ES2231774T3 - Vectores retrovirales para transducir genes de beta-globina y derivados de la region de control del locus beta. - Google Patents
Vectores retrovirales para transducir genes de beta-globina y derivados de la region de control del locus beta.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN UN PROCESO Y ELEMENTO PARA EL DISEÑO Y LA OPTIMIZACION DE VECTORES RETROVIRALES QUE TRANSDUCEN GENES DE {BE}-GLOBINA Y DERIVADOS DE UNA REGION DE CONTROL DE POSICION {BE} ({BE}-LCR), DE AHORA EN ADELANTE DENOMINADOS RETROVIRUS [{BE}-GLOBINA/LCR], QUE SATISFACEN BIEN LOS SIGUIENTES CRITERIOS REQUERIDOS PARA APLICACIONES DE TERAPIA GENICA: (1) ESTABILIDAD A UNA TRANSMISION PROVIRAL (BAJA FRECUENCIA DE REDISPOSICIONES SIMILARES A LA DE LOS VECTORES VIRALES CONSIDERADOS ESTABLES EN LA MATERIA) TRAS LA INFECCION DE LINEAS CELULARES Y DE CELULAS DE MEDULA OSEA DE MURINO, (2) TITRACION VIRAL MEJORADA, LO QUE PERMITE UNA INFECCION CON EXITO DE LAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA Y (3) ALTA EXPRESION ERITROIDE DEL GEN DE {BE}-GLOBINA HUMANO TRANSDUCIDO, ASI COMO ESTRUCTURAS ESPECIFICAS.
Description
Vectores retrovirales para transducir genes de
\beta-globina y derivados de la región de control
del locus \beta.
La presente invención está en el campo de la
genética molecular y, en particular, se refiere al campo de vectores
retrovirales y métodos para fabricar estos vectores para transducir
genes de \beta-globina y derivados de la región de
control del locus \beta.
Las \beta-talasemias y la
anemia drepanocítica son trastornos genéticos humanos del gen de la
\beta-globina con graves manifestaciones clínicas
en los homocigotos. En la actualidad, el transplante alógeno de
médula ósea representa la mejor posibilidad disponible de cura para
estos pacientes. Desafortunadamente, pocos pueden encontrar un
donante con el mismo HLA e incluso aunque hubiese un donante con el
mismo HLA, muchos se enfrentarían a graves complicaciones en el
procedimiento de transplante de médula ósea tal como la enfermedad
de injerto frente a huésped (Parkman, R., Science
232:1373-1378 (1986)). Por estas razones, la terapia
genética que usa células madre hematopoyéticas totipotentes
autólogas modificadas genéticamente (THSC) es una alternativa
atractiva para el transplante alógeno de médula ósea. Como la
especificación genética por recombinación homóloga todavía no es
técnicamente posible en THSC, la estrategia más realista es obtener
una integración estable del gen de \beta-globina
humano normal y de sus elementos reguladores con acción cis en el
genoma de THSC. Esto puede realizarse mediante transferencia
genética mediada por retrovirus, una técnica eficaz de transferencia
genética aplicable a estas células (Fraser et al., Blood,
76:1071-1076 (1990)).
Los experimentos de transferencia genética han
demostrado previamente que los elementos proximales de acción cis
del gen de \beta-globina humano son insuficientes
para las aplicaciones en terapia ya que proporcionan una expresión
muy baja, dependiente del sitio de integración del transgen de
\beta-globina humano (menos del 1 a 5% en la
relación de ARNm
\beta-globina/\beta_{maj}-globina
murina) (Cone et al., Mol. Cell Biol.
7:887-897 (1987); Dzierzak et al., Nature
331:35-41 (1988); Karlsson et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:6062-6066 (1988); Miller et
al., J. Virol., 62:4337-4345 (1988); Bender
et al., Mol. Cell. Biol., 9:1426-1434
(1989)). El descubrimiento de sitios hipersensibles (HS) en sentido
ascendente del locus del gen de \beta-globina
humano, que constituyen la región de Control de Locus \beta
(\beta-LCR), ha dado nueva esperanzas de obtener
una terapia genética satisfactoria de trastornos del gen de la
\beta-globina humana. (Tuan y London, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81:2718-2722 (1984); Tuan
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:6384-6388 (1985); Forrester et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:5439-5443 (1989);
Grosveld et al., Cell 51:975-985 (1987)). Los
derivados de LCR pueden conferir una alta expresión eritroide
específica independiente del sitio de expresión de un gen de
\beta-globina en ratones transgénicos y células de
eritroleucemia murina (MEL), que imitan la diferenciación eritroide
en adultos (Grosveld et al., Cell 51:975-985
(1987)). Como la actividad de cada sitio HS se ha localizado en
pequeños fragmentos de ADN (Patente de Estados Unidos Nº. 5.126.260;
Curtin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:7082-7086 (1989); Forrester et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5439-5443
(1989); Ryan et al., Genes Dev. 3:314-323
(1989); Tuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86:2554-2558 (1989); Collis et al., EMBO J.,
9:233-240 (1990); Ney et al., Genes Dev.
4:993-1006 (1990); Philipsen et al., EMBO J.,
9:2159-2167 (1990); Talbot et al., EMBO J.,.
9:2169-2178 (1990); Pruzina et al., Nucleic Acids
Res., 19:1413-1419 (1991); Walters et al.,
Nucleic Acids Res., 19:5385-5393 (1991)), ahora
es posible construir vectores retrovirales que transducen derivados
de \beta-LCR unidos al gen de
\beta-globina humano y sus elementos proximales de
acción cis (Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
87:3386-3390 (1990); Chang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:3107-3110 (1992)). Sin
embargo, estos retrovirus [\beta-globina/LCR]
tienen baja titulación, son muy inestables con múltiples
redisposiciones después de la transmisión de la estructura proviral
y proporcionan una mejora relativamente modesta y altamente variable
de la expresión del gel \beta-globina en células
de eritroleucemia murina infectadas (MEL) (Novak et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3386-3390
(1990); Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:3107-3110 (1992)). La Patente de Estados Unidos
Nº. 5.126.260 describe sitios hipersensibles a la DNAasa que
constituyen el \beta-LCR y, en particular,
identifica el promotor HS2 en la estructura
\beta-LCR. La Patente de Estados Unidos Nº.
5.126.260 también reivindica el uso de \beta-LCR y
derivados de HS2 en los protocolos de transferencia genética,
incluyendo transferencia genética mediada por retrovirus, obteniendo
un alto nivel de expresión del gen de
\beta-globina humana. Sin embargo, la Patente de
Estados Unidos Nº. 5.126.260 no identifica medios específicos con
los que se puede conseguir la transmisión proviral estable de
retrovirus [\beta-globina/LCR].
Por lo tanto, es un objeto de la presente
invención proporcionar vectores retrovirales para la transducción
estable del gen de \beta-globina y de derivados de
la región de control del locus \beta y otros genes específicos
eritroides.
Se proporcionan vectores retrovirales que pueden
transducir el gen de \beta-globina humano y
derivados de la Región de Control del Locus \beta
(\beta-LCR), denominados en lo sucesivo vectores
retrovirales [\beta-globina/LCR]. Los vectores
retrovirales [B-globina/LCR] cumplen
satisfactoriamente los siguientes criterios para una terapia
genética satisfactoria: (1) estabilidad de transmisión proviral o
baja frecuencia de redisposiciones similar a la de los vectores
retrovirales considerados estables en la técnica, después de la
infección de líneas celulares y células de médula ósea murina; (2)
mayor titulación viral, permitiendo por tanto la infección exitosa
de células de médula ósea; y (3) alta expresión eritroide del gen de
\beta-globina humano transducido, definida en este
documento como más del 50% en la relación de ARNm
\beta-globina humana con ARNm de
\beta-globina murina por gen en lotes de células
infectadas y células con eritroleucemia murina (MEL) inducida con
dimetilsulfóxido (DMSO).
Las construcciones específicas que cumplen los
criterios presentados anteriormente se describen detalladamente a
continuación.
También se describen los medios específicos para
diseñar vectores retrovirales [B-globina/LCR]
adicionales que cumplen estos criterios.
Los vectores mejorados son útiles en el
tratamiento de una diversidad de trastornos que incluyen
\beta-talasemia y anemia drepanocítica.
La Figura 1 es una representación esquemática del
diseño general de los vectores retrovirales
(\beta-globina/LCR) de la presente invención.
