JPH09507839A - 胎児のための子宮内遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 胎児の子宮内遺伝子治療を行う一つの方法であって、一つの治療薬をコード化する少くとも１個の核酸配列で生体内胎児細胞を形質導入することよりなる方法。胎児細胞は治療薬をコード化する核酸配列を含む一つのウイルスベクター（レトロウイルスベクターなど）で形質導入される。ウイルスベクターは胎児に投与されるウイルス上澄みに含まれるか、もしくは胎児に投与される生産者細胞系により生成される。

Description

【発明の詳細な説明】 胎児のための子宮内遺伝子治療 この発明は遺伝子の治療に関し、とりわけ子宮内遺伝子治療に関する。より詳 細には、この発明は胎児に一つの治療薬をコード化する少なくとも１個の核酸配 列を投与することによる胎児のための生体内遺伝子治療に関する。 ある種の遺伝的代謝疾病、例えばフルラー症候群、レッシュ−ナイハン病、テ イサックス病、およびαサラセミアなどは誕生前に胎児に不可逆的損傷を起こし 得る。例えばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症などの他の遺伝的疾病を 持って生まれた乳児は生誕時は正常に見える。しかしこのような疾病はその後間 もなく徴候が現れる。前記の疾患はそれが生まれる前あるいは後に徴候が現れよ うとも、遺伝子治療が安全に子宮内で行い得たなら治療することが出来た。 カントッフ、他、血液、７３巻、４号、１０６６−１０７３ページ（１９８９ 年３月）は、交換輸血によりネオマイシン耐性（ｎｅｏ^R）遺伝子のヒツジ胎児 へのレトロウイルス媒介転移を開示する。このような方法で、血液がヒツジ胎児 から獲得され、単核細胞が収穫された。細胞は次いでｎｅｏ^R遺伝子あるいはヒ トアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のｃＤＮＡを含むレトロウイルスベクター を使って生体外で形質導入された。形質導入細胞は、次いでヒツジ胎児に再注入 された。生誕後子ヒツジは機能性ｎｅｏ^R遺伝子の存在を調べられた。解析され た１０匹の子ヒツジの内、６匹がＧ４１８耐性造血始原細胞に対し陽性であった 。１匹のヒツジは生誕後２年以上もｎｅｏ^R遺伝子を発現する血球を有していた 。 しかしこのような交換輸血方法は、遺伝子転移を実行するのに十分な血球を得 るために胎児が十分な大きさになるように、妊娠のある遅い時期まで待つ必要が あり、また胎児細胞への遺伝子転移が妊娠の初期に行われるとある種の遺伝子疾 病がより成功裡に治療される。加えて、このような方法は、胎児に損傷の危険を 増す沢山の操作を必要とする。また形質導入は、胎児からとり出された細胞にの み生じる。 従って、治療薬をコード化する遺伝子が妊娠の初期に胎児細胞に形質導入され るように胎児に遺伝子治療を提供し、胎児の幹細胞の形質導入を改善することが この発明の一つの目的である。 この発明の一つの見地に従って、胎児に生体内遺伝子治療を実行する方法が提 供される。この方法は、一つの治療薬をコード化する少くとも１個の核酸（ＤＮ ＡあるいはＲＮＡ）配列を使って生体内で胎児細胞を形質導入することよりなる 。 ここで使用される「核酸配列」という用語は、ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子を意 味し、完全あるいは部分遺伝子配列を含み、また同じくポリヌクレオチドを含む 。この用語は更に隣接するペントースの３′および５′炭素の間のリン酸ジエス テル結合により相互に連結する線形配列のデオキシリボヌクレオチドあるいはリ ボヌクレオチドを含む。 ここで使用される「治療薬」という用語は、その包括的な感 覚で使用され、治療薬、予防薬、および置換剤を含む。 この発明の方法は、卵黄嚢段階を含む妊娠のいずれの段階においても実施する ことが出来る。この方法はヒトに適用することが出来、ここで胎児がαサラセミ アの治療のために輸血を受けるのと同じ様式で超音波により胎児に誘導される針 を使ってヒト胎児は腹腔内に注射を受ける。 治療薬をコード化する核酸配列は、胎児細胞を形質導入する適切な発現ベクタ ーに含有される。このような発現ベクターは必ずしもそれに限定されないが、真 核ベクター、原核ベクター（例えば細菌ベクターなど）、およびウイルスベクタ ーを含む。 一つの実施例において、発現ベクターはウイルスベクターである。使用される ウイルスベクターは必ずしもそれに限定されないが、レトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、およびヘルペスウイ ルスベクターである。望ましくは、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター である。 望ましい実施例において、一つのパッケージング細胞系がウイルスベクターを 含む生産者細胞系を形成するために、治療薬をコード化する核酸配列を含む一つ のウイルスベクターを使って形質導入される。生産者細胞は次いで胎児に生体内 で投与され、それによって生産者細胞は胎児細胞を形質導入することの出来るウ イルス粒子を生成する。このような胎児細胞は体全体にわたり位置しており、そ れは必ずしもそれに限定されないが、骨髄細胞を含み、造血細胞を含む体細胞お よび胚細胞； 末梢血球；脳細胞を含む中枢神経系細胞；肺細胞；腎細胞；精巣細胞；卵巣細胞 ；および肝細胞を含む。 望ましい実施例において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである 。使用されるレトロウイルスベクターは、必ずしもそれに限定されないが、モロ ニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、および以下のレトロウイルス、 つまりラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、ヒト 免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどから誘導 されるベクターを含む。望ましくは、レトロウイルスベクターは感染性ではある が非複製コンピテントレトロウイルスである。しかし複製コンピテントレトロウ イルスもまた使用することが出来る。 レトロウイルスベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介遺伝子の転移を 媒介する作用薬として有用である。レトロウイルスベクターは、ウイルスの構造 遺伝子をコードする多数の配列が欠失し対象となる遺伝子により置換されるよう な形で一般には構築される。非常にしばしば構造遺伝子（すなわちｇａｇ，ｐｏ ｌ、およびｅｎｖ）は、従来周知の遺伝子技術手法を用いてレトロウイルスバッ クボーンから除去される。これは適切なエンドヌクレアーゼ、あるいはある場合 には、パッケージングシグナルの適切な部分を含む断片を生成するためのＢａｌ ３１エキソヌクレアーゼを使う消化を含む。 これらの新しい遺伝子は、いくつかの一般的方法でプロウイルスバックボーン にとり込まれてきた。もっとも簡単な構築は、レトロウイルスの構造遺伝子が単 一の遺伝子により代替さ れ、その単一遺伝子が次いで長末端反復（ＬＴＲ）内でウイルス調節配列の制御 下で転写される構築である。レトロウイルスベクターは、更に１個以上の遺伝子 を標的細胞に導入出来るように構築されている。通常このようなベクターにおい て、１個の遺伝子はウイルスＬＴＲの調節制御下にあり、一方第２遺伝子がスプ ライスドメッセージから離れて発現されるかもしくはそれ自身の内部プロモータ ーの調節下にある。 ウイルスバックボーンのウイルス成分を最小にするよう努力が払われたが、主 としてパッケージング細胞内でベクターとパッケージング欠損ヘルパーウイルス との間の組換えの機会を少なくする努力に向けられた。パッケージング欠損ヘル パーウイルスは、ベクター自身から欠失されるレトロウイルスの構造遺伝子を提 供するのに必要である。 