ES2231774T3 - Vectores retrovirales para transducir genes de beta-globina y derivados de la region de control del locus beta. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN UN PROCESO Y ELEMENTO PARA EL DISEÑO Y LA OPTIMIZACION DE VECTORES RETROVIRALES QUE TRANSDUCEN GENES DE {BE}-GLOBINA Y DERIVADOS DE UNA REGION DE CONTROL DE POSICION {BE} ({BE}-LCR), DE AHORA EN ADELANTE DENOMINADOS RETROVIRUS [{BE}-GLOBINA/LCR], QUE SATISFACEN BIEN LOS SIGUIENTES CRITERIOS REQUERIDOS PARA APLICACIONES DE TERAPIA GENICA: (1) ESTABILIDAD A UNA TRANSMISION PROVIRAL (BAJA FRECUENCIA DE REDISPOSICIONES SIMILARES A LA DE LOS VECTORES VIRALES CONSIDERADOS ESTABLES EN LA MATERIA) TRAS LA INFECCION DE LINEAS CELULARES Y DE CELULAS DE MEDULA OSEA DE MURINO, (2) TITRACION VIRAL MEJORADA, LO QUE PERMITE UNA INFECCION CON EXITO DE LAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA Y (3) ALTA EXPRESION ERITROIDE DEL GEN DE {BE}-GLOBINA HUMANO TRANSDUCIDO, ASI COMO ESTRUCTURAS ESPECIFICAS.

Description

Vectores retrovirales para transducir genes de \beta-globina y derivados de la región de control del locus \beta.

La presente invención está en el campo de la genética molecular y, en particular, se refiere al campo de vectores retrovirales y métodos para fabricar estos vectores para transducir genes de \beta-globina y derivados de la región de control del locus \beta.

Antecedentes de la invención

Las \beta-talasemias y la anemia drepanocítica son trastornos genéticos humanos del gen de la \beta-globina con graves manifestaciones clínicas en los homocigotos. En la actualidad, el transplante alógeno de médula ósea representa la mejor posibilidad disponible de cura para estos pacientes. Desafortunadamente, pocos pueden encontrar un donante con el mismo HLA e incluso aunque hubiese un donante con el mismo HLA, muchos se enfrentarían a graves complicaciones en el procedimiento de transplante de médula ósea tal como la enfermedad de injerto frente a huésped (Parkman, R., Science 232:1373-1378 (1986)). Por estas razones, la terapia genética que usa células madre hematopoyéticas totipotentes autólogas modificadas genéticamente (THSC) es una alternativa atractiva para el transplante alógeno de médula ósea. Como la especificación genética por recombinación homóloga todavía no es técnicamente posible en THSC, la estrategia más realista es obtener una integración estable del gen de \beta-globina humano normal y de sus elementos reguladores con acción cis en el genoma de THSC. Esto puede realizarse mediante transferencia genética mediada por retrovirus, una técnica eficaz de transferencia genética aplicable a estas células (Fraser et al., Blood, 76:1071-1076 (1990)).

Los experimentos de transferencia genética han demostrado previamente que los elementos proximales de acción cis del gen de \beta-globina humano son insuficientes para las aplicaciones en terapia ya que proporcionan una expresión muy baja, dependiente del sitio de integración del transgen de \beta-globina humano (menos del 1 a 5% en la relación de ARNm \beta-globina/\beta_{maj}-globina murina) (Cone et al., Mol. Cell Biol. 7:887-897 (1987); Dzierzak et al., Nature 331:35-41 (1988); Karlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6062-6066 (1988); Miller et al., J. Virol., 62:4337-4345 (1988); Bender et al., Mol. Cell. Biol., 9:1426-1434 (1989)). El descubrimiento de sitios hipersensibles (HS) en sentido ascendente del locus del gen de \beta-globina humano, que constituyen la región de Control de Locus \beta (\beta-LCR), ha dado nueva esperanzas de obtener una terapia genética satisfactoria de trastornos del gen de la \beta-globina humana. (Tuan y London, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2718-2722 (1984); Tuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6384-6388 (1985); Forrester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5439-5443 (1989); Grosveld et al., Cell 51:975-985 (1987)). Los derivados de LCR pueden conferir una alta expresión eritroide específica independiente del sitio de expresión de un gen de \beta-globina en ratones transgénicos y células de eritroleucemia murina (MEL), que imitan la diferenciación eritroide en adultos (Grosveld et al., Cell 51:975-985 (1987)). Como la actividad de cada sitio HS se ha localizado en pequeños fragmentos de ADN (Patente de Estados Unidos Nº. 5.126.260; Curtin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7082-7086 (1989); Forrester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5439-5443 (1989); Ryan et al., Genes Dev. 3:314-323 (1989); Tuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2554-2558 (1989); Collis et al., EMBO J., 9:233-240 (1990); Ney et al., Genes Dev. 4:993-1006 (1990); Philipsen et al., EMBO J., 9:2159-2167 (1990); Talbot et al., EMBO J.,. 9:2169-2178 (1990); Pruzina et al., Nucleic Acids Res., 19:1413-1419 (1991); Walters et al., Nucleic Acids Res., 19:5385-5393 (1991)), ahora es posible construir vectores retrovirales que transducen derivados de \beta-LCR unidos al gen de \beta-globina humano y sus elementos proximales de acción cis (Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:3386-3390 (1990); Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3107-3110 (1992)). Sin embargo, estos retrovirus [\beta-globina/LCR] tienen baja titulación, son muy inestables con múltiples redisposiciones después de la transmisión de la estructura proviral y proporcionan una mejora relativamente modesta y altamente variable de la expresión del gel \beta-globina en células de eritroleucemia murina infectadas (MEL) (Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3386-3390 (1990); Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3107-3110 (1992)). La Patente de Estados Unidos Nº. 5.126.260 describe sitios hipersensibles a la DNAasa que constituyen el \beta-LCR y, en particular, identifica el promotor HS2 en la estructura \beta-LCR. La Patente de Estados Unidos Nº. 5.126.260 también reivindica el uso de \beta-LCR y derivados de HS2 en los protocolos de transferencia genética, incluyendo transferencia genética mediada por retrovirus, obteniendo un alto nivel de expresión del gen de \beta-globina humana. Sin embargo, la Patente de Estados Unidos Nº. 5.126.260 no identifica medios específicos con los que se puede conseguir la transmisión proviral estable de retrovirus [\beta-globina/LCR].

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar vectores retrovirales para la transducción estable del gen de \beta-globina y de derivados de la región de control del locus \beta y otros genes específicos eritroides.

Sumario de la invención

Se proporcionan vectores retrovirales que pueden transducir el gen de \beta-globina humano y derivados de la Región de Control del Locus \beta (\beta-LCR), denominados en lo sucesivo vectores retrovirales [\beta-globina/LCR]. Los vectores retrovirales [B-globina/LCR] cumplen satisfactoriamente los siguientes criterios para una terapia genética satisfactoria: (1) estabilidad de transmisión proviral o baja frecuencia de redisposiciones similar a la de los vectores retrovirales considerados estables en la técnica, después de la infección de líneas celulares y células de médula ósea murina; (2) mayor titulación viral, permitiendo por tanto la infección exitosa de células de médula ósea; y (3) alta expresión eritroide del gen de \beta-globina humano transducido, definida en este documento como más del 50% en la relación de ARNm \beta-globina humana con ARNm de \beta-globina murina por gen en lotes de células infectadas y células con eritroleucemia murina (MEL) inducida con dimetilsulfóxido (DMSO).

Las construcciones específicas que cumplen los criterios presentados anteriormente se describen detalladamente a continuación.

También se describen los medios específicos para diseñar vectores retrovirales [B-globina/LCR] adicionales que cumplen estos criterios.

Los vectores mejorados son útiles en el tratamiento de una diversidad de trastornos que incluyen \beta-talasemia y anemia drepanocítica.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática del diseño general de los vectores retrovirales (\beta-globina/LCR) de la presente invención.

