DE10109147A1

DE10109147A1 - Verpackungszelllinie für lentivirale Vektoren

Info

Publication number: DE10109147A1
Application number: DE2001109147
Authority: DE
Inventors: Valerie Bosch; Sandra Sparacio; Tanya Pfeiffer
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2001-02-26
Filing date: 2001-02-26
Publication date: 2002-10-02
Also published as: WO2002068625A2; AU2002250802A1; WO2002068625A3

Abstract

Beschrieben wird eine stabile Säuger-Verpackungszellinie für lentivirale Vektoren, die HIV-Gag/Pol-Partikel produziert und durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem eine Ausgangszellinie mit die drei HIV-Gene gag, pol und rev unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors enthaltenden Vektoren transfiziert wird, die transfizierten Zellen unter Selektionsbedingungen und in Gegenwart eines Inhibitors der HIV-Protease gezüchtet werden und schließlich solche Zellen selektiert werden, die eine hohe Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln zeigen. Ferner werden verschiedene Verwendungen dieser Verpackungszellinie beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Säuger-Verpac kungszellinie für lentivirale Vektoren, die HIV-Gag/Pol-Partikel produziert und durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem eine Ausgangszellinie mit die drei HIV-Gene gag, pol und rev unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors enthaltenden Vektoren transfiziert wird, die transfizierten Zellen unter Selektions bedingungen und in Gegenwart eines Inhibitors der HIV-Protease gezüchtet werden und schließlich solche Zellen selektiert wer den, die eine hohe Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln zeigen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung verschiedene Verwen dungen dieser Verpackungszellinie.

Es kann davon ausgegangen werden, daß die in den letzten Jahren entwickelten lentiviralen Vektoren gut in sich nicht teilende Zellen (die sich mittels den üblichen retroviralen Vektoren nicht transduzieren lassen) eingeschleust werden können und auch eine stabile Genexpression erlauben. Diese Eigenschaft ist bei einer Gentherapie von hoher Bedeutung, da viele Zielzellen in vivo differenziert sind, z. B. Zellen im Gehirn, oder sich nicht teilen, z. B. haemotopoeitische Stammzellen. Es werden zwar ge genwärtig eine Reihe von unterschiedlichen Lentiviren (und ande re komplexe Retroviren, die sich nicht teilende Zellen infizie ren können) als potentielle virale Vektoren untersucht, bisher basieren jedoch die am besten entwickelten lentiviralen Vektoren auf HIV-1. Dies hat seinen Grund darin, daß das Verständnis des komplexen Replikationszyklus von HIV-1 im Vergleich zu allen anderen möglichen Kandidaten bisher am weitesten fortgeschritten ist.

Zur klinischen Anwendung lentiviraler Vektoren benötigt man zur sicheren und reproduzierbaren Produktion dieser Vektoren de finierte stabile Zellinien. Allerdings stehen bisher keine Zellinien zur Verfügung, die alle erforderlichen bzw. gewünschten Kriterien (z. B. hinsichtlich Sicherheit, Stabilität, Partikelti ter, Möglichkeit der Pseudotypisierung) erfüllen. So gibt es zur Zeit nur Zellinien, die entweder nicht stabil sind oder das gesamte HIV-Genom beinhalten und somit verständlicherweise ein großes Sicherheitsrisiko darstellen oder Zellinien, die kein gerichtetes "Targeting" der verpackten Vektoren erlauben, da sie von Beginn an ein Glykoprotein stabil integriert haben, womit der Wirtstropismus des lentiviralen Vektorpartikels bereits festgelegt ist.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, eine stabile Verpackungszellinie zur Verpackung von lentiviralen Vektoren bereitzustellen, die HIV-Gag/Pol-Partikel nach Induktion in hoher Konzentration freisetzt, ein hohes Maß an Sicherheit aufweist und je nach Bedarf mit dem gewünschten lentiviralen Vektor und Glykoproteinen zur Festlegung des Wirt stropismus modifiziert werden kann.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereit stellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausfüh rungsformen erzielt. Es wurde überraschenderweise während den zu der vorliegenden Erfindung führenden Untersuchungen fest gestellt, daß bei Beachtung bestimmter Vorgehensweisen bei der Etablierung einer solchen Verpackungszellinie die gewünschten Eigenschaften erreicht werden können. Zur Erzeugung der erfin dungsgemäßen Verpackungszellinie wurden nacheinander HIV-rev bzw. HIV-gag/pol Genprodukte jeweils unter Kontrolle eines durch Ecdyson induzierbaren Promotors kodierende Plasmide in humane 293-Zellen eingeschleust. Über diese Vorgehensweise konnte eine stabile, subvirale Partikel in hohen Mengen induzierbar produ zierende Verpackungszellinie erhalten werden, was allerdings die ständige Anwesenheit eines spezifischen HIV-Protease-Inhibitors im Kulturmedium während der Selektion transduzierter Zellen zur Bedingung hatte. Die näher charakterisierte Zellinie mit der Bezeichnung 293-Rev/Gag/Pol_i setzt innerhalb eines Zeitraums von 48 Stunden nach Induktion hohe Mengen an HIV-Gag/Pol-Partikeln frei (bis zu 10 µg CA/ml). Diese HIV-Gag/Pol-Partikel konnten einen HIV-Vektor der dritten Generation verpacken und transduzieren, wobei hohe Titer erreicht wurden. Die erfindungsgemäße Zellinie stellt somit eine sehr flexible "Stamm"-Verpackungs zellinie dar, die nach Induktion HIV-1-ähnliche Partikel in hoher Konzentration produziert, ein sehr hohes Maß an Sicherheit bietet, da sie nur drei von insgesamt neun HIV-1-Genen stabil integriert hat und - in Abhängigkeit von den jeweiligen Erfor dernissen - weiter modifiziert werden kann, z. B. so daß sie noch einen spezifischen, ein Transgen kodierenden lentiviralen Vektor und ein oder mehrere Gene für "Targeting"-Glykoproteine enthält, somit die Festlegung eines gewünschten Wirtstropismus erlaubt.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine Säuger-Verpackungszellinie für lentivirale Vektoren, die HIV-Gag/Pol-Partikel produziert und durch ein folgende Schritte umfassendes Verfahren erhältlich ist:

a) Transfektion einer Ausgangszellinie mit (einem) die drei HIV-Gene gag, pol und rev unter Kontrolle eines induzier baren Promotors enthaltenden Vektor (oder Vektoren);
b) Züchtung der nach Schritt (a) erhaltenen Zellen unter Bedingungen, die eine Selektion transfizierter Zellen erlauben, und in Gegenwart eines Inhibitors der HIV-Protease; und
c) Selektion transfizierter Zellen mit hoher Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln, die zur Verpackung von lentiviralen Vektoren geeignet sind.

Der hier verwendete Ausdruck "Säuger-Verpackungszellinie" be zieht sich auf jede Zellinie, die prinzipiell zur Herstellung von HIV-Gag/Pol-Partikeln geeignet ist. Geeignete Zellen sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise ist die Zellinie eine humane Zellinie, z. B. 293, 293T, BJAB, HeLa, ECV, A204, HaCat, wobei die 293-Zellinie besonders bevorzugt ist.

Der hier verwendete Ausdruck "lentivirale Vektoren" bezieht sich auf jeden lentiviralen Vektor, vorzugsweise auf für die Gen therapie verwendete, von HIV abgeleitete Vektoren, z. B. pRRL.GFP.CCL (R. Zufferey, Universität Genf, Schweiz), pRRL.CMV.GFP.SIN18 (Dull et al. Journal of Virology 72 1998), 6463-6471) pHR. CMV.lacZ.SIN18 (Zufferey et al., Journal of Virology 72 (1998), 9873-9880).

Der hier verwendete Ausdruck "Transfektion" bezieht sich auf jedes Verfahren, mit dem DNA-Sequenzen in eine gewünschte Zelle eingeschleust werden können. Geeignete Verfahren sind dem Fach mann bekannt und z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) beschrieben. Zu diesen zäh len z. B. das Kalziumphosphat-Verfahren, Elektroporation, Lipo fektion, "Gene-Gun" etc.

