DE69626681T2

DE69626681T2 - Konditionell-replizierende virale vektoren und ihre verwendung.

Info

Publication number: DE69626681T2
Application number: DE69626681T
Authority: DE
Inventors: Boro Dropulic; M. Paula PITHA
Original assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University; School of Medicine of Johns Hopkins University
Priority date: 1995-11-28
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2016-11-28
Also published as: KR100537458B1; KR19990071728A; RU2270250C2; EP1380650A1; CA2236868C; CA2236868A1; CN1207775A; CN100390291C; IL124636A; AU1000001A; ATE455858T1; DE69626681D1; CZ162498A3; AU767620B2; NO329619B1; EP0871757A1; IL124636A0; CN1940076A; AU1124997A; NO982418L

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen bedingt replizierenden viralen Vektor, Verfahren zur Herstellung, Modifizierung, Vermehrung und selektiven Verpackung eines solchen Vektors, isolierte Moleküle von spezifizierten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, die für solche Vektoren relevant sind, eine pharmazeutische Zusammensetzung und eine Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthalten, und Verfahren der Verwendung eines solchen Vektors und einer solchen Wirtszelle.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Entdeckung des Human-Immunschwäche-Virus (HIV) als Ursache des Erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) hat eine Fülle von Forschungsarbeiten bezüglich der zugrunde liegenden Mechanismen des viralen Infektionszyklus und der viralen Pathogenese bewirkt. Studien zu diesen Mechanismen haben die Forscher mit einer ständig wachsenden Anzahl von Zielen für die Entwicklung von antiviralen Mitteln versorgt, die nicht nur gegen HIV, sondern auch gegen andere Viren wirksam sind. Diese antiviralen Mittel, insbesondere jene, die gegen HIV gerichtet sind, können nach ihrem Wirkungsmodus in Gruppen unterteilt werden. Solche Gruppen schließen ein: Inhibitoren der Reversen Transkriptase, Konkurrenten bezüglich des Viruseintritts in Zellen, Vakzine und Protease-Inhibitoren sowie eine neuere Gruppe, die hier als „genetische antivirale Mittel" bezeichnet wird.
Im Allgemeinen hat jede Art von antiviralem Mittel ihre eigenen damit verbundenen Vorteile und Grenzen und muss in Bezug auf die Anforderungen der jeweiligen Behandlungssituation beurteilt werden. Antivirale Mittel wie Zidovudin (3'-Azido-3'-deoxythymidin, auch als AZT bekannt), Protease-Inhibitoren und dergleichen können in die Körperzellen des Patienten relativ leicht eingebracht werden und wurden in gro ßem Umfang untersucht. Indem sie auf einen spezifischen Faktor im viralen Infektionszyklus zielen, haben sich solche Mittel als relativ unwirksam gegen HIV erwiesen. Das beruht primär auf der Tatsache, dass HIV-Stämme sich rasch verändern und gegen Mittel mit einem einzigen Wirkungsort resistent werden (Richman, AIDS Res. and Hum. Retrovir., 8, 1065–1071 (1992)). Folglich erzwingen die Probleme der genetischen Variation und schnellen Mutation in HIV-Genomen, dass man neue Antivirenstrategien in Betracht zieht, um HIV-Infektionen zu behandeln. In dieser Hinsicht sind genetische antivirale Mittel attraktiv, da sie intrazellulär auf vielen verschiedenen Niveaus arbeiten.
Genetische antivirale Mittel unterscheiden sich von anderen Therapeutika insofern, als sie als molekulare Elemente in eine Zielzelle transferiert werden, wo sie die Zelle vor Virusinfektionen schützen (Baltimore, Nature, 325, 395–396 (1988) und Dropulic' et al., Hum. Gene Ther., 5, 927–939 (1994)). Genetische antivirale Mittel können jedwede genetische Sequenz sein und schließen Antisense-Moleküle, RNA-Decoys, transdominante Mutanten, Interferone, Toxine, Immunogene und Ribozyme ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Insbesondere sind Ribozyme genetische antivirale Mittel, die Ziel-RNAs, einschließlich HIV-RNA, auf sequenzspezifische Weise schneiden. Diese Spezifität der Ribozym-vermittelten Spaltung von Ziel-RNA legt die mögliche Verwendung von Ribozymen als therapeutische Inhibitoren der Virusreplikation, einschließlich der HIV-Replikation, nahe. Verschiedene Arten von Ribozymen, wie Hammerhead- und Hairpin-Ribozyme, werden in Strategien gegen HIV eingesetzt (siehe z. B. US-PS 5 144 019, 5 180 818 und 5 272 262 , und die PCT-Anmeldungen WO 94/01549 und WO 93/23569). Sowohl Hammerhead- als auch Hairpin-Ribozyme können so konstruiert werden, dass sie jede Ziel-RNA schneiden, die eine GUC-Sequenz enthält (Haseloff et al., Nature, 334, 585–591 (1988); Uhlenbeck, Nature, 334, 585 (1987); Hampel et al., Nuc. Acids Res., 18, 299–304 (1990); und Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641–671 (1992)). Allgemein gesagt, haben Hammerhead-Ribozyme zwei Arten von funktionellen Domänen, eine konservierte katalytische Domäne, die von zwei Hybridisierungsdomänen flankiert ist. Die Hybridisierungsdomänen binden an Sequenzen, welche die GUC-Sequenz umgeben, und die katalytische Domäne schneidet das RNA-Ziel 3' zur GUC-Sequenz (Uhlenbeck (1987), supra; Haseloff et al. (1988), supra; und Symons (1992), supra).
Eine Anzahl von Studien hat bestätigt, dass Ribozyme zumindest teilweise beim Hemmen der Vermehrung von HIV in Gewebekulturzellen wirksam sein können (siehe z. B. Sarver et al., Science, 247, 1222–1225 (1990); Sarver et al., NIH Res., 5, 63–67 (1993a); Dropulic et al., J. Virol., 66, 1432–1441 (1992); Dropulic' et al., Methods: Comp. Meth. Enzymol., 5, 43–49 (1993); Ojwang et al., PNAS, 89, 10802-10806 (1992); Yu et al., PNAS, 90, 6340–6344 (1993) ; und Weerasinghe et al., J. Virol., 65, 5531–5534 (1991)). Insbesondere Sarver et al. ((1990), supra) haben gezeigt, dass für die Spaltung innerhalb der transkribierten Region des HIV-gag-Gens ausgelegte Hammerhead-Ribozyme, i.e. Anti-gag-Ribozyme, spezifisch HIV-gag-RNAs in vitro schneiden können. Weiter wurde, wenn Anti-gag-Ribozyme exprimierende Zelllinien HIV-1 ausgesetzt wurden, eine 50- bis 100fache Hemmung der HIV-Replikation beobachtet. Ähnlich haben Weerasinghe et al. ((1991), supra) gezeigt, dass retrovirale Vektoren, die Ribozyme codieren, die für die Spaltung innerhalb der U5-Sequenz von HIV-1-RNA ausgelegt sind, transduzierten Zellen HIV-Resistenz verleihen, wenn anschließend HIV ausgesetzt wird. Obgleich verschiedene Klone von transduzierten Zellen verschiedene Niveaus der Resistenz auf den Challenge zeigten, wie durch das Promotorsystem bestimmt wurde, welches zur Steuerung der Ribozym-Expression verwendet wurde, erlagen die meisten der Ribozym exprimierenden Zelllinien der HIV-Expression nach einer beschränkten Zeit in Kultur.
Es wurde gezeigt, dass die Transduktion von Gewebekulturzellen mit einem Provirus in das nef-Gen (das für die Virusreplikation in Gewebekultur nicht essentiell ist), von dem ein Ribozym eingeführt wurde, dessen Hybridisierungsdomänen spezifisch für die U5-Region von HIV waren, die Virusreplikation innerhalb der transduzierten Zellen im Vergleich zu Zellen, die mit Wildtyp-Proviren transduziert wurden, 100fach hemmte (siehe z. B. Dropulic' et al. (1992) und (1993), supra). Ähnlich wurde gezeigt, dass Hairpin-Ribozyme die HIV-Replikation in T-Zellen hemmen, welche mit U5-Hairpin-Ribozyme enthaltenden Vektoren transduziert und HIV ausgesetzt wurden (Ojwang et al. (1992), supra). Andere Studien haben gezeigt, dass Vektoren, die Ribozyme enthielten, die von einem tRNA-Promotor exprimiert wurden, auch eine Vielzahl von HIV-Stämmen hemmen (Yu et al. (1993), supra).
Die Abgabe von Ribozymen oder anderen genetischen antiviralen Mitteln an die zellulären Ziele der HIV-Infektion (z. B. CD4+ T-Zellen und monocytische Makrophagen) war eine Haupthürde für die wirksame genetische therapeutische Behandlung von AIDS. Derzeitige Ansätze zum Zielen auf Zellen des hämatopoetischen Systems (i. e. die primären Ziele für die HIV-Infektion) verlangen die Einführung therapeutischer Gene in multipotente Vorläufer-Stammzellen, die nach der Differenzierung reife T-Zellen geben, oder, alternativ dazu, in die reifen CD4+ T-Lymphocyten selbst. Das Zielen auf Stammzellen ist jedoch problematisch, weil die Zellen schwer zu kultivieren und in vitro zu transduzieren sind. Das Zielen auf zirkulierende T-Lymphocyten ist ebenfalls problematisch, da diese Zellen so weit verstreut sind, dass es schwierig ist, alle Zielzellen unter Anwendung derzeitiger Vektortransfersysteme zu erreichen. Außerdem müssen Makrophagen als zelluläres Ziel betrachtet werden, da sie das Hauptreservoir für die Virusausbreitung in andere Organe sind. Da Makrophagen jedoch terminal differenziert sind und daher keine Zellteilung mehr stattfindet, werden sie nicht leicht mit üblicherweise verwendeten Vektoren transduziert.
Folglich macht der vorherrschende derzeitige Ansatz bei der HIV-Behandlung von replikationsdefekten vitalen Vektoren und Verpackungs- (i. e. „Helfer"-) Zelllinien Gebrauch (siehe z. B. Buchschacher, JAMA, 269(22), 2880–2886 (1993); Anderson, Science, 256, 808–813 (1992); Miller, Nature, 357, 455–460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926–931 (1993); Friedmann, Science, 244, 1275–1281 (1989); und Cournoyer et al., Ann. Rev. Immunol., 11, 297–329 (1993)), um in für Virusinfektionen (wie die HIV-Infektion) anfällige Zellen ein Fremdgen einzuführen, das die Virusreplikation spezifisch stört oder das den Tod einer infizierten Zelle (erörtert von Buchschacher (1993) supra) verursacht. Solche replikationsdefekten vitalen Vektoren enthalten, zusätzlich zu dem interessierenden Fremdgen, die cis-wirkenden Sequenzen, die für die Virusreplikation erforderlich sind, aber nicht Sequenzen, die essentielle Virusproteine codieren. Folglich ist ein solcher Vektor nicht in der Lage, den vitalen Replikationszyklus zu beenden, und eine Helferzelllinie, die vitale Gene in ihrem Genom enthält und konstitutiv exprimiert, wird für seine Vermehrung verwendet. Nach dem Einführen eines replikationsdefekten vitalen Vektors in eine Helferzelllinie werden für die Viruspartikelbildung erforderliche Proteine dem Vektor in trans bereitgestellt, und es werden Vektorviruspartikel gebildet, die in der Lage sind, Zielzellen zu infizieren und darin das Gen zu exprimieren, das die Virusreplikation stört oder den Tod einer virusinfizierten Zelle verursacht.
Solche replikationsdefekten retroviralen Vektoren schließen Adenoviren und Adenoassoziierte Viren ein, wie auch jene retroviralen Vektoren, die in klinischen Versu chen der HIV-Gentherapie eingesetzt werden, und insbesondere den amphotropen retroviralen Maus-Vektor, der als Moloney Murines Leukämievirus (MuLV) bekannt ist. Diese defekten viralen Vektoren wurden verwendet, um CD4+ Zellen mit genetischen antiviralen Mitteln, wie Anti-HIV-Ribozyme, zu transduzieren, und zwar mit variierendem Erfolg (Sarver et al. (1990), supra; Weerasinghe et al. (1991), supra; Dropulic' et al., (1993), supra; Ojwang et al. (1992), supra; und Yu et al. (1993), supra). Diese Vektoren sind jedoch intrinsisch beschränkt für HIV-Gentherapieanwendungen. Beispielsweise ist eine hohe Transduktionsfrequenz speziell wichtig bei der Behandlung von HIV, wo der Vektor entweder seltene CD34+ Progenitor hämatopoetische Stammzellen oder weit verstreute Ziel-CD4+-T-Zellen, von denen die meisten während der klinischen „latenten" Stufe der Erkrankung bereits mit HIV infiziert sind, transduzieren muss. MuLV-Vektoren sind jedoch schwer mit hohem Titer zu erhalten und führen daher zu geringer Transduktion. Außerdem wurde Langzeitexpression von transduzierter DNA in CD34+ Progenitor Stammzellen nicht erhalten, insbesondere nach Differenzierung zu reifen T-Lymphozyten. Weiters erfordert die Verwendung defekter viraler Vektoren ex vivo Gentransferstrategien (siehe z.B. US-PS 5 399 346 ), was teuer und jenseits der Kosten für die allgemeine Bevölkerung sein kann.
Diese mit der Verwendung der derzeit verfügbaren Vektoren für genetische therapeutische Behandlung von AIDS verbundenen Nachteile haben Forscher dazu geführt, nach neuen viralen Vektoren zu suchen. Ein solcher Vektor ist HIV selbst. HIV-Vektoren wurden für Infektivitätsstudien (Page et al., J. Virol., 64, 5270–5276 (1990)) und zum Einführen von Genen (wie Selbstmordgenen) in CD4+ Zellen, insbesondere HIV-infizierte CD4+ Zellen verwendet (siehe z. B. Buchschacher et al., Hum. Gener. Ther., 3, 391–397 (1992); Richardson et al., J. Virol., 67, 3997–4005 (1993); Carroll et al., J. Virol., 68, 6047–6051 (1994); und Parolin et al., J. Virol., 68, 3888–3895 (1994)). Die Strategie dieser Studien ist die Verwendung von HIV-Vektoren zum Einführen von Genen in CD4+ T-Zellen und monocytische Zellen.
