DE69937556T2 - Amphotrope retrovirus-verpackungszelllinie, verfahren zur herstellung und verwendung - Google Patents

Amphotrope retrovirus-verpackungszelllinie, verfahren zur herstellung und verwendung Download PDF

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    • C12N2740/13052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Description

  • Die Erfindung betrifft eine verbesserte amphotrope retrovirale Verpackungszelllinie, ein Verfahren für ihre Herstellung sowie ihre Verwendung insbesondere zur Gentherapie in vitro und in vivo. Mit retroviralen Vektoren, die durch eine derartige Verpackungszelllinie hergestellt sind, können hohe Virustiter erzielt werden.
  • Retrovirale Vektoren werden weithin verwendet, um fremde Gene in Zellen von Säugern und Menschen zu übertragen. Aus Sicherheitsgründen sollten solche retroviralen Vektoren jedoch nicht mehr zur Replikation in der Lage sein. Aus diesem Grund werden Verpackungszelllinien verwendet, um retrovirale Vektoren herzustellen, die nicht in der Lage sind, Wildtypviren herzustellen, da sie keine funktionalen Verpackungssequenzen enthalten. Solche Verpackungszelllinien sind seit langem bekannt gewesen und wurden beschrieben: ψ2 (Mann et al., Cell 33 (1983) 153–156), ψ-Am (Cone und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1994) 6349–6353), PA12 (Miller et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985) 431–437), GP+E-86 (Markovitz et al., J. Virol. 62 (1988) 1120–1124), PA317 (Miller und Buttimore, Mol. Cell Biol. 6 (1986) 2895–2902) und GP+env Am12 (Markowitz et al., Virology 167 (1988) 400–406), siehe auch „Handbuch der molekularen Medizin", Bd. 1, Hrsg. D. Ganten und K. Ruckpaul, Springer Verlag, Heidelberg 1997, R. Rügen, Kapitel 2.1, 197–241.
  • Alle diese Verpackungszelllinien mit Ausnahme von GP+env Am12 (im Folgenden als Am12 bezeichnet) führen jedoch in einem bestimmten Maß zur Bildung von Wildtypvirus (Bosselman et al., Mol. Cell Biol. 7 (1987) 1797–1804). Am12, bei der die viralen gag- und pol-Funktionen in die Zelle auf einem Plasmid eingefügt werden und env auf einem anderen Plasmid in die Zelle eingefügt wird, ist dagegen eine sichere Verpackungszelllinie. Diese Funktionen werden daher an verschiedenen Loci des Verpackungszellgenoms integriert. Um Wildtypvirus aus Am12 zu bilden, müssen drei Rekombinationen stattfinden, welche das ursprüngliche intakte Genom restaurieren. Dies scheint nahezu unmöglich zu sein, und wurde bisher auch noch nicht beobachtet.
  • Um die durch homologe Rekombination in Verpackungszelllinien auftretenden Probleme zu vermeiden, wurden beispielsweise auch Versuche unternommen, gag/pol und env durch unterschiedliche Promotoren zu exprimieren (Meyers et al., Arch. Virol. 119 (1991) 257–264; Dougherty et al., J. Virol. 63 (1989) 3209–3212) und Verpackungszelllinien auf Basis von Milznekrosevirus (snv) zu verwenden (Martinez und Dornburg, Virology 208 (1995) 234–241).
  • Ein Nachteil der bekannten Verpackungszelllinien ist jedoch, dass die Vektor-Virustiter der auf diese Weise hergestellten retroviralen Vektoren sehr niedrig sind und im Bereich von zwischen 102 und einem Maximum von 106 Kolonien bildenden Einheiten (CFU)/ml Zellkulturüberstand liegen.
  • Das Ziel der Erfindung besteht darin, retrovirale, sichere Verpackungszelllinien bereitzustellen, die dazu in der Lage sind, Vektorviren mit einer hohen Transduktionseffizienz herzustellen.