Las Figuras 2A-D son reproducciones de un análisis por ordenador de transferencias Southern que muestran transmisión proviral de los retrovirus [\beta-globina/LCR) usando una sonda específica Neo^{R}. La Figura 2A muestra múltiples redisposiciones en líneas celulares infectadas con un virus [\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]. El ADN genómico de células infectadas se digirió con Sac1. El carril P representa ADN genómico de células infectadas con una agrupación de productores. Los carriles derechas representan ADN genómico de células infectadas con clones de productores independientes. La posición esperada del provirus correcto se indica con una flecha. La Figura 2B muestra una transmisión proviral estable en líneas celulares infectadas obtenidas con vectores [\betaglobina/LCR]^{mut}. El ADN genómico y los plásmidos de control se digirieron con Sac1. Los carriles izquierdas muestran plásmidos como controles de tamaño donde el carril 1 es [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut}; el carril 2 es [\beta-globina/(HS2+HS3+[4xCP2 HS4])/PGK]^{mut}; el carril 3 es [\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]^{mut}; el carril 4 es [\beta-globina/HS2/PGK/Neo^{R}-]^{mut}; el carril 5 es [\beta-globina/ (HS2+HS3+[ 4xCP2 HS4 ]) /PGK/Neo^{R}-]^{mut}; el carril 6 es [\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK/Neo^{R}-]^{mut}. Los carriles derechas muestran ADN genómico de células infectadas. Se usó una agrupación de productores para infectar células en los carriles 1, 2, 3 y 4, mientras que se usaron clones simples de productores para infectar los carriles 5, 6 y 7. El carril 1 es [\beta-globina/HS2/SV40]^{mut}; los carriles 2, 5, 6 y 7 son [\beta-globina/HS2/PGK] ^{mut}; el carril 3 es [\beta-globina/(HS2+HS3+[4xCP2 HS4])/PGK]^{mut}; y el carril 4 es [\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]^{mut}. En el carril 3 hay presente un componente redispuesto secundario. La figura 2C muestra una transferencia Southern dirigida a detectar micro-redisposiciones en la inserción de Y transducido digiriendo Y genómicos con Sma1, que se localiza en ambos LTR así como entre derivados LCR y en el módulo interno PGK/NeoR. Los carriles 1 a 7 son idénticas a los carriles derechas 1 a 7 de la figura 2B, excepto por el hecho de que los ADN se digirieron con Sma1 en lugar de Sac1. La flecha marcada como "a" muestra la posición correcta del carril 1 ya que no hay ningún sitio Sma1 en sentido ascendente del promotor SV40. La flecha marcada como "p" muestra una carril anormal en el carril 3 que corresponde a la forma redispuesta secundario descrita anteriormente. La flecha marcada como "c" muestra la estructura proviral correcta para construcciones que transducen el promotor PGK. La figura 2D muestra la transmisión proviral después del transplante de médula ósea en ratones. Los ADN genómicos de bazos infectados (13 días post-implante) y de líneas celulares de control se digirieron con Sac1. Los carriles izquierdas 1 y 2 contienen controles de tamaño que corresponden a los carriles 1 y 3 de la Figura 2B. Los carriles derechas HS2 (1, 2, 3) muestran los resultados de los tres ratones transplantados con [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut} obtenidos con una agrupación de productores virales. Los carriles derechos Zen (1, 2, 3) muestran los resultados de tres ratones transplantados con virus de control Zen. Los carriles HS2+HS3+[4xCP2 de HS4] (1, 2) muestran los resultados de dos ratones transplantados con (\beta-globina/ (HS2+HS3+[4xCP2 HS4 ])/PGK]mut con una agrupación de productores virales.

Las figuras 3a-3b son un análisis de secuencia de ADN de construcciones [\beta-globina/LCR], detectando la presencia de secuencias potencialmente perjudiciales tales como sitios de ayuste 5' (5'SS), sitios de ayuste 3' (3'SS) y sitios de ramificación (PBS) y señales de poliadenilación (poliA). Los aciertos o fallos con secuencias consensuadas se indican con letras mayúsculas o minúsculas, respectivamente. Las regiones mutadas por mutagénesis dirigida por sitio o procedimientos relacionados se indican con un asterisco.

Las figuras 4A-F son representaciones esquemáticas de las etapas implicadas en el procedimiento de mutagénesis usado para producir las construcciones retrovirales de la presente invención. El sistema de numeración corresponde al de las figuras 3a-3b y 5a-5c. La figura 4A muestra de eliminación mediada por RCP del fragmento de 372 pb [Rsa1-Rsa1] en el intrón 2. Se realizaron dos reacciones RCP independientes usando dos pares de cebadores que solapan los sitios intragénicos EcoRl (1908), Rsa1 (2345), Rsa1 (2717) y BamHl (2820), respectivamente. Para marcar la región de codificación de los genes para estudios posteriores, se introdujeron mutaciones que sustituían dos aminoácidos de \beta- con aminoácidos de \delta-globina en el cebador EcoR1. Los productos de RCP se digirieron con EcoR1, BamH1 y Rsa1. Posteriormente se realizó una triple ligadura con el vector [\beta-globina] precursor abierto en los sitios EcoR1 y BamH1. La figura 4B muestra que la región [1665 a 1770] se reconstituyó y mutó por ligadura de cuatro oligonucleótidos complementarios y solapados con el vector LXSN abierto en los sitios EcoR1 y Xba1. Se incluyó un poliengarce en la secuencia de oligonucleótidos para prepararse para etapas posteriores de la construcción. Solo se fosforilaron dos de los cuatro oligonucleótidos para evitar concatémeroización después de la ligadura. El producto de ligadura se digirió con Xho1 antes de la transformación para eliminar el plásmido precursor. La figura 4C muestra que la región [1770 a 2185] se reconstituyó y mutó por construcción mediada por RCP. Se introdujeron mutaciones puntuales y sitios de restricción adicionales por (Mlu1 y Hind3) en los cebadores RCP. Estos nuevos sitios permitieron la ligadura con el vector obtenido en la etapa mostrada en la figura 4b abierto en los sitios Mlu1 y Hind3. El producto de ligadura se digirió con BamH1 antes de la transformación para eliminar el plásmido precursor. La figura 4D muestra que la región [2185 a 3250] se reconstituyó y mutó por construcción mediada por RCP con un enfoque similar a la etapa mostrada en la figura 4C. La plantilla usada contenía la eliminación intrónica de 372 pb obtenida en la etapa mostrada en la figura 4A. Después de cortar el vector y el fragmento de RCP con Sac1 y Nco1, se realizó la ligadura con un vector que contenía HS2, el promotor \beta-globina y la primera parte del gen. El producto de ligadura se digirió con Sma1 antes de la transformación para eliminar el plásmido precursor.

La figura 4E muestra que la inserción [Hind3-Bgl2) de la construcción mostrada en la figura 4D se ligó con el esqueleto de la construcción mostrada en la figura 4C abierto con Hind3 y Bgl2. El producto de ligadura se digirió con Cla1 antes de la transformación para eliminar plásmidos precursor y formas no deseadas. La figura 4F muestra que la construcción retroviral [B^{-}globina/HS2]^{mut} final se obtuvo ligando un fragmento [Bgl1-Bgl2] de la construcción mostrada en la figura 4E con un fragmento [Bgl2-Bgl1] que contenía un módulo potenciador/promotor/NeoR y un MoMLV LTR con [Pvu2-Xbal) suprimido. El producto de ligadura se digirió con Apa1 antes de la transformación para eliminar plásmidos precursores y formas no deseadas. La precisión de la construcción se verificó por secuenciación de ADN.

Las figuras 5a-5c son la secuencia de ADN (Lista de Secuencia ID Nº 1) del gen de \beta-globina humano transducido de forma retroviral con orientación C/I, desde la base 1665 a 3325 de acuerdo con el sistema de numeración descrito en las figuras 3a-3b. Los tres exones, dos intrones y el promotor se indican. La eliminación de 372 pb [Rsa1-Rsa1] en el intrón 2 está subrayada. Se indica el PoliA mutado y 3'SS. Las mutaciones puntuales introducidas por mutagénesis se muestran a continuación de la secuencia natural. Se indican los codones mantenidos o sustituidos con codones correspondientes del gen \delta-globina humana. Los sitios de restricción relevantes en la mutagénesis están encuadrados y numerados. Los oligonucleótidos usados para la mutagénesis se representan con flechas.

