CN1154743C - 双嗜性逆转录病毒包装细胞系、其生产方法及用途 - Google Patents

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Abstract

使用含有已整合进基因组的功能性的gag，pol及env基因的双嗜性逆转录病毒包装细胞系，其中gag及pol基因的表达的调节独立于env基因的表达，并且其中所述细胞系基因组含有一个或两个功能性活动的env基因，得到了每毫升细胞培养上清液中至少约107个集落形成单元的逆转录病毒载体效价。

Description

双嗜性逆转录病毒包装细胞系、其生产方法及用途
本发明涉及一种改良的双嗜性逆转录病毒包装细胞系，其生产方法及用途，尤其是关于体内外基因治疗的用途。通过这样的一个包装细胞系所生产的逆转录病毒载体可以获得高效价的病毒。
逆转录病毒载体被广泛用于将外源基因转化进入人类或哺乳动物的细胞中去。但是出于安全考虑，这样的病毒载体将不再成为复制型载体。因此，包装细胞系被用于生产不能产生野生型病毒的逆转录病毒载体，因为其不含有功能性的包装序列。这样的包装细胞系在很长一段时间内为人所知且已有描述：Ψ2(Mann等，Cell 33(1983)153-156)，Ψ-Am(Cone and Mulligan)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1994)6349-6353)，PA12(Miller等，Mol.Cell Biol.5(1985)431-437)，GP+E-86(Markowitz等，J.Virol.62(1988)1120-1124)，PA317(Miller and Buttimore，Mol.Cell Biol.6(1986)2895-2902)，and GP+env Aml2(Markowitz等，Virology 167(1988)400-406)，同样可以参见t1Handbuch der molekularen Medizin″，Vol.1 Ed.D.Ganten and K.Ruckpaul，Springer Publishers，Heidelberg 1997，R.Ru ger，chapter 2.1，197-241。
然而，除了GP+env Aml2(参见下文所述的Aml2)，所有这些包装细胞系将导致一定程度的野生型病毒的形成(Bosselman等，Mol.Cell Biol.7(1987)1797-1804)。与Aml2相比较，病毒gag及pol功能基因通过一种质粒被引入安全的包装细胞系，而env通过另一种质粒被引入安全的包装细胞系。这些功能性基因因此被整合进包装细胞基因组的不同位置。为了从Aml2形成野生型的病毒，修复原始的完整无缺的基因组必须发生三次重组。这看起来几乎是不可能实现的且以前从未被人发现过。
为了避免在包装细胞系中由于同源重组而导致的问题，已经做了许多努力和尝试以通过使用不同的启动子来表达gag/pol及env基因(Nleyers等，Arch.Virol.119(1991)257-264；Dougherty等，J.Virol.63(1989)3209-3212)并且使用建立在脾坏疽病毒基础上的包装细胞系(SNV)(Martinez and Dornburg，Virology 208(1995)234-241)。
然而，已知的包装细胞系的缺点在于，用这种方法所产生的逆转录病毒载体的病毒载体滴度很低，在每毫升细胞培养上清液中有102至最大106的集落形成单元。
本发明的目的是提供一种逆转录病毒的安全的包装细胞系，其能够产生一种具有很高转导效率的病毒载体。
本发明涉及一种双嗜性逆转录病毒包装细胞系，其含有已整合进基因组中去的功能性的gag，pol及env基因，在这样的基因组中，gag及pol基因的表达的调控独立于env基因的表达，其特征在于所述细胞系的基因组含有一个或多个功能性活动的env基因。
本发明的另一个主题是关于逆转录病毒载体的制备方法，其特征在于，按照本发明所述的双嗜性逆转录病毒包装细胞系被一种含有一个或多个对于病毒来说异源性的基因但不含有功能性活动的逆转录病毒结构基因的载体病毒(载体基因组)转染，然后培养细胞系并从培养上清液中分离逆转录病毒载体。
本发明的另一个主题是关于双嗜性逆转录病毒包装细胞系的制备方法，其特征在于，一种含有选择基因的env辅助质粒及一种含有选择基因的gag/pol辅助质粒被转染进真核细胞中，然后基于该选择基因鉴别已转染的细胞并分离，然后选出含有一个或两个功能性活动的env基因的细胞。