Geeignete Vektoren für die Insertion und Expression der drei HIV-Gene gag, pol und rev sind dem Fachmann bekannt. Diese Vek toren sind Vektoren, die zu einer stabilen Integration der vor stehenden HIV-Gene in das Wirtsgenom und somit zur Erzeugung stabiler Zellinien führen und dazu zählen neben den in den nach stehenden Beispielen beschriebenen Vektoren auch pIND (Invitro gen, Groningen, Niederlande), pIND-Sp1 (Invitrogen, Groningen, Niederlande, pKEX (Rittner et al. Nucleic Acid. Res. 19 (1981), 1421-1426), pcDNA3 (Invitrogen, Groningen, Niederlande) sowie Vektoren, die eukaryotische Promotoren besitzen. Ausgangsquellen für die drei HIV-Gene gag, pol und rev sind dem Fachmann eben falls bekannt und auch in den nachstehenden Beispielen beschrie ben. Zur Herstellung der Expressionsvektoren von Schritt (a) kann der Fachmann nach üblichen in vitro-Rekombinationsverfah ren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., 1989 beschrieben sind, vorgehen.

Vorzugsweise enthält ein Vektor, vorzugsweise der die HIV-Gene gag und pol enthaltende Vektor, ein nicht mehr funktionsfähiges Verpackungssignal Ψ, was z. B. durch die Einführung einer Dele tion in vitro erreicht werden kann, und ferner das HIV "Rev/rev responsive element" (RRE), oder das CTE (constitutive transport element) von Mason-Pfizer-Virus (Bray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 1256-1260; Zolotukhin et al., Journal of Virology 68 (1994), 7944-7952).

Der Fachmann kennt geeignete Züchtungsverfahren und Medien, um Säugerzellen kultivieren zu können. Das Medium für die Züchtung kann jedes Medium sein, das üblicherweise für die Züchtung von Säugerzellen verwendet wird, z. B. IMEM, DMEM etc. Die Zellen werden in dem vorstehenden Medium unter geeigneten Bedingungen, gegebenenfalls unter (teilweiser) Erneuerung des Mediums in geeigneten Zeitabständen, gezüchtet. Geeignete Bedingungen, beispielsweise hinsichtlich geeigneten Behältern, Temperatur, relativer Luftfeuchte, O₂-Gehalt und CO₂-Gehalt der Gasphase sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise werden die Zellen in dem vorstehenden Medium unter den folgenden Bedingungen kultiviert:
(a) 37°C, (b) 100% rel. Luftfeuchte, (c) 10% O₂ und (d) 5% bis 7% CO₂.

Die Selektion transduzierter Zellen kann auf die übliche Weise erfolgen, vorzugsweise durch Zugabe eines Antibiotikums in ge eigneter Konzentration in das Züchtungsmedium, das nur den Zel len ein Wachstum erlaubt, die den das entsprechende Resistenzgen enthaltenden Vektor besitzen. Geeignete Antibiotika für die Selektion sind z. B. Hygromycin, Neomycin, Zeocin. Der Fachmann kennt Quellen für die entsprechenden Resistenz-verleihenden Gene.

Ein wesentliches Merkmal des Verfahrens zur Selektion von Ver packunsgzellinien mit den gewünschten Eigenschaften ist die Züchtung und Selektion zusätzlich in Gegenwart eines Inhibitors der HIV-Protease. Geeignete Inhibitoren sind im Handel erhält lich und dem Fachmann bekannt. Der Fachmann kann anhand ein facher Versuche die für eine Selektion optimale Konzentration des Inhibitors bestimmen.

Vorzugsweise ist der Inhibitor der HIV-Protease Saquinavir, wobei die Konzentration im Medium vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 µM, noch mehr bevorzugt im Bereich von 1 bis 2 µM liegt.

Zur Gewährleistung der Induzierbarkeit der Genexpression der HIV-Gene gag, pol und rev eignet sich im Prinzip jeder induzier bare, in Säugerzellen aktive Promotor, wobei vor allem hinsicht lich der Expression von rev bzw. gag, pol (HIV-Protease) solche Promotoren bevorzugt sind, bei denen die basale Expression (d. h. Expression unter nicht-induzierten Bedingungen) möglichst gering ist. Geeignete induzierbare Promotoren sind z. B. pIND (vgl. Invitrogen, supra), pIND-Sp1 (Invitrogen, supra), ptet, z. B. T- Rex-System (Invitrogen, Groningen, Niederlande), cre-lox System, lacSwitch II (Stratagene, LaJolla USA). Die induzierbaren Pro motoren können für die unterschiedlichen HIV-Gene unterschied lich sein, sind jedoch vorzugsweise die gleichen, was die Induk tion aller HIV-Gene mit einem einzigen Induktor erlaubt.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem induzierbaren Promotor um den durch das Insektenhormon Ecdyson oder ein Analoges, z. B. Ponasteron A, induzierbaren Promotor. Die Säugerzellinie, bei der zur Induktion der HIV-Genexpression dieser Promotor verwen det wird, enthält außerdem (durch Transfektion mit den entspre chenden Vektoren) die Proteinuntereinheiten VgEcR und RXR des modifizierten heterodimeren Rezeptors, die in Gegenwart von Ecdyson dimensieren und an das entsprechende Ecdyson-"responsive element" im Promotor binden, und für dessen Aktivierung ess entiell sind.

Vorzugsweise erfolgt die Transfektion auf eine solche Weise, daß die Ausgangszellen in Schritt (a) mit zwei Vektoren nacheinander transfiziert werden, wobei ein Vektor das HIV-Gen rev enthält, der andere Vektor die HIV-Gene gag und pol.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Säuger- Verpackungszellinie dadurch gekennzeichnet, daß sie von einer humanen Zellinie abgeleitet ist (vgl. supra), wobei 293-Zellen bevorzugt sind. Am meisten bevorzugt ist die Verpackungszellinie 293-Rev/Gag/Pol_i, die bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroor ganismen und Zellkulturen) unter DSM ACC2488 am 21. Dezember 2000 hinterlegt wurde.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Her stellung der erfindungsgemäßen Säuger-Verpackungszellinie, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Transfektion einer Ausgangszellinie mit (einem) die drei HIV-Gene gag, pol und rev unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors enthaltenden Vektor (oder Vektoren);
b) Züchtung der nach Schritt (a) erhaltenen Zellen unter Bedingungen, die eine Selektion transfizierter Zellen erlauben, und in Gegenwart eines Inhibitors der HIV-Protease; und
c) Selektion transfizierter Zellen mit hoher Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Her stellung von HIV-Gag/Pol-Partikeln, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist: (a) Züchtung der erfindungsgemäßen Säuger- Verpackungszellinie unter Promotor-induzierenden Bedingungen in Gegenwart von Natriumbutyrat; und (b) Gewinnung der HIV-Gag/Pol- Partikel aus dem Kulturüberstand. Zur Induktion der Expression ist der entsprechende Induktor in ausreichender Konzentration im Züchtungsmedium vorhanden und der Fachmann kann mittels ein facher Testreihen die geeignete Konzentration ermitteln. Im Fall des durch Ecdyson aktivierbaren Promotors liegt der Induktor Ponasteron A vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2,0 µM im Medium vor. Natriumbutyrat ist vorzugsweise zu Beginn der Induktion für 18 h im Medium vorhanden, vorzugsweise in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 50 mM, wobei eine Konzentration von etwa 5 mM besonders bevorzugt ist. Die Gewin nung der Partikel aus dem Kulturüberstand kann durch übliche Standardverfahren erfolgen, z. B. Zentrifugation, wie Dichte- und Geschwindigkeitszentrifugation mit geeigneten Trägermedien, die dem Fachmann bekannt sind, Filtration, PEG-Fällung, Affinität schromatographie. Vorzugsweise werden die HIV-Partikel, vor allem für eine Anwendung im klinischen Bereich noch weiter ge reinigt, beispielsweise über die vorstehenden Standardverfah ren, denen sich eine Dialyse anschließt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens sind die HIV-Gag/Pol-Partikel in einer Konzentration von bis zu 10 µg/ml (gemessen als CA) im Kulturüberstand vorhanden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Her stellung eines verpackten lentiviralen Vektors, dadurch gekenn zeichnet, daß man die erfindungsgemäße Säuger-Verpackungszelli nie mit dem gewünschten lentiviralen Vektor transfiziert und die in die HIV-Gag/Pol-Partikel verpackten lentiviralen Vektoren gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren gewinnt und gegebe nenfalls weiter reinigt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Säuger-Verpackungszellinie zur Herstellung von HIV-Gag/Pol-Partikeln oder von in HIV-Gag/Pol-Partikel verpackte lentivirale Vektoren. Vorzugsweise sind die HIV-Gag/Pol-Partikel weiter modifiziert, z. B. so, daß diese mit einem gewünschten viralen Glykoprotein zur Bestimmung des gewünschten Wirtstropis mus pseudotypisiert sind. Beispiele solcher Glykoproteine sind VSV-G, MuLV-Env, LEMV-Env, GALV-Env, Influenza-HA, HIV-Env, CD4 und entsprechende Korezeptoren.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Säuger-Verpackungszellinie zum Screenen nach Inhibitoren der HIV-Partikelbildung, z. B. HIV-Protease- Inhibitoren, RT-Hemmer etc. Geeignete Assayformate für das Screening sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise wird die Zellinie in geeigneten Mikrofilterplatten ausplattiert, bevor eine synchrone Induktion der Partikelproduktion und eine Zugabe der zu testenden Substanz(en) in verschiedenen Konzentrationen zu geeigneten Zeitpunkten erfolgen. Ferner erfolgt die Bestim mung eines Meßparameters, z. B. p24 (ELISA), RT-Assay, und/oder die Bestimmung der Zelltoxizität, z. B. Apoptose-Marker, Nekrose- Marker. Die über ein solches Verfahren identifizierbaren Inhibi toren sind insbesondere für die Therapie von HIV-Infektionen von herausragender Bedeutung.

