D1; US5861488A; WO1996009385A1; CA2199832A1; EP0783575A1

Abstract

(57)【要約】遺伝子治療方法及び鎌状赤血球疾患を治療するための赤血球系細胞における抗鎌状化β−グロビン蛋白質の高レベル発現のための組成物を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】抗鎌状化β−グロビン蛋白質、組成物及び鎌状赤血球疾患を治療する方法発明の背景鎌状赤血球疾患（ＳＣＤ）における赤血球の鎌状化は、緊迫した（Ｔ）脱酸素化状態におけるヘモグロビンＳ（α₂β^s ₂）の重合へと導く単一アミノ酸突然変異β６［Ｇ１ｕからＶａ１］の結果である。長い多数本の繊維が、ＳＣＤの患者の赤血球（ＲＢＣ）内に生じる。主な繊維は、対（Ｗｉｓｈｅｒ−Ｌｏｗｅ二本鎖）になっている１４の撚られた糸からなる。このβ６Ｖａ１突然変異は、この二本鎖ユニット内の他の４量体との安定な側面接触を開始するのに必要とされる。この二本鎖内で並びに二本鎖間で、多くの他のアミノ酸残基が側面及び軸方向の接触に関与するのに対して、４量体間接触には、α₂β^s ₂４量体当り唯１つの β６Ｖａ１突然変異が関係するだけである（Bunn,H.F．及びForget,B.G.(1986)H emoglobin:Molecular Genetic and Clinical Aspects，(W.B.Saunders Company ，Philadelphia 在);Bunn,H.F.(1994) in The Molecular Basis of Blood Disea ses，第二版、編者 Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis,A.,W.,Majerus,P.W.及びV armus,H.(W.B.Saunders Company，Philadelphia在)、207-256頁; Dickerson,R.E .及びGeis,I．(1983) Hemoglobin: Structure，Function,Evolution，and Patho logy (The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.,Menlo Park 在、カリフォルニア ); Schechter,A.N.,Noguchi,C.T．及びRodgers,G.P.(1987)The Molecular Bas is of Blood Diseases,編者 Stamatoyannopoulos,G.，Nienhuis,A.，W.,Leder,P .及びMajerus,P.W.(W.B.Saunders Company,Philadelphia),179-218頁）。 β^sを、他の正常のヒトβ様グロビン鎖（β^x）即ちβ−、δ−又はγ−と混合することは、同じヘモグロビン４量体内のα／βサブユニット界面での相互作用（パッキング及び側面接触）がβ様グロビン鎖間で類似しているので、対称性（ α₂β^s ₂及びα₂β^x ₂）及びハイブリッド（α₂β^sβ^x）４量体間の平衡を生じる。β６Ｖａ１突然変異を有しない対称性４量体（α₂β^x ₂）は、非常に僅かしかこれらの繊維に取り込まれない。α₂β^sβハイブリッド４量体は、４量体間接触には４量体当り１つのβ６Ｖａ１残基しか必要でなく、他の側面及び軸方向接触がトランスβサブユニットで効率的に形成されるのでヘモグロビンＳとコポリマーを形成することができる。対照的に、α₂β^sγ及びα₂β^sδハイブリッド４量体は、たとえβ^sサブユニットのβ６Ｖａ１残基を適当に整列させてもトランスδ−及びγ−グロビン鎖がＳ繊維内で重要な接触を形成することができないので取り込まれるとしても僅かである。この現象は、何故γ−及びδ−グロビンがβ−グロビンよりイン・ビトロで遥かに強力なインヒビターであるのかを説明すると考えられる。更に、これらのハイブリッド４量体の上首尾のコポリマー形成を伴わないヘモグロビンＳとの相互作用は、イン・ビボでの重合過程を遅延させ、その結果、ＲＢＣは有意の鎌状化が起きる前に肺に戻って再酸素化されることが予想される（Benesch,R.E.,Edalji,R.,Benesch,R．及びKwong,S.(1980)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA,77,5130-5134; Cheetham,R.C.,Huehns,E.R.及びRosemeye r,M.A.(1979)J.Mol.Biol.,129,45-61; Sunshine,H.R.,Hofrichter,J.及びEaton, W.A.(1979)J.Mol.Biol.,133,435-467; Bunn,H.F.及びForget,B.G.(1986)Hemoglo bin: Molecular，Genetic and Clinical Aspects,(W.B.Saunders Company,Phila delphia在); Bunn,H.F.(1994) The Molecular Basis of Blood Diseases第二版、編者Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis,A.,W.,Majerus,P.W.及びVarmus,H.(W.B .Saunders Company,Philadelphia 在)207-256頁; Dickerson,R.E.及びGeis,I.(1 983)Hemoglobin: Structure,Function,Evolution,and Pathology (The Benjamin /Cummings Publishing Company,Inc.,Menlo Park,カリフォルニア); Schechter,A.N.,No guchi,C.T. 及びRodgers,G.P.(1987)The Molecular Basis of Blood Diseases, 編者 Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis,A.,W.,Leder,P.及びMajerus,P.W.(W.B.S aunders Company,Philadelphia在)179-218頁）。 δ鎖の現実の阻害効果は、ヒトＲＢＣにおいてδ−グロビン遺伝子が常に非常に低レベルで発現されているので、未だ、イン・ビボで評価されたことはない。対照的に、イン・ビボでのγ鎖の高発現レベルと低い鎌状化傾向との間には、例えば、胎児ヘモグロビン（ＨＰＦＨ）の遺伝的永続性と関連したある種の形態のＳＣＤにおいて認められるように、強い相関がある（Bunn,H.F．及びForget,B.G .