  • Die Erfindung betrifft eine amphotrope retrovirale Verpackungszelllinie DSM ACC 2235, welche funktionelle gag-, pol- und env-Gene enthält, die in das Genom integriert sind, in der die Expression der Gene gag und pol unabhängig von der Expression der env-Gene reguliert ist, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das Genom der Zelllinie ein oder zwei funktionell aktive env-Gene enthält.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines retroviralen Vektors, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine erfindungsgemäße amphotrope retrovirale Verpackungszelllinie mit einem Vektorvirus (Vektorgenom) transfiziert wird, welches ein oder mehrere Gene enthält, die für den Virus heterolog sind, die aber keine funktionell aktiven retroviralen Strukturgene enthalten, worin die Zelllinie kultiviert wird und der retrovirale Vektor aus dem Kulturüberstand isoliert wird.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer amphotropen retroviralen Verpackungszelllinie DSM ACC 2235, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein env-Helferplasmid, das ein Selektionsgen enthält und ein gag/pol-Helferplasmid, das ein Selektionsgen enthält, in eine eukaryotische Zelle transfiziert werden, transfizierte Zellen auf Grundlage des Selektionsgens identifiziert und isoliert werden und diejenigen Zellen selektiert werden, die ein oder zwei funktionell aktive env-Gene enthalten.
  • Ein zur Replikation unfähiges retrovirales Vektorvirus kann durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
  • Es hat sich herausgestellt, dass die Anzahl der env-Integrationen in das Genom einer Verpackungszelllinie einen entscheidenden Einfluss auf die Transduktionseffizienz der auf diese Weise hergestellten Vektorviren besitzt. Dies ist umso überraschender, da von Martinez und Dornburg, Virology 208 (1995) 234–241 bekannt ist, dass das Ausmaß der env-Expression in einer Verpackungszelllinie keine Einfluss auf die Transduktionseffizienz besitzen würde. Die von Martinez und Dornburg untersuchten Verpackungszelllinien unterscheiden sich hinsichtlich der env-Expression nur in der Promotorstärke der Sequenzen, welche die env-Expression regulieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Verpackungszelllinie zwei env-Integrationen und eine gag/pol-Integration. Gemäß der Erfindung wird durch die Verwendung der Verpackungszelllinie ein Titer der retroviralen Vektoren von 2 × 106 bis 107 oder mehr erreicht, vorzugsweise wenigstens 107 Kolonien bildende Einheiten pro ml Zellkulturüberstand und/oder vorzugsweise eine Transduktionseffizienz von wenigstens 50% in MOLT-4-Zellen (ATCC CRL 1582) nach 3 Tagen, gemessen mittels des Zentrifugationsverfahrens.
  • Die unabhängige Regulierung der Genexpression von gag/pol und env wird üblicherweise dadurch erzielt, dass wenigstens eine Expressionskontrollsequenz und/oder ein Stoppsignal zwischen gag/pol und env angeordnet wird.
  • Ausgangszelllinien für die Verpackungszelllinie sind beispielsweise 3T3, D17. Geeignete Ausgangsvektoren beruhen beispielsweise auf MLV, MoMuLV. Solche geeigneten Verpackungszelllinien und Ausgangsvektoren sind einem Fachmann bekannt und beispielsweise von R. Rüger (1997) in „Handbuch der molekularen Medizin" beschrieben.
  • Die Zelllinie HSR BM01 ist als Verpackungszelllinie erfindungsgemäß besonders bevorzugt. Diese Zelllinie wurde am 12.09.1995 von Boehringer Mannheim GmbH nach dem Budapester Vertrag in der „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (DSM), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig unter Nr. DSM ACC 2235 hinterlegt.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen amphotropen retroviralen Verpackungszelllinie.
  • Eine retrovirale Verpackungszelllinie mit amphotrop geteiltem Genom kann beispielsweise wie in Markowitz et al., Virology 167 (1988) 400–406 beschrieben hergestellt werden. Dafür werden zwei Plasmide verwendet, die für die sogenannten f-Helfersequenzen codieren (gag, pol und env).
