JP2779192B2 - ヒト赤血球特異的転写エンハンサー - Google Patents
ヒト赤血球特異的転写エンハンサーInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 背景 サラセミア症候群および異常血色素症のための遺伝子
治療において、導入されたグロビン遺伝子は、組織特異
性および転写の効能の両者においてその場の正常グロビ
ン遺伝子の機能をまねることが要求される。参照、例え
ば、Anderson、W.F.（1984）Science、226、401−409。
DNA仲介遺伝子転移の実験において、その隣接する５′
および３′フランキング配列をもつヒトベータ−グロビ
ン遺伝子は、組織および発生の段階に対して特異的であ
る方法で、発現することができることが示された。Chag
e、K.et al.（1985）Nature、314、377−380;Townes、
T.et al.（1985）EMBO，４1715−1723;Kollies、T.およ
びNienhuis、A.（1987）Mol. and Cell Biol.、７、
398−402;Constantini、F.et al.（1986）Science、23
3、1192−1194;Magram、J.et al.（1985）Nature、31
5、338−340。しかしながら、このような導入されたベ
ータ−グロビンの転写効率は一般に低い（上の参考文献
を参照）。高いレベルの転写は、クロビン構造遺伝子お
よびその隣接するフランキング配列中に存在しない配列
の要素、例えば、エンハンサー配列が発揮するcis制御
の他のレベルを要求することがある（上のKollias。G.e
t al.）。
治療において、導入されたグロビン遺伝子は、組織特異
性および転写の効能の両者においてその場の正常グロビ
ン遺伝子の機能をまねることが要求される。参照、例え
ば、Anderson、W.F.（1984）Science、226、401−409。
DNA仲介遺伝子転移の実験において、その隣接する５′
および３′フランキング配列をもつヒトベータ−グロビ
ン遺伝子は、組織および発生の段階に対して特異的であ
る方法で、発現することができることが示された。Chag
e、K.et al.（1985）Nature、314、377−380;Townes、
T.et al.（1985）EMBO，４1715−1723;Kollies、T.およ
びNienhuis、A.（1987）Mol. and Cell Biol.、７、
398−402;Constantini、F.et al.（1986）Science、23
3、1192−1194;Magram、J.et al.（1985）Nature、31
5、338−340。しかしながら、このような導入されたベ
ータ−グロビンの転写効率は一般に低い（上の参考文献
を参照）。高いレベルの転写は、クロビン構造遺伝子お
よびその隣接するフランキング配列中に存在しない配列
の要素、例えば、エンハンサー配列が発揮するcis制御
の他のレベルを要求することがある（上のKollias。G.e
t al.）。
トランスジェニック（transgenic）マウスにおいて、
例えば、ベータ−グロビン遺伝子の低いレベルである
が、組織特異的でありなおかつ発生段階特異的である発
現は、わずかの５′であるが1.5キロ塩基の３′フラン
キング配列をマウスの接合体中に注入したとき、報告さ
れた。トランスジェニックマウスの赤血球中の導入され
たベータ−グロビン遺伝子のwpのレベルは、非常に低
く、内因性マウスベータ−グロビン遺伝子のそれの数％
より小さい。わずかのトランスジェニックマウスにおい
て、しかしながら、注入したベータ−グロビン遺伝子か
ら転写されたmRNAは内因性マウスベータ−グロビンmRNA
の50％程度に高いことが報告された（参照、上のTowne
s、T.et al.およびConstantini、F.et al.）。このよう
な場合において、注入したベータ−グロビン遺伝子の多
数のコピー（20〜50コピー）は、宿主染色体中に組み込
まれることが発見された。これらの組み込まれた遺伝子
の転写体の高いレベルの蓄積は、活性化された宿主染色
体部位中に導入された遺伝子のコピーの組み込みの低い
速度および機会で、多くのこのような組み込まれた遺伝
子の累積効果の結果であり得る。この位置の効果、すな
わち、組み込み部位の転写活性への発現レベルの依存性
により、遺伝子およびその隣接するフランキング配列か
ら遠くに位置するcis転写制御のなお他のレベル、例え
ば、エンハンサー要素により発揮されることがあるも
の、は導入されたベータ−グロビン遺伝子の効率よい転
写のために要求される。
例えば、ベータ−グロビン遺伝子の低いレベルである
が、組織特異的でありなおかつ発生段階特異的である発
現は、わずかの５′であるが1.5キロ塩基の３′フラン
キング配列をマウスの接合体中に注入したとき、報告さ
れた。トランスジェニックマウスの赤血球中の導入され
たベータ−グロビン遺伝子のwpのレベルは、非常に低
く、内因性マウスベータ−グロビン遺伝子のそれの数％
より小さい。わずかのトランスジェニックマウスにおい
て、しかしながら、注入したベータ−グロビン遺伝子か
ら転写されたmRNAは内因性マウスベータ−グロビンmRNA
の50％程度に高いことが報告された（参照、上のTowne
s、T.et al.およびConstantini、F.et al.）。このよう
な場合において、注入したベータ−グロビン遺伝子の多
数のコピー（20〜50コピー）は、宿主染色体中に組み込
まれることが発見された。これらの組み込まれた遺伝子
の転写体の高いレベルの蓄積は、活性化された宿主染色
体部位中に導入された遺伝子のコピーの組み込みの低い
速度および機会で、多くのこのような組み込まれた遺伝
子の累積効果の結果であり得る。この位置の効果、すな
わち、組み込み部位の転写活性への発現レベルの依存性
により、遺伝子およびその隣接するフランキング配列か
ら遠くに位置するcis転写制御のなお他のレベル、例え
ば、エンハンサー要素により発揮されることがあるも
の、は導入されたベータ−グロビン遺伝子の効率よい転
写のために要求される。
エンハンサー要素は、次のものにおいて同定された：
ウイルスのSV40ゲイム（Bernolst、C.およびChambon、
P.（1981）Nature、290、309−310）および赤血球免疫
グロブリン遺伝子クラスター（参照、例えば、Gillie
s、S.et al.（1983）Cell、33、729−740;Mercola、M.e
t al.（1983）Science、221、663−665;Qeen、C.および
Baltimore D.（1983）Cell、33、741−748;picard、P.
およびSchaffner W.（1983）Nature、307、80−82;Gill
ies、S.およびTonegawa、S.米国特許第4,6763,281
号）。それらは長い距離にわたってcis連結遺伝子を転
写的に活性化することができ、そしてそれらの作用はエ
ンハンサー要素の向きおよび遺伝子に関するその位置に
対して独立である。広い型異性を示すSV40ウイルスのエ
ンハンサーに比較して、Igエンハンサーおよび他の同定
された真核生物のエンハンサー要素は組織の特異性を表
す:Igエンハンサーはリンパ系球において、インスリン
エンハンサー要素は膵臓のベータ細胞において（Edlu
m、T.et al.（1985）Science、230、912）そしてアルブ
ミンエンハンサーは肝臓細胞において（Pinker、C.et a
l.（1987）Genes and Development、１、268）最も活
性であるように思われる。
ウイルスのSV40ゲイム（Bernolst、C.およびChambon、
P.（1981）Nature、290、309−310）および赤血球免疫
グロブリン遺伝子クラスター（参照、例えば、Gillie
s、S.et al.（1983）Cell、33、729−740;Mercola、M.e
t al.（1983）Science、221、663−665;Qeen、C.および
Baltimore D.（1983）Cell、33、741−748;picard、P.
およびSchaffner W.（1983）Nature、307、80−82;Gill
ies、S.およびTonegawa、S.米国特許第4,6763,281
号）。それらは長い距離にわたってcis連結遺伝子を転
写的に活性化することができ、そしてそれらの作用はエ
ンハンサー要素の向きおよび遺伝子に関するその位置に
対して独立である。広い型異性を示すSV40ウイルスのエ
ンハンサーに比較して、Igエンハンサーおよび他の同定
された真核生物のエンハンサー要素は組織の特異性を表
す:Igエンハンサーはリンパ系球において、インスリン
エンハンサー要素は膵臓のベータ細胞において（Edlu
m、T.et al.（1985）Science、230、912）そしてアルブ
ミンエンハンサーは肝臓細胞において（Pinker、C.et a
l.（1987）Genes and Development、１、268）最も活
性であるように思われる。
トランスフェクションされたベータ−グロビン遺伝子
の高いレベルの転写は、事実、SV40エンハンサー（参
照、例えば、Banerji、J.et al.（1981）Cell、27、299
−308）または免疫クロブリン（Ig）遺伝子エンハンサ
ー（Banerji、J.et al.（1983）Cell、33、729−740）
のcisにおいて達成することができる。しかしながら、
このようなエンハンサー−ベータ−グロビン遺伝子構成
体の組織特異的発言は、cisエンハンサーの宿主範囲に
より支配され、こうしてIgエンハンサーにより推進され
るベータ−グロビン遺伝子は赤血球中でなくリンパ系球
中で最も効率よく発現される（Banerji、J.et al.（198
3）Cell、33、729−740）。これはトランスフェクショ
ンされたベータ−グロビン遺伝子の高いレベルの発現が
cisエンハンサーの存在を要求するばかりでなく、かつ
またエンハンサー中に含有される組織特異的要素がプロ
モーターの組織特異性を取り消すことができることを示
唆する。
の高いレベルの転写は、事実、SV40エンハンサー（参
照、例えば、Banerji、J.et al.（1981）Cell、27、299
−308）または免疫クロブリン（Ig）遺伝子エンハンサ
ー（Banerji、J.et al.（1983）Cell、33、729−740）
のcisにおいて達成することができる。しかしながら、
このようなエンハンサー−ベータ−グロビン遺伝子構成
体の組織特異的発言は、cisエンハンサーの宿主範囲に
より支配され、こうしてIgエンハンサーにより推進され
るベータ−グロビン遺伝子は赤血球中でなくリンパ系球
中で最も効率よく発現される（Banerji、J.et al.（198
3）Cell、33、729−740）。これはトランスフェクショ
ンされたベータ−グロビン遺伝子の高いレベルの発現が
cisエンハンサーの存在を要求するばかりでなく、かつ
またエンハンサー中に含有される組織特異的要素がプロ
モーターの組織特異性を取り消すことができることを示
唆する。
赤白血病を誘発するフレンド（Friend）白血病ウイル
スは、その長い末端の反復（LTK's）中に赤血球特異的
エンハンサー要素を含有することが報告された（Booa
e、Z.et al.（1986）EMBO、５、1615−1632）。ウイル
ス配列の発癌性のために、この赤血球特異的ウイルスの
エンハンサー要素の遺伝子治療への応用は制限されるよ
うに思われる。赤血球特異的エンハンサーの存在は推定
されていたが、哺乳動物細胞においてこのようなエンハ
ンサーは同定されてきていない。ツアン（Tuan）らはヒ
ト「ベータ−グロビン様」遺伝子ドメインにおいて主要
なDNアーゼＩ−超感受性部位を検査し、そしてエンハン
サーのある種の特性を有するDNA領域にそれらが位置す
ることを示した。（参照、Tuan、D.et al.（1985）Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、82、6384−6388:Tuan、
D.およびLondon、I.M.（1985）Proc. Natl. Acad Sc
i. USA、81、2718−2722）。
スは、その長い末端の反復（LTK's）中に赤血球特異的
エンハンサー要素を含有することが報告された（Booa
e、Z.et al.（1986）EMBO、５、1615−1632）。ウイル
ス配列の発癌性のために、この赤血球特異的ウイルスの
エンハンサー要素の遺伝子治療への応用は制限されるよ
うに思われる。赤血球特異的エンハンサーの存在は推定
されていたが、哺乳動物細胞においてこのようなエンハ
ンサーは同定されてきていない。ツアン（Tuan）らはヒ
ト「ベータ−グロビン様」遺伝子ドメインにおいて主要
なDNアーゼＩ−超感受性部位を検査し、そしてエンハン
サーのある種の特性を有するDNA領域にそれらが位置す
ることを示した。（参照、Tuan、D.et al.（1985）Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、82、6384−6388:Tuan、
D.およびLondon、I.M.（1985）Proc. Natl. Acad Sc
i. USA、81、2718−2722）。
レトロウイルスのベクターは宿主細胞、例えば、造血
細胞中への遺伝子の導入の従来の方法よりすぐれた独立
の利点を有する。なぜなら、それらを使用して遺伝子の
単一のコピーをほとんどの哺乳動物細胞の型中に非常に
高い効率で、時には100％に到達する効率で導入するこ
とができるからである（Weiss、R.et al.（1985）RNA T
umor Viruses、第２版、Cold Spring Harbor Laborator
y、ニューヨーク）。ウイルスエンハンサー配列をプロ
ウイルスの両者のLTRSから欠失されている、エンハンサ
ーをもたないレトロウイルスのベクターの構成は、転写
的に不活性であるプロウイルスを産生し、こうしてこの
ようなウイルス中のゲノムのインサートからベクターの
転写の潜在的作用を除去する（Cone、et al.（1987）Mo
l. and Cell Biol.、７、87）。組み込まれたプロウ
イルスの両者LTRsにおいてエンハンサー配列の不存在
は、また、細胞のガン原遺伝子を活性化する可能性を最
小とすることができ、こうしてヒト遺伝子治療において
より安全な代替法を提供する。
細胞中への遺伝子の導入の従来の方法よりすぐれた独立
の利点を有する。なぜなら、それらを使用して遺伝子の
単一のコピーをほとんどの哺乳動物細胞の型中に非常に
高い効率で、時には100％に到達する効率で導入するこ
とができるからである（Weiss、R.et al.（1985）RNA T
umor Viruses、第２版、Cold Spring Harbor Laborator
y、ニューヨーク）。ウイルスエンハンサー配列をプロ
ウイルスの両者のLTRSから欠失されている、エンハンサ
ーをもたないレトロウイルスのベクターの構成は、転写
的に不活性であるプロウイルスを産生し、こうしてこの
ようなウイルス中のゲノムのインサートからベクターの
転写の潜在的作用を除去する（Cone、et al.（1987）Mo
l. and Cell Biol.、７、87）。組み込まれたプロウ
イルスの両者LTRsにおいてエンハンサー配列の不存在
は、また、細胞のガン原遺伝子を活性化する可能性を最
小とすることができ、こうしてヒト遺伝子治療において
より安全な代替法を提供する。
（１）完全な５′LTR（２）レトロウイルスのエンハン
サー配列中に欠失をもつ３′LTR（３）ヒトベータ−グ
ロビン遺伝子インサートおよび（４）選択可能なマーカ
ー遺伝子、バクテリアのネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子（NeoR）からなる、エンハンサーをもた
ないレトロウイルスのベクターは、構成された（上のCo
ne et al.）。転写エンハンサー要素の不存在下に、形
質導入されたヒトベータ−グロビン遺伝子は、宿主細胞
中へのレトロウイルスの感染により効率的に導入された
が、内因性ベータ−グロビン遺伝子より約500倍低いレ
ベルで非効率的に発現される（上のCone et al.）。エ
ンハンサーをもたなりレトロウイルスのベクターの他の
変異型の構成体は、cis連結遺伝子上のＢ細胞特異的発
現を与える、カッパ免疫グロブリン遺伝子のエンハンサ
ー−プロモーターの組み合わせにカップリングされた、
選択可能なNeoR遺伝子およびｃ−myc腫瘍遺伝子を含有
する（Dick、J.et al.（1985）Cell、42、71）。このベ
クター中のｃ−myc遺伝子は、この組み換えレトロウイ
ルスで感染されたBr細胞株において転写されうることが
発見された（Hawley、R.et al.（1987）Proc. Natl.