(1986) Hemoglobin: Molecular, Genetic and Clinical Aspects,(W.B.Saunder s Company,Philadelphia 在); Bunn,H.F.(1994)The Molecular Basis of Blood Diseases 第二版、編者 Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis,A.,W.,Majerus,P.W. 及びVarmus,H.(W.B.Saunders Company,Philadelphia 在)207-256頁; Dickerson, R.E.及びGeis,I.(1983)Hemoglobin: Structure,Function,Evolution,and Pathol ogy (The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.,Menlo Park,カリフォルニア); Schechter,A.N.,Noguchi,C.T．及びRodgers,G.P.(1987)The Molecular Basis of Blood Diseases,編者Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis,A.,W.,Leder,P．及び M ajerus，P.W．(W.B.Saunders Company,Philadelphia在)179-218頁）。更に、γ−グロビン遺伝子発現を部分的に抑制することが知られた薬物例えばヒドロキシウレア及びブチレート誘導体は、明らかに、ＳＣＤ患者に対して有益である。しかしながら、これらのアプローチは、決定的治療法を意味するものではなく、ヒドロキシウレアについての催奇性及び発癌性並びにブチレートについての神経毒性及び多器官損傷を含むそれらの潜在的な長期の結果に関する正当な懸念が掲げられてきた。更に、薬物で誘導されるγ−グロビンの発現は、主としてＦ細胞に限られており、その結果、非Ｆ細胞は、ＳＣＤにおいて、依然として、鎌状化し得る (Stamatoyannopoulos,G．及びNienhuis,A.,W.(1994) The Molec ular Basis of Blood Diseases,第二版、編者Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis ，A.W.，Majerus，P.W．及びVarmus，H.(W.B.Saunders Company,Philadelphia在 )107-155頁）。鎌状赤血球疾患に悩まされている患者を治療するための新しい治療方法が必要である。発明の要約一般に、この発明は、鎌状赤血球疾患に悩まされている患者を治療するための遺伝子治療法及び組成物に関係する。ここに記載の抗鎌状化グロビン蛋白質の高レベルの発現は、ヘモグロビンＳの重合を有効に邪魔することができ、それにより、鎌状赤血球疾患と関連する症状を減じ又は除去することができる。一つの面において、この発明は、少なくとも１つのアミノ酸残基が、δ−又は γ−グロビン由来の対応する残基（抗鎌状化残基）で置換されたコンホメーション的に正しいβグロビンを含む新規な抗鎌状化グロビン蛋白質を特徴とする。好適具体例において、これらのβ、δ及びγグロビンはヒトのものである。他の好適具体例において、抗鎌状化残基を、９Ｔｈｒ、１２Ａｓｎ、２２Ａ１ａ、５０Ｓｅｒ、８０Ａｓｐ、８６Ｓｅｒ、８７Ｇ１ｎ、１１６Ａｒｇ、１１７Ａｓｎ、１２５Ｇ１ｎ、１２６Ｍｅｔよりなる群から選択する。特に好適な具体例において、抗鎌状化β−グロビン蛋白質は、次の置換を有するβ−グロビンの１４６アミノ酸を含む：９Ｔｈｒ、１２Ａｓｎ、２２Ａ１ａ、５０Ｓｅｒ、８６Ｓｅｒ、８７Ｇ１ｎ、１１６Ａｒｇ及び１１７Ａｓｎ。他の面において、この発明は、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質に関係する。一具体例において、この遺伝物質は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。他の具体例において、この遺伝物質は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。更なる面において、この発明は、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質及び適当な転写制御要素を含む遺伝子構築物に関係する。第１の具体例において、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質は、ＤＮＡであり、転写制御要素は、ＤＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターである。好適具体例において、このＤＮＡポリメラーゼは、赤血球系（erythroid）細胞特異的である。特に好適な具体例において、このプロモーターは、β−グロビンプロモーター又はＨＰＦＨプロモーターである。第２の具体例において、抗鎌状化 β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質はＲＮＡであり、転写制御要素はＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターである。抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝子構築物は、更に、エンハンサー配列を含むことができる。好適具体例において、このエンハンサー配列は、ヒトβ遺伝子座制御領域のＤＮアーゼＩ過敏性部位２である。抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝子構築物は又、抗鎌状化コーディング構築物を含む赤血球系細胞を選択するためにエキソ・ビボ遺伝子治療手順において有用である選択可能マーカーをもコードする。更に別の面において、この発明は、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝子構築物を赤血球系細胞に導入して安定に維持するための要素及び抗鎌状化 β−グロビン蛋白質をコードする遺伝子構築物を含むベクターに関係する。好適な遺伝子治療ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、裸のプラスミッド、プラスミッドの脂質送達（リポソームによるものを含む）、レセプター媒介によるプラスミッドの送達（単独又はアデノウイルスキャプシドに結合したトランスファー用ＤＮＡ−ポリリジン複合体を伴う）よりなる群から選択する。特に好適なベクターはレトロウイルス要素を含む。更に別の面において、この発明は、鎌状赤血球疾患を有する患者を治療するための遺伝子治療方法に関係する。