Bei den in diesem Screening zu untersuchenden Testverbindungen kann es sich um sehr unterschiedliche Verbindungen handeln, sowohl um natürlich vorkommende als auch synthetische, organi sche und anorganische Verbindungen, sowie Polymere (z. B. Oligo peptide, Polypeptide, Oligonucleotide und Polynucleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und Nucleotid-Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen (z. B. Peptid-"Imitatoren", Nucleinsäureanaloge etc.) und zahl reiche weitere Verbindungen.

Darüber hinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise nützli chen Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können aus einer großen Anzahl von Quellen stammen, beispielsweise den Spezies Pilze, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflan zen und Bakterien. Die Extrakte, die Aktivität zeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls analysiert werden. Das Suchen nach Inhibitoren der HIV-Partikelbildung kann auch in großem Maßstab erfolgen, beispielsweise dadurch, daß eine sehr hohe Anzahl von Kandidaten-Verbindungen in Substanzbibliotheken gescreent wird, wobei die Substanzbibliotheken synthetische oder natürliche Moleküle enthalten können. Beispielsweise kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gege ben und gleichzeitig getestet werden. Wenn die Gegenwart einer Verbindung mit einer gewünschten inhibitorischen Aktivität ent deckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100 aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden, bis eine individuelle Verbindung identifiziert ist. Jedenfalls kön nen die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen beispielsweise mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden. Das erfindungsgemäße Screening kann auch als Screening mit hohem Durchsatz ("high throughput screening") stark beschleunigt wer den.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1: Expressionsschema, das die für die Erzeugung der stabi len, induzierbar HIV-Gag/Pol-Partikel produzierenden Zellinie zur Verpackung von HIV abgeleiteten verwendeten Vektoren zeigt
Promotoren sind als leere Balken dargestellt, kodierende Sequen zen als graue Balken und essentielle cis-Elemente (IRES, RRE) als schwarze Balken. Im Vektor pIND-Rev-IRES-Rev (nicht dar gestellt) wurde die Tat-Sequenz gegen eine weitere Rev-Sequenz ausgetauscht.

Fig. 2: Induzierbare Expression der regulatorischen HIV-Protei ne Rev und Tat in den stabilen Zellinien 293-Tat/Rev_i und 293- Rev_i

A) 293-Zellen (leere Säulen) wurden mit pNL4-3 transfiziert (Säule 1) oder dem für tat und rev defizienten proviralen Kon strukt pNL4-3tat^-/rev^- (Säule 2), 293-Tat/Rev_i-Zellen (gestreifte Säulen) oder 293-Rev_i-Zellen (graue Säulen) mit pNL4-3tat^-/rev^- (plus pCMVtat im Fall der 293-Rev_i-Zellen) und 48 Stunden in Abwesenheit (-) (Säulen 3,5) oder Gegenwart (+) (Säulen 4,6) von 1 µM Ponasteron A wie angegeben gezüchtet.
B) 293-Tat/Rev_i-Zellen (gestreifte Säulen) oder 293-Rev_i-Zellen (graue Säulen) wurden mit pIND(Sp1)-Δψgag/pol-RRE transfiziert und in Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) von 1 µM Ponasteron A gezüchtet. Die Freisetzung von HIV-Gag/pol-Partikeln in den Kulturüberstand wurde durch ELISA für CA (als pg/ml p24) quanti fiziert. Es ist zu beachten, daß aufgrund der relative geringen Effizienz der transienten Transfektion die Maximalmenge an ex primiertem CA hier geringer ist (im Bereich von 0,2 µg/ml) als in späteren Analysen.

Fig. 3: Induzierbare Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln in einer Zellinie, die durch stabile Transfektion von 293-Rev_i- Zellen mit pIND (Sp1)-Δψgag/pol-RRE in Abwesenheit von Saquinavir erhalten wurde

A) Indirekte Immunfluoreszenz-Analysen von Zellen nach 48 Stun den langer Züchtung in Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) von 1 µM Ponasteron A wie angegeben, bei denen Antikörper gegen HIV-CA verwendet wurden.
B) Die Mengen (in pg/ml) an HIV-Gag/Pol-Partikeln in den Medien nicht-induzierter (-) oder induzierter (+) Zellen wurden über ELISA für CA quantifiziert.
C) Westernblotanalysen von Zellysaten und von pelletierten Partikeln von Medien nicht-induzierter (-) und (+) induzierter Zellen unter Verwendung von Antikörpern gegen HIV-p24. Die Posi tionen der HIV-Gag-Proteine sind angegeben.

Fig. 4: Induzierbare Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln in 293-Rev/Gaa/Pol_i-Zellen

A) Indirekte Immunfluoreszenzanalysen von Zellen nach 48 Stun den langer Züchtung in Abwesenheit (-) oder Gegenwart (+) von 1 µM Ponasteron A wie angegeben unter Verwendung von Antikörpern gegen HIV-CA.
B) Gelektrophorese und Autoradiographie (keine Immunpräzipita tion) von metabolisch markierten HIV-Gag/Pol-Partikeln, die aus Kulturüberständen von nicht-induzierten (-) und induzierten (+) 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen abzentrifugiert wurden. Die Positionen der HIV-Gag/Pol-Proteine sind auf der linken Seite gezeigt und die Positionen der Molekulargewichtsmarker auf der rechten.

Fig. 5: HIV-Gag/Pol-Partikelproduktion und Zellwachstum von nicht-induzierten und induzierten 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen, die für verschieden lange Zeiträume in Kultur gehalten wurden
Aus 2 × 10⁵ 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen bestehende Kulturen wurden entweder kurz nach Auftauen (eine Woche) (schwarze Säulen) oder nach Haltung in Kultur über einen Zeitraum von 6 Wochen im An schluß an das Auftauen (offene Säulen) in Gegenwart (+/) oder Abwesenheit (-/) von 2 µM Ponasteron A plattiert. 24 Stunden später wurden die angegebenen Kulturen 18 Stunden mit 5 mM Na triumbutyrat wie angegeben behandelt (/+) oder nicht (/-). Nach der Natriumbutyrat-Behandlung wurden bei allen Kulturen das Medium gegen frisches Medium (mit oder ohne Ponasteron A) ausge tauscht. 48 Stunden später wurde dann die Menge an HIV-Gag/Pol- Partikeln in den Medien über ELISA für CA quantifiziert, die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Kulturen gezählt und der Prozessierungsstatus der exprimierten HIV-Gag-Proteine in den Zellysaten und Kulturüberständen mittels Westernblots analy siert.

