DE69636546T2

DE69636546T2 - Natürliche oder synthetische retroelement-sequenzen, die die insertion von nukleotiden in eukaryotische zellen erlauben

Info

Publication number: DE69636546T2
Application number: DE69636546T
Authority: DE
Inventors: Andre Choulika; Jean-Francois Nicolas
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1995-08-07
Filing date: 1996-07-25
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2016-07-26
Also published as: DE69636546D1; CA2226301C; EP1760154A2; US6200800B1; EP1760154A3; ES2276407T3; HK1105662A1; JP4173543B2; JPH11510391A; JP2008086321A; EP0843732A1; PT843732E; DE69638235D1; DK0843732T3; US20060269522A1; CA2226301A1; WO1997006271A1; EP1760154B1; FR2737731B1; FR2737731A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Sequenz von natürlichen oder synthetischen Retroelementen, insbesondere eine retrovirale LTR-Nucleotidsequenz, insbesondere retrovirale DNA, sowie einen diese Sequenz enthaltenden retroviralen Vektor, durch den sich bei der Infektion einer Zelle, in die die Integration eines interessierenden Gens, welches in diesem Vektor enthalten ist, gewünscht ist, ein großer Teil der proviralen Sequenzen, die nach Integration des rekombinanten Provirus nicht mehr notwendig sind, entfernen lässt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polynucleotid, umfassend:

(a) die Sequenz LTR3' oder LTR5' eines natürlichen oder synthetischen Retroelements; und
(b) eine Insertionssequenz, umfassend eine interessierende Nucleotidsequenz sowie, für ein gegebenes Rekombinationssystem, eine einzelne Erkennungssequenz einer Rekombinase,

Die neuesten Fortschritte hinsichtlich der Verwendung der Retroviren als Vektoren von Genen teilen sich in 3 Kategorien: (i) Verbesserung der Enkapsidierungszelllinien, (ii) Manipulation des Tropismus der Hüllproteine, (iii) Expression von mehreren Genen. Die Modifikation der Struktur des integrierten Provirus wurde bisher noch nicht genau untersucht, weil dieses bestimmte essentielle Elemente enthält, die in cis wirken. Diese Elemente sind der Ursprung mehrerer Probleme.
Hinsichtlich der Struktur gründet sich das retrovirale Vektorsystem auf 2 Elemente: Die transkomplementierenden Gene (gag, pol und env), und die in cis wirkenden Sequenzen (U3, R, U5, die Polypurinkette (PPT), die Primer-Bindungsstelle (PBS) und das Enkapsidierungs- und Dimerisierungssignal).
Die transkomplementierenden Gene werden in transkomplementierende Zellen eingebaut. Sie werden nicht auf die Zielzellen übertragen.
Die Sequenzen, die in cis wirken, werden in retrovirale Vektoren eingebaut. Die meisten von ihnen werden auf die infizierten Zielzellen übertragen und werden in das rekombinante Provirus integriert. Die Beseitigung von einer beliebigen dieser Sequenzen, die in cis wirken, führt zu einem nicht funktionellen retroviralen System. Das Enkapsidierungssignal ist zur Enkapsidierung des retroviralen Genoms in virale Partikel notwendig. PBS, PPT und R sind zur inversen Transcription erforderlich. Die U3- und U5-Sequenzen sind zur inversen Transcription und zur Integration des retroviralen in die Zelle eingebrachten Produkts unerlässlich.
Nach Integration des Provirus sind diese Sequenzen zur Expression des Gens nicht mehr notwendig. Diese Sequenzen können im Gegenteil sogar der Grund für zahlreiche Probleme sein. (i) Eine transcriptionelle Interferenz kann sich aus der Gegenwart des starken Promotors in den U3-Sequenzen ergeben. (ii) Die PBS kann in cis als inhibitorisches Element für die internen Promotoren wirken. Beispielsweise ist die PBS in den pluripotenten Zellen eine Erkennungssequenz für einen starken Repressor und wirkt außerdem als inhibitorisches Element. (iii) Die U3-Sequenz enthält mindestens eines der negativen Regulationselemente, die in den direkten zwischen –345 und –306 wiederholten beabstandeten Aktivatoren liegen. (iv) LTR3' (lange terminate Wiederholungseinheit) kann flankierende Gene der Zellen aktivieren, mit mitunter für die Zelle schädlichen Folgen. (v) Die RNA, die ausgehend von dem Promotor des LTR5' exprimiert wird, enthält das Enkapsidierungssignal und kann folglich in einen retroviralen Partikel eingebaut werden. Diese RNA kann mit einer zellulären RNA oder einer retroviralen RNA eines Phänotyps rekombinieren, was zu der Gewinnung eines Retrovirus führt, der mit neuen Eigenschaften (die eine potentielle biologische Gefahr hervorrufen) ausgestattet ist. Diese Probleme sind noch nicht vollkommen behoben, da alle diese Elemente zur Replikation und Insertion des Virus in das Genom notwendig sind.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder eine Sequenz von natürlichen oder synthetischen Retroelementen entwickelt, insbesondere eine retrovirale Nucleotidsequenz und insbesondere einen retroviralen Vektor, der diese Sequenz umfasst, und zwar dergestalt, dass sich ein großer Teil der proviralen Sequenzen, die nach Integration eines Provirus in eine Wirtszelle nicht mehr notwendig sind, beseitigen lässt. Insbesondere ist diese retrovirale Sequenz eine retrovirale DNA, die die Integration einer einzigen LTR-Sequenz, eines Retrotransposons oder einer Sequenz, umfassend eine U3-, R- oder U5-Region, in das Genom einer Wirtszelle ermöglichen kann.
Die Erfindung betrifft auch die Wirtszellen, vorzugsweise eukaryotische Zellen, die nach Transfektion durch die erfindungsgemäße Sequenz von Retroelementen oder durch einen Vektor, der sie enthält, erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach ein Polynucleotid, umfassend:

(a) die Sequenz LTR3' oder LTR5' eines natürlichen oder synthetischen Retroelements; und
(b) eine Insertionssequenz, umfassend eine interessierende Nucleotidsequenz sowie, für ein gegebenes Rekombinatiossystem, eine einzelne Erkennungssequenz einer Rekombinase,

Insbesondere wird diese Insertionssequenz in eine Region eingebaut, die in cis wirkt, insbesondere in die LTR3'- oder LTR5'-Region, und vorzugsweise in die U3-Region von LTR3' oder die U5-Region von LTR5' dieser retroviralen Sequenz. Diese Insertionssequenz umfasst eine interessierende Nucleotidsequenz, die in das Genom einer Wirtszelle integriert werden kann, sowie eine Erkennungssequenz für eine Rekombinase. Vorzugsweise enthält die gesamte retrovirale Sequenz nur eine einzige Erkennungssequenz, die zu der interessierenden Sequenz beispielsweise stromaufwärts oder stromabwärts liegt, obwohl letzterer Parameter nicht absolut notwendig ist. Die interessierende Nucleotidsequenz kann in dem Maße stromabwärts von der Erkennungssequenz liegen, in dem diese letztere in der Region eingeschlossen ist, die in eine Zielzelle bei Infektion dieser Zielzelle durch ein Retrovirus, der die retrovirale Sequenz enthält, transferiert wird. Die maximale Länge der Insertionssequenz, die der erfindungsgemäße retrovirale Vektor enthält, liegt normalerweise zwischen 0,5 und 10 kb.