Acad. Sci. USA、84、2405）。
サー配列中に欠失をもつ３′LTR（３）ヒトベータ−グ
ロビン遺伝子インサートおよび（４）選択可能なマーカ
ー遺伝子、バクテリアのネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子（NeoR）からなる、エンハンサーをもた
ないレトロウイルスのベクターは、構成された（上のCo
ne et al.）。転写エンハンサー要素の不存在下に、形
質導入されたヒトベータ−グロビン遺伝子は、宿主細胞
中へのレトロウイルスの感染により効率的に導入された
が、内因性ベータ−グロビン遺伝子より約500倍低いレ
ベルで非効率的に発現される（上のCone et al.）。エ
ンハンサーをもたなりレトロウイルスのベクターの他の
変異型の構成体は、cis連結遺伝子上のＢ細胞特異的発
現を与える、カッパ免疫グロブリン遺伝子のエンハンサ
ー−プロモーターの組み合わせにカップリングされた、
選択可能なNeoR遺伝子およびｃ−myc腫瘍遺伝子を含有
する（Dick、J.et al.（1985）Cell、42、71）。このベ
クター中のｃ−myc遺伝子は、この組み換えレトロウイ
ルスで感染されたBr細胞株において転写されうることが
発見された（Hawley、R.et al.（1987）Proc. Natl.
Acad. Sci. USA、84、2405）。
組み換えレトロウイルスで感染した造血細胞は、照射
しないか、あるいは照射された宿主動物中に注中すると
き、受容体動物の骨髄細胞の長期間の再構成を可能とす
ることが発見された。上のHawley、et al.、Lemiska、
I.et al.（1986）Cell、45、917。
しないか、あるいは照射された宿主動物中に注中すると
き、受容体動物の骨髄細胞の長期間の再構成を可能とす
ることが発見された。上のHawley、et al.、Lemiska、
I.et al.（1986）Cell、45、917。
発明の要約 本発明は、赤血球中の遺伝子の転写を増強するように
機能するヒト転写エンハンサー要素に関する。赤血球特
異的エンハンサー要素は、ヒトエプシロングロビンから
約10.3〜11.0キロ塩基だけ上流におよびヒト赤血球中の
ベータ−グロビン遺伝子から約53.0〜53.8キロ塩基だけ
上流に位置するエンハンサー配列（約800ヌクレオチド
単位の長さをもつ）に相当する。この天然のエンハンサ
ーのヌクレオチド配列は第１図に示されている。本発明
の好ましいエンハンサー要素は、この配列の少なくとも
一部分に対して実質的に相同性のDNAセグメントからな
る。
機能するヒト転写エンハンサー要素に関する。赤血球特
異的エンハンサー要素は、ヒトエプシロングロビンから
約10.3〜11.0キロ塩基だけ上流におよびヒト赤血球中の
ベータ−グロビン遺伝子から約53.0〜53.8キロ塩基だけ
上流に位置するエンハンサー配列（約800ヌクレオチド
単位の長さをもつ）に相当する。この天然のエンハンサ
ーのヌクレオチド配列は第１図に示されている。本発明
の好ましいエンハンサー要素は、この配列の少なくとも
一部分に対して実質的に相同性のDNAセグメントからな
る。
エンハンサー要素は転写単位と組み合わせるすること
ができる。この転写単位は、問題の１または２以上のタ
ンパク質（またはその前駆体）をエンコードする１また
は２以上の構造遺伝子およびこれらの遺伝子のための適
当な調節配列（例えば、プロモーター）からなる。エン
ハンサー要素の存在は、赤血球宿主中の構造遺伝子の転
写効能を増加する（mRNAの産生を増加する）。増加した
転写効能は、受容体宿主細胞中の遺伝子産生物の発現を
増加することができる。転写単位に結合したエンハンサ
ー要素は、普通の技術により赤血球中に導入することが
できる、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルス
中に組み込むことができる。生ずるトランスフェクショ
ンされた赤血球は、転写単位によりエンコードされたタ
ンパク質を高いレベルで発現する。
ができる。この転写単位は、問題の１または２以上のタ
ンパク質（またはその前駆体）をエンコードする１また
は２以上の構造遺伝子およびこれらの遺伝子のための適
当な調節配列（例えば、プロモーター）からなる。エン
ハンサー要素の存在は、赤血球宿主中の構造遺伝子の転
写効能を増加する（mRNAの産生を増加する）。増加した
転写効能は、受容体宿主細胞中の遺伝子産生物の発現を
増加することができる。転写単位に結合したエンハンサ
ー要素は、普通の技術により赤血球中に導入することが
できる、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルス
中に組み込むことができる。生ずるトランスフェクショ
ンされた赤血球は、転写単位によりエンコードされたタ
ンパク質を高いレベルで発現する。
本発明のエンハンサー要素は、赤血球由来の細胞のト
ランスフェクションのための遺伝子の構成体を改良す
る。これらの構成体は、赤血球の疾患、例えば、サラセ
ミアおよび異常血色素症の有効な遺伝子治療のために設
計される。
ランスフェクションのための遺伝子の構成体を改良す
る。これらの構成体は、赤血球の疾患、例えば、サラセ
ミアおよび異常血色素症の有効な遺伝子治療のために設
計される。
図面の簡単な説明 第１図は、赤血球特異的エンハンサー要素のヌクレオ
チド配列を示す。
チド配列を示す。
第２図は、SV40プロモーターにより推進されたクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺
伝子をもつCATプラスミドの構成を示す。
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺
伝子をもつCATプラスミドの構成を示す。
第３図は、SV40プロモーターにより推進されたCAT遺
伝子を含有する組み換えプラスミドのK562およびHeLa細
胞のCAT活性のアッセイの結果を示す。
伝子を含有する組み換えプラスミドのK562およびHeLa細
胞のCAT活性のアッセイの結果を示す。
第４図は、トランスフェクションされたHeLa細胞から
分離したRNA中のCAT転写体の開始部位のSLヌクレアーゼ
のマッピングを示す。
分離したRNA中のCAT転写体の開始部位のSLヌクレアーゼ
のマッピングを示す。
第５図は、エプシロン−グロビンプロモーターにより
推進されたCAT遺伝子をもつCATプラスミドの構成を示
す。
推進されたCAT遺伝子をもつCATプラスミドの構成を示
す。
第６図は、エプシロン−グロビンプロモーターにより
推進されたCAT遺伝子を含有する組み換えCATプラスミド
のCAT活性を示す。
推進されたCAT遺伝子を含有する組み換えCATプラスミド
のCAT活性を示す。
第７図は、造血細胞中に遺伝子を導入するための組み
換えレトロウイルスのベクターの構成を示す。
換えレトロウイルスのベクターの構成を示す。
発明の詳細な説明 本発明のエンハンサー要素は、ヒト赤血球中の遺伝子
の転写を調節するcis−制御要素である。この要素は800
bpのDNAセグメントであり、エプシロングロビンから約1
0.3〜11.1キロ塩基だけ上流におよびベータ−グロビン
遺伝子から約53.0〜53.8キロ塩基だけ上流に位置する。
の転写を調節するcis−制御要素である。この要素は800
bpのDNAセグメントであり、エプシロングロビンから約1
0.3〜11.1キロ塩基だけ上流におよびベータ−グロビン
遺伝子から約53.0〜53.8キロ塩基だけ上流に位置する。
天然の800bpのエンハンサー要素のDNA配列は第１図に
示されている。（エプシロン−グロビン遺伝子から2lKb
だけ上流のヒトゲノムの領域は、Qiliang Li et al.（1
985）J.Biol. Chem.、260、14901により配列決定され
た。）好ましいエンハンサー要素は、この配列の少なく
とも一部分に対して実質的に相同性であるDNA分子から
なる。800bpのセグメントのより小さい部分は、また、
エンハンサー活性を有することができる。さらに、この
エンハンサー配列は欠失、付加および置換を包含する塩
基の突然変異により修飾することができる。したがっ
て、本発明のエンハンサー要素は、自然エンハンサーの
800bpの配列の領域に対して実質的に相同性である活性D
NA配列からなる。
示されている。（エプシロン−グロビン遺伝子から2lKb
だけ上流のヒトゲノムの領域は、Qiliang Li et al.（1
985）J.Biol. Chem.、260、14901により配列決定され
た。）好ましいエンハンサー要素は、この配列の少なく
とも一部分に対して実質的に相同性であるDNA分子から
なる。800bpのセグメントのより小さい部分は、また、
エンハンサー活性を有することができる。さらに、この
エンハンサー配列は欠失、付加および置換を包含する塩
基の突然変異により修飾することができる。したがっ
て、本発明のエンハンサー要素は、自然エンハンサーの
800bpの配列の領域に対して実質的に相同性である活性D
NA配列からなる。
エンハンサー要素を使用して、遺伝子を効率よく発現
しかつ赤血球中でタンパク質を産生するのための、改良
された遺伝子構成体を提供することができる。トランス
ジェニックマウスの赤血球宿主細胞、例えば、結合した
エンハンサー配列をもたない、単一のトランスフェクシ
ョンされたベータ−グロビン遺伝子は、内因性ベータ−
グロビン遺伝子の転写効率の1/100〜1/1000で、平均転
写されると計算される：平均20〜50コピー／宿主細胞の
レベルで存在する、トランスフェクションされたグロビ
ン遺伝子は、内因性ベータ−グロビン遺伝子のそれの２
％〜50％の範囲で蓄積された量のベータ−グロビンmRNA
を産生すると報告された。この計算した100〜1000倍の
転写の増加は、宿主赤血球の内因性ベータ−グロビン遺
伝子と同程度の効率で、トランスフェクションされたベ
ータ−グロビン遺伝子が転写されることが要求されるよ
うに思われる。この程度の増強は、本発明の赤血球特異
的エンハンサー要素を使用して達成される増強の範囲内
である。
しかつ赤血球中でタンパク質を産生するのための、改良
された遺伝子構成体を提供することができる。トランス
ジェニックマウスの赤血球宿主細胞、例えば、結合した
エンハンサー配列をもたない、単一のトランスフェクシ
ョンされたベータ−グロビン遺伝子は、内因性ベータ−
グロビン遺伝子の転写効率の1/100〜1/1000で、平均転
写されると計算される：平均20〜50コピー／宿主細胞の
レベルで存在する、トランスフェクションされたグロビ
ン遺伝子は、内因性ベータ−グロビン遺伝子のそれの２
％〜50％の範囲で蓄積された量のベータ−グロビンmRNA
を産生すると報告された。この計算した100〜1000倍の
転写の増加は、宿主赤血球の内因性ベータ−グロビン遺
伝子と同程度の効率で、トランスフェクションされたベ
ータ−グロビン遺伝子が転写されることが要求されるよ
うに思われる。この程度の増強は、本発明の赤血球特異
的エンハンサー要素を使用して達成される増強の範囲内
である。
一般に、細胞のトランスフェクションのDNA構成体
は、 ａ、１または２以上のタンパク質またはその前駆体をエ
ンコードする転写単位からなるDNA、および ｂ、ヒト赤血球特異的エンハンサー要素、 からなる。
は、 ａ、１または２以上のタンパク質またはその前駆体をエ
ンコードする転写単位からなるDNA、および ｂ、ヒト赤血球特異的エンハンサー要素、 からなる。
構成体のアセブリーのために、転写単位へ結合するた
めのエンハンサー要素は、自然源からか、あるいは合成
により得ることができる。例えば、エンハンサー要素は
ヒトゲノムDNAクローンから切除し、次いで転写単位か
らなるDNAと結合することができる。あるいは、エンハ
ンサー要素は第１図に与えられた配列に従い、DNA合成
の普通の技術、例えば、ホスファイトトリエステル化学
により合成することができる（参照、例えば、Caruther
s et al.、米国特許第4,415,732号;Sinha、N.D.et a
l.、Nucleic Acids Research、X:4539（1984））。
めのエンハンサー要素は、自然源からか、あるいは合成
により得ることができる。例えば、エンハンサー要素は
ヒトゲノムDNAクローンから切除し、次いで転写単位か
らなるDNAと結合することができる。あるいは、エンハ
ンサー要素は第１図に与えられた配列に従い、DNA合成
の普通の技術、例えば、ホスファイトトリエステル化学
により合成することができる（参照、例えば、Caruther
s et al.、米国特許第4,415,732号;Sinha、N.D.et a
l.、Nucleic Acids Research、X:4539（1984））。
一般に、エンハンサー要素は転写単位に対して十分に