Derzeit sind diese Vektoren jedoch außerordentlich komplex. Zudem ist die Verwendung dieser Vektoren von dem Risiko der Erzeugung von Wildtyp-HIV über intrazelluläre Rekombination begleitet. Es wurde beobachtet, dass die Cotransfektion/Coinfektion von defekten Vektorsequenzen und Helfervirus zur Rekombination zwischen homologen Regionen der viralen Genome führt (Inoue et al., PNAS, 88, 2278-282 (1991)). Beobachtete Komplementation in vitro zeigt, dass ein ähnlicher replikationsdefekter HIV-Vektor in vivo rekombinieren könnte, wobei eine bereits bestehende HIV-Infektion verschlechtert wird. Die Tatsache, dass Retroviren zwei RNA-Genome in ein Virion verpacken, hat Forscher dazu geführt vorzuschlagen, dass Retroviren zwei virale RNAs tragen, um genetische Defekte zu umgehen, die durch Komplementation und/oder Rekombination verursacht sind (Inoue et al. (1991), supra).
Zusätzlich zu dem Risiko intrazellulärer Rekombination, wobei Wildtyp-HIV resultiert, ist mit HIV-Vektoren noch das Risiko der Mutation in vivo verbunden, welche die Pathogenität des viralen Vektors erhöht. Das hat Sarver et al. (AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 483–487 (1993b)) dazu gebracht, bezüglich der Entwicklung von rekombinanten HIV-Vektoren der zweiten Generation zu spekulieren, die replikationskompetent, aber nicht-pathogen sind. Solche Vektoren replizieren in einem Patienten weiter, im Vergleich zu den vorherrschend verwendeten nichtreplizierenden Vektoren (i.e. replikationsdefekten Vektoren), und bieten somit konstante Konkurrenz für Wildtyp-HIV. Bisher sind jedoch solche Vektoren nicht verfügbar.
Idealerweise ist die beste Gelegenheit zur Behandlung eines Infizierten zum Zeitpunkt der Inokulation, bevor das Virus den Wirt infiziert. Dies ist jedoch schwer zu erreichen, da viele Individuen bis zur klinischen latenten Phase der Erkrankung nicht merken, dass die mit HIV infiziert wurden. Basierend darauf ist die Stufe, bei der antivirale Intervention am dringendsten gebraucht wird, während der klinischen Latenz. Die Therapie auf dieser Stufe erfordert, dass der Herausforderung durch die große Anzahl von bereits infizierten CD4+ Lymphozyten, die virale Genome beinhalten, begegnet wird. Das ist keine leichte Herausforderung, wie die Tatsache zeigt, dass HIV noch unheilbar und nur schlecht mit den derzeit verfügbaren Therapien behandelbar ist. Ein wirksames Vakzin ist nicht in Sicht, und obgleich gezeigt wurde, dass Inhibitoren der Reversen Transkriptase und Protease die HIV-Replikation in Gewebekultur verhindern, hat die Entwicklung von viraler Resistenz in vivo zum Versagen der Behandlung geführt. HIV-Gentherapie kann also für die große Mehrheit der HIV-Infizierten, deren Zahl im Jahr 2000 mehr als 40 Millionen erreichen dürfte, geringen Nutzen haben.
Im Hinblick auf das Gesagte wird es auch immer wichtiger, Langzeit- und persistente immunologische Antworten auf bestimmte Pathogene zu entwickeln, insbesondere Viren, speziell im Kontext von beispielsweise AIDS und Krebs. Abgeschwächte Lebendvakzine (LA Vakzine), die replikationskompetente, aber nicht-pathogene Viren verwenden, wurden in Betracht gezogen (Daniel et al., Science, 258, 1938–1941 (1992); und Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331–332 (1994)). Solche nicht-pathogenen Viren, die sich von den entsprechenden Wildtyp-Viren durch eine Deletion in einem oder mehreren Genen unterscheiden, können jedoch entweder (i) keine schützende Immunantwort hervorrufen, weil das Antigen nicht persistiert (weil das LA-Virus nicht effizient repliziert), oder (ii) das LA-Virus repliziert, hat aber ein anderes pathogenes Potential, wofür die Fähigkeit des LA-Virus, in Jungtier-Modellen Krankheit hervorzurufen (Baba et al., Science, 267, 1823–1825 (1995)), zeugt.
Aus den genannten Gründen besteht Bedarf an alternativen prophylaktischen und therapeutischen Behandlungsformen von Virusinfektionen, insbesondere im Zusammenhang mit AIDS und Krebs. Die vorliegende Erfindung bietet solche alternativen Methoden, indem sie einen bedingt replizierenden Vektor bereitstellt. Die Erfindung sieht auch weitere Methoden vor, in denen ein solcher Vektor verwendet werden kann. Diese und andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie weitere Merkmale der Erfindung werden anhand der hier dargelegten Beschreibung der Erfindung offensichtlich.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen bedingt replizierenden, viralen Vektor bereit, der durch eine Fähigkeit gekennzeichnet ist, nur in einer Wirtszelle zu replizieren, die eine Replikation des Vektors gestattet.
In einer Ausführungsform beinhaltet der bedingt replizierende, virale Vektor mindestens eine Nukleinsäuresequenz, deren Anwesenheit, Transkription oder Translation dem Vektor in einer bezüglich der Replikation permissiven Wirtszelle einen Selektionsvorteil gegenüber einem Wildtyp-Stamm des Virus verleiht, der dem Virus entspricht, von dem der Vektor abgeleitet wurde.
In einer anderen Ausführungsform des bedingt replizierenden, viralen Vektors umfasst der Vektor, der vorzugsweise ein Retrovirus ist, mindestens eine Nukleinsäuresequenz, deren Anwesenheit, Transkription oder Translation einer mit dem Vektor infizierten Wirszelle einen Selektionsvorteil gegenüber einer Zelle verschafft, die mit einem Wildtyp-Stamm des Virus, der dem Virus entspricht, von dem der Vektor abgeleitet wurde, infiziert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen bedingt replizierenden, viralen Vektor und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält. Weiter ist eine Wirtszelle vorgesehen, welche einen bedingt replizierenden viralen Vektor enthält. Ein Vektor, wobei dieser Vektor, wenn er DNA ist, eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 3, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, und wobei der Vektor, wenn er RNA ist, eine Nukleotidsequenz aufweist, die codiert wird durch eine Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 3, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, wird ebenfalls bereitgestellt, ebenso wie isolierte und gereinigte Nukleinsäuremoleküle, wie hier dargelegt. Ebenso wird ein Verfahren bereitgestellt, einen Vektor mit einem Ribozym zu erzeugen, ein Verfahren zum Modifizieren eines Vektors und ein Verfahren zum Vermehren und selektiven Verkapseln eines bedingt replizierenden Vektors ohne die Verwendung einer Zelllinie zum Verkapseln.
In einen weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur therapeutischen und prophylaküschen Behandlung einer Wirtszelle bezüglich einer Virusinfektion bereitgestellt. Solche Verfahren können zusätzlich die Verwendung eines Hiffs-Expressionsvektors, eines zytotoxischen Wirkstoffes, Proteine/Faktoren oder eines Protease/Reverse Transkriptase-Inhibitors, je nach Bedarf, beinhalten. Das Verfahren kann beispielsweise zum Hemmen der Replikation eines Virus, zur Behandlung von Krebs, für in vito Gentransfer oder zum Exprimieren eines interessierenden Gens in einer Wirtszelle verwendet werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist ein Verfahren zur Verwendung einer Wirtszelle bereitgestellt, welche einen bedingt replizierenden Vektor enthält, um die Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoff/Faktor und einem Protein nachzuweisen. Ein solches Verfahren ermöglicht die Charakterisierung von Protein und das Screening von Wirkstoffen/Faktoren hinsichtlich der Aktivität in Bezug auf ein gegebenes Protein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1A bis 1E sind schematische Darstellungen der Struktur des viralen Genoms, das in Wildtyp-HIV (1A), crHIV-1.1 (1B), crHIV-1.11 (1C), crHIV-1.12 (1D) und crHIV-1.111 (1E) vorhanden ist. Bezeichnungen: cr, bedingt (konditional) replizierend; U5, U5 codierende Sequenz; Rz, Ribozym; Ψ, Verpackungssignal; gag, pol und env, die codierende Sequenz für Proteine, die Virus-Core, Reverse Transkriptase bzw. Hülle bilden; tat, rev, rre und nef, weitere virale Gene; offene Kästchen, virale lange Terminalwiederholungen. Die Kreuze in der Wildtyp U5 codierenden Region zeigen die ungefähren Regionen an, in denen Ribozyme gemäß dieser Erfindung in Wildtyp U5 RNA schneiden, aber nicht in modifizierter crHIV U5 RNA (i. e. „mU5").
2 zeigt die DNA-Sequenzen von Wildtyp-HIV U5 RNA [SEQ ID NR. 1] (A) und modifizierter crHIV U5 RNA [SEQ ID NR. 2] (B). Die Zahlen beziehen sich auf die Zahl der Basen stromab vom Transkriptionsstart.
3 ist ein Graph, der die Aktivität von Reverser Transkriptase (cpm/μl) gegen die Zeit (Tage nach der Co-Transfektion) für crHIV-vermittelte Hemmung der Wildtyp HIV-Replikation in Jurkat-Zellen zeigt, die mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.1 (offene Kästchen), mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.11 (offene, durchkreuzte Kästchen), mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.12 (gepunktete Kästchen) und Wildtyp-HIV und Kontroll-Plasmid pGEM-3Z (ausgefüllte Kästchen) co-transfiziert wurden.
4 ist ein Graph, der die Aktivität von Reverser Transkriptase (cpm/μI) gegen die Zeit (Tage nach der Co-Transfektion) für crHIV-vermittelte Hemmung der Wildtyp-HIV-Replikation in Jurkat-Zellen zeigt, die mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.1 (offene Kästchen), mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.11 (offene, durchkreuzte Kästchen), mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.111 (gepunktete Kästchen) und Wildtyp-HIV und Plasmid pGEM-3Z (ausgefüllte Kästchen) co-transfiziert wurden.
Die 5A-5C sind schematische Darstellungen der Primer und Sonden, die verwendet werden, um U5 RNA Transkripte von Wildtyp-HIV (5A), crHIV-1.1 ( 5B) und crHIV-1.111 (5C) zu detektieren. Bezeichnungen: U5, U5 codierende Sequenz; Ψ, Verpackungssignal; gag, pol und env, die codierenden Sequenzen für Proteine, die Virus-Core, Reverse Transkriptase bzw. Hülle bilden; offene Kästchen, virale lange Terminalwiederholungen; ausgefüllte Kästchen, al und rev codierende Sequenzen; PE, V1, V2, V3, R1 und R2, Primer, die für Wildtyp- und/oder bedingt replizierende Viren verwendet werden. Das Kreuz in der Wildtyp U5 codierenden Region zeigt die ungefähre Region an, wo Ribozyme gemäß dieser Erfindung in Wildtyp U5 RNA schneiden, aber nicht in modifizierter cr-HIV U5 RNA (i. e. „mU5").
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Hemmen der Replikation eines Wildtyp-Stammes eines Virus bereit. Der Verfahren beinhaltet, dass ein Wirt, der in der Lage ist, mit einem solchen Wildtyp-Stamm eines Virus infiziert zu werden, und vorzugsweise tatsächlich mit einem solchen Wildtyp-Stamm eines Virus infiziert ist, mit einem Vektor in Kontakt gebracht wird, der nur in einem Wirt vermehrt wird, der hinsichtlich der Replikation des Vektors (i. e. ein nicht-pathogener, bedingt (konditional) replizierender (cr) Vektor) permissiv ist.
Wie weiter hier beschrieben wird, besteht ein spezielles Ziel des Verfahrens darin, eine kompetitive Infektion in dem Wirt mit einem solchen nicht-pathogenen, bedingt replizierenden Vektor zu schaffen. Im Allgemeinen umfasst ein bedingt replizierender Vektor gemäß dieser Erfindung mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die einen Selektionsvorteil für die Replikation und die Ausbreitung für den bedingt replizierenden Vektor im Vergleich zum Wildtyp-Virus verleiht, und/oder mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die einen Selektionsvorteil für die Vermehrung von Viruspartikeln einer Wirtszelle verleiht, die einen bedingt replizierenden Vektor enthält, im Vergleich zu einer Wirtszelle, die ein Wildtyp-Virus enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der Vektor eine HIV-Sequenz und wird für die Behandlung von HIV-Infektionen verwendet. Der Vektor oder eine den Vektor enthaltende Wirtszelle enthält also mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die (1) ein crHIV-Genom mit einem Selektionsvorteil gegenüber einem Wildtyp-HIV-Genom für das Verpacken in Virionen-Nachkommenschaft (i. e. in Zellen, wo beide vorhanden sind) und/oder (2) eine Wirtszelle, die einen bedingt replizierenden Vektor (Virus) produziert, mit einem Selektionsvorteil für die Bildung von crHIV-Virion im Vergleich zu einer Wildtyp-Virus produzierenden Zelle bereitstellt. Ein Verfahren (auf das die Erfindung nicht eingeschränkt ist) besteht darin, crHIV-Genomen einen Selektionsvorteil für die Verpackung zu verleihen, indem sie mit einem oder mehreren Ribozymen versehen werden, die in der Lage sind, das Wildtyp-HIV-Genom zu schneiden.
Wildtyp-Virus
Erfindungsgemäß ist ein „Virus" ein infektiöses Mittel, das aus Protein und Nukleinsäure besteht und den genetischen Mechanismus einer Wirtszelle benutzt, um virale Produkte zu bilden, die durch die virale Nukleinsäure spezifiziert sind. „Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Polymer von DNA oder RNA, das einzel- oder doppelsträngig, linear oder zirkulär ist und gegebenenfalls synthetische, nicht-natürliche oder modifizierte Nukleotide enthält, die in der Lage sind, in DNA- oder RNA-Polymere eingebracht zu werden. Ein DNA-Polynukleotid besteht vorzugsweise aus genomischen oder cDNA-Sequenzen.
Ein „Wildtyp-Stamm eines Virus" ist ein Stamm, der keinerlei von Menschen erzeugte Mutationen, wie hier beschrieben, enthält, i. e. jedwedes Virus, das aus der Natur isoliert werden kann. Andererseits ist ein Wildtyp-Stamm jedwedes Virus, das in einem Labor gezüchtet worden ist, aber in Abwesenheit anderer Viren noch in der Lage ist, Genom- oder Virionen-Nachkommenschaft wie die aus der Natur isolierte zu bilden. Beispielsweise der pNL4-3 HIV molekulare Klon, der in den folgende Beispielen beschrieben wird, ist ein Wildtyp-Stamm, der aus dem „AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog" durch die „National Institutes of Health" erhältlich ist (siehe auch Adachi et al., J. Virol., 59, 284–291 (1986)).