Insbesondere umfasst die erfindungsgemäße Sequenz auch eine DNA-Sequenz, die eine Rekombinase codiert, die zur Erkennung der Sequenz ihrer Erkennungsstelle ausgelegt ist, wobei diese, eine Rekombinase codierende DNA-Sequenz vorteilhafterweise zwischen den Regionen LTR5' und LTR3' des Vektors liegt. Die Erfindung betrifft auch einen retroviralen Vektor oder ein rekombinantes Retrovirus, die die vorstehend beschriebene Sequenz umfassen. Vorzugsweise enthält der retrovirale Vektor, der sich in Form eines rekombinanten Retrovirus präsentieren kann, nur eine einzige Erkennungssequenz, die in die Region eingebaut ist, die auf eine Zielzelle übertragen werden kann.
Die erfindungsgemäße DNA erlaubt demnach die Insertion mittels eines retroviralen Vektors von interessierenden Nucleotidsequenzen in Wirtszellen, beispielsweise vom eukaryotischen Typ, ohne dass provirale Sequenzen inseriert werden, die nach Integration der interessierenden Sequenzen in das Provirus nicht mehr notwendig sind.
Der Begriff "interessierende Nucleotidsequenz" der vorstehend verwendet wird, bezieht sich auf Sequenzen zur Insertion in das Genom von Wirtszellen, um es somit diesen zu ermöglichen, interessierende Moleküle zu produzieren, insbesondere in der Therapie oder zur Impfung. Diese interessierenden Sequenzen umfassen unter anderem Gene, DNA- oder RNA-Sequenzen, die entweder Proteine (Hormone, Immunglobuline, Enzyme oder andere) codieren, wenn die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren in der Gentherapie eingesetzt werden, oder menschliche oder nicht menschliche Proteine (wie virale Proteine) codieren, wenn es sich um die Verwendung der retroviralen erfindungsgemäßen Vektoren im Rahmen von Impfvorschriften handelt. Die interessierenden Nucleotidsequenzen können einerseits auch teilweise aus zu der Wirtszelle homologen oder heterologen Regulationselementen (d.h. Promotor, Aktivator) und andererseits aus Sequenzen, die alles oder einen Teil von einem oder von mehreren Genen codieren, oder komplementärer DNA bestehen. Ferner können die interessierenden Nucleotidsequenzen auch eine Antisense-RNA oder eine Ribozym-Sequenz codieren.
Die Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Retroelementsequenz sind mannigfaltig. Die erfindungsgemäße Sequenz wird entweder einfach zur Insertion von Nucleotidsequenzen in Wirtszellen, wie eukaryotische Zellen, in einer Umgebung, die eine bessere Expression dieses Gens begünstigt, oder in der Gentherapie oder bei der Impfung verwendet. Als Beispiel kann die interessierende Sequenz, die in Nature Medicine, Bd. Nr. 7, Juli 1995, die dem Insert in den Plasmiden pMEPV_H/pMEPV_L oder pMEPV_H/pREPV_H entspricht, verwendet werden, und das Expressionsprodukt in vivo kann ein Element einer therapeutischen Zusammensetzung sein.
Der erfindungsgemäße retrovirale Vektor wird durch Transfektion einer viralen transkomplementierenden Zelllinie mit einer erfindungsgemäßen Retroelementsequenz erhalten, die vorzugsweise in Plasmidform vorliegt und vorzugsweise in einem ihrer LTR und insbesondere in dem rechten LTR eine interessierende Nucleotidsequenz sowie eine Erkennungssequenz einschließt. Das Plasmid kann auch eine Nucleotidsequenz enthalten, die eine Rekombinase codiert, die dazu ausgelegt ist, die Erkennungsstelle zu erkennen, die stromaufwärts oder stromabwärts von der interessierenden Sequenz liegt, wobei diese Nucleotidsequenz vorteilhafterweise zwischen der LTR3'- und LTR5'-Region liegt. Nach Durchführung der Transfektion der viralen Zelllinie wird ein retroviraler Vektor erhalten, der zur Infektion einer Wirtszelle, in die die Integration der interessierenden Nucleotidsequenz gewünscht ist, verwendet werden kann.
Das vorstehend definierte Plasmid sowie das Transfektionsverfahren der Zelllinie durch das Plasmid liegen ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode oder ein Verfahren zum Einbringen von interessierenden Nucleotidsequenzen in eine Wirtszelle, wie eine eukaryotische Zelle. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass es einen Schritt der Infektion einer eukaryotischen Zelle durch einen retroviralen Vektor umfasst, der die erfindungsgemäße retrovirale Sequenz enthält, die die Nucleotidsequenz einschließt, zum Einbringen in die eukaryotische Zelle unter Bedingungen, die die Integration in das Zellgenom der Zelle eines einzigen LTRs des retroviralen Vektors gestatten, der die Sequenz enthält, die in das Genom der Wirtszelle einzubringen ist, und einen zweiten Schritt der Expression der interessierenden Sequenz sowie des Produkts ausgehend von der rekombinierten Zelle.
Die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren können in der Gentherapie eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle mit einer in ihr Genom integrierten proviralen Struktur, umfassend eine einzige LTR-Region eines retroviralen Vektors, der die erfindungsgemäße retrovirale Sequenz enthält, wobei diese LTR-Sequenz eine einzige Kopie einer interessierenden Nucleotidsequenz einschließt. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Wirtszelle eine eukaryotische Zelle, und die provirale Struktur ist dadurch gekennzeichnet, dass sie im Wesentlichen frei ist von einer PBS-Sequenz, von einem Enkapsidierungssignal und von einem Dimerisierungssignal und/oder von einer PPT.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Retroelementsequenz oder des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors zur Herstellung einer Zusammensetzung, die die Produktion in den Wirtszellen von Proteinen ermöglicht, die von einer interessierenden Nucleotidsequenz, die in dieser retroviralen DNA eingeschlossen ist, codiert werden. Die Erfindung betrifft außerdem das Polynucleotid oder den retroviralen erfindungsgemäßen Vektor zur Verwendung bei der medizinischen Behandlung eines Patienten, die auf die Integration einer interessierenden Nucleotidsequenz in das Genom von Zielzellen ausgerichtet ist.
