KR20010071300A - 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주, 그의 제조 방법및 그의 용도 - Google Patents

양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주, 그의 제조 방법및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

gag 및 pol 유전자의 발현이 env 유전자의 발현돠 독립적으로 제어되는 게놈에 삽입된 gag, pol 및 env 기능 유전자를 포함하는, 하나 또는 두 개의 기능적으로 활성인 env 유전자를 포함하는 양성향종 레트로바이러스 패키지 세포주를 사용하여 세포 배양 상층액 1 ml 당 약 107콜로니-형성 단위의 역가를 얻었다.

Description

양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주, 그의 제조 방법 및 그의 용도{AMPHOTROPIC RETROVIRUS PACKAGING CELL LINE, PROCESS FOR ITS PRODUCTION AND USE THEREOF}
본 발명은 개선된 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주, 그의 제조 방법 및 특히 생체외 및 생체내 유전자 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다. 상기 패키지 세포주에 의해 제조된 레트로바이러스 벡터를 사용하여 높은 바이러스 역가를 달성할 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 포유류 및 인간의 세포에 이종 유전자를 이식하는데 널리 사용된다. 그러나, 안전성의 이유로 그러한 레트로바이러스 벡터는 더이상 복제-콤피텐트이어서는 안된다. 상기 이유로, 패키지 세포주를 사용하여 기능적인 패키지 서열을 포함하지 않기 때문에 야생형 바이러스를 제조할 수 없는 레트로바이러스 벡터를 제조한다. 상기 패키지 세포주는 오랜 기간 알려져 있었고 하기에 기재되어 있다: ψ2[Mann 등, Cell 33 (1983) 153-156], ψ-Am [Cone 및 Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1994) 6349-6353], PA12 [Miller 등, Mol. Cell Biol. 5 (1985) 431-437], GP+E-86 [Markowitz 등, J. Virol. 62 (1988) 1120-1124], PA317 [Miller 및 Buttimore, Mol. Cell Biol.6 (1986) 2895-2902], 및 GP+env Am12 [Markowitz 등, Virology 167 (1988) 400-406], 또한 ["Handbuch der molekularen Medizin", Vol. 1 Ed. D. Ganten 및 K. Ruckpaul, SpringerPublishers, Heidelberg 1997, R. Ruger, chapter 2.1, 197-241] 을 참조.
그러나, GP+env Am12(하기에서 Am12 로 언급됨) 를 제외한 모든 상기 패키지 세포주는 어느정도 야생형 바이러스를 형성한다[Bosselman 등, Mol. Cell Biol. 7 (1987) 1797-1804]. 이와는 반대로, 바이러스의 gag 및 pol 의 기능이 하나의 플라스미드 상의 세포에 도입되고 env 는 다른 플라스미드 상의 세포에 도입되는 Am12 는 안전한 패키지 세포주이다. 이들 기능은 그러므로 패키지 세포 게놈의 다른 위치에 삽입되어 있다. Am12 로부터 야생형 바이러스를 형성하기 위해서는, 본래 그대로인 게놈을 복구하는 3 개의 재조합이 발생되어야 한다. 이는 거의 불가능하고 또한 예전에 관찰된 바도 없었다.
패키지 세포주에서의 동종 재조합에 의해 야기되는 문제를 피하기 위해, 예를 들어, 다른 프로모터에 의해 gag/pol 및 env 를 발현시키는 것 [Meyers 등, Arch. Virol. 119 (1991) 257-264]; [Dougherty 등, J. Virol. 63 (1989) 3209-3212] 및 비장 괴사 바이러스 (SNV) 를 기초로한 패키지 세포주를 사용하는 것이 시도되어 왔다 [Martinez 및 Dornburg, Virology 208 (1995) 234-241].
그러나, 공지된 패키지 세포주의 단점은 상기 방법으로 제조된 레트로바이러스 벡터의 벡터-바이러스 역가가 세포 배양 상층액 1 ml 당 102내지 최대 106의 콜로니-형성 단위 (CFU) 의 범위로서 매우 낮다는데 있다.
본 발명의 목적은 높은 형질 도입 효율을 갖는 벡터 바이러스를 제조할 수 있는, 레트로바이러스의, 안전한 패키지 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명은 gag 및 pol 유전자의 발현이 env 유전자의 발현과 독립적으로 조절되는 게놈에 삽입된 기능 유전자 gag, pol 및 env 를 포함하는 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주에 있어서, 하나 또는 두 개의 기능적으로 활성인 env 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주에 관한 것이다.