一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、ベクターとパッケージン グシステムの間の相同性を絶対最小値にまで減少させる一連の欠失および置換を 含むＮ２ベクター（アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻：１６ ４７−１６５０ページ）に基礎を置くベンダー、他、ウイルス学ジャーナル、６ １巻：１６３９−１６４９ページ（１９８７年）で記載される一連のベクターの 一つである。これらの変化は、更にウイルスタンパク質が発現される尤度も減少 させた。これらベクターの最初であるＬＮＬ−ＸＨＣにおいて、部位指向突然変 異によりｇａｇの天然ＡＴＧ出発コドンからＴＡＧへ変更され、これによりその 点から意図しないタンパク質合成が排除された。５′から真正ｇａｇ出発までの モロ ニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）において、も一つのグリコシル化タ ンパク質（ｐＰｒ８０^gag）の発現を可能にする一つの読み取り枠が存在する。 モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）はフレームシフトおよびグリコシ ル化部位欠損を含むこの５′領域で変更を有し、それがｐＰｒ８０^gagのアミノ 末端の潜在的発現を回避する。従ってベクターＬＮＬ６が作られ、これはＬＮＬ −ＸＨＣの変更ＡＴＧおよびＭｏＭｕＳＶの５′部分双方をとり込んだ。ＬＮベ クターシリーズの５′構造は、かくしてレトロウイルス読み取り枠の発現の可能 性、およびそれに続く遺伝子形質導入標的細胞におけるウイルス抗原の生産を排 除する。パッケージング欠損ヘルパーウイルスでオーバーラップを少なくするた めの最終変更において、ミラーはＬＮベクターの３′ＬＴＲの直前にある余分の ｅｎｖ配列を排除した（ミラー、他、バイオテクニク、７巻：９８０−９９０ペ ージ、１９８９年）。 遺伝子治療に適用されるいずれの遺伝子転移システムにおいても満足されねば ならない最高の必要性は安全性である。安全性はベクターゲノム構造を感染性ベ クターの生産に利用されるパッケージングシステムと組合せることから誘導され る。ミラー、他、はレトロウイルス構造タンパク質の発現のためのｐＰＡＭ３プ ラスミド（パッケージング欠損ヘルパーゲノム）をベクターパッケージングシス テムを作るためのＬＮベクターシリーズと組合せることにより発展させたが、こ こでは組換え野生型レトロウイルスの生成は、ベクターゲノムとパッケージング 欠損ヘルパーゲノム（すなわちＬＮとｐＰＡＭ３）の間の 組換えの殆どあらゆる部位の排除を通じて最小値にまで減少される。 一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、前記記載のもの、および ベンダー、他（１９８７年）、およびミラー、他（１９８９年）に詳細に記載さ れているもののようなベクターのＬＮシリーズであるモロニーマウス白血病ウイ ルスである。このようなベクターは、マウス肉腫ウイルスから誘導されるパッケ ージングシグナルの部分、および突然変異ｇａｇ開始コドンを持つ。ここで使用 される「突然変異」という用語は、ｇａｇ開始コドンが欠失あるいは変更され、 ｇａｇタンパク質あるいは断片もしくはその切形が発現されないことを意味する 。 も一つの実施例において、レトロウイルスベクターは、少くとも４個のクロー ニング、あるいは制限酵素認識部位を持ち、ここで少くとも２個の部位は１０， ０００塩基対で１個以下の真核遺伝子の出現頻度を持ち、つまり制限産物は少く とも１０，０００塩基対の平均ＤＮＡサイズを持っている。望ましいクローニン グ部位は、ＮｏｔＩ，ＳｎａＢＩ，ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループ から選択される。望ましい実施例において、レトロウイルスベクターはこれらク ローニング部位のそれぞれを含む。このようなベクターは更に１９９２年７月２ ３日受理されたアメリカ合衆国特許出願番号９１９，０６２号で説明されている 。 このようなクローニング部位を含むレトロウイルスベクターが使用される場合 には、更にシャトルクローニングベクターが 提供され、このベクターはレトロウイルスベクターに局在するＮｏｔＩ，Ｓｎａ ＢＩ，ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩよりなるグループから選択される少くとも２個 のクローニング部位と適合する少くとも２個のクローニング部位を含む。シャト ルクローニングベクターは、更にシャトルクローニングベクターからレトロウイ ルスベクターに転移することの出来る少くとも１個の望ましい遺伝子を含む。 シャトルクローニングベクターは、クローニングあるいは制限酵素認識部位を 含む１個乃至それ以上のリンカーに連結される基本「バックボーン」ベクターあ るいは断片から構築される。クローニング部位に含まれるものは、前記の適合性 、あるいは相補性クローニング部位である。シャトルベクターの制限部位に対応 する末端を持つ遺伝子、およびもしくはプロモーターは、従来既知の手法を通じ てシャトルベクターに連結される。 シャトルクローニングベクターは原核システムのＤＮＡ配列を増幅するために 使用することが出来る。シャトルクローニングベクターは、原核システムおよび とりわけ細菌で一般に使用されるプラスミドから調製される。かくして例えば、 シャトルクローニングベクターは、ｐＢＲ３２２；ｐＵＣ１８などのプラスミド から誘導される。 ベクターは１個以上のプロモーターを含む。使用される適切なプロモーターは 必ずしもそれに限定されないが、ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９号、９ ８０−９９０ページ（１９８９年）に記載されているレトロウイルスＬＴＲ； ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ ー；あるいはいずれかの他のプロモーター（例えば、必ずしもそれに限定されな いがヒストン，ｐｏｌ ＩＩＩ，およびβ−アクチンプロモーターなどを含む真 核細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）を含む。使用される他のウイルス プロモーターは、必ずしもそれに限定されないが、アデノウイルスプロモーター ，ＴＫプロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターを含む。適切な プロモーターの選択は、ここに含まれる教訓から当業者にとっては明らかであろ う。 ベクターは次いで生産者細胞系を形成するためにパッケージング細胞系に形質 導入するのに使用される。形質移入されるパッケージング細胞の例は、必ずしも それに限定されないが、ＰＥ５０１，ＰＡ３１７，−２，−ＡＭ，ＰＡ１２，Ｔ １９−１４Ｘ，ＶＴ−１９−１７−Ｈ２，ＣＲＥ，ＣＲＩＰ，ＧＰ＋Ｅ−８６， ＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２，ＰＡＴ２．４，およびＤＡＮ細胞系を含む。代表的なパ ッケージング細胞系の例は、同じくミラー、ヒト遺伝子治療、１巻、５−１４ペ ージ（１９９０年）に記載されている。治療薬をコード化する核酸配列を含むベ クターは、いずれかの従来既知の手段を通じてパッケージング細胞を形質導入す る。このような手段は、必ずしもそれに限定されないが、電気穿孔法、リポソー ムの使用、およびリン酸カルシウム沈殿法を含む。 一つの実施例において、ＰＥ５０１などの第１パッケージン グ細胞系がベクターで形質移入され、ウイルス粒子が生成される。これらの感染 性ウイルス粒子は次いでＰＡ３１７などの第２パッケージング細胞系を形質移入 するのに使用され、これが量を増やしたウイルス粒子を生成する。 生産者細胞は次いで胎児に治療効果を生み出すのに有効な量で胎児に生体内で 投与される。