Las figuras 6A-D son reproducciones de un análisis por ordenador de un ensayos de protección de ARN. Las pistas izquierda y derecha de cada carril contienen una sonda \beta-globina específica murina y una sonda \beta-globina específica humana, respectivamente. Las posiciones de fragmentos protegidos específicos se indican con letras minúsculas a la derecha de cada transferencia. El carril para la \beta humana es "a", la \beta_{maj} murina es b y la \beta_{min} murina es c. Los carriles izquierdos M y H de la figura 6A muestran las posiciones de sondas murina no digeridas (M) y humana (H). El carril 1 es ARN extraído de una agrupación (>100) de células con MEL inducida por DMSO, G418 seleccionadas, electroporadas (media de tres copias por células) usando una construcción [\beta-globina/HS2/PGK]. Los carriles 2 a 5 son ARN extraído de una agrupación (> 100) de células con MEL inducida por DMSO, G418 seleccionadas infectadas (un provirus por célula) donde el carril 2 es [\beta-globina/HS2/SV40]^{mut}, el carril 3 es [\beta-globina/HS2/PGK) , el carril 4 es [\beta-globina/(HS2+HS3+(4xCP2 HS4))/PGK] y el carril 5 es [\beta-globina/(HS2+HS3+HS4)/PGK]^{mut}. La figura 6B es una reproducción de ensayos de protección de ARN usando ARN extraído de células obtenidas con ensayos clonogénicos in vitro después de una infección de células de médula ósea murina con [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut}. La figura 6C muestra el efecto de promotores heterólogos en donde el ARN se extrajo de una agrupación (> 100) de células MEL inducida con DMSO, G418 seleccionadas infectadas (un provirus por célula) y en donde el carril 1 es [\beta-globina/ (HS2+[4x23pb HS2))/F441 Py)^{mut}, el carril 2 es [\beta-globina/HS2/F441 Py)^{mut}, el carril 3 es [\beta-globina/HS2/SV40]^{mut}, el carril 4 es [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut} y el carril 5 es [\beta-globina/SV40]^{mut}. La figura 6D muestra ensayos de protección de ARN dirigidos a medir la variabilidad de expresión dependiente de la posición. Los carriles 1 a 6 muestran ARN extraído de clones individuales de células MEL inducida con DMSO, G418 seleccionadas infectadas (un provirus por célula), usando la construcción [\beta-globina/HS2/PGK)^{mut}.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un método para fabricar un vector retroviral para transducir genes de \beta-globina y secuencias LCR \beta que comprende las etapas de

(a) proporcionar un vector retroviral en combinación con un gen de \beta-globina o un derivado del mismo y una porción eficaz de un promotor HS2 del LCR \beta, con o sin sitios LCR \beta adicionales para conseguir la transducción y expresión del gen de \beta-globina o derivado del mismo, y

(b) eliminar por mutación el segmento rico en A/T en el segundo intrón del gen de \beta-globina, señales de ayuste complementarias/inversas y una señal de poliadenilación en el vector retroviral, para formar un vector retroviral caracterizado por

i)

estabilidad de la transmisión proviral en la infección de líneas celulares y células de médula ósea murina,

ii)

titulación viral eficaz para conseguir infección de células de médula ósea, y

iii)

alta expresión eritroide del gen de \beta-globina humana transducido.

Los vectores retrovirales fabricados de acuerdo con este método pueden transducir el gen de la \beta-globina humana y derivados de la Región de Control Locus \beta (\beta-LCR) (los vectores retrovirales [\beta-globina/LCR]), para el tratamiento de trastornos tales como \beta-talasemia y anemia drepanocítica por terapia genética, y se proporcionan métodos para producir estos vectores. Estos vectores retrovirales [\beta-globina/LCR] son superiores a los vectores retrovirales disponibles en la actualidad ya que (1) muestran una transmisión proviral estable con baja frecuencia de redisposiciones en la infección de líneas celulares y células de médula ósea murina, (2) producen mayores titulaciones virales, permitiendo por tanto la infección satisfactoria de de células de médula ósea, definida en este documento como más de 10^{5} colonias NIH 3T3 resistentes a G418 por ml de sobrenadante viral en condiciones convencionales, y (3) causan una alta expresión de eritroides del gen de la \beta-globina humana transducido, definida en este documento como más del 50% en la reacción de ARNm de \beta-globina humana con ARNm de \beta_{maj}-globina murina por gen en grupos de células de eritroleucemia murina (MEL) inducida con dimetilsulfóxido e infectadas.

Se han identificado estructuras que se suponen responsables de la inestabilidad proviral y baja titulación de los vectores retrovirales [\beta-globina/LCR] disponibles en la actualidad. Éstas incluyen un segmento rico en A/T en el segundo intrón del gen de la \beta-globina humana y varias señas de poliadenilación complementarias/inversas (C/I) y sitios de ayuste. La mutagénesis extensiva del gel de la \beta-globina humana que da como resultado la eliminación de estas estructuras hace la transmisión proviral estable en la infección de líneas celulares y células madre de médula ósea murina, aumenta diez veces la titulación viral y no afecta de forma significativa a la expresión del gen de la \beta-globina transducido. Los vectores retrovirales optimizados descritos en este documento han permitido el estudio de las propiedades de expresión de distintos derivados de \beta-LCR transducidos retroviralmente en células MEL inducida con DMSO y han permitido alcanzar más del 50% en la relación de ARNm de \beta-globina human/\beta_{maj}-globina murina gen a gen. También se ha abordado la cuestión de la expresión independiente de la posición después de la integración cromosómica. También se ha analizado la influencia de potenciadores/promotores heterólogos en la expresión del gen de la \beta-globina transducido retroviralmente cuando se une en posición cis a derivados de LCR \beta.

Como se usa en este documento, un retrovirus es un virus animal que pertenece a la familia de virus de Retroviridae, incluyendo cualquier tipo, subfamilia, género o tropismos.

Los vectores retrovirales, en general, se describen en Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. En MICROBIOLOGY-1985, American Society for Microbiology, p. 229-232, Washington, 1985, que se incorpora por referencia en este documento.

Identificación de secuencias de ADN perjudiciales para la estabilidad y titulación de retrovirus [\beta-globina/LCR].

Las estructuras supuestas responsables de la inestabilidad proviral y baja titulación se identificaron mediante el siguiente procedimiento. Se realizó una búsqueda por ordenador en el gen de \beta-globina y derivados \beta-LCR que pudiesen ser causas potenciales de redisposiciones retrovirales. Se han descrito previamente dos mecanismos generales de inestabilidad retroviral: (1) ayustes inapropiados o poliadenilación que crea eliminaciones en el ARN genómico y/o (2) redisposiciones durante las etapas de transcripción inversa desencadenadas normalmente por distintos tipos de secuencias repetidas. La búsqueda por ordenador se realizó por tanto para un concatémero virtual que representa un segmento de ADN de 5 kb compuesto, de 5' a 3', por la señal de empaquetado híbrida extendida de 814 pb (\Psi+); el fragmento de 2748 pb que contiene el gen de la \beta-globina humana y su promotor, en orientación complementaria/inversa (C/I); el fragmento HS2 de 374 pb, en orientación C/I; el fragmento HS3 de 287 pb, en orientación directa; el fragmento HS4 de 243 pb, en orientación C/I; el promotor fosfoglicerato quinasa-1 (PGK) murina de 583 pb, en orientación directa. Los elementos en sentido ascendente o descendente de este segmento de 5 kb no se incluyeron es esta búsqueda, porque las redisposiciones en los LTR o marcadores de resistencia antibiótica (Neo^{R}) no serían compatibles muy probablemente con la transmisión viral de resistencia G418.