Las Figuras 2A-D son
reproducciones de un análisis por ordenador de transferencias
Southern que muestran transmisión proviral de los retrovirus
[\beta-globina/LCR) usando una sonda específica
Neo^{R}. La Figura 2A muestra múltiples redisposiciones en líneas
celulares infectadas con un virus
[\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]. El ADN genómico
de células infectadas se digirió con Sac1. El carril P representa
ADN genómico de células infectadas con una agrupación de
productores. Los carriles derechas representan ADN genómico de
células infectadas con clones de productores independientes. La
posición esperada del provirus correcto se indica con una flecha. La
Figura 2B muestra una transmisión proviral estable en líneas
celulares infectadas obtenidas con vectores
[\betaglobina/LCR]^{mut}. El ADN genómico y los plásmidos
de control se digirieron con Sac1. Los carriles izquierdas muestran
plásmidos como controles de tamaño donde el carril 1 es
[\beta-globina/HS2/PGK]^{mut}; el carril
2 es [\beta-globina/(HS2+HS3+[4xCP2
HS4])/PGK]^{mut}; el carril 3 es
[\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]^{mut};
el carril 4 es
[\beta-globina/HS2/PGK/Neo^{R}-]^{mut}; el
carril 5 es [\beta-globina/ (HS2+HS3+[ 4xCP2 HS4
]) /PGK/Neo^{R}-]^{mut}; el carril 6 es
[\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK/Neo^{R}-]^{mut}.
Los carriles derechas muestran ADN genómico de células infectadas.
Se usó una agrupación de productores para infectar células en los
carriles 1, 2, 3 y 4, mientras que se usaron clones simples de
productores para infectar los carriles 5, 6 y 7. El carril 1 es
[\beta-globina/HS2/SV40]^{mut}; los
carriles 2, 5, 6 y 7 son [\beta-globina/HS2/PGK]
^{mut}; el carril 3 es
[\beta-globina/(HS2+HS3+[4xCP2
HS4])/PGK]^{mut}; y el carril 4 es
[\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]^{mut}.
En el carril 3 hay presente un componente redispuesto secundario. La
figura 2C muestra una transferencia Southern dirigida a detectar
micro-redisposiciones en la inserción de Y
transducido digiriendo Y genómicos con Sma1, que se localiza en
ambos LTR así como entre derivados LCR y en el módulo interno
PGK/NeoR. Los carriles 1 a 7 son idénticas a los carriles derechas 1
a 7 de la figura 2B, excepto por el hecho de que los ADN se
digirieron con Sma1 en lugar de Sac1. La flecha marcada como
"a" muestra la posición correcta del carril 1 ya que no hay
ningún sitio Sma1 en sentido ascendente del promotor SV40. La flecha
marcada como "p" muestra una carril anormal en el carril 3 que
corresponde a la forma redispuesta secundario descrita
anteriormente. La flecha marcada como "c" muestra la estructura
proviral correcta para construcciones que transducen el promotor
PGK. La figura 2D muestra la transmisión proviral después del
transplante de médula ósea en ratones. Los ADN genómicos de bazos
infectados (13 días post-implante) y de líneas
celulares de control se digirieron con Sac1. Los carriles izquierdas
1 y 2 contienen controles de tamaño que corresponden a los carriles
1 y 3 de la Figura 2B. Los carriles derechas HS2 (1, 2, 3) muestran
los resultados de los tres ratones transplantados con
[\beta-globina/HS2/PGK]^{mut} obtenidos
con una agrupación de productores virales. Los carriles derechos Zen
(1, 2, 3) muestran los resultados de tres ratones transplantados con
virus de control Zen. Los carriles HS2+HS3+[4xCP2 de HS4] (1, 2)
muestran los resultados de dos ratones transplantados con
(\beta-globina/ (HS2+HS3+[4xCP2 HS4
])/PGK]mut con una agrupación de productores virales.
Las figuras 3a-3b son un análisis
de secuencia de ADN de construcciones
[\beta-globina/LCR], detectando la presencia de
secuencias potencialmente perjudiciales tales como sitios de ayuste
5' (5'SS), sitios de ayuste 3' (3'SS) y sitios de ramificación (PBS)
y señales de poliadenilación (poliA). Los aciertos o fallos con
secuencias consensuadas se indican con letras mayúsculas o
minúsculas, respectivamente. Las regiones mutadas por mutagénesis
dirigida por sitio o procedimientos relacionados se indican con un
asterisco.
Las figuras 4A-F son
representaciones esquemáticas de las etapas implicadas en el
procedimiento de mutagénesis usado para producir las construcciones
retrovirales de la presente invención. El sistema de numeración
corresponde al de las figuras 3a-3b y
5a-5c. La figura 4A muestra de eliminación mediada
por RCP del fragmento de 372 pb [Rsa1-Rsa1]
en el intrón 2. Se realizaron dos reacciones RCP independientes
usando dos pares de cebadores que solapan los sitios intragénicos
EcoRl (1908), Rsa1 (2345), Rsa1 (2717) y BamHl (2820),
respectivamente. Para marcar la región de codificación de los genes
para estudios posteriores, se introdujeron mutaciones que sustituían
dos aminoácidos de \beta- con aminoácidos de
\delta-globina en el cebador EcoR1. Los
productos de RCP se digirieron con EcoR1, BamH1 y Rsa1.
Posteriormente se realizó una triple ligadura con el vector
[\beta-globina] precursor abierto en los sitios
EcoR1 y BamH1. La figura 4B muestra que la región [1665 a
1770] se reconstituyó y mutó por ligadura de cuatro oligonucleótidos
complementarios y solapados con el vector LXSN abierto en los sitios
EcoR1 y Xba1. Se incluyó un poliengarce en la secuencia de
oligonucleótidos para prepararse para etapas posteriores de la
construcción. Solo se fosforilaron dos de los cuatro
oligonucleótidos para evitar concatémeroización después de la
ligadura. El producto de ligadura se digirió con Xho1 antes de la
transformación para eliminar el plásmido precursor. La figura 4C
muestra que la región [1770 a 2185] se reconstituyó y mutó por
construcción mediada por RCP. Se introdujeron mutaciones puntuales y
sitios de restricción adicionales por (Mlu1 y Hind3)
en los cebadores RCP. Estos nuevos sitios permitieron la ligadura
con el vector obtenido en la etapa mostrada en la figura 4b abierto
en los sitios Mlu1 y Hind3. El producto de ligadura se
digirió con BamH1 antes de la transformación para eliminar el
plásmido precursor. La figura 4D muestra que la región [2185 a 3250]
se reconstituyó y mutó por construcción mediada por RCP con un
enfoque similar a la etapa mostrada en la figura 4C. La plantilla
usada contenía la eliminación intrónica de 372 pb obtenida en la
etapa mostrada en la figura 4A. Después de cortar el vector y el
fragmento de RCP con Sac1 y Nco1, se realizó la ligadura con
un vector que contenía HS2, el promotor
\beta-globina y la primera parte del gen. El
producto de ligadura se digirió con Sma1 antes de la transformación
para eliminar el plásmido precursor.
La figura 4E muestra que la inserción
[Hind3-Bgl2) de la construcción mostrada en
la figura 4D se ligó con el esqueleto de la construcción mostrada en
la figura 4C abierto con Hind3 y Bgl2. El producto de
ligadura se digirió con Cla1 antes de la transformación para
eliminar plásmidos precursor y formas no deseadas. La figura 4F
muestra que la construcción retroviral
[B^{-}globina/HS2]^{mut} final se obtuvo ligando un
fragmento [Bgl1-Bgl2] de la construcción
mostrada en la figura 4E con un fragmento
[Bgl2-Bgl1] que contenía un módulo
potenciador/promotor/NeoR y un MoMLV LTR con
[Pvu2-Xbal) suprimido. El producto de
ligadura se digirió con Apa1 antes de la transformación para
eliminar plásmidos precursores y formas no deseadas. La precisión de
la construcción se verificó por secuenciación de ADN.
Las figuras 5a-5c son la
secuencia de ADN (Lista de Secuencia ID Nº 1) del gen de
\beta-globina humano transducido de forma
retroviral con orientación C/I, desde la base 1665 a 3325 de acuerdo
con el sistema de numeración descrito en las figuras
3a-3b. Los tres exones, dos intrones y el promotor
se indican. La eliminación de 372 pb [Rsa1-Rsa1] en
el intrón 2 está subrayada. Se indica el PoliA mutado y 3'SS.