一般に生産者細胞は胎児に対して約１×１０⁴細胞から約１×１０^{1 0} 細胞、望ましくは約１×１０⁷細胞から約１×１０⁹細胞、より望ましくは約５ ×１０⁷細胞から約１×１０⁸細胞の量で投与される。生産者細胞は胎児に全身系 で、例えば腹腔内投与、静脈内投与により、あるいは器官あるいは筋への直接注 射により投与される。投与される生産者細胞の量は、治療される疾病およびその 範囲ならびに発病度を含む各種の要素に依存する。 生産者細胞は患者への投与に適切な調剤許容担体と併用して投与される。担体 は例えば食塩水あるいは緩衝液、もしくは他の等モル水溶液などの液状担体であ ることが出来る。 胎児への生産者細胞投与に際して、生産者細胞はウイルス粒子を生成する。ウ イルス粒子は次いで、例えば造血幹細胞、中枢神経系細胞、および他の組織ある いは器官の細胞などの胎児細胞を形質導入し、これにより形質導入細胞が治療薬 を発現する。 も一つの選択肢において、ウイルス粒子を含むウイルス上澄みが胎児に投与さ れ、これによりそのようなウイルス粒子が前記の胎児細胞を形質導入する。ウイ ルス上澄みは約１×１０³ＣＦＵから約１×１０¹¹ＣＦＵ、望ましくは 約１×１０⁴ＣＦＵから約１×１０⁸ＣＵＦの量で投与される。 少くとも１個の核酸配列によりコード化される治療薬は、必ずしもそれに限定 されないが、造血系欠損症、免疫不全、リソソーム蓄積症、レッシュ−ナイハン 病、および白血球付着欠損症を治療するものを含む。治療薬の特異な例は、必ず しもそれに限定されないが、血友病Ａを治療する因子ＶＩＩＩ；血友病Ｂを治療 する因子ＩＸ；貧血を治療するＦＡＣＣ；αサラセミアを治療するα−グロブリ ン；βサラセミアおよび鎌型赤血球貧血症を治療するβ−グロビン；重症複合型 免疫欠損を治療するアデノシンデアミナーゼ、およびＰＮＰ；Ｘ染色体免疫不全 を治療するＴ細胞レセプターα鎖；ゴーシェ病を治療するグルコセレブロシド； ハンター症候群を治療するイドゥロナートスルファターゼ；フルラー症候群を治 療するイドゥロニダーゼ；ファブリー病を治療するα−ガラクトシダーゼ；テイ サックス病を治療するヘキソサミニダーゼＡのα−サブユニット；レッシュ−ナ イハン病を治療するＨＰＲＴ；白血球付着欠損を治療するＣＤ１８複合体を含む 。しかしこの発明の範囲は前記の治療薬に限定されるものではない。 更に、この発明の方法は、成長ホルモンおよび疾病に耐性を付与する作用薬な どの治療薬を胎児動物に供給するために胎児動物に適用出来る。加えて、この発 明の方法は、ヒトタンパク質あるいは治療薬をコード化する遺伝子を胎児動物に 提供するために使用される。例えば、胎児動物はヒトヘモグロビンの遺伝子を与 えられ、次いでヒト代用血液を提供するために生まれ た後の動物から収穫される。 またこの発明の方法は遺伝子発現および遺伝子治療のための動物モデルを提供 するために使用される。 これからこの発明は以下の実施例と関連して説明される。しかしこの発明の範 囲はそれにより限定されるものではない。 実施例１ ｐＧ１ＮａＳｖＡｄの構築および生産者細胞 ならびにそのウイルス上澄みの生成 Ａ．ｐＧ１ＮａＳｖＡｄの構築 プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＡｄはプラスミドＰＧ１（図３）から誘導された。 プラスミドｐＧ１はｐＬＮＳＸから構築された（パーマー、他、血液、７３巻、 ４３８−４４５ページ）。プラスミドｐＧ１の構築戦略は図１で示される。５′ モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭｕＳＶ）ＬＴＲを含む１．６キロベースＥ ｃｏＲＩ断片、および３′ＬＴＲを含む３．０キロベースＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ 断片、細菌複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子が個別に分離された。７個の ユニーククローニング部位を含むリンカーが次いでＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ断片を それ自身で閉じるために使用され、かくしてプラスミドｐＧ０を生成した。プラ スミドｐＧ０は５′ＬＴＲを含む１．６キロベースＥｃｏＲＩ断片をｐＧ０のユ ニークＥｃｏＲＩ部位に挿入することでベクタープラスミドｐＧ１（図３）を生 成するために使用された。かくしてｐＧ１（図３）は、 ＭｏＭｕＳＶから誘導される５′部分より構成されるレトロウイルスベクターバ ックボーン、真正ＡＴＧ出発コドンがＴＡＧに突然変異されたｇａｇの短部分（ ベンダー、他、１９８７年）、５′から３′までのＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ，Ｓｎ ａＢＩ，ＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＡｐａＩ、および ＣｌａＩを含む５４塩基対多重クローニング部位（ＭＣＳ）、および塩基対７７ ６４から７８１３まで（ヴァン ビヴァレン、他、コールド スプリング ハー バー 、２巻、５６７ページ、１９８５年で番号を付されたもの）のＭｏＭｕＬＶ の３′部分よりなる（図２）。ＭＣＳはｐＧ１プラスミド，ｎｅｏ^r遺伝子，β ガラクトシダーゼ遺伝子，ヒグロマイシン遺伝子、およびＳＶ４０プロモーター の非切断制限酵素部位の鑑別にもとづいて最大数のユニーク挿入部位を生成する ように設計された。 「バックボーン」ベクターｐＧ１ＮａはｐＧ１およびｐＮ２から構築された（ アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６４７−１６５０ペー ジ、（１９８７年））。ｐＧ１ＮａはＥｃｏＲＩおよびＡｓｕＩＩでｐＮ２を切 断し（図４）、ｎｅｏ^R遺伝子を含むＥｃｏＲＩ／ＡｓｕＩＩ断片の末端に充填 し、ｐＧ１Ｎａを形成するためにこの断片をＳｎａＢＩ消化ｐＧ１に連結するこ とにより構築された（図５）。 ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）ｃＤＮＡ配列（エイドリアン、他、分 子細胞生物学 、４巻、１７１２−１７１７ページ（１９８４年）；ウイッグマン 、他、全米科学 アカデミー紀要 、８０巻、７４８１ページ（１９８３年）；ウイッグマン、他、核酸研究 、１２巻、２４３９ページ（１９８４年））を含み、ＳＶ４０プロモー ター（約１．６キロベース）で促進されたＳｖＡｄ断片が、ＥｃｏＲＩでｐＢ２ ＳＡから切断されたクレノウで平滑末端化された。（ＳｖＡｄは当業者が利用出 来る他のベクターから利用可能である。望ましくは、それは、カントフ、他、全 米科学アカデミー紀要 、８３巻、６５６３−６５６７ページ（１９８６年）に記 載されているベクターＳＡＸから得られるであろう）。ｐＧ１ＮａはＳａｌＩお よびＨｉｎｄＩＩＩで二重酵素切断によりｎｅｏ^R遺伝子の３′で線形化され、 クレノウで平滑末端化された。ＳｖＡｄ断片は次いでｐＧ１Ｎａに連結され、ｐ Ｇ１ＮａＳｖＡｄを形成した（図７）。ｐＧ１ａＮａＳｖＡｄの構築の図形は図 ６で示される。Ｂ．ＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ生産者細胞系の生成 一つの生産者細胞系がベクタープラスミドおよびパッケージング細胞から作ら れた。ＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ生産者細胞はこれまでの臨床関連レトロウ イルスベクター生産者細胞系を作るために使用されたものと同じ手法により作ら れた。ベクタープラスミドｐＧ１ＮａＳｖＡｄ ＤＮＡがエコトロピック細胞系 ，ＰＥ５０１に形質移入された。ＰＥ５０１形質移入細胞の上澄みが、次いで両 種性ｈＴＫ含有パッケージング細胞系（ＰＡ３１７）を形質移入するために使用 された。形質移入生産者細胞系のクローンが、次いでＮｅｏ^R遺伝子を含むクロ ーンを選択するためにＧ４１８含有培地で成育された。