近接させて配置して、それが単位と機能的に活性である
ようにする、すなわち、それが構造遺伝子の転写効率を
増強するようにする。ある場所において、エンハンサー
は転写単位から離れて配置することができる。例えば、
ある構成体において、エンハンサーはエンハンサーの機
能を低下させないで転写単位から少なくとも６塩基だけ
離すことができる。エンハンサーの最適な位置は、特定
のDNA構成体について日常の実験により決定することが
できる。エンハンサー要素の機能はその向きに対して実
質的に独立であり、こうしてエンハンサー要素は転写単
位に関してゲノムの向きまたは逆ゲノムの向きに配置す
ることができる。一般に、エンハンサー要素は転写単位
から上流（５′）に配置する。しかしながら、ある構成
体において、それは転写単位から下流（３′）に配置す
る。
近接させて配置して、それが単位と機能的に活性である
ようにする、すなわち、それが構造遺伝子の転写効率を
増強するようにする。ある場所において、エンハンサー
は転写単位から離れて配置することができる。例えば、
ある構成体において、エンハンサーはエンハンサーの機
能を低下させないで転写単位から少なくとも６塩基だけ
離すことができる。エンハンサーの最適な位置は、特定
のDNA構成体について日常の実験により決定することが
できる。エンハンサー要素の機能はその向きに対して実
質的に独立であり、こうしてエンハンサー要素は転写単
位に関してゲノムの向きまたは逆ゲノムの向きに配置す
ることができる。一般に、エンハンサー要素は転写単位
から上流（５′）に配置する。しかしながら、ある構成
体において、それは転写単位から下流（３′）に配置す
る。
転写単位は、１または２以上の問題のタンパク質をエ
ンコードする１また２以上の構造遺伝子および１または
２以上のプロモーターおよび他の調節配列からなる。転
写的に競合する転写単位は、普通の技術によりつくるこ
とができる。使用する構造遺伝子は、一般に、赤血球の
タンパク質をエンコードするが、構成体は、また、外因
性（非赤血球）のタンパク質のために設計することがで
きる。遺伝子治療において意味をもつ赤血球タンパク質
の例は、次のものを包含する：ヒト赤血球グロビン鎖
（例えば、ベータ−グロビン、ガンンマ−グロビン、エ
プシロン−グロビン、およびアルファ−グロビン）、赤
血球の酵素またはそのサブユニット（例えば、グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびピルベー
トキナーゼ）および赤血球の構造タンパク質。さらに、
遺伝子はタンパク質の前駆体をエンコードすることがで
き、前駆体は翻訳後細胞内で修飾される問題のタンパク
質を産生する。
ンコードする１また２以上の構造遺伝子および１または
２以上のプロモーターおよび他の調節配列からなる。転
写的に競合する転写単位は、普通の技術によりつくるこ
とができる。使用する構造遺伝子は、一般に、赤血球の
タンパク質をエンコードするが、構成体は、また、外因
性（非赤血球）のタンパク質のために設計することがで
きる。遺伝子治療において意味をもつ赤血球タンパク質
の例は、次のものを包含する：ヒト赤血球グロビン鎖
（例えば、ベータ−グロビン、ガンンマ−グロビン、エ
プシロン−グロビン、およびアルファ−グロビン）、赤
血球の酵素またはそのサブユニット（例えば、グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびピルベー
トキナーゼ）および赤血球の構造タンパク質。さらに、
遺伝子はタンパク質の前駆体をエンコードすることがで
き、前駆体は翻訳後細胞内で修飾される問題のタンパク
質を産生する。
適当なプロモーターを構成体中に使用することができ
る。赤血球プロモーターは赤血球タンパク質をエンコー
ドする構造遺伝子との接合のために好ましいが、これは
常に最適であるわけではない。問題のタンパク質をエン
コードする構造遺伝子と通常関連するプロモーターは、
しばしば、望ましい。
る。赤血球プロモーターは赤血球タンパク質をエンコー
ドする構造遺伝子との接合のために好ましいが、これは
常に最適であるわけではない。問題のタンパク質をエン
コードする構造遺伝子と通常関連するプロモーターは、
しばしば、望ましい。
問題のタンパク質をエンコードする転写単位へ結合さ
れたエンハンサー要素からなるDNA構成体は、普通の技
術、例えば、トランスフェクション、感染、マイクロ注
入（microinjection）、およびエレクトロポレイション
（electroporation）により導入することができる。転
写単位に結合されたエンハンサー要素からなるDNA構成
体は、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルス中
に挿入するか、あるいはその内部にアセブリングするこ
とができる。構成体は問題の宿主細胞中への組み込みの
ために適当なベクター中にアセブリングするか、あるい
はスプライシングすることができる。ベクターは、バク
テリア宿主中で増幅されうるように、複製のバクテリア
起源を含有することができる。ベクターは、また、トラ
ンスフェクションされた細胞の選択のための選択可能な
マーカーをエンコードする。発現可能な遺伝子を含有す
ることができる。構成体の導入のために好ましいベクタ
ーは、「エンハンサーをもたない」（すなわち、自然エ
ンハンサー要素を欠く）。
れたエンハンサー要素からなるDNA構成体は、普通の技
術、例えば、トランスフェクション、感染、マイクロ注
入（microinjection）、およびエレクトロポレイション
（electroporation）により導入することができる。転
写単位に結合されたエンハンサー要素からなるDNA構成
体は、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルス中
に挿入するか、あるいはその内部にアセブリングするこ
とができる。構成体は問題の宿主細胞中への組み込みの
ために適当なベクター中にアセブリングするか、あるい
はスプライシングすることができる。ベクターは、バク
テリア宿主中で増幅されうるように、複製のバクテリア
起源を含有することができる。ベクターは、また、トラ
ンスフェクションされた細胞の選択のための選択可能な
マーカーをエンコードする。発現可能な遺伝子を含有す
ることができる。構成体の導入のために好ましいベクタ
ーは、「エンハンサーをもたない」（すなわち、自然エ
ンハンサー要素を欠く）。
タンパク質をエンコードするDNAを受容するための開
始部位に関して適当に配置されたエンハンサー要素を有
するベクターを構成することができる。例えば、 ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードするDNA
の挿入のための挿入領域、および ｂ、挿入領域に対して十分に隣接して位置して挿入され
たDNAの転写を増強するヒト赤血球特異的転写エンハン
サー要素、 からなるすることができる。挿入領域は制限酵素の制限
部位を含有することができる。ベクターは、また、構造
遺伝子を挿入するための挿入部位から上流にプロモータ
ーを含有することができる。
始部位に関して適当に配置されたエンハンサー要素を有
するベクターを構成することができる。例えば、 ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードするDNA
の挿入のための挿入領域、および ｂ、挿入領域に対して十分に隣接して位置して挿入され
たDNAの転写を増強するヒト赤血球特異的転写エンハン
サー要素、 からなるすることができる。挿入領域は制限酵素の制限
部位を含有することができる。ベクターは、また、構造
遺伝子を挿入するための挿入部位から上流にプロモータ
ーを含有することができる。
本発明の赤血球特異的エンハンサー要素は、正常構造
遺伝子の発現の不足または赤血球中の異常な構造遺伝子
の発現により特徴づけられる、ヒト遺伝病の遺伝子治療
を改良する。これらの病気は、次のものを包含する：異
常グロビンに関係する赤血球の疾患（例えば、鎌状赤血
球の病気および異常値色素症）；酵素の欠乏により赤血
球の破壊増大のため貧血（例えば、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼの欠乏およびピルベートキ
ナーゼの欠乏）；および異常の形状の赤血球の破壊の増
大のための貧血（例えば、遺伝的楕円赤血球症）。エン
ハンサー要素は、赤血球中の正常赤血球タンパク質を高
いレベルで発現しそして赤血球の疾患の効果な遺伝子治
療を生ずる手段を提供する。前述の構成体は、異常赤血
球中に導入して、異常なタンパク質または細胞中で不足
または欠乏するタンパク質の産生を補正することができ
る。
遺伝子の発現の不足または赤血球中の異常な構造遺伝子
の発現により特徴づけられる、ヒト遺伝病の遺伝子治療
を改良する。これらの病気は、次のものを包含する：異
常グロビンに関係する赤血球の疾患（例えば、鎌状赤血
球の病気および異常値色素症）；酵素の欠乏により赤血
球の破壊増大のため貧血（例えば、グルコース−６−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼの欠乏およびピルベートキ
ナーゼの欠乏）；および異常の形状の赤血球の破壊の増
大のための貧血（例えば、遺伝的楕円赤血球症）。エン
ハンサー要素は、赤血球中の正常赤血球タンパク質を高
いレベルで発現しそして赤血球の疾患の効果な遺伝子治
療を生ずる手段を提供する。前述の構成体は、異常赤血
球中に導入して、異常なタンパク質または細胞中で不足
または欠乏するタンパク質の産生を補正することができ
る。
一般に、赤血球タンパク質の不足または異常の発現に
より特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療は、次の
ようにして実施される。患者の骨髄を取り出す（例え
ば、無菌の条件下の吸引による）。次いで、骨髄細胞を
正常赤血球タンパク質（またはその前駆体）をエンコー
ドする転写単位および赤血球特異的転写エンハンサーか
らなるそのDNA構成体をもつベクターとともに、そのDNA
構成体をもつベクターを細胞中に組み込ませる条件下
に、インキュベーションする。次いで、処理した骨髄細
胞を患者に再注入する。この手順を数回反復して、正常
遺伝子が導入された骨髄の赤血球の合計の数を増加する
ことができる。
より特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療は、次の
ようにして実施される。患者の骨髄を取り出す（例え
ば、無菌の条件下の吸引による）。次いで、骨髄細胞を
正常赤血球タンパク質（またはその前駆体）をエンコー
ドする転写単位および赤血球特異的転写エンハンサーか
らなるそのDNA構成体をもつベクターとともに、そのDNA
構成体をもつベクターを細胞中に組み込ませる条件下
に、インキュベーションする。次いで、処理した骨髄細
胞を患者に再注入する。この手順を数回反復して、正常
遺伝子が導入された骨髄の赤血球の合計の数を増加する
ことができる。
ヘモグロビンの正常ベータ類のヒトヘモグロビン疾患
（ここで正常ベータ−グロビン鎖の合成は不足していあ
るか、あるいは異常鎖が合成されている）の遺伝子治療
において、ベータ−グロビンをエンコードする転写単位
および転写エンハンサーを含有するベクター−DNA構成
体を骨髄細胞中に組み込む。骨髄細胞の処理は、ベクタ
ー−DNA構成体を赤血球前駆体および造血幹細胞中に組
み込むであろう。
（ここで正常ベータ−グロビン鎖の合成は不足していあ
るか、あるいは異常鎖が合成されている）の遺伝子治療
において、ベータ−グロビンをエンコードする転写単位
および転写エンハンサーを含有するベクター−DNA構成
体を骨髄細胞中に組み込む。骨髄細胞の処理は、ベクタ
ー−DNA構成体を赤血球前駆体および造血幹細胞中に組
み込むであろう。
遺伝子治療のためにとくに有用なベクターは、レトロ
ウイルスのベクターである。組み換えレトロウイルスの
ベクターは、次の部分から成ることができる（参照、第
７図）： ｉ） MMLV、ネズミ白血病レトロウイルス、からの完全
な５′LTR、引き続くレトロウイルスのパッケージング
シグナル配列を含有するDNA。
ウイルスのベクターである。組み換えレトロウイルスの
ベクターは、次の部分から成ることができる（参照、第
７図）： ｉ） MMLV、ネズミ白血病レトロウイルス、からの完全
な５′LTR、引き続くレトロウイルスのパッケージング
シグナル配列を含有するDNA。
ii） 赤血球特異的エンハンサーにカップリングされ
た、置換遺伝子治療のための赤血球中に導入された転写
単位。
た、置換遺伝子治療のための赤血球中に導入された転写
単位。
iii） 選択可能な遺伝子、例えば、ネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子（NeoR）またはメソトレキ