一具体例において、患者から又はドナーからの赤血球系細胞を得て、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする適当なベクターとイン・ビトロで接触させる。次いで、抗鎌状化β−グロビン蛋白質を発現している赤血球系細胞を選択して（例えば、遺伝子構築物に含ませた抗鎌状化β−グロビン蛋白質又は選択可能マーカーの発現に基づいて）、患者に注入する（例えば、移植により）。他の具体例において、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードするベクターを、直接、患者にイン・ビボにて投与する。他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から容易に明らかとなろう。図面の簡単な説明図１は、ヒトのβ−、β^s及びδ−グロビンのアミノ酸配列のアラインメントの図式表示である。［β／δ−ＳＣＩ１／ＨＳ２］レトロウイルスベクターに取り込まれなかった２つのアミノ酸残基δ１２５Ｇ１ｎ及びδ１２６Ｍｅｔを、角型括弧内に示してある［ＱＭ］。抗鎌状化残基δ８７Ｇ１ｎ及びδ２２Ａ１ａを、アスタリスク及び縦の破線により示してある。グロビン４量体中のα／βパッキング及びスライディング接触を「＋」により示し；弛緩した（Ｒ）「酸素化」又は緊迫した（Ｔ）「脱酸素化」状態においてのみ存在する接触をそれぞれＲ又はＴにより示し；ＨｂＳポリマーのＷｉｓｈｅｒ−Ｌｏｗｅ二本鎖中のβ₁ 及びβ₂側面及び軸方向接触を「＋」により示してある。図２は、［β／δ−グロビン／ＨＳ２］レトロウイルスベクターｐ＃１４７の構造の図式表示を示している。発明の詳細な説明本発明は、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質の赤血球系細胞中へのレトロウイルストランスファーが抗鎌状化β−グロビン蛋白質の高度の且つ赤血球系細胞特異的な発現を生じるという発見に基づいている。この発見に基づいて、この発明は、抗鎌状化β−グロビン蛋白質；それらの蛋白質を生成する方法；それらの蛋白質の生成に有用な構築物及びベクター；並びにそれらの構築物を、鎌状細胞疾患を治療するために、赤血球系細胞に送達する方法を特徴とする。抗鎌状化β−グロビン蛋白質 γ−及びδ−グロビン鎖は、イン・ビトロで、β鎖より一層強力な鎌状化のインヒビターであることが見出されている（Benesch,R.E.,Edalji,R.,Benesch,R. 及びKwong,S.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,5130-5134; Cheetham,R.C.,Hue hns,E.R．及びRosemeyer,M.A.(1979)J.Mol.Biol.,129,45-61; Sunshine,H.R.,Ho frichter,J.及びEaton,W.A.(1979)J.Mol.Biol.,133,435-467）。しかしながら、 γ−グロビン及びδ−グロビン遺伝子の両方は、正常の成人のＲＢＣにおいては、非常に低レベルで発現される。しかしながら、ここに記載のように、抗鎌状化特性を有する抗鎌状化β−グロビン鎖蛋白質の高い発現レベルを、β−グロビン遺伝子及びそのシス作用性要素の一般的構造を維持しているが、γ若しくはδ鎖由来の「抗鎌状化」アミノ酸残基をコードする核酸をβ−グロビン遺伝子中の対応するコドンの代りに用いる構築物の発現から得ることができる。 Nagel と同僚は、このδ及びγ鎖の抗鎌状化効果の原因を特定のアミノ酸残基に割り当てることを試みた（Nagel,R.L.,Bookchin,R.M.,Johnson,J.,Labie,D.,W ajcman,H.,Isaac-Sodeye,W.A.,Honig,G.R.,Schiliro,G.,Crookston,J.H.及び Matsutomo,K.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,76,670-672）。β鎖とδ鎖との間に殆ど違いがないこと（１４６残基中の１０）及び天然のβ／δハイブリッド鎖レポアグロビンの存在のために、Nagel と同僚は、δ鎖のイン・ビトロの抗鎌状化特性の殆どをδ２２Ａ１ａ及びδ８７Ｇ１ｎ残基に割り当てることに成功したが、δ１２Ａｓｎの更なる寄与もあり得る（Nagel,R.L.，Bookchin,R.M.,Johnso n,J.Labie,D.,Wajcman,H.,Isaac-Dodeye,W.A.,Honig,G.R.,Schiliro,G.,Crookst on,J.H.及びMatsutomo,K.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,76，670-672）。興味深いことに、β８７及びβ２２は、Ｗｉｓｈｅｒ−Ｌｏｗｅ二本鎖（β８７及び β２２について）内で、ＨｂＳ繊維中の４量体間の接触について（Bunn，H.F.及びForget,B.G.(1986) Hemoglobin: Molecular,Genetic and Clinical Aspects,( W.B.Saunders Company,Philadelphia 在）；Bunn，H.F.(1994) MolecularBasis of Blood Diseases,第二版、編者 Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis,A.,W.,Maje rus,P.W.及びVarmus,H.(W.B.Saunders Company,Philadelphia在）207-256頁; Di ckerson,R.E.及びGeis,I.(1983) Hemoglobin:Structure,Function,Evollution,a nd Pathology（The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.,カリフォルニア、Menl o Park在); Schechter,A.N.,Noguchi,C.T.及びRodgers,G.P.(1987) The Molecul ar Basis of Blood Diseases, 編者Stamatoyannopoulos,G.,Nienhuis,A.W.,Lede r,P.及びMajerus,P.W．（W.B.Saunders Company,Philadelphia 在)179-218頁）及び鎖間パッキング（β８７）（Cretegny,I．及びEdelstein,S.J.(1993)J.Mol. Biol.,230,733-738）について重要な位置を占めると考えられる（図１）。 γ及びβ鎖は、すべての１４６残基の内の３９において、異なるアミノ酸を有する。