Im Allgemeinen wird das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise angewendet, um Viruserkrankungen zu behandeln, die von einer Virusinfektion herrühren. Zweckmäßigerweise ist ein Virus (sowie der Vektor, wie nachstehend erörtert) ein RNA-Virus, es kann aber auch ein DNA-Virus sein. RNA-Viren sind eine vielfältige Gruppe, die Prokaryoten (z. B. Bakteriophagen) sowie viele Eukaryoten, einschließlich Säuger und insbesondere Menschen, infiziert. Die meisten RNA-Viren haben einzelsträngige RNA als genetisches Material, obwohl zumindest eine Familie doppelsträngige RNA als genetisches Material hat. Die RNA-Viren werden in drei Hauptgruppen unterteilt: die Positivstrang-Viren (i. e. jene, von denen das von dem Virus transferierte Genom in Protein translatiert wird und deren deproteinisierte Nukleinsäure ausreichend ist, um Infektionen auszulösen), die Negativstrang-Viren (i. e. jene, bei denen das von dem Virus transferierte Genom komplementär zum Message-Sinn ist und durch Virion-assoziierte Enzyme transkribiert werden muss, ehe es zur Translation kommen kann) und die Doppelstrang-RNA-Viren. Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise angewendet, um Positivstrang-Viren, Negativstrang-Viren und Viren mit doppelsträngiger RNA zu behandeln.
Wie es hier verwendet wird, umfasst ein RNA-Virus Sindbis-ähnliche Viren (z. B. Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus und Potexvirus), Picornavirus-ähnliche Viren (z. B. Picornaviridae, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus und Potyvirus), Minusstrang-Viren (z. B. Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae und Arenaviridae), Doppelstrang-Viren (z. B. Reoviridae und Birnaviridae), Flavivirus-ähnliche Viren (z. B. Flaviviridae und Pestivirus), Retrovirus-ähnliche Viren (z. B. Retroviridae), Coronaviridae und andere Virengruppen, einschließlich Nodaviridae, aber nicht darauf eingeschränkt.
Ein bevorzugtes RNA-Virus gemäß dieser Erfindung ist ein Virus der Familie Flaviviridae, vorzugsweise ein Virus des Genus Filovirus, insbesondere ein Marburg- oder Ebola-Virus. Vorzugsweise ist ein Virus der Familie Flaviviridae ein Virus des Genus Flavivirus, wie Gelbfiebervirus, Denguevirus, Westnilvirus, St.-Louis-Enzephalitisvirus, Japanisches Enzephalitisvirus, Murray Valley-Enzephalitisvirus, Rocio-Virus, durch Zecken übertragenes Enzephalitisvirus und dergleichen.
Ebenfalls bevorzugt ist ein Virus der Familie Picornaviridae, vorzugsweise ein Hepatitis A-Virus (HAV), Hepatitis B-Virus (HBV) oder ein Non-A- oder Non-B-Hepatitis-Virus.
Ein anderes bevorzugtes RNA-Virus ist ein Virus der Familie Retroviridae (i.e. ein Retrovirus), insbesondere ein Virus des Genus oder der Subfamilie Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae und Lentivirus. Ein RNA-Virus der Subfamilie Oncovirinae ist zweckmäßigerweise ein humanes T-lymphotropes Virus Typ 1 oder 2 (i. e. HTLV-1 oder HTLV-2) oder Bovines Leukämie-Virus (BLV), ein Aviäres Leukose-Sarkom-Virus (z. B. Rous-Sarkom-Virus (RSV), Aviäres Myeloblastose-Virus (AMV), Aviäres Erythroblastose-Virus (AEV) und Rous-assoziiertes Virus (RAV; RAV-0 bis RAV-50), Säuger C-Typ-Virus (z. B. Moloney Murines Leukämievirus (MuLV), Harvey Murines Sarkomvirus (HaMSV), Abelson Murines Leukämievirus (A-MuLV), AKR-MuLV, Felines Leukämievirus (FeLV), Simianes Sarkomvirus, Retikuloendotheliose-Virus (REV), Milznekrosevirus (SNV)), ein B-Typ-Virus (z. B. Maus-Mammatumor-Virus (MMTV)) und ein D-Typ-Virus (z. B. Mason-Pfizer Affenvirus (MPMV) und „SAIDS"-Viren). Ein RNA-Virus der Subfamilie Lentivirus ist zweckmäßigerweise ein Human-Immunschwäche-Virus Typ 1 oder 2 (i. e. HIV-1 oder HIV-2, wobei HIV-1 früher Lymphadenopathie-assoziiertes Virus 3 (HTLV-lll) und mit erworbenem Immunschwächesyndrom assoziiertes (AIDS-related) Virus (ARV) genannt wurde), oder ein anderes zu HIV-1 oder HIV-2 verwandtes Virus, das identifiziert und mit AIDS oder AIDS-ähnlichen Erkrankungen assoziiert wurde. Das Akronym „HIV" oder die Ausdrücke „AIDS-Virus" oder „Human-Immunschwäche-Virus" werden hier verwendet, um auf diese HIV-Viren, HIV-verwandten und HIV-assoziierten Viren generisch Bezug zu nehmen. Weiter ist ein RNA-Virus der Subfamilie Lentivirus vorzugsweise ein Visna/Maedi-Virus (z. B. solche, wie sie Schafe infizieren), ein Felines Immunschwächevirus (FIV), Bovines Lentivirus, Simianes Immunschwächevirus (SIV), Pferdeanämievirus (equine infectious anemia virus, EIAV) und Caprines Arthritis-Enzephalitis-Virus (CAEV).
Ein Virus gemäß dieser Erfindung ist auch zweckmäßigennreise ein DNA-Virus. Vorzugsweise ist das DNA-Virus ein Epstein-Barr-Virus, ein Adenovirus, ein Herpes-Simplex-Virus, ein Papilloma-Virus, ein Vaccinia-Virus und dergleichen.
Viele dieser Viren sind als Pathogene der Sicherheitsstufe 4 („Biosafety Level 4") klassifiziert (i. e. World Health Organization (WHO) „Risikogruppe 4"), für die maximales Containment bei der gesamten Laborarbeit erforderlich ist. Der Durchschnittsfachmann ist jedoch mit den für diese Viren erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen vertraut und in der Lage, sie einzuhalten.
Eine „Wirtszelle" kann jedwede Zelle sein und ist vorzugsweise eine eukaryotische Zelle. Zweckmäßigerweise ist die Wirtszelle ein Lymphozyt (wie ein T-Lymphozyt) oder ein Makrophage (wie ein monocytischer Makrophage), oder sie ist ein Vorläufer zu einer dieser Zellen, wie eine hämatopoetische Stammzelle. Vorzugsweise umfassen die Zellen ein CD4+ Glycoprotein an der Zelloberfläche, i. e. sie sind CD4+. Wünschenswertewreise ist jedoch ein CD4+ T-Lymphozyt, der mit dem AIDS-Virus infi ziert wurde, noch nicht aktiviert worden (i. e. vorzugsweise ist die Expression von nef noch nicht eingetreten, und noch bevorzugter wurde die CD4-Genexpression nicht herunterreguliert, wie nachstehend erörtert). Weiter ist eine Wirtszelle vorzugsweise eine Zelle, der der CD4-Marken fehlt und die doch in der Lage ist, von einem Virus gemäß dieser Erfindung infiziert zu werden. Solch eine Zelle schließt folgende ein, ohne darauf eingeschränkt zu sein: Astrozyt, Hautfibroblast, Darmepithelzelle und dergleichen. Vorzugsweise ist die Wirtszelle von einer eukaryotischen, mehrzelligen Spezies (z. B. im Gegensatz zu einer einzelligen Hefezelle) und, noch bevorzugter, eine Säuger-Zelle, z. B. eine menschliche Zelle. Eine Zelle kann als einzelne Einheit vorhanden sein, oder sie kann Teil einer größeren Ansammlung von Zellen sein. Eine solche „größere Ansammlung von Zellen" kann beispielsweise eine Zellkultur (gemischt oder rein), ein Gewebe (z. B. Epithel- oder anderes Gewebe), ein Organ (z. B. Herz, Lunge, Leber, Gallenblase, Harnblase, Auge und andere Organe), ein Organsystem (z. B. Kreislauf, Atmungsorgane, Gastrointestinalsystem, Harnorgane, Nervensystem, Haut- und Hautanhangsgebilde oder ein anderes Organsystem) oder ein Organismus (z. B. Vogel, Säuger oder dergleichen) sein. Vorzugsweise sind die Organe/Gewebe/Zellen, auf die abgezielt wird, aus dem Kreislaufsystem (z. B. einschließlich Herz, Blutgefäße und Blut, aber nicht darauf eingeschränkt), Atmungsorgane (z. B. Nase, Pharynx, Larynx, Trachea, Bronchien, Bronchiolen, Lungen und dergleichen), Gastrointestinalsystem (z. B. einschließlich Mund, Pharynx, Ösophagus, Magen, Eingeweide, Speicheldrüsen, Pankreas, Leber, Gallenblase u. a.), Harnsystem (z. B. wie Nieren, Harnröhre, Harnblase, Harnleiter und dergleichen), Nervensystem (z. B. einschließlich – aber nicht darauf eingeschränkt – Gehirn und Rückenmark, und spezielle Sinnesorgane, wie das Auge) und Haut- und Hautanhangsgebilde (z. B. Haut). Noch bevorzugter werden die Zellen, auf die abgezielt wird, aus der aus Herz-, Blutgefäß-, Lungen-, Leber-, Gallenblasen-, Harnblasen- und Augenzellen bestehenden Gruppe ausgewählt.
Vektor
Ein „Vektor" ist ein Nukleinsäuremolekül (typischerweise DNA oder RNA), das dazu dient, eine Passagier-Nukleinsäuresequenz (i. e. DNA oder RNA) in eine Wirtszelle zu transferieren. Drei übliche Typen von Vektoren schließen Plasmide, Phagen und Viren ein. Vorzugsweise ist der Vektor ein Virus.
Zweckmäßigerweise ist der Vektor kein Wildtyp-Stamm eines Virus, insofern als er von Menschen gemachte Mutationen enthält. Der Vektor wird also typischerweise von einem Wildtyp-Virusstamm durch genetische Manipulation (i. e. durch Deletion) abgeleitet, sodass ein bedingt replizierendes Virus umfasst ist, wie weiter hier beschrieben. Optimalerweise umfasst der virale Vektor einen Stamm eines Virus, das vom selben Typ wie das Wildtyp-Virus ist, welches die zu behandelnde Infektion verursacht, welches vorzugsweise eines der zuvor genannten Wildtyp-Viren ist. Folglich wird der Vektor vorzugsweise von einem RNA-Virus abgeleitet, bevorzugter von einem Retrovirus, und optimalerweise ist der Vektor von einem Human-Immunschwäche-Virus abgeleitet. Ein solcher von einem Human-Immunschwäche-Virus abgeleiteter Vektor wird hier generisch als „crHIV"-Vektor bezeichnet.
Ein Vektor ist vorzugsweise auch ein „chimärer Vektor", z. B. eine Kombination eines viralen Vektors mit anderen Sequenzen, wie beispielsweise eine Kombination von HIV-Sequenzen mit einem anderen Virus (das zweckmäßigerweise von einem Wildtyp-Virusstamm abgeleitet ist, um einen bedingt replizierenden Vektor zu umfassen). Insbesondere können HIV-Sequenzen zweckmäßigerweise mit Sequenzen eines modifizierten (i. e. Nicht-Wildtyp) Stammes von Adenovirus, Adeno-assoziiertem Virus, Sindbisvirus-Vektor oder einem amphotropen murinen retroviralen Vektor verknüpft werden.
Wie hier in Betracht gezogen, kann ein Vektor DNA oder RNA umfassen. Zum Beispiel kann entweder ein DNA- oder ein RNA-Vektor verwendet werden, um das Virus abzuleiten. Ähnlich kann eine cDNA-Kopie eines viralen RNA-Genoms gemacht werden. Alternativ kann eine cDNA- (oder virale genomische DNA-) Einheit in vitro transkribiert werden, um RNA zu produzieren. Diese Techniken sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt, und sie sind auch in den folgenden Beispielen beschrieben.
Ein „bedingt (konditional) replizierendes Virus" ist ein replikationsdefektes Virus, das nur unter bestimmten Bedingungen defekt ist. Insbesondere kann das Virus seinen Replikationszyklus in einer permissiven Wirtszelle beenden, in einer restriktiven Wirtszelle nicht. Eine „permissive Wirtszelle" ist eine mit einem Wildtyp-Stamm eines Virus infizierte Wirtszelle. Eine solche Infektion kann vor oder nach der Infektion mit einem bedingt replizierenden Virus gemäß dieser Erfindung erfolgen. Alternativ ist eine „permissive Wirtszelle" eine, die Wildtyp-Virusgenprodukte codiert, die für die Virusreplikation erforderlich sind. Ein bedingt replizierender Vektor gemäß dieser Erfindung ist also ein Virus (das vorzugsweise vom gleichen Virentyp ist, wie die Infektion, die behandelt wird), das nur nach Komplementation mit einem Wildtyp-Virusstamm repliziert oder wenn Wildtyp-Virus Zellen infiziert, die bedingt replizierende Vektorgenome enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Vektor ein RNA-Virus (z. B. ein bedingt replizierendes HIV-Virus), das in Form von DNA eingeführt wird. Diese bevorzugte Ausführungsform stellt eine Strategie mit replizierendem HIV-1 (crHIV) Vektor- bereit, die nicht-pathogene crHIV-1-Vektorgenome mit einem Selektionsvorteil gegenüber pathogenen Wildtyp-HIV-Genomen bietet. Speziell in Zellen, die Wildtyp-HIV- und crHIV-Genome enthalten, haben crHIV-RNAs einen Selektionsvorteil für das Verpacken in Virionen, weil sie beispielsweise Ribozyme enthalten, die Wildtyp-RNA schneiden, aber nicht crHIV-RNA. Solche nicht-pathogenen crHIVs sind in der Lage, sich in nicht infizierte Zellen auszubreiten, die für eine HIV-Infektion anfällig sind (z. B. CD4+ Zellen), in Gegenwart von Wildtyp-Helfervirus. Auf diese Art stört das selektive Verpacken und die Ausbreitung von crHIV die Replikation von Wildtyp-HIV.