セート抵抗性ジヒドロフォレートリダクターゼ（dhfr）
遺伝子、隣接する５′−プロモーターをもたない。変異
型の構成体は、パッケージング細胞系ならびに造血細胞
において活性である、隣接する５′プロモーター（例え
ば、マウスまたはヒトのメタロチオネインまたはSV40プ
ロモーター）をもつ選択可能の遺伝子を含有することが
できる。
ホトランスフェラーゼ遺伝子（NeoR）またはメソトレキ
セート抵抗性ジヒドロフォレートリダクターゼ（dhfr）
遺伝子、隣接する５′−プロモーターをもたない。変異
型の構成体は、パッケージング細胞系ならびに造血細胞
において活性である、隣接する５′プロモーター（例え
ば、マウスまたはヒトのメタロチオネインまたはSV40プ
ロモーター）をもつ選択可能の遺伝子を含有することが
できる。
iv） ウイルスのエンハンサー領域に欠失を含有する
か、あるいはウイルスのエンハンサーおよびプロモータ
ーの両者の領域中に欠失を含有する３′LTR。
か、あるいはウイルスのエンハンサーおよびプロモータ
ーの両者の領域中に欠失を含有する３′LTR。
組み換えレトロウイルスのベクターDNAは、両栄養性
パッケージング細胞ψ−AM（Cone R.およびMulligan、
R.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81、634
9）またはヘルパー不含組み換えレトロウイルスの高い
力価のストックを産生することができる他のパッケージ
ング細胞系中にトランスフェクションすることができ
る。トランスフェクション後、パッケージング細胞系
は、増殖培地中の適当な濃度で存在する、薬物G418に対
する抵抗性について選択する。組み換えレトロウイルス
のDNAを組み込んだ細胞のみは、選択培地中に生き残る
ことができる。なぜなら、組み換えレトロウイルスのベ
クター中のneoR遺伝子は、５′LTR中に存在する完全な
ウイルスエンハンサー−プロモーター配列により、そし
て存在するとき隣接する５′非ウイルスプロモーターに
より、推進されるであろうからである。個々のG418抵抗
性のクローンを取り上げ、そして膨張させて高いウイル
ス力価を産生するクローンについて選択する。
パッケージング細胞ψ−AM（Cone R.およびMulligan、
R.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81、634
9）またはヘルパー不含組み換えレトロウイルスの高い
力価のストックを産生することができる他のパッケージ
ング細胞系中にトランスフェクションすることができ
る。トランスフェクション後、パッケージング細胞系
は、増殖培地中の適当な濃度で存在する、薬物G418に対
する抵抗性について選択する。組み換えレトロウイルス
のDNAを組み込んだ細胞のみは、選択培地中に生き残る
ことができる。なぜなら、組み換えレトロウイルスのベ
クター中のneoR遺伝子は、５′LTR中に存在する完全な
ウイルスエンハンサー−プロモーター配列により、そし
て存在するとき隣接する５′非ウイルスプロモーターに
より、推進されるであろうからである。個々のG418抵抗
性のクローンを取り上げ、そして膨張させて高いウイル
ス力価を産生するクローンについて選択する。
骨髄細胞は、G418抵抗性ウイルス産生細胞系との同時
培養によるか、あるいは普通の方法に従い精製したレト
ロウイルスにより感染することができる。ウイルスんゲ
ノムからの逆転写により産生され、そして感染した造血
細胞の染色体中に組み込まれたプロウイルスは、５′ま
たは３′のいずれのLTR中にもウイルスのエンハンサー
配列を含有しないであろう。こうして、スプライシング
した構造遺伝子、すなわち、転写単位は、ウイルスのエ
ンハンサー配列による転写調節を含まず、そして転写調
節下にcis結合赤血球特異的エンハンサーにより発現さ
れるであろう。造血細胞を選択可能なマーカーおよび隣
接する５′非ウイルスプロモーターを含有するレトロウ
イルス構成体により感染したとき、これらの細胞は選択
培地中で増殖し、こうして患者へ再導入される細胞の10
0％は組み換えプロウイルスゲノムを含有するであろ
う。導入された遺伝子は、cis結合赤血球特異的エンハ
ンサーにより調節されるので、感染した赤血球中で活性
的に転写されるであろう。非赤血球造血細胞は、また、
組み換えプロウイルスを組み込むであろうが、cis結合
エンハンサーの赤血球特異性の結果、遺伝子非赤血球中
で有意に発現されないであろう。
培養によるか、あるいは普通の方法に従い精製したレト
ロウイルスにより感染することができる。ウイルスんゲ
ノムからの逆転写により産生され、そして感染した造血
細胞の染色体中に組み込まれたプロウイルスは、５′ま
たは３′のいずれのLTR中にもウイルスのエンハンサー
配列を含有しないであろう。こうして、スプライシング
した構造遺伝子、すなわち、転写単位は、ウイルスのエ
ンハンサー配列による転写調節を含まず、そして転写調
節下にcis結合赤血球特異的エンハンサーにより発現さ
れるであろう。造血細胞を選択可能なマーカーおよび隣
接する５′非ウイルスプロモーターを含有するレトロウ
イルス構成体により感染したとき、これらの細胞は選択
培地中で増殖し、こうして患者へ再導入される細胞の10
0％は組み換えプロウイルスゲノムを含有するであろ
う。導入された遺伝子は、cis結合赤血球特異的エンハ
ンサーにより調節されるので、感染した赤血球中で活性
的に転写されるであろう。非赤血球造血細胞は、また、
組み換えプロウイルスを組み込むであろうが、cis結合
エンハンサーの赤血球特異性の結果、遺伝子非赤血球中
で有意に発現されないであろう。
本発明のエンハンサー配列を含有するDNA構成体は、
また、胚および胎児の段階を包含する発生の種々の段階
において一次細胞中に導入することができる。これを発
生の早期の段階において実施して遺伝子治療を行うこと
ができる。それは、また、トランスジェニック動物を産
生するために実施することができる。さらに、本発明の
構成体は、生体外で問題のタンパク質を産生するために
細胞系（例えば、赤血球系）形質転換するために使用す
ることができる。
また、胚および胎児の段階を包含する発生の種々の段階
において一次細胞中に導入することができる。これを発
生の早期の段階において実施して遺伝子治療を行うこと
ができる。それは、また、トランスジェニック動物を産
生するために実施することができる。さらに、本発明の
構成体は、生体外で問題のタンパク質を産生するために
細胞系（例えば、赤血球系）形質転換するために使用す
ることができる。
次に実施例によって、本発明をさらに説明する。
実施例 エプシロン−グロビン遺伝子の−10Kbの５′に主要な
DNase1超感受性部位HS IIを含有する1.9KbのDNA断片は
エンハンサー活性を有することを示した。エンハンサー
活性は、1.9Kbの断片の５未満中の0.8KbのDNAの直接下
に横たわるHS IIに対してマッピングした。このエンハ
ンサー要素は、相同性のエプシロン−グロビンプロモー
ターと組み合わせたとき、CAT遺伝子の活性を約300倍だ
け増強する。それは赤血球特異性であると思われ、そし
てエプシロン−グロビンプロモーターから6Kb程度に遠
く配置することができ、そしてなおエンハンサー機能を
保持するように思われる。SV40プロモーターにカップリ
ングした主要なDNase 1超感受性部位HS II−エプシロン
−グロビン遺伝子の−10Kb5′を含む1.9KbのDNA断片中
にエンハンサー活性は発見された。
DNase1超感受性部位HS IIを含有する1.9KbのDNA断片は
エンハンサー活性を有することを示した。エンハンサー
活性は、1.9Kbの断片の５未満中の0.8KbのDNAの直接下
に横たわるHS IIに対してマッピングした。このエンハ
ンサー要素は、相同性のエプシロン−グロビンプロモー
ターと組み合わせたとき、CAT遺伝子の活性を約300倍だ
け増強する。それは赤血球特異性であると思われ、そし
てエプシロン−グロビンプロモーターから6Kb程度に遠
く配置することができ、そしてなおエンハンサー機能を
保持するように思われる。SV40プロモーターにカップリ
ングした主要なDNase 1超感受性部位HS II−エプシロン
−グロビン遺伝子の−10Kb5′を含む1.9KbのDNA断片中
にエンハンサー活性は発見された。
エプシロン−グロビン遺伝子の−６〜−20Kbの57に、
４つの明らかに赤血球特異的なDNase1超感受性部位（HS
I〜IV）の位置により案内され（Tuan、D.et al.（198
5）PNAS USA、6384−88）エプシロン−グロビン遺伝子
の−10.3〜−11.1Kbの５′において、HS IIの下に横た
わるDNAのセグメントはエンハンサー機能を有すること
が同定された。
４つの明らかに赤血球特異的なDNase1超感受性部位（HS
I〜IV）の位置により案内され（Tuan、D.et al.（198
5）PNAS USA、6384−88）エプシロン−グロビン遺伝子
の−10.3〜−11.1Kbの５′において、HS IIの下に横た
わるDNAのセグメントはエンハンサー機能を有すること
が同定された。
第2a図は、エプシロン−グロビン遺伝子に関する、赤
血球特異的超感受性部位の下に横たわる赤血球特異的エ
ンハンサー要素を含むHind III（Ｈ）断片の位置および
赤血球特異的超感受性部位HS I、HS IIおよびHS IVを含
むが、赤血球特異的感受性部位を含まない、他のHind I
II断片の位置を示す。Bgl II（Bg）リンカーの添加後、
これらの断片はpA10CAT2プラスミドのBgl II（Bg）また
はBamH I（Bam）部位中にスプライシングされた。第2b
図は、対照のプラスミドpA10CAT2およびpSV2CAT、およ
びエンハンサー要素を含む1.9KbのDNA、またはこの1.9K
bの断片から誘導された下位断片を含有する種々のCATプ
ラスミドの部分的線状地図を示す。ハッチングしたボッ
クスはSV40早期のプロモーターを表す。pSV2CATプラス
ミド中の充填したボックスはSV40赤血球特異的を表す；
他の構成体において、それはエンハンサー活性について
試験した種々のヒトゲノム断片を表す。垂直の矢印は、
エプシロン−グロビン遺伝子の−10Kbの５′における、
主要なDNase1超感受性部位HS IIの位置を示す。水平の
半分の矢印は、スプライシングしたゲノム（→）または
逆ゲノム（←）の向きを示す。pAHS II（0.8）およびpA
HS II（1.1）は、まずBamH Iリンカード1.9Kbの断片をB
gl II（参照、第５図）で消化し、次いで下位断片をCAT
遺伝子のBgl II部位５′中にスプライシングすることに
よって得た。
血球特異的超感受性部位の下に横たわる赤血球特異的エ
ンハンサー要素を含むHind III（Ｈ）断片の位置および
赤血球特異的超感受性部位HS I、HS IIおよびHS IVを含
むが、赤血球特異的感受性部位を含まない、他のHind I
II断片の位置を示す。Bgl II（Bg）リンカーの添加後、
これらの断片はpA10CAT2プラスミドのBgl II（Bg）また
はBamH I（Bam）部位中にスプライシングされた。第2b
図は、対照のプラスミドpA10CAT2およびpSV2CAT、およ
びエンハンサー要素を含む1.9KbのDNA、またはこの1.9K
bの断片から誘導された下位断片を含有する種々のCATプ
ラスミドの部分的線状地図を示す。ハッチングしたボッ
クスはSV40早期のプロモーターを表す。pSV2CATプラス
ミド中の充填したボックスはSV40赤血球特異的を表す；
他の構成体において、それはエンハンサー活性について
試験した種々のヒトゲノム断片を表す。垂直の矢印は、
エプシロン−グロビン遺伝子の−10Kbの５′における、
主要なDNase1超感受性部位HS IIの位置を示す。水平の
半分の矢印は、スプライシングしたゲノム（→）または
逆ゲノム（←）の向きを示す。pAHS II（0.8）およびpA
HS II（1.1）は、まずBamH Iリンカード1.9Kbの断片をB
gl II（参照、第５図）で消化し、次いで下位断片をCAT
遺伝子のBgl II部位５′中にスプライシングすることに
よって得た。
HS IIを含む1.9Kbの断片中に含有されるエンハンサー
は、SV40の早期のプロモーターにより推進された、バク
テリアんCAT遺伝子の転写を、50倍以上増強する。同様
な構成体において、エプシロン−グロビン遺伝子の−6K
bの５′を含有するDNA断片は、CAT活性を弱く、約２倍
だけ増強する。それぞれHS IIIおよびHS IVを含むDNA断
片、ならびに超感受性部位を含まない隣接するDNA断片
は、CAT活性を認められ得るほどに増強しない。SV40プ
ロモーターにより推進されるCATプラスミドにおいて、H
S IIのエンハンサー効果は、向きおよび位置の両者に対