本发明的另一个主题是通过本发明的方法制备的不可复制的逆转录病毒载体病毒。
现在已经证明包装细胞系的基因组中env整合体的数目对本方法制备的载体病毒的转染效率有着决定性的影响。这是非常令人奇怪的，因为从Martinez及Dornburg，在病毒学杂志208期(1995)的论文中234-241中得知，包装细胞系中env基因的表达程度对于转染效率是不会产生任何影响的。由Martinez及Dornburg所鉴别的包装细胞系在env表达方面仅在调节env表达的该序列的启动子强度不同。
在一个优选的实施例中，按照本发明所述的包装细胞系含有两个env整合子及一个gag/pol整合子。按照本发明包装细胞系的使用获得了2×106到107甚至更多的逆转录病毒载体滴度，最好时每毫升细胞培养上清液中至少107个集落形成单元和/或在培养三天后离心测量发现在MOLT-4细胞(ATCC CRL1582)中有至少50％的转导效率。
gag/pol及env基因的独立表达调控可以通过在gag/pol及env基因之间定位至少一个表达调控序列和/或一个终止信号来实现。
对于包装细胞系的起始细胞系有如3T3，D17等细胞系。合适的起始载体是基于，例如，MLV，MoMuLV等载体的。这种合适的起始细胞系及起始载体对于本技术领域的普通技术人员来说是公知的，其在R.Ruger(1997)del的“Handbuch der molekularen”中已举例加以描述。
按照本发明细胞系HSR BM01被推荐为包装细胞系的首选细胞系。按照布达佩斯条约该细胞系已经于1995年9月12日被伯林格·曼海姆有限公司(Boehringer Mannheim GmbH)保藏在德国微生物和细胞培养物保藏有限公司(″Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH″(DSM))，Mascheroder Weg lb，38124 Braunschweig，保藏号为No.DSM ACC 2235。
本发明的另一个主题是关于制备如本发明所述的双嗜性逆转录病毒的包装细胞系的方法。
一种双嗜性分离基因组逆转录病毒包装细胞系可以，例如，由Markowitz等，Virology 167(1988)400-406所述方法来生产。其中使用两个质粒，其编码所谓的f辅助序列(gag，pol及env)。
为了选择如本发明所述的细胞系，必须确定env及gag/pol整合子的数量。通过使用不切割gag/pol序列或者env序列的限制性酶消化基因组DNA并确定含有特异性的gag/pol序列或者env序列的片断数目可以很方便地来实现这一点。
本发明，其保护范围来自于权利要求书，可以通过下述实施例及出版物进一步来阐明。所述方法只是举例说明，经修改后依然描述本发明的主题内容。
实施例1
辅助质粒的构建
Gag/pol辅助质粒的构建：
一种辅助质粒携有莫洛尼氏鼠白血病病毒(MoMULV)的病毒结构基因gag/pol，例如在MoMULV 5′LTR的调控下。这些结构基因gag/pol与5′LTR一起可以通过使用限制性切割MoMULV的前病毒DNA来获得。在这个过程中，出于安全考虑最重要的是使所谓的包装序列Ψ失活。这个可以通过例如所述的在限制性切割的帮助下进行缺失来实现。而且对于在辅助质粒(其基因产物给予其对于选择性药剂霉酚酸的抗性)上获得一个可选择性的标记例如gpt基因是有很大的优越性的。霉酚酸抗性允许已含有目标质粒(gag/pol辅助质粒)的菌落的快速选择。相应的一个辅助质粒的构建亦在Markowitz等，J.Virol.62(1988)1120-1124中举例描述。Env辅助质粒的构建：
另外一个辅助质粒携有双嗜性鼠白血病病毒克隆4070A(4070A)(Chattopadhyay等，J.Virol.39(1981)777-791)的病毒结构基因env，例如，在MoMULV 5′LTR的调控下。对此一个含有env基因及3′端受体拼接位点的4070A前病毒DNA片断被分离。该片断被克隆进入一个含有MoMULV 5’LTR及5′供体拼接位点的质粒。一种相应的辅助质粒已被Markowitz et al在病毒学167(1988)400-406举例描述。
实施例2
辅助结构的转化
Gag/pol辅助质粒的转移：
NIH 3T3细胞(ATCC No.CRL 1658)作为示例首先用gag/pol辅助质粒进行转染。例如，可通过使用电穿孔技术进行。已转染的细胞可以通过合适的选择性培养基进行分离，因为gpt基因出现在gag/pol质粒上。一个合适的选择性培养基含有如次黄嘌呤(15μg/ml)，黄嘌呤(250μg/ml)及霉酚酸(25μg/ml)(HXM培养基)。如Markowitz等，J.Virol.62(1988)1120-1124所述，抗性克隆可以随后因反转录酶(RT)的表达而被鉴别。选择一个有着显著表达程度的克隆，随后用env辅助质粒进行转染。