Se identificaron cinco señales de escisión [AATAAA] C/I /poliadenilación (poliA), todas localizadas en el gen de \beta-globina, como se muestra en las figuras 3a-3b y 5a-5c. No se detectó ningún elemento poliA en sentido descendente tal como [T]n, [GT]n o [YGTGTTYY] en la mayoría de ellas, excepto por la poliA en la posición 1704 en la figura 3a, que está seguida de nueve [T] en un segmento de 11 pb en sentido inmediatamente descendente. Para las señales de ayuste, el consenso descrito en animales vertebrados presentado por Krainer y Maniatis, (1988) En Hames, B., D., y Glover, D., M. (ed.), TRANSCRIPTION AND SPLICING (IRL Press, Oxford) p. 131-206): [C_{38}/A_{39}A_{62}G_{77}G_{100}T_{100}A_{60}A_{74}G_{84}T_{50}] para 5'SS, [Y_{77}Y_{78}Y_{81}Y_{83}Y_{89}Y_{85}Y_{82}Y_{81}Y_{86}Y_{91}Y_{87}NY_{97}A_{100}G_{100}] para 3'SS y [Y_{13/16}NY_{16/16}T_{14/16}R_{13/16}A_{16/16}Y_{15/16}) para sitios de ramificación (BPS) 2 a 21 pb en sentido ascendente de un 3'SS putativo. Además, los 5'SS se agruparon de acuerdo con las siguientes cinco clases descritas previamente por Krainer y Maniatis, supra (1988): clase I = AGGTA; clase II = GTAAG; clase III = RGGTGAG; y clase IV = AGGTNNGT.

Se identificaron dieciocho 5'SS potenciales con dos errores o menos treinta y dos 3'SS potenciales con tres errores o menos, como se muestra en las figuras 3a-3b y 5a-5c. Con respecto a repeticiones directas, se notó una región muy rica en A/T, incluyendo repeticiones directas en tándem degeneradas de motivos tales como [AAAAT]n o la variante [AAAAN]n en el intrón 2, como se muestra en las figuras 5a-5c. Tres de los sitios poliA C/I están presentes en esta área rica en A/T, que también se ha descrito en Miller et al., J. Virol. 62:4337-4345 (1988) que tiene un posible efecto perjudicial en la propagación de vectores retrovirales de [\beta-globina]. Otra repetición tándem extendida [ATTTATATGCAGAAATATT] (Listado de Secuencia ID Nº 2) se encontró en el intrón 2, como se muestra en las figuras 5a-5c. No se detectó homología con elementos retrovirales constitutivos tales como \Psi+, sitio de unión del cebador de ARNt o LTR que incluye el motivo de integración (IN). No se detectó una fuerte homología con la pista de polipurina para la escisión por la ARNasa H de ARN genómico viral ni la iniciación de la cadena positiva strong-stop, aunque se identificaron dos segmentos de polipurina en el intrón 2: [GGAGAAGAAAAAAAAAGAAAG] (Lista de Secuencias Nº 3) y [AGAAAAGAAGGGGAAAGAAAA] (Lista de Secuencias Nº 4), como se muestra en las figuras 5a-5c. No se detectaron repeticiones invertidas extensas.

Descripción de construcciones retrovirales [\beta-globina/LCR] específicas útiles en la terapia genética

El diseño general de los vectores retrovirales [\beta-globina/LCR] de la presente invención se describe en la figura 1. El gen de la \beta-globina se inserta en orientación inversa con respecto a la dirección de transcripción del provirus, para evitar el ayuste de los intrones de la \beta-globina en el ARN genómico viral antes de la transcripción inversa. Todas las construcciones de estos ejemplos se derivan del vector LXSN (Miller y Rosman, BioTechniques, 7:980-990 (1989), cuyo contenido se incorpora como referencia a este documento), sin embargo, puede usarse cualquier otro vector basado en retrovirus.

Las características principales de LXSN (Dusty Miller, The Fred Hutchinson Center, Seattle, WA) incluyen de 5' a 3': el LTR izquierdo del virus de sarcoma murina Moloney (MoMSV), el sitio de unión del cebador ARNt (PBS) de MoMSV, una señal de empaquetado híbrida extendida (\Psi+) descrita a continuación, un poliengarce para la inserción de ADN, un potenciador interno de SV40/promotor prematuro que proporciona un gen NeoR, la pista polipurina del virus de leucemia murina Moloney (MoMLV) y el LTR de derecho de MoMLV. \Psi+ se extiende en la región gag para la producción de virus con alta titulación. Para evitar la expresión de las proteínas gag MoMLV gp85 y p65, el codón de inicio gag p65 de este vector se muta en un codón de parada y la parte ascendente del vector (desde el LTR izquierdo hasta la parte 5' de \Psi+) se sustituye con secuencias homólogas de MoMSV que no expresan gag gp85. Esta región también contiene un intrón híbrido con 5'SS de MoMSV y 3'SS críptico de MoMLV.

El extremo 5' del promotor de la \beta-globina humana es el sitio SnaB1 266 pb en sentido ascendente del sitio CAP. El extremo 3' se optimizó eliminando la mayor parte de la región alrededor de 3' del gen de la \beta-globina humana. Solo se mantuvieron 30 pb en sentido descendente del gen, para permitir la escisión/poliadenilación normal del gen de la \beta-globina humana. El LTR derecho se mantuvo intacto o se diseñó un vector auto-inactivante creando en el LTR 3' de LXSN una eliminación de 176 pb [Pvu2-Xba1] descrita previamente en pZipNeoSV(X)1 por Cone et al., Mol. Cell Biol. 7:887-897 (1987) y Dzierzak et al., Nature 331:35-41 (1988), cuyo contenido se incorpora como referencia a este documento.

Con respecto a los derivados de LCR, todas las construcciones contienen un fragmento de 374 pb [Hind3-Xba1] que contiene el potenciados HS2 descrito en la Patente de Estados Unidos 5.126.260, cuyo contenido se incorpora como referencia a este documento. Además del potenciador HS2 potenciador, una construcción contiene un fragmento HS3 de 287 pb obtenido por RCP comenzando 21 pb en sendito ascendente [AGACCCT ...] y acabando 41 pb en sentido descendente [... CCTATAC] del núcleo HS3 de 225 pb [Hph1-Fnu4H1] descrito por Philipsen et al., EMBO J. 9:2159-2167 (1990) y un fragmento HS4 de 243 pb obtenido por RCP comenzando 27 pb en sentido descendente [GGGTATA ...] y acabando en el sitio Ava1 del fragmento de núcleo HS4 de 280 pb [Sst1-Ava1] descrito por Pruzina et al., Nucleic Acid. Res. 19:1413-1419 (1991). Otra construcción contiene solamente en fragmento HS4 descrito anteriormente próximo al fragmento potenciador HS2, sin HS3.

El potenciador SV40/promotor prematuro que proporciona NeoR de LXSN se sustituyó con el módulo potenciador F441 Py/promotor TK/NeoR de PMClneo (Stratagene, San Diego, CA) o un módulo promotor fosfoglicerato quinasa (PGK-1)/NeoR (obtenido de Rudolf Jaenisch, The Whitehead Institute, Cambridge, MA). En algunas construcciones, se eliminó el módulo potenciador heterólogo/NeoR para aumentar la titulación viral, aunque no había posibilidad de selección.

Los marcadores de selección que pueden insertarse en los vectores retrovirales incluyen además del gen de resistencia de la neomicina/G418, un gen de resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a la puromicina, un gen de resistencia a la fleomicina, un gen dihidrofolato reductasa y un gen de resistencia multifármaco. Otros marcadores que pueden usarse incluyen cualquier molécula, tal como el gen que codifica la \beta-galactosidasa, que interactúa con un sustrato produciendo una célula coloreada, o una molécula que se expresa en la membrana celular y se usa en un procedimiento de clasificación de células, por ejemplo, por interacción con un anticuerpo específico.

Características del gen de la \beta-globina transducido modificado y derivados de \beta-LCR

Las anteriores modificaciones del gen de \beta-globina transducido y los derivados de \beta-LCR causaron una mayor titulación viral, recuperaron la estabilidad de la transmisión proviral en líneas celulares y células madre de médula ósea y no impidieron la expresión del gen de la \beta-globina transducido.

Inicialmente, se intentó la eliminación de los segmentos de ADN potencialmente perjudiciales para la titulación y la estabilidad, probablemente neutros para la expresión del gen de \beta-globina. Se eliminó un fragmento de 372 pb del intrón 2 entre dos sitios Rsa1 localizados respectivamente en +580 y +952 a partir del sitio cap de la \beta-globina humana. Este fragmento eliminado contiene la mayor parte de segmento satélite rico en A/T similar al ADN, tres de los cinco sitios poliA potenciales y una de las pistas de polipurina. Este segmento eliminado es claramente distante de las estructuras intrónicas esenciales tales como 5'SS, 3'SS, puntos de ramificación y potenciador intragénico. Como los sitios Rsa1 son elementos de escisión, esta eliminación se realizó por RCP recombinante, como se muestra en las figuras 4A y 5a-5c.