して依存性であり（第１図および表１）そしてCAT遺伝
子の５′を逆ゲノムの向きでスプライシングしたとき、
最も顕著であると思われる。
は、SV40の早期のプロモーターにより推進された、バク
テリアんCAT遺伝子の転写を、50倍以上増強する。同様
な構成体において、エプシロン−グロビン遺伝子の−6K
bの５′を含有するDNA断片は、CAT活性を弱く、約２倍
だけ増強する。それぞれHS IIIおよびHS IVを含むDNA断
片、ならびに超感受性部位を含まない隣接するDNA断片
は、CAT活性を認められ得るほどに増強しない。SV40プ
ロモーターにより推進されるCATプラスミドにおいて、H
S IIのエンハンサー効果は、向きおよび位置の両者に対
して依存性であり（第１図および表１）そしてCAT遺伝
子の５′を逆ゲノムの向きでスプライシングしたとき、
最も顕著であると思われる。
さらに、それは厳格な赤血球特異性を示さず、このと
きHeLA細胞中でCAT遺伝子を活性化する（表１）が、単
核細胞の白血病細胞系THP−１または前骨髄細胞の白血
病の細胞系HL60において活性化しない。HL60はまたTHP
−１のエンハンサー活性の欠乏は、トランスフェクショ
ンするプラスミドDNAを吸収するこれらの細胞の能力の
欠如のためでなく、また宿主細胞中の参照プラスミドの
コピーより多い、この断片を含有する組み換えプラスミ
ドのコピーが偶発的に存在するために、K562およびHeLa
細胞においてエンハンサー活性は観察されない（DNAの
ドットブロットのデータは示されていない）。HS IIの
直ぐ下に横たわる0.8Kbの断片中に、エンハンサー活性
は位置する 赤血球特異性ならびにエンハンサー要素の転写増強活
性を改善する試みにおいて、1.9Kbの断片を２つの下位
断片に分割した:5′の半分の直ぐ下に横たわるHS IIか
ら誘導された0.8Kbの断片、および赤血球特異的DNase1
超感受性部位を含まない、３′半分からの1.1Kbの下位
断片（第２図）。それぞれの断片をエンハンサーをもた
ないpA10CAT2（Gorman、C.et al.（1982）Mol.and Cell
Biol.、２、1044−1051）中で両者の向きにスプライシ
ングし、次いで赤血球K562および非赤血球HeLa細胞中に
トランスフェクションした。
きHeLA細胞中でCAT遺伝子を活性化する（表１）が、単
核細胞の白血病細胞系THP−１または前骨髄細胞の白血
病の細胞系HL60において活性化しない。HL60はまたTHP
−１のエンハンサー活性の欠乏は、トランスフェクショ
ンするプラスミドDNAを吸収するこれらの細胞の能力の
欠如のためでなく、また宿主細胞中の参照プラスミドの
コピーより多い、この断片を含有する組み換えプラスミ
ドのコピーが偶発的に存在するために、K562およびHeLa
細胞においてエンハンサー活性は観察されない（DNAの
ドットブロットのデータは示されていない）。HS IIの
直ぐ下に横たわる0.8Kbの断片中に、エンハンサー活性
は位置する 赤血球特異性ならびにエンハンサー要素の転写増強活
性を改善する試みにおいて、1.9Kbの断片を２つの下位
断片に分割した:5′の半分の直ぐ下に横たわるHS IIか
ら誘導された0.8Kbの断片、および赤血球特異的DNase1
超感受性部位を含まない、３′半分からの1.1Kbの下位
断片（第２図）。それぞれの断片をエンハンサーをもた
ないpA10CAT2（Gorman、C.et al.（1982）Mol.and Cell
Biol.、２、1044−1051）中で両者の向きにスプライシ
ングし、次いで赤血球K562および非赤血球HeLa細胞中に
トランスフェクションした。
第３図は、SV40プロモーターにより推進されたCAT遺
伝子を含有する、組み換えプラスミドのK562およびHeLa
細胞中のCAT活性のアッセイの結果を示す。K562細胞
は、トランスフェクションの前後における、20μモルの
ヘミン（Hemin）を含有する培地中で維持した。CATのア
ッセイは次のようにして実施した：等しい数のトランス
フェクションされた細胞からの細胞抽出物を、まず65℃
に10分間加熱して、K562細胞抽出物中のCAT酵素活性を
明らかに妨害する分子を不活性化し、次いで余分のアセ
チルCoAを45分毎に添加して、14C−クロランフェニコー
ルおよびアセチルCoAとともに37℃において３時間イン
キュベーションした。アセチル化産生物（ａ、ｂ）を未
反応のクロランフェニコール（ｃ）から、薄層クロマト
グラフィー（TLC）により分離した。平板をＸ線フィル
ムに24〜48時間露出した。各レーンは、印をしたよう
に、それぞれの組み換えプラスミドのCAT活性を表す。
伝子を含有する、組み換えプラスミドのK562およびHeLa
細胞中のCAT活性のアッセイの結果を示す。K562細胞
は、トランスフェクションの前後における、20μモルの
ヘミン（Hemin）を含有する培地中で維持した。CATのア
ッセイは次のようにして実施した：等しい数のトランス
フェクションされた細胞からの細胞抽出物を、まず65℃
に10分間加熱して、K562細胞抽出物中のCAT酵素活性を
明らかに妨害する分子を不活性化し、次いで余分のアセ
チルCoAを45分毎に添加して、14C−クロランフェニコー
ルおよびアセチルCoAとともに37℃において３時間イン
キュベーションした。アセチル化産生物（ａ、ｂ）を未
反応のクロランフェニコール（ｃ）から、薄層クロマト
グラフィー（TLC）により分離した。平板をＸ線フィル
ムに24〜48時間露出した。各レーンは、印をしたよう
に、それぞれの組み換えプラスミドのCAT活性を表す。
第３図から理解することができるように、HS IIを含
む、0.8Kbの断片は、K562細胞（第3a図）およびHeLa細
胞（第3b図）の両者において試験したとき、エンハンサ
ー活性を含有する。1.1Kbの下位断片は認められ得るエ
ンハンサー機能を含有しない。K562細胞において、0.8K
bの下位断片は、逆ゲノム向きにおいて、1.9Kbの親断片
のように、ゲノム向き中の同一下位断片より３〜５倍大
きいエンハンサー活性を示す（表１）。再び、それは厳
格な赤血球特異性を示さず、このときそれは、また、He
La細胞中でCAT遺伝子の発現を増強する（第3b図）。
む、0.8Kbの断片は、K562細胞（第3a図）およびHeLa細
胞（第3b図）の両者において試験したとき、エンハンサ
ー活性を含有する。1.1Kbの下位断片は認められ得るエ
ンハンサー機能を含有しない。K562細胞において、0.8K
bの下位断片は、逆ゲノム向きにおいて、1.9Kbの親断片
のように、ゲノム向き中の同一下位断片より３〜５倍大
きいエンハンサー活性を示す（表１）。再び、それは厳
格な赤血球特異性を示さず、このときそれは、また、He
La細胞中でCAT遺伝子の発現を増強する（第3b図）。
顕著な向き依存性、すなわち、逆ゲノム向きにおける
0.8Kbの断片の非常に高い転写増強活性は、この断片中
に存在しうる、エンハンサー配列よりむしろ、向き依存
性の方法で機能する、可能性をプロモーター配列に付与
した。５′〜３′方向にHS II（0.8）−SV40の早期のプ
ロモーター−CAT遺伝子を含有するPA HS II（0.8）（第
２図）でトランスフェクションしたHeLa細胞から分離し
たRNAの、予備的S1ヌクレアーゼのマッピングを第４図
に示す。
0.8Kbの断片の非常に高い転写増強活性は、この断片中
に存在しうる、エンハンサー配列よりむしろ、向き依存
性の方法で機能する、可能性をプロモーター配列に付与
した。５′〜３′方向にHS II（0.8）−SV40の早期のプ
ロモーター−CAT遺伝子を含有するPA HS II（0.8）（第
２図）でトランスフェクションしたHeLa細胞から分離し
たRNAの、予備的S1ヌクレアーゼのマッピングを第４図
に示す。
第４図は、トランスフェクションしたHeLa細胞から分
離したRNAにおけるCAT転写開始部位のS1ヌクレアーゼの
マッピングを示す。RNAはグアニジンイソチオシアネー
ト方法により分離した（Chirgwin、J.M.et al.（1979）
Biochem.、18、5294）、S1ヌクレアーゼのマッピング
は、記載されるようにして実施した（Beck、A.およびSh
arp、P.（1977）Cell、12、721;Weaver、R.およびWeiss
mann、C.（1979）Nucl．Acids Res．６、1175−119
2）。プローブは次のようにして作った:CAT遺伝子の非
転写鎖内からの20マーのオリゴヌクレオチドのプライマ
ー（A.Baldwin博士から入手した）を、ポリヌクレオチ
ドキナーゼにより５′末端において標識した。キナーゼ
オリゴヌクレオチドプライマーを変性したpA10CAT2、鋳
型、に対してハイブリダイゼーションし、クレノー断片
および４つの非標識デオキシヌクレオチドの存在下に伸
長し、次いでBgl IIで切断し、次いでアルカリ性ゲル電
気泳動により５′末端において標識したほぼ300bpの一
本鎖のプローブを産生し、これはCAT転写体に対してハ
イブリダイゼーションするであろう。レーンM1およびM
2:分子の大きさのマーカー。レーン２および2:S1ヌクレ
アーゼにより消化の前後。pSV2CAT（レーン３）によ
り、pA10CAT2（レーン４）により、pAS II（0.8）
（レーン５）により、 により、およびpAS II（＋）（レーン７）により、産
生された、保護されたCAT転写体。水平の矢印は、保護
されたCAT転写体の主要な長さを示す。
離したRNAにおけるCAT転写開始部位のS1ヌクレアーゼの
マッピングを示す。RNAはグアニジンイソチオシアネー
ト方法により分離した（Chirgwin、J.M.et al.（1979）
Biochem.、18、5294）、S1ヌクレアーゼのマッピング
は、記載されるようにして実施した（Beck、A.およびSh
arp、P.（1977）Cell、12、721;Weaver、R.およびWeiss
mann、C.（1979）Nucl．Acids Res．６、1175−119
2）。プローブは次のようにして作った:CAT遺伝子の非
転写鎖内からの20マーのオリゴヌクレオチドのプライマ
ー（A.Baldwin博士から入手した）を、ポリヌクレオチ
ドキナーゼにより５′末端において標識した。キナーゼ
オリゴヌクレオチドプライマーを変性したpA10CAT2、鋳
型、に対してハイブリダイゼーションし、クレノー断片
および４つの非標識デオキシヌクレオチドの存在下に伸
長し、次いでBgl IIで切断し、次いでアルカリ性ゲル電
気泳動により５′末端において標識したほぼ300bpの一
本鎖のプローブを産生し、これはCAT転写体に対してハ
イブリダイゼーションするであろう。レーンM1およびM
2:分子の大きさのマーカー。レーン２および2:S1ヌクレ
アーゼにより消化の前後。pSV2CAT（レーン３）によ
り、pA10CAT2（レーン４）により、pAS II（0.8）
（レーン５）により、 により、およびpAS II（＋）（レーン７）により、産
生された、保護されたCAT転写体。水平の矢印は、保護
されたCAT転写体の主要な長さを示す。
結果が示すように、pSV2CATおよびpASH II（0.8）で
トランスフェクションされた細胞から分離したRNAにお
けるCATの転写体は、すべて、長さ約130bpの保護された
断片を産生した（第４図におけるレーン３、５および
６）。こうして、pAFS II（0.8）により産生された保護
された断片は、５′−SV40エンハンサー−SV40CAT遺伝
子３′を含有する、pSV2CATのCAT転写体によりそれと同
一の長さを有する（第４図におけるレーン３）。pAHS I
I（0.8）においてゲノム向きまたは逆ゲノム向きで0.8K
bの断片内からのSV40早期プロモーターから上流で開始
されたより長いCATの転写は、検出されなかった（第４
図におけるレーン５および６）。これが示唆するよう
に、明らかなプロモーター配列は0.8Kbの断片中に存在
する。
トランスフェクションされた細胞から分離したRNAにお
けるCATの転写体は、すべて、長さ約130bpの保護された
断片を産生した（第４図におけるレーン３、５および
６）。こうして、pAFS II（0.8）により産生された保護
された断片は、５′−SV40エンハンサー−SV40CAT遺伝
子３′を含有する、pSV2CATのCAT転写体によりそれと同
一の長さを有する（第４図におけるレーン３）。pAHS I
I（0.8）においてゲノム向きまたは逆ゲノム向きで0.8K
bの断片内からのSV40早期プロモーターから上流で開始
されたより長いCATの転写は、検出されなかった（第４
図におけるレーン５および６）。これが示唆するよう
に、明らかなプロモーター配列は0.8Kbの断片中に存在
する。
こうして、逆ゲノム向きの0.8Kbの断片の非常に高い
エンハンサー活性は、実際のエンハンサー要素がこの0.