Insbesondere gestattet die erfindungsgemäße Sequenz auch die Übertragung von Nucleotidsequenzen, die Antikörper codieren, in Wirtszellen. Man spricht hier auch über die extrazelluläre Immunisierung, da die ausgehend von diesen Sequenzen erzeugten Antikörper ihre Wirkung im Inneren der Zellen, in die sie integriert werden, hervorrufen. Unter den Nucleotidsequenzen, die Antikörper codieren, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen retroviralen Sequenz und des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors in Wirtszellen integriert werden können, können als nicht einschränkendes Beispiel die Antikörper genannt werden, die Hüllproteine des HIV-Virus erkennen, insbesondere die gp.120-Proteine des HIV-1-Virus und des HIV-2-Virus, sowie Antikörper, durch die sich die inverse Transcriptase blockieren lässt. Solche Antikörper sind unter anderem in der Veröffentlichung von Maciejewski et al. (Nature Medicine, Bd. Nr. 7, Juli 1995) beschrieben. Da der erfindungsgemäße retrovirale Vektor eine wirksamere Integration dieser interessierenden Nucleotidsequenzen gestattet, ist die therapeutische Wirksamkeit dieses Weges umso mehr verbessert.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode oder ein Verfahren zur Expression eines Moleküls, das durch eine interessierende Nucleotidsequenz codiert wird, in einer Wirtszelle in Kultur. Das Verfahren umfasst:

– Infizierung der Wirtszelle durch einen erfindungsgemäßen retroviralen Vektor, der die interessierende Nucleotidsequenz umfasst;
– Wachstum der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der interessierenden Nucleotidsequenz erlauben; und
– Gewinnung des gewünschten Moleküls.

Die erfindungsgemäße retrovirale Nucleotidsequenz sowie die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren können auf mehrere Arten verwendet werden, um die gewünschte Integration der interessierenden Nucleotidsequenz zu ermöglichen. In der Tat haben die Erfinder gezeigt, dass es nicht notwendig war, die Expression der Rekombinase direkt mit dem retroviralen Vektor zu kombinieren, obwohl die Integrationsausbeuten höher sind, wenn eine Nucleotidsequenz, die die Rekombinase codiert, ein integraler Teil des Vektors ist.
Ein retroviraler Vektor, der in der LTR3'- oder LTR5'-Region des retroviralen Vektors eine erste Nucleotidsequenz, umfassend eine interessierende Nucleotidsequenz sowie eine Erkennungssequenz, die stromabwärts oder stromaufwärts von der interessierenden Sequenz angeordnet ist, sowie eine zweite Nucleotidsequenz, die zu der ersten Nucleotidsequenz identisch ist, die in die LTR5'-Region des Vektors inseriert ist, umfasst, wird durch Infektion in das Genom einer Wirtszelle eingebracht. Ein Plasmid, das eine Nucleotidsequenz einschließt, die eine Rekombinase codiert, die dazu ausgelegt ist, die Erkennungssequenz zu erkennen, wird ebenfalls durch Transfektion in die Zelle eingebracht. Die Expression der Rekombinase durch Transfektion wandelt die Struktur eines Provirus mit zwei LTRs in einen Provirus mit einem einzigen LTR um. Bei diesem Typ von Reaktion enthalten etwa 50 % der stabilen Transformanten das modifizierte Provirus. Dieses Teilergebnis kann durch die vorübergehende Expression nach der Transfektion des Plasmids erklärt werden, das die Nucleotidsequenz umfasst, die die Rekombinase codiert, was zu einer Rekombination ohne Integration führt.
Eine retrovirale Sequenz wird verwendet, umfassend eine Nucleotidsequenz, umfassend eine interessierende Sequenz sowie eine Erkennungssequenz, die stromabwärts oder stromaufwärts von dieser interessierenden Sequenz angeordnet ist. Die vollständige Sequenz wird in die LTR3'-Region eines Retrovirus inseriert. Der so erhaltene retrovirale Vektor wird anschließend zur Infektion einer Zelllinie verwendet, die konstitutiv oder durch Induktion eine Rekombinase exprimiert, die dazu ausgelegt ist, die Erkennungssequenz zu erkennen. Die Wirksamkeit eines solchen Systems wird besonders erhöht, wenn das Gen, das die Rekombinase codiert, bereits zu Beginn der retroviralen Infektion exprimiert wird.
Ein retroviraler Vektor umfasst eine Nucleotidsequenz, die in seine LTR3'-Region inseriert ist. Diese Nucleotidsequenz umfasst eine interessierende Sequenz sowie eine Erkennungssequenz, die von einer Rekombinase erkannt werden kann. Die Erkennungssequenz liegt stromabwärts oder stromaufwärts von der interessierenden Sequenz. Ferner sind in den retroviralen Vektor zwischen den beiden LTRs dieses Vektors ein Gen, das eine Rekombinase codiert, sowie ein Promotor inseriert. Anschließend wird durch dieses Retrovirus eine Zelllinie infiziert. Ein solcher retroviraler Vektor erzeugt nur Proviren mit einem einzigen LTR. Die Wirksamkeit dieses Systems ist erhöht, da alle integrierten und analysierten Ereignisse diese Struktur aufweisen. Der wesentliche Vorteil eines solchen retroviralen Vektors besteht darin, dass er Rekombinationsereignisse, die zwischen den beiden LTR erfolgreich waren, mit der Deletion des Gens kombiniert, das die Rekombinase codiert. Folglich exprimieren die infizierten Zellen die Rekombinase nur vorübergehend.
Die Erfinder haben das Rekombinasesystem Crelox verwendet, das für die Stelle des Bakteriophagen P1 spezifisch ist. Die Erkennungsstelle LoxP wurde in den LTR3' stromaufwärts von der interessierenden Nucleotidsequenz in einen Vektor vom Typ ΔEnh inseriert und das Gen, das die Rekombinase cre codiert, zwischen die beiden LTR. In der Produktionszelllinie wird das Protein Cre ausgehend von der proviralen Plasmidkonstruktion exprimiert. Da jedoch das Plasmid nur ein einziges Ziel loxP enthält, wird es nicht mit dem Cre-Protein rekombiniert. Nach der Infektion wird die loxP-Stelle der LTR3' in LTR5' dupliziert. Somit rekombiniert Cre die beiden direkt wiederholten loxP-Stellen, was sich in der Deletion von sämtlichen Sequenzen, die zwischen den beiden loxP eingeschlossen sind, einschließlich PBW, Enkapsidierungssignal und Dimerisierungssignal und PPT, auswirkt. In dem zellulären Genom bleibt nur ein einziges LTR integriert, das das Reportergen enthält. Das cre-Gen geht ebenfalls während der Rekombination verloren.