  • Um erfindungsgemäße Zelllinien auszuwählen, muss die Anzahl der env- und gag/pol-Integrationen bestimmt werden. Dies wird geeigneterweise durchgeführt, indem die genomische DNA mit Restriktionsenzymen verdaut wird, welche in den gag/pol-Sequenzen oder env-Sequenzen nicht spalten und indem die Anzahl der Fragmente, welche gag/pol- oder env-spezifische Sequenzen enthalten, bestimmt wird.
  • Die Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt, wird durch die folgenden Beispiele und Publikationen weiter veranschaulicht. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, welche auch nach Modifikationen noch den Gegenstand der Erfindung beschreiben.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion von Helferplasmiden
  • Konstruktion des gag/pol-Helferplasmids:
  • Ein Helferplasmid trägt die viralen Strukturgene gag/pol des Moloney murinen Leukämievirus (MoMULV) z. B. unter der Kontrolle von MoMULV 5'LTR. Diese Strukturgene gag/pol zusammen mit der 5'LTR können aus der proviralen DNA von MoMULV durch Restriktionsverdau erhalten werden. Bei diesem Verfahren ist es aus Sicherheitsgründen wichtig, die sogenannten Verpackungssequenzen ψ zu inaktivieren. Dies kann beispielsweise durch eine Deletion erreicht werden, die mit Hilfe eines Restriktionsverdaus eingeführt wird. Außerdem ist es vorteilhaft, einen selektierbaren Marker wie z. B. das gpt-Gen auf dem Helferplasmid zur Verfügung zu haben, dessen Genprodukt Resistenz gegenüber dem Selektionswirkstoff Mycophenolsäure verleiht. Mycophenolsäure-Resistenz ermöglicht die rasche Selektion von Klonen, welche das gewünschte Plasmid aufgenommen haben (gag/pol-Helferplasmid). Ein entsprechendes Helferplasmid kann wie beispielsweise von Markowitz et al., J. Virol. 62 (1988) 1120–1124 beschrieben konstruiert werden.
  • Konstruktion des env-Helferplasmids:
  • Ein weiteres Helferplasmid trägt das virale Strukturgen env des amphotropen murinen Leukämievirusklons 4070A (4070A) (Chattopadhyay et al., J. Virol. 39 (1981) 777–791) z. B. unter der Kontrolle von MoMULV 5'LTR. Dafür wird ein Fragment der proviralen DNA von 4070A isoliert, welches das env-Gen und die 3'-Akzeptor-Splicestelle enthält. Dieses Fragment wird in ein Plasmid kloniert, welches MoMULV 5'LTR sowie die 5'-Donor-Splicestelle enthält. Ein entsprechendes Helferplasmid kann wie beispielsweise von Markowitz et al., Virology 167 (1988) 400–406 beschrieben hergestellt werden.
  • Beispiel 2
  • Übertragung der Helferkonstrukte
  • Übertragung des gag/pol-Helferplasmids:
  • NIH 3T3-Zellen (ACC Nr. CRL 1658) werden beispielsweise zunächst mit dem gag/pol-Helferplasmid transfiziert. Dies kann beispielsweise mit Hilfe von Elektroporation durchgeführt werden. Transfizierte Zellen können mit Hilfe eines geeigneten Selektionsmediums isoliert werden, da das gpt-Gen auf dem gag/pol-Plasmid vorliegt. Ein geeignetes Selektionsmedium enthält beispielsweise Hypoxanthin (15 μg/ml), Xanthin (250 μg/ml) und Mycophenolsäure (25 μg/ml) (HXM-Medium). Resistente Klone können anschließend auf die Expression von reverser Transkriptase (RT) untersucht werden, wie beispielsweise von Markowitz et al., J. Virol. 62 (1988) 1120–1124 beschrieben. Ein Klon, der in einem besonders hohen Maß exprimiert, wird für die anschließende Transfektion mit dem env-Helferplasmid ausgewählt.