ク ローンは、次いでレトロウイルスベクター生産のために滴定された。いくつかの クローンは、次いで更なる検査のために選択され、最後に臨床用として選択され た。 ５×１０⁵ＰＥ５０１細胞（ミラー、他、バイオテクニク、７巻、９８０−９ ９０ページ（１９８９年）、引用例としてここにとり込まれたもの）は、１００ ｍｍ皿で１０ｍｌ高グルコースダルベッコ修飾必須培地（ＤＭＥＭ）成長培地で 皿当り（３ｍｍ−１００ｍｍ皿が形質移入当り必要）１０％胎児ウシ血清で補充 されたもので平板培養された。細胞は３７℃で５％ＣＯ₂の雰囲気で一晩保温さ れた。 プラスミドｐＧ１ＮａＳｖＡｄは、次いで下記の手続きで５０μｇのＤＮＡを 用いるリン酸カルシウム沈殿によりＰＥ５０１細胞に形質移入された。 ５０μｇのＤＮＡ，５０μｌの１０×ＣａＣｌ₂，および４５０μｌの無菌水 が１５ｍｌのポリプロピレン管で混合され、５０μｇのＤＮＡ，０．５ｍｌの２ ×ＰＢＳ（５０ｍＭのＮ−Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエ タン−スルホン酸，２８０ｍＭのＮａＣｌ，１．５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、および ５０ｍＭのヘペス、ｐＨ６．９５を含有するもの）を含む０．２５ＭのＣａＣｌ₂ 溶液を生成し、次いで試験管に加えられ、試験管の内容物はピペットを使って 混合された。ＤＮＡ溶液は次いで室温で約２０分から１時間放置された。１ｍｌ のＤＮＡ溶液は次いで各培養皿に加えられ、各皿はＤＮＡが平たんな分布になる よう回転された。皿は次いで３５℃で３％ＣＯ₂の雰囲気で一晩培養された。 一晩保温に続く最適沈殿物を持つ培養皿が次いで選択された。培地／ＤＮＡ沈 殿物は皿から吸引され、５ｍＬのＰＢＳが各皿に加えられた。皿は塩が溶解出来 るように２−３分間放置された。 皿は次いで再びＰＢＳで洗われ、塩および塩溶液が除去された。１０ｍｌのＨ ＧＤ１０培地が次いで皿に加えられ、皿は３７℃で５％ＣＯ₂雰囲気で約４８時 間保温された。 ４８時間一過性上澄みは、次いで細胞から上澄みを除くことにより形質移入細 胞から収集され、それは１５ｍｌのポリプロピレン管に配置された。皿は次いで ５ｍｌのＰＢＳですすぎ洗いされた。ＰＢＳが次いで除去され１ｍｌのトリプシ ン−ＥＤＴＡが各皿に加えられた。３個の１５ｍｌポリプロピレン管が次いでそ れぞれ非希釈、１：１０、および１：１００と標識された。９ｍｌのＨＧＤ１０ プラス０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が１：１０および１：１００の管に加えられ た。 細胞がもはや皿に付着しなくなった時、９ｍｌのＨＧＤ１０および０．８ｍｇ ／ｍｌのＧ４１８が非希釈管に加えられ、その細胞は非希釈管に移された。 次いで細胞の連続希釈が１ｍｌの非希釈細胞を１：１０管に加えまた１ｍｌの １：１０細胞を１：１００管に加えることにより行われた。細胞は次いで混合さ れた。 １０ｍｌのＨＧＤ１０および０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が６個の１００ｍｍ 皿のそれぞれに加えられた。１個の皿には、０．５ｍｌの非希釈細胞が加えられ て１：２０希釈の細胞が作られ、１個の皿には０．２５ｍｌの非希釈細胞が加え られて、 １：４０希釈の細胞が作られた。また１個の皿には１．０ｍｌの１：１０希釈液 が加えられ、１：１００希釈の細胞が作られ、１個の皿には０．２ｍｌの１：１ ０希釈液が加えられ、１：５００希釈の細胞が作られた。１個の皿には１．０ｍ ｌの１：１００希釈液が加えられ、１：１０００希釈の細胞が作られた。またも 一つの皿には０．５ｍｌの１：１００希釈液が加えられ、１：２０００希釈の細 胞が作られた。 ６個の平板の細胞は毎日検査された。培地は大量の細胞死滅が存在する場合に は交換された。このような培地の交換は死滅細胞が殆ど見られなくなるまで繰返 された。この点において、生細胞あるいはコロニーは、コロニーがクローンを見 分けるのに十分なだけ大きくなる（すなわち平板の底から見上げた時にコロニー が裸眼で見える）ような大きさにまで成長させられた。このようなＰＥ５０１細 胞のコロニーから得られるウイルス上澄みは約５ｍｌから約１０ｍｌまでの量で 収集され、冷凍管に入れられ、約−７０℃の液体窒素で凍結された。 ＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣアクセス番号ＣＲＬ９０７８）（ミラー、他、分子 細胞生物学 、６巻：２８９５−２９０２ページ（１９８６年））はアメリカ合衆 国特許番号４，８６１，７１９号でも説明されているが、これが４．５ｇ／ｌの グルコース、グルタミン補足体および１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むダ ルベッコ修飾必須培地（ＤＭＥＭ）で１００ｍｍ平板当り５×１０⁴細胞の濃度 で平板培養された。 ウイルス上澄みは次いで解凍され、８μｇ／ｍｌのポリブレ ンがＰＥ５０１細胞のウイルス上澄みに加えられ、上澄みおよびポリブレンは混 合され０．２２μｍフィルターユニットを使って注射器に入れられた。ＤＭＥＭ は細胞平板から吸引され、７乃至８ｍｌのウイルス上澄みが一晩感染のため加え られた。 ウイルス上澄みは次いで除去され新鮮１０％ＦＢＳで置換された。１日後、培 地は１０％のＦＢＳおよびＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）に交換された。平板は 次いでモニターされ、培地は必要な場合には死にかけているか死滅した細胞を除 去するために新鮮１０％ＦＢＳおよびＧ４１８で交換された。平板は更に顕微鏡 なしで皿の底からスキャニングによりＧ４１８耐性コロニーの外観を少くとも１ ０乃至１４日間モニターされた。コロニーが十分大きく見えるようになると、そ れは次いでクローンとして選択された。 培地は次いで皿から吸引され、５ｍｌのＰＢＳで置換された。細胞は次いです すぎ洗いされ、大抵のＰＢＳが吸引された。約０．５から１．０ｍｌのＰＢＳは それが湿潤を保つために平板に残された。クローニングリングが次いですべての 選択コロニーに配置された。２滴のトリプシン−ＥＤＴＡ２が次いで各クローニ ングに置かれた。皿は次いで恒温器内に配置され、細胞が皿から離れるまで定期 的に軽くたたかれた。５ｍｌのＨＧＤ１０プラス０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が ６個のウエル皿に必要とされるのと同じだけのウエルに加えられた。 各コロニーの細胞が皿からとり出された時、２滴のＨＧＤ１０が各クローニン グリングに加えられる。次いでピペットが ２００μｌに設定され、すべての細胞を除去するためにクローニングリングに挿 入された。細胞は次いで６個のウエル皿のウエルの１個に移された。この方法が すべての望ましいクローンが採集されるまで繰返された。６個のウエル皿は３７ ℃で５％ＣＯ₂雰囲気で保温された。 クローンは次いで密集成長を観察された。クローンが密集あるいは殆ど密集す ると、そのクローンはトリプシン化され１００ｍｌ皿で拡張された。 拡張クローンが約９０％密集化した時、古い培地は除去され、１０ｍｌの新鮮 ＨＧＤ１０培地で置換された。皿は恒温器に戻され２０乃至２４時間保温された 。 この保温の後、上澄みは皿から除去され、１５ｍｌのポリプロピレン管に入れ られた。管は１，２００乃至１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離され、上澄みに あったどの細胞もペレットでとり出された。 上澄みは次いで６個の冷凍小びんにアリコートされた（１ｍｌ／小びん）。ア リコートは液体窒素で貯蔵された。５ｍｌのＰＢＳが皿に加えられ、細胞はすす ぎ洗いされた。 細胞が皿からとり出された時、９ｍｌのＨＧＤ１０が細胞に加えられ、細胞は １５ｍｌのポリプロピレン管に移された。細胞は１，２００乃至１，５００ｒｐ ｍで５分間遠心分離によりペレット化された。 