Im Besonderen werden crHIV-Genome in infizierte Zellen oder nicht infizierte Zellen eingebracht. Infizierte Zellen versorgen das crHIV-Genom mit Proteinen, die für die Enkapsidation und die Bildung von Virionen-Nachkommenschaft erforderlich sind. crHIV-Genome werden in nicht infizierte Zellen vorzugsweise direkt durch Transduktion (z. B. kann das durch Liposom-vermittelte Transduktion von crHIV-DNA oder durch die Verwendung eines chimären viralen Vektors gemacht werden) oder durch Infektion von crHIV-Partikeln, die aus der Transfektion von mit Wildtyp-HIV infizierten Zellen resultieren, eingeführt. Nicht infizierte Zellen produzieren von sich aus keine crHIV-Partikel. Sie können jedoch mit Wildtyp-Virus superinfiziert werden, was die Proteine liefert, die für die weitere Produktion von crHIV-Partikeln erforderlich sind. In diesem Sinn fungiert ein bedingt replizierender Vektor gemäß dieser Endung auch als eine Art „viraler Transfer-Vektor", der die Mittel bereitstellt, durch die mehrfache Durchgänge der crHIV-Infektion (i. e. in Gegenwart von gleichzeitiger Infektion mit Wildtyp-HIV) folgen können. Ein solcher Vektor, der eine Virenquelle für mehr als einen Durchgang der Virusreplikation bereitstellt, kontrastiert mit anderen derzeit ver wendeten Vektoren, wie jenen, die mit Verpackungszelllinien verwendet werden und die für nur einen Durchgang der Replikation sorgen.
Falls das gewünscht wird (z. B. um die Verwendung des Vektors in vitro zu erleichtern), können virale Wildtyp-Genprodukte der mit dem bedingt replizierenden Vektor infizierten Zelle gleichzeitig zugeführt werden. Virale Wildtyp-Genprodukte können nicht nur durch Co-Infektion mit einem Wildtyp-Virusstamm (oder einer cDNA oder einem Provirus eines RNA-Virus) zugeführt werden, sondern auch dadurch, dass man sie einer Zelle in Form ihrer Gene, subkloniert in einem Expressionsvektor, z. B. einem Hilfs-Expressionsvektor („Helfer"), der in der Lage ist, auf einer Wirtszelle Transkription oder Translation der Sequenzen (regulatorisch oder strukturell) zu geben, zuführt, oder alternativ können die Genprodukte exogen zugeführt werden, i. e. durch Zugabe der Proteinprodukte zu der Zelle. In Bezug auf den „Helfer": Seine Expression kann zeltspezifisch oder nicht zeltspezifisch sein, und er kann in eine Wirtszelle gemeinsam mit einem bedingt replizierenden viralen Vektor, wie er hier definiert ist, eingeführt werden und die kontinuierliche Replikation des bedingt replizierenden viralen Vektors ermöglichen.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Komplementation" auf eine nicht-genetische Interaktion von viralen Genprodukten aus unterschiedlichen Quellen in Zellen. Speziell mit einer Mischinfektion umfasst die Komplementation eine Erhöhung der Virenausbeute von einem oder beiden parentalen Genomen, während die Genotypen der parentalen Genome unverändert bleiben. Die Komplementation kann nicht-allelisch (i. e. intergen, wobei in verschiedenen Funktionen defekte Mutanten einander bei der Virusreplikation durch Zuführen der im anderen Virus defekten Funktion unterstützen) oder allelisch (i. e. intragen, wobei die beiden Eltern in verschiedenen Domänen eines multimeren Proteins Defekte haben) sein.
Zweckmäßigerweise können die Arten von Zellen, die mit crHIV-DNA transfiziert (transduziert) (i. e. durch Liposomen oder durch Verwendung eines adenoviralen Vektors oder eines amphotropen retroviralen Vektors) werden können, mit HIV infizierte oder nicht infizierte Zellen sein. Mit HIV infizierte Zellen können aktiviert oder nicht aktiviert sein. Wenn sie aktiviert sind, transkribieren sie sofort Wildtyp-HIV-RNA und crHIV-RNA, was zu selektiver Verpackung von crHIV-RNA in Virionen-Nachkommenschaft führt. Wenn mit HIV infizierte Zellen nicht aktiviert sind, bleibt die crHIV-DNA in ihnen, bis sie aktiviert werden (z. B. durch Stimulierung durch Mitogene, Antigene und dergleichen), was wiederum zu selektiver Verpackung von crHIV-RNA in Virionen-Nachkommenschaft führt. Weder aktivierte noch nicht aktvierte uninfizierte Zellen, die mit crHIV-DNA transfiziert sind, erzeugen Virionen, bis sie mit Wildtyp-HIV superinfiziert und durch Stimulation aktiviert werden, was wiederum zu selektiver Verpackung von crHIV RNA in Virionen-Nachkommenschaft führt.
Die Superinfektion von Zellen, die crHIV-Genoma (z. B. als Ergebnis einer Transfektion oder Infektion enthalten, tritt auf, weil crHIV-Genoma keine viralen Proteine codieren, die die Superinfektion blockieren (wie env oder nef) Die resultierenden crHIV-Virionen können nicht infizierte Zellen infizieren, wiel die Viruspartikel das Reverse Transkriptase-Molekül enthalten, das aIIe HIV-Partikel tragen, so dass sie ein DNA-Provirus aus ihrer genomischen RNA erzeugen können. Dieser Prozess wird reverse Transkription genannt. Sobald crHIV-Virionen nicht infiziere Zellen infizieren, könnn sie reverser Transkription unterliegen und ein Provirus aus ihrer genomischen RNA erzeugen. Diese Zellen sind daher jenen nicht infizierten Zelten äquivalent, die direkt mit crHIV-DNA transduziert werden. Sie können keine crHIV-Partikel erzeugen, bis diese Zellen mit Wildtyp-HIV superinfiziert und aktiviert werden, dann tritt wiederum selektives Verpacken von crHIV-RNA in Virionen-Nachkommenschaft auf. Es ist möglich, dass crHIV-Partikel auch einige Zellen infizieren, die schon mit HIV infiziert sind (siehe z. B. Yunoki et al., Arch. Virol., 116, 143–158 (1991); Winslow et al., Virol., 196, 849–854 (1993); Chen et al., Nuc. Acids Res., 20, 4581–4589 (1992); und Kim et al., AIDS Res. & Hum. Retrovir., 9, 875–882 (1993)). Damit dies auftritt, dürfen die HIV-infizierten Zellen jedoch keine Proteine exprimieren, welche die CD4-Expression herunterregulieren, weil das die crHIV-Virionen daran hindert, diese Zellen zu infizieren. Aktivierte, mit HIV infizierte Zellen regulieren im Allgemeinen die CD4-Expression herunter. Folglich sind mit HIV infizierte Zellen, die nicht aktiviert sind, potentiell empfänglich für crHIV-Superinfektion und könnten daher eine andere Quelle für die Produktion von crHIV-Partikeln sein.
Mit einem bevorzugten crHIV-Vektor gemäß dieser Erfindung umfasst der Vektor Sequenzen, die für RNA-Transknption, tRNA Primen-Bindung, Dimerisierung und Verpackung erforderlich sind, und es fehlen Sequenzen, die Proteine codieren, welche die Superinfektion mit Wifdtyp-HIV blockieren (z. B. nef oder env Proteine), oder es sind solche Sequenzen enthalten, aber Sie werden nicht transkribiert oder nicht translatiert in funktionelle Proteine, so dass ihre Expression für „still" gehalten wird. Noch bevorzugter fehlen dem Vektor die Region oder die Region codierende Sequenzen von Wildtyp-HIV von innerhalb der gag codierenden Sequenz bis und einschließlich des nef-Gens. Optimalerweise umfasst jedoch der Vektor das rev-responsive Element (RRE), das in den Vektor kloniert wird in der Region der Deletion oder einer anderen geeigneten Region. Von einem solchen bevorzugten HIV-Vektor sagt man, dass ihm „die Region oder die Region codierende Sequenzen fehlen", da dieser Vektor in der RNA-Manifestation verabreicht werden kann oder alternativ als DNA, wie zuvor beschrieben.
Die Konstruktion von Vektoren ist den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt. Zum Beispiel – und wie im Beispiel 1 beschrieben – wird die DNA-Manifestation eines RNA-Virus, wie HIV, unter Verwendung von Restriktionsenzymen geschnitten, um HIV codierende Sequenzen auszuschneiden von innerhalb der gag codierenden Region bis innerhalb der U3 Region, dem nef-Gen folgend. Eine Klonierungskassette, die einen Polylinker mit mehrfachen Restriktionsstellen enthält, wird in die Region der Deletion vor der Ligation eingeführt, um geeignete Restriktionsstellen für das Klonieren in den Vektor bereitzustellen. Ein RRE enthaltendes DNA-Fragment wird in eine dieser Stellen subkloniert. Der resultierende Vektor erzeugt ein trunkiertes gag-Transkript und erzeugt kein Wildtyp-Gag-Protein oder irgendwelche anderen Wildtyp-HIV-Proteine. Es ist außerdem nicht erforderlich, dass der Vektor das trunkierte gag-Protein exprimiert, da die gag-Translationsinitiationssequenz mutiert werden kann, um die Translation zu verhindern.
Unter Verwendung des gleichen Ansatzes können die crHIV-Sequenzen auch an andere Sequenzen gebunden werden, wie jene eines Virus oder eines anderen Vektors, um einen chimären Vektor zu erhalten. Beispielsweise können die crHIV-Sequenzen an die von Sindbis-Virus, AAV, Adenovirus oder amphotropem Retrovirus ligiert werden, um nur einige solche Viren zu nennen, die verwendet werden können, um für den Transfer der crHIV-Sequenzen zu sorgen. Mit einem solchen chimären Vektor kann der Vektor in die Zelle eingeführt werden, und zwar entweder unter Verwendung des gemeinsamen Virus-Mechanismus für den Eintritt in die Zelle (z. B. Rezeptor-vermittelte Endocytose für Adenovirus) oder anderer Mittel, z. B. Liposomen.
Vorzugsweise umfasst erfindungsgemäß ein Vektor (i. e. ein bedingt replizierendes Virus, das vorzugsweise ein crHIV-Vektor ist) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, deren Besitz (i. e. Anwesenheit, Transkription oder Translation) einen Selektionsvorteil verleiht. Zwei Arten von Nukleinsäuresequenzen werden für das Einbringen in den Vektor in Betracht gezogen: (1) eine Nukleinsäuresequenz, deren Besitz optimalerweise einen Selektionsvorteil für die Virusreplikation und Ausbreitung einem eine solche Sequenz enthaltenden Vektor gegenüber einem Wildtyp-Stamm eines Virus (i. e. vorzugsweise einem Wildtypstamm, von dem der Vektor abgeleitet wurde und der die Sequenz nicht umfasst) verleiht und (2) eine Nukleinsäuresequenz, deren Besitz optimalerweise den mit einem die Sequenz enthaltenden Vektor infizierten Zellen einen Selektionsvorteil verleiht im Vergleich zu Zellen, die mit einem Wildtypstamm des Virus infiziert wurden (i. e. vorzugsweise einem Wildtypstamm, von dem der Vektor abgeleitet wurde (und auch beispielsweise ein Hilfs-Expressionsvektor, der die Vektorreplikation und/oder die Funktion in einer nicht infizierten Wirtszelle fördert) und der die Sequenz nicht enthält), beispielsweise durch Fördern des Überlebens der Zelle, Fördern der Vektorpartikelproduktion und/oder -vermehrung, Förderung der Produktion von crHIV-Vektor-Virionen von crHIV-Vektor produzierenden Zellen, Herbeiführen von Apoptose, Erleichterung der Proteinproduktion oder Förderung der immunologischen Funktion oder des Targeting, um ein gewünschtes prophylaktisches, therapeutisches oder biologisches Ergebnis zu erzielen, Jede dieser Sequenzen oder mehrere von jeder dieser Sequenzen, i. e. eine Sequenz, die allein oder in Kombination mit (einem) anderen Faktoren) die Vermehrung des Vektor fördert und/oder eine spezielle Wirtszellenfunktion fördert, um ein vorteilhaftes prophylaktisches, therapeutisches und/oder biologisches Ergebnis zu ermöglichen, kann in den Vektor inkludiert werden, und zwar in Abwesenheit oder Anwesenheit der anderen Sequenz, i. e. der Vektor kann „mindestens eine Nukleinsäuresequenz" und „mindestens eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz" beinhalten.
Eine „Nukleinsäure" ist wie zuvor beschrieben. Eine „Nukleinsäuresequenz" im Besonderen beinhaltet ein Gen oder eine codierende Sequenz (i. e. DNA oder RNA), potentiell von jedweder Größe (i. e. beschränkt natürlich von den Bedingungen der Verpackung, die der Vektor auferlegt), wobei der Besitz einen Selektionsvorteil verleiht, wie hier definiert. Ein „Gen" ist eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert oder ein nascierendes mRNA-Molekül (unabhängig davon, ob die Sequenz transkribiert und/oder translatiert wird). Obwohl ein Gen codierende Sequenzen so wie nicht codierende Sequenzen (z. B. regulatorische Sequenzen) enthält, schließt eine „codierende Sequenz" nicht-codierende DNA nicht ein.

1. Nukleinsäuresequenz, deren Besitz in einer Wirtszelle einem eine solche Sequenz enthaltenden Vektor einen Selektionsvorteil gegenüber einem Wildtypsiamm eines Virus verleiht

Eine Nukleinsäuresequenz, die einem Vektor in einer Wirtszelle einen Selektionsvorteil gegenüber einem Wildtypstamm eines Virus verleiht, ist vorzugsweise irgendeine Sequenz, die erlaubt, dass von dem Vektor vermehrte Viruspartikel selektiv produziert oder verpackt werden im Vergleich zu Viruspartikeln, die von dem Wildtyp-Virus vermehrt werden. Solche Sequenzen schließen folgende ein, ohne darauf eingeschränkt zu sein: eine Sequenz, die zu einem Anstieg bei der Zahl der intrazellulär erzeugten Vektorgenome im Vergleich zu Wildtyp-Genomen führt, und eine antivirale Nukleinsäuresequenz.