  • Übertragung des env-Helferplasmids:
  • Anschließend kann das env-Helferplasmid beispielsweise mit Hilfe von Elektroporation in einen mit gag/pol transfizierten Mycophenolsäure-resistenten Klon mit hoher RT-Aktivität transfiziert werden. Um auf einfache Weise transfizierte Zellen zu identifizieren, ist es vorteilhaft, beispielsweise ein weiteres Plasmid, das ein Resistenzgen enthält, zusammen mit dem Helferplasmid zu kotransfizieren. Dies kann beispielsweise ein Plasmid sein, welches Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht, wie beispielsweise das Plasmid pRSHhyg (Murphy, A. J. (1987) Doktorarbeit, Columbia-Universität, USA). Erfolgreich transfizierte Klone können auf einfache Weise mit Hilfe eines geeigneten Selektionsmediums selektiert werden, das beispielsweise 200 μg/ml Hygromycin B enthält. Hygromycin-resistente Klone können anschließend mit Hilfe von Radioimmunpräzipitation unter Verwendung eines env-Antiserums auf env-Expression untersucht werden wie beispielsweise in Markowitz et al., Virology 167 (1988) 400–406 beschrieben.
  • Beispiel 3
  • Selektion von amphotropen retroviralen Verpackungszelllinien
  • Die Anzahl der Kopien des in das Genom integrierten env-Helferplasmids wurde als Parameter für die Auswahl eines bestimmten Subklons einer Verpackungszelllinie gewählt. Martinez und Dornburg, Virology 208 (1995) 234–241 haben gezeigt, dass im Gegensatz zu gag/pol eine höhere env-Expression keinen Einfluss auf den Virustiter besitzt; der Titer der Klone mit einer höheren gag/pol-Expression, aber ohne höhere env-Expression, korrelierte mit der gefundenen Infektionseffizienz. Dies war die Grundlage für die Annahme, dass das Verhältnis von gag/pol- zu env-Genprodukten von großer Bedeutung für die Wirksamkeit von Verpackungszelllinien sein kann und dass möglicherweise Verpackungszellen mit einer geringeren env-Expression zu viralen Überständen mit einer höheren Transduktionseffizienz führen können.
  • Bestimmung der Anzahl von env-Integrationen:
  • Die Anzahl der Kopien der in das Genom integrierten env-Helferplasmide der einzeln untersuchten Klone wurde mit Hilfe von Restriktionsverdau und Southern Blot-Analyse bestimmt. Zu diesem Zweck wurde genomische DNA aus verschiedenen Subklonen isoliert und mit Hilfe von Restriktionsenzymen, z. B. dem Enzym Pstl verdaut. Dieses Enzym spaltet nicht in der env-Sequenz und in der gesamten Plasmidsequenz spaltet es nur einmal. Da jede korrespondierende zweite Spaltstelle, die zu dem entsprechenden Restriktionsfragment führt, in dem Genom zufällig angeordnet ist, ist es möglich, auf diese Weise die Anzahl der env-Integrationen zu bestimmen.
  • Die verdaute DNA wurde in einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran mittels Kapillartransfer übertragen. Die Fragmente, welche env-spezifische Sequenzen enthalten, wurden mit Hilfe einer env-spezifischen Digoxigenin-markierten DNA-Sonde nachgewiesen. Subklone mit unterschiedlichen Anzahlen von env-Integrationen wurden gefunden. Beispielsweise lagen die Bandengrößen, die nach Verdau mit dem Restriktionsenzym Pstl erhalten wurden, bei 17,5 kb, 13,3 kb und 3,4 kb für die Verpackungszelllinie GP+env Am12 und bei 13,3 kb und 3,4 kb für die Verpackungszelllinie HSR BM01.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Virus-produzierenden Zelllinien mit unterschiedlichen Anzahlen von env-Integrationen
  • Jeder Subklon wurde mit entweder zwei (HSR BM01) oder drei (GP+env Am12) env-Integraten transfiziert, die das retrovirale Konstrukt pL1 enthielten, um Virus-produzierende Zelllinien (Produzentenlinien) herzustellen. Das Konstrukt pL1 trägt die cDNA für eine verkürzte Form des humanen niederaffinen Nervenwachstumsfaktorrezeptors (hΔ LNGFR (analog zu WO 95/06723 hergestellt)), in der die Cytoplasmadomäne deletiert ist und die sich unter der Kontrolle der viralen 5'LTR befindet. Das Genprodukt der hΔ LNGFR-cDNA, ein Membranprotein, kann auf den Zellen mit Hilfe eines hΔ LNGFR-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAb) nachgewiesen werden. Virus-produzierende Klone wurden aus HSR BM01 (HSRBM-L1) sowie aus GP+env Am12 (Klon C11-C4) mit Hilfe von Immunofluoreszenz und Durchflusszytometrie isoliert.