Env辅助质粒的转移：
随后，env辅助质粒可以通过电穿孔转染进入到gag/pol转染的，具有高反转录酶活性的霉酚酸抗性菌落中。为了成功且简便地识别已成功转染的细胞，使用一个含有抗性基因的质粒与辅助质粒一起转染具有很大的优越性。其可以是这样一个质粒，其对潮霉素具有抗性，如质粒pRSHhyg(Murphy，A.J.(1987)博士论文，哥伦比亚大学，美国)。已成功转染的菌落可以通过合适的选择性培养基简便地进行选择。这样的培养基例如含有200μg/ml潮霉素B。潮霉素抗性克隆可以随后使用env抗血清在放射性免疫沉降技术的帮助下检测env的表达，如Markowitz等，Virology 167(1988)400-406所述。
实施例3
双嗜性逆转录病毒包装细胞系的选择
整合进基因组中去的env辅助质粒的复制数量被作为一个参数对包装细胞系的亚克隆进行选择。Martinez及Dornburg，在病毒学杂志208(1995)234-241证实，与gag/pol比较，更高表达的env对于病毒效价没有影响；具有较高的gag/pol而不是较高的env表达的克隆的效价与发现的感染效率相关。这对于下述论断是一个基础，其为gag/pol与env基因产物的比例可能对于包装细胞系的效率至为重要，可能具有较低env表达的包装细胞系将导致病毒上清液具有很高的转导效率。
Env整合子数量的确定：
整合进分别检测的克隆的基因组中去的env辅助质粒的复制数量可以通过限制性切割及Southern blot分析进行确定。为此，将基因组DNA从多种亚克隆中进行分离且用限制性酶如PstI进行消化。该酶并不切割env序列且在整个质粒序列中仅切割一次。因为导致不同限制性片断的每一相应的二次切割位点在基因组上是随意分布的，用这种方法可确定env整合子的数量。
将已消化的DNA通过琼脂糖凝胶分离并通过毛细管迁移的方法转移到一个尼龙膜上。含有env特异性序列的片断可以通过env特异性的，毛毒黄地苷探针进行检测。其结果发现了含有不同env整合子数量的亚克隆。例如，对于包装细胞系GP+env Aml2来说用限制性酶PstI消化后所获得的片断大小为17.5kb，13.3kb及3.4kb，而对于包装细胞系HSR BM01来说为13.3kb及3.4kb。
实施例4
具有不同env整合子数目的病毒生产细胞系的制备
为了制备病毒生产细胞系(producer lines)，每一亚克隆或用两个(HSRBM01)或用三个(GP+env Aml2)含有逆转录病毒构建体pL1的env整合子来进行转染。构建体pL1携有截短形式的编码人类低亲和力的神经生长因子受体(hΔLNGFR(其依照WO 95/06723类似的方法进行生产))的cDNA，其中细胞质区域被删除且在病毒5’LTR的调控下。hΔLNGFR cDNA的基因产物，一种膜蛋白，可以通过hΔLNGFR特异的单克隆抗体(mAb)在细胞中检测到。生产病毒的克隆借助于免疫荧光及流体血细胞计数技术从HSR BM01(HSRBM-L1)以及从GP+env Aml2(克隆C11-C4)分离。
含有不同数量的env整合子的病毒生产细胞系上清液效价的确定：
指示细胞(NIH/3T3；ATCC No.CRL 1658)用含有来自两个克隆HSRBM-L1或C11-C4的含有病毒颗粒的上清液来转化。一个基于抗hΔLNGFR单克隆抗体的细胞化学染色方法可确定编码逆转录病毒的hΔLNGFR的菌落形成单元(效价)的数量。而基于包装细胞系GP+env Aml2的生产细胞系C11-C4(3个env复制子)的上清液具有6.3×105菌落形成单元的病毒滴度，而基于包装细胞系HSR BM01的生产细胞系HSRBM-L1(2个env复制子)的上清液具有1.25×107菌落形成单元的病毒滴度。
实施例5
使用含有相同的逆转录病毒载体的两个不同的生产细胞系的上清液来转导不同的细胞系
在正常细胞培养条件下，将细胞系Jurkat，MOLT4，Raji及K 562培养在RPMI/10％FCS中，且以3-9×105细胞/毫升的细胞密度来转导。在正常细胞培养条件下，含有相同的逆转录病毒载体的不同的生产细胞系被培养在DMEM/10％FCS中。将这些细胞在1×104细胞/cm2接种。经过三天培养，丢弃上清液，再加入新鲜的培养基。24小时后收集上清液。用0.22μm的滤膜进行过滤上清液。确定不同上清液的病毒滴度，并进行调整，是相同体积中含有相同的病毒颗粒。用NIH3T3作为靶细胞的免疫染色滴定的方法确定逆转录病毒上清液的病毒滴度。