A) Mengen an p24 in den Medien der angegebenen Kulturen in ng/ml (die entsprechenden Mengen sind über jeder Säule angege ben).
B) Zellzahl in den entsprechenden Kulturen. (Die entsprechende Zellzahl × 10⁴ ist über jeder Säule angegeben.) Die horizontale Linie gibt die Zelldichte bei Ausplattierung (2 × 10⁵ Zellen) an.
C) Westernblot-Analysen von Zellysaten (linke Abbildung) und Kulturüberständen (rechte Abbildung) der Kulturen 1, 2 und 3 mittels Antikörpern gegen HIV-p24.

Fig. 6: Auswirkung der Konzentration von Ponasteron A und der Induktionszeit auf die Menge an von 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen freigesetzten HIV-Gag/Pol_i-Partikeln

A) 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen wurden mit den angegebenen Konzen trationen an Ponasteron A in Abwesenheit (schwarze Rauten) oder Gegenwart (schwarze Quadrate) einer zusätzlichen Behandlung mit 5 mM Natriumbutyrat (während der ersten 18 Stunden der Induk tion) induziert. Die Mengen an p24 in den Kulturüberständen wurden über ELISA entweder zwei Tage noch Induktion (schwarze Rauten) oder zwei Tage nach Behandlung mit Natriumbutyrat (schwarze Quadrate) quantifiziert.
B) 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen wurden mit 1 µM Ponasteron A (offene Säulen) induziert oder mit 2 µM Ponasteron A unter gleichzeiti ger Behandlung mit 5 µM Natriumbutyrat für 18 Stunden (schwarze Säulen). Im letzteren Fall wurde das Medium gegen frisches Medi um ausgetauscht, das 2 µM Ponasteron A enthielt jedoch kein Natriumbutyrat. Im Anschluß daran wurden Aliquots des Kultur überstands in täglichen Intervallen gesammelt und die Mengen an freigesetzten HIV-Gag/Pol-Partikeln über ELISA für CA quantifi ziert.

Fig. 7: FACS-Analyse von HeLa-Zellen, die mit dem GFP exprimie renden Vektor pRRL-eGFP transduziert worden waren, der in HIV- Gag/Pol-Partikel verpackt und mit dem VSV-G pseudotypisiert worden war, die von induzierten 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen produ ziert worden waren
293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen wurden mit pMD.G und pRRL-eGFP transient transfiziert und vier Stunden später 16 Stunden lang mit 2 µM Ponasteron A und 5 mM Natriumbutyrat behandelt. Danach wurde das Medium gegen neues Medium ausgetauscht, das 2 µM Ponasteron A enthielt jedoch kein Natriumbutyrat. 24 Stunden später wurde das Medium zu einer definierten Anzahl von HeLa-Zellen in Gegenwart von 8 µg/ml Polybren gegeben. 48 Stunden später wurden nicht- transduzierte und transduzierte HeLa-Zellen hinsichtlich der GFP-Expression mittels FACS analysiert. In den Kontrollzellen (leerer Peak) zeigten nur 0,19% der Zellen innerhalb des angege benen Bereichs Fluoreszenz. Der graue Peak gibt das Fluoreszenz profil an, das nach Transduktion von 1,3 × 10⁵ HeLa-Zellen mit einem Milliliter Medium von induzierten und transfizierten 293- Rev/Gag/Pol_i-Zellen erhalten wurde.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Allgemeine Verfahren (A) Expressionskonstrukte

pIND(Sp1)-ΔΨgag/pol-RRE basiert auf dem Vektor pIND(Sp1)/Hygro (Invitrogen, Groningen, Niederlande), bei dem die Genexpression durch Ponasteron A, ein Analogon des Insektenhormons Ecdyson, induzierbar ist. pIND(Sp1)/Hygro kodiert außerdem für Hygromy cinresistenz. Ein Gag und Pol kodierendes BssHII-Nde-Fragment von pNL4-3 (Adachi et al., J. Virol. 59 (1986), 284-291) (Nukleo tide 711 bis 5122) wurde stromabwärts des induzierbaren Pro motors pIND(Sp1)/Hygro kloniert. Über PCR wurde eine Deletion von 37 bp (Richardson et al., J. Gen. Virol. 76 (1995), 691-696) (Nukleotide 749 bis 785 (pNL4-3) innerhalb des 5'-Verpackungs signals Ψ erzeugt, von der bekannt ist, daß sie die RNA-Verpac kung hemmt. Folgende Primersequenzen wurden verwendet:
A(722)AG ACT CGA GGG CGG CGA CTG GTG
AG(748)ΔΨA(786)GA GAT GGG TGC GAG AGC GT(805).

Die Sequenz des "rev-responsible" Element (RRE) von Stamm BH10 (Ratner et al., Nature 313 (1985), 277-284) wurde aus pK-R-gpII (Mergener et al., Virology 186 (1992), 25-39) ausgeschnitten und stromabwärts der gag- und pol-Gene inseriert.

Die induzierbaren Vektoren pIND-Tat-IRES-Rev und pIND-Rev-IRES- Rev basieren auf dem Vektor pIND (Invitrogen, Groningen, Nieder lande). Das Plasmid pIND kodiert außerdem Neomycin-Resistenz. Im ersten Schritt wurde eine die interne Ribosomenbindungsstelle (IRES) vom 5'-Ende des Encephalomyocarditis-Virus(EMCV)-Genoms kodierende DNA-Sequenz aus pEMC-F (Morgan et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 1293-1299) exzisiert und als EcoRI-NcoI-Fragment in einen Bluescript-Vektor (Stratagene, LaJolla, USA) inseriert. Die Sequenzen der tat- und rev-Gene wurden von Plasmid pUHctat- crev (Schaal et al., Gene 124 (1993), 275-280) amplifiziert, bei dem das tat/rev-Intron (SD4-SA7) deletiert ist. Die verwendeten Oligonukleotide trugen flankierende Sequenzen für passende Klo nierungsrestriktionsenzyme. Das stromaufwärts gelegene Gen trug eine 5'-SmaI-Stelle und stromabwärts eine EcoRI-Stelle und das stromabwärts gelegene Gen eine stromaufwärts gelegene NcoI-Stel le, die das Initiationscodon ATG umspannt, und stromabwärts eine XhoI-Stelle. Das Nukleotid direkt stromabwärts des Initiations- ATG ist in rev G so, daß zur Erzeugung der NcoI-Stelle (CCATGG) keine Veränderungen nötig waren. Folgende Primer wurden verwen det:

Nach getrennter Insertion der tat- und rev-Gene in unmittelbarer Nachbarschaft zu der EMCV-IRES wurde die gesamte Kassette mit SmaI und XhoI exzisiert und in das mit den gleichen Enzymen geschnittene Plasmid pIND inseriert, wobei der Vektor pIND-Tat- IRES-Rev erhalten wurde. Der Vektor pIND-Rev-IRES-Rev wurde aus pIND-Tat-IRES-Rev durch Austausch der ctat-Sequenz gegen eine crev-Sequenz (ebenfalls mit flankierenden SmaI- und EcoRI-Stel len) erzeugt. Außerdem wurden zur Erzielung einer besseren Translationsinitiation der rev-mRNA in pIND-Rev-IRES-Rev die Nukleotide stromaufwärts des rev-ATG in der stromaufwärts gele genen rev-Sequenz durch die stromaufwärts des tat-ATG gelegenen ersetzt (d. h. AGAAATG anstelle von TCCTATG).

(B) Zellinien und Transfektionen

293- und 293T-Zellen wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum gezüchtet und mittels des Standard-Kalziumphosphat-Verfahrens transfiziert. Vier Stunden nach Transfektion (p. t.) wurden die transfizierten Zellen mit frischem Medium versorgt, das, falls erforderlich, Ponasteron A (Invitrogen, Groningen, Niederlande) enthielt. Falls erforderlich wurde die relative Transfektionseffizienz durch Cotransfektion mit einem üblichen Luciferase-Expressions plasmid pCMV-luci transfiziert und die Luziferaseaktivität gemäß Standardverfahren in Zellysaten analysiert. Zur Erzeugung stabi ler Zellinien wurden die Plasmide in 293-Zellen transfiziert und die transfizierten Zellen zwei Tage p. t. in die zytotoxische Mindestkonzentration des entsprechenden Selektionsantibiotikums bei einer Dichte von 100 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert. Zwei Wochen nach Selektion wurden indi viduelle antibiotikumresistente Zellklone expandiert und die Genexpression wurde analysiert. Für die Erzeugung von Zellinien mit stabil integrierten Kopien der die HIV-Protease kodierenden gag- und pol-Gene wurde der HIV-Proteaseinhibitor Saquinavir (Hoffmann La-Roche, Basel, Schweiz) zu dem Medium zu einer Kon zentration von 1,5 µM zugegeben. Dieser war während der Selek tion und der Züchtung der Zellen ständig anwesend, wurde jedoch bei der Induktion der Genexpression durch Ponasteron A entfernt. Zur Stimulierung der induzierbaren Genexpression in stabilen Zellinien wurden 5 mM Natriumbutyrat zu dem Kulturmedium entwe der gleichzeitig mit oder kurz nach der Zugabe von Ponasteron A zugegeben. Nach Inkubation ü. N. (etwa 16 Stunden) wurde das Medium wie beschrieben (Soneoka et al., Nucleic Acids Res. 23 (1995), 628-633) gegen frisches Medium ausgetauscht, das Pona steron A enthielt, jedoch kein Natriumbutyrat.