Las mutaciones puntuales introducidas por mutagénesis se muestran a
continuación de la secuencia natural. Se indican los codones
mantenidos o sustituidos con codones correspondientes del gen
\delta-globina humana. Los sitios de restricción
relevantes en la mutagénesis están encuadrados y numerados. Los
oligonucleótidos usados para la mutagénesis se representan con
flechas.
Las figuras 6A-D son
reproducciones de un análisis por ordenador de un ensayos de
protección de ARN. Las pistas izquierda y derecha de cada carril
contienen una sonda \beta-globina específica
murina y una sonda \beta-globina específica
humana, respectivamente. Las posiciones de fragmentos protegidos
específicos se indican con letras minúsculas a la derecha de cada
transferencia. El carril para la \beta humana es "a", la
\beta_{maj} murina es b y la \beta_{min} murina es c. Los
carriles izquierdos M y H de la figura 6A muestran las posiciones de
sondas murina no digeridas (M) y humana (H). El carril 1 es ARN
extraído de una agrupación (>100) de células con MEL inducida por
DMSO, G418 seleccionadas, electroporadas (media de tres copias por
células) usando una construcción
[\beta-globina/HS2/PGK]. Los carriles 2 a 5 son
ARN extraído de una agrupación (> 100) de células con MEL
inducida por DMSO, G418 seleccionadas infectadas (un provirus por
célula) donde el carril 2 es
[\beta-globina/HS2/SV40]^{mut}, el carril
3 es [\beta-globina/HS2/PGK) , el carril 4 es
[\beta-globina/(HS2+HS3+(4xCP2 HS4))/PGK] y el
carril 5 es
[\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]^{mut}.
La figura 6B es una reproducción de ensayos de protección de ARN
usando ARN extraído de células obtenidas con ensayos clonogénicos
in vitro después de una infección de células de médula ósea
murina con [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut}.
La figura 6C muestra el efecto de promotores heterólogos en donde el
ARN se extrajo de una agrupación (> 100) de células MEL inducida
con DMSO, G418 seleccionadas infectadas (un provirus por célula) y
en donde el carril 1 es [\beta-globina/
(HS2+[4x23pb HS2))/F441 Py)^{mut}, el carril 2 es
[\beta-globina/HS2/F441 Py)^{mut}, el
carril 3 es [\beta-globina/HS2/SV40]^{mut}, el
carril 4 es [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut}
y el carril 5 es
[\beta-globina/SV40]^{mut}. La figura 6D
muestra ensayos de protección de ARN dirigidos a medir la
variabilidad de expresión dependiente de la posición. Los carriles 1
a 6 muestran ARN extraído de clones individuales de células MEL
inducida con DMSO, G418 seleccionadas infectadas (un provirus por
célula), usando la construcción
[\beta-globina/HS2/PGK)^{mut}.
La invención proporciona un método para fabricar
un vector retroviral para transducir genes de
\beta-globina y secuencias LCR \beta que
comprende las etapas de
(a) proporcionar un vector retroviral en
combinación con un gen de \beta-globina o un
derivado del mismo y una porción eficaz de un promotor HS2 del LCR
\beta, con o sin sitios LCR \beta adicionales para conseguir la
transducción y expresión del gen de \beta-globina
o derivado del mismo, y
(b) eliminar por mutación el segmento rico en A/T
en el segundo intrón del gen de \beta-globina,
señales de ayuste complementarias/inversas y una señal de
poliadenilación en el vector retroviral, para formar un vector
retroviral caracterizado por
- i)
- estabilidad de la transmisión proviral en la infección de líneas celulares y células de médula ósea murina,
- ii)
- titulación viral eficaz para conseguir infección de células de médula ósea, y
- iii)
- alta expresión eritroide del gen de \beta-globina humana transducido.
Los vectores retrovirales fabricados de acuerdo
con este método pueden transducir el gen de la
\beta-globina humana y derivados de la Región de
Control Locus \beta (\beta-LCR) (los vectores
retrovirales [\beta-globina/LCR]), para el
tratamiento de trastornos tales como
\beta-talasemia y anemia drepanocítica por terapia
genética, y se proporcionan métodos para producir estos vectores.
Estos vectores retrovirales [\beta-globina/LCR]
son superiores a los vectores retrovirales disponibles en la
actualidad ya que (1) muestran una transmisión proviral estable con
baja frecuencia de redisposiciones en la infección de líneas
celulares y células de médula ósea murina, (2) producen mayores
titulaciones virales, permitiendo por tanto la infección
satisfactoria de de células de médula ósea, definida en este
documento como más de 10^{5} colonias NIH 3T3 resistentes a G418
por ml de sobrenadante viral en condiciones convencionales, y (3)
causan una alta expresión de eritroides del gen de la
\beta-globina humana transducido, definida en este
documento como más del 50% en la reacción de ARNm de
\beta-globina humana con ARNm de
\beta_{maj}-globina murina por gen en grupos de
células de eritroleucemia murina (MEL) inducida con dimetilsulfóxido
e infectadas.
Se han identificado estructuras que se suponen
responsables de la inestabilidad proviral y baja titulación de los
vectores retrovirales [\beta-globina/LCR]
disponibles en la actualidad. Éstas incluyen un segmento rico en A/T
en el segundo intrón del gen de la \beta-globina
humana y varias señas de poliadenilación complementarias/inversas
(C/I) y sitios de ayuste. La mutagénesis extensiva del gel de la
\beta-globina humana que da como resultado la
eliminación de estas estructuras hace la transmisión proviral
estable en la infección de líneas celulares y células madre de
médula ósea murina, aumenta diez veces la titulación viral y no
afecta de forma significativa a la expresión del gen de la
\beta-globina transducido. Los vectores
retrovirales optimizados descritos en este documento han permitido
el estudio de las propiedades de expresión de distintos derivados de
\beta-LCR transducidos retroviralmente en células
MEL inducida con DMSO y han permitido alcanzar más del 50% en la
relación de ARNm de \beta-globina
human/\beta_{maj}-globina murina gen a gen.
También se ha abordado la cuestión de la expresión independiente de
la posición después de la integración cromosómica. También se ha
analizado la influencia de potenciadores/promotores heterólogos en
la expresión del gen de la \beta-globina
transducido retroviralmente cuando se une en posición cis a
derivados de LCR \beta.
Como se usa en este documento, un retrovirus es
un virus animal que pertenece a la familia de virus de Retroviridae,
incluyendo cualquier tipo, subfamilia, género o tropismos.
Los vectores retrovirales, en general, se
describen en Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. En
MICROBIOLOGY-1985, American Society for
Microbiology, p. 229-232, Washington, 1985,
que se incorpora por referencia en este documento.
Las estructuras supuestas responsables de la
inestabilidad proviral y baja titulación se identificaron mediante
el siguiente procedimiento. Se realizó una búsqueda por ordenador en
el gen de \beta-globina y derivados
\beta-LCR que pudiesen ser causas potenciales de
redisposiciones retrovirales. Se han descrito previamente dos
mecanismos generales de inestabilidad retroviral: (1) ayustes
inapropiados o poliadenilación que crea eliminaciones en el ARN
genómico y/o (2) redisposiciones durante las etapas de transcripción
inversa desencadenadas normalmente por distintos tipos de secuencias
repetidas. La búsqueda por ordenador se realizó por tanto para un
concatémero virtual que representa un segmento de ADN de 5 kb
compuesto, de 5' a 3', por la señal de empaquetado híbrida extendida
de 814 pb (\Psi+); el fragmento de 2748 pb que contiene el
gen de la \beta-globina humana y su promotor, en
orientación complementaria/inversa (C/I); el fragmento HS2 de 374
pb, en orientación C/I; el fragmento HS3 de 287 pb, en orientación
directa; el fragmento HS4 de 243 pb, en orientación C/I; el promotor
fosfoglicerato quinasa-1 (PGK) murina de 583 pb, en
orientación directa. Los elementos en sentido ascendente o
descendente de este segmento de 5 kb no se incluyeron es esta
búsqueda, porque las redisposiciones en los LTR o marcadores de
resistencia antibiótica (Neo^{R}) no serían compatibles muy
probablemente con la transmisión viral de resistencia G418.
Se identificaron cinco señales de escisión
[AATAAA] C/I /poliadenilación (poliA), todas localizadas en el gen
de \beta-globina, como se muestra en las figuras
3a-3b y 5a-5c. No se detectó ningún
elemento poliA en sentido descendente tal como [T]n,
[GT]n o [YGTGTTYY] en la mayoría de ellas, excepto por la
poliA en la posición 1704 en la figura 3a, que está seguida de nueve
[T] en un segmento de 11 pb en sentido inmediatamente descendente.