转导
方案1：
将5×105个细胞悬浮在1ml的逆转录病毒上清液中。转导在一个24孔模板上进行。经过离心(1000g，30℃，90分钟)清洗细胞并重悬浮在1ml新鲜的细胞培养基中。然后将细胞过夜培养。加入1ml新鲜的细胞培养基。转导后3天收集细胞，用FITC-标记的抗LNGFR抗体染色。表达LNGPR的细胞的百分数通过流体细胞计数的方法进行确定。在此过程中用碘化丙锭染色的方式从分析液中排除死亡细胞。使用PACScan设备进行流体细胞计数分析。
方案2：
方案2的步骤按照方案1来进行，但不用离心。在37℃将细胞与逆转录病毒上清液一起培养2小时。
表1显示的是按照方案1转导后3天不同细胞系LNGFR的表达。
表2显示的是按照方案2转导后3天不同细胞系LNGFR的表达。
                     表1
转导后3天(离心方法)LNGFR呈阳性的细胞的百分数
    HSRBM01(HSRBM-L1)     GP+envAml2(克隆C11-C4)
    K562     88.81     12.79
    MOLT4     53.64     3.52
    RAJI     25.31     8.83
    JURKAT     44.36     3.96
                     表2
转导后3天(温浴方法)LNGFR呈阳性的细胞的百分数
    HSRBM01(HSRBM-L1)     GP+envAml2(克隆C11-C4)
    K562      68.69     8.24
    MOLT4      37.86     2.68
    RAJI      6.72     3.01
    JURKAT      23.91     4.64
参考文献
Bosselman等，Mol.Cell Biol.7(1987)1797-1804
Chattopadhyay等，J.Virol.39(1981)777-791
Cone and Mulligan，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 81(1994)6349-6353
Dougherty等，J.Virol.63(1989)3209-3212
Handbuch der molekularen Medizin，Volume I，Ed.D.Ganten and K.
Ruckpaul，Springer Verlag Heidelberg 1997，R.Ruger，Chapter 2.1，197-
241
Mann等，Cell 33(1983)153-156
Markowitz等，J.Virol.62(1988)1120-1124
Markowitz等，Virology 167(1988)400-406
Martinez and Dornburg，Virology 208(1995)234-241
Meyers等，Arch.Virol.119(1991)257-264
Miller and Buttimore，Mol.Cell Biol.6(1986)2895-2902
Miller等，Mol.Cell Biol.5(1985)431-437
Murphy，A.J.(1987)，Doctoral Thesis，Columbia University，USA

Claims (5)

1.双嗜性逆转录病毒包装细胞系，每个包装细胞含有正好一个功能性gag基因，正好一个功能性pol基因及正好两个功能性env基因，该基因以gag及pol基因的表达的调节独立于env基因的表达的方式被整合入基因组，并且当包装一个逆转录病毒载体时，通过该包装细胞系得到至少107集落形成单位/每毫升细胞培养上清液的滴度。
2.双嗜性逆转录病毒包装细胞系的制备方法，其包括将含有一种选择基因的env辅助质粒及含有一种选择基因的gag/pol辅助质粒转染进真核细胞中，基于该选择基因鉴别已转染的细胞并分离含有两个功能性活动的env基因的细胞。
3.包装细胞系DSM ACC 2235。
4.逆转录病毒载体的制备方法，其中将权利要求1所述的包装细胞系用一种载体基因组转染，该载体基因组含有一个或多个相对于该病毒的异源基因但不含有功能性活动的逆转录病毒结构基因，然后培养细胞系并从培养上清液中分离逆转录病毒载体。
5.通过权利要求4所述的方法得到的不可复制的逆转录病毒载体-病毒。
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