(C) Analyse der Genexpression

Die Expression der Proteinuntereinheiten des für die Expression von pIND-Promotoren erforderlichen modifizierten heterodimeren Rezeptors (VgEcR und RXR) wurde indirekt durch Transfektion mit pIND/lacZ (Invitrogen) und Färbung transfizierter Zellen hin sichtlich β-Galaktosidase 48 Stunden p. t. mittels Standardver fahren analysiert. Die Expression und Freisetzung von HIV- Gag/Pol-Partikeln wurde mittels verschiedener Techniken unter sucht. Transfizierte, auf Glasdeckplättchen gezüchtete Zellen wurden einer indirekten Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung des Überstands der Hybridomzellen 183-H12-5G (Chesebro et al., J. Virol. 66 (1992), 6547-6554), die monoklonalen, einen mit HIV- 1 p24 (CA) reaktiven Maus-Antikörper freisetzen, und fluores zenzmarkiertem anti-Maus-IgG wie in Krausslich et al. (Virology 192 (1993), 605-617) beschrieben unterzogen. Die Quantifizierung der Menge an Partikeln in Zellkulturüberständen erfolgte mittels ELISA für CA (Innogenetics, Ghent, Belgien). HIV-Gag/Pol-Parti kel enthaltende Medium wurden durch Filtration über ein 0,45 µm Filter geklärt und die HIV-Gag/Pol-Partikel über Zentrifugation durch ein 32% Saccharosekissen (3 Stunden, 200.000 × g, 4°C) konzentriert. Lysate transfizierter Zellen, unzentrifugierter Kulturüberstände, von denen die Zellen durch Zentrifugation entfernt worden waren, oder von pelletierten HIV-Gag/Pol-Parti keln wurden einer Westernblot-Analyse entsprechend dem Protokoll von Schaal et al., J. Virol. 69 (1995), 3308-3314, unterzogen, bei dem Zellkulturüberstände von 183-H12-5C-Hybridomzellen ver wendet wurden. Für die Präparation von radioaktiv markierten HIV-Gag/Pol-Partikeln wurden die Zellen 24 bis 48 Stunden nach Induktion mit 75 µCi/ml ³⁵S-Methionin, ³⁵S-Cystein (Pro-mix; Amersham, Braunschweig, Deutschland) metabolisch markiert. HIV- Ga/Pol-Partikel wurden wie vorstehend beschrieben pelletiert, direkt einer PAGE unterzogen und die Banden über Autoradiogra phie sichtbar gemacht.

(D) Transduktionsanalysen

Die Fähigkeit der HIV-Gag/Pol-Partikel zur Vermittlung der Transduktion eines von einem HIV-Vektor kodierten Transgens wurde mittels pRRL-eGFP (Dull et al., J. Virol. 73 (1998), 8463- 8471) analysiert. 293T-Zellen wurden mit pRRL-eGFP, VSV-G kodie rendem pMD.G (Naldini et al., Science 272 (1996), 263-267) und den zu analysierenden Expressionsplasmiden gemeinsam transfi ziert und, entsprechend den Untersuchungsbedingungen, mit Pona steron A induziert. Alternativ dazu wurden stabile, induzierbar HIV-Gag/Pol-Partikel exprimierende Zellinien mit pRRL-eGFP und pMD.G transient transfiziert, mit 2 µM Ponasteron A induziert und 18 Stunden mit 5 mM Natriumbutyrat behandelt (Soneoka et al., Nucleic Acids Res. 23 (1995), 628-633). Danach wurde das Medium mit frischem Medium erneuert, das zwar Ponasteron A ent hielt, jedoch kein Natriumbutyrat, und die Inkubation wurde 24 Stunden fortgesetzt. Potentiell transduzierende Vektorpartikel enthaltende Kulturüberstände wurden über ein 0,45 µm Filter filtriert, auf 8 µg/ml Polybren eingestellt und zu einer de finierten Anzahl von frischen 293T- oder HeLa-Zellen gegeben. Zwei bis drei Tage später wurde der Prozentsatz an GFP exprimie renden Zellen über Durchflußzytometrie-Analyse (FACS) bestimmt und der Titer an infektiösen Einheiten (IE) pro ml berechnet.

Beispiel 2 Herstellung induzierbarer Expressionskonstrukte

Die Experimente dieses Beispiels dienten zur Identifizierung optimaler Vektoren für die induzierbare Expression von Genpro dukten, die für die Herstellung der geplanten stabilen HIV-Par tikel produzierenden Zellinie erforderlich waren. Ein hoher Expressionsspiegel nach Induktion ist zur Erzielung hoher Vek tortiter aus der Verpackungszellinie essentiell, wobei jedoch die Kopplung mit geringer Basalexpression genauso wichtig ist. Nach ausführlichen vergleichenden Analysen der Partikelexpres sion von verschiedenen induzierbaren, das gleiche Gag/Pol/RRE kodierende DNA-Fragment enthaltenden Vektoren fiel die Entschei dung auf das Ecdyson-induzierbare Expressionssystem (Invitrogen, Niederlande). In einem transienten Transfektionsassay, bei dem die Expression des Gag/Pol/RRE kodierenden DNA-Fragments unter der Kontrolle des Ecdyson-induzierbaren Promotors in dem Vektor pIND (Invitrogen) war, war die Expression der zwei Transakti vator-Untereinheiten VgEcR und RXR von pVgRXR und die HIV-Rev- Expression konstitutiv von pNLA-1 (Strebel et al., Science 241 (1988), 1221-1223). Die Expression von HIV-Partikeln in Gegen wart des Ectyson-Analogen Ponasteron A bei einer Konzentration von 1 µM war hoch und betrug im Durchschnitt 50% im Vergleich zu der, die nach Transfektion des proviralen Plasmids pNL-4-3 er halten wurde. Die Basalexpression war immer 1000fach niedriger, jedoch nachweisbar.

Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde dann der modifizierte HIV-Gag/Pol-Partikel-Expressionsvektor pIND(Sp1)-ΔΨgag/pol-RRE entworfen, der zur Erzeugung einer stabilen HIV-Partikel produ zierenden Zellinie verwendet wurde (siehe Fig. 1, die das Ex pressionsschema und die Vektoren schematisch zeigt). Die HIV- Sequenzen wurden in das modifizierte Expressionskonstrukt pIND(Sp1)/Hygro (Invitrogen) inseriert, bei dem drei Kopien der Sp1-Enhancersequenzen innerhalb der Ecdyson-abhängigen Enhan cer/Promotor-Sequenz vorhanden sind. Wie bereits vorstehend erwähnt war die basale HIV-Expression von dem Ectysonsystem zwar gering, jedoch in transienten Assays, bei denen die HIV-Rev- Expression konstitutiv war, nachweisbar. Es wurde daher davon ausgegangen, daß die basale Expression dadurch weiter reduziert werden könnte, daß die für den Transport der gag/pol-RRE-Trans kripte in das Zytoplasma erforderliche HIV-Rev-Expression eben falls induzierbar ist. Es wurden daher - wieder auf dem Ectyson system basierend - zwei induzierbare Expressionskonstrukte für Tat plus Rev bzw. Rev allein erzeugt. Der Vektor pIND-Tat-IRES- Rev (Fig. 1) wurde mit dem Ziel der Verpackung Tat-abhängiger, von HIV abgeleiteten Vektoren (Vektoren der ersten und zweiten Generation) erzeugt. In diesem Vektor werden Tat und Rev von cDNA-Sequenzen kodiert, die von dem HIV-Stamm pNL-4-3 (Schaal et al., Gene 124 (275-280) stammen, wobei die Translation des stromabwärts gelegenen rev-Gens-Transkripts durch die Gegenwart der EMCV-IRES-Sequenz ermöglicht wird. Das Plasmid Rev-IRES-Rev wurde aus pIND-Tat-IRES-Rev durch Austausch der stromabwärts gelegenen ctat-Sequenz durch eine zweite Kopie von crev erhal ten.