Die erste Kategorie von Nukleinsäuresequenzen, die einem die Sequenz enthaltenden Vektor in einer Wirtszelle gegenüber einem Virus-Wildtypstamm einen Selektionsvorteil verleihen, sind Sequenzen wie ein Promotor. Ein „Promotor" ist eine Sequenz, welche die Bindung von RNA-Polymerase steuert und dabei die RNA-Synthese fördert und die einen oder mehrere Enhancer enthalten kann. „Enhancer" sind cis-wirkende Elemente, welche die Transkription benachbarter Gene stimulieren oder hemmen. Ein Enhancer, der die Transkription hemmt, wird auch als „Silencer" bezeichnet. Enhancer unterscheiden sich von DNA-Bindungsstellen für Sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine, die nur im Promotor gefunden werden (die auch als „Promotor-Elemente" bezeichnet werden), dadurch, dass Enhancer in jeder Orientierung fungieren können und über Distanzen von bis zu mehreren Kilobasenpaaren (kb), selbst von einer Position stromab von einer transkribierten Region.
Folglich ist der Promotor (z. B. LTR (long terminal repeat)) eines bedingt replizierenden HIV-Vektors vorzugsweise so modifiziert, dass der Vektor mehr auf bestimmte Cytokine anspricht als der Wildtyp-HIV-Stamm. Beispielsweise ist ein modifizierter HIV-Promotor erhältlich, der in Gegenwart von Interleukin-2 erhöhte Transkriptionsaktivität zeigt. Das Einbringen dieses Promotors in einen Vektor und das Einführen des Vektors in Wildtyp-HIV-infizierte Zellen führt vorzugsweise zu einer erhöhten Produktion und Verpackung von Virionen-Nachkommenschaft vom Vektorgenom im Vergleich zu Wildtyp-HIV-Genom. Andere Cytokine und/oder Chemokine (z. B. einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Tumornekrosefaktor α, RANTES und dergleichen) können ebenfalls verwendet werden, um das selektive Verpacken von Virionen zu fördern, codiert von dem Vektor.
Die zweite Kategorie von Nukleinsäuresequenz, die einem die Sequenz enthaltenden Vektor im Vergleich zu einem Virus-Wildtypstamm einen Selektionsvorteil verleiht, schließt als bevorzugte Nukleinsäuresequenz eine antivirale Nukleinsäuresequenz ein. „Antivirale Agenzien" werden nach ihrer Wirkungsart in Kategorien eingeteilt, z. B. Inhibitoren der Reversen Transkriptase, Konkurrenten um den Viruseintritt in Zellen, Vakzine, Protease-Inhibitoren und genetische antivirale Mittel. „Genetische antivirale Mittel" sind DNA- oder RNA-Moleküle, die in Zellen transferiert werden und ihre intrazellulären Ziele entweder direkt (i. e. wie intrazellulär eingeführt) oder nach ihrer Umwandlung in RNA oder Protein (dargestellt von Dropulic et al. (1994), supra) beeinflussen. Eine genetische antivirale Sequenz ist auch eine bevorzugte Nukleinsäuresequenz. Genetische antivirale Agenzien schließen folgende ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Antisense-Moleküle, RNA-Decoys, transdominante Mutanten, Toxine, Immunogene und Ribozyme. Zweckmäßigerweise ist ein genetisches antivirales Mittel ein Antisense-Molekül, ein Immunogen und ein Ribozym. Folglich ist eine bevorzugte Nukleinsäuresequenz, die einem Vektor gegenüber einem Virus-Wildtypstamm einen Selektionsvorteil verleiht, die eines genetischen antiviralen Mittels, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense-Molekül, einem Immunogen und einem Ribozym.
Ein „Antisense-Molekül" ist ein Molekül, das ein kurzes Segment eines Gens spiegelbildlich darstellt, dessen Expression blockiert werden soll. Ein gegen HIV gerichtetes Antisense-Molekül hybridisiert mit Wildtyp-HIV-RNA, wobei der vorzugsweise Abbau durch zelluläre Nukleasen ermöglicht wird. Antisense-Moleküle sind vorzugsweise DNA-Oligonukleotide, zweckmäßigerweise mit etwa 20 bis etwa 200 Basenpaaren Länge, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 50 Basenpaaren Länge und optimalerweise weniger als 25 Basenpaaren Länge. Ein Antisense-Molekül kann von crHIV-RNA exprimiert werden, die vorzugsweise an genomische Wildtyp-RNA bindet, wobei die crHIV-RNA mit einem Selektionsvorteil für die Verpackung in Virionen-Nachkornmenschaft versehen wird.
Ein „Immunogen" ist ein Einzelketten(single-chain)-Antikörper (scAb), der gegen ein virales Strukturprotein gerichtet ist. Ein Immunogen wird als Nukleinsäure transferiert und intrazellulär expoimiert. Ein Immunogen kann auch irgendein Antigen, Oberflächenprotein (einschließlich jener, die klassenrestringiert sind) oder ein Antikörper sein, der die Vektor- und/oder Wirtszellenselektion erleichtert. In einem bevorzugten Vektor umfasst die Nukleinsäuresequenz einen scAb, der an Wildtyp-HIV-Rev-Protein bindet. Das verhindert vorzugsweise die Reifung von Rev-Protein, indem es dazu führt, dass dieses im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten wird. Speziell exportieren Rev-Proteine ungespleißte HIV-RNA zum Zytoplasma durch Bindung an RRE und Oligomerisierung, um die HIV-RNA zu umgeben. HIV-RNAs, die mit Rev komplexiert sind, werden in das Zytoplasma exportiert und umgehen den Spleiß-Mechanismus der Zelle. Wenn also Wildtyp-Rev nicht an Wildtyp-RRE bindet, werden Wildtyp-HIV-RNAs nicht in das Zytoplasma exportiert und nicht in Virionen-Nachkommenschaft verkapselt.
Optimalerweise umfasst der die scAb-Nukleinsäuresequenz enthaltende Vektor eine modifizierte RRE-Sequenz und codiert eine mutiertes Rev-Protein, das modifiziertes RRE, aber nicht Wildtyp-RRE erkennt. Folglich wird der Vektor in Zellen, die Wildtyp-HIV und einen die scAb-Nukleinsäuresequenz umfassenden Vektor enthalten, vorzugsweise in Virionen gepackt. Eine ähnliche Strategie wird vorzugsweise dort verwendet, wo Proteine von Wildtyp-HIV-Matrix oder Nucleocapsid (i. e. oder irgendein Protein, das in Protein/RNA-Interaktionen involviert ist, die Enkapsidation von viraler RNA beeinflussen) die Ziele des scAb sind.
Ein „Ribozym" ist ein Antisense-Molekül mit katalytischer Aktivität, i. e. statt RNA zu binden und die Translation zu hemmen, binden Ribozyme RNA und bewirken eine ortsspezifische Spaltung des gebundenen RNA-Moleküls. Im Altgemeinen gibt es vier Ribozym-Gruppen: Tetrahymena-Gruppe 1 intervenierende Sequenz, RNase P, Hammerhead- und Hairpin-Ribozyme. Es existieren jedoch auch weitere katalytische Motive in anderen RNA-Molekülen, z. B. Hepatitis Delta-Virus und ribosomale RNAs in Pilz-Mitochondrien.
Ein bevorzugtes Ribozyms ist ein Ribozym, in dem die katalytische Domäne eine 3'-Nukleotid-NUH-Sequenz schneidet, wobei N irgendein Nukleotid sein kann (i. e. G, A, U oder C) und N gleich A, C oder U sein kann. Da jedoch die Sequenz, die am wirksamsten durch solche Ribozyme geschnitten wird, eine GUC-Stelle ist, umfasst die NUH-Sequenz vorzugsweise eine GUC-Stelle.
Zweckmäßigerweise schneidet ein solches Ribozym in einer in einer Region eines Wildtyp-Virenstammes oder seiner Transkripte, aber nicht in einer Region eines Vektors oder seiner Transkripte. Das Ribozym schneidet das Virus oder seine Transkripte in dem Sinn, dass ein solches Virus oder Vektor RNA oder DNA sein kann, wie zuvor beschrieben. Mit Schneiden „in einer Region" ist Schneiden in einer Region, auf die abgezielt wird, gemeint, i. e. vorzugsweise eine Region des Virus, die für die Virusvermehrung erforderlich ist. Zweckmäßigerweise wurde der Vektor so modifiziert, dass diese spezielle Region, auf die abgezielt wird (i. e. wenn überhaupt in dem Vektor vorhanden) nicht durch das Ribozym geschnitten wird. Optional kann das Ribozym den Vektor schneiden, solange die Spaltung nicht in einer Region erfolgt, die für die Vermehrung viraler, z. B. crHIV, Partikel erforderlich ist.
Optimalerweise wird das Ribozym durch eine Sequenz codiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 3 (i. e. CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA) und SEQ iD NR. 4 (i. e. ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC). Während SEQ iD NR. 3 ein Ribozym umfasst, das auf die Stelle +115 (i. e. ausgedrückt als Zahl der Basen stromab vom Transkriptionsstart) der Wildtyp-HIV U5 Region ausgerichtet ist, umfasst SEQ ID NR. 4 ein Ribozym, das auf die Stelle +133 der Wildtyp-HIV U5 Region ausgerichtet ist.
Ein solches Ribozym ist in der Lage, innerhalb des Wildtyp-HIV-Genoms (oder seiner Transkripte) zu schneiden, aber nicht das Vektorgenom (oder seine Transkripte), da die U5-Sequenzen des Vektors durch ortsgerichtete Mutagenese in vitro modifiziert sind, wie das auf diesem Gebiet bekannt ist und im Beispiel 1 beschrieben wird. Insbesondere werden die Vektorsequenzen vorzugsweise so modifiziert, dass der Vektor eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

SEQ ID NR. 14, worin mindestens ein N mutiert ist, SEQ ID NR. 15 und SEQ ID NR.
16. In der Form von RNA enthält der Vektor vorzugsweise eine Sequenz, die durch eine Sequenz codiert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 5, SEQ ID NR. 6, SEQ ID NR. 14, worin mindestens ein N mutiert ist, SEQ ID NR. 15 und SEQ ID NR. 16. Im Gegensatz dazu enthält Wildtyp-HIV die U5-Sequenz codiert durch die Sequenz von SEQ ID NR. 1 (i. e. GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC). Die Modifizierungen in toto und der Vergleich mit der Wildtyp-U5-Sequenz (in der Form von DNA) sind in 2 dargelegt.
Zudem können andere Ribozyme, die auf andere Regionen eines viralen und insbesondere eines HIV-Genoms ausgerichtet sind, allein oder in Kombination verwendet werden. Beispielsweise kann das Ribozym innerhalb anderer RNA-Sequenzen schneiden, die für die Virusreplikation erforderlich sind, z. B. in der Reversen Transkriptase, Protease oder Transaktivator-Protein, innerhalb von Rev oder innerhalb anderer notwendiger Sequenzen, wie beschrieben wurde. Vorzugsweise enthält ein Vektor multiple Ribozyme, z. B. auf mehrer Orte ausgerichtet. In solchen Fällen werden die analogen Sequenzen in dem Vektor durch ortsgerichtete Mutagenese oder ein anderes auf dem Gebiet bekanntes Mittel modifiziert, um einen Vektor abzuleiten, der gegen eine solche Ribozym-Spaltung resistent ist.
Wenn der Vektor ein Human-Immunschwäche-Virus ist, fehlen dem Vektor vorzugsweise das tat-Gen und die 5'-Spleiß-Stelle, und stattdessen ist eine Tripel-anti-Tat-Ribozym-Kassette vorhanden, wobei die katalytische Domäne jedes Ribozyms der Tripel-Ribozym-Kassette eine andere Stelle an einem Nukleinsäuremolekül vom Wildtyp-Human-Immunschwächevirus schneidet, insbesondere an einer anderen Stelle innerhalb von tat. Vorzugsweise schneidet die katalytische Domäne jedes Ribozyms eine Nukleotidsequenz in einer Region eines Nukleinsäuremoleküls von Wildtyp-Human-Immunschwächevirus, für die kein Ribozym-empfindliches Gegenstück im Vektor selbst vorhanden ist.

2. Nukleinsäuresequenz, deren Besitz den mit einem die Sequenz aufweisenden Vektor infizierten Zellen einen Selektionsvorteil im Vergleich zu den mit einem Wildtyp-Stamm des Virus infizierten Zellen verleiht

Eine Nukleinsäuresequenz, die einer Zelle, die einen die Sequenz aufweisenden Vektor enthält, einen Selektionsvorteil gegenüber einer Zelle verschafft, die einen Wildtyp-Virenstamm enthält (i. e. der diese Sequenz fehlt), ist vorzugsweise jede Sequenz, die erlaubt, dass eine den Vektor enthaltende Zelle überlebt und Viruspartikel (i. e. crHIV-Viruspartikel) sich vermehren, im Vergleich zu einer Zelle, die das Wildtyp-Virus enthält. Solche Sequenzen schließen jedwede Sequenz ein, die ermöglicht, dass die Zelle oder der darin enthaltende Vektor der Zerstörung entgeht, Sequenzen, die das Überleben der Zelle fördern, Sequenzen, die Apoptose induzieren, Sequenzen, die Proteinproduktion erleichtern, oder Sequenzen, die Immunfunktion oder das Targeting fördern, sind aber nicht darauf eingeschränkt.
Beispielsweise codiert eine solche auf dem Vektor vorhandene Nukleinsäuresequenz Gene für eine Resistenz gegen mehrere Wirkstoffe (siehe z. B. Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 141, 956–962 (1986) ; Ueda et al., J. Biol. Chem., 262, 505-508 (1987); und Ueda et al., PNAS, 84, 3004–3008 (1987)). In der Gegenwart von zugesetztem zytotoxischem Wirkstoff (z. B. wie sie bei der Chemotherapie gegen Krebs verwendet werden), ermöglicht das einer den Vektor enthaltenden Zelle zu überleben, wohingegen eine Zelle, die Wildtyp-Virus enthält, wie HIV, nicht überlebt. Solche zytotoxischen Wirkstoffe (Medikamente) schließen–ohne darauf eingeschränkt zu sein–ein: Actinomycin D, Vinblastinsulfat, Vincristinsulfat, Daunomycin, Adriamycin, VP-16 und AMSA.
Alternativ enthält eine solche Nukleinsäuresequenz zweckmäßigerweise eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz einer mutierten (i. e. mutanten) Protease (oder einer Sequenz, die eine solche codiert) und einer Sequenz einer mutierten (i. e. mutanten) Reversen Transkriptase (oder einer Sequenz, die eine solche codiert). Vorzugsweise wird eine mutierte Reverse Transkriptase so konstruiert, dass sie resistent ist gegenüber nukleosidischen und nichtnukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, und eine mutierte Protease wird so konstruiert, dass sie gegen üblicherweise verwendete Protease-Inhibitoren resistent ist.