또한 본 발명의 주제는, 본 발명에 따른 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주가 바이러스에 대해 이종인 하나 이상의 유전자는 포함하지만, 세포주를 배양하고 레트로바이러스 벡터를 배양액의 상층액으로부터 단리시킨 기능적으로 활성인 레트로바이러스의 구조 유전자는 포함하지 않는 벡터-바이러스 (벡터 게놈) 로 트랜스펙션 (transfection) 된 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터의 제조 방법이다.
또한 본 발명의 주제는, 선택 유전자를 포함하는 env 헬퍼 플라스미드 및 선택 유전자를 포함하는 gag/pol 헬퍼 플라스미드를 진핵 세포에 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포를 선택 유전자를 토대로 확인하고, 단리시키고 하나 또는 두 개의 기능적으로 활성인 env 유전자를 포함하는 세포를 선택하는 것을 특징으로 하는 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 복제-비콤피텐트 레트로바이러스성 벡터 바이러스에 관한 것이다.
패키지 세포주의 게놈 내 env 의 삽입 수가 이러한 방법으로 제조된 벡터-바이러스의 형질도입 효율에 결정적인 영향을 미친다는 것이 증명되었다. [Martinez 및 Dornburg, Virology 208 (1995) 234-241] 로부터, 패키지 세포주에서의 env 발현 정도는 형질도입 효율에 영향을 미치지 않는다는 것이 알려져 있어서 이는 더욱 놀랍다. Martinez 및 Dornburg 에 의해 시험된 패키지 세포주는 env 발현에 있어서 단지 env 발현을 조절하는 서열의 프로모터 강도에 있어서만 다르다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 패키지 세포주는 두 개의 env 삽입 및 하나의 gag/pol 삽입을 포함한다. 본 발명에 따라, 패키지 세포주를 사용하여 세포 배양 상층액 1 ml 당 2·106내지 107개 이상, 바람직하게는 107개 이상의 콜로니-형성 단위 및/또는 바람직하게는 3 일 후 원심분리법으로 측정하여 MOLT-4 세포 (ATCC CRL 1582) 중 50 % 이상의 형질도입 효율을 달성하게 된다.
gag/pol 및 env 의 유전자 발현의 독립적인 조절은 통상적으로 하나 이상의 발현 제어 서열 및/또는 멈춤 시그날을 gag/pol 및 env 사이에 위치시킴으로써 성취된다.
패키지 세포주에 대한 출발 세포주는 예를 들어 3T3, D17 이다. 적절한 출발 벡터는, 예를 들어 MLV, MoMuLV 를 기본으로 한다. 상기 적절한 패키지 세포주 및 출발 벡터는 당업계의 숙련된 사람에게 공지되어 있고, 예를 들어 [R. Ruger (1997) "Handbuch der molekularen Medizin"] 에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 패키지 세포주로서 세포주 HSR BM01 이 특히 바람직하다. 상기 세포주는 Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig 에 소재한 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" (DSM) 에서의 부다페스트 조약에 따라 Boehringer Mannheim GmbH 에 의해 기탁 번호 DSM ACC 2235 로 1995년 9 월 12 일 기탁되었다.
또한 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주의 제조 방법에 관한 것이다.
양종향성 분할 게놈 레트로바이러스 패키지 세포주는 예를 들어 [Markowiz 등, Virology 167 (1988) 400-406] 에 기재되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 이를 위해 소위 f 헬퍼 서열 (gag, pol 및 env) 을 코딩하는 두개의 플라스미드가 사용된다.
본 발명에 따른 세포주를 선택하기 위해, env 및 gag/pol 의 삽입수가 결정되어야 한다. 이는 gag/pol 서열 또는 env 서열 내에서 절단하지 않는 제한효소로 게놈 DNA 를 절단하고, gag/pol- 또는 env-특이 서열을 포함하는 단편의 수를 결정함으로써 용이하게 수행된다.
특허 청구항으로서 그 보호 범위가 결정되는 본 발명은 하기 실시예 및 공고에 의해 더욱 설명될 것이다. 기재된 방법은 심지어 변형 후에도 본 발명의 주제를 기재하는 예로서 이해되어야 한다.