Die interessierende Nucleotidsequenz, die im Allgemeinen eine für das Retrovirus fremde Sequenz ist, wird vorteilhafterweise in die U3-Region von LTR3' der retroviralen Sequenz eingebracht. In der Tat ist die Möglichkeit des Einbringens von Sequenzen, sogar von kompletten Transcriptionseinheiten, in die U3-Region von LTR3' sehr gut dokumentiert. Dennoch kann der Einbau von interessierenden Sequenzen anderswo als in der U3-Region von LTR3' des retroviralen Vektors in Erwägung gezogen werden. Beispiele umfassen die U5-Region von LTR5'. Obwohl es vorzuziehen ist, dass die Erkennungsstelle unmittelbar stromabwärts oder stromaufwärts von der interessierenden Nucleotidsequenz liegt, kann diese Sequenz ferner auch in einem nennenswerten Abstand, der zwischen 32 nt und 4,5 kb schwanken kann, positioniert werden, ohne die letztendliche Integration der interessierenden Sequenz in die Zielzelle zu beeinflussen.
Die Menge an genetischen Fremdprodukten, die in die U3-Region der viralen DNA eingebracht wird, kann erhöht werden und in bestimmten Fällen über 4kbp erhöht werden. Diese Sequenzen können sogar einer vollständigen Transcriptionseinheit mit einem unabhängigen Promotor entsprechen, was die Vielseitigkeit dieser Vektoren zeigt.
Die Möglichkeit des Einbringens von beträchtlichen Mengen von genetischen Fremdprodukten in den 3'-LTR des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors macht diesen retroviralen Vektor zu einem System der Wahl zur Insertion von Gensequenzen in Zellen insbesondere in eurkaryotische Zellen. Somit können mehrere Typen von eukaryotischen Zellen transformiert werden. Unter den eukaryotischen Zellen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, nennen wir insbesondere die folgenden Zelltypen: NIH 3T3, BRL, HM1, D, PLL4, LT.
Die Insertion einer Nucleotidsequenz, die einen Marker codiert, ist in der LTR3'-Region des retroviralen Vektors vorgesehen. Durch die Gegenwart dieses Markers lässt sich die Insertion des neuen Produkts verifizieren.
Als nicht einschränkende Beispiele können die folgenden Marker verwendet werden: LacZ, GFP (grün fluoreszierendes Protein), CD9, PAL (alkalische Phosphatase) und HRP (Merrettichperoxidase).
Obwohl das Crelox-Rekombinasesystem für den erfindungsgemäßen retroviralen Vektor ein System der Wahl darstellt, können auch andere Rekombinasesysteme verwendet werden. Als nicht einschränkende Beispiele sind die folgenden Rekombinationssysteme verwendbar: Das Hefesystem FLP ("Flip" genannt) und das bakterielle R-System.
Die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren stellen demnach ein wirksames Mittel zur Übertragung von DNA in Wirtszellen bereit. Die provirale Integration ist exakt und ruft keine chromosomale Umlagerung hervor. Das Konzept der Duplikat-Vektoren geht von dem Prinzip aus, dass die Transposition des Gens in den LTR5', außerhalb der retroviralen transcriptionellen Einheit, seine Expression verbessert.
Obwohl die Gegenwart des Enkapsidierungssignals die Erzeugung eines replikationskompetenten Virus durch Rekombination zwischen den endogenen Sequenzen des Retrovirus und des Provirus möglich macht, die Gegenwart von PPT und anderen Elementen in cis die Transposition möglich macht und die Gegenwart von PBS-Sequenzen negative Auswirkungen auf die Expression des Transgens haben kann, sind alle diese Ereignisse sehr unwahrscheinlich, wenn ein erfindungsgemäßer retroviraler Vektor verwendet wird, da alle diese viralen Sequenzen deletiert sind.
Das System der sLTR ist ein neues Konzept bei der Konstruktion von Retroelementen im Allgemeinen. Es gibt zahlreiche Retroviren, deren Wirtsspektrum des Partikels von Interesse ist, für die allerdings die Konzeption der Vektoren die Gegenwart von bestimmten cis- oder transaktiven-Sequenzen notwendig macht, die von denjenigen verschieden sind, die zuvor zitiert worden sind, die eine korrekte Zusammenfügung des Virions erlauben und ihm die Infektiosität gestatten, wie beispielsweise die menschlichen Viren HIV, HTLV oder das Ziegenvirus CAEV. Sobald sie integriert sind, werden die regulatorischen cis- oder trans-Elemente für das translatierte Gen unbrauchbar, allerdings haben sie für die Zelle pathogene Wirkungen und steigern die Wahrscheinlichkeiten des Wiederauftauchens eines Wildtypvirus signifikant. Die Notwendigkeit dieser Art von Sequenzen für diesen Typ von Retrovirus macht sie praktisch für eine Verwendung als Vektoren ungeeignet.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen sLTR-Systems für diese Retroviren ermöglicht es eine Verwendung als Vektoren zur Übertragung von Genen mit erhöhter Sicherheit und transcriptioneller Zuverlässigkeit in Erwägung zu ziehen.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden nicht einschränkenden Beispiele und unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren ausführlich beschrieben:
1a stellt die Struktur des Plasmids pMloxPL dar;
1b stellt die Struktur des Provirus MloxPL dar, der aus der Infektion des Retrovirus MloxPL hervorgeht;
1c stellt einen Provirus nach induzierter Rekombination durch cre unter Verwendung der beiden loxP-Stellen im Inneren der LTR dar;
1d stellt eine "Southern Blot"-Analyse der zellulären DNA dar, die aus mit MloxPL infizierten NIH3T3-Fibroblasten stammt;
1e stellt eine "Southern Blot"-Analyse der zellulären DNA dar, die aus dem Klon NIH3T3 MloxPL.1 stammt, der mit dem Plasmid pMC1-Cre transfiziert wurde;
2a stellt die Struktur und die molekulare Analyse des Provirus MloxPL dar, der aus der Infektion des Retrovirus MloxPL und der durch Cre induzierten Rekombination unter Verwendung der beiden loxP-Stellen im Inneren der LTR hervorgeht;
2b stellt die Ergebnisse einer "Southern Blot"-Analyse der zellulären DNA dar, die aus NIH3T3 Cre.1-Fibroblasten stammt, die mit MloxPL infiziert wurden, mit Verdau durch die Restriktionsendonuclease BclI;
2c stellt die Ergebnisse einer "Southern Blot"-Analyse der zellulären DNA dar, die aus NIH3T3 Cre.1-Fibroblasten stammt, die mit MloxPL infiziert wurden, mit Verdau durch die ECORV-Endonucleasen dar;
3a stellt die Struktur des Plasmids pMCreloxPL dar;
3b stellt ein Diagramm von 3'-sLTR von einigen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors dar;
3c stellt die Ergebnisse einer "Southern Blot"-Analyse der zellulären DNA dar, die aus NIH3T3-Fibroblasten stammt, die durch MCreloxPL infiziert wurden, durch Abbau durch die Restriktionsendonuclease BclI;
3d stellt die Ergebnisse einer "Southern Blot"-Analyse der zellulären DNA dar, die aus NIH3T3-Fibroblasten stammt, die mit MCreloxPL infiziert wurden, durch Verdau durch die Restriktionsendonuclease EcoRV;
3e stellt die Ergebnisse einer "Southern Blot"-Analyse der zellulären DNA dar, die aus NIH3T3-Fibroblasten stammt, die mit MCreloxPL infiziert wurden, durch Verdau durch die Restriktionsendonuclease KpnI;
4 stellt ein Ablaufschema der Erzeugung von sTLR mit dem retroviralen Vektor MCreloxPL dar.