8Kbの断片の５′末端に向かって非常に小さいDNA領域に
位置することができ、そしてゲノムの向きにおけるよう
に、エンハンサーとプロモーターとの間に介在されると
き、この断片の３′部分がエンハンサー活性に対する阻
害的であるすることができる可能性のためでありうる。
エンハンサー活性は、実際のエンハンサー要素がこの0.
8Kbの断片の５′末端に向かって非常に小さいDNA領域に
位置することができ、そしてゲノムの向きにおけるよう
に、エンハンサーとプロモーターとの間に介在されると
き、この断片の３′部分がエンハンサー活性に対する阻
害的であるすることができる可能性のためでありうる。
胚のエプシロン−グロビンプロモーターにより推進され
るCAT遺伝子をもつ組み換えCATプラスミド 厳格な赤血球特異性を示さない上のプラスミドは、す
べて、広い組織特異性をもつSV40プロモーターを含有す
るCATプラスミド中で構成された。CAT遺伝子を推進する
胚のエプロシン−グロビンプロモーターを使用して、他
の組の組み換えCATプラスミドを構成して、1.9Kbまたは
切頭0.8Kbの断片中に含有されるエンハンサー配列がよ
り厳格な赤血球特異性を示すかどうかを決定した。なぜ
なら、グロビンプロモーターは結合した遺伝子に赤血球
特異的発現を与えることが示されたからである。
るCAT遺伝子をもつ組み換えCATプラスミド 厳格な赤血球特異性を示さない上のプラスミドは、す
べて、広い組織特異性をもつSV40プロモーターを含有す
るCATプラスミド中で構成された。CAT遺伝子を推進する
胚のエプロシン−グロビンプロモーターを使用して、他
の組の組み換えCATプラスミドを構成して、1.9Kbまたは
切頭0.8Kbの断片中に含有されるエンハンサー配列がよ
り厳格な赤血球特異性を示すかどうかを決定した。なぜ
なら、グロビンプロモーターは結合した遺伝子に赤血球
特異的発現を与えることが示されたからである。
第５図は、エプシロン−グロビンプロモーターにより
推進されたCAT遺伝子をもつCATプラスミドの構成を示
す。上の水平線は、組み換えプラスミドの構成において
使用したエプシロン−グロビン遺伝子の制御部位５′を
示す。H:Hind III、Bg:Bgl II、Bc:Bcl I、Ba:BamH I、
pv:Pvu II。次の水平線は、膨張した1.9KbのHind III断
片を示す。水平線より下の数字は、それぞれのDNA断片
のKbの大きさを表す。チェッカーのボックスはエプシロ
ン−クロビンプロモーターを表す。CAT遺伝子のエプシ
ロン−グロビンプロモーター５′をもつエンハンサーを
もたないppは、エプシロン−グロビンプロモーターを含
有する200bpのBst I−Pvu II断片（Li、Q.L.et al.（19
85）J. Biol. Chem.、260、1491−14910）をBgl II−
Stu I二重消化によりSV40プラスミドを欠失してある。p
A10CAT2プラスミドに結合することによって構成した。
ｐεｐS IIまたは （図示せず）は、エンハンサー要素を含有するBst I結
合1.9Kb断片、エプシロン−グロビンプロモーターを含
有する200bpのBst I−Pvu II断片、およびpA10CAT2から
のCAT遺伝子を含有する大きいBgl II−Stu I断片の三重
結合により構成した。ｐεｐS II（0.8）はｐεｐS
II中の1.9KbのインサートをBgl IIおよびBamH Iで消化
し、ここでこれはDNase1超感受性部位を含有しない1.9K
bのインサート中の３′の1.1Kbの下位断片を失欠し、次
いで残りの大きい断片の再循環により形成した。ｐεｐ
S II（0.8）−S I（6.3）は、上の線状の再循環し
ないBgl II−RBamH Iの大きい断片を、エプシロン−グ
ロビン遺伝子の6.3KbのBcl I−BamH I断片５′に結合す
ることによって構成した。
推進されたCAT遺伝子をもつCATプラスミドの構成を示
す。上の水平線は、組み換えプラスミドの構成において
使用したエプシロン−グロビン遺伝子の制御部位５′を
示す。H:Hind III、Bg:Bgl II、Bc:Bcl I、Ba:BamH I、
pv:Pvu II。次の水平線は、膨張した1.9KbのHind III断
片を示す。水平線より下の数字は、それぞれのDNA断片
のKbの大きさを表す。チェッカーのボックスはエプシロ
ン−クロビンプロモーターを表す。CAT遺伝子のエプシ
ロン−グロビンプロモーター５′をもつエンハンサーを
もたないppは、エプシロン−グロビンプロモーターを含
有する200bpのBst I−Pvu II断片（Li、Q.L.et al.（19
85）J. Biol. Chem.、260、1491−14910）をBgl II−
Stu I二重消化によりSV40プラスミドを欠失してある。p
A10CAT2プラスミドに結合することによって構成した。
ｐεｐS IIまたは （図示せず）は、エンハンサー要素を含有するBst I結
合1.9Kb断片、エプシロン−グロビンプロモーターを含
有する200bpのBst I−Pvu II断片、およびpA10CAT2から
のCAT遺伝子を含有する大きいBgl II−Stu I断片の三重
結合により構成した。ｐεｐS II（0.8）はｐεｐS
II中の1.9KbのインサートをBgl IIおよびBamH Iで消化
し、ここでこれはDNase1超感受性部位を含有しない1.9K
bのインサート中の３′の1.1Kbの下位断片を失欠し、次
いで残りの大きい断片の再循環により形成した。ｐεｐ
S II（0.8）−S I（6.3）は、上の線状の再循環し
ないBgl II−RBamH Iの大きい断片を、エプシロン−グ
ロビン遺伝子の6.3KbのBcl I−BamH I断片５′に結合す
ることによって構成した。
第６図は、エプシロン−グロビンプロモーターにより
推進されたCAT遺伝子を含有する組み換えCATプラスミド
のCAT活性を示す。同一量（20μｇ）の各組み換えプラ
スミドをトランスフェクションのために使用した。しか
しながら、7Kbの大きいインサートをもつ、ｐεｐS I
I（0.8）−S I（6.3）プラスミドは他のプラスミドの
分子量の約２倍の分子量を有し、こうしてこのプラスミ
ドについて、20μｇのトランスフェクション分子の数は
20μｇの他のプラスミドの約半分のみである。したがっ
て、ｐεｐS II（0.8）−SI（6.3）中のアセチル化
スポットの強度は、トランスフェクション分子の数につ
いて補正後、ほぼ２倍だけ増加されるであろう。パイロ
ット実験において、アセチル化スポットの強度少なくと
も20μg/10cm皿のK562細胞において、トランスフェクシ
ョンプラスミドの量に関して直線で増加することが示さ
れた。
推進されたCAT遺伝子を含有する組み換えCATプラスミド
のCAT活性を示す。同一量（20μｇ）の各組み換えプラ
スミドをトランスフェクションのために使用した。しか
しながら、7Kbの大きいインサートをもつ、ｐεｐS I
I（0.8）−S I（6.3）プラスミドは他のプラスミドの
分子量の約２倍の分子量を有し、こうしてこのプラスミ
ドについて、20μｇのトランスフェクション分子の数は
20μｇの他のプラスミドの約半分のみである。したがっ
て、ｐεｐS II（0.8）−SI（6.3）中のアセチル化
スポットの強度は、トランスフェクション分子の数につ
いて補正後、ほぼ２倍だけ増加されるであろう。パイロ
ット実験において、アセチル化スポットの強度少なくと
も20μg/10cm皿のK562細胞において、トランスフェクシ
ョンプラスミドの量に関して直線で増加することが示さ
れた。
これらの構成体において、1.9Kbの断片は、いずれの
向きにおいても、HeLa細胞中でCAT遺伝子を活性化する
と思われない（第６図）。しかもK562細胞において、1.
9kgの断片（ｐεｐS II中）および0.8Kbの断片（ｐε
ｐS II 0.8中）は、ゲノムの向きにおいてさえ、CAT
遺伝子の活性を約300倍の同様なレベルに増強する。こ
れが示唆するように、相同性のエプシロン−グロビンプ
ロモーターとの組み合わせにおいて、エンハンサー要素
１）は異質のSV40プロモーターより活性であり;2）それ
はHeLa細胞中のCAT遺伝子を活性化しないので、より厳
格な赤血球特異性を示すように思われる；そして３）エ
プシロン−グロビンプロモーターから少なくとも1.1Kb
だけ離れた配置することができ、そしてなお同一程度の
エンハンサー活性を保持する。なぜなら、それぞれ、ｐ
εｐS IIおよびｐεｐS II中の1.9Kbおよび0.8KBの
断片は類似するからである（表１）。
向きにおいても、HeLa細胞中でCAT遺伝子を活性化する
と思われない（第６図）。しかもK562細胞において、1.