Die Verabreichung dieser Protease- oder Reverse-Transkriptase-Inhibitoren an einen Wirt in Verbindung mit dem Vektor wird angewendet, um den Vektor produzierende Zellen zu selektieren, im Gegensatz zu Wildtyp-Virus produzierenden Zellen. Ähnlich wird dieser Ansatz modifiziert für die Verwendung mit irgendeinem Wirkstoff, der die. Virusreplikation hemmt, so dass das Virus mutiert werden kann, um der Hemmung zu entgehen. Folglich enthält für die Behandlung von HIV die in den Vektor eingebrachte selektive Nukleinsäuresequenz vorzugsweise mutierte HIV-Sequenzen. Optimalerweise verhindern diese Sequenzen jedoch nicht die Superinfektion mit Wildtyp-HIV.
Vorzugsweise ist der Vektor einer von denen, die oben dargelegt wurden, und insbesondere einer der in den 1B bis 1E dargestellten bevorzugten crHIV-Vektoren, i. e. crHIV-1.1, crHIV-1.11, crHIV-1.12 bzw. crHIV-1.111 (Dropulic' et al., PNAS, 93, 11103–11108 (1996)). Ebenfalls bevorzugt ist ein Vektor, wie er im Beispiel 11 beschrieben ist, i. e. cr2HIV.
Dem cr2HIV-Vektor fehlen vorzugsweise das tat-Gen und seine Spleiß-Stelle vom Genom eines Wildtyp-Human-Immunschwächevirus. An Stelle des tat-Gens und seiner Spleiß-Stelle enthält der cr2HIV-Vektor eine Tripel-anti-Tat-Ribozym-Kassette, wobei die katalytische Domäne jedes Ribozyms der Tripel-Ribozym-Kassette eine andere Stelle auf dem Nukleinsäuremolekül von Wildtyp-HIV schneidet. Vorzugsweise schneidet die katalytische Domäne jedes Ribozyms der Tripel-Ribozym-Kassette eine andere Stelle innerhalb von tat auf einem Wildtyp-HIV-Nukleinsäuremolekül. Bevorzugter schneidet die katalytische Domäne jedes Ribozyms eine Nukleotidsequenz in einer Region eines Nukleinsäuremoleküls von Wildtyp-HIV, für die kein Ribozym-unempfindliches Gegenstück im Vektor selbst vorhanden ist.
Optimalerweise ist ein Vektor kompatible mit der Zelle, in die er eingeführt wird, z. B. ist er in der Lage, auf der Zelle Expression der Vektor-codierten Nukleinsäuresequenzen zu vermitteln. Zweckmäßigerweise umfasst der Vektor einen Replikationsursprung, der in der Zelle funktional ist. Wenn eine Nukleinsäuresequenz in Form ihrer DNA codierenden Sequenz transferiert wird (z. B. versus in Form eines kompletten Gens, das seinen eigenen Promotor enthält), enthält der Vektor optimalerweise auch einen Promotor, der in der Lage ist, die Expression der codierenden Sequenz zu steuern und der mit der codierenden Sequenz operabel verbunden ist. Eine codierende Sequenz ist mit einem Promotor „operabel verbunden" (z. B. wenn die codierende Sequenz und der Promotor zusammen ein natives oder rekombinantes Gen konstituieren), wenn der Promotor in der Lage ist, die Transkription der codierenden Sequenz zu dirigieren.
In einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor sind vorzugsweise alle geeigneten Transkriptions- (z. B. Initiations- und Terminationssignale), Translations- (z. B. Ribosom-Eintritt oder Bindungsstelle und dergleichen) und Processing-Signale (z. B. Spleiß-Donor- oder -Akzeptor-Stellen, falls erforderlich, und Polyadenylierungssignale) korrekt auf dem Vektor angeordnet, so dass jedes Gen oder jede codierende Sequenz geeignet in den Zellen transkribiert (und/der translatiert, falls das gewünscht ist) wird, in die der Vektor eingeführt wird. Die Manipulation solcher Signale zum Sicherstellen der geeigneten Expression in Wirtszellen liegt im Bereich der Kenntnisse und Fähigkeiten des Durchschnittsfachmannes.
Vorzugsweise enthält der Vektor auch Mittel, durch die der Vektor oder seine enthaltene subklonierte Sequenz identifiziert und selektiert wird. Die Vektoridentifizierung und/oder -selektion erfolgt unter Verwendung einer Vielzahl von Ansätzen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Beispielsweise werden Vektoren, die spezielle Gene oder codierende Sequenzen enthalten, vorzugsweise identifiziert durch Hybridisierung, die Gegenwart oder Abwesenheit so genannter „Macker"-Genfunktionen, die von auf dem Vektor vorhandenen Markengenen codiert werden, undloder die Expression spezieller Sequenzen. Im ersten Ansatz wird die Gegenwart einer speziellen Sequenz in einem Vektor durch Hybridisierung (z. B. durch DNA-DNA-Hybridisierung) unter Verwendung von Sonden detektiert, die zu der relevanten Sequenz homologe Sequenzen aufweisen. Im zweiten Ansatz wird das System rekombinanter Vektor/Wirt identifiziert und selektiert auf Basis der Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter Markergenfunktionen, wie Antibiotikaresistenz, Thymidinkinase-Aktivität und dergleichen, die durch auf dem Vektor vorhandene spezielle Gene, die diese Funktionen codieren, verursacht sind. Im dritten Ansatz werden Vektoren durch Prüfung hinsichtlich eines bestimmten Genproduktes, das von dem Vektor codiert wird, identifiziert. Solche Prüfungen basieren auf den physikalischen, immunologischen oder funktionalen Eigenschaften des Genproduktes.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung auch einen Vektor bereit, der, wenn er DNA ist, eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 3, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, der, wenn er RNA ist, eine Nukleotidsequenz aufweist, die codiert wird durch eine Nukle otidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren bereit, um einen Vektor zu erzeugen, der von einem Wildtyp-Human-Immunschwächevirus abgeleitet ist und der in der Lage ist, nur in einer Wirtszelle zu replizieren, die die Replikation dieses Vektors gestattet, mit einem Ribozym. Das Ribozym, das in dem Vektor vorhanden oder von ihm codiert ist, schneidet eine Nukleinsäure eines Wildtyp-Human-Immunschwächevirus, aber nicht den Vektor selbst und seine Transkripte, sofern vorhanden. Das Verfahren beinhaltet, dass ein Vektor erhalten wird, der von einem Wildtyp-Human-Immunschwächevirus abgeleitet ist und der in der Lage ist, nur in einer Wirtszelle zu replizieren, die die Replikation dieses Vektors gestattet, und dass in den Vektor eine Nukleinsäuresequenz eingebracht wird, die ein Ribozym umfasst oder codiert, dessen katalytische Domäne eine Nukleinsäure eines Wildtyp-Human-Immunschwächevirus schneidet, aber nicht den Vektor selbst oder seine Transkripte, sofern vorhanden. In einem solchen Verfahren kann die Nukleotidsequenz, die die U5-Sequenz des Wildtyp-Human-Immunschwächevirus enthält oder codiert, von dem Vektor deletiert und durch eine Nukleotidsequenz ersetzt werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, wenn der Vektor DNA ist, und eine Nukleotidsequenz, die codiert ist durch eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, wenn der Vektor RNA ist. Vorzugsweise repliziert der Vektor in einer für die Replikation dieses Vektors permissiven Zelle mehr als ein Mal.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Modifizieren eines Vektors bereit. Das Verfahren beinhaltet, dass man einen Vektor erhält und in ihn eine Nukleotidsequenz einbringt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den DNA-Sequenzen SEQ ID NRN. 2, 3, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, wenn der Vektor DNA ist, und eine Nukleotidsequenz, die codiert ist durch eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 3, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, wenn der Vektor RNA ist.
Weiters stellt diese Erfindung ein Verfahren zum Vermehren und selektiven Verpacken eines bedingt replizierenden Vektors ohne die Verwendung einer Verpackungs zelllinie bereit. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen des bedingt replizierenden Vektors mit einer Zelle, die zur Infektion durch einen anderen Vektor befähigt ist, der derselbe Vektortyp wie der bedingt replizierende Vektor ist und der sich vom bedingt replizierenden Vektor dadurch unterscheidet, dass er für die Replikationskompetenz Wildtyp ist; anschließendes Inkontaktbringen der Zelle mit dem anderen Vektor; und Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die zur Vermehrung des bedingt replizierenden Vektors führen.
Bereitgestellt wird auch ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, einem RNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die codiert ist durch eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16.
Methoden der Verwendung
Die oben beschriebenen Vektoren werden vorzugsweise für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Virusinfektionen, wegen der Einfachheit der Vektorhaltung und aus anderen Gründen in eine Wirtszelle eingeführt. Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle bereit, die einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Die Isolierung von Wirtszellen und/oder die Haltung solcher Zellen oder davon . abgeleiteter Zeltlinien in Kultur ist eine Routineangelegenheit geworden und eine, in der der Durchschnittsfachmann versiert ist.
Insbesondere wird ein Vektor, wie er oben beschrieben wurde, vorzugsweise bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung einer Virusinfektion verwendet, vorzugsweise einer solchen, wo die Infektion von einem Wildtyp-Virus herrührt, vorzugsweise einem Wildtyp-RNA-Virus, noch bevorzugter von einem Wildtyp-Retrovirus und optimalerweise von einem Wildtyp-HIV.
Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer Wirtszelle, die mit einem Wildtyp-Virus infiziert werden kann, mit einem bedingt replizierenden Vektor, der in der Lage ist, nur in einer Wirtszelle repliziert zu werden, die für die Replikation des Vektors permissiv ist, dessen Anwesenheit, Transkription oder Translation die Replikation des Wildtyp-Stammes des Virus in der Wirtszelle hemmt. Zweckmäßigerweise repliziert der Vektor mehr als ein Mal und enthält mindestens eine Nukleinsäuresequenz, deren Besitz (i. e. Anwesenheit, Transkription oder Translation) dem Vektor in einer Wirtszelle einen Selektionsvorteil gegenüber einem Wildtyp-Virenstamm verleiht, der optimalerweise der Stamm ist, von dem der Vektor abgeleitet wurde.
Gemäß diesem Verfahren enthält die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise eine Nukleotidsequenz die ein genetisches antiviales Agens aufweist oder codiert, welches die Replikation und/oder Expression eines anderen Virus als des Vektors nachteilig beeinflusst. Zweckmäßigerweise ist das genetische antivirale Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense-Molekül, einem Ribozym und einem Immunogen. Optimalerweise ist das genetische antivirale Mittel ein Ribozym, vorzugsweise eines, dessen katalytische Domäne bei der 3' NUH-Nukleotidsequenz (i. e. speziell einer GUC-Sequenz) schneidet. Optional wird das Ribozym zumindest teilweise durch eine Sequenz codiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 3 und SEQ ID NR. 4. Zweckmäßigerweise schneidet das Ribozym in einer Region des Wildtyp-Virusstammes oder seiner Transkripte, schneidet aber nicht in einer Region des Vektors oder seiner Transkripte. Das ist vorzugsweise so, weil der Wildtyp-Virusstamm eine Sequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 1 codiert ist, wohingegen der Vektor, wenn er DNA ist, eine Nukleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16, und, wenn er RNA ist, eine Nukleotidsequenz aufweist, die von einer Nukleotidsequenz codiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16.
Das Verfahren wird zweckmäßigerweise auch durchgeführt, wo der Vektor mindestens eine Nukleinsäuresequenz aufweist, deren Besitz (i. e. Anwesenheit, Transkription oder Translation) einer mit dem Vektor infizierten Wirtszelle einen Selektionsvorteil gegenüber einer Zelle verleiht, die mit einem Wildtyp-Virusstamm infiziert ist, der optimalerweise der Virusstamm ist, von dem der Vektor abgeleitet ist. Im Hinblick darauf kann ein Vektor mindestens eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die einer mit dem Virus infizierten Wirtszelle einen Selektionsvorteil verleiht, und mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die dem Vektor einen Selektionsvorteil gegenüber einem Wildtyp-Virusstamm eines dem Virus, von dem der Vektor abgeleitet wurde, entsprechenden Virus verleiht.
Folglich wird das Verfahren vorzugsweise durchgeführt, wo die Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz aufweist, die Resistenz gegen mehrere Wirkstoffe codiert. Alternativ wird das Verfahren durchgeführt, wo die Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz aufweist, die eine mutierte (mutante) Protease codiert, und eine Nukleotidsequenz, die eine mutierte (mutante) Reverse Transkriptase codiert, sowie wenn die prophylaktisch oder therapeutisch zu behandelnde Virusinfektion ein Retrovirus ist.
Das Verfahren umfasst weiter vorzugsweise die Verabreichung eines Mittels, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem zytotoxischen Wirkstoff, einem Protease-Inhibitor, einem Inhibitor der Reversen Transkriptase, (i. e. zusätzlich zur Verabreichung des Vektors) an eine Wirtszelle.
Folglich kann ein Vektor gemäß dem oben beschriebenen Verfahren nicht nur verwendet werden, um eine Virusinfektion therapeutisch zu behandeln, sondern um eine potentielle Wirtszelle vor einer Virusinfektion zu schützen, i. e. ein Verfahren der prophylaktischen Behandlung einer Virusirfektion oder eine „Impfung" gegen ein interessierendes Virus, wie ein RNA-Virus, insbesondere ein Retrovirus, wie HIV. Das Verfahren hemmt im Wesentlichen die Replikation eines Wildtyp-Virusstammes, bevor die Wirtszelle mit dem Wildtyp-Virusstamm in Kontakt kommt. In dieser Hinsicht kann der Vektor Proteine enthalten oder codieren, welche die Superinfektion mit einem Wildtyp-Virus blockieren. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einem bedingt replizierenden Vektor, wie oben beschrieben, und einem „Hilfs-Expressionsvektor", i. e. einem viralen Genom, das die Replikation des „Vektors" in einem nicht infizierten Wirt fördert. Der bedingt replizierende Vektor umfasst einen Seiektionsvorteil für die Verpackung und/oder Vermehrung. Weiter kann der Vektor beispielsweise eine Sequenz enthalten, die das Überleben der Zelle verbessert, die Virusproduktion fördert, Apoptose induziert, die Proteinproduktion erleichtert und/oder die Immunfunktion fördert und/oder das Targeting fördert. Das „Hilfs-Expressionsvektor"-Konstrukt ist irgendein Expressionsvektor, der in Bezug auf die Unfähigkeit des „Vektors" zur Replikation ergänzt. Solche Hilfs-Expressionsvektoren sind üblich und können leicht von Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet aufgebaut werden. Der Hilfs-Expressionsvektor kann in Virionen verpackt sein, wie der Vektor, oder ohne das Erfordernis der Verpackung exprimiert werden. Da der „Vektor" einen Selektionsvorteil für die Verpackung und/oder die Vermehrung hat, stellt dieses System ein sicheres Mittel bereit, um hohe Replikation des Virus ohne die möglichen pathogenen Effekte zu erreichen, die ein lebendes abgeschwächtes Virus potentiell verursachen könnte. Weiter kann der Vektor mit nicht-spezifischen Adjuvantien vermischt werden, um die Immunogenizität zu erhöhen. Solche Adjuvantien sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, und sie schließen – ohne darauf eingeschränkt zu sein – ein: komplettes oder inkomplettes Freund Adjuvans, Emulsionen aus Bakterien- und Mycobakterien-Zellwandkomponenten und dergleichen.