Para las señales de ayuste, el consenso descrito en animales
vertebrados presentado por Krainer y Maniatis, (1988) En Hames, B.,
D., y Glover, D., M. (ed.), TRANSCRIPTION AND SPLICING (IRL Press,
Oxford) p. 131-206):
[C_{38}/A_{39}A_{62}G_{77}G_{100}T_{100}A_{60}A_{74}G_{84}T_{50}]
para 5'SS,
[Y_{77}Y_{78}Y_{81}Y_{83}Y_{89}Y_{85}Y_{82}Y_{81}Y_{86}Y_{91}Y_{87}NY_{97}A_{100}G_{100}]
para 3'SS y
[Y_{13/16}NY_{16/16}T_{14/16}R_{13/16}A_{16/16}Y_{15/16})
para sitios de ramificación (BPS) 2 a 21 pb en sentido ascendente de
un 3'SS putativo. Además, los 5'SS se agruparon de acuerdo con las
siguientes cinco clases descritas previamente por Krainer y
Maniatis, supra (1988): clase I = AGGTA; clase II = GTAAG;
clase III = RGGTGAG; y clase IV = AGGTNNGT.
Se identificaron dieciocho 5'SS potenciales con
dos errores o menos treinta y dos 3'SS potenciales con tres errores
o menos, como se muestra en las figuras 3a-3b y
5a-5c. Con respecto a repeticiones directas, se notó
una región muy rica en A/T, incluyendo repeticiones directas en
tándem degeneradas de motivos tales como [AAAAT]n o la
variante [AAAAN]n en el intrón 2, como se muestra en las
figuras 5a-5c. Tres de los sitios poliA C/I están
presentes en esta área rica en A/T, que también se ha descrito en
Miller et al., J. Virol. 62:4337-4345
(1988) que tiene un posible efecto perjudicial en la propagación de
vectores retrovirales de [\beta-globina]. Otra
repetición tándem extendida [ATTTATATGCAGAAATATT] (Listado de
Secuencia ID Nº 2) se encontró en el intrón 2, como se muestra en
las figuras 5a-5c. No se detectó homología con
elementos retrovirales constitutivos tales como \Psi+, sitio de
unión del cebador de ARNt o LTR que incluye el motivo de integración
(IN). No se detectó una fuerte homología con la pista de polipurina
para la escisión por la ARNasa H de ARN genómico viral ni la
iniciación de la cadena positiva strong-stop, aunque
se identificaron dos segmentos de polipurina en el intrón 2:
[GGAGAAGAAAAAAAAAGAAAG] (Lista de Secuencias Nº 3) y
[AGAAAAGAAGGGGAAAGAAAA] (Lista de Secuencias Nº 4), como se muestra
en las figuras 5a-5c. No se detectaron repeticiones
invertidas extensas.
El diseño general de los vectores retrovirales
[\beta-globina/LCR] de la presente invención se
describe en la figura 1. El gen de la
\beta-globina se inserta en orientación inversa
con respecto a la dirección de transcripción del provirus, para
evitar el ayuste de los intrones de la
\beta-globina en el ARN genómico viral antes de la
transcripción inversa. Todas las construcciones de estos ejemplos se
derivan del vector LXSN (Miller y Rosman, BioTechniques,
7:980-990 (1989), cuyo contenido se incorpora
como referencia a este documento), sin embargo, puede usarse
cualquier otro vector basado en retrovirus.
Las características principales de LXSN (Dusty
Miller, The Fred Hutchinson Center, Seattle, WA) incluyen de 5' a
3': el LTR izquierdo del virus de sarcoma murina Moloney (MoMSV), el
sitio de unión del cebador ARNt (PBS) de MoMSV, una señal de
empaquetado híbrida extendida (\Psi+) descrita a
continuación, un poliengarce para la inserción de ADN, un
potenciador interno de SV40/promotor prematuro que proporciona un
gen NeoR, la pista polipurina del virus de leucemia murina Moloney
(MoMLV) y el LTR de derecho de MoMLV. \Psi+ se extiende en la
región gag para la producción de virus con alta titulación. Para
evitar la expresión de las proteínas gag MoMLV gp85 y p65, el codón
de inicio gag p65 de este vector se muta en un codón de parada y la
parte ascendente del vector (desde el LTR izquierdo hasta la parte
5' de \Psi+) se sustituye con secuencias homólogas de MoMSV que no
expresan gag gp85. Esta región también contiene un intrón híbrido
con 5'SS de MoMSV y 3'SS críptico de MoMLV.
El extremo 5' del promotor de la
\beta-globina humana es el sitio SnaB1 266
pb en sentido ascendente del sitio CAP. El extremo 3' se optimizó
eliminando la mayor parte de la región alrededor de 3' del gen de la
\beta-globina humana. Solo se mantuvieron 30 pb en
sentido descendente del gen, para permitir la
escisión/poliadenilación normal del gen de la
\beta-globina humana. El LTR derecho se mantuvo
intacto o se diseñó un vector auto-inactivante
creando en el LTR 3' de LXSN una eliminación de 176 pb
[Pvu2-Xba1] descrita previamente en
pZipNeoSV(X)1 por Cone et al., Mol. Cell
Biol. 7:887-897 (1987) y Dzierzak et al.,
Nature 331:35-41 (1988), cuyo contenido se
incorpora como referencia a este documento.
Con respecto a los derivados de LCR, todas las
construcciones contienen un fragmento de 374 pb
[Hind3-Xba1] que contiene el potenciados HS2
descrito en la Patente de Estados Unidos 5.126.260, cuyo contenido
se incorpora como referencia a este documento. Además del
potenciador HS2 potenciador, una construcción contiene un fragmento
HS3 de 287 pb obtenido por RCP comenzando 21 pb en sendito
ascendente [AGACCCT ...] y acabando 41 pb en sentido descendente
[... CCTATAC] del núcleo HS3 de 225 pb
[Hph1-Fnu4H1] descrito por Philipsen et
al., EMBO J. 9:2159-2167 (1990) y un
fragmento HS4 de 243 pb obtenido por RCP comenzando 27 pb en sentido
descendente [GGGTATA ...] y acabando en el sitio Ava1 del
fragmento de núcleo HS4 de 280 pb [Sst1-Ava1] descrito
por Pruzina et al., Nucleic Acid. Res.
19:1413-1419 (1991). Otra construcción contiene
solamente en fragmento HS4 descrito anteriormente próximo al
fragmento potenciador HS2, sin HS3.
El potenciador SV40/promotor prematuro que
proporciona NeoR de LXSN se sustituyó con el módulo potenciador F441
Py/promotor TK/NeoR de PMClneo (Stratagene, San Diego, CA) o un
módulo promotor fosfoglicerato quinasa (PGK-1)/NeoR
(obtenido de Rudolf Jaenisch, The Whitehead Institute, Cambridge,
MA). En algunas construcciones, se eliminó el módulo potenciador
heterólogo/NeoR para aumentar la titulación viral, aunque no había
posibilidad de selección.
Los marcadores de selección que pueden insertarse
en los vectores retrovirales incluyen además del gen de resistencia
de la neomicina/G418, un gen de resistencia a la higromicina, un gen
de resistencia a la puromicina, un gen de resistencia a la
fleomicina, un gen dihidrofolato reductasa y un gen de resistencia
multifármaco. Otros marcadores que pueden usarse incluyen cualquier
molécula, tal como el gen que codifica la
\beta-galactosidasa, que interactúa con un
sustrato produciendo una célula coloreada, o una molécula que se
expresa en la membrana celular y se usa en un procedimiento de
clasificación de células, por ejemplo, por interacción con un
anticuerpo específico.
Las anteriores modificaciones del gen de
\beta-globina transducido y los derivados de
\beta-LCR causaron una mayor titulación viral,
recuperaron la estabilidad de la transmisión proviral en líneas
celulares y células madre de médula ósea y no impidieron la
expresión del gen de la \beta-globina
transducido.
Inicialmente, se intentó la eliminación de los
segmentos de ADN potencialmente perjudiciales para la titulación y
la estabilidad, probablemente neutros para la expresión del gen de
\beta-globina. Se eliminó un fragmento de 372 pb
del intrón 2 entre dos sitios Rsa1 localizados
respectivamente en +580 y +952 a partir del sitio cap de la
\beta-globina humana. Este fragmento eliminado
contiene la mayor parte de segmento satélite rico en A/T similar al
ADN, tres de los cinco sitios poliA potenciales y una de las pistas
de polipurina. Este segmento eliminado es claramente distante de las
estructuras intrónicas esenciales tales como 5'SS, 3'SS, puntos de
ramificación y potenciador intragénico. Como los sitios Rsa1
son elementos de escisión, esta eliminación se realizó por RCP
recombinante, como se muestra en las figuras 4A y
5a-5c.