9kgの断片（ｐεｐS II中）および0.8Kbの断片（ｐε
ｐS II 0.8中）は、ゲノムの向きにおいてさえ、CAT
遺伝子の活性を約300倍の同様なレベルに増強する。こ
れが示唆するように、相同性のエプシロン−グロビンプ
ロモーターとの組み合わせにおいて、エンハンサー要素
１）は異質のSV40プロモーターより活性であり;2）それ
はHeLa細胞中のCAT遺伝子を活性化しないので、より厳
格な赤血球特異性を示すように思われる；そして３）エ
プシロン−グロビンプロモーターから少なくとも1.1Kb
だけ離れた配置することができ、そしてなお同一程度の
エンハンサー活性を保持する。なぜなら、それぞれ、ｐ
εｐS IIおよびｐεｐS II中の1.9Kbおよび0.8KBの
断片は類似するからである（表１）。
エンハンサー要素がエプシロン−グロビンプロモータ
ーからなおさらに離れて配置することができるかどうか
を決定するために、およびまた、それ自体多くのエンハ
ンサー機能を示さないが、HS II中でエンハンサーと縦
に結合されている場合、HS IIの真下に横たわるDNAがHS
IIのエンハンサー機能を促進することができるかどう
かを決定するために、他のプラスミド（ｐεｐS II
（0.8）−ｐεｐS II（6.3））を構成した。このプラ
スミドにおいて、0.8Kbの断片中に含有されるエンハン
サー要素をHS Iの真下に横たわる接触させ、次いでゲノ
ム中のHS Iとエプシロン−グロビンプロモーターとの間
に自然に存在する他の5.5KbのDNAと接触させる（第５
図）。CAT遺伝子の活性を約500倍だけ増強する、このプ
ラスミドのCAT活性は、ε−グロビンプロモーターの0.8
Kbの断片５′およびCAT遺伝子のみを含有する、ｐεpHS
II（0.8）より40％活性である。これが示唆するよう
に、１）HS II中のエンハンサー要素はエプシロン−グ
ロビンプロモーターから6Kb程度に離れて配置すること
ができ、そしてなおエンハンサー活性を保持することが
でき；そして２）HS I中のまたは5.5Kbのより下流のDNA
中の配列要素はHS IIのエンハンサー機能を促進するこ
とができる。
ーからなおさらに離れて配置することができるかどうか
を決定するために、およびまた、それ自体多くのエンハ
ンサー機能を示さないが、HS II中でエンハンサーと縦
に結合されている場合、HS IIの真下に横たわるDNAがHS
IIのエンハンサー機能を促進することができるかどう
かを決定するために、他のプラスミド（ｐεｐS II
（0.8）−ｐεｐS II（6.3））を構成した。このプラ
スミドにおいて、0.8Kbの断片中に含有されるエンハン
サー要素をHS Iの真下に横たわる接触させ、次いでゲノ
ム中のHS Iとエプシロン−グロビンプロモーターとの間
に自然に存在する他の5.5KbのDNAと接触させる（第５
図）。CAT遺伝子の活性を約500倍だけ増強する、このプ
ラスミドのCAT活性は、ε−グロビンプロモーターの0.8
Kbの断片５′およびCAT遺伝子のみを含有する、ｐεpHS
II（0.8）より40％活性である。これが示唆するよう
に、１）HS II中のエンハンサー要素はエプシロン−グ
ロビンプロモーターから6Kb程度に離れて配置すること
ができ、そしてなおエンハンサー活性を保持することが
でき；そして２）HS I中のまたは5.5Kbのより下流のDNA
中の配列要素はHS IIのエンハンサー機能を促進するこ
とができる。
エンハンサー配列は種特異的ではない。
ヒト赤血球特異的転写エンハンサー配列は、適当なプ
ロモーター配列にカップリングしたとき、ヒトばかりで
なく、かつまたマウス（MEL）赤血球において機能的で
ある（表１）。この観察が示唆するように、ヒト赤血球
特異的転写エンハンサー配列は種特異的ではない。
ロモーター配列にカップリングしたとき、ヒトばかりで
なく、かつまたマウス（MEL）赤血球において機能的で
ある（表１）。この観察が示唆するように、ヒト赤血球
特異的転写エンハンサー配列は種特異的ではない。
遺伝子を造血細胞中に導入するための組み換えベクター
の構成 第７図は、遺伝子を造血細胞中に導入するための組み
換えベクターの構成を示す。この図面は一定の尺度で描
れていない。点描したボックス選択可能なマーカー遺伝
子を表す（NeoRは示されているが、他のものを使用する
ことができる）。水平の矢印は遺伝子転写の向きを示
す。チェッカーのボックスは、必要に応じてスプライシ
ングした選択可能なマーカー遺伝子であることができ
る、プロモーター配列（メタロチオネイン、SV40または
他の適当なプロモーター）を表す。ハッチングしたボッ
クスは遺伝子治療のためにスプライシングすべき遺伝子
を表し、この遺伝子は５′および３′のウイルスのスプ
ライシング部位（５′ssおよび３′ss）の間の独特BamH
I（Bam）中に、選択可能なマーカー遺伝子およびウイ
ルスの転写のそれと反対の転写向きにスプライシングす
ることができる。充填したボックスは、置換遺伝子治療
のために遺伝子のスプライシングされた５′であるべ
き、赤血球特異的エンハンサー要素を表す。赤血球特異
的エンハンサーは、また、遺伝子のスプライシングされ
た３′であることができる。適当な向きにおいて、エン
ハンサー−遺伝子のカセットを、また、レトロウイルス
のベクター中の他の制限部位中にスプライシングするこ
とができるが、ただしこのような挿入部位はカセット中
の遺伝子の転写が赤血球特異的エンハンサーにより調節
されるようにさせ、そして他のベクター配列による望ま
しくない調節の影響を存在させなくすることができる。
の構成 第７図は、遺伝子を造血細胞中に導入するための組み
換えベクターの構成を示す。この図面は一定の尺度で描
れていない。点描したボックス選択可能なマーカー遺伝
子を表す（NeoRは示されているが、他のものを使用する
ことができる）。水平の矢印は遺伝子転写の向きを示
す。チェッカーのボックスは、必要に応じてスプライシ
ングした選択可能なマーカー遺伝子であることができ
る、プロモーター配列（メタロチオネイン、SV40または
他の適当なプロモーター）を表す。ハッチングしたボッ
クスは遺伝子治療のためにスプライシングすべき遺伝子
を表し、この遺伝子は５′および３′のウイルスのスプ
ライシング部位（５′ssおよび３′ss）の間の独特BamH
I（Bam）中に、選択可能なマーカー遺伝子およびウイ
ルスの転写のそれと反対の転写向きにスプライシングす
ることができる。充填したボックスは、置換遺伝子治療
のために遺伝子のスプライシングされた５′であるべ
き、赤血球特異的エンハンサー要素を表す。赤血球特異
的エンハンサーは、また、遺伝子のスプライシングされ
た３′であることができる。適当な向きにおいて、エン
ハンサー−遺伝子のカセットを、また、レトロウイルス
のベクター中の他の制限部位中にスプライシングするこ
とができるが、ただしこのような挿入部位はカセット中
の遺伝子の転写が赤血球特異的エンハンサーにより調節
されるようにさせ、そして他のベクター配列による望ま
しくない調節の影響を存在させなくすることができる。
表１。SV40またはエプシロン−グロビンプロモーターに
より推進されたCATプラスミドの相対的CAT活性。試験プ
ラスミドの相対的CAT活性は、アセチル化された形態に
転化された合計の入力の14Cクランフェニコールの百分
率（TLC上のスポットａおよびｂ）／そのCAT活性を１と
して設定したエンハンサーをもたないpA10CAT2またはｐ
εｐによる転化の百分率として定義される。カッコ内の
数値は、改良された条件下に実施したCATアッセイから
得られた相対的CAT活性である（第３図の凡例参照）。
＊＝他の小さいプラスミドと同一の数のトランスフェク
ションｐεpHS II（0.8）−RHS I（6.3）分子の補正し
たCAT活性（第５図の凡例参照）。＊＊：アセチル化し
た形態への14C−クロランフェニコールの転化百分率
は、SV40プロモーターを含有するプラスミドについての
それらに比較して非常に低い。したがって、この観察を
例示するために、相対的CAT値は参照としてpA10CAT2を
使用して計算した。N.D.＝実施せず。
より推進されたCATプラスミドの相対的CAT活性。試験プ
ラスミドの相対的CAT活性は、アセチル化された形態に
転化された合計の入力の14Cクランフェニコールの百分
率（TLC上のスポットａおよびｂ）／そのCAT活性を１と
して設定したエンハンサーをもたないpA10CAT2またはｐ
εｐによる転化の百分率として定義される。カッコ内の
数値は、改良された条件下に実施したCATアッセイから
得られた相対的CAT活性である（第３図の凡例参照）。
＊＝他の小さいプラスミドと同一の数のトランスフェク
ションｐεpHS II（0.8）−RHS I（6.3）分子の補正し
たCAT活性（第５図の凡例参照）。＊＊：アセチル化し
た形態への14C−クロランフェニコールの転化百分率
は、SV40プロモーターを含有するプラスミドについての
それらに比較して非常に低い。したがって、この観察を
例示するために、相対的CAT値は参照としてpA10CAT2を
使用して計算した。N.D.＝実施せず。
造血細胞中のカセット中の遺伝子の適切な調節のため
に、主要なDNase1超感受性部位HS I、HS III、HS IV
（参照、第１図）またはHS VI（Tuan、D.et al.（198
5）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、6384）またはこれら
の部位の任意の組み合わせ下に横たわる、可能な補助調
節機能をもつDNA配列を、また、赤血球特異的エンハン
サーの次に、あるいはカセットまたはベクター配列中の
他の適当な中にスプライシングすることができる。
に、主要なDNase1超感受性部位HS I、HS III、HS IV
（参照、第１図）またはHS VI（Tuan、D.et al.（198
5）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、6384）またはこれら
の部位の任意の組み合わせ下に横たわる、可能な補助調
節機能をもつDNA配列を、また、赤血球特異的エンハン
サーの次に、あるいはカセットまたはベクター配列中の
他の適当な中にスプライシングすることができる。
同等の実施態様 当業者は日常の実験を越えない実験を使用して、ここ
に記載する本発明の特定の実施態様に対する多くの同等
の実施態様に認識するであろう。このような同等の実施
態様は次の請求の範囲内に包含される。
に記載する本発明の特定の実施態様に対する多くの同等
の実施態様に認識するであろう。このような同等の実施
態様は次の請求の範囲内に包含される。
なお、本発明の主たる特徴及び態様は以下のとおりで
ある。
ある。
1.第１図に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素。
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素。
2.長さが約800ヌクレオチドの配列からなり、該配列は
ヒトエプシロングロビン遺伝子から約10.3〜11.1キロベ
ースだけ上流におよびヒト赤血球細胞中のベーターグロ
ビン遺伝子から約53.0〜53.8キロベースだけ上流に位置
するエンハンサー配列に対して実質的に相同性である、
上記第１項記載のエンハンサー要素。
ヒトエプシロングロビン遺伝子から約10.3〜11.1キロベ
ースだけ上流におよびヒト赤血球細胞中のベーターグロ
ビン遺伝子から約53.0〜53.8キロベースだけ上流に位置
するエンハンサー配列に対して実質的に相同性である、
上記第１項記載のエンハンサー要素。
3.第１図に示すヌクレオチド配列の少なくとも一部分と
同一または実質的に相同性である、上記第１項記載のエ
ンハンサー要素。
同一または実質的に相同性である、上記第１項記載のエ
ンハンサー要素。
4.a.タンパク質またはその前駆体をエンコードする転写
単位からなるDNA、および b.第１図に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素ま
たはその転写的に機能する部分、 からなる、宿主細胞中の組み込みかつその中でタンパク
質を発現するためのDNA構成体。
単位からなるDNA、および b.第１図に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素ま
たはその転写的に機能する部分、 からなる、宿主細胞中の組み込みかつその中でタンパク
質を発現するためのDNA構成体。
5.転写エンハンサー要素は長さが約800ヌクレオチドの
配列からなり、該配列はヒトエプシロングロビン遺伝子
から約10.3〜11.1キロベースだけ上流におよびベーター
グロビン遺伝子から約53.0〜53.8キロベースだけ上流に
位置するエンハンサー配列に対して実質的に相同性であ
る、上記第４項記載のDNA構成体。
配列からなり、該配列はヒトエプシロングロビン遺伝子
から約10.3〜11.1キロベースだけ上流におよびベーター
グロビン遺伝子から約53.0〜53.8キロベースだけ上流に
位置するエンハンサー配列に対して実質的に相同性であ
る、上記第４項記載のDNA構成体。
6.エンハンサー要素が第１図に示すヌクレオチド配列の
少なくとも一部分からなる、上記第５項記載のDNA構成
体。
少なくとも一部分からなる、上記第５項記載のDNA構成
体。
7.転写単位がプロモーター配列を含むDNA構成体。
8.転写単位がヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコード
する、上記第４項記載のDNA構成体。
する、上記第４項記載のDNA構成体。
9.転写単位がヒトベーターグロビンをエンコードする、
上記第８項記載のDNA構成体。
上記第８項記載のDNA構成体。
10.転写単位が酵素または酵素サブユニツトをエンコー
ドする、上記第４項記載のDNA構成体。
ドする、上記第４項記載のDNA構成体。
11.酵素がグルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼまたはピルベートキナーゼである、上記第10項記載
のDNA構成体。
ーゼまたはピルベートキナーゼである、上記第10項記載
のDNA構成体。
12.転写単位が赤血球構造タンパク質をエンコードす
る、上記第４項記載のDNA構成体。
る、上記第４項記載のDNA構成体。
13.a.プロモーターおよびタンパク質またはその前駆体
をエンコードする１または２以上の構造遺伝子からなる
転写単位、および b.第１図に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素ま
たはその転写的に機能する部分、 からなる、赤血球、その前駆体または造血幹細胞をトラ
ンスフエクシヨンして、問題のタンパク質を発現するト
ランスフエクシヨンされた細胞を産生するためのベクタ
ー。
をエンコードする１または２以上の構造遺伝子からなる