Wenn ein Vektor gemäß dem oben beschriebenen Verfahren als prophylaktische Behandlung einer Virusinfektion verwendet wird, kann der Vektor ein Antigen eines Proteins codieren, das nicht von einem Wildtyp-Virus codiert wird, wie ein mutantes virales Protein oder ein nicht-virales Protein. Folglich kann das von dem Vektor codierte Antigen beispielsweise bakteriellen Ursprungs sein oder eine Krebszelle als Ursprung haben. Weiter kann der „Vektor auch ein MHC-Gen für die geeignete Präsentation des Antigens für das Immunsystem des Wirtes codieren. Solche Vektoren können also zur Erleichterung einer persistenten immunologischen Antwort auf eine Anordnung potentieller Pathogene und/oder endogene Proteine (z. B. Tumor-spezifisches Antigen), die in anormalen Zellen selektiv exprimiert werden, verwendet werden.
Außerdem kann der „Helfer-Virus"- (hier auch als „Helfer" bezeichnet) Expressionsvektor so konstruiert werden, dass nur in spezifischen Zelltypen exprimiert wird (z. B. Stammzellen, professionelle Antigen präsentierende Zellen und Tumorzellen), durch Zugeben oder Weglassen eines spezifischen genetischen Elements/Faktors (im Vektor oder Helfervirus-Expressionskonstrukt), der zellspezifische Vektorreplikation oder Ausbreitung erlaubt. Der Vektor breitet sich also durch Komplementation mit einem Helfervirus-Konstrukt noch aus, aber die Ausbreitung ist zellspezifisch, in Abhängigkeit davon, ob ein bestimmtes genetisches Element/Faktor dem Vektor- oder Helfervirusexpressionskonstrukt hinzugefügt oder daraus weggelassen wird. Das kann allein oder in Kombination mit anderen der obigen Strategien verwendet werden.
Beispielsweise kann ein bedingt replizierender HIV-Vektor so konstruiert werden, dass er spezifisch in Makrophagen statt in T-Zellen repliziert. Der Vektor, der ein Tatdefektes HIV bilden würde (der Vektor codiert die anderen HIV-Proteine, aber sie werden aufgrund der Abwesenheit des Tat-Transkriptions-Transaktivators nicht exprimiert), kann ein Ribozym codieren, das Wildtyp-HIV schneidet, aber nicht bedingt replizierende HIV-RNA. Der Hilfs-Expressionsvektor für diesen Vektor kann ein tat-Gen codieren, das von einem Makrophagen-spezifischen Promotor ab exprimiert wird. Das crHIV würde also nur in Makrophagenzellen bedingt replizieren, während es nicht in der Lage wäre, in T-Zellen oder anderen Zelltypen zu replizieren.
Alternativ kann das tat-Gen mit einem tumorspezifischen Promotor operabel verknüpft sein; dann würde das crHIV nur in CD4 Tumorzellen replizieren, nicht aber in normalen CD4 Zellen. Das genetische Element/Faktor kann auch eine Modifizierung einer Promotorsequenz des Vektors sein, so dass nur in spezifischen Zelltypen exprimiert wird und nicht in anderen Zelltypen gleichzeitig mit dem „Helfervirus"-Expressionskonstrukt.
In einer anderen Ausführungsform können Hilfs-Expressionskonstrukt- oder Vektorkonstrukt-Hüllproteine (wenn solche Konstrukte so konstruiert werden, dass sie Hüllproteine enthalten) so modifiziert werden, dass das Vektor-Virion spezifisch bestimmte Zelltypen infiziert (z. B. Tumorzellen), während es aber nicht in der Lage ist, andere Zelltypen (z. B. normale Zellen) zu infizieren. In einer weiteren Ausführungsform kann ein Adenovirus, dem ein oder mehrere Schlüsselfaktoren für die Replikation fehlen, durch Verwendung eines Helferkonstrukts ergänzt werden, das solche Faktoren bereitstellt, verknüpft mit einem tumorspezifischen Promotor. Die Faktoren, welche die Replikation des Adenovirus ergänzen, würden nur in Tumorzellen repliziert, wobei Virusreplikation in Tumorzellen erlaubt würde (mit Expression von Proteinen, die für die Zelltötung erforderlich sind), nicht aber in normalen Zellen.
Die vorliegende Erfindung bietet also auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, insbesondere zur Behandlung von T-Zellen-Leukämie. „Behandlung von Krebs" gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Verabreichung eines weiter modifizierten Vektors, wie hier dargelegt, an einen Wirt zu dem Zweck, eine therapeutische Reaktion zu bewirken. Eine solche Reaktion kann beispielsweise geprüft werden, indem die Abschwächung des Tumorwachstums und/oder die Tumorregression über wacht wird. „Tumorwachstum" beinhaltet eine Zunahme der Tumorgröße und/oder der Zahl der Tumore. „Tumorregression" beinhaltet eine Reduktion der Tumormasse.
„Krebs" beinhaltet gemäß dieser Erfindung Krebsarten, welche durch anormale Zeltproliferation und die Abwesenheit von Kontaktinhibition gekennzeichnet sind, was sich durch Tumorbildung zeigen kann. Der Ausdruck umfasst Krebs, der in Tumoren lokalisiert ist, sowie Krebs, der nicht in Tumoren lokalisiert ist, wie beispielsweise jene Krebszellen, die sich von einem Tumor lokal durch Invasion oder systemisch durch Metastasen ausbreiten. Theoretisch kann auf jede Krebsart mit der erfindungsgemäßen Behandlung abgezielt werden. Vorzugsweise ist der Krebs jedoch viralen Ursprungs.
Schließlich können die oben beschriebenen Vektoren direkt für Gentherapie in vivo verwendet werden. Übliche Strategien der Gentherapie sind mangelhaft, weil sie die Gentransfer an einen großen Prozentsatz von Zellen nicht vermitteln können; nur ein bestimmter Prozentsatz der Zellen wird infiziert. Das ist besonders wichtig bei Strategien gegen Tumore, wo die Gentransduktion der gesamten Tumorpopulation entscheidend ist. Durch Zugabe des „Vektors" gemeinsam mit einem „Helfer" produzieren die unmittelbar transduzierten Zellen Viruspartikel, die benachbarte Zellen infizieren können und somit hohe und möglicherweise vollständige Transduktionseffizienz ermöglichen. In einer Ausführungsform dieser Erfindung könnte ein humanes Retrovirus (das HIV oder ein Retrotransposon-Element sein kann) in Gewebe (oder Zellen in vitro) mit einem „Helfer"-Konstrukt abgegeben werden. Zellen, welche unmittelbar den Vektor und den Helfer enthalten, werden Virus produzieren und den Vektor bedingt in Virionen verpacken. Diese Virionen werden in der Lage sein, hoch effiziente Transduktion benachbarter Zellen zu vermitteln (da der Kontakt von Zelle zu Zelle das effizienteste Mittel zur Transduktion von Zellen ist). Die unmittelbar transduzierten Zellen können sterben oder nicht, je nachdem, ob die Vektor/Helfer-Kombination zu einer zytolytischen Infektion führt. Im Falle eines Retrotransposons kann es sein, dass der Helfer keine Strukturproteine enthalten muss, da normale oder Tumorzellen das Protein/den Faktor enthalten können, der für die Enkapsidation in Virionen erforderlich ist. In diesem Fall kann der Helfer ein Transaktivatorprotein sein – ohne darauf eingeschränkt zu sein -, das die Transkription der für die Retrotransposon-Enkapsidation erforderlichen Faktoren aktiviert. Im Falle von HIV können, müssen aber nicht, andere Faktoren für die Enkapsidation des HIV-Genoms in Virionen-Nachkommenschaft für die Infektion/Transduktion von Zellen erforderlich sein.
Die oben beschriebenen Vektoren können auch in Kriegstechniken gegen biologische und chemische Waffen zum Einsatz kommen. Beispielsweise kann ein bedingt replizierender Vektor in einen Patienten gebacht werden, der kürzlich mit einem hoch pathogenen Virus oder Bakterium oder einer Chemikalie (z. B. Toxin) infiziert wurde. Der Vektor würde die Replikation des pathogenen Virus wie zuvor beschrieben stören. Der bedingt replizierende Vektor kann jedoch auch gemeinsam mit einem Hilfs-Expressionsvektor („Helfer") für antibakterielle Techniken oder Techniken gegen Chemikalien eingesetzt werden.
Beispielsweise kann ein bedingt replizierender Vektor Antikörper gegen Bakterien oder Toxin abgeben, nachdem ein „Helfer" seine Expression oder Vermehrung erlaubte. Der „Helfer" kann, muss aber nicht, von einem induzierbaren Promotor getrieben sein, der seine Expression nach Aktivierung durch ein Bakterium, ein Cytokin (als Reaktion auf eine bakterielle Infektion), ein Antibiotikum (wie mit den mit Tetracyclin induzierbaren Promotorsystemen (Paulus et al., J. Virol., 70, 62–67 (1996)) oder eine Chemikalie (z. B. das Toxin selbst) erlaubt. Der bedingt replizierende Vektor würde sich also nicht nur mit Hilfe des „Helfers" als Antwort auf das Pathogen oder Toxin (als Ergebnis der Aktivierung des Helfers) selektiv vermehren, sondern auch Anti-Pathogen- oder Anti-Toxin-Antikörper sezernieren, um die pathologischen Effekte des Tumor-Antigens, Pathogens oder der Chemikalie (z. B. Toxin) zu hemmen. Jedwedes Protein, Faktor oder genetische Element, das in mRNA und/oder Protein transkribiert werden kann, kann also in einen bedingt replizierenden Vektor inseriert werden, um eine pathogene Reaktion zu hemmen, und zwar gemeinsam mit einem „Helfer", der seine selektive Vermehrung und Expression fördert (selektiv, weil die Produkte des Helfers bedingt exprimiert werden (beispielsweise, aber nicht darauf eingeschränkt, (a) ein induzierbares Promotorsystem -- ein Faktor in einer Tumorzelle aktiviert die Produktion eines Helferfaktors, einer auf Toxin ansprechenden Sequenz, die einen Helferfaktor exprimiert, oder ein auf Cytokin ansprechender Promotor induziert die Herstellung eines. Helferfaktors, (b) ein Helfer-RNA/Protein/Faktor wird in bestimmten Zellen selektiv stabilisiert, in anderen nicht, und (c) indirekte Induktion eines Gens eines Dritten, das die Produktion von Helfervirusprotein, Chaperoning, Targeting, Struktur- und andere Biofunktionen beeinflusst)). Solche Strategien können in transgenen Pflanzen und Tieren zum Einsatz kommen, um sie vor Pathogenen zu schützen. Ähnlich können solche Strategien in transgenen Systemen herangezogen werden, um heterologe Proteine/Faktoren von Wert zu produzieren.
In einer anderen Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Zelllinie für das Screening eines Wirkstoffes/Faktors entwickelt werden, um beispielsweise zu bestimmen, welcher Teil des Proteins/Faktors für eine spezielle Funktion wichtig ist. Es kann ein Vektor kreiert werden, um ein interessierendes mutagenisiertes Protein innerhalb einer bestimmten Zelllinie zu exprimieren. Die das mutagenisierte Protein codierende RNA wird jedoch gegen das Ribozym beispielsweise durch Einführen von stillen Punktmutationen resistent gemacht. Die Expression von Wildtyp-Protein wird jedoch innerhalb der Zelllinie gehemmt. Vektoren, welche ein Ribozym zu dem interessierenden Protein exprimieren, können auch konstruiert werden, damit sie mutantes Testprotein exprimieren. Wenn der Vektor in die Zellen transduziert wird, wird die meiste, das normale Protein codierende native RNA geschnitten, während das mutante Testprotein exprimiert wird. Diese Methode kann mit kürzlich entwickelten Transfer- und Selektionstechniken als schnelle und wirkungsvolle Technik zur Bestimmung, wie ein gegebenes Protein funktioniert und wie ein gegebener Faktor/Wirkstoff mit dem Protein interagiert, verwendet werden.
Es gibt auch zahlreiche Verwendungen des Verfahrens und der Vektoren der vorliegenden Erfindung in vitro. Beispielsweise können die Vektoren verwendet werden, um bestimmte Nuancen der Virusreplikation und der Ribozymfunktion festzustellen. Ähnlich können die Ribozym enthaltenden Vektoren als Diagnostikum verwendet werden, z. B. um auf Mutationen in abgestorbenen Zellen zu prüfen oder eine genetische Drift zu untersuchen. Die obige Erörterung ist im Hinblick auf die Verwendung der gegenständlichen Erfindung in keiner Weise erschöpfend.