Los resultados indican que la eliminación de 372
pb en el intrón 2 y el acortamiento de la región alrededor de 3'
aumenta la titulación viral de construcciones
[\beta-globina/LCR] en diez veces (Tabla I), pero
no puede evitar por sí misma la inestabilidad de la transmisión
proviral en presencia de derivados BLCR complejos tales como [HS2 +
HS3 + HS4].
\begin{minipage}[t]{153mm} a Agrupación de más de 100 clones de células MEL resistentes a G418. Valores corregidos para actividades específicas de las sondas por gen (una copia proviral por célula en células MEL pseudo-diploides)\end{minipage} |
\begin{minipage}[t]{153mm} b Titulaciones de los mejores productores \Psicre, medidas por transmisión de resistencia a G418 a células NIH 3T3 (cfu/ml).\end{minipage} |
\begin{minipage}[t]{153mm} c Construcción proporcionada por R. Mulligan, Whitehead Institute y MIT, Cambridge, MA, y descrita por Cone, et al., Mol. Cell Biol. 7:887-897 (1987) y Dzierzak, et al., Nature 331:35-41 (1988)\end{minipage} |
\begin{minipage}[t]{153mm} d Con esta construcción se observó la eliminación de parte de la región alrededor de 3' del gen de \beta-globina humana transducido.\end{minipage} |
También se realizó una eliminación más extensa de
774 pb en el intrón 2 con resultados similares. La secuencia de este
nuevo intrón, construido mediante construcción mediada con
oligonucleótidos, es CTGTGGGAGGAAGATA
AGAGGGATGAACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACGCGTCATCA AGGGTCCCATAGACTCAC (representado en orientación complementaria/inversa; las bases sustituidas o introducidas están subrayadas) (Lista de Secuencias Nº 5).
AGAGGGATGAACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACGCGTCATCA AGGGTCCCATAGACTCAC (representado en orientación complementaria/inversa; las bases sustituidas o introducidas están subrayadas) (Lista de Secuencias Nº 5).
En un esfuerzo adicional para estabilizar la
transmisión proviral de vectores retrovirales
[\beta-globina/LCR], se realizó una mutagénesis
extendida dirigida a un sitio para eliminar otros SS y señales poliA
complementarias/inversas. Como hubo indicaciones de que la mayoría
de las redisposiciones tenían lugar en el gen de
\beta-globina transducido, el esfuerzo se
concentró en los sitios SS potenciales localizados en el gen de
\beta-globina y la primera fase de la mutagénesis
se limitó a 3'SS. En este proceso, se tomaron precauciones para no
alterar características conocidas con actuación cis y regiones de
codificación. Por consiguiente, siete de los diez 3'SS C/I
potenciales localizados en el gen de \beta-globina
se destruyeron por mutación puntual en [AG], como se muestra en las
figuras 5a-5c. En particular, se mutaron todos los
3'SS potenciales que presentaban uno o dos errores. Además, se creó
una mutación puntual en el poliA de la posición 1704, como se
muestra en las figuras 3a-3b, seguido de una fuerte
región en sentido descendente [GT]/[T]. En total se introdujeron un
total de veinte mutaciones puntuales en esta primera fase de la
mutagénesis, mediante un complejo procedimiento de construcción
multietapa descrito en la figura 4.
Estas mutaciones adicionales recuperaron la
estabilidad de la transmisión proviral en líneas celulares y células
madre de médula ósea y no impidieron la expresión del gen de
\beta-globina transducido. Estos retrovirus
[\beta-globina/LCR] optimizados se denominan en lo
sucesivo [\beta-globina/LCR]^{mut}.
Para estabilizar la posterior transmisión
proviral en algunas construcciones, el fragmento de 340 pb
[BamH1-Xho1] de
pZipNeoSV(X)1 que contenía el 3'SS de MLV Moloney
usado para generar la transcripción "ENV" subgenómica se
insertó en algunas construcciones. Este fragmento parecía neutro,
útil o perjudicial dependiendo de la construcción usada.
Se comprobó la transmisión proviral de virus
[B-globina/LCR]^{mut} con la infección de
células NIH 3T3 y MEL con sobrenadante de productores generado con
estas construcciones. Los análisis por transferencia Southern de ADN
genómico de células infectadas y G418 seleccionadas demostró una
transmisión proviral estable con todas las construcciones, incluso
en presencia de derivados (HS2 + HS3 + HS4) y cuando la infección se
realizó con una agrupación de productores, como se muestra en la
figura 2B. Solo se detectó un componente secundario redispuesto
(menos del 10%) en una agrupación de células infectadas generadas
con virus que contenían (HS2 + HS3 + (4 x CP2 de HS4)). Cuando se
analizaron clones de productor independiente, la mayoría expresaron
una forma no redispuesta. Para detectar microredisposiciones que
podrían haber pasado desapercibidas para este análisis, el ADN
genómico de células infectadas y G418 seleccionadas se digirió con
Sma1, que se localiza en ambos LTR así como entre derivados
\beta-LBR y el módulo interno PGK/NeoR. El sitio
interno Sma1 se conservó siempre, confirmando la ausencia de
microeliminaciones en esta región proviral, como se muestra en la
figura 2C. Aunque Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA
87:3386-3390 (1990) y Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 89:3107-3110 (1992) han informado de que las
construcciones retrovirales de [\beta-globina/LCR]
son propensas a experimentar redisposiciones adicionales después de
múltiples pasos de productores, no se observaron tales
redisposiciones, ni siquiera después de varias semanas de cultivo
continuo.
Para estimular adicionalmente la estabilidad de
los vectores mutados, se introdujo un LTR derecho intacto en la
construcción
[\beta-globina/HS2/PGKr]^{mut} y se
realizó una infección "ping-pong" por cocultivo
de productores de \Psicrip anfotrófico y \Psicre ecotrópicos
durante dos semanas. No se observó ninguna redisposición durante
este ensayo. Se cultivaron células \Psicre y \Psiscrip de
empaquetado (Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85:6460-6464 (1988)), proporcionadas por Richard
Mulligan (Whitehead Institute y MIT, Cambridge, MA) se cultivaron a
37ºC con CO_{2} al 5%/aire al 95% en medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino al 10%, 100 IU/ml de
penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Los ADN de los plásmidos
usados para la transfección se prepararon con el procedimiento de
Quiagen, de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante
(Quiagen, Inc., Chatsworth, CA). Como se usaron vectores
auto-inactivantes, los ADN plásmidos se
transfectaron directamente en células de empaquetado usando un
procedimiento con fosfato cálcico (5prime:3prime, Inc), después de
la linealización de los plásmidos fuera de la estructura proviral
(sitio Nde1). Después de la selección con G418 (500 mg/ml de
fracción activa) (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD), se aisló y expandió
una agrupación de grupo de productores o clones de productores
independientes. En el caso de experimentos
"ping-pong" usando vectores no
auto-inactivantes, los productores cre y scrip se
mezclaron y se cocultivaron durante 10 días. Las células productoras
se usaron directamente para la infección por cocultivo o los virus
se prepararon por filtración de sobrenadante a través de un filtro
Millipore de 0,45 mm, como se en Danos y Mulligan, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988).
Las titulaciones virales obtenidas con estos
vectores se presentan en la Tabla I anterior. Para comprobar si los
vectores [\beta-globina/LCR]^{mut} pueden
transmitir la estructura proviral correcta a células madre
hematopoyéticas, las células de médula ósea murina se infectaron con
una agrupación de productores de ratones donantes tratados con
5-fluorouracilo (5-FU). Se
seleccionaron dos construcciones:
[\beta-globina/HS2/PGK]^{mut} por su alta
titulación y [\beta-globina/(HS2 + HS3 + [4 x CP2
de HS4])/PGK]^{mut} porque el componente redispuesto
secundario observado en esta construcción podría indicar una
tendencia a la inestabilidad y representaría una estimulación
adicional. Se usó un vector "vacío" Zen (titulación mayor de
10^{6}/ml) (descrito por Fraser et al., Blood,
76:1071-1076 (1991)) como control. La médula ósea
infectada se dispuso en placas para ensayos clonogénicos in
vitro para estimar la eficiencia en la transferencia genética o
se transplantó en ratones transgénicos irradiados letalmente. La
eficacia de la transferencia genética se estimó comparando el número
de colonias CFU-Mix-Erythroid
macroscópicas en presencia o ausencia de G418.