興味深いことには、β−グロビンと比べて、同じアミノ酸鎖がγ−及びδ −グロビン中の８７位に存在する（δ８７Ｇ１ｎ及びγ８７Ｇ１ｎ対β８７Ｔｈｒ）、そしてこの置換も又、γ−グロビンの抗鎌状化活性にとって重要であるようである（Nagel,R.L.,Bookchin,R.M.,Johnson,J.,Labie,D.,Wajcman,H.,Isaac- Sodeye,W.A.,Honig,G.R.,Schiliro,G.,Crookston,J.H．及びMatsutomo,K.(1979) Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,76,670-672）。しかしながら、γ８０Ａｓｐ及び他の割り当ててない残基を含む他の残基は、γ８７Ｇ１ｎと協同して最大効果を与える（Nagel,R.L.,Bookchin,R.M.,Johnson,J.,Labie,D.,Wajcman,H.,Is aac-Sodeye,W.A.,Honig,G.R.,Schiliro,G.,Crookston,J.H．及びMatsutomo,K.(1 979)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,76,670-672）。図１は、ヒトのβ−、β^s-及びδ−グロビンのアミノ酸配列アラインメントの図式表示である。β−グロビン及びδ−グロビンの公知のアミノ酸配列に基づいて、抗鎌状化グロビン蛋白質をデザインすることができる。実施例１は、次の置換を有するβ−グロビンの１４６アミノ酸を含む抗鎌状化 β−グロビン蛋白質をコードするδ−グロビン／β−グロビンハイブリッド遺伝子、β／δ−ＳＣＩ１のデザインを説明する：９Ｔｈｒ、１２Ａｓｎ、２２Ａ１ａ、５０Ｓｅｒ、８６Ｓｅｒ、８７Ｇ１ｎ、１１６Ａｒｇ及び１１７Ａｓｎ。この構築物の高い発現レベルは、成人の赤血球系細胞において達成された。ここに記載のように、発現レベルの評価は、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする他の構築物を同定するための予備アッセイを与えることができる。高い発現を示す構築物の候補の更なる評価を、例えば、鎌状赤血球疾患のトランスジェニック動物モデルにおいて行なうことができる。有効な抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする構築物の発現は、鎌状赤血球疾患を最少化し又は改善するであろう。遺伝子構築物抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質（即ち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を、公知技術を用いて合成することができる。或は、天然起源より単離し更に操作することができる（例えば、部位特異的突然変異誘発剤により）。次いで、遺伝物質及び適当な転写制御要素を含む遺伝子構築物を生成することができる。遺伝物質がＤＮＡである場合、適当な転写制御要素は、ＤＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターである。安全性の理由のために、このＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、赤血球系細胞特異的である（即ち、赤血球系細胞でのみ発現される）。公知の赤血球系細胞特異的プロモーターは、β−グロビンプロモーター又はＨＰＦＨプロモーターを含む。もし抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質がＲＮＡであるならば、適当なプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されなければならない。プロモーターに加えて、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝子構築物は、更に、エンハンサー配列を含むことができる。好適具体例において、エンハンサー配列は、ヒトのβ遺伝子座制御領域のＤＮアーゼＩ過敏性部位２である。ヒトのβ遺伝子座制御領域のＤＮアーゼＩ過敏性部位２に加えて又はそれに変えて含むことのできる他のエンハンサーは、β−グロビン遺伝子の第２イントロンである（ＢＩＶＳ２）。抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝子構築物は又、抗鎌状化コーディング構築物を含む赤血球系細胞を選択するためのエキス・ビボの遺伝子治療において有用な選択可能マーカー（例えば、ネオマイシン、メトトレキセート）をもコードすることができる。ベクター抗鎌状化β−グロビン遺伝子の調製物を、鎌状赤血球疾患（ＳＣＤ）を有する疑いのある患者又は有することが知れた患者を治療するために遺伝子をエキソ・ビボ又はイン・ビボで適当な細胞に送達するための適当なベクターに取り込ませることができる。適当な遺伝子治療用ベクターは、好ましくは、赤血球系細胞（例えば、赤血球細胞系統の幹細胞及び一層分化した細胞（例えばＢＦＵ（バースト形成単位）、ＣＦＵ（コロニー形成単位）、有核赤血球細胞及び成熟赤血球細胞）に感染させることができる。臨床治療での使用のためには、適当なベクターは又、赤血球系細胞において適当に維持され且つ安全でなければならない。本発明における使用のための適当なベクターには、レトロウイルス；アデノウイルス（Berkner,K.L.(1988)BioTechniques 6:616）；アデノ関連ウイルス(Muzyczka,N .(1992) Current Topics in Microbiology and Immunology 158:97）；裸のプラスミッド（Wolff,J.等(1988)Science 247:1465）；プラスミッドの脂質送達（リポソームによるものを含む）（Felgner,P.及びRingold,G.M.(1989)Nature 337:3 87)；レセプター媒介のプラスミッドの送達（単独(Wu,G.及びWu,C.H.(1988)J.Bi ol.Chem.263:14621）若しくはアデノウイルスキャプシドに結合したトランスファー用ＤＮＡ−ポリリジン複合体を伴うもの（Curiel，D. T.等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8850））；又は赤血球系細胞に感染させて維持することができ且つ宿主に悪影響を与えない任意の他のベクターが含まれる。抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質の送達のための好適な遺伝子治療用ベクターは、今日までに最もよく特性決定された系であり且つ唯一ヒトの遺伝子治療に使用することが承認された欠損レトロウイルスである（Miller,A .D.