Los resultados indican que la eliminación de 372 pb en el intrón 2 y el acortamiento de la región alrededor de 3' aumenta la titulación viral de construcciones [\beta-globina/LCR] en diez veces (Tabla I), pero no puede evitar por sí misma la inestabilidad de la transmisión proviral en presencia de derivados BLCR complejos tales como [HS2 + HS3 + HS4].

TABLA I Comparación de propiedades de transmisión y expresión de retrovirus [\beta-globina/LCR]

1

\begin{minipage}[t]{153mm} a Agrupación de más de 100 clones de células MEL resistentes a G418. Valores corregidos para actividades específicas de las sondas por gen (una copia proviral por célula en células MEL pseudo-diploides)\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{153mm} b Titulaciones de los mejores productores \Psicre, medidas por transmisión de resistencia a G418 a células NIH 3T3 (cfu/ml).\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{153mm} c Construcción proporcionada por R. Mulligan, Whitehead Institute y MIT, Cambridge, MA, y descrita por Cone, et al., Mol. Cell Biol. 7:887-897 (1987) y Dzierzak, et al., Nature 331:35-41 (1988)\end{minipage}

\begin{minipage}[t]{153mm} d Con esta construcción se observó la eliminación de parte de la región alrededor de 3' del gen de \beta-globina humana transducido.\end{minipage}

También se realizó una eliminación más extensa de 774 pb en el intrón 2 con resultados similares. La secuencia de este nuevo intrón, construido mediante construcción mediada con oligonucleótidos, es CTGTGGGAGGAAGATA
AGAGGGATGAACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACGCGTCATCA AGGGTCCCATAGACTCAC (representado en orientación complementaria/inversa; las bases sustituidas o introducidas están subrayadas) (Lista de Secuencias Nº 5).

En un esfuerzo adicional para estabilizar la transmisión proviral de vectores retrovirales [\beta-globina/LCR], se realizó una mutagénesis extendida dirigida a un sitio para eliminar otros SS y señales poliA complementarias/inversas. Como hubo indicaciones de que la mayoría de las redisposiciones tenían lugar en el gen de \beta-globina transducido, el esfuerzo se concentró en los sitios SS potenciales localizados en el gen de \beta-globina y la primera fase de la mutagénesis se limitó a 3'SS. En este proceso, se tomaron precauciones para no alterar características conocidas con actuación cis y regiones de codificación. Por consiguiente, siete de los diez 3'SS C/I potenciales localizados en el gen de \beta-globina se destruyeron por mutación puntual en [AG], como se muestra en las figuras 5a-5c. En particular, se mutaron todos los 3'SS potenciales que presentaban uno o dos errores. Además, se creó una mutación puntual en el poliA de la posición 1704, como se muestra en las figuras 3a-3b, seguido de una fuerte región en sentido descendente [GT]/[T]. En total se introdujeron un total de veinte mutaciones puntuales en esta primera fase de la mutagénesis, mediante un complejo procedimiento de construcción multietapa descrito en la figura 4.

Estas mutaciones adicionales recuperaron la estabilidad de la transmisión proviral en líneas celulares y células madre de médula ósea y no impidieron la expresión del gen de \beta-globina transducido. Estos retrovirus [\beta-globina/LCR] optimizados se denominan en lo sucesivo [\beta-globina/LCR]^{mut}.

Para estabilizar la posterior transmisión proviral en algunas construcciones, el fragmento de 340 pb [BamH1-Xho1] de pZipNeoSV(X)1 que contenía el 3'SS de MLV Moloney usado para generar la transcripción "ENV" subgenómica se insertó en algunas construcciones. Este fragmento parecía neutro, útil o perjudicial dependiendo de la construcción usada.

Estabilidad de la transmisión proviral en la infección de líneas celulares y células madre de médula ósea murina

Se comprobó la transmisión proviral de virus [B-globina/LCR]^{mut} con la infección de células NIH 3T3 y MEL con sobrenadante de productores generado con estas construcciones. Los análisis por transferencia Southern de ADN genómico de células infectadas y G418 seleccionadas demostró una transmisión proviral estable con todas las construcciones, incluso en presencia de derivados (HS2 + HS3 + HS4) y cuando la infección se realizó con una agrupación de productores, como se muestra en la figura 2B. Solo se detectó un componente secundario redispuesto (menos del 10%) en una agrupación de células infectadas generadas con virus que contenían (HS2 + HS3 + (4 x CP2 de HS4)). Cuando se analizaron clones de productor independiente, la mayoría expresaron una forma no redispuesta. Para detectar microredisposiciones que podrían haber pasado desapercibidas para este análisis, el ADN genómico de células infectadas y G418 seleccionadas se digirió con Sma1, que se localiza en ambos LTR así como entre derivados \beta-LBR y el módulo interno PGK/NeoR. El sitio interno Sma1 se conservó siempre, confirmando la ausencia de microeliminaciones en esta región proviral, como se muestra en la figura 2C. Aunque Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87:3386-3390 (1990) y Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:3107-3110 (1992) han informado de que las construcciones retrovirales de [\beta-globina/LCR] son propensas a experimentar redisposiciones adicionales después de múltiples pasos de productores, no se observaron tales redisposiciones, ni siquiera después de varias semanas de cultivo continuo.

Para estimular adicionalmente la estabilidad de los vectores mutados, se introdujo un LTR derecho intacto en la construcción [\beta-globina/HS2/PGKr]^{mut} y se realizó una infección "ping-pong" por cocultivo de productores de \Psicrip anfotrófico y \Psicre ecotrópicos durante dos semanas. No se observó ninguna redisposición durante este ensayo. Se cultivaron células \Psicre y \Psiscrip de empaquetado (Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:6460-6464 (1988)), proporcionadas por Richard Mulligan (Whitehead Institute y MIT, Cambridge, MA) se cultivaron a 37ºC con CO_{2} al 5%/aire al 95% en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino al 10%, 100 IU/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Los ADN de los plásmidos usados para la transfección se prepararon con el procedimiento de Quiagen, de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante (Quiagen, Inc., Chatsworth, CA). Como se usaron vectores auto-inactivantes, los ADN plásmidos se transfectaron directamente en células de empaquetado usando un procedimiento con fosfato cálcico (5prime:3prime, Inc), después de la linealización de los plásmidos fuera de la estructura proviral (sitio Nde1). Después de la selección con G418 (500 mg/ml de fracción activa) (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD), se aisló y expandió una agrupación de grupo de productores o clones de productores independientes. En el caso de experimentos "ping-pong" usando vectores no auto-inactivantes, los productores cre y scrip se mezclaron y se cocultivaron durante 10 días. Las células productoras se usaron directamente para la infección por cocultivo o los virus se prepararon por filtración de sobrenadante a través de un filtro Millipore de 0,45 mm, como se en Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988).

Las titulaciones virales obtenidas con estos vectores se presentan en la Tabla I anterior. Para comprobar si los vectores [\beta-globina/LCR]^{mut} pueden transmitir la estructura proviral correcta a células madre hematopoyéticas, las células de médula ósea murina se infectaron con una agrupación de productores de ratones donantes tratados con 5-fluorouracilo (5-FU). Se seleccionaron dos construcciones: [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut} por su alta titulación y [\beta-globina/(HS2 + HS3 + [4 x CP2 de HS4])/PGK]^{mut} porque el componente redispuesto secundario observado en esta construcción podría indicar una tendencia a la inestabilidad y representaría una estimulación adicional. Se usó un vector "vacío" Zen (titulación mayor de 10^{6}/ml) (descrito por Fraser et al., Blood, 76:1071-1076 (1991)) como control. La médula ósea infectada se dispuso en placas para ensayos clonogénicos in vitro para estimar la eficiencia en la transferencia genética o se transplantó en ratones transgénicos irradiados letalmente. La eficacia de la transferencia genética se estimó comparando el número de colonias CFU-Mix-Erythroid macroscópicas en presencia o ausencia de G418.