Beispiel 3 Erzeugung von für Tat/Rev bzw. Rev induzierbaren Zellinien

293-Zellen wurden deshalb als Empfängerzellen zur Erzeugung stabiler Zellinien gewählt, da sie leicht transfizierbar und humaner Abstammung sind. Es ist günstig, daß die retroviralen Vektorpartikel für die beabsichtigte klinische Anwendung in vivo in humanen Zellen erzeugt werden, da dadurch die mögliche In aktivierung der Infektivität der Vektorpartikel durch Immunant worten oder das Komplementsystem vermieden wird. Die erforderlichen Plasmide wurden nacheinander eingeführt, da dies einerseits die Möglichkeit der Rekombination zwischen gleichzeitig trans fizierten Vektor-DNAs verringert, andererseits für eine weitere Modifizierung die Selektion von Zellklonen mit der höchsten Expression des eingeführten Gens erlaubt. Zuerst wurde pVgRXR, der beide für die Expression des modifizierten heterodimeren Rezeptors von pIND-Vektoren erforderlichen Proteinunterein heiten(VgEcR und RXR) kodiert, in 293-Zellen transfiziert und Zeocin-resistente Zellklone wurden expandiert. Die Expression von pVgRXR wurde durch Transfektion von pIND/LacZ in potentielle positive Zellklone und darauffolgende Anfärbung hinsichtlich β- Galaktosidase indirekt analysiert. Die Transfektion der selek tierten Zellinie (mit der Bezeichnung 293-EcR) mit pIND/LacZ führte zur gleichen Anzahl an β-Galaktosidas-positiven Zellen wie dies nach Cotransfektion von pVgRXR und pIND/LacZ in normale 293-Zellen beobachtet wurde, was die Transfektionseffizienz repräsentiert. Im nächsten Schritt wurden entweder pIND-Tat- IRES-Rev oder pIND-Rev-IRES-Rev in 293-EcR-Zellen transfiziert und Neomycin-resistente Zellklone expandiert. Die HIV-Expression wurde indirekt durch Quantifizieren der HIV-Partikelexpression und Freisetzung nach Transfektion von Rev-abhängigen HIV-Parti kelexpressionsplasmiden in Kandidaten-Zelklone und Induktion mit Ponasteron A analysiert. Fig. 2 zeigt die mit den ausgewählten Zellinien (mit der Bezeichnung Tat/Rev_i, Tat und Rev induzierbar exprimierend, bzw. 293-Rev_i, Rev induzierbar exprimierend) erhal tenen Ergebnisse. Zuerst wurde der für Tat und Rev defekte pro virale Expressionsvektor pNL4-3tat^-/rev^- verwendet. Nach Trans fektion dieses Konstrukts in normale Zellen war die Freisetzung von HIV-Partikeln äußerst gering und manchmal nicht nachweisbar (Fig. 2A). pNL4-3tat^-/rev^- wurde transient in 293-Tat/Rev_i-Zel len oder 293-Rev_i-Zellen (in diesem Fall zusammen mit pCMV-Tat) transfiziert und zwei Tage p. t. wurde die Menge an freigesetzten HIV-Partikeln durch ELISA (für CA) quantifiziert. Wie in Fig. 2A gezeigt waren die HIV-Partikelexpression und Freisetzung sowohl von 293-Tat/Rev_i-Zellen als auch 293-Rev_i-Zellen in Gegen wart von Ponasteron A äquivalent zu denen, die nach Transfektion des proviralen Wildtypvektors pNL4-3 in parentale 293-Zellen erhalten wurden. Dies bedeutet, daß eine zur vollen Komplemen tierung des für Rev und Tat defizienten pNL4-3tat^-/rev^--Plasmids ausreichende Menge an Rev (und im Fall der 293-Tat/Rev_i-Zellen auch ausreichend Tat) in den 293-Tat/Rev_i-Zellen oder 293-Rev_i- Zellen synthetisiert worden war. In Abwesenheit von Ponasteron A konnte eine im Vergleich zu der nach Induktion erhaltenen Ex pression 100- bis 200fach geringere Basalexpression von Parti keln nachgewiesen werden. Um analysieren zu können ob diese Basalaktivität dadurch reduziert werden könnte, daß das HIV- Partikel-Expressionsplasmid auch induzierbar ist, wurde in einem zweiten Experiment pIND(Sp1)-ΔΨgag/pol-RRE in 293- Tat/Rev_i-Zellen und 293-Rev_i-Zellen transient transfiziert. Die Menge der nach Züchtung ohne oder mit Zugabe von Ponasteron A freigesetzten HIV-Partikel wurde quantifiziert. Nach Induktion war die Partikelfreisetzung wieder so hoch wie nach Transfektion von Wildtyp-pNL4-3 in normale 293-Zellen (Fig. 2B). In Abwesen heit von Ponasteron A konnte jedoch überhaupt keine Basalexpres sion nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze des verwendeten ELISA-Assays lag bei einer Konzentration von etwa 6 pg p24/ml, was bedeutet, daß die Induktion der Expression über einen Be reich von 10⁵ induzierbar ist. Dies ist ein starker Hinweis darauf, daß diese Vorgehensweise (Doppelinduktion, d. h. bei der sowohl die Rev- als auch Gag/Pol-Expression exprimierbar ist) zur Verringerung des basalen Expressionspiegels beiträgt.

Beispiel 4 Erzeugung von HIV-Gag/Pol-Partikel induzierbar ex primierenden Zellinien

293-Tat/Rev_i-Zellen und 293-Rev_i-Zellen stellen optimale "Stamm"- Zellen zur Einführung weiterer in einer Verpackungszellinie für von HIV stammende Vektoren erforderlichen Komponenten dar. Es wurden daher zur Erzeugung einer Zellinie zur Verpackung Tat unabhängiger Vektoren mit einer maximalen Sicherheitsstufe (Vek toren der dritten Generation, die in der Verpackungszellinie nicht mehr Tat benötigen, da die Expression der Vektor-RNA unter der Kontrolle eines heterologen Promotors ist) 293-Rev_i-Zellen verwendet. In diesem Stadium konnte die interessante Beobachtung gemacht werden, daß die minimale zytotoxische Konzentration des Selektionsantibiotikums (welches die optimale Konzentration für die Selektion darstellt) im allgemeinen geringer wird, wenn die Zellklone schon einen oder mehrere Resistenzmarker tragen (wie im Fall der 293-Rev_i-Zellen). Tabelle 1 veranschaulicht die Verschiebung der Empfindlichkeit gegenüber Neomycin und Hygromy cin von der maternalen Zellinie 293 zu der Tochterzellinie 293- RcR und weiter zu den Derivaten 293-Tat/Rev_i und 293-Rev_i. Daher wurden Derivate von 293-Rev_i erzeugt, die mit pIND(Sp1)- ΔΨgag/pol-RRE transfiziert und mit Hygromycin selektiert worden waren. Resistente Klone wurden mit 1 µM Ponasteron A induziert und zwei Tage später durch indirekte Immunfluoreszenz mit für HIV-CA spezifischen Antikörpern analysiert. Verschiedene Klone waren eindeutig positiv und zeigten eine spezifische und starke Immunfluoreszenz in bis zu 80% der Zellen nur nach Induktion (Fig. 3A). Die Quantifizierung der Mengen an freigesetzten Partikeln (mittels ELISA für CA) ergab jedoch, daß nur geringe Mengen und für eine Verpackungszellinie nicht ausreichende Men gen an Partikeln im Bereich von 10 bis 20 ng/ml p24 zwei Tage nach Induktion in das Medium freigesetzt wurden (Fig. 3B). Westernblotanalysen mit für CA spezifischen Antikörpern bestä tigten die Gegenwart von prozessiertem CA in Pellets von abzen trifugierten Partikeln. In Zellysaten konnte jedoch nur Pr55^gag, jedoch kein prozessiertes CA beobachtet werden, was vermutlich daraus resultiert, daß die Menge an exprimiertem Gag/Pol in den Zellen gering und für die Dimerisierung und Aktivierung der HIV- Protease nicht ausreichend ist (Fig. 3C). Verschiedene unabhän gige Selektionsrunden an Transfektion und Selektion ergaben keine Zellinie, die größere Mengen an Partikeln produziert. Da die induzierten und basalen Expressionsspiegel vermutlich par allel verlaufen, waren diese Ergebnisse ein starker Hinweis darauf, daß die Basalexpression von zytotoxischen Genprodukten, die zwar in transienten Assays nicht nachweisbar sind, trotzdem das Überleben von Klonen mit hochinduzierbarer Partikelexpres sion verhindern könnten. Somit fand eine Selektion hinsichtlich Zellklonen mit geringen und daher nicht-toxsichen basalen Ex pressionsspiegel statt, wobei in diesen Zellen jedoch die indu zierten Expressionsspiegel ebenfalls gering sind.