Se aislaron células de médula ósea de ratones
macho adultos (C57BL/6J x C3H/HeJ)F1 inyectados previamente
cuatro días antes con 5-FU (150 mg/Kg). Para la
infección, 6 x 10^{6} células de médula ósea se añadieron a
células productoras virales irradiadas (15 Gy rayos x) confluentes
al 90% en placas de de Petri de 100 mm en un medio que contiene FCS
al 10%, CS al 5% (para productores virales de
\beta-globina derivados de \Psicre) o suero de
ternera recién nacida al 5% (para productores virales JZenNeo
derivados de GP-E86), medio condicionado con
esplenocito estimulado con mitógeno de Phytolacca americana al 5%,
100 ng/ml de factor Steel murina (Immunex, Seattle, WA) y 4
\mug/ml de Polybrene^{TM} (Sigma, St. Louis, MO). Los
co-cultivos se realizaron durante dos días, con o
sin selección (antes del ensayo) en G418 (500 (activo) \mug/ml)
durante un día más. Las células adherentes y no adherentes se
recogieron por tratamiento con tripsina, se combinaron para ensayos
con progenitor clonogénico se para el transplante en ratones
receptores irradiados (9,5 Gy ^{137}Cs). Los receptores de los
transplantes recibieron 2 x 10^{6} equivalentes celulares
pre-infección de forma intravenosa y se sacrificaron
tres semanas después para aislar el ADN del bazo. Para los ensayos
de progenitor clonogénico, las células se dispusieron en placas con
una concentración de 1,5 x 10^{4} equivalentes celulares
pre-infección en placas de Petri de 35 mm en 1,1 ml
de un medio de cultivo que contenía metilcelulosa al 0,8%, FCS al
30%, albúmina de suero bovino al 1%,
1-mercaptoetanol 10^{-4} M, 3 unidades/ml
eritropoyetina de orina humana, medio condicionado con células de
bazo estimuladas con mitógeno de Phytolacca americana al 2% y medio
condicionado con leucocitos humanos estimulados con agar al 10%
(Media Preparation Service, Terry Fox Laboratory, Vancouver,
Canadá), con o sin G418 (0,8 (activo) \mug/ml). Después de 18 días
de incubación, las colonias eritroides macroscópicas se evaluaron
con criterios convencionales descritos por Humphries et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3629-3633
(1981). Después, las placas se inundaron con solución salina con
tampón fosfato (PBS) y las células se recuperaron por centrifugación
para el aislamiento y análisis posterior del ADN.
Las eficacia de las transferencias genéticas se
estimó en aproximadamente un 60% para el vector Zen y
aproximadamente un 40% para los vectores
[\beta-globina/LCR]^{mut}. Se preparó ADN
genómico de bazos enteros de animales reconstituidos el día 13
después del implante. El análisis por transferencia Southern
realizado posteriormente mostró que la transferencia genética en
células madre hematopoyéticas se obtuvo en todos los ratones
transplantados, como se muestra en la figura 2D. Se observó una
transmisión proviral correcta sin redisposiciones detectables en los
tres ratones que recibían el vector
[HS2/\beta-globina/PGK]^{mut}. Los dos
ratones que recibían [\beta-globina/(HS2 + HS3 +
[4 x CP2 de HS4])/PGK]^{mut} mostraron distintas relaciones
entre las dos formas observadas en la infección de líneas celulares
con este virus. Esta diferencia en la relación es probablemente
consecuencia de la oligo-clonalidad de la
reconstitución de la médula ósea después del implante, en base a los
resultados obtenidos por Lemischka et al., Cell
45:917-927 (1986) y Fraser et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:1968-1972 (1992). No se
detectó ninguna otra forma con redisposiciones.
Después se determinó si la mutagénesis extendida
era perjudicial para la expresión del gen de la
\beta-globina. Los ensayos de protección de ARN
usando sondas apropiadas demostraron que el ARNm de la
\beta-globina humana mutada iniciaba y empalmaba
en células MEL infectadas, como se muestra en la figura A. El ARNm
de la \beta-globina humana mutada también parecía
correctamente iniciado y empalmado en células obtenidas en ensayos
clonogénicos in vitro después de la infección de células
madre de médula ósea murina, como se muestra en la figura 6B.
Además, el nivel de expresión del transgen de
\beta-globina humana en células MEL inducida con
DMSO infectadas con virus
[\beta-globina/LCR]^{mut} fue similar al
nivel de expresión genética obtenida con construcciones
[\beta-globina/LCR] no mutadas electroporadas en
células MEL, como se muestra en la figura 6A.
Para obtener indicaciones preliminares sobre la
expresión genética, se electroporaron plásmidos linealizados que
contenían distintas inserciones
[\beta-globina/LCR] en el contexto de una
estructura proviral en células MEL. Se cultivaron células MEL
semi-adherentes (APRT-), proporcionadas por
Paul-Henri Romeo (INSERM U91, Paris, Francia), a
37ºC con CO_{2} al 5%/aire al 95% en DMEM suplementado con suero
de caballo al 12%, 4,5 \mug/ml glucosa, glutamina 2 mM, penicilina
100 IU/ml y 100 \mug/ml de estreptomicina. Las electroporaciones
se realizaron con aproximadamente 10^{7} células MEL/ml en DMEM y
20 \mug de ADN plásmido linealizado con Nde1, usando el
Cell-porator (BRL) con la siguiente configuración:
baja resistencia, capacitancia 1180 \muF y en el intervalo de
250-350 V. Las infecciones de células MEL se
realizaron con 3 ml de sobrenadante filtrado de productores virales
en presencia de 8 \mug/ml de Polybrene^{TM} (Sigma, St. Louis,
MO) como se ha descrito anteriormente. Las células electroporadas o
infectadas se dividieron posteriormente en medio que contenía 500
\mug/ml de G418 (activo)). Se aislaron y agotaron colonias
resistentes simples o en grupo. Las células MEL se indujeron a 37ºC
con CO_{2} al 5%/aire al 95% en DMEM suplementado con suero de
ternera fetal al 15%, 4,5 mg/ml de glucosa, glutamina 2 mM, 100
IU/ml penicilina, 100 \mug/ml estreptomicina y dimetilsulfóxido al
2% (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO) durante 5 días. El ARN total se
extrajo con el método RNAzol B de acuerdo con el protocolo
proporcionado por el fabricante (Biotecx Laboratories, Inc.,
Houston, TX). Los ensayos de protección de ARN cuantitativos se
realizaron son sondas de ARN marcadas de forma uniforme in
vitro transcritas con polimerasa SP6 (Promega, Madison, WI) en
presencia de [\alpha-^{32}P) UTP (Amersham,
Arlington Heights, IL). Tom Maniatis (Harvard University, Cambridge,
MA) proporcionó una sonda específica humana: el fragmento protegido
específico tienen una longitud de 350 pb y corresponde al primer y
segundo axón del ARNm de la \beta-globina hasta el
sitio BAMH1 exónico. Se construyó una sonda específica murina de
forma que se protege el fragmento de 145 pb correspondiente al
primer exón del ARNm de la \beta_{maj}-globina.
Los primeros exones de los genes de la
\beta_{maj}-globina tienen una homología
extendida en sentido descendente del "ATG", pero difieren de
forma extensiva en su secuencia líder. Debido a este patrón de
homología y a las condiciones de los ensayos de protección de ARN,
la sonda específica murina también protege un fragmento de 115 pb
del ARNm de \beta_{maj}-globina. El ensayo de
protección de ARN se realizó como describen Sambrook et al.,
Molecular cloning; a laboratory manual - 2ª ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) y con las
siguientes condiciones 10 \mug de ARN total, con más de 5 x
10^{5} cpm de cada sonda en distintas reacciones, hibridación a
52ºC durante 16 horas en (PIPES 40 mM, pH 6.4, NaCl 400 mM, EDTA 1
mM, 80% formamida], digestión con 20 \mug/ml ARNasa A (Sigma, St.