Se aislaron células de médula ósea de ratones macho adultos (C57BL/6J x C3H/HeJ)F1 inyectados previamente cuatro días antes con 5-FU (150 mg/Kg). Para la infección, 6 x 10^{6} células de médula ósea se añadieron a células productoras virales irradiadas (15 Gy rayos x) confluentes al 90% en placas de de Petri de 100 mm en un medio que contiene FCS al 10%, CS al 5% (para productores virales de \beta-globina derivados de \Psicre) o suero de ternera recién nacida al 5% (para productores virales JZenNeo derivados de GP-E86), medio condicionado con esplenocito estimulado con mitógeno de Phytolacca americana al 5%, 100 ng/ml de factor Steel murina (Immunex, Seattle, WA) y 4 \mug/ml de Polybrene^{TM} (Sigma, St. Louis, MO). Los co-cultivos se realizaron durante dos días, con o sin selección (antes del ensayo) en G418 (500 (activo) \mug/ml) durante un día más. Las células adherentes y no adherentes se recogieron por tratamiento con tripsina, se combinaron para ensayos con progenitor clonogénico se para el transplante en ratones receptores irradiados (9,5 Gy ^{137}Cs). Los receptores de los transplantes recibieron 2 x 10^{6} equivalentes celulares pre-infección de forma intravenosa y se sacrificaron tres semanas después para aislar el ADN del bazo. Para los ensayos de progenitor clonogénico, las células se dispusieron en placas con una concentración de 1,5 x 10^{4} equivalentes celulares pre-infección en placas de Petri de 35 mm en 1,1 ml de un medio de cultivo que contenía metilcelulosa al 0,8%, FCS al 30%, albúmina de suero bovino al 1%, 1-mercaptoetanol 10^{-4} M, 3 unidades/ml eritropoyetina de orina humana, medio condicionado con células de bazo estimuladas con mitógeno de Phytolacca americana al 2% y medio condicionado con leucocitos humanos estimulados con agar al 10% (Media Preparation Service, Terry Fox Laboratory, Vancouver, Canadá), con o sin G418 (0,8 (activo) \mug/ml). Después de 18 días de incubación, las colonias eritroides macroscópicas se evaluaron con criterios convencionales descritos por Humphries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3629-3633 (1981). Después, las placas se inundaron con solución salina con tampón fosfato (PBS) y las células se recuperaron por centrifugación para el aislamiento y análisis posterior del ADN.

Las eficacia de las transferencias genéticas se estimó en aproximadamente un 60% para el vector Zen y aproximadamente un 40% para los vectores [\beta-globina/LCR]^{mut}. Se preparó ADN genómico de bazos enteros de animales reconstituidos el día 13 después del implante. El análisis por transferencia Southern realizado posteriormente mostró que la transferencia genética en células madre hematopoyéticas se obtuvo en todos los ratones transplantados, como se muestra en la figura 2D. Se observó una transmisión proviral correcta sin redisposiciones detectables en los tres ratones que recibían el vector [HS2/\beta-globina/PGK]^{mut}. Los dos ratones que recibían [\beta-globina/(HS2 + HS3 + [4 x CP2 de HS4])/PGK]^{mut} mostraron distintas relaciones entre las dos formas observadas en la infección de líneas celulares con este virus. Esta diferencia en la relación es probablemente consecuencia de la oligo-clonalidad de la reconstitución de la médula ósea después del implante, en base a los resultados obtenidos por Lemischka et al., Cell 45:917-927 (1986) y Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1968-1972 (1992). No se detectó ninguna otra forma con redisposiciones.

Las mutaciones son neutras para la expresión del gen de la \beta-globina transducido

Después se determinó si la mutagénesis extendida era perjudicial para la expresión del gen de la \beta-globina. Los ensayos de protección de ARN usando sondas apropiadas demostraron que el ARNm de la \beta-globina humana mutada iniciaba y empalmaba en células MEL infectadas, como se muestra en la figura A. El ARNm de la \beta-globina humana mutada también parecía correctamente iniciado y empalmado en células obtenidas en ensayos clonogénicos in vitro después de la infección de células madre de médula ósea murina, como se muestra en la figura 6B. Además, el nivel de expresión del transgen de \beta-globina humana en células MEL inducida con DMSO infectadas con virus [\beta-globina/LCR]^{mut} fue similar al nivel de expresión genética obtenida con construcciones [\beta-globina/LCR] no mutadas electroporadas en células MEL, como se muestra en la figura 6A.

Expresión alta y eritroide del gen de la \beta-globina humano transducido en células infectadas y en células MEL inducida por DMSO

Para obtener indicaciones preliminares sobre la expresión genética, se electroporaron plásmidos linealizados que contenían distintas inserciones [\beta-globina/LCR] en el contexto de una estructura proviral en células MEL. Se cultivaron células MEL semi-adherentes (APRT-), proporcionadas por Paul-Henri Romeo (INSERM U91, Paris, Francia), a 37ºC con CO_{2} al 5%/aire al 95% en DMEM suplementado con suero de caballo al 12%, 4,5 \mug/ml glucosa, glutamina 2 mM, penicilina 100 IU/ml y 100 \mug/ml de estreptomicina. Las electroporaciones se realizaron con aproximadamente 10^{7} células MEL/ml en DMEM y 20 \mug de ADN plásmido linealizado con Nde1, usando el Cell-porator (BRL) con la siguiente configuración: baja resistencia, capacitancia 1180 \muF y en el intervalo de 250-350 V. Las infecciones de células MEL se realizaron con 3 ml de sobrenadante filtrado de productores virales en presencia de 8 \mug/ml de Polybrene^{TM} (Sigma, St. Louis, MO) como se ha descrito anteriormente. Las células electroporadas o infectadas se dividieron posteriormente en medio que contenía 500 \mug/ml de G418 (activo)). Se aislaron y agotaron colonias resistentes simples o en grupo. Las células MEL se indujeron a 37ºC con CO_{2} al 5%/aire al 95% en DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 15%, 4,5 mg/ml de glucosa, glutamina 2 mM, 100 IU/ml penicilina, 100 \mug/ml estreptomicina y dimetilsulfóxido al 2% (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO) durante 5 días. El ARN total se extrajo con el método RNAzol B de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX). Los ensayos de protección de ARN cuantitativos se realizaron son sondas de ARN marcadas de forma uniforme in vitro transcritas con polimerasa SP6 (Promega, Madison, WI) en presencia de [\alpha-^{32}P) UTP (Amersham, Arlington Heights, IL). Tom Maniatis (Harvard University, Cambridge, MA) proporcionó una sonda específica humana: el fragmento protegido específico tienen una longitud de 350 pb y corresponde al primer y segundo axón del ARNm de la \beta-globina hasta el sitio BAMH1 exónico. Se construyó una sonda específica murina de forma que se protege el fragmento de 145 pb correspondiente al primer exón del ARNm de la \beta_{maj}-globina. Los primeros exones de los genes de la \beta_{maj}-globina tienen una homología extendida en sentido descendente del "ATG", pero difieren de forma extensiva en su secuencia líder. Debido a este patrón de homología y a las condiciones de los ensayos de protección de ARN, la sonda específica murina también protege un fragmento de 115 pb del ARNm de \beta_{maj}-globina. El ensayo de protección de ARN se realizó como describen Sambrook et al., Molecular cloning; a laboratory manual - 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) y con las siguientes condiciones 10 \mug de ARN total, con más de 5 x 10^{5} cpm de cada sonda en distintas reacciones, hibridación a 52ºC durante 16 horas en (PIPES 40 mM, pH 6.4, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, 80% formamida], digestión con 20 \mug/ml ARNasa A (Sigma, St. Louis, MO) y 2 \mug/ml ARNasa T1 (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Con estas condiciones, no se detectan errores dispersos tales como aquellos presentes en el gen de la \beta-globina mutada humana o entre regiones homólogas de ARNm de \beta_{maj}-murina y \beta_{maj}-globina. Los carriles radioactivas que corresponden a los fragmentos protegidos específicos se escanearon usando un Phosphor Imager (Molecular Dynamics, Evry Cedex, France) y/o los autoradiogramas se analizaron con un densitómetro láser 2202 Ultrascan (LKB Instruments, Inc., Gaithersburg, MD). Las relaciones de ARNm de \beta-globina humana/ B-globina murina se corrigieron en el número de restos uridina de cada sonda (factor 2,5) y gen a gen. Aunque el aislado original de células MEL semi-adherentes aneuploides (APRT) se cree que es pseudo-tetraploide (Chao et al., Cell, 32:483-493 (1983)), el análisis por transferencia Southern sugiere que las células MEL usadas en este estudio son más bien pseudo-diploides para los genes de \beta-globina endógenos de ratones. Por lo tanto, la corrección (factor 2) se aplicó para contar con esta relación: medio de dos genes \beta_{maj}-globina y dos genes \beta_{min}-globina y solo un provirus por célula. Los cálculos globales se realizaron como se indica a continuación:

\frac{\beta \ Humana}{\beta_{maj} \ + \ _{min} \ Murina}=\frac{[carril \ B-globina \ humana] \ x \ 2 \ x \ 100}{[carriles \ \beta_{maj} \ + \ _{min} \ globina \ murina] \ x \ 2,5}

\frac{\beta \ Humana}{\beta_{maj} \ Murina}=\frac{[carril \ \beta-globina \ humana] \ x \ 2 \ x \ 100}{[carril \ \beta_{maj}-globina \ murina] \ x \ 2,5}

Los ensayos de protección de ARN y los análisis por transferencia Southern se realizaron con una agrupación de células con MEL inducida por DMSO, seleccionadas con G418 y electroporadas. Los resultados de este experimento sugieren que los derivados [2 x HS2], (HS2 + HS3) y (HS2 + [2 x HS3]) no aumentan la expresión del gen de la \beta-globina en relación a solamente HS2; por el contrario, la adición de derivados HS4 a HS2 y HS3 parecía aumentar significativamente la expresión del gen de la \beta-globina.

Por consiguiente, el estudio de infección se limitó a las siguientes combinaciones \beta-LCR: HS2, [HS2 + (4 x 23 pb de HS2)], [HS2 + (4 x 23 pb de HS2) + HS3], [HS2 + HS3 + HS4] y [HS2 + HS3 + (4 x CP2 de HS4)]. Estos distintos derivados de \beta-LCR se insertaron en el vector optimizado mutado para la transmisión proviral estable. También se incluyó un vector de control que contenía el potenciador SV40 sin \beta-LCR. Las células MEL se infectaron con sobrenadante de productores en condiciones experimentales proporcionando hasta un provirus integrado por célula y se seleccionaron posteriormente con G418. Los grupos de células infectadas y células MEL seleccionadas con al menos 10^{2} clones se indujeron con DMSO durante cinco días y se analizaron posteriormente para detectar la expresión de ARNm de \beta-globina humana y murina con un ensayo de protección de ARN. Las relaciones de ARNm entre \beta-globina humana transducida/\beta-globina murina se calcularon gen a gen, después de lo cual se realizaron las correcciones apropiadas. Se aplicaron correcciones a la actividad específica de las sondas y basándose en que las células MEL aneuploides parecen pseudo-diploides para los gentes de \beta-globina murina endógenos aunque solo contienen una copia de provirus integrado por célula después de la infección y selección con G418. La especificidad de la expresión por tipo de célula se verificó con la infección de células NIH 3T3: no se detectó expresión del gen de la \beta-globina transducido. Además, la expresión del gen de la \beta-globina transducido fue baja en células MEL no inducidas. Los resultados obtenidos con las distintas construcciones se presentan en la figura 6A y en la Tabla I.

Otra implicación para los protocolos de terapia genética de la mono- u oligo- clonalidad de reconstituciones de médula ósea es la necesidad de implantar solamente THSC transducido, de forma que se consiga una reconstitución completa y sostenida con células infectadas en el 100% de los individuos transplantados. Como una parte significativa de THSC no se infectan ni siquiera con vectores retrovirales de alta titulación, como se informa en Lemischka et al., Cell 45:917-927 (1986); Dzierzak et al., Nature 331:35-41 (1988); Karlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6062-6066 (1988); Bender et al., Mal. Cell. Biol. 9:1426-1434 (1989); y Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1968-1972 (1991), por lo tanto puede ser deseable añadir una etapa de selección de células de médula ósea infectadas antes del transplante. Desafortunadamente, se cree que los potenciadores/promotores que proporcionan NeoR (por ejemplo LTR, SV40) se reprimen en THSC, como se observa con otras células madre tales como células madre embrionarias (ES), como se informa en Hawley et al., Plasmid,22:120-131 (1989). Por consiguiente, los potenciadores/promotores internos que no se reprimen en células ES se insertaron en los vectores [\beta-globina/LCR]^{mut}para proporcionar NeoR. Estos potenciadores/promotores incluyen polioma F441 (F441 Py) potenciador/promotor de timidina quinasa (TK) y promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) murina. Además, se añadió la secuencia líder del Virus del Mosaico del Tabaco (TMV), que es un potente potenciador de la traducción (Gallie et al., Nucleic Acids Res., 15:3257-3273 (1987)), en algunas construcciones.

Se compararon las titulaciones de estos distintos vectores después de selección con G418 de células 3T3 infectadas. Se cultivaron células NIH 3T3, proporcionadas por Jane-Jane Chen (Harvard-MIT HST, MIT, Cambridge, MA), a 37ºC con CO_{2}al 5%/aire al 95% en DMEM suplementado con suero de ternera al 10%, 100 IU/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Las células NIH 3T3 se infectaron con distintas diluciones de sobrenadante viral filtrado en TM (Sigma, St. Louis, MO) como se ha descrito en Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464 (1988). Las células se dividieron posteriormente en medio que contenía 500 \mug /ml de G418 (activo). Se contaron las colonias resistentes y las titulaciones se estimaron mediante cálculos convencionales descritos previamente (Danos y Mulligan, supra 1988). La transmisión proviral se comprobó mediante análisis Southern (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), con neoR y sondas específicas de \beta-globina y controles apropiados.

Las titulaciones se encontraron similares a las de SV40, F441 Py/TK y F441 Py/TK/TMV. Por el contrario, PGK aumentó la titulación viral en cinco veces en comparación con el primer grupo (Tabla I). Como estos potenciadores heterólogos se posicionan en vectores [\beta-globina/LCR]^{mut} próximos a los derivados LCR, también se investigó la posible influencia ejercida por estos potenciadores heterólogos en sobre los derivados \beta-LCR para la transcripción del gen de la \beta-globina transducido. Los resultados de este experimento indican que los potenciadores heterólogos no son neutros para la expresión de la \beta-globina cuando se unen a HS2. El nivel general de mejora proporcionado por la combinación [HS2 + potenciador heterólogo] aumenta en el siguiente orden: SV40, PGK y F441 Py/TK (figura 6C y Tabla I).

La expresión de la \beta-globina es parcialmente independiente de los sitios de integración cromosómica

Como se observa frecuentemente mono- u oligo-clonalidad en sistemas hematopoyéticos reconstituidos a largo plazo (Lemischka et al., Cell 45:917-927 (1986); Fraser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1968-1972 (1991)), es esencial obtener la expresión del gen de la \beta-globina transducido de forma relativamente independiente del sitio de integración cromosómica de forma que se consiga una expresión del gen de la \beta-globina consistente y sostenida. Grosveld et al., Cell, 51:975-985 (1987); Collis et al., EMBO J. 9:233-240 (1990); Philipsen et al., EMBO J. 9:2159-2167 (1990); Talbot et al., EMBO J. 9:2169-2178 (1990); y Pruzina et al., Nucleic Acids Res. 19:1413-1419 (1991) han informado de que cada uno de los sitios HS, de forma individual o en asociación, pueden conferir independencia de la posición en células MEL y en ratones transgénicos, aunque también se ha informado de una independencia de posición incompleta en Curtin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7082-7086 (1989); Forrester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5439-5443 (1989); Ryan et al., Genes Dev., 3:314-323 (1989); y Novak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3386-3390 (1990). Por consiguiente, se comprobó la variabilidad de la expresión de ARNm de \beta-globina en seis clones de células MEL independientes después de infección y selección G418. El [\beta-globina/HS2/PGK]^{mut} fue el centro del estudio, en base a la suposición de que la independencia de la posición se vería reforzada por fragmentos HS adicionales si se observaba con un sitio HS aislado.