실시예 1
헬퍼 플라스미드의 제조
gag/pol 헬퍼 플라스미드의 제조:
헬퍼 플라스미드는 예를 들어 MoMULV 5'LTR 의 제어 하의 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 (MoMULV) 의 바이러스 구조 유전자 gag/pol 를 갖는다. 5'LTR 과의상기 구조 유전자 gag/pol 은 제한 절단에 의한 MoMULV 의 프로바이러스 DNA 로 부터 수득될 수 있다. 상기 과정에서, 안전성의 이유로 소위 패키지 서열 ψ를 불활성화시키는 것이 중요하다. 이는 예를 들어 제한 절단의 도움으로 유도되는 결실에 의해 성취될 수 있다. 또한, 선택 마커, 예를 들어 선택 약물 미코페놀성 산에 대한 내성을 나타내는 유전자 생성물인, 헬퍼 플라스미드 상의 gpt 유전자를 갖는 것이 유리하다. 미코페놀성 산 내성은 목적 플라스미드 (gag/pol 헬퍼 플라스미드) 를 갖는 클론을 빨리 선택할 수 있도록 한다. 대응하는 헬퍼 플라스미드는 예를 들어 [Markowitz 등, J. Virol. 62 (1988) 1120-1124] 에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
env 헬퍼 플라스미드의 제조:
또 다른 헬퍼 플라스미드는 예를 들어 MoMULV 5'LTR 의 제어 하에 양종향성 마우스 백혈병 바이러스 클론 4070A (4070 A) 의 바이러스 구조 유전자 env 을 갖는다 [Chattopadhyay 등, J. Virol. 39 (1981) 777-791]. 이를 위해 env 유전자 및 3' 수용체 스플라이스 부위를 포함하는 4070 A 의 프로바이러스 DNA 의 단편을 단리하였다. 상기 단편을 MoMULV 5'LTR 및 5' 공여체 스플라이스 부위를 포함하는 플라스미드에 클로닝하였다. 대응하는 헬퍼 플라스미드는 예를 들어 [Markowitz 등, Virology 167 (1988) 400-406] 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시예 2
헬퍼 구조물의 이식
gag/pol 헬퍼 플라스미드의 이식:
먼저 예를 들어 gag/pol 헬퍼 플라스미드로 NIH 3T3 세포 (ATCC 제 CRL 1658 호) 를 트랜스펙션시켰다. 이는 예를 들어 전기천공으로 수행할 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 gpt 유전자가 gag/pol 플라스미드 상에 존재하기 때문에, 적절한 선택 배지를 사용하여 단리될 수 있다. 적절한 선택 배지는 예를 들어 히포크산틴 (15 μg/ml), 크산틴 (250 μg/ml) 및 미코페놀성 산 (25 μg/ml) (HXM 배지) 을 포함한다. 이어서 내성 클론을 예를 들어 [Markowitz 등, J. Virol. 62 (1988) 1120-1124] 에 기재된 바와 같이 역전사효소 (RT) 의 발현을 사용하여 시험할 수 있다. env 헬퍼 플라스미드로 후속 트랜스펙션시켜서 특별하게 높은 수준으로 발현하는 클론을선택했다.
env 헬퍼 플라스미드의 이식:
후속적으로 env 헬퍼 플라스미드를 예를 들어 전기천공을 사용하여 gag/pol-트랜스펙션된, 높은 RT 활성을 갖는 미코페놀성 산-내성 클론에 트랜스펙션시킬 수 있다. 단지 성공적으로 세포가 트랜스펙션되었는지를 확인하기 위하여, 예를 들어 헬퍼 플라스미드와 함께 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를 더 공-트랜스펙션시키는 것이 유리하다. 이는 예를 들어 히그로미신, 예컨대 플라스미드 pRSHhyg [Murphy, A. J. (1987) doctoral thesis, Columbia University, USA] 에 내성을 나타내는 플라스미드일 수 있다. 성공적으로 트랜스펙션된 클론은 단지 예를 들어 200 μg/ml 히그로미신 B 를 포함하는 적절한 선택 배지의 도움으로 선택될 수 있다. 후속적으로 예를 들어 [Markowitz 등, Virology 167 (1988) 400-406] 에 기재된 것과 같은 env 항혈청을 사용한 방사능면역-침전으로 히그로미신-내성 클론의env 발현에 대해 시험하였다.