BEISPIELE
Nomenklatur
Die Nomenklatur der verschiedenen Vektoren und der verschiedenen Zellen wurde folgendermaßen entwickelt: p bezeichnet den Plasmid-Vektor (beispielsweise pMloxPL); die Bezeichnungen mit ψ2 (hinterlegt am 10.03.1993 bei der ECAC unter der Nummer 93031002) bezeichnen die Zelllinie des Wildtyp-Hilfsvirus ψ2, der mit diesem Vektor transfiziert wurde (beispielsweise ψ2-MloxPL); die Bezeichnungen ohne p bezeichnen die Viren, die von den Zellen des Wildtyp-Hilfsvirus (beispielsweise MloxPL) produziert werden; die Bezeichnung einer Zelllinie gefolgt von der Bezeichnung des Virus gibt an, dass die Zelllinie ein Provirus enthält, welches das Ergebnis einer Infektion ist (beispielsweise NIH3T3MloxPL).
Kultur und Selektion der Zellen
Auf die etablierten Zelllinien NIH3T3 (Mausfibroblasten) und ψ2 (Enkapsidierungszelllinie des ecotropen Retrovirus der Maus) wird in (7) und (13) Bezug genommen. Sie werden in DMEM (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium) mit einem erhöhten Gehalt an Glucose (4,5 g/l), angereichert mit fötalem Kälberserum bis auf 5 %, kultiviert. Die Zellen werden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 12 % CO₂ enthält, inkubiert. G418 wird dem entsprechenden Medium in einer Konzentration von 600 mg/ml zugefügt. Die Klonierung der Kolonien, die gegenüber G418 resistent sind, wurde durch Pipettieren von einzelnen Kolonien und Isolierung in einer anderen Zellkulturschale durchgeführt. Die Klonierung der infizierten Zellen wird durch limitierende Verdünnung 48 h nach der Infektion durchgeführt.
Transfektion, Infektion, Färbung der Zellen und Analyse der Nucleinsäuren durch "Southern Blot"
Calciumphosphat-Präzipitationen wurden wie in (12) beschrieben durchgeführt. Der Überstand, der das Virus enthält, wurde zur Infizierung der NIH3T3-Zellen in Gegenwart von 5 μg/ml Polybren verwendet, wie zuvor in (37) beschrieben. Hybridisierungen durch "Southern Blot" wurden durch das Verfahren gemäß Referenz (6) durchgeführt. Die β-Galactosidaseaktivität wurde durch X-gal-Färbung, wie zuvor in (38) beschrieben, durchgeführt.
Nachweis von LacZ durch PCR
Die PCR wurde mit 1 μg genomischer zellulärer DNA in einer Reaktion von 40 μl (Tris-HCl 50 mM (pH 9), 150 μg/ml Rinderserumalbumin, (NH₄)₂SO₄ 16 mM, MgCl₂ 7 mM, 250 μM für jedes dNTP, 1,25 U Taq DNApol (USB), 0,078 U Vent(exo+) DNApol (N.E. Biolabs)) durchgeführt. Primer wurden in einer Endkonzentration von 0,25 μM (für 20-Mere) hinzugefügt. Die PCR-Reaktion wurde vor Beginn 5 min auf 80 °C erwärmt. 35 Zyklen (94 °C, 55 min; 59 °C, 30 s; 70 °C, 3 min 30 s) mit den folgenden Primern:
5'-GCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAAT-3' und
5'-GACACCAGACCAATGGTAATGGTAGCGAC-3' für den Nachweis von LacZ und
5'-GGACTGGGTGGCTTCCAACTCCCAGACAC-3' und
5'-AGCTTCTCATTGCTGCGCGCCAGGTTCAGG-3' für den Nachweis von endogenem Maus-RAP-SYN als interne Kontrolle. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden durch Gelelektrophorese analysiert.
Beispiel 1 – Konstruktion des retroviralen Vektors (pMloxPL und Transfektion von Zelllinien
a) Konstruktion des Vektors pMloxPL
pMloxPL resultiert aus dem Plasmid pG-MPL (beschrieben bei Choulika et al., 1995), in den die loxP-Erkennungsstelle innerhalb der NcoI-Stelle in einem Bindungsadapter (5'-CATGCATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATC-3' und 5'-CATGGATAACTTCGTATAATGTATGCTTATCGAAGTTATATG-3') an Stelle der I-Sce I-Stelle inseriert ist. Die Sequenz der loxP-Stelle wurde durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Das verwendete Retrovirus ist in 1a erläutert. pMloxPL wird ausgehend von einem defektiven Moloney Murine Leukämie-Provirus (dem die Gene gag, pol und env fehlen) durch Insertion der Sequenz, die PhleoLacZ codiert, in die U3-Region des rechten LTR anstelle von entfernten Aktivierungssequenzen konstruiert. 5' aus dem Gen PhleoLacZ wurde zwischen der Akzeptorschnittstelle des Gens env von MoMuLV und einer langen loxP-Stelle von 32bp aus dem Bakteriophagen P1 angeordnet. In den infizierten Zellen weist dieser Typ von Virus den LTR auf, der das Gen enthält, das durch einen flankierenden zellulären Promotor aktiviert wird durch Anlagerung an diesen Promotor.
b) Transfektion von Zelllinien mit dem Plasmid pMloxPL
Die Zelllinien, die das Virus produzieren, wurden hergestellt durch Transfektion des Plasmids pMloxPL mit dem Selektionsplasmid pUSVneo in die Zelllinie des Wildtyp-Hilfsvirus ψ2, die das ecotrope Wildtyp-Hilfsvirus, das defektiv für die Enkapsidation ist, exprimiert. Nach Selektion auf G418 (Neomycin) wurden die einzelnen aufgrund ihrer β-Galactosidaseaktivität selektierten Klone getestet, um das Virus zu titrieren. Die Titration wurde unter Klonierung von NIH3T3-Zellen unmittelbar nach Infektion durch limitierende Verdünnung und durch Nachweis der Gegenwart des Provirus, das lacZ enthält, durch PCR durchgeführt. Für die Produktions-Zelllinien ψ2-MloxPL.1 und ψ2-MloxPL.2 wurde ein Titer in der Zelllinie NIH3T3 von 2,5 × 10⁴ bzw. 5 × 10⁴ (Tabelle 1) gezeigt. Die Titration der blaue Kolonie-bildenden Einheiten pro ml (BCFU/ml) des viralen Überstands von ψ2-MloxPL.1 und ψ2-MloxPL.2 beträgt 3 bzw. 6, was einem ungefähren Verhältnis von 1 blauen Kolonie auf 10⁴ Integrationen entspricht. Wie wir bereits zuvor beschrieben haben, funktionieren diese Proviren als Promotorfänger, und ausschließlich 1 von 10⁴ Integrationen exprimiert das Reportergen in der Fibroblastenzelllinie NIH3T3.