(1990)Blood 76:271）。レトロウイルス媒介の遺伝子トランスファーを用いる上首尾の遺伝子治療のためには、次の幾つかの要求が満たされることが必要である：(i) 安定なプロウイルス伝達；(ii)感染骨髄細胞を移植された個人の持続的再構成のための変換された赤血球系細胞の高力価及び／又は効率的選択；(iii ) 高度の位置独立的且つ赤血球系細胞特異的なβ−グロビン発現；(iv)安全性。 β−グロビン遺伝子及びβ−ＬＣＲ誘導体を形質導入するレトロウイルスベクターのデザインは、重大な技術的困難に面していた（Novak,U.,Harris,E.A.S.,F orrester,W.,Groudine,M.及びGelinas,R.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,87,33 86-3390; Chang,J.C.,Liu,D.及びKan,Y.W.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,31 07-3110; Plavec,I.,Papayannopoulou,T.,Maury,C.及びMeyer,F.(1993)Blood,81 ,1384-1392）が、安定なプロウイルス伝達及び高い赤血球系細胞特異的なβ−グロビンｍＲＮＡ発現が可能な［β−グロビン／ＬＣＲ］レトロウイルスベクターが、最近、得られた（Leboulch,P.,Huang,G.M.S.,Humphries,R.K.,Oh,Y.H.,Eave s,C.J.,Tuan,D.Y.H.及びLondon,I.M.(1994)EMBO J.,13(1994)）。図２は、［β／δ−グロビン／ＨＳ２］レトロウイルスベクターｐ＃１４７の構造の図式表示を示している。β／δＳＣＩ１レトロウイルスベクターは、５’ から３’へ：（１）モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）とその後のＬＸＳＮのハイブリッドの伸長したパッケージングシグナル、（２）ヒトβ−グロビンプロモーターにより駆動される逆ゲノム方向の変異したヒトβ−グロビン遺伝子、（３）逆ゲノム方向のヒトβ−ＬＣＲ由来のＨＳ２部位、（４）直接ゲノム方向のマウスＰＧＫ−１プロモーター、（５）Ｎｅｏ^R 遺伝子、（６）モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）のポリプリントラック（ＰＰＴ）、及び（７）改変ＭｏＭＬＶＬＴＲを含む。このβ−グロビン遺伝子を、プロウイルスの転写の向きに関して逆方向で挿入して、逆転写前のウイルスゲノムＲＮＡ上のβ−グロビンイントロンのスプライシングを阻止した。安全のため及び変換したβ−グロビンプロモーターの逆方向のための可能なアンチセンス効果の阻止のために、３’ＬＴＲ中に１７６ｂｐ［Ｐｖｕ２−Ｘｂａ１］の欠失を作ることにより自己不活性化ＬＸＳＮベクターを造った(Lebou lch,P．等(1994)）。このヒトβ−グロビンプロモーターの５’境界は、ｂ−グロビンｍＲＮＡキャップ部位の２６６ｂｐ上流のＳｎａＢ１部位である。この遺伝子の３０ｂｐ下流は、開裂／ポリアデニル化につき、保持された。ＨＳ２要素は、ヒトｂ−ＬＣＲ（２３、２４、２５、２６）からの３７４ｂｐ［Ｈｉｎｄ３ −Ｘｂａ１］ＨＳ２断片であった。［βグロビン／ＬＣＲ／ＰＧＫ］^mutレトロウイルスベクター中のヒトβ−グロビン遺伝子は又、β−グロビン遺伝子発現に対しては中立であるがプロウイルス伝達及びウイルス力価の安定性を増大させる欠失及び突然変異をも含む（Lebo ulch,P．等(1994)The EMBO Journal 13:3065-3076）。これらの改変は、（１）ヒトβ−グロビンキャップ部位から＋５８０及び＋９５２下流に位置する２つのＲｓａ１部位の間のβＩＶＳ２中の３７２ｂｐの欠失及び（２）相補的／逆（Ｃ／Ｒ）ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）及びＣ／Ｒスプライス部位（ＳＳ）の点突然変異を含む。［β／δＳＣＩ１／ＨＳ２］レトロウイルスベクターｐ＃１４７を、次のように構築した。上記のδ−グロビン遺伝子のセグメントを含むヒトδ−グロビン遺伝子の４３０ｂｐの［Ｎｃｏ１−ＢａｍＨＩ］断片を用いて、［β−グロビン／ＬＣＲ／ＰＧＫ］^mutレトロウイルスベクター中のヒトβ−グロビン遺伝子の対応する断片を置換した（図２）。この置換は、δ−グロビン遺伝子に特異的な１０コドンの内の６を導入する（Nagel と同僚により同定された「抗鎌状化」残基をコードするすべての位置を含む）。エキソンIIIにおいて、２つの更なる変化［β１１６Ｈｉｓからｄ１１６Ａｒｇ］及び［β１１７Ｈｉｓからｄ１１７Ａｓｎ］を、β−グロビン／ＬＣＲ／ＰＧＫ］^mutレトロウイルスベクター（１５）中のβＩＶＳ２の部分を欠失させるために前に使用された変異したプライマーを用いる組換えポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により導入した（図２）。Ｃ／ＲＳＳ及びポリＡは、［β−グロビン／ＬＣＲ］レトロウイルスベクター（Leboulch,P．等(1994)The EMBO Journal 13:3065-3076）における伝達されたプロウイルス構造、かかる有害な特徴の存在のためのヒトδ−グロビン遺伝子の前述の［Ｎｃｏ１−ＢａｍＨＩ］断片のＤＮＡ配列の、前に採用されたのと同じ方法論（Leboulch,P．等(1994)The EMBO Journal 13:3065-3076）を用いる再配置へと導くことができる。［AATAAA］シグナルは、見出されなかった。対照的に、幾つかの潜在的に危険なＣ／ＲＳＳが同定された。これらは、Ｃ／Ｒ方向で、それぞれ、Ｎｃｏ１部位から１１１ｂｐ、３７２ｂｐ及び３９８ｂｐ下流にある３つの３’ＳＳ［agCCTTCaCCTTAGG］、［aCTTTgCCCCACAGG］及び［agTCTTCT CCTCAGG］を含む。これらの最後の２つの３’ＳＳは又、適当な距離上流に、よく保存された分枝点シグナルをも有する。よく保存された５’ＳＳ、Ｎｃｏ１部位から６３ｂｐ下流の［CAGGTGAGC］も又、Ｃ／Ｒ方向で存在する。変異してない［β−グロビン／ＨＳ２／ＰＧＫ］レトロウイルスベクターのプロウイルス伝達は、更なるＬＣＲ誘導体がベクター（１５）に取り込まれないときに安定であったので、レトロウイルスベクターｐ＃１４７が安定か否かを測定した。プロウイルス伝達を研究するため及びウイルス力価を測定するために、ＭＥＬ及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、プールしたψｃｒｉｐ安定な生産者細胞由来の又は一時的にトランスフェクトしたＢＯＳＣ２３細胞由来のウイルス上清にさらすことにより感染させた。