Louis, MO) y 2 \mug/ml ARNasa T1 (Sigma) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Con estas condiciones, no se detectan errores
dispersos tales como aquellos presentes en el gen de la
\beta-globina mutada humana o entre regiones
homólogas de ARNm de \beta_{maj}-murina y
\beta_{maj}-globina. Los carriles radioactivas
que corresponden a los fragmentos protegidos específicos se
escanearon usando un Phosphor Imager (Molecular Dynamics, Evry
Cedex, France) y/o los autoradiogramas se analizaron con un
densitómetro láser 2202 Ultrascan (LKB Instruments, Inc.,
Gaithersburg, MD). Las relaciones de ARNm de
\beta-globina humana/ B-globina
murina se corrigieron en el número de restos uridina de cada sonda
(factor 2,5) y gen a gen. Aunque el aislado original de células MEL
semi-adherentes aneuploides (APRT) se cree que es
pseudo-tetraploide (Chao et al., Cell,
32:483-493 (1983)), el análisis por transferencia
Southern sugiere que las células MEL usadas en este estudio son más
bien pseudo-diploides para los genes de
\beta-globina endógenos de ratones. Por lo tanto,
la corrección (factor 2) se aplicó para contar con esta relación:
medio de dos genes \beta_{maj}-globina y dos
genes \beta_{min}-globina y solo un provirus por
célula. Los cálculos globales se realizaron como se indica a
continuación:
\frac{\beta \
Humana}{\beta_{maj} \ + \ _{min} \ Murina}=\frac{[carril \
B-globina \ humana] \ x \ 2 \ x \
100}{[carriles \ \beta_{maj} \ + \ _{min} \ globina \ murina] \
x \
2,5}
\frac{\beta \
Humana}{\beta_{maj} \ Murina}=\frac{[carril \
\beta-globina \ humana] \ x \ 2 \ x \
100}{[carril \ \beta_{maj}-globina \ murina] \ x \
2,5}
Los ensayos de protección de ARN y los análisis
por transferencia Southern se realizaron con una agrupación de
células con MEL inducida por DMSO, seleccionadas con G418 y
electroporadas. Los resultados de este experimento sugieren que los
derivados [2 x HS2], (HS2 + HS3) y (HS2 + [2 x HS3]) no aumentan la
expresión del gen de la \beta-globina en relación
a solamente HS2; por el contrario, la adición de derivados HS4 a HS2
y HS3 parecía aumentar significativamente la expresión del gen de la
\beta-globina.
Por consiguiente, el estudio de infección se
limitó a las siguientes combinaciones \beta-LCR:
HS2, [HS2 + (4 x 23 pb de HS2)], [HS2 + (4 x 23 pb de HS2) + HS3],
[HS2 + HS3 + HS4] y [HS2 + HS3 + (4 x CP2 de HS4)]. Estos distintos
derivados de \beta-LCR se insertaron en el vector
optimizado mutado para la transmisión proviral estable. También se
incluyó un vector de control que contenía el potenciador SV40 sin
\beta-LCR. Las células MEL se infectaron con
sobrenadante de productores en condiciones experimentales
proporcionando hasta un provirus integrado por célula y se
seleccionaron posteriormente con G418. Los grupos de células
infectadas y células MEL seleccionadas con al menos 10^{2} clones
se indujeron con DMSO durante cinco días y se analizaron
posteriormente para detectar la expresión de ARNm de
\beta-globina humana y murina con un ensayo de
protección de ARN. Las relaciones de ARNm entre
\beta-globina humana
transducida/\beta-globina murina se calcularon gen
a gen, después de lo cual se realizaron las correcciones apropiadas.
Se aplicaron correcciones a la actividad específica de las sondas y
basándose en que las células MEL aneuploides parecen
pseudo-diploides para los gentes de
\beta-globina murina endógenos aunque solo
contienen una copia de provirus integrado por célula después de la
infección y selección con G418. La especificidad de la expresión por
tipo de célula se verificó con la infección de células NIH 3T3: no
se detectó expresión del gen de la \beta-globina
transducido. Además, la expresión del gen de la
\beta-globina transducido fue baja en células MEL
no inducidas. Los resultados obtenidos con las distintas
construcciones se presentan en la figura 6A y en la Tabla I.
Otra implicación para los protocolos de terapia
genética de la mono- u oligo- clonalidad de reconstituciones de
médula ósea es la necesidad de implantar solamente THSC transducido,
de forma que se consiga una reconstitución completa y sostenida con
células infectadas en el 100% de los individuos transplantados. Como
una parte significativa de THSC no se infectan ni siquiera con
vectores retrovirales de alta titulación, como se informa en
Lemischka et al., Cell 45:917-927 (1986);
Dzierzak et al., Nature 331:35-41 (1988); Karlsson et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6062-6066 (1988);
Bender et al., Mal. Cell. Biol.
9:1426-1434 (1989); y Fraser et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:1968-1972 (1991), por lo
tanto puede ser deseable añadir una etapa de selección de células de
médula ósea infectadas antes del transplante. Desafortunadamente, se
cree que los potenciadores/promotores que proporcionan NeoR (por
ejemplo LTR, SV40) se reprimen en THSC, como se observa con otras
células madre tales como células madre embrionarias (ES), como se
informa en Hawley et al.,
Plasmid,22:120-131 (1989). Por consiguiente,
los potenciadores/promotores internos que no se reprimen en células
ES se insertaron en los vectores
[\beta-globina/LCR]^{mut}para
proporcionar NeoR. Estos potenciadores/promotores incluyen polioma
F441 (F441 Py) potenciador/promotor de timidina quinasa (TK) y
promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) murina. Además, se
añadió la secuencia líder del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV),
que es un potente potenciador de la traducción (Gallie et
al., Nucleic Acids Res., 15:3257-3273
(1987)), en algunas construcciones.
Se compararon las titulaciones de estos distintos
vectores después de selección con G418 de células 3T3 infectadas. Se
cultivaron células NIH 3T3, proporcionadas por
Jane-Jane Chen (Harvard-MIT HST,
MIT, Cambridge, MA), a 37ºC con CO_{2}al 5%/aire al 95% en DMEM
suplementado con suero de ternera al 10%, 100 IU/ml de penicilina y
100 \mug/ml de estreptomicina. Las células NIH 3T3 se infectaron
con distintas diluciones de sobrenadante viral filtrado en TM
(Sigma, St. Louis, MO) como se ha descrito en Danos y Mulligan,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464
(1988). Las células se dividieron posteriormente en medio que
contenía 500 \mug /ml de G418 (activo). Se contaron las colonias
resistentes y las titulaciones se estimaron mediante cálculos
convencionales descritos previamente (Danos y Mulligan, supra
1988). La transmisión proviral se comprobó mediante análisis
Southern (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory
manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1989), con neoR y sondas específicas de
\beta-globina y controles apropiados.
Las titulaciones se encontraron similares a las
de SV40, F441 Py/TK y F441 Py/TK/TMV. Por el contrario, PGK aumentó
la titulación viral en cinco veces en comparación con el primer
grupo (Tabla I). Como estos potenciadores heterólogos se posicionan
en vectores [\beta-globina/LCR]^{mut}
próximos a los derivados LCR, también se investigó la posible
influencia ejercida por estos potenciadores heterólogos en sobre los
derivados \beta-LCR para la transcripción del gen
de la \beta-globina transducido. Los resultados de
este experimento indican que los potenciadores heterólogos no son
neutros para la expresión de la \beta-globina
cuando se unen a HS2. El nivel general de mejora proporcionado por
la combinación [HS2 + potenciador heterólogo] aumenta en el
siguiente orden: SV40, PGK y F441 Py/TK (figura 6C y Tabla I).
Como se observa frecuentemente mono- u
oligo-clonalidad en sistemas hematopoyéticos
reconstituidos a largo plazo (Lemischka et al., Cell
45:917-927 (1986); Fraser et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:1968-1972 (1991)), es esencial
obtener la expresión del gen de la \beta-globina
transducido de forma relativamente independiente del sitio de
integración cromosómica de forma que se consiga una expresión del
gen de la \beta-globina consistente y sostenida.
Grosveld et al., Cell, 51:975-985 (1987);
Collis et al., EMBO J. 9:233-240 (1990);
Philipsen et al., EMBO J. 9:2159-2167
(1990); Talbot et al., EMBO J. 9:2169-2178 (1990); y Pruzina
et al., Nucleic Acids Res. 19:1413-1419
(1991) han informado de que cada uno de los sitios HS, de forma
individual o en asociación, pueden conferir independencia de la
posición en células MEL y en ratones transgénicos, aunque también se
ha informado de una independencia de posición incompleta en Curtin
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86:7082-7086 (1989); Forrester et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86:5439-5443 (1989); Ryan
et al., Genes Dev., 3:314-323 (1989); y Novak
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:3386-3390 (1990). Por consiguiente, se comprobó
la variabilidad de la expresión de ARNm de
\beta-globina en seis clones de células MEL
independientes después de infección y selección G418. El
[\beta-globina/HS2/PGK]^{mut} fue el
centro del estudio, en base a la suposición de que la independencia
de la posición se vería reforzada por fragmentos HS adicionales si
se observaba con un sitio HS aislado.