실시예 3
양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주의 선택
게놈에 삽입된 env 헬퍼 플라스미드의 많은 카피가 패키지 세포주의 특정 서브클론을 선택하기 위한 파라미터로서 선택되었다. [Martinez 및 Dornburg, Virology 208 (1995) 234-241] 은 gag/pol 과는 대조적으로, 높은 env 발현이 바이러스 역가에 아무런 영향을 미치지 않으며; gag/pol 은 더 많이 발현되지만 env 는 더 많이 발현되지는 않는 클론의 역가는 발견된 감염 효율과 상호 관련되어있음을 보였다. 이는 env 유전자 생성물에 대한 gag/pol 의 비가 패키지 세포의 효율에 있어서 매우 중요하고 가능하게는 낮은 env 발현의 패키지 세포를 높은 형질도입 효율의 바이러스 상층액으로 유도할 수 있다는 가정의 근거가 된다.
env 삽입수의 측정:
독립적으로 시험된 클론의 게놈에 삽입된 env 헬퍼 플라스미드의 카피수를 제한 절단 및 서던 흡입 분석법으로 측정했다. 이를 위해 DNA 를 각종 서브클론으로부터 단리하고 제한 효소, 예를 들어 효소 PstⅠ으로 절단하였다. 상기 효소는 env 서열 내에서 절단하지 않고 단지 모든 플라스미드 서열 내에서 한 번 절단한다. 각각의 절단 단편을 산출하는 각각의 해당하는 두 번째 절단 부위가 게놈안에 무작위로 위치기 때문에, 상기 방법으로 env 삽입수를 측정하는 것이 가능하였다.
절단된 DNA 를 아가로스 젤에서 분리하였고 모세관 이식을 통해 나일론막으로 이식했다. env 특정 서열을 포함하는 단편을 env-특이성, 디곡시제닌-표지된 DNA 프로브로 검출했다. env 삽입수가 다른 서브클론을 발견했다. 예를 들어, 제한 효소 PstⅠ으로 절단 후 수득한 밴드 크기는 패키지 세포주 GP+env Am12 에 대해 17.5 kb, 13.3 kb 및 3.4 kb 이었고, 패키지 세포주 HSR BM01 에 대해 3.4 kb 이었다.
실시예 4
env 삽입수가 다른 바이러스-제조 세포주의 제조
바이러스-제조 세포주 (제조주)를 제조하기 위하여 레트로바이러스 구조물 pL1을 포함하는 세 개의 (GP+env Am12) 또는 두 개의 (HSR BM01) env 삽입 중 어느 하나를 사용하여 각각의 서브클론을 트랜스펙션시켰다. 구조물 pL1 은 세포질 영역이 결실되고 바이러스 5' LTR 의 통제 하에 있는, 인간의 저친화성 신경 성장 요소 수용체 (hΔLNGFR (WO 95/06723) 과 유사하게 제조됨)) 의 보다 짧은 형태에 대한 cDNA를 갖는다. hΔLNGFR cDNA 의 유전자 생성물인 막 단백질은 hΔLNGFR-특이성 단일클론성 항체 (mAb)를 사용하여 세포 상에서 검출될 수 있다. 면역형광법 및 흘림세포계측법을 사용하여 바이러스-제조 클론을 HSR BM01 (HSRBM-L1) 및 GP+env Am12 (클론 C11-C4) 로부터 단리하였다.
다른 env 삽입수를 포함하는 바이러스-제조 세포로부터의 상층액의 역가 측정:
지시 세포 (NIH/3T3; ATCC 제 CRL 1658 호)를 두 개의 클론 HSRBM-L1 또는 C11-C4 로부터의 바이러스 입자를 포함하는 상층액으로 형질도입하였다. 항-hΔLNGFR mAb 에 기재한 세포화학적 착색 방법으로 hΔLNGFR-코딩 레트로바이러스의 콜로니-형성 단위수 (역가)를 측정했다. 패키지 세포 GP+env Am12 에 기재한제조주 C11-C4 (3 env 카피) 의 상층액은 6.3 × 105의 콜로니-형성 단위 역가를 갖는 반면, HSR BM01 에 기재한 제조주 HSRBM-L1 (두개의 env 카피) 의 상층액은 1.25 × 107의 역가를 가졌다.