感染させた細胞を、続いて、Ｇ４１８を用いて選択した。プロウイルス伝達を、各ＬＴＲ中で１回だけ切断するＳａｃ１を用いるゲノムＤＮＡの制限消化後のＮｅｏ^R 特異的プローブを用いるサザーンブロットにより分析した。対応する消化されたプラスミッドを、寸法対照として用いた。サザーンブロット分析の結果は、検出される再配置を伴わず、プロウイルス伝達が安定であったことを示す。一時的にトランスフェクトしたＢＯＳＣ２３細胞から得られたウイルス力価は、レトロウイルスベクターｐ＃１４７及び［ｂ−グロビン／ＨＳ２／ＰＧＫ］^mutの両方について２×１０⁴ｃｆｕ／ｍｌであり、これらのベクターが非常に類似の伝達特性を有することを示した。［β−グロビン／ＨＳ２／ＰＧＫ］^mut手順（Leboulch,P．等(1994) The EMBO Journal 13:3065-3076 ）を用いる以前の結果に照らして、最良の独立のｐ＃１４７ψｃｒｅ生産者は、１０⁵ｃｆｕ／ｍｌより高い力価を達成することが予想される。これらのウイルス生産者の何れにおいても、β−ガラクトシダーゼ流動化アッセイを用いて、ヘルパーウイルスは、検出されなかった。成人の赤血球系分化を真似るＤＭＳＯ誘導したＭＥＬ細胞におけるβ／δ−ＳＣＩ１ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。ＭＥＬ細胞を、細胞当り最大で１つのインテグレートされたプロウイルスを与える実験条件下で、両栄養性生産者由来の上清を用いて感染させ、続いて、Ｇ４１８を用いて選択した。少なくとも１００の感染し且つ選択したＭＥＬ細胞クローンのプールを、誘導なしで、又は最終的赤血球系分化を誘導するために５日間ＤＭＳＯにさらした後に分析した。ヒト及びマウスβ−グロビンｍＲＮＡレベルを、実施例１に記載のように、マウスβ_ma _j −又はヒトδ−グロビンｍＲＮＡの何れかにおけるＤＮＡ配列に特異的なプローブを用いるＲＮＡ保護アッセイにより測定した。これらの結果は、ヒトβ／δ −−ＳＣＩ１ｍＲＮＡが感染ＭＥＬ細胞において適当に開始され且つスプライスされたことを示している。これらのｍＲＮＡの比を、適当な補正を用いて遺伝子当りで計算した。感染させ（細胞当り１つのプロウイルス）、Ｇ４１８選択し且つＤＭＳＯ誘導したＭＥＬ細胞において、ｐ＃１４７ウイルスを用いるβ／δ− ＳＣＩ１ｍＲＮＡの発現レベルは、マウスβ_maj−グロビンｍＲＮＡの８５％に達した（実施例に記載のように、遺伝子当りで補正）。遺伝子治療抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードするベクターの高い発現レベルは、それらを、鎌状赤血球疾患の症状を阻止し又は減じ又は除去するための遺伝子治療に対して有用なものにする。上記のように、抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードするベクターを赤血球系細胞に感染させることにより遺伝子治療を行なうことができる。一般に、鎌状赤血球疾患のエキス・ビボ遺伝子治療を、取り出した（例えば、無菌条件下の吸引により）患者（例えば、ヒト又は動物）の骨髄から得た赤血球系細胞において行なう。次いで、それらの骨髄細胞を、ベクターと共にインキュベートする。これらの処理した骨髄細胞を、次いで、患者に再注入する（例えば、移植により）。この手順を、抗鎌状化βグロビン蛋白質を発現する骨髄赤血球細胞の総数を増すために数回繰り返すことができる。或は、これらの赤血球系を、ドナー（即ち、レシピエント以外の互換性の源）から得て、改変し、再び移植によりレシピエントに送達することができる。或は、抗鎌状化βグロビンをコードするベクター及び製薬上許容し得るキャリアー（例えば、塩類溶液）の「有効量」を、鎌状赤血球疾患の患者に直接投与することができる。ここで用いる場合、「有効量」は、鎌状赤血球疾患と関連した症状を減じ又は除去するのに十分な量である。この有効量は、当業者により、常例的実験を用いて決定され得るものであり、治療する症状の型及び重さ、患者の体重及び／又は年齢、患者の以前の病歴及び選択した投与経路等の因子を考慮することができる。抗鎌状化βグロビン遺伝子治療用ベクターの投与の典型的様式には、皮下、静脈、腹腔、筋肉、非経口、粘膜下、経口、経皮又はその他の適当な方法が含まれる。投与の特定の様式により必要とされるのであれば、抗鎌状化 βグロビン遺伝子治療用ベクターを、それを酵素分解から保護する材料内に封入することができる。本発明を、更に、下記の実施例により説明するが、それらは、制限するものと解釈すべきではない。この出願中で引用されるすべての引用文献（参考文献、発行された特許、公開された特許出願及び同時係属中の特許出願を含む）を、本明細書中に、参考として援用する。実施例１ヒトδ−グロビン／β−グロビンハイブリッド遺伝子のレトロウイルストランスファーＤＮＡ構築レトロウイルスベクター［β−グロビン／ＬＣＲ／ＰＧＫ］^mutは、記載されている（Leboulch,P.,Huang,G.M.S.,Humphries,R.K.,Oh,Y.H.,Eaves,C.J.,Tuan, D.Y.H.及びLondon,I.M.(1994)EMBO J.,13,(1994)）。それは、Dusty Miller （Fred Hutchinson Cancer Research Center，Seattle 在）により提供されたベクターＬＸＳＮ（Miller,A.D．及びRosman,G.J.(1989) BioTechniques,7,980-99 0）からの要素、Tom Maniatis（Harvard 大学、Cambridge 在）及びOliver Smit hies（ノースカロライナ大学、Chapel Hill在）により提供されたヒトｂ−ＬＣＲ及びβ −グロビン遺伝子配列を含む。δ−グロビン遺伝子は、Oliver Smithies により提供された。マウスｂ_maj−グロビン遺伝子は、Deborah Galson（Harvardメディカルスクール、Boston 在）により提供された。マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）−１プロモーター／ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ^R）カセットは、Rudolf Jaenisch（Whitehead Institute and MIT,Cambridge 在）により提供された。すべての構築を、標準的技術（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及び Maniatis,T.(1989)Molecular cloning: ラボラトリーマニュアル第二版、Cold Springer Ha rbor Laboratory Press,米国、ニューヨーク、Cold Spring Harbor在）を用いて行なった。