Tabelle 1

Beispiel 5 Selektion nach Zellklonen, die in Gegenwart von Saquinavir HIV-Gag/Pol-Partikel induzierbar exprimieren

Es wurde davon ausgegangen, daß die basale Expression der für die Zelle toxischen HIV-Protease zu der Selektion der Zellklone beiträgt, die nur geringe induzierbare HIV-Partikelexpression zeigen. Um dem entgegenzuwirken wurde Saquinavir, ein spezi fischer Inhibitor der HIV-Protease, mit einer Konzentration von 1,5 µM während des Zeitraums der Selektion Hygromycin-resisten ter Klone und während des Zellwachstums vor der Induktion der Partikelexpression zugegeben. 1,5 µM Saquinavir sind zur voll ständigen Hemmung der Prozessierung von Pr55^gag und Pr160^gag/pol nach transienter Transfektion von pNL-4-3 in 293T-Zellen ausreichend. Verschiedene mit dieser Vorgehensweise selektierte Klone, die spezifische Immunfluoreszenz mit p24-Antikörpern zwei Tage nach Induktion mit 1 µM Ponasteron A zeigten, wurden mittels CA-ELISA des Kulturüberstands näher analysiert. Die meisten immunfluo reszenzpositiven Zellklone setzten im Vergleich zu in Abwesen heit von Saquinavir selektierten Klonen signifikant höhere Men gen an HIV-Partikel in das Medium frei. Außerdem waren in den Lysaten induzierter Zellen von verschiedenen Klonen zusätzlich zu pr55^gag prozessiertes CA sowie eine Bande an der Position des Prozessierungsintermediats MA-CA nachweisbar, was vermutlich das Ergebnis einer höheren Gag/Pol-Expression war (Fig. 5C). Die Daten für eine ausgewählte Zellinie mit der Bezeichnung 293- Rev/Gag/Pol_i sind in Fig. 4 gezeigt. Die indirekte Immunfluo reszenz nicht-induzierter Zellen mit p24-Antikörpern führte lediglich zu Hintergrundfluoreszenz, die zu der mit normalen 293-Zellen erhaltenen äquivalent war. Nach Induktion zeigten jedoch 100% der 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen eine starke CA-spezi fische Immunfluoreszenz (Fig. 4A). Die Quantifizierung freige setzter HIV-ähnlicher Partikel in Kulturüberständen zwei Tage nach Entfernung von Saquinavir und mit und ohne Zugabe von 1 µM Ponasteron A über ELISA (hinsichtlich CA) zeigte, daß relativ hohe Mengen an p24 im Bereich von 1 µg/ml nur nach Induktion vorhanden waren. CA war in Überständen nicht-induzierter Zellen nicht nachweisbar. Nach Zentrifugation durch ein 32% Saccharose- Kissen waren etwa 25-50% p24 (nachweisbar durch ELISA im Über stand induzierter Zellen) im Pellet vorhanden. Ein ähnlicher Prozentsatz kann auch dann beobachtet werden, wenn infektiöse, von infizierten T-Zellen freigesetzte HIV unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert werden und dies zeigt auch, daß ein ähnlicher Prozentsatz an von induzierten 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen freigesetztem p24 in dem teilchenförmigen Material vorhanden ist. Um weitere Proteine nachweisen zu können wurden zentrifu gierte HIV-Gag/Pol-Partikel, die von induzierten oder nicht- induzierten 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen freigesetzt worden waren und mit ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein 16 Stunden lang 30 bis 46 Stun den nach Induktion metabolisch markiert worden waren, über PAGE und Autoradiographie direkt analysiert (Fig. 4B). Spezifische Banden mit den Molekulargewichten der gag/pol-kodierten Proteine p66, p51, IN, CA (p24), MA (p17) und NC (p9) zusätzlich zu eini gen minoren nicht-identifizierten radioaktiv markierten Banden konnten nur in abzentrifugierten Pellets von induzierten Zellen beobachtet werden.

Beispiel 6 Nähere Analyse der Eigenschaften der HIV-Partikel produzierenden Zellinie 293-Rev/Gag/Pol_i

Die Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln von 293-Rev/Gag/Pol_i- Zellen blieb in den Originalkulturen etwa auf dem gleichen Niveau (etwa 1 µg CA/ml) und entsprach etwa der nach Rekulti vierung der gefrorenen Aliquots beobachteten. Danach gingen jedoch trotz der ständigen Gegenwart von Saquinavir im Kulturme dium die HIV-Gag/Pol-Expressionsspiegel allmählich zurück. Um die Expression und Freisetzung der HIV-Gag/Pol-Partikel zu re stimulieren wurde daher eine 16- bis 17-stündige Behandlung der 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen mit 5 mM Natriumbutyrat während der Induktion mit Ponasteron A miteingeschlossen. Es zeigte sich, daß diese Vorgehensweise zu einer Stimulation der Expression der HIV-Gag/Pol-Partikel auf ein ausgesprochen hohes Niveau führte. Dies ist in Fig. 5A dargestellt, wobei 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen verwendet wurden, die entweder für einen kürzeren (eine Woche) oder längeren (sieben Wochen) Zeitraum nach Auftauen gezüchtet wurden. In Abwesenheit einer Natriumbutyrat-Behandlung setzten 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen, die nur eine Woche gezüchtet und mit Ponasteron A induziert worden waren, ähnliche Mengen an HIV- Gag/Pol-Partikeln (etwa 1 µg/ml) frei wie vor dem Einfrieren. 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen, die nach dem Auftauen sieben Wochen gezüchtet worden waren, setzten jedoch nach Induktion nur gerin ge Mengen an HIV-Gag/Pol-Partikeln frei (36 ng CA/ml). Obwohl die induzierbare Freisetzung von HIV-Gag/Pol-Partikeln im letz teren Fall gering war, führte die Behandlung beider Kulturen mit Natriumbutyrat zu einer drastischen Zunahme der Partikelfreiset zung, wobei die erhaltenen Mengen im Bereich von 10 pg CA/ml lagen. Andererseits führte die Behandlung von 293-Rev/Gag/Pol_i- Zellen mit Natriumbutyrat in Abwesenheit einer Induktion mit Ponasteron A nicht zu irgendeiner meßbaren Freisetzung an HIV- Gag/Pol-Partikeln.