No se observó una independencia completa de la
posición, pero la variación parece relativamente moderada, como se
muestra en la figura 6D y en la Tabla II.
Clones independientes después de infección y
selección con G418. Valores corregidos para actividades específicas
de las sondas y gen a gen (una copia proviral en células MEL
pseudo-diploides).
El vector retroviral descrito en este documento
es útil para el tratamiento de trastornos de la
\beta-globina tales como
\beta-talasemias y anemia drepanocítica mediante
transferencia genética.
La transferencia genética se logra infectando
células madre hematopoyéticas autólogas (THSC) con el vector
retroviral de acuerdo con métodos que conocen los especialistas en
la técnica.
Las modificaciones y variaciones de la presente
invención, vectores retrovirales para transducir el gen de la
\beta-globina humana y derivados de la región de
control del locus \beta, serán evidentes para los especialistas en
la técnica a partir de la descripción detallada anteriormente. Se
pretende que tales modificaciones y variaciones estén incluidas en
el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Massachussets Institute of Technology
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 77 Massachussets Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachussets
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02139
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (617) 253-6966
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (617) 258-6790
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VECTORES RETROVIRALES PARA TRANSDUCIR GENES DE BETA-GLOBINA Y DERIVADOS DE LA REGIÓN DE CONTROL DEL LOCUS BETA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº1.0, Versión Nº1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1666 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 37..298
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Exón III"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 299..1148
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Intrón 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1149..1370
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Exón II"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1371..1501
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Intrón 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1502..1643
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Exón I"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTTATATGC AGAAATATT
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGAAGAAA AAAAAAGAAA G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAAAAGAAG GGGAAAGAAA A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 83 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 55..60
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "bases sustituidas o bases introducidas"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTGGGAGG AAGATAAGAG GGATGAACAT GATTAGCAAA AGGGCCTAGC TTGGACGCGT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCAAGGGT CCCATAGACT CAC
\hfill83
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Un método para fabricar un vector retroviral
para transducir genes de \beta-globina y
secuencias LCR \beta que comprende las etapas de
(a) proporcionar un vector retroviral en
combinación con un gen de \beta-globina o un
derivado del mismo y una porción eficaz de un promotor HS2 del LCR
\beta, con o sin sitios LCR \beta adicionales para conseguir la
transducción y expresión del gen de \beta-globina
o de un derivado del mismo, y
(b) eliminar por mutación del segmento rico en
A/T en el segundo intrón del gen de \beta-globina,
señales de ayuste complementarias/inversas y una señal de
poliadenilación en el vector retroviral, para formar un vector
retroviral caracterizado por
- i)
- estabilidad de la transmisión proviral en la infección de líneas celulares y células de médula ósea murina,
- ii)
- titulación viral eficaz para conseguir infección de células de médula ósea, y
- iii)
- alta expresión eritroide del gen de \beta-globina humana transducido.
2. El método de la reivindicación 1 en el que la
titulación viral eficaz es mayor de 10^{5} colonias resistentes
por ml de sobrenadante viral en condiciones estándar.
3. El método de la reivindicación 1 en el que la
alta expresión eritroide es mayor del 50% de la proporción en ARNm
de \beta-globina humana a
\beta_{maj}-globina murina, evaluada en células
con MEL inducida con DMSO.
4. El método de la reivindicación 1 en el que el
vector retroviral comprende:
(a) una repetición terminal larga izquierda y
derecha (LTR),
(b) un sitio de unión al cebador de ARNt para el
inicio de la síntesis de la cadena viral negativa
strong-stop,
(c) un sitio de unión al cebador de la pista de
polipurina para el inicio de la síntesis de la cadena viral positiva
strong-stop, y
(d) una señal de empaquetamiento.
5. El método de la reivindicación 4 en el que la
señal de empaquetamiento se extiende a una región gag.
6. El método de la reivindicación 1 en el que el
vector retroviral es un vector de ayuste que comprende señales de
ayuste funcionales que generan transcripciones genómicas y
subgenómicas.
7. El método de la reivindicación 1 en el que el
vector retroviral no es un vector de ayuste.
8. El método de la reivindicación 1 en el que el
vector retroviral tiene un marcador seleccionable.
9. El método de la reivindicación 1 en el que las
mutaciones se seleccionan entre el grupo compuesto por
eliminaciones, adiciones y sustituciones de nucleótidos en la
secuencia de ADN del segundo intrón del gen de la
\beta-globina, señales de ayuste complementarias y
señales de poliadenilación del gen de la
\beta-globina transducido o LCR.
10. El método de la reivindicación 8 en el que el
marcador seleccionable se hace funcionar con un potenciador/promotor
interno.
11. El método de la reivindicación 10 en el que
el marcador seleccionable se hace funcionar con el LTR
izquierdo.
12. El método de la reivindicación 8 en el que el
marcador seleccionable se introduce en un vector retroviral de
ayuste.
13. El método de la reivindicación 8 en el que el
marcador seleccionable se selecciona entre el grupo compuesto por un
gen de resistencia de la neomicina/G418, un gen de resistencia a la
higromicina, un gen de resistencia a la puromicina, un gen de
resistencia a la fleomicina, un gen dihidrofolato reductasa y un gen
de resistencia multifármaco y un gen para una enzima.
14. El método de la reivindicación 8 en el que el
marcador seleccionable es una molécula que interactúa con un
sustrato produciendo una célula coloreada.
15. El método de la reivindicación 8 en el que el
marcador seleccionable es una molécula expresada en la membrana
celular.
16. El método de la reivindicación 14 en el que
el marcador seleccionable es el gen que codifica la
\beta-galactosidasa.
17. El método de la reivindicación 4 en el que el
LTR derecho comprende una eliminación en una región U3 produciendo
un vector auto-inactivante en la transcripción
inversa.
18. El método de la reivindicación 1 en el que
el gen de la \beta-globina se muta en el segundo
intrón del gen de la \beta-globina, manteniendo el
ayuste correcto de este intrón así como la expresión normal del
transgen de la \beta-globina en comparación con el
intrón 2 no eliminado que contiene el gen de la
\beta-globina.
19. El método de la reivindicación 1 en el que el
gen de la \beta-globina transducido o el
\beta-LCR contienen eliminaciones parciales,
sustituciones, mutaciones o modificaciones en al menos un sitio de
ayuste 5', sitio de ayuste 3' complementario/inverso o en señales de
puntos de bifurcación o en señales de poliadenilación.
20. El método de la reivindicación 1 en el que la
estabilidad de la transmisión proviral se obtiene modificado la
localización, posición, orientación de cualquiera de los segmentos
\beta-LCR.
21. El método de la reivindicación 1 en el que se
incorpora un fragmento HS2 transcripcionalmente activo, en forma
simple o duplicada o junto con otros \beta-LCR o
secuencias potenciadoras heterólogas.
22. El método de la reivindicación 1 en el que se
incorpora un fragmento HS3 transcripcionalmente activo, en forma
simple o duplicada o junto con otros \beta-LCR o
secuencias potenciadoras heterólogas.
23. El método de la reivindicación 1 en el que se
incorpora un fragmento HS4 transcripcionalmente activo, en forma
simple o duplicada o junto con otros \beta-LCR o
secuencias potenciadoras heterólogas.
24. Un vector retroviral que puede obtenerse con
el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
25. El vector retroviral de la reivindicación 24
en el que la titulación viral eficaz es mayor de 10^{5} colonias
resistentes por ml de sobrenadante viral en condiciones
convencionales y la alta expresión eritroide es mayor del 50% en la
relación de ARNm de \beta-globina humana con
\beta_{maj}-globina murina evaluada en células
con MEL inducida con DMSO.
26. El vector de la reivindicación 24 para uso en
medicina.
27. El uso de un vector de la reivindicación 24
en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno
genético seleccionado entre el grupo compuesto por
\beta-talasemias y anemia drepanocítica.
28. El vector de la reivindicación 24 para el uso
en la transducción del gen de la \beta-globina y
derivados del \beta-LCR.
29. El vector de la reivindicación 24 en el que
la célula infectada es una célula de médula ósea.
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