No se observó una independencia completa de la posición, pero la variación parece relativamente moderada, como se muestra en la figura 6D y en la Tabla II.

TABLA II Variabilidad de la expresión del gen de la \beta-globina humano transducido en clones de células MEL independientes infectadas con [\beta-globina/HS2 /PGK] ^{mut}

2

Clones independientes después de infección y selección con G418. Valores corregidos para actividades específicas de las sondas y gen a gen (una copia proviral en células MEL pseudo-diploides).

Tratamientos de trastornos de la \beta-globina por transferencia genética

El vector retroviral descrito en este documento es útil para el tratamiento de trastornos de la \beta-globina tales como \beta-talasemias y anemia drepanocítica mediante transferencia genética.

La transferencia genética se logra infectando células madre hematopoyéticas autólogas (THSC) con el vector retroviral de acuerdo con métodos que conocen los especialistas en la técnica.

Las modificaciones y variaciones de la presente invención, vectores retrovirales para transducir el gen de la \beta-globina humana y derivados de la región de control del locus \beta, serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de la descripción detallada anteriormente. Se pretende que tales modificaciones y variaciones estén incluidas en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Massachussets Institute of Technology

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 77 Massachussets Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Boston

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Massachussets

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 02139

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: (617) 253-6966

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: (617) 258-6790

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VECTORES RETROVIRALES PARA TRANSDUCIR GENES DE BETA-GLOBINA Y DERIVADOS DE LA REGIÓN DE CONTROL DEL LOCUS BETA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº1.0, Versión Nº1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1666 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 37..298

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Exón III"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 299..1148

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Intrón 2"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1149..1370

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Exón II"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1371..1501

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Intrón 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1502..1643

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Exón I"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTATATGC AGAAATATT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGAAGAAA AAAAAAGAAA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAAAGAAG GGGAAAGAAA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TIPO DE CÉLULAS: gen de beta-globina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: señal misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 55..60

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "bases sustituidas o bases introducidas"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGGGAGG AAGATAAGAG GGATGAACAT GATTAGCAAA AGGGCCTAGC TTGGACGCGT

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCAAGGGT CCCATAGACT CAC

\hfill

83

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (29)

1. Un método para fabricar un vector retroviral para transducir genes de \beta-globina y secuencias LCR \beta que comprende las etapas de

(a) proporcionar un vector retroviral en combinación con un gen de \beta-globina o un derivado del mismo y una porción eficaz de un promotor HS2 del LCR \beta, con o sin sitios LCR \beta adicionales para conseguir la transducción y expresión del gen de \beta-globina o de un derivado del mismo, y

(b) eliminar por mutación del segmento rico en A/T en el segundo intrón del gen de \beta-globina, señales de ayuste complementarias/inversas y una señal de poliadenilación en el vector retroviral, para formar un vector retroviral caracterizado por

i)

estabilidad de la transmisión proviral en la infección de líneas celulares y células de médula ósea murina,

ii)

titulación viral eficaz para conseguir infección de células de médula ósea, y

iii)

alta expresión eritroide del gen de \beta-globina humana transducido.

2. El método de la reivindicación 1 en el que la titulación viral eficaz es mayor de 10^{5} colonias resistentes por ml de sobrenadante viral en condiciones estándar.

3. El método de la reivindicación 1 en el que la alta expresión eritroide es mayor del 50% de la proporción en ARNm de \beta-globina humana a \beta_{maj}-globina murina, evaluada en células con MEL inducida con DMSO.

4. El método de la reivindicación 1 en el que el vector retroviral comprende:

(a) una repetición terminal larga izquierda y derecha (LTR),

(b) un sitio de unión al cebador de ARNt para el inicio de la síntesis de la cadena viral negativa strong-stop,

(c) un sitio de unión al cebador de la pista de polipurina para el inicio de la síntesis de la cadena viral positiva strong-stop, y

(d) una señal de empaquetamiento.

5. El método de la reivindicación 4 en el que la señal de empaquetamiento se extiende a una región gag.

6. El método de la reivindicación 1 en el que el vector retroviral es un vector de ayuste que comprende señales de ayuste funcionales que generan transcripciones genómicas y subgenómicas.

7. El método de la reivindicación 1 en el que el vector retroviral no es un vector de ayuste.

8. El método de la reivindicación 1 en el que el vector retroviral tiene un marcador seleccionable.

9. El método de la reivindicación 1 en el que las mutaciones se seleccionan entre el grupo compuesto por eliminaciones, adiciones y sustituciones de nucleótidos en la secuencia de ADN del segundo intrón del gen de la \beta-globina, señales de ayuste complementarias y señales de poliadenilación del gen de la \beta-globina transducido o LCR.

10. El método de la reivindicación 8 en el que el marcador seleccionable se hace funcionar con un potenciador/promotor interno.

11. El método de la reivindicación 10 en el que el marcador seleccionable se hace funcionar con el LTR izquierdo.

12. El método de la reivindicación 8 en el que el marcador seleccionable se introduce en un vector retroviral de ayuste.

13. El método de la reivindicación 8 en el que el marcador seleccionable se selecciona entre el grupo compuesto por un gen de resistencia de la neomicina/G418, un gen de resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a la puromicina, un gen de resistencia a la fleomicina, un gen dihidrofolato reductasa y un gen de resistencia multifármaco y un gen para una enzima.

14. El método de la reivindicación 8 en el que el marcador seleccionable es una molécula que interactúa con un sustrato produciendo una célula coloreada.

15. El método de la reivindicación 8 en el que el marcador seleccionable es una molécula expresada en la membrana celular.

16. El método de la reivindicación 14 en el que el marcador seleccionable es el gen que codifica la \beta-galactosidasa.

17. El método de la reivindicación 4 en el que el LTR derecho comprende una eliminación en una región U3 produciendo un vector auto-inactivante en la transcripción inversa.

18. El método de la reivindicación 1 en el que el gen de la \beta-globina se muta en el segundo intrón del gen de la \beta-globina, manteniendo el ayuste correcto de este intrón así como la expresión normal del transgen de la \beta-globina en comparación con el intrón 2 no eliminado que contiene el gen de la \beta-globina.

19. El método de la reivindicación 1 en el que el gen de la \beta-globina transducido o el \beta-LCR contienen eliminaciones parciales, sustituciones, mutaciones o modificaciones en al menos un sitio de ayuste 5', sitio de ayuste 3' complementario/inverso o en señales de puntos de bifurcación o en señales de poliadenilación.

20. El método de la reivindicación 1 en el que la estabilidad de la transmisión proviral se obtiene modificado la localización, posición, orientación de cualquiera de los segmentos \beta-LCR.

21. El método de la reivindicación 1 en el que se incorpora un fragmento HS2 transcripcionalmente activo, en forma simple o duplicada o junto con otros \beta-LCR o secuencias potenciadoras heterólogas.

22. El método de la reivindicación 1 en el que se incorpora un fragmento HS3 transcripcionalmente activo, en forma simple o duplicada o junto con otros \beta-LCR o secuencias potenciadoras heterólogas.

23. El método de la reivindicación 1 en el que se incorpora un fragmento HS4 transcripcionalmente activo, en forma simple o duplicada o junto con otros \beta-LCR o secuencias potenciadoras heterólogas.

24. Un vector retroviral que puede obtenerse con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.

25. El vector retroviral de la reivindicación 24 en el que la titulación viral eficaz es mayor de 10^{5} colonias resistentes por ml de sobrenadante viral en condiciones convencionales y la alta expresión eritroide es mayor del 50% en la relación de ARNm de \beta-globina humana con \beta_{maj}-globina murina evaluada en células con MEL inducida con DMSO.

26. El vector de la reivindicación 24 para uso en medicina.

27. El uso de un vector de la reivindicación 24 en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno genético seleccionado entre el grupo compuesto por \beta-talasemias y anemia drepanocítica.

28. El vector de la reivindicación 24 para el uso en la transducción del gen de la \beta-globina y derivados del \beta-LCR.

29. El vector de la reivindicación 24 en el que la célula infectada es una célula de médula ósea.