Die Strukturen der integrierten MloxPL-Proviren-DNA sind in 1B schematisch dargestellt. In den Figuren des vorliegenden Texts sind die Positionen der LTR und der BclI-Schnittstellen und die Größen der Fragmente angegeben (x gibt das Bdl-Fragment zufälliger Größe des linken Arms an, und y gibt das BclI-Fragment zufälliger Größe des rechten Arms an. P gibt eine mit 32p radiomarkierte LacZ- Sonde an. Diese Strukturen werden anschließend durch "Southern Blot"-Hybridisierung in 6 unabhängigen NIH3T3-Klonen analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 1d dargestellt. Sämtliche Klone enthalten ein Provirus, in dem die Sequenzen innerhalb der U3-Region des 3'-LTR in den 5'-LTR dupliziert wurden; der Verdau durch BclI-Endonuclease erzeugt das von Seiten der Proviren erwartete Fragment mit 2 LTR, die PhleoLacZ enthält (das Restriktionsenzym BclI weist eine Erkennungsstelle in jeder LacZ-Sequenz in den LTR auf). Die "Southern Blot"-Hybridisierung, die LacZ als Sonde verwendet, zeigt ein Spaltungsfragment von 6 kbp, das eine zuverlässige Duplikation der U3-Region zeigt. Die beiden zusätzlichen Banden von variabler Größe stellen Fragmente dar, die sich von den BclI-Stellen in dem Provirus bis zur flankierenden zellulären DNA erstrecken. Die beiden zusätzlichen Banden zeigen, dass pro Klon eine provirale Integration erfolgt ist, und ihre variable Größe bestätigt, dass jede Zelllinie ein unabhängiger Klon war.
Beispiel 2: Cotransfektion von Zelllinien mit den Plasmiden pMloxPL und pMCI-Cre
Wir haben untersucht, ob die loxP-Duplikation mittels der LTR mit der Cre-Rekombinase rekombiniert werden kann. Wir haben die klonale Zelllinie NIH3T3MloxPL.1 zur Erreichung eine Rekombination mit dem Cre-Protein verwendet. In diese Zelllinie haben wir den Expressionsvektor pMC1-Cre mit dem Selektionsvektor pUSVneo cotransfiziert. Die Struktur des Provirus nach der durch Cre induzierten Rekombination ist in 1c gezeigt.
Die DNA von 24 Neomycin-resistenten Klonen wurde durch "Southern Blot"-Hybridisierung analysiert. Der Nachweis von rekombinanten Proviren wurde durch Analyse der Verdaus mit Bcl I durchgeführt. Die verdaute DNA der Klone wurde mit einem 32p radioaktiv markierten LacZ getestet. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 1e gezeigt. Die parentale Struktur des Provirus zeigt eine Bande von 6 kbp, entsprechend der zuverlässigen Duplikation der U3-Sequenz, die LacZ enthält, und 2 zusätzliche Banden von 8 und 2 kbp (vorstehend beschrieben (1b und d)). Die DNA-Analyse der Neomycin-resistenten Klone zeigt 5 von 24 Klone, in denen die Bande von 6,0 kbp beseitigt wurde (1e). Die Banden von 8 und 2 kbp, entsprechend der zellulären DNA, die das Provirus flankiert, waren immer noch vorhanden, was somit zeigt, dass die provirale Integrationsstelle nicht umgelagert wurde. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Expression des Gens cre in einer Zelle, die das Provirus MloxPL enthält, zu einer häufigen Rekombination von 2 loxP-Stellen, die in den LTR enthalten sind, führen kann.
Um die Wirksamkeit der Rekombination mittels Crelox zu überprüfen, haben wir auch die DNA von 25 G418-resistenten Klonen durch "Southern blot"-Hybridisierung überprüft, um die Gegenwart der cre-Sequenz zu überprüfen. Die DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease Xho I verdaut und mit einer 32p radioaktiv markierten Volllängen cre-DNA getestet. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 1e gezeigt. Drei der fünf in loxP rekombinierten Klone zeigen eine Bande, die mit der cre-Sonde von 1,9 kbp hybridisiert, was nahe legt, dass die komplette cre-Expressionseinheit von pMC1-Cre zugegen ist. Einer von fünf in loxP rekombinierten Klonen zeigt keine Bande, die mit der Cre-Sonde hybridisiert. Ein an loxP rekombinierter Klon zeigt eine Bande von 5 kbp, die aus einer Umlagerung des Plasmids pMC1-Cre resultiert. Vier weitere Klone zeigen eine Bande von 1,9 kbp, die mit cre hybridisieren und keine Rekombination in den integrierten Provirus MloxPL zeigen. Wir haben kein Vorliegen von cre-DNA in den 16 restlichen Klonen nachgewiesen. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Wirksamkeit der durch die Gegenwart des Plasmids pMC1-Cre ausgelösten Rekombination in den stabil transfizierten Zelllinien nicht absolut ist, oder nur 50 % der loxP-Stellen rekombiniert sind. Dieses Ergebnis legt auch nahe, dass die Rekombination zwischen den beiden loxP-Stellen durch vorübergehende Expression von pMC1-Cre (Tabelle 2) erhalten werden kann.
Beispiel 3 – Infektion der Zellen, die das Cre-Enzym exprimieren, mit MloxPL
Wir haben eine NIH3T3 Zelllinie, die das Plasmid pMC1-Cre enthält, durch Kotransfektion der Plasmide pMC1-Cre und pUSVneo erzeugt. Klone wurden in einem Medium, das G418 enthält, selektiert, und ihre DNA wurde nach Verdau mit der Restriktionsendonuclease Xho I durch "Southern Blot"-Hybridisierung analysiert. Die Gegenwart des Cre-Gens wurde durch Hybridisierung mit einer mit 32p radioaktiv markierten Volllängen cre-DNA-Sonde nachgewiesen. Zehn der zwölf G418-resistenten analysierten Klone haben die Gegenwart der Cre-Sequenz bei variabler Kopienzahl (von ungefähr 1 bis 10 Kopien) gezeigt (Daten nicht gezeigt).
Wir haben den Klon NIH3T3Cre.1, der ungefähr 10 Kopien des Plasmids pMC1-Cre enthält, zur weiteren Analyse gewählt. Wir haben den Klon NIH3T3Cre.1 mit dem MloxPL-Virus infiziert. Die Klone wurden durch Grenzverdünnung isoliert.