  • Bestimmung des Titers von Überständen Virus-produzierender Zellen, die unterschiedliche Anzahlen von env-Integrationen enthalten:
  • Indikatorzellen (NIH/3T3; ATCC Nr. CRL 1658) wurden mit den Überständen transfiziert, die Viruspartikel der beiden Klone HSRBM-L1 oder C11-C4 enthielten. Ein auf dem Anti-hΔ LNGFR mAb basiertes cytochemisches Anfärbungsverfahren erlaubt die Bestimmung der Anzahl von Kolonien bildenden Einheiten (Titer) der hΔ LNGFR-codierenden Retroviren. Während der Überstand der Produzentenlinie C11-C4 (3 env-Kopien) auf Basis der Verpackungszelle GP+env Am12 einen Titer von 6,3 × 105 Kolonien bildenden Einheiten aufwies, hatte der Überstand der Produzentenlinie HSRBM-L1 (2 env-Kopien) auf Basis von HSR BM01 einen Titer von 1,25 × 107.
  • Beispiel 5
  • Transduktion verschiedener Zelllinien mit Überständen von zwei verschiedenen Produzentenzelllinien, die denselben retroviralen Vektor enthalten
  • Die Zelllinien Jurkat, MOLT4, Raji und K 562 werden in RPMI/10% FCS unter normalen Zellkulturbedingungen kultiviert und bei Zelldichten von 3–9 × 105 Zellen/ml transduziert. Die verschiedenen Produzentenzelllinien, die einen identischen retroviralen Vektor enthalten, werden in DMEM/10% FCS unter normalen Zellkulturbedingungen kultiviert. Die Zellen werden mit 1 × 104 Zellen/cm2 ausgesät. Nach 3 Tagen wird der Überstand verworfen und frisches Medium wird hinzugefügt. Der Überstand wird 24 Stunden später geerntet. Der Überstand wird durch einen 0,22 μm-Filter filtriert. Der Titer der verschiedenen Überstände wird bestimmt und so eingestellt, dass äquivalente Volumenmengen eine äquivalente Anzahl von Viruspartikeln enthalten. Der Titer des retroviralen Überstandes wurde unter Verwendung des Verfahrens der Immunanfärbungstitration unter Verwendung von NIH3T3 als Zielzellen bestimmt.
  • Transduktion
  • Protokoll 1:
  • 5 × 105 Zellen werden in 1 ml retroviralem Überstand resuspendiert. Die Transduktion wird in einer 24-Well-Platte durchgeführt. Nach Zentrifugation (1000 g, 30°C, 90 min) werden die Zellen gewaschen und in 1 ml frischem Zellkulturmedium resuspendiert. Die Zellen werden über Nacht inkubiert und 1 ml frisches Medium wird hinzugefügt. 3 Tage nach der Transduktion werden die Zellen geerntet und mit einem FITC-markierten Anti-LNGFR-Antikörper angefärbt. Der Prozentsatz der LNGFR-exprimierenden Zellen wird mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Bei diesem Verfahren werden tote Zellen durch Propidiuimiodid-Anfärbung aus der Analyse ausgeschlossen. Die Durchflusszytometrie-Analyse wird an einem FAC-Scan-Instrument durchgeführt.
  • Protokoll 2:
  • Die Vorgehensweise bei Protokoll 2 wurde entsprechend Protokoll 1 durchgeführt, aber ohne Zentrifugation. Die Zellen werden für 2 h bei 37°C mit dem retroviralen Überstand inkubiert.