培地は細胞ペレットで吸引された。ペレットは次いで１ｍｌのＨＧＤ１０およ び１ｍｌの２×ＤＭＳＯ凍結培地で再懸濁され、１ｍｌの細胞が２個の冷凍小び んのそれぞれにアリコート された。冷凍小びんはドライアイスの上に置かれ、凍結すると液体窒素に移され た。 前記の方法を通じて、もっとも高い力価のクローンが生産者細胞系ＰＡ３１７ ／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４と名付けられ、生産者細胞のマスター細胞バンクを生 産するのに使用された。Ｃ．凍結保存されたウイルス上澄みの生産 ＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４細胞は３７℃で解凍され、凍結保存ジメ チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）により細胞への損傷を避けるため出来るだけ速や かに再培養される。 １個の実用細胞バンク冷凍小びんの内容物が高グルコース（４．５ｇ／ｌ）Ｄ ＭＥＭおよび１０％のＦＢＳと２ｍＭのグルタミンを含む２５ｍｌの培地を含む Ｔ７５フラスコに設置される。このフラスコの内容物は次いで４個乃至１０個の ７５ｃｍ²フラスコに分割される。このフラスコの内容物が次いで更に７５ｃｍ² のフラスコに分割出来る。細胞が約９０％密集した時、すべてのフラスコの培地 が交換される。 上澄みは次いでフラスコから採集され、１個の大型スピナ型フラスコにプール される。サンプルがとり出され、マイコプラスマスクリーニングにかけられる。 残った上澄みは０．２２ミクロンフィルターを通して濾過され、プールされ（サ ンプルが追加ロット放出検査のためとられ）、最終コンテナにアリコートされる 。各フラスコに更に培地が加えられる。 １日後、再び上澄みがフラスコから採取され、プールされ、前記の通り濾過さ れる。この方法は翌日再び繰返される。上澄みがアリコートされかつ標識され、 フリーザー内で−７０℃で 貯蔵される。 実施例２ ｐＧ１ＴｋＳｖＮａの構築およびその生産者 細胞系の生成 Ａ．ｐＧ１ＴｋＳｖＮａの構築 以下はｐＧ１ＴｋＳｖＮａの構築を記述し、その図解は図１０で示される。こ のベクターはレトロウイルスプロモーターおよび細菌遺伝子、ＳＶ４０プロモー ターで駆動されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ^R）により調 節されるＩ型単純ヘルペスウイルスより得られるチミジンキナーゼ（ｈＴＫ）遺 伝子を含有する。ｈＴＫ遺伝子はＤＮＡ類似体アシクロビルおよびガンシクロビ ルに感受性を与え、一方Ｎｅｏ^R遺伝子産物はネオマイシン類似体、Ｇ４１８に 耐性を付与する。 ｐＧ１ＴｋＳｖＮａを作るために、３段階クローニング戦略が使用された。ま ず、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｔｋ）がｐＧ１Ｔｋを生産するため にＧ１プラスミドバックボーンにクローンされた。第二にＮｅｏ^R遺伝子（Ｎａ ）がｐＳｖＮａを作るためにプラスミドｐＳｖＢｇにクローンされた。最後にＳ ｖＮａがｐＳｖＮａから切除され、ｐＧ１ＴｋＳｖＮａを生産するためにｐＧ１ Ｔｋに連結された。 ｐＧ１は実施例１で記述されたように構築された。 ｐＢｇ（図８）を構築するために、β−ガラクトシダーゼ をコード化する３．０キロベースのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ ｌａｃＺ断片がｐ ＭＣ１８７１（ファルマチア）から分離された。この断片はβ−ガラクトシダー ゼ読み取り枠の５′および３′最末端を欠いている。完全ｌａｃＺ読み取り枠を 復旧しｌａｃＺ遺伝子の各末端に制限部位を加えるリンカーが合成され、Ｂａｍ ＨＩ／ＥｃｏＲＩ ｌａｃＺ断片に連結され ＮｄｅＩ−ＳｐｈＩ−ＮｏｔＩ−ＳｎａＢＩ−ＳａｌＩ−ＳａｃＩＩ−ＡｃｃＩ −ＮｒｕＩ−ＢｇＩＩＩ−ＩＩＩ２７塩基対リボソーム結合シグナル−コザック 共通配列／ＮｃｏＩ−ｌ ＥｃｏＲＩ−ｌａｃＺ読み取り枠の最後の５５塩基対−Ｘｈｏ カーの制限部位は、それらがネオマイシン耐性遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝 子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、あるいはＳＶ４０プロモーターに存在しないた めに選択された。２７塩基対リボソーム結合シグナルは５′リンカーに含まれて いたが、それはｍＲＮＡの安定性を高めるものと考えられていたためであった（ ハーゲンビュッヒレ、他、細胞、１３巻：５５１−５６３ページ、１９７８年、 およびローレンスならびにジャクソン、分子生物学ジャーナル、１６２巻、３１ ７−３３４ページ、１９８２年）。コザック共通配列（５′−ＧＣＣＧＣＣＡＣ ＣＡＴＧＧ−３′）はｍＲＮＡ翻訳のシグナル開始を示している（コザック、核 酸研究 、１２巻：８５７− ８７２ページ、１９８４年）。コザック共通配列はＡＴＧ翻訳開始コドンを標識 するＮｃｏＩ部位を含む。 ｐＢＲ３２２（ボリバー、他、遺伝子、２巻：９５ページ、１９７７年）はＮ ｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、アンピシリン耐性遺伝子および細菌複製起 点を含む２．１キロベースの断片が分離された。前記の連結５′リンカー−ｌａ ｃＺ−３′リンカーＤＮＡはｐＢｇ生成のためｐＢＲ３２２ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲ Ｉベクターに連結された。ｐＢｇはシャトルプラスミドとして有用であるが、そ れはｌａｃＺ遺伝子を切除することが出来、ｌａｃＺ遺伝子の５′および３′末 端に存在するいずれの制限部位にもも一つの遺伝子を挿入出来るからである。こ れらの制限部位はｐＧ１プラスミド内で反復されるために、シャトルプラスミド 構築物内でｌａｃＺ遺伝子あるいはそれと置換する遺伝子はたやすくｐＧ１に移 動することが出来る。 Ｉ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ジェンバンク アクセス 番号Ｖ００４６７、引用例としてここにとり込まれたもの）を含む１．７４キロ ベースＢｇ１ＩＩ／ＰｖｕＩＩ断片はｐＸ１プラスミド（ヒューバーマン、他、エキスポウネンシャル細胞研究 、１５３巻、３４７−３６２ページ（１９８４年 ）、引用例としてここにとり込まれたもの）から切除され、ＤＮＡポリメラーゼ Ｉの大型（クレノウ）断片で平滑化され、ｐＧ１多重クローニング部位のユニー クＳｎａＢＩ部位に挿入され、プラスミドｐＧ１Ｔｋを形成した（図９）。 プラスミドｐＳＶ２Ｎｅｏ（サザン、他、分子応用遺伝学 ジャーナル 、１巻：３２７−３４１ページ（１９８２年））から得られる３３９ 塩基対ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＳＶ４０初期プロモーター断片は、次いで ユニークＮｒｕＩ部位のｐＢｇに挿入され、プラスミドｐＳｖＢｇを生成した（ 図５）。ｐＳｖＢｇプラスミドはｌａｃＺ遺伝子を除去するためにＢｇ１ＩＩ／ ＸｈｏＩで消化され、その末端はクレノウ断片を使って平滑化された。ネオマイ シン耐性遺伝子のコーディング配列を含む８５２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＡｓｕＩＩ 断片はｐＮ２（アーメンターノ、他、ウイルス学ジャーナル、６１巻、１６４７ −１６５０ページ（１９８７年））から除去され、クレノウ断片で平滑化され前 記の生成された２．５キロベース平滑Ｂｇ１ＩＩ／ＸｈｏＩ断片に連結され、ｐ ＳｖＮａを生じた。ＳＶ４０プロモーター／ネオマイシン耐性遺伝子カセットは 次いで１１９１塩基対Ｓａ１Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＳｖＮａから除去 された。