転写単位、および b.第１図に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素ま
たはその転写的に機能する部分、 からなる、赤血球、その前駆体または造血幹細胞をトラ
ンスフエクシヨンして、問題のタンパク質を発現するト
ランスフエクシヨンされた細胞を産生するためのベクタ
ー。
14.転写エンハンサー要素は長さが約800ヌクレオチドの
配列からなり、該配列はヒトエプシロングロビン遺伝子
から約10.3〜11.1キロベースだけ上流におよびヒト赤血
球中のベーターグロビン遺伝子から約53.0〜53.8キロベ
ースだけ上流に位置するエンハンサー配列に対して実質
的に相同性である、上記第13項記載のベクター。
配列からなり、該配列はヒトエプシロングロビン遺伝子
から約10.3〜11.1キロベースだけ上流におよびヒト赤血
球中のベーターグロビン遺伝子から約53.0〜53.8キロベ
ースだけ上流に位置するエンハンサー配列に対して実質
的に相同性である、上記第13項記載のベクター。
15.エンハンサー要素が第１図に示す配列の少なくとも
一部分に対して実質的に相同性である配列からなる、上
記第14項記載のベクター。
一部分に対して実質的に相同性である配列からなる、上
記第14項記載のベクター。
16.転写単位がヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコー
ドする、上記第13項記載のベクター。
ドする、上記第13項記載のベクター。
17.転写単位がヒトベーターグロビンをエンコードす
る、上記第16項記載のベクター。
る、上記第16項記載のベクター。
18.転写単位が酵素または酵素サブユニツトをエンコー
ドする、上記第13項記載のベクター。
ドする、上記第13項記載のベクター。
19.酵素がグルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナ
ーゼまたはピルベートキナーゼである、上記第18項記載
のベクター。
ーゼまたはピルベートキナーゼである、上記第18項記載
のベクター。
20.転写単位が赤血球構造タンパク質をエンコードす
る、上記第13項記載のベクター。
る、上記第13項記載のベクター。
21.選択可能なマーカーをエンコードする発現可能な遺
伝子をさらに含む、上記第13項記載のベクター。
伝子をさらに含む、上記第13項記載のベクター。
22.プラスミドまたはウイルスからなる、上記第13項記
載のベクター。
載のベクター。
23.レトロウイルスからなる、上記第15項記載のベクタ
ー。
ー。
24.レトロウイルスからなる、上記第13項記載のベクタ
ー。
ー。
25.構造遺伝子が正常ヒトグロビンポリペプチド鎖をエ
ンコードする、上記第24項記載のレトロウイルスのベク
ター。
ンコードする、上記第24項記載のレトロウイルスのベク
ター。
26.構造遺伝子が正常ヒトベーターグロビンポリペプチ
ドをエンコードする、上記第25項記載のレトロウイルス
のベクター。
ドをエンコードする、上記第25項記載のレトロウイルス
のベクター。
27.構造遺伝子が正常ベーターグロビンポリペプチド鎖
である、上記第24項記載のレトロウイルスのベクター。
である、上記第24項記載のレトロウイルスのベクター。
28.エンハンサーが第１図に示すヌクレオチド配列の少
なくとも一部分に対して実質的に相同性である配列であ
る、上記第24項記載のレトロウイルスのベクター。
なくとも一部分に対して実質的に相同性である配列であ
る、上記第24項記載のレトロウイルスのベクター。
29.a.タンパク質またはその前駆体をエンコードするDNA
の挿入のための挿入領域、および b.第１図に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素ま
たはその転写的に機能する部分、 からなる、タンパク質をエンコードするDNAを受容しお
よび赤血球をトランスフエクシヨンして、問題のタンパ
ク質を発現するトランスフエクシヨンされた赤血球を産
生するためのベクター。
の挿入のための挿入領域、および b.第１図に示すヌクレオチド配列と同一または実質的に
相同性であるヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素ま
たはその転写的に機能する部分、 からなる、タンパク質をエンコードするDNAを受容しお
よび赤血球をトランスフエクシヨンして、問題のタンパ
ク質を発現するトランスフエクシヨンされた赤血球を産
生するためのベクター。
30.挿入領域が制限酵素のための認識部位をエンコード
するDNA配列である、上記第29項記載のベクター。
するDNA配列である、上記第29項記載のベクター。
31.エンハンサー要素は長さが約800ヌクレオチドの配列
からなり、該配列はヒトエプシロングロビン遺伝子から
約10.3〜11.1キロベースだけ上流におよびヒト赤血球中
のベーターグロビン遺伝子から53.0〜53.8キロベースだ
け上流に位置するエンハンサー配列に対して実質的に相
同性である、上記第29項記載のベクター。
からなり、該配列はヒトエプシロングロビン遺伝子から
約10.3〜11.1キロベースだけ上流におよびヒト赤血球中
のベーターグロビン遺伝子から53.0〜53.8キロベースだ
け上流に位置するエンハンサー配列に対して実質的に相
同性である、上記第29項記載のベクター。
32.エンハンサーが第１図に示すヌクレオチド配列の少
なくとも一部分からなる、上記第29項記載のベクター。
なくとも一部分からなる、上記第29項記載のベクター。
33.挿入領域から上流に位置するプロモーターをさらに
含む、上記第29項記載のベクター。
含む、上記第29項記載のベクター。
34.a.タンパク質またはその前駆体をエンコードする転
写単位からなるDNA、および b.転写単位に対して十分に近接して位置してその転写を
増強する上記第１項記載のヒト赤血球特異的転写エンハ
ンサー要素またはその転写的に機能する部分、 からなるトランスフエクシヨンされたDNAを含有する、
タンパク質の発現のための赤血球トランスフエクシヨン
体。
写単位からなるDNA、および b.転写単位に対して十分に近接して位置してその転写を
増強する上記第１項記載のヒト赤血球特異的転写エンハ
ンサー要素またはその転写的に機能する部分、 からなるトランスフエクシヨンされたDNAを含有する、
タンパク質の発現のための赤血球トランスフエクシヨン
体。
35.転写単位がヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコー
ドする、上記第34項記載のベクター。
ドする、上記第34項記載のベクター。
36.転写単位がベーターグロビンをエンコードする、上
記第35項記載のベクター。
記第35項記載のベクター。
37.次の工程： a.赤血球の疾患に悩まされる個体から骨髄細胞を取り出
し、 b.i.タンパク質またはその前駆体をエンコードする転写
単位からなるDNA、および ii.転写単位に対して十分に近接して位置してその
転写を増強する上記第１項記載のヒト赤血球特異的転写
エンハンサー要素またはその転写に機能する部分、 からなるDNAで骨髄細胞をトランスフエクシヨンし、 c.トランスフエクシヨンした骨髄細胞を個体にもどすこ
と、 からなる、正常赤血球タンパク質の発現の不足による
か、あるいは構造的または機能的に異常な赤血球の生合
成により特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方
法。
し、 b.i.タンパク質またはその前駆体をエンコードする転写
単位からなるDNA、および ii.転写単位に対して十分に近接して位置してその
転写を増強する上記第１項記載のヒト赤血球特異的転写
エンハンサー要素またはその転写に機能する部分、 からなるDNAで骨髄細胞をトランスフエクシヨンし、 c.トランスフエクシヨンした骨髄細胞を個体にもどすこ
と、 からなる、正常赤血球タンパク質の発現の不足による
か、あるいは構造的または機能的に異常な赤血球の生合
成により特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方
法。
38.転写エンハンサーが、第１図に示すヌクレオチド配
列の少なくとも一部分に対して実質的に相同性である配
列からなる、上記第37項記載の方法。
列の少なくとも一部分に対して実質的に相同性である配
列からなる、上記第37項記載の方法。
39.転写単位のベーターグロビンをエンコードする、上
記第37項記載の方法。
記第37項記載の方法。
40.DNAがレトロウイルスのベクターからなる、上記第37
項記載の方法。
項記載の方法。
41.次の工程： a.疾患に悩まされる個体から骨髄細胞を取り出し、 b.i.ベーターグロビンまたはその前駆体をエンコードす
る転写単位からなるDNA、および ii.転写単位に対して十分に近接して位置してその
転写を増強する上記第１項記載のヒト赤血球特異的転写
エンハンサー要素またはその転写的に機能する部分、 からなるDNAで骨髄細胞をトランスフエクシヨンし、 c.トランスフエクシヨンした骨髄細胞を個体にもどすこ
と、 からなる、ベーターグロビンが不足するか、あるいは異
常である、ヘモグロビンのベーターグロビン鎖のヒトヘ
モグロビン疾患の遺伝子治療方法。
る転写単位からなるDNA、および ii.転写単位に対して十分に近接して位置してその
転写を増強する上記第１項記載のヒト赤血球特異的転写
エンハンサー要素またはその転写的に機能する部分、 からなるDNAで骨髄細胞をトランスフエクシヨンし、 c.トランスフエクシヨンした骨髄細胞を個体にもどすこ
と、 からなる、ベーターグロビンが不足するか、あるいは異
常である、ヘモグロビンのベーターグロビン鎖のヒトヘ
モグロビン疾患の遺伝子治療方法。
42.トランスフエクシヨンするDNAがレトロウイルスのベ
クターである、上記第41項記載の方法。
クターである、上記第41項記載の方法。
43.転写エンハンサーが、第１図に示すヌクレオチド配
列の少なくとも一部分に対して実質的に相同性である配
列からなる、上記第41項記載の方法。
列の少なくとも一部分に対して実質的に相同性である配
列からなる、上記第41項記載の方法。
44.ヒト赤血球特異的転写エンハンサー、プロモーター
および正常タンパク質またはその前駆体の構造遺伝子ま
たはその成分からなる遺伝子構成体を、ヒトまたはヒト
以外の胚細胞または胎児造血細胞中に導入することから
なる、正常赤血球タンパク質の発現の不足によるか、あ
るいは構造的または機能的に異常な赤血球の生合成によ
り特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方法。
および正常タンパク質またはその前駆体の構造遺伝子ま
たはその成分からなる遺伝子構成体を、ヒトまたはヒト
以外の胚細胞または胎児造血細胞中に導入することから
なる、正常赤血球タンパク質の発現の不足によるか、あ
るいは構造的または機能的に異常な赤血球の生合成によ
り特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方法。
45.遺伝子構成体を、トランスフエクシヨン、感染、マ
イクロインジエクシヨンまたはエレクトロボレイシヨン
により導入する、上記第４項記載の方法。
イクロインジエクシヨンまたはエレクトロボレイシヨン
により導入する、上記第４項記載の方法。
46.転写単位が非赤血球タンパク質である、上記第４項
記載のDNA構成体。
記載のDNA構成体。
47.細胞がヒト赤血球である、上記第34項記載のトラン
スフエクシヨン体。
スフエクシヨン体。
48.細胞がヒト以外の赤血球である、上記第34項記載の
トランスフエクシヨン体。
トランスフエクシヨン体。
フロントページの続き (72)発明者 ソロモン，ウイリアム・ビー アメリカ合衆国ニユーヨーク州10021ニ ユーヨーク・イーストシツクステイナイ ンスストリート205
Claims (9)
- 【請求項１】下記ヌクレオチド配列を、またはその転写
機能を有する部分を含むDNAからなるヒト赤血球特異的
転写エンハンサー要素。 - 【請求項２】a.タンパク質またはその前駆体をコードす
る転写単位からなるDNA、および b.請求項１記載のヒト赤血球特異的転写エンハンサー要
素を含んでなる、宿主細胞中に組み込みかつその中でタ
ンパク質を発現するためのDNA構成体。 - 【請求項３】転写単位が赤血球構造タンパク質をコード
する請求項２記載のDNA構成体。 - 【請求項４】転写単位が非赤血球細胞タンパク質をコー
ドする請求項２記載のDNA構成体。 - 【請求項５】a.プロモーターおよびタンパク質またはそ
の前駆体をコードする１また２以上の構造遺伝子からな
る転写単位、および b.請求項１記載のヒト赤血球特異的転写エンハンサー要
素 を含んでなる、赤血球、その前駆体または造血幹細胞を
トランスフエクシヨンして、問題のタンパク質を発現す
るトランスフエクシヨンされた細胞を産生するためのベ
クター。 - 【請求項６】レトロウイルスDNAからなる請求項５記載
のベクター。 - 【請求項７】a.タンパク質またはその前駆体をコードす
る転写単位からなるDNA、および b.転写単位に対して十分に近接して位置してその転写を
増強する請求項１記載のヒト赤血球特異的転写エンハン
サー要素、 を含んでなるトランスフエクシヨンされたDNAを有す
る、タンパク質の発現のための赤血球トランスフエクシ
ヨン体。 - 【請求項８】細胞がヒト赤血球である請求項７記載のト
ランスフエクシヨン体。 - 【請求項９】細胞がヒト以外の赤血球である請求項７記
載のトランスフェクシヨン体。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9802587A | 1987-09-17 | 1987-09-17 | |
| US113,677 | 1987-09-26 | ||
| US11367787A | 1987-10-26 | 1987-10-26 | |
| US98,025 | 1987-10-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03500245A JPH03500245A (ja) | 1991-01-24 |
| JP2779192B2 true JP2779192B2 (ja) | 1998-07-23 |
Family
ID=26793935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63509102A Expired - Lifetime JP2779192B2 (ja) | 1987-09-17 | 1988-09-15 | ヒト赤血球特異的転写エンハンサー |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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