실시예 5
동일한 레트로바이러스 벡터를 포함하는 두 개의 다른 제조 세포주로부터의 상층액을 사용한 각종 세포주의 형질도입
세포주 Jurkat, MOLT4, Raji 및 K 562를 RPMI/10 % FCS에서 정상적인 세포 배양 조건 하에 배양하였고, 3-9 × 105세포/ml 의 세포 밀도로 형질도입하였다. 동일한 레트로바이러스 벡터를 포함하는 각종 제조 세포주를 DMEM/10 % FCS에서 정상적인 세포 배양 조건 하에 배양하였다. 세포를 1 × 104세포/cm2로 심었다. 3 일 후 상층액을 버리고 신선한 배지를 첨가했다. 상층액을 24 시간 후 거둬들였다. 상층액을 0.22 ㎛ 여과기를 통하여 여과하였다. 각종 상층액의 역가를 측정하고 동등한 부피량이 동등한 수의 바이러스 입자를 포함하도록 조절하였다. 레트로바이러스 상층액의 역가를 표적 세포로서 NIH3T3을 사용한 면역 착색 적정법을 사용하여 측정하였다.
형질도입
프로토콜 1:
5 ×105개의 세포를 1 ml 의 레트로바이러스 상층액에 재현탁시켰다. 24-웰 플레이트에서 형질 도입을 실행하였다. 원심분리 (1000 g, 30 ℃, 90 분) 후, 세포를 세척하고 1 ml 의 신선한 세포 배양 배지에 재현탁하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고 1 ml 의 신선한 배지를 첨가하였다. 형질 도입 3 일 후 세포를 수확하고 FITC-표지된 항-LNGFR 항체로 착색하였다. LNGFR-발현 세포의 백분율을 흘림세포계측법으로 측정하였다. 상기 방법에서 죽은 세포는 요오드화프로피듐 착색에 의해 분석으로부터 배재되었다. 흘림세포계측 분석법을 FACScan 기구 상에서 수행하였다.
프로토콜 2:
원심분리하지 않는 것을 제외하고는, 프로토콜 2 에서의 과정을 프로토콜 1 에 따라 수행하였다. 세포를 레트로바이러스 상층액과 함께 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
표 1 은 프로토콜 1 에 따른 형질도입 3 일 후 각종 세포주의 LNGFR 발현을 보여준다.
표 2 는 프로토콜 2 에 따른 형질도입 3 일 후 각종 세포주의 LNGFR 발현을 보여준다.
형질도입 3 일 후 LNGFR-양성 세포의 백분율 (원심분리법)
HSR BM01 (HSRBM-L1) GP+envAm12 (C11-C4 클론)
K562 88.81 12.79
MOLT4 53.64 3.52
RAJI 25.31 8.83
JURKAT 44.36 3.96
형질도입 3 일 후 LNGFR-양성 세포의 백분율 (인큐베이션법)
HSR BM01 (HSRBM-L1) GP+envAm12 (C11-C4 클론)
K562 68.69 8.24
MOLT4 37.86 2.68
RAJI 6.72 3.01
JURKAT 23.91 4.64
참고문헌

Claims (7)

  1. gag 및 pol 유전자의 발현이 env 유전자의 발현과는 독립적으로 조절되는 게놈에 삽입된 gag, pol 및 env 기능 유전자를 포함하는 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주에 있어서, 상기 세포주의 게놈이 하나 또는 두 개의 기능적으로 활성인 env 유전자를 포함하는 패키지 세포주.
  2. 제 1 항에 있어서, 두 개의 env 삽입 및 하나의 gag/pol 삽입을 포함하는 것을 특징으로 하는 패키지 세포주.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터를 패키지할 경우, 세포 배양 상층액 1 ml 당 2 ×106내지 107이상의 콜로니-형성 단위의 역가가 성취되는 것을 특징으로 하는 패키지 세포주.
  4. 선택 유전자를 포함하는 env 헬퍼 플라스미드 및 선택 유전자를 포함하는 gag/pol 헬퍼 플라스미드를 진핵 세포에 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포를 선택 유전자를 토대로 확인하고, 단리시키고, 하나 또는 두 개의 기능적으로 활성인 env 유전자를 포함하는 세포를 선택하는, 양종향성 레트로바이러스 패키지 세포주의 제조 방법.
  5. 패키지 세포주 DSM ACC 2235.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항에서 청구된 패키지 세포주를, 바이러스에 대한 하나 이상의 이종 유전자를 포함하지만 기능적으로 활성인 레트로바이러스 구조 유전자는 포함하지 않는 벡터 게놈으로 트랜스펙션시키고, 세포주를 배양하고 레트로바이러스 벡터를 배양 상층액으로부터 단리시키는 레트로바이러스 벡터의 제조 방법.
  7. 제 6 항에서 청구된 방법에 의해 수득된 복제-비콤피텐트 레트로바이러스성 벡터-바이러스.
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