Zellen in HIV-Gag/Pol-Partikel exprimierenden Kulturen wurden in ihrem Wachstum gehemmt (Fig. 5B). Induzierte Zellkulturen, die zusätzlich mit Natriumbutyrat behandelt wurden, zeigten die deutlichste Hemmung des Zellwachstums und tatsächlich hatten sich in diesen Kulturen die meisten Zellen von den Schalen abge löst. Fig. 5C stellt einen Westernblot der Gag-Proteine in Zellysaten und Kulturüberständen von 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen dar, die nach Auftauen eine Woche entweder nicht-induziert (Spuren 1) oder induziert ohne (Spuren 2) oder mit (Spuren 3) einer zusätz lichen Behandlung mit Natriumbutyrat gezüchtet wurden. Proteoly tisch prozessiertes CA kann nur in den Lysaten (linker Ab schnitt) von induzierten Zellen, jedoch nicht von nicht-indu zierten Zellen beobachtet werden. Wie bereits vorstehend erwähnt steht dies im Gegensatz zu der Zusammensetzung an Gag-Proteinen in Zellinien, die in Abwesenheit von Saquinavir selektiert wor den waren: In diesen Fällen konnte, vermutlich aufgrund der geringen Expression, nur Pr55^gag beobachtet werden. In den Lysa ten induzierter 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen stieg das Verhältnis von prozessiertem CA zu Pr55^gag bei zusätzlicher Behandlung der Zel len mit Natriumbutyrat an. Dies reflektiert vermutlich wieder die höhere Expression an HIV-Gag/Pol-Partikeln und die daraus resultierende Aktivierung der Protease in den mit Natriumbutyrat behandelten induzierten Kulturen. In Fig. 5C (rechter Ab schnitt) wurden 15 µl-Aliquots der geklärten Kulturüberstände (aus 2 ml Medium auf einer Multiplatte mit 6 Vertiefungen) von nicht-induzierten und induzierten 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen mittels Westernblot direkt, d. h. ohne Anreicherung der freigesetzten Partikel, analysiert. Prozessiertes CA stellt die Mehrheit der nachweisbaren Produkte dar und die beobachteten Signalstärken repräsentieren unterschiedliche Mengen an freigesetzten HIV- Gag/Pol-Partikeln. Die minoren oberen Banden, die im Medium von mit Natriumbutyrat behandelten induzierten 293-Rev/Gag/Pol_i- Zellen nachweisbar waren, dürften das Ergebnis einer Zellschädi gung sein.

Die Auswirkung unterschiedlicher Konzentrationen an Ponasteron A und unterschiedlicher Induktionszeiten auf die Mengen an von 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen exprimierten und freigesetzten HIV- Gag/Pol-Partikeln wurde in Fig. 6 analysiert. Einerseits wurden Zellen früher Passagen in Abwesenheit einer Natriumbutyrat-Be handlung untersucht, andererseits wurden Zellen, die sieben Wochen lang nach Auftauen gezüchtet worden waren, zusätzlich 18 Stunden lang während der Induktionsperiode mit Natriumbutyrat stimuliert. Wie in Fig. 6A dargestellt konnte eine nachweisbare Expression bereits mit der geringsten getesteten Menge an Pona steron A (0,1 µM) beobachtet werden. Konzentrationen an Ponaste ron A über 1 µM führten nur zu einem minimalen weiteren Anstieg der Expression. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für weitere Experimente Ponasteron A mit einer Konzentration von 2 µM ver wendet. Fig. 6B veranschaulicht den zeitlichen Verlauf der Freisetzung der HIV-Gag/Pol-Partikel. Die Menge an HIV-Gag/Pol- Partikeln im Medium stieg nach zwei Tagen Induktion nicht signifikant an, unabhängig von einer zusätzlichen Behandlung mit Natriumbutyrat. Dies zeigt, daß die Induktion der Genexpression auf hohem Niveau und die Freisetzung von HIV-Gag/Pol-Partikeln in das Medium sehr schnell geschieht.

Beispiel 7 Transduktionsassays mit HIV-Gag/pol-Partikeln von 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen

Ein Grund für die Erzeugung der 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellinie war die Möglichkeit der reproduzierbaren Produktion definierter Partikel für die Verpackung von von HIV abgeleiteten Vektoren. Um zu untersuchen, ob die von 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen freigesetzten HIV-Gag/Pol-Partikel prinzipiell einen von HIV abgeleiteten Vektor der dritten Generation verpacken und mit einem viralen Glykoprotein pseudotypisiert werden können, wurden diese Zellen mit dem GFP kodierenden HIV-Vektor pRRL-eGFP (Dull et al., J. Vi rol. 72 (1998), 8463-8471) und dem VSV-G kodierenden Vektor pMD.G transient transfiziert und mit Natriumbutyrat (mit und ohne Induktion mit Ponasteron (A) wie vorstehend beschrieben behandelt. 24 Stunden nach Erneuerung des Mediums nach Natrium butyrat-Behandlung wurden die Kulturüberstände zur Transduktion frischer HeLa-Zielzellen verwendet. Die FACS-Analyse zwei Tage nach Transduktion zeigte, daß die meisten der mit Medium der transfizierten und induzierten 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen behandel ten HeLa-Zellen (92,7%) positive GFP-Fluoreszenz über einen weiten Bereich zeigten, nicht jedoch die mit Medium nicht-indu zierter 293-Rev/Gag/Pol_i-Zellen behandelten (Fig. 7). Um den Vektorpartikeltiter bestimmen zu können wurden Verdünnungen der Medien zu einer definierten Anzahl von Zellen gegeben und der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde ermittelt. Mittels die ser Analysen konnte gezeigt werden, daß der Titer an Vektorp artikeln, die wie beschrieben erzeugt worden waren, im Bereich von 1-3 × 10⁵ IE/ml lag.

Die Zellinie 293-Rev/Gag/Pol_i wurde am 21. Dezember 2000 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags mit der Hinterle gungsnummer DSM ACC2488 hinterlegt.

Claims

1. Säuger-Verpackungszellinie für lentivirale Vektoren, die HIV- Gag/Pol-Partikel produziert und durch ein folgende Schritte umfassendes Verfahren erhältlich ist:

a) Transfektion einer Ausgangszellinie mit (einem) die drei HIV-Gene gag, pol und rev unter Kontrolle eines induzier baren Promotors enthaltenden Vektor (oder Vektoren);
b) Züchtung der nach Schritt (a) erhaltenen Zellen unter Bedingungen, die eine Selektion transfizierter Zellen erlauben, und in Gegenwart eines Inhibitors der HIV-Protease; und
c) Selektion transfizierter Zellen mit hoher Expression von HIV-Gag/Pol-Partikeln.

2. Säuger-Verpackungszellinie nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß der Inhibitor der HIV-Protease Saquinavir ist.

3. Säuger-Verpackungszellinie nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß in Schritt (b) Saquinavir in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mm im Medium vorhanden ist.

4. Säuger-Verpackungszellinie nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß in Schritt (b) Saquinavir in einer Konzentration von 1 bis 2 µM im Medium vorhanden ist.

5. Säuger-Verpackungszellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der induzierbare Promotor ein durch Ecdyson induzierbarer Promotor ist.

6. Säuger-Verpackunszellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei in Schritt (a) die Transfektion mit einem Gag/Pol kodie renden Vektor und einem Rev kodierenden Vektor zeitlich getrennt erfolgt.

7. Säuger-Verpackungszellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die humanen Ursprungs ist.

8. Säuger-Verpackungszellinie nach Anspruch 7, die eine von 293- Zellen abgeleitete Zellinie ist.

9. Säuger-Verpackungszellinie nach Anspruch 7 oder 8, die die Zellinie 293-Rev/Gag/Pol_i mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2488 ist.

10. Verfahren zur Herstellung der Säuger-Verpackungszellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren die fol genden Schritte umfaßt:

11. Verfahren zur Herstellung von HIV-Gag/Pol-Partikeln, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Züchtung der Säuger-Verpackungszellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 unter Promotor-induzierenden Bedingungen in Gegenwart von Natriumbutyrat; und
b) Gewinnung der HIV-Gag/Pol-Partikel aus dem Kulturüber stand.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die HIV-Gag/Pol-Partikel in einer Konzentration von über 1 µg/ml (gemessen als CA) im Kulturüberstand vorhanden sind.

13. Verfahren zur Herstellung eines verpackten lentiviralen Vektors, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säuger-Verpackungs zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zusätzlich mit dem gewünschten lentiviralen Vektor und mit dem gewünschten Targe ting-Protein exprimierenden Vektor transfiziert und die in die HIV-Gag/Pol-Partikel verpackten lentiviralen Vektoren gemäß dem Verfahren von Anspruch 10 gewinnt.

14. Verwendung der Säuger-Verpackunszellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung von HIV-Gag/Pol-Partikeln oder von in HIV-Gag/Pol-Partikel verpackte lentivirale Vektoren.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die HIV-Gag/Pol-Partikel weiter modifiziert und für eine Vakzinierung geeignet sind.

16. Verwendung der Säuger-Verpackunszellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Screenen nach Inhibitoren der HIV-Parti kelbildung.