Die Struktur des Provirus, der aus der Infektion des Retrovirus MloxPL und der durch Cre ausgelösten Rekombination hervorgeht, ist in 2a erläutert. Die Struktur des integrierten Vektors ist ein solitäres LTR (sLTR). Es fehlen ein LTR und sämtliche Sequenzen, die zwischen den beiden LTR in den integrierten Proviren liegen (2a + c).
Die DNA-Struktur der Proviren MloxPL wurde durch "Southern blot"-Hybridisierung nach Verdau ihrer zellulären DNA mit der Restriktionsendonuclease Bcl I analysiert, um die Gegenwart oder die Abwesenheit von LTR-Duplikaten in der proviralen Struktur nachzuweisen. Wie in 2b dargestellt, zeigt die Analyse der 12 Klone, die aus der Infektion von NIH3T3Cre.1 durch MloxPL herrühren, die Abwesenheit der 6 kbp-Bande, die ein Indikator für die Duplikation ist, in sämtlichen Klonen.
Um die Abwesenheit des 5'LTR in dem Provirus zu zeigen, wurde eine DNA-Restriktion mit EcoR V durchgeführt. Die "Southern blot"-Hybridisierung der DNA von NIH3T3Cre.1.MloxPL, verdaut mit der EcoR V-Endonuclease unter Verwendung einer radioaktiv markierten LacZ-Sonde (2a + c), zeigt die Gegenwart einer 2,1 kbp-Bande und einer Bande von zufälliger Größe. Die Abwesenheit einer 3,9-kbp-Bande zeigt die Abwesenheit eines 5'LTR.
Beispiel 4 – Konstruktion des retroviralen Vektors pMcreloxPL und Transfektion von Zelllinien
a) Konstruktion des Plasmids pMcreloxPL
Die Struktur des in dem vorliegenden Beispiel verwendeten Retrovirus ist in 3a dargestellt. pMCreloxPL rührt von der Insertion des 1,3 kbp cre-Gens her, das mit einer nukleären Lokalisation des großen T-Antigens des Simian Virus 40 zwischen den beiden LTR des Plasmids pMloxPL fusioniert ist. Das cre-Gen steht unter der transkriptionalen Kontrolle des Promotors des Thymidinkinase (tk)-Gens des Herpex Simplex Virus, der von einer Duplikation des entfernten Aktivators der Polyoma-Virus-Mutante PYF441 flankiert ist, mit Bindungsadaptoren in der PstI-Stelle von pMloxPL. Die Cre-Sequenz befindet sich in der gleichen Orientierung wie das virale Genom. Das Plasmid pMcreloxPL wurde bei der CNCM am 13. Juni 1995 mit der Nr. 1-1599 hinterlegt.
b) Transfektion der Zelllinien mit dem Plasmid pMcreloxPL
Zelllinien, die das Virus produzieren, wurden durch Kotransfektion des Plasmids pMCreloxPL mit dem Selektionsplasmid pUSVneo in die Enkapsidierungszelllinie ψ2 erzeugt. Nach Selektion der transfizierten ψ2-Zellen in einem Medium, das G418 enthält, wurden einzelne Klone für die Herstellung eines Retrovirus, welches LacZ exprimiert, selektiert. Ein Klon hat ein infektiöses Virus produziert. Dieser Klon wurde ψ2-MCreloxPL.1 genannt. In ψ2-MCreloxPL.1 wurde das Plasmid pMCreloxPL in einer einzigen Kopie in das Wirtszellengenom integriert (Daten nicht gezeigt). Die Herstellungszelllinien ψ2-MCreloxPL.1, produzieren 1 × 10⁴ infektiöse Viren pro Milliliter. Die Gegenwart des LacZ-Gens wird durch PCR nachgewiesen (Tabelle 1). Die Titration der blaue Kolonien bildenden Einheiten pro Milliliter (BCFU/ml) des viralen Überstandes von ψ2-MCreloxPL.1 beträgt 3 BCFU/ml, was, wie vorhergesehen, einer ungefähren Verminderung von 10⁴ im Vergleich zu der Titration durch PCR entspricht. Die Produktion von ψ2-MCreloxPL wies eine im Vergleich zu der Produktion von ψ2-MloxPL geringe Effizienz auf, da nach mehreren Kotransfektionsexperimenten nur ein einziger produktiver Klon gewonnen wurde. Dieser Klon hatte eine einzige Kopie der plasmidischen viralen Konstruktion integriert. Wir haben daraus abgeleitet, dass die Zellen, die mehr als eine Kopie des Plasmids integrieren, auf Grund der Gegenwart der Rekombinase-Aktivität, die die integrierten Transgene modifiziert, nicht gewonnen werden können.
c) Provirale Struktur von MCreloxPL
Die Isolierung von mit MCreloxPL infizierten NIH3T3-Zellen wurde durch Grenzverdünnung nach Infektion mit einer Multiplizität von 0,5 viraler Partikel pro Zelle durchgeführt. Die Struktur des aus der Infektion mit dem Retrovirus pMCreloxPL hervorgehenden Provirus ist in 3b gezeigt. In dieser Figur gibt a das Fragment von zufälliger Größe des linken Arms an.
Die DNA-Struktur der integrierten Proviren wurde durch "Southern blot"-Hybridisierung in sechs unabhängigen NIH3T3MCreloxPL Klonen analysiert. Die "Southern blot"-Analyse der proviralen DNA, die mit der Endonuclease Bcl I verdaut und mit einer radioaktiv markierten LacZ-Sonde nachgewiesen wurde, hat zwei Fragmente von variabler Größe erzeugt, und diese Klone haben keine zusätzliche Bande von 7,5 kbp ergeben (3c). Die Abwesenheit dieses zusätzlichen Fragments von 7,5 kbp zeigt die Gegenwart eines einzigen LTR, die PhleoLacZ enthält. Um ferner festzustellen, dass die provirale Struktur einem einzigen LTR entspricht, wurde eine zusätzliche Analyse durchgeführt. Um die Abwesenheit eines 5'LTR in dem Provirus definitiv zu beweisen, wurde ein Verdau der zellulären DNA mit EcoR V durchgeführt. Die "Southern blot"-Hybridisierung der mit EcoR V verdauten DNA von NIH3T3MCreloxPL unter Verwendung einer radioaktiv markierten LacZ-Sonde (3d) zeigt die Gegenwart einer Bande von 2,1 kbp und einer Bande einer zufälligen Größe. Die Abwesenheit einer Bande von 6 kbp zeigt die Abwesenheit eines 5'LTR. Dieser "blot" wurde nun mit einer radioaktiv markierten cre-Sonde hybridisiert. Die Abwesenheit einer Bande in der DNA von NIH3T3MCreloxPL zeigt, dass der proviralen DNA das cre-Gen fehlt (3d). Um festzustellen, dass die Struktur des restlichen LTR nicht umgelagert war, wurde schließlich die DNA von NIH3T3MCreloxPL mit der Kpn I Endonuclease verdaut und mit einer radioaktiv markierten LacZ-DNA-Sonde hybridisiert. In sämtlichen Fällen wurde ein 4,3 kbp-Fragment gefunden, was zeigt, dass das PhleoLacZ-LTR von erwarteter Größe war (3e). Folglich enthielten alle isolierten Klone ein integriertes Provirus mit einem einzigen nicht umgelagerten LTR. TABELLE 1. Titer der Zelllinien ψ2-MloxPL und MCreloxPL^a

^a G418-resistente Klone, die sich von dem mit pMC1-Cre und pUSVneo cotransfizierten Klon NIH3T3MloxPL.1 ableiten.