  • Tabelle 1 zeigt die LNGFR-Expression verschiedener Zelllinien drei Tage nach Transduktion gemäß Protokoll 1.
  • Tabelle 2 zeigt die LNGFR-Expresssion verschiedener Zelllinien drei Tage nach Transduktion gemäß Protokoll 2. Tabelle 1
    % LNGFR-positive Zellen 3 Tage nach Transduktion (Zentrifugationsverfahren)
    HSR BM01 GP+envAm12
    (HSRBM-L1) (Klon C11-C4)
    K562 88,81 12,79
    MOLT4 53,64 3,52
    RAJI 25,31 8,83
    JURKAT 44,36 3,96
    Tabelle 2
    % LNGFR-positive Zellen 3 Tage nach Transduktion (Inkubationsverfahren)
    HSR BM01 GP+envAml2
    (HSRBM-L1) (Klon C11-C4)
    K562 68,69 8,24
    MOLT4 37,86 2,68
    RAJI 6,72 3,01
    JURKAT 23,91 4,64
  • Literaturstellen
    • Bosselman et al., Mol. Cell Biol. 7(1987) 1797–1804
    • Chattopadhyav et al., J. Virol. 39 (1981) 777–791
    • Cone und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1994) 6349–6353
    • Dougherty et al., J. Virol. 63 (1989) 3209–3212
    • Handbuch der molekularen Medizin, Band I, Hrsg. D. Ganten und K. Ruckpaul,
    • Springer Verlag Heidelberg 1997, R. Rügen, Kapitel 2.1, 197–241
    • Mann et al., Cell 33 (1983) 153–156
    • Markowitz et al., J. Virol. 62 (1988) 1120–1124
    • Markowitz et al., Virology 167 (1988) 400–406
    • Martinez und Dornburg, Virology 208 (1995) 234–241
    • Meyers et al., Arch. Virol. 119 (1991) 257–264
    • Miller und Buttimore, Mol. Cell Biol. 6 (1986) 2895–2902
    • Miller et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985) 431–437
    • Murphy, A. J. (1987), Doktorarbeit, Columbia University, USA.

Claims (5)

  1. Amphotrope retrovirale Verpackungszelllinie DSM ACC 2235, welche funktionelle gag-, pol- und env-Gene enthält, die in das Genom integriert sind, in der die Expression der Gene gag und pol unabhängig von der Expression der env-Gene reguliert ist, worin das Genom der Zelllinie ein oder zwei funktionell aktive env-Gene enthält.
  2. Verpackungszelllinie nach Anspruch 1, worin diese zwei env-Integrationen und eine gag/pol-Integration enthält.
  3. Verpackungszelllinie nach Anspruch 1 oder 2, worin ein Titer von wenigstens 2 × 106 bis 107 kolonienbildenden Einheiten/ml Zellkulturüberstand erreicht wird, wenn ein retroviraler Vektor verpackt wird.
  4. Verfahren zur Herstellung einer amphotropen retroviralen Verpackungszelllinie DSM ACC 2235, worin ein env-Helferplasmid, das ein Selektionsgen enthält und ein gag/pol-Helferplasmid, das ein Selektionsgen enthält, in eine eukaryotische Zelle transfiziert werden, transfizierte Zellen auf Grundlage des Selektionsgens identifiziert und isoliert werden, und diejenigen Zellen selektiert werden, die ein oder zwei funktionell aktive env-Gene enthalten.
  5. Verfahren zur Herstellung eines retroviralen Vektors, worin eine Verpackungszelllinie nach Anspruch 1–3 mit einem Vektorgenom transfiziert wird, welches ein oder mehrere heterologe Gene für das Virus enthält, aber keine funktionell aktiven retroviralen Strukturgene enthält, die Zelllinie kultiviert wird und der retrovirale Vektor aus dem Kulturüberstand isoliert wird.
DE69937556T 1998-05-20 1999-05-14 Amphotrope retrovirus-verpackungszelllinie, verfahren zur herstellung und verwendung Expired - Lifetime DE69937556T2 (de)

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EP98109135 1998-05-20
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