ｐＧ１Ｔｋプラスミドは次いでＳａ１Ｉ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、 ＳＶ４０／ｎｅｏ^r断片に連結され、ｐＧ１ＴｋＳｖＮａを生成した（図１０） 。Ｂ．生産者細胞系ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．９０の生成およびそのウイ ルス上澄みの生成 生産者細胞系ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．９０は、生産者細胞系ＰＡ３ １７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４を調製する実施例１で開示された方法に従って調 製され、パッケージング細胞系ＰＡ３１７に代りパッケージング細胞系ＰＡＴ２ ．４が使用されたことのみが異なっていた。ＰＡＴ２．４は、 ミラー、他、分子細胞生物学、６巻：２８９５−２９０２ページ（１９８６年） およびミラーに許可された１９８９年８月２９日付アメリカ合衆国特許番号４， ８６１，７１９号で開示されたＰＡ３１７の調製方法に従って作られ、これらの 開示はここに引用例としてとり込まれているが、ここでも選択マーカを提供する ため単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の代りにＮＩＨ ３Ｔ３ Ｔ Ｋ−マイナス細胞がヒグロマイシン耐性遺伝子と同時形質移入され、またパッケ ージング細胞系がオリゴ−クローナル集団から選択されたことが異なっていた。 この方法は以下のように要約される。ＮＩＨ ３Ｔ３ ＴＫ−マイナス細胞の 集団が標準のＣａＰＯ₄横断区法を用いて２０：１の比率で２種のプラスミドＤ ＮＡと同時形質移入された。第一のプラスミドはｐＰＡＭ３（ＡＴＣＣアクセス 番号４０２３４）であり、これは両種性マウス白血病ウイルスのプロモーター、 ｇａｇ，ｐｏｌ、およびｅｎｖ配列を含んでいる。ＤＮＡの７０マイクログラム が使用された。第二のプラスミドはＰＹ３であり、これはヒグロマイシン耐性遺 伝子を含んでいた（ヒグロマイシン耐性遺伝子は更に当業者の利用出来る他のプ ラスミドでも見出される）。細胞の集団はヒグロマイシンから選択され、またヒ グロマイシン耐性遺伝子は一次および二次種子ロットとして凍結された。集団は ウイルス包膜発現を解析され、またパッケージング機能は高力価ベクターを探す ためにＴＫベクター生産者細胞クローンで分析された。オリゴ−クローナル集団 は１個の２４ウエル平板にウエル当り５−１０ 細胞、およびも一つの平板にウエル当り１０−２０細胞を播種することで創り出 された。全部で４６集団が創り出された。各オリゴクローンは拡張され凍結され た。各集団は実施例１の手法に従ってネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド ｐＧ１ＴｋＳｖＮａで形質移入されたパッケージング細胞ＰＥ５０１から得た上 澄みで生産者集団を創り出すことにより、パッケージング効率を個別に分析され た。高力価生産者細胞系を生産し得る一つのサブ集団が実施例１の方法に従って 確認され、ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．９０と名付けられた。 Ｇ１ＴｋＳｖＮａを含むウイルス上澄みが実施例１に従ってこの生産者細胞か ら調製された。 実施例３ Ａ．ヒツジ胎児への遺伝子転移 妊娠日の判明している１０匹の雌ヒツジが手術のため飼料を４８時間、水を１ ８乃至２４時間差し控えて準備された。各雌ヒツジは筋肉内へのケタミン（１０ ｍｇ／ｋｇ）投与で鎮静化され、また０．５乃至１０％のハロタン−酸素吸入混 合剤を気管内挿入管経由で与えられた。各動物は静脈液および抗生物質を手術中 に受けた。子宮は下部正中切開で露出され、各胎児は子宮筋層および卵膜の小さ い子宮切開および横経切開を通じてアクセスされた。羊膜は無傷で残された。胎 児は次いで視覚化され、また羊膜塊の中にゆっくりと手で押し込まれた。胎児は 次いでやわらかな圧力の下で塊内での注射のために固 定された。この時点で胎児は完全に視野の中にあり、それが注射細胞あるいはウ イルス上澄みが腹腔内に留まることを確実なものとする。ヒツジは以下のものの 一つを注射された：（ｉ）１×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌの力価を持つＧ１ＮａＳｖＡ ｄ．２４から得る２ｍｌのウイルス上澄み；（ii）１ｍｌの５×１０⁷ＰＡ３１ ７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４生産者細胞；（iii）セシウムイラジエーターで３ ，０００ラドの照射を受けた１ｍｌの５×１０⁷ＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ ．２４生産者細胞；（iv）２ｍｌの１×１０⁸ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ ．９０生産者細胞；（ｖ）１ｍｌ含有の５×１０⁷ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖ Ｎａ．９０生産者細胞；（vi）セシウムイラジエーターで３，０００ラドの照射 を受けた２ｍｌ含有１×１０⁸ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．９０生産者細 胞；（vii）１ｍｌの５×１０⁷ＰＡ３１７パッケージング細胞；（viii）１ｍｌ の５×１０⁷ＰＡＴ２．４パッケージング細胞；あるいは（ix）２ｍｌ含有１× １０⁸ＰＡＴ２．４パッケージング細胞。各雌ヒツジの胎児は以下の表Ｉで示さ れるようにウイルス上澄みあるいは細胞を注射された。 注射の後、各胎児は最初の羊膜隙に戻され、子宮筋層は二層で閉じられた。す べての切開部の閉鎖に続き、各雌ヒツジは４８時間観察され、また更なる実験が 行われない限り妊娠期間の残りを送るため大きい家畜設備に戻された。生存する 各雌ヒツジは分娩予定日の前１週間検査された（正常な妊娠は１４５日間である ）。注射を受けた１７匹の胎児の内、Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４ウイルス上澄みで 注射された３匹が生きて生まれた。非放射線照射ＰＡＴ２．４Ｇ１ＴｋＳｖＮａ ．９０の注射を受けた２匹が生きて生まれた。放射線照射生産者細胞を注射され た４匹（内２匹はＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４照 射生産者細胞、また２匹はＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．９０照射生産者細 胞）が生きて生まれた。Ｂ．ｎｅｏ^Rおよび単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の存在を確認する検定 手順 生まれた後の各時点で、ＣＦＵ−Ｅ，ＢＦＵ−Ｅ，ＣＦＵ−ＧＭ、あるいはＣ ＦＵ−Ｍｉｘ骨髄細胞（これらすべては造血幹細胞である）が各ヒツジから採取 され、Ｇ４１８の存在下で細胞を培養することによりｎｅｏ^R遺伝子の発現、お よびもしくはガンシクロビルの存在下で細胞を培養することによる単純ヘルペス チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の発現が解析された。 ＣＦＵ−Ｅ細胞およびＢＦＵ−Ｅ細胞は以下のような血漿凝固培養検定で検査 された。 ヒツジからの全骨髄が１５ｍｌの遠心分離管に転移され、この管は１，６００ ｒｐｍで１０分間回転された。軟層が除去され、骨髄はイスコーブ溶液で１５ｍ ｌにまで引上げられた。細胞は次いで５ｍｌのフィコール緩衝液上で層にされ、 ３０分２，０００ｒｐｍで回転された。単核層が除去され、残存細胞は２回イス コーブ溶液で洗われた。細胞は５ｍｌのイスコーブ溶液で再懸濁され、計数され た。