^b Zeigt die Gegenwart der pMC1-Cre-Sequenz an.
(+) Zeigt die Gegenwart eines richtigen Xho I-Fragments von 1,9 kbp an, das aus pMC1-Cre stammt und mit einer mit ³²P radioaktiv markierten Sonde nachgewiesen wurde.
(*) Zeigt die Gegenwart eines Xho I-Fragments an, das mit der mit ³²P radioaktiv markierten cre-Sonde hybridisiert, aber eine unrichtige Größe hat.
(–) Zeigt die Abwesenheit des pMC1-Cre-Plasmids an.
^c Ergebnisse der loxP-Rekombination mittels Cre, nachgewiesen durch "Southern blot"-Analyse.

^a ψ2-Zellen wurden entweder mit pMloxPL+pUSVneo oder mit pMCreloxPL+pUSVneo transfiziert, G418-resistente Klone wurden in einem Medium selektiert, das G418 enthielt. Virusvorräte wurden durch Inkubieren von 8 ml Medium mit 5 × 10⁶G418-resistenten Zellen von jedem Klon hergestellt, 5 × 10⁴ NIH3T3 Zellen wurden während 8 Stunden verschiedenen Virus-Verdünnungen ausgesetzt und anschließend durch Grenzverdünnung kloniert oder auf ihre β-Galactosidase-Aktivität durch X-Gal-Färbung getestet.
^b Die Titer wurden durch das Verhältnis zwischen den infizierten Klonen, die nach Klonierung isoliert und durch PCR nachgewiesen wurden (IP: infektiöses Partikel), und den nicht infizierten Klonen (PCR+/PCR-)/1 × 10⁵) berechnet.
^c BCFU ist das Acronym für "blue colony forming unit" (blaue Kolonie bildende Einheiten). Die BCFU sind Infektionen, die zu einem "Einfangen" des Gens führen, das das durch X-Gal-Färbung nachgewiesene Gen PhleoLacZ aktiviert.
^d BCFU pro infiziertem Das Verhältnis ist die Anzahl von Klon.

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Claims

Polynucleotid, umfassend a) die Sequenz LTR3' oder LTR5' eines natürlichen oder synthetischen Retroelements; und b) eine Insertionssequenz, umfassend eine interessierende Nucleotidsequenz sowie, für ein gegebenes Rekombinationssystem, eine einzelne Erkennungssequenz einer Rekombinase, wobei die Insertionssequenz, dergestalt in LTR3' oder LTR5' inseriert ist, dass mittels eines retroviralen Vektors die Insertion der interessierenden Sequenz in das Genom einer Wirtszelle ermöglicht wird, ohne dass provirale Sequenzen inseriert werden, die nach der Integration der interessierenden Sequenz in das Genom der Wirtszelle nicht mehr erforderlich sind.
Polynucleotid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertionssequenz in die Region U3 von LTR3', die Region U5 von LTR5' oder in die Region R von LTR eingefügt wird.
Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Retroelement eine retrovirale DNA-Sequenz ist.
Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungssequenz, die durch eine Rekombinase erkannt werden kann, stromaufwärts von der interessierenden Nucleotidsequenz liegt.
Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungssequenz, die durch eine Rekombinase erkannt werden kann, stromabwärts von der interessierenden Nucleotidsequenz liegt.
Polynucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungssequenz die Erkennungsstelle LoxP umfasst.
Polynucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die interessierende Nucleotidsequenz eine Sequenz umfasst, die ein Protein oder eine interessierende RNA codiert, insbesondere eine Antisense-RNA oder eine Ribozymsequenz.
Polynucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die interessierende Nucleotidsequenz zusätzlich Regulationselemente umfasst.
Polynucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nucleotidsequenz umfasst, die eine Rekombinase codiert, die in der Lage ist, die Erkennungssequenz zu erkennen.
Polynucleotid gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die die Rekombinase codierende Nucleotidsequenz zwischen den Regionen LTR5' und LTR3' des Vektors liegt.
Polynucleotid gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die die Rekombinase codierende Nucleotidsequenz das Protein Cre codiert.
Polynucleotid gemäß Anspruch 11, enthalten in dem am 13. Juni 1995 unter der Nr. 1-1599 bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes – National Depository Authority) hinterlegten Plasmid.
Retroviraler Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Polynucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche umfasst.
Retroviraler Vektor gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein defektives Moloney Murine Leukemia Provirus ist, der die Erkennungssequenz in seiner Region U3 von LTR3', U5 von LTR5' oder R umfasst.
Zellulärer Wirt, in dessen Genom eine provirale Struktur integriert ist, die eine einzige LTR-Sequenz eines retroviralen Vektors gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14 umfasst, wobei die LTR-Sequenz eine einzelne Kopie einer interessierenden Nucleotidsequenz umfasst.
Zellulärer Wirt gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryontische Zelle handelt und die provirale Struktur im Wesentlichen frei von PBS-Sequenzen, Enkapsidierungs- und Dimerisierungssignalen und PPT ist.
Verfahren zur Insertion eines Gens in eine Wirtszelle in Kultur, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Infizierung der Wirtszelle durch den retroviralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14 umfasst.
Verfahren zur Expression eines durch eine interessierende Sequenz codierten Moleküls in einer Wirtszelle in Kultur, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: – Infizierung der Wirtszelle durch einen retroviralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14, der die interessierende Nucleotidsequenz umfasst; – Wachstum der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression der interessierenden Nucleotidsequenz erlauben; und – Gewinnung des gewünschten Moleküls.
Verwendung eines Polynucleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, für die Herstellung einer Zusammensetzung, welche die Produktion von Proteinen oder RNAs, die von der interessierenden Nucleotidsequenz codiert werden, durch Wirtszellen erlaubt.
Verwendung eines retroviralen Vektors gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14 für die Herstellung einer Zusammensetzung, welche die Produktion von Proteinen, die von der interessierenden Nucleotidsequenz codiert werden, in Wirtszellen erlaubt.
Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Verwendung in der medizinischen Behandlung eines Patienten.
Retroviraler Vektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14 zur Verwendung in der medizinischen Behandlung eines Patienten.
Arzneimittel, umfassend einen retroviralen Vektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 14 in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.
Arzneimittel bestehend aus Wirtszellen gemäß Anspruch 15 oder 16.