オリゴヌクレオチドは、ＭＩＴＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙにて合成した。組換えレトロウイルスの生成 Richard Mulligan（Whitehead Institute and MIT，Cambridge在）により提供されたパッケージング細胞株ψｃｒｅ及びψｃｒｉｐを、記載されたようにして生育させた（Danos,O.及びMulligan,R.C.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,64 60-6464）。David Pear及びDavid Baltimore（Rockefeller 大学、New York在）により提供されたパッケージング細胞株ＢＯＳＣ２３を、記載されたようにして生育させた（Paer,W.S.,Nolan,G.P.,Scott,M.L．及びBaltimore,D.(1993)Proc.N atl.Acad.Sci.,USA,90,8392-8396）。トランスフェクションに用いるプラスミッドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ手順（Qiagen,Inc．）により調製した。自己不活性化ベクターを用いたので、プラスミッドＤＮＡを、Ｙｃｒｅ及びＹｃｒｉｐ細胞についてはプロウイルス構造（Ｎｄｅ１部位）の外側でのプラスミッドの線状化の後、又はＢＯＳＣ２３細胞については線状化なしで、リン酸カルシウム手順（5p rime:3prime,Inc）を用いて、直接、パッケージング細胞中にトランスフェクトした。ウイルス上清を、ＢＯＳＣ２３細胞の一時的トランスフェクションの２日後に、記載されたように採取した（Danos,O.及びMulligan,R.C.(1988)P roc.Natl.Acad.Sci.USA,85,6460-6464）。Ｙｃｒｅ及びＹｃｒｉｐ生産者細胞のプールを、Ｇ４１８選択（５００ｍｇ／ｍｌ活性）（Gibco）により選択して拡大した。ウイルスを、記載されたようにして０．４５ｍｍミリポアフィルターを通しての上清の瀘過により調製した（Leboulch,P.,Huang,G.M.S.,Humphries，R. K.,Oh,Y.H.,Eaves,C.J.,Tuan,D.Y.H．及びLondon,I.M.(1994)EMBO J.,13,(1994) ; Danos,O.及びMulligan,R.C.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,6460-6464)。ヘルパーウイルスの検出を、記載されたようにして、ｂ−ガラクトシダーゼ流動化アッセイにより行なった（Danos,O.及びMulligan,R.C.(1988)Proc.Natl.Acad. Sci.USA,85,6460-6464）。プロウイルス伝達及びウイルス滴定ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、濾過したウイルス上清の種々の希釈物を用いて、８ｍｇ／ｍｌポリブレン（Sigma）の存在下で、記載されたようにして感染させた（Leb oulch,P.,Huang,G.M.S.,Humphries,R.K.,Oh,Y.H.,Eaves,C.J.,Tuan,D.Y.H.及びL ondon,I.M.(1994)EMBO J.,13,(1994); Danos,O．及びMulligan,R.C.(1988)Proc. Natl.Acad.Sci.USA,85,6460-6464）。続いて、細胞を、５００ｍｇ／ｍｌの活性なＧ４１８を含む培地に移した。耐性コロニーを計数し、前に記載された標準的計算により評価した（Leboulch,P.,Huang,G.M.S.,Humphries，R.K.,Oh,Y.H.,Eav es,C.J.,Tuan,D.Y.H．及びLondon,I.M.(1994)EMBO J.,13,(1994);Danos,O．及び Mulligan,R.C.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,6460-6464）。プロウイルス伝達を、感染細胞由来のＳａｃ１消化したＤＮＡの、Ｎｅｏ^R特異的プローブ及び適当なプラスミッド対照を用いるサザーンブロット分析により試験した。ＭＥＬ細胞の感染及びＲＮＡ保護アッセイ半接着性（ＡＰＲＴ−）ＭＥＬ細胞を、１２％ウマ血清、４．５ｍｇ／ｍｌグルコース、２ｍＭグルタミン、１０ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ中で、３７℃で、５％ＣＯ₂ ／９５％空気にて生育させた。ウイルス生産者由来の濾過した上清３ｍｌを用いて、８ｍｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、上記のように細胞の感染を行なった。次いで、感染細胞を、５００ｍｇ／ｍｌの活性Ｇ４１８を含む培地中で生育させた。耐性コロニーのプールを、単離して拡大した。ＭＥＬ細胞を、１５％ウシ胎児血清、４．５ｍｇ／ｍｌグルコース、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Sigma ）を補ったＤＭＥＭ中で、３７℃で、５日間、５％ＣＯ₂／９５％空気にて生育させた。全ＲＮＡを、ＲＮＡゾルＢ法（Biotecx Laboratories，Inc.）により抽出した。定量的ＲＮＡ保護アッセイを、［ａ−³ ² Ｐ］ＵＴＰ（Amersham）の存在下でＳＰ６又はＴ７ポリメラーゼ（Gibco ）を用いてイン・ビトロ転写した均一に標識されたＲＮＡプローブを用いて行なった。ＲＮＡ保護アッセイを、記載されたようにして（Leboulch,P.,Huang,G.M.S.,H umphries,R.K.,Oh,Y.H.,Eaves,C.J.,Tuan,D.Y.H.及びLondon,I.M.(1994); Sambr ook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T.(1989) Molecularcloning: ラボラトリーマニュアル第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,米国、ニューヨーク、Cold Spring Ha rbor在）、次の条件を用いて行なった：１０ｍｇの全ＲＮＡ、別々の反応物中の５×１０⁵ｃｐｍの各プローブ、５２℃で１６時間のハイブリダイゼーション［４０ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、４００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、８０％ホルムアミド中］及びその後の２０ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ（Sigma ）及び２ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＴ１（Sigma ）を用いる室温で３０分間の消化。