下記の成分を含む培地が次いで各血漿凝固培養のために形成された： １００μｌ Ｌ−アスパラギン ３００μｌ ウシ胎児血清 １００μｌ α−チオシアネート Ｂ ３０μｌ エリトロポイエチン １００μｌ ４×トロンビン ６３０μｌのこの混合物はピペットで各管に注入された。細胞の量は２×１０⁵ 細胞を得るのに必要なものとして計算された。０ｍｇ／ｍｌ，０．５ｍｇ／ｍ ｌ，１．０ｍｇ／ｍｌ，１．５ｍｇ／ｍｌ，２．０ｍｇ／ｍｌ，２．５ｍｇ／ｍ ｌ、あるいは３．０ｍｇ／ｍｌの量のＧ４１８、およびもしくはガンシクロビル の０μＭ，３μＭあるいは６μＭが各管に加えられた。単純ヘルペスチミジンキ ナーゼ遺伝子を発現する細胞を殺すために、ガンシクロビルが単純ヘルペスチミ ジンキナーゼと相互作用する。各管のイスコーブ溶液量は、細胞を含め管の最終 量が１ｍｌになるように計算された。イスコーブ溶液が管に加えられ、続いてＧ ４１８およびもしくはガンシクロビル、その後細胞が加えられた。凝固を促進す る１００μｌのクエン酸塩添加血漿が加えられる。管内容物は１ｍｌのピペット を使って内容物を上下に動かすことで混合され、そして２００μｌの内容物はそ れぞれ８個の血漿凝固ウエルに分配される。４個のウエルは１個の６ウエル平板 にあり、また４個のウエルはも一つの６ウエル平板にある。 前記の手続きはすべてのサンプルで繰返される。水が６ウエル平板の上のウエ ルの間の空隙に加えられ、また平板は細胞が収穫出来るよう準備が整うまで恒温 器に置かれる。 凝塊を収穫するために平板が恒温器からとり出され、頭巾をかけて１０分間放 置される。この間にＰＯ₃緩衝液がペトリ皿に置かれる。 被覆スライドが次いでカフェテリアトレーに設置され、標識される。４個の凝 塊が各グループから同じスライドにのるよう とり上げられ、凝塊がお互いに接触しないようにオフセット模様に配列される。 次いで濾紙がＰＯ₃緩衝液に浸漬され、一片が各スライドの上に置かれる。濾 紙およびスライドは１乃至２分そのまま放置される。 大型のバクスター濾紙が次いで用意され、すべてのスライドの上にかけられる 。この濾紙は、余分の緩衝液を吸い取るようにしっかり押しつけられる。大型濾 紙は捨てられ、３％のグルタルアルデヒドが各スライドのＰＯ₃緩衝液被覆濾紙 に噴出される。スライドおよび濾紙は１分放置される。スライドの濾紙は除去さ れ廃棄される。スライドは乾燥ラックに置かれ、染色の前に乾燥される。各スラ イドは次いでメタノールで１分処理され、次いでベンジジン１％入りメタノール で５分処理される。各スライドは次いでペルオキシダーゼで３分処理され、次い で蒸留水で１分洗われる。各スライドは次いでヘマトキシリンで８分染色され、 次いで冷たい生水の下で１０分置かれる。 ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−Ｍｉｘコロニーは以下のようなメチルセルロース 培養検定で単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のネオマイシン耐性あるいは発 現を評価された。 骨髄吸引液がヒツジからとり出され、１０ｍｌの骨髄（ＩＭＤＭで１：３に希 釈したもの）を５ｍｌのフィコール−ハイパーク緩衝液のクッションの上に重ね ることで分離された。管は１，５００ｒｐｍで３０分遠心分離された。単核画分 は無菌移入ピペットで除去され、ＩＭＤＥＭで２回洗われた。細胞は ペレットにされ２×１０⁵細胞／ｍｌで培養された。各平板は でいた。 １．６ｍｌのメチルセルロース（ジブコ社） ６０μｌのエリトロポイエチン （最終濃度５０ユニット／ｍｌ） １００μｌのヒツジ植物性血球凝集素刺激白血球馴化培地 （ＰＨＡ−ＬＣＭ） ４×１０⁵細胞 Ｇ４１８およびもしくはガンシクロビル 最終量を２ｍｌとするためのＩＭＤＭ Ｇ４１８が、０ｍｇ／ｍｌ，０．５ｍｇ／ｍｌ，１．０ｍｇ／ｍｌ，１．５ｍ ｇ／ｍｌ，２．０ｍｇ／ｍｌ，２．５ｍｇ／ｍｌおよび３．０ｍｇ／ｍｌの濃度 で平板に加えられ、およびもしくはガンシクロビルが０μＭ，３μＭ、あるいは ６μＭで加えられた。これらの平板は次いで７日（ＣＦＵ−ＧＭ）、および１２ 日（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）培養され、コロニーは解体範囲の下で計数された。 実施例４ コロニー形成に対するＧ４１８の効果は、実施例３の検定手続きに従って、生 産者細胞あるいはウイルス上澄みを与えられなかった６匹の新生対照ヒツジから 採られたＣＦＵ−Ｍｉｘ，ＢＦＵ−Ｅ，ＣＦＵ−ＧＭ、およびＣＦＵ−Ｅ細胞と の関連で評価された。６匹のヒツジから採られた各タイプの全コロニー 数が計数された。その結果は図１１で示される。これらのヒツジはまた生誕７ケ 月および１７ケ月後にも評価された。生誕７ケ月および１７ケ月後の結果はヒツ ジが新生の時と同じであった。 実施例５ 生きて生まれ、現在７ケ月の月齢（ウイルス上澄みあるいは生産者細胞の腹腔 内投与の１０ケ月後）である３匹のヒツジのＣＦＵ−Ｍｉｘ，ＢＦＵ−Ｅ，ＣＦ Ｕ−ＧＭ、およびＣＦＵ−Ｅ細胞に対するＧ４１８の効果が評価され、生産者細 胞あるいはウイルス上澄みを何も与えられなかった６匹の対照ヒツジのＣＦＵ− Ｍｉｘ，ＢＦＵ−Ｅ，ＣＦＵ−ＧＭ、およびＣＦＵ−Ｅ骨髄細胞に対するＧ４１ ８の効果と比較された。この実験においては、３匹の加療ヒツジの１匹はＧ１Ｎ ａＳｖＡｄ．２４ウイルス上澄みを受け、１匹のヒツジは５×１０⁷照射ＰＡ３ １７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４生産者細胞を受け、また１匹は５×１０⁷ＰＡＴ ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮａ．９０生産者細胞を受けた。各ヒツジに対して、各細 胞タイプのＧ４１８耐性コロニーの割合は、実施例３の検定手続きに従って測定 され、Ｇ４１８耐性コロニーの平均割合が各ヒツジで計数された。Ｇ４１８耐性 の平均割合は、次いで０ｍｇ／ｍｌ，０．５ｍｇ／ｍｌ，１．０ｍｇ／ｍｌ，１ ．５ｍｇ／ｍｌ，２．０ｍｇ／ｍｌ，２．５ｍｇ／ｍｌ、および３．０ｍｇ／ｍ ｌの濃度でＧ４１８に対してヒツジの（対照あるいは加療）各グループに対し計 数された。Ｇ４１８の用量を変更した対照ヒツジおよび 加療ヒツジにおけるＧ４１８耐性コロニーの割合が図１２で与えられる。 実施例６ 月齢６ケ月の４匹のヒツジが、実施例３の検定手続きに従って２ｍｇ／ｍｌの Ｇ４１８の存在下でＧ４１８耐性ＣＦＵ−Ｅ，ＢＦＵ−Ｅ、およびＣＦＵ−ＧＭ 細胞の存在を評価された。ヒツジ１は５×１０⁷ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳｖＮ ａ．９０生産者細胞を受けた。ヒツジ２は１×１０⁸ＰＡＴ２．４／Ｇ１ＴｋＳ ｖＮａ．９０生産者細胞を受けた。ヒツジ３は１ｍｌの１×１０⁴ＣＦＵ／ｍｌ のＧ１ＮａＳｖＡｄ．２４ウイルス上澄みを受け、またヒツジ４は５×１０⁷照 射ＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４生産者細胞を受けた。２ｍｇ／ｍｌのＧ ４１８に対する各ヒツジから得た細胞の耐性割合は以下の表IIで与えられる。 実施例７ 生きて生まれ、生産者細胞を受け、ｎｅｏ^R遺伝子を発現す るウイルス粒子を生産するすべてのヒツジは、またウイルス上澄みを受けた生き て生まれたすべてのヒツジは、前記記載の実施例３および５の検定に従って骨髄 細胞のＧ４１８耐性コロニーを２０ケ月にわたりモニターされた。すべての細胞 タイプ、および従ってウイルス上澄みあるいは生産者細胞を受けたすべてのヒツ ジのＧ４１８耐性細胞の平均パーセントが計数された。このようなモニターによ る結果が図１３で示されている。 実施例８ ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ細胞に対するＧ４１８およびガンシクロビル（ ＧＣＶ）の効果が前記実施例３の前記検定手続きに従って前記表IIのヒツジ１で 測定された。供試細胞は３ｍｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８、およびもしくは６μＭ の量のガンシクロビルと接触させられた。この結果は図１４で示される。 図１４で見られるように、Ｇ４１８あるいはガンシクロビルのいずれも投与さ れない場合と、ガンシクロビルが投与される場合のコロニー量の間の差異は、基 本的にはＧ４１８耐性コロニーの数と等しい。かくして、ガンシクロビルがネオ マイシン耐性の細胞すべてを死滅させることが暗示される。Ｇ４１８およびガン シクロビルが培地に存在する場合には、基本的には細胞コロニーは形成されず、 これはＧ４１８耐性の細胞がガンシクロビルに対し感受性であることを示してい る。 実施例９ 生きて生まれ、ｎｅｏ^R遺伝子を帯同する生産者細胞あるいはウイルス上澄み を与えられたすべてのヒツジにおけるｎｅｏ^R発現の割合は、２０ケ月にわたり ＣＦＵ−Ｍｉｘ，ＣＦＵ−ＧＭ，ＢＦＵ−Ｅ、およびＣＦＵ−Ｅ細胞との関連で モニターされた。すべてのヒツジの各タイプの細胞に対するＧ４１８耐性の平均 割合が計数され、その結果が図１５で与えられる。 実施例１０ ５×１０⁷照射ＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４生産者細胞を受けた１匹 のヒツジが、生産者細胞の注射１３ケ月後（あるいは生誕１０ケ月後）に犠牲に された。ＰＣＲ検定が次いでｎｅｏ^R遺伝子の存在を検定のため、肺、肝臓、腎 臓および精巣から分離されたＤＮＡについて行われた。ＰＣＲ検定は以下のよう に行われた。 ３００ナノグラムの全グラムＤＮＡが、サイキ、他、サイエンス、２３０巻、 １３５０−１３５４ページ（１９８５年）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）の手法により、一部反応成分を下記のように変更を加えて分析が行われ た：使用されたＰＣＲプライマーは０．５μＭのプライマー１および０．５μＭ のプライマー２であった。ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰは１５０μＭで 使用された。製品繰越しが偽陽性へと導く機会をとり除くために、ｄＵＴＰ（６ ００μＭ）がｄＴＴＰの代りにされ、ワン、他、アメリカ血液学ジャーナ ル 、４０巻、１４６−１４８ページ（１９９２年）の方法に従って、反応は増幅 の前にウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理された。ＭｇＣｌ₂ が５ｍＭで使用され、２．５ユニットのアンプリタックＤＮＡポリメラーゼ（す べてのＰＣＲ試薬はパーキン エルマーから購入された）が各５０μｌの反応液 に加えられた。プライマー１は次の配列を持つ： ５′−GGT GGA GAG GCT ATT CGG CTA TGA−３′ プライマー２は以下の配列である。 ５′−ATC CTG ATC GAC AAG ACC GGC TTC−３′ これらのプライマーは、ネオマイシン耐性遺伝子の４４０塩基対断片を増幅する 。サンプルはＵＤＧを不活性化するため９５℃で１０分加熱された１００ｕｌの 鉱油の上に置かれ、次いで４０サイクルのＰＣＲを受けた。 反応は自動ＰＣＲ温度サイクリングブロック内で進められ、それは９５℃で１ 分ＤＮＡの変性を可能にし、プライマーを６５℃で１．５分アニーリングし、プ ライマーを７２℃で１．５分拡張し、またプライマーを７２℃で１．５分拡張し た。４０回目のサイクル終了後、増幅産物が完全に拡張出来るように、また残存 ＵＤＧに起因する損傷を阻止するために、反応は７２℃で保持された。反応でク ロロホルム抽出が行われ、１５μｌの各生成水相が２％のアガロースゲル上にの せられ、トリスアセテート−ＥＤＴＡ内で電気泳動された。 精巣および腎臓から得たＤＮＡのＰＣＲ分析は、両組織がｎｅｏ^R遺伝子を含 有していたことを示した。しかし腎臓およ び精巣ゲノムにおけるプロウイルスの存在は、そのような器官が試験に対し何ら 病的状態の徴候を示さなかったので、動物に対し何も有害な効果をもたらすよう には見えなかった。このような結果は、操作レトロウイルスの胎児への直接注射 は、外来遺伝子を成長する胎児にデリバリし、受容体を危険にさらすことなく長 期の発現を達成する実現可能な手段であることを示している。 実施例１１ ５×１０⁷照射ＰＡ３１７／Ｇ１ＮａＳｖＡｄ．２４生産者細胞を受けた１匹 のヒツジが生産者細胞注射１８ケ月後（あるいは生誕１５ケ月後）に犠牲にされ た。ＰＣＲ検定が次いでｎｅｏ^R遺伝子の存在を知るため、脳から分離されたＤ ＮＡで行われた。ＰＣＲ検定は実施例１０で説明された通りに行われた。 脳のＤＮＡのＰＣＲ分析は、脳細胞がｎｅｏ^R遺伝子を含有していることを示 した。かくして操作レトロウイルスの胎児への直接注射が遺伝子を成長する胎児 の脳までデリバリ出来ることが示された。 ここで引用されたすべての文献がここに引用例としてとり込まれる。 しかし、この発明の範囲は前記の特異な実施例により限定されるものでないこ とは理解されねばならない。この発明は特に記載されたもの以外にも実施するこ とが可能であり、しかも以下に示される特許請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/16 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 38/43 9051−4Ｃ 37/04 9051−4Ｃ 37/20 (72)発明者 モリス，ライザ，エム. アメリカ合衆国，20872 メリーランド, ダマスカス，トラリー コート 25105 (72)発明者 ザンジャーニ，エズマイル，エム. アメリカ合衆国，98511 ネバダ，レノ, スライド マウンテン サークル 4360

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．胎児に生体内遺伝子治療を行う一つの方法であって、一つの治療薬をコード 化する少くとも１個の核酸配列で生体内胎児細胞を形質導入することよりなるこ とを特徴とする方法。 ２．請求の範囲第１項記載の方法であって、ここで前記胎児細胞が一つの治療薬 をコード化する前記の少くとも１個の核酸配列を含む一つのウイルスベクターで生体内 形質導入されることを特徴とする方法。 ３．請求の範囲第２項記載の方法であって、ここで前記ウイルスベクターが一つ のレトロウイルスベクターであることを特徴とする方法。 ４．請求の範囲第３項記載の方法であって、ここで胎児細胞の前記生体内形質導 入が前記レトロウイルスベクターを生成する前記胎児生産者細胞に投与すること によって行われることを特徴とする方法。 ５．胎児に生体内遺伝子治療を行う一つの方法であって、一つの治療薬をコード 化する少くとも１個の核酸配列を含む一つのレトロウイルスベクターで生体内胎 児細胞を形質導入することよりなることを特徴とする方法。 ６．請求の範囲第５項記載の方法であって、ここで前記胎児細胞の生体内形質導 入が前記レトロウイルスベクターを生成する前記胎児生産者細胞に投与すること によって行われることを特徴とする方法。 ７．請求の範囲第３項記載の方法であって、ここで胎児細胞の 前記生体内形質導入が前記レトロウイルスベクターを含む一つのウイルス上澄み を前記胎児に投与することにより行われることを特徴とする方法。 ８．請求の範囲第５項記載の方法であって、ここで胎児細胞の前記生体内形質導 入が前記レトロウイルスベクターを含む一つのウイルス上澄みを前記胎児に投与 することにより行われることを特徴とする方法。 ９．請求の範囲第４項記載の方法であって、ここで前記生産者細胞が腹腔内に投 与されることを特徴とする方法。 １０．請求の範囲第６項記載の方法であって、ここで前記生産者細胞が腹腔内に 投与されることを特徴とする方法。 １１．請求の範囲第７項記載の方法であって、ここで前記ウイルス上澄みが腹腔 内に投与されることを特徴とする方法。 １２．請求の範囲第８項記載の方法であって、ここで前記ウイルス上澄みが腹腔 内に投与されることを特徴とする方法。