マウスβ−グロビン及びヒトδ−グロビンプローブを含むＲＮＡ保護試料を、６％ポリアクリルアミドゲル上に載せる前に、１：２の比で合わせた。ヒトδ− グロビン特異的プローブは、ｄエキソンIIのＢａｍＨＩ部位に逆ゲノム方向でＴ７プロモーターをサブクローニングし、このテンプレートを、ｄエキソンＩ中の開始コドン「ATG」と重複するＮｃｏ１部位におけるイン・ビトロ転写前に線状化することにより構築した。特異的に保護された断片は、２１０ｂｐ長であり、このエキソンのＢａｍＨＩ部位までのｄエキソンIIの殆どに対応している。前に記載（Leboulch,P.,Huang,G.M.S.,Humphries,R.K.,Oh,Y.H.,Eaves,C.J.,Tuan,D. Y.H．及びLondon,I.M.(1994)EMBO J.,13,(1994)）されたマウス特異的プローブを、マウス内因性ｍＲＮＡ発現に対する内部対照として用いた。このプローブは、マウスｂ_maj−グロビンｍＲＮＡのエキソンＩに対応する１４５ｂｐの断片を保護する。β_maj及びβ_min−グロビンｍＲＮＡ間の広範な相同性及び我々のＲＮＡ保護アッセイの状況の故に、このマウス特異的プローブは又、ミスマッチのクラスターの開裂に際して、マウスｂ_min −グロビンｍＲＮＡの１１５ｂｐ断片をも保護する。これらの特異的に保護された断片に対応する放射性のバンドを、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Mo lecular Dynamics）を用いてスキャンした。これらのｍＲＮＡ比を、内因性マウスグロビン遺伝子について擬似二倍体であるＭＥＬ細胞において、遺伝子当りで計算した（補正因子：２）。このｍＲＮＡ比は又、各プローブにおけるウリジン残基数についても補正した（ヒトｄについては４４でありマウスｂ_majについては３３である；補正因子：１．３）。包括的計算は、下記のように行なった：同等物当業者は、ここに記載の発明の特定の具体例の多くの同等物を認識し、又は、常例的実験を用いて確認することができるであろう。かかる同等物は、後述の請求の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/16 ＡＢＹＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/14 ＡＢＹ

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１つのアミノ酸残基が対応するδ−又はγ−グロビン由来の抗鎌状化残基で置換されたコンホメーション的に正しいβグロビンをからなる抗鎌状化β−グロビン蛋白質であって、抗鎌状化残基を、９Ｔｈｒ、１２Ａｓｎ、２２Ａ１ａ、５０Ｓｅｒ、８６Ｓｅｒ、８７Ｇ１ｎ、１１６Ａｒｇ、１１７Ａｓｎ、１２５Ｇ１ｎ及び１２６Ｍｅｔよりなる群から選択する上記の抗鎌状化β−グロビン蛋白質。２．SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を有する抗鎌状化β−グロビン蛋白質。３．請求項１に記載の抗鎌状化β−グロビン蛋白質をコードする遺伝物質。４．ＤＮＡである、請求項３に記載の遺伝物質。５．ＲＮＡである、請求項３に記載の遺伝物質。６．請求項４に記載の遺伝物質及びＤＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターをコードする遺伝物質を含むＤＮＡ構築物。７．ＤＮＡポリメラーゼが赤血球系細胞特異的である、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。８．プロモーターを、βグロビンプロモーター及びＨＰＦＨプロモーターよりなる群から選択する、請求項７に記載のＤＮＡ構築物。９．エンハンサーを更に含む、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。１０．エンハンサーが、ヒトβ遺伝子座制御領域のＤＮアーゼＩ過敏性部位２及び／又はβグロビン遺伝子の第２イントロンである、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。１１．同一の又は更なるプロモーターの制御下の選択可能マーカーをコードする遺伝物質を更に含む、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。１２．請求項５に記載の遺伝物質及び赤血球系ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターをコードする遺伝物質を含むＲＮＡ構築物。１３．ＲＮＡポリメラーゼが赤血球系細胞に特異的である、請求項１２に記載のＲＮＡ構築物。１４．エンハンサーを更に含む、請求項１３に記載のＲＮＡ構築物。１５．同一の又は更なるプロモーターの制御下の選択可能マーカーをコードする遺伝物質を更に含む、請求項１４に記載のＲＮＡ構築物。１６．請求項１１に記載のＤＮＡ構築物を含み且つそのＤＮＡを赤血球系細胞に感染させて安定に維持する要素を含むベクター。１７．要素を、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、裸のウイルス、プラスミッドの脂質送達（リポソームによるものを含む）、レセプター媒介のプラスミッド送達（単独若しくはアデノウイルスキャプシドに結合したトランスファー用ＤＮＡ−ポリリジン複合体を伴うもの）よりなる群から選択する、請求項１６に記載のベクター（特に、好適なベクターは、レトロウイルスの要素を含む）。１８．ＤＮＡを赤血球系細胞に感染させて安定に維持するための要素がレトロウイルスの要素である、請求項１７に記載のベクター。１９．少なくとも１つのアミノ酸残基が対応するδ−又はγ−グロビン由来の抗鎌状化残基で置換されたコンホメーション的に正しいβグロビンを含む抗鎌状化 β−グロビンを発現する赤血球系細胞であって、抗鎌状化残基を、９Ｔｈｒ、１２Ａｓｎ、２２Ａ１ａ、５０Ｓｅｒ、８６Ｓｅｒ、８７Ｇ１ｎ、１１６Ａｒｇ、１１７Ａｓｎ、１２５Ｇ１ｎ及び１２６Ｍｅｔよりなる群から選択する、上記の赤血球系細胞。２０．幹細胞、バースト形成単位細胞、コロニー形成単位細胞、有核赤血球細胞及び成熟赤血球細胞よりなる群から選択する、請求項１９に記載の赤血球系細胞。２１．幹細胞である、請求項１９に記載の赤血球系細胞。