Vorteile der Erfindung
Die Vorteile der Verwendung einer crHIV-Strategie für die genetische therapeutische Behandlung von AIDS und anderen Viren sind beträchtlich. Beispielsweise wird das Problem des Targeting des Vektors zu HIV-infizierten Zellen gelöst. Nach Transfektion von crHIV in infizierte CD4+-Zellen in vivo werden die crHIV in Virionen-Nachkommenschaft verkapselt, wobei endogene infektiöse HIV-Hüllproteine verwendet werden. Die crHIV-RNA geht also in der Virionen-Nachkommenschaft mit und infiziert Zelttypen, die normalerweise durch diesen speziellen Stamm von HIV infizierbar sind, wobei nicht-pathogene Virionen produziert werden. Das inkludiert Zellen, auf die schwer zu zielen ist, wie die Mikroglia des Gehirns, die ein Hauptreservoir für HIV-Infektion des Zentralnervensystems sind. Es ist wahrscheinlich wenig Toxizität mit crHIV-Vektoren verbunden, die uninfizierte CD4+-Zellen infizieren, da keine vitalen Proteine von crHIV-Vektoren codiert werden. Außerdem ist das Ergebnis des Wettbewerbs zwischen crHIV-Vektor und Wildtyp-HIV die Produktion nicht-pathogener Partikel, was zu verminderter Viruslast führt. Abnehmende Last an pathogenem HIV-1 kann nicht nur die Überlebenszeit infizierter Patienten erhöhen, sondern kann auch die Übertragungsgeschwindigkeit auf nicht infizierte Personen senken, da sich die crHIV-Partikel auch systemisch ausbreiten können (i. e. wie infektiöse HIV). Verminderte Last an pathogenen HIV-1 im Blut kann besonders bei HIV-infizierten Schwangeren wichtig sein, da die Produktion von crHIVs auch die Übertragung von HIV-1 von der infizierten Mutter auf den Fötus in utero vermindern kann.
Die Plasmid-DNA/Lipid-Mischung, die zum Einführen des crHIV-Vektors in Wirtszellen verwendet werden kann, sollte stabil und billig in der Herstellung sein, wobei teure ex vivo-Strategien umgangen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist natürlich insofern inhärent flexibel, als es auch für den Gentransfer ex vivo verwendet werden könnte, falls das gewünscht wird. Unabhängig davon eröffnet die Verfügbarkeit des von Liposomen vermittelten Ansatzes die Möglichkeit der Behandlung der allgemeinen Bevölkerung – etwas, was mit herkömmlichen Gentherapiestrategien nicht machbar ist. Die crHIV-Vektoren können so konstruiert werden, dass sie mehrere Ribozyme enthalten, die zu verschiedenen Zielen auf dem HIV-Genom gemacht werden können. Das reduziert die Möglichkeit, dass infektiöse HIV mutieren und dem Effekt der Anti-HIV-Ribozyme entgehen können. Außerdem kann die Strategie mit für bedingte Replikation kompetentem Virus auch angewendet werden, um andere Virusinfektionen zu behandeln, besonders jene, wo der vitale Turnover hoch ist.
Ein besonders nützliches Merkmal der crHIV-Vektoren besteht darin, dass sie verwendet werden können, um genetische antivirale Mittel post-transkriptional zu exprimieren, beispielsweise ein Ribozym. Die Infektion von nicht infizierten Zellen mit crHIV-Vektoren führt zu niedriger Toxizität, weil wenig Expression vom HIV-LTR-Promotor in Abwesenheit des Tat-Proteins auftritt. Hohe Niveaus an crHIV-Expres sion und die daraus folgende antivirale Aktivität tritt nur auf, wenn das Tat-Protein durch Komplementation mit Wildtyp-HIV bereitgestellt wird. Die crHIV-Vektoren sind also nicht zum Schutz von Zellen vor HIV-Infektion gebaut, sondern um die Gesamtviruslast an Wildtyp-HIV durch selektive Akkumulation nicht-pathogener crHIV-Partikel zu vermindern.
Ohne an eine spezielle Theorie bezüglich des Funktionierens oder der Wirkungsweise der Erfindung gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass Ribozyme verwendet werden können, wie in den folgenden Beispielen bestätigt, um crHIV-Genome mit einem Selektionsvorteil bereitzustellen, und zwar aufgrund zweier nützlicher Eigenschaften: (1) Sie sind in hohem Grade spezifisch und (2) sie haben eine relative Wirksamkeit in Abhängigkeit von ihrer Fähigkeit zur Co-Lokalisierung mit Ziel-RNAs (Cech, Science, 236, 1532–1539 (1987)). Die Spezifität von Ribozymen wird durch ihre spezifische Hybridisierung mit komplementären Zielsequenzen, welche die XUY-Stelle enthalten, verliehen. Ribozyme sind relativ effizient, weil sie Ziel-RNAs nur mit hoher Wirksamkeit schneiden, wenn effiziente Co-Lokalisierung mit Ziel-RNAs erfolgt. In einer gemischten Infektion mit HIV/crHIV muss es zur Co-Lokalisierung von Ribozyme enthaltenden crHIV-RNAs mit Wildtyp-HIV-RNAs kommen, da HIV-RNA-Genome vor der Verpackung in Virionen-Nachkommenschaft dimerisieren. Das Schneiden von nicht-genomischen Spezies von Wildtyp-HIV-RNAs, das für die Produktion von viralen Proteinen erforderlich ist, dürfte insofern weniger effizient sein als das von genomischen Wildtyp-HIV-RNAs, als nicht-genomische HIV-RNAs nicht dimerisieren. Es wurde in den hier beschriebenen Experimenten festgestellt, dass der den crHIV-RNAs verliehene Selektionsvorteil auf dem selektiven Verpacken von. crHIVs in virale Partikel beruht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die wirksamste Spaltung intrazellulär während der Dimerisierung auftritt, was zur selektiven Zerstörung von Wildtyp-HIV-RNAs durch Wirtsnukleasen führt. Dies ermöglicht das bevorzugte Verpacken von crHIV-RNAs in Viruspartikel.
Die Anwendung von crHIV-Vektoren für die HIV-Therapie kann auch nicht nur genomische Selektion von crHIVs beinhalten, sondern auch zelluläre Selektion von crHIV-Partikel produzierenden Zellen. Andernfalls werden die Wildtyp-HIV produzierenden Zellen Wildtyp-HIV-Partikel mit einem Selektionsvorteil gegenüber den crHIV produzierenden Zellen produzieren und schnell vorherrschen. Ein Selektionsvorteil kann crHIV exprimierenden Zellen verliehen werden, indem ein Gen in crHIV-Genome (z. B. ein Gen für Resistenz gegen mehrere Wirkstoffe) eingeführt wird, das crHIV exprimierenden Zellen (in Gegenwart von Wirkstoff) einen Überlebensvorteil gegenüber Wildtyp-HIV exprimierenden Zellen verleiht. Unter diesen Bedingungen sterben Wildtyp-HIV exprimierende Zellen zunehmend ab, produzieren aber noch Wildtyp-HIV, während crHIV exprimierende Zellen, die selektiv crHIV produzieren, überleben. Die Infektion von crHIV enthaltenden Zellen mit verbleibendem Wildtyp-HIV führt zur weiteren Produktion von crHIV enthaltenden Viruspartikeln. Es kann also zu einer viralen genomischen Verschiebung mit der kumulativen Infektion von CD4+-Zellen mit crHIV-Genomen kommen, wobei im Wirt die virale Balance von pathogenen Wildtyp-HIV zu nicht-pathogenen crHIV-Genomen geändert wird. Eine solche Strategie kann zum Clearance von Wildtyp-HIV führen, wenn die Balance von HIV-Genomen selektiv von Wildtyp-HIV zu crHIV verschoben wird. Die Virusreplikation hört schließlich auf, da crHIVs nur in Gegenwart von Wildtyp-HIV-Helfergenomen replizieren können. Unter solchen gegenseitig restriktiven Bedingungen kann es möglich sein, crHIV-Vektoren zu konstruieren, welche nicht nur die. Viruslast an Wildtyp-HIV vermindern, sondern auch das Virus aus dem HIV-infizierten Wirt entfernen.
Mittel der Verabreichung
Erfindungsgemäß wird ein Vektor in eine Wirtszelle, die wegen einer Virusinfektion der Gentherapie bedarf, eingeführt wie zuvor beschrieben. Das Mittel des Einführens umfasst das Inkontaktbringen eines Wirtes, der mit einem Virus infiziert werden kann, mit einem erfindungsgemäßen Vektor. Vorzugsweise umfasst das Inkontaktbringen jedwedes Mittel, durch das der Vektor in eine Wirtszelle eingeführt wird; das Verfahren hängt nicht von einem speziellen Mittel der Einführung ab und soll auch nicht so interpretiert werden. Mittel der Einführung sind dem Fachmann bekannt und werden hier auch als Beispiele angeführt.
Folglich kann das Einführen beispielsweise in vitro (z. B. in einem Gentherapieverfahren vom ex vivo-Typ) oder in vivo bewirkt werden, was die Verwendung von Elektroporation, Transformation, Transduktion, Konjugation oder triparentales Mating, Transfektion, Infektion, Membranfusion mit kationischen Lipiden, Hochgeschwindigkeitsbeschuss mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen, Inkubation mit Calciumphosphat-DNA-Präzipitat, direkte Mikroinjektion in einzelne Zellen und dergleichen einschließt. Andere Methoden sind verfügbar und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Vorzugsweise werden die Vektoren oder Ribozyme jedoch mit Hilfe kationischer Lipide, z. B. Liposomen, eingeführt. Solche Liposomen sind im Handel erhältlich (z. B. Lipofectin^®, Lipofectamin^® und dergleichen, geliefert von Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Außerdem können Liposomen mit erhöhter Transferkapazität und/oder reduzierter Toxizität in vivo (z. B. wie in PCT-Anmeldung WO 95/21259 dargestellt) in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für die Verabreichung von Liposomen können die in der PCT-Anmeldung WO 93/23569 angeführten Empfehlungen befolgt werden. Im Allgemeinen wird bei einer solchen Verabreichung die Formulierung von der Mehrzahl der Lymphozyten innerhalb von 8 Stunden bei 37°C aufgenommen, wobei mehr als 50% der injizierten Dosis eine Stunde nach der intravenösen Verabreichung in der Milz nachgewiesen werden. Ähnlich schließen andere Transfer-Vehikel Hydrogele und Polymere mit gesteuerter Freigabe ein.
Die Form des in eine Wirtszelle eingeführten Vektors kann variieren, teilweise in Abhängigkeit davon, ob der Vektor in vivo oder in vitro eingeführt wird. Beispielsweise kann die Nukleinsäure eine geschlossen zirkulär, mit einem Bruch (nick) versehen oder linearisiert sein, in Abhängigkeit davon, ob der Vektor extragenomisch gehalten werden soll (i. e. als autonom replizierender Vektor), als Provirus oder Prophage integriert, transient transfiziert, transient infiziert, wie mit Verwendung eines replikationsdefekten oder bedingt replizierenden Virus, oder durch doppelte oder einfache Crossover-Rekombinationsvorgänge stabil in das Wirtsgenom eingeführt werden soll.
Vor dem Einführen in einen Wirt kann ein erfindungsgemäßer Vektor in Form von verschiedenen Zusammensetzungen für die Verwendung bei therapeutischen oder prophylaktischen Behandlungsmethoden zubereitet werden. Insbesondere kann mit dem Vektor durch Kombination mit geeigneten pharmazeutisch unbedenklichen Trägern oder Verdünnungsmitteln eine pharmazeutische Zubereitung hergestellt werden, und sie kann so gemacht werden, dass sie für Anwendung beim Menschen oder im Veterinärbereich geeignet ist.
Eine Zusammensetzung zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren kann einen oder mehrere der genannten Vektoren aufweisen, vorzugsweise in Kombination mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Pharmazeutisch unbedenkliche Träger wie auch geeignete Methoden der Verabreichung sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Die Wahl des Trägers wird teilweise durch den speziellen Vektor bestimmt sowie durch die spezielle Methode, die zur Verabreichung der Zusammensetzung herangezogen wird. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird auch erkennen, dass verschiedene Wege zur Verabreichung einer Zusammensetzung verfügbar sind, und obwohl mehr als ein Weg für die Verabreichung verwendet werden kann, kann ein spezieller Weg eine unmittelbarere und effektivere Reaktion bewirken als ein anderer. Folglich gibt es ein ganzes Spektrum von geeigneten Zubereitungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
Eine einen erfindungsgemäßen Vektor allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Verbindungen enthaltende Zusammensetzung kann eine für die parenterale Verabreichung geeignete Formulierung sein, vorzugsweise für intraperitoneale Verabreichung. Eine solche Formulierung kann einschließen: wässrige und nichtwässrige, isotonische sterile Injektionslösungen, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostate und gelöste Stoffe, welche die Formulierung mit dem Blut des ins Auge gefassten Empfängers isotonisch machen, enthalten können, und wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel, Solubilisatoren, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in dichten Behältern mit Einzeldosis oder mehreren Dosen, wie Ampullen und Vials dargeboten werden, und sie können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, was nur die Zugabe des stabilen flüssigen Trägers, beispielsweise Wasser, unmittelbar vor der Verwendung für Injektionen erforderlich macht. Nicht vorbereitete injizierbare Lösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulat und Tabletten hergestellt werden wie hier beschrieben.
Eine für die orale Verabreichung geeignete Formulierung kann aus flüssigen Lösungen, wie einer in Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Kochsalzlösung oder Fruchtsaft gelösten, wirksamen Menge der Verbindung; Kapseln, Säckchen oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des Wirkstoffes fest oder als Körner enthalten; Lösungen oder Suspensionen in einer wässrigen Flüssigkeit; und Öl-in-Wasser-Emulsionen oder Wasser-in-Öl-Emulsionen bestehen. Tabletten können eines oder mehrere aus der Gruppe Lactose, Mannit, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Cellulose, Gummi arabicum, Gelatine, kolloidales Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talk, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Exzipienten, Farbstoffe, Verdün nungsmittel, Pufferungsmittel, Befeuchtungsmittel, Konservierungsmittel, Geschmacksstoffe und pharmakologisch kompatible Träger enthalten.
Es kann auch eine für die Verabreichung über Inhalation geeignete Aerosol-Formulierung gemacht werden. Die Aerosol-Formulierung kann in ein unter Druck stehendes geeignetes Treibmittel, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen gebracht werden.
Ebenso kann eine für die orale Verabreichung geeignete Formulierung in Form von Tabletten vorliegen, die den Wirkstoff in einem Geschmacksstoff, üblicherweise Sucrose und Gummi arabicum oder Tragacanth, enthalten; als Pastillen, die den Wirkstoff in einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin, oder Sucrose und Gummi arabicum enthalten; und als Mundspülungen, die den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger enthalten; sowie Cremes, Emulsionen, Gele und dergleichen, die zusätzlich zum Wirkstoff Träger enthalten, wie sie auf dem Gebiet bekannt sind.
Eine für die topische Anwendung geeignete Formulierung kann in Form von Cremes, Salben oder Lotionen vorliegen.
Eine für die rektale Verabreichung geeignete Formulierung kann als Suppositorium mit einer geeigneten Basis vorliegen, die beispielsweise Kakaobutter oder ein Salicylat enthält. Eine für die vaginale Verabreichung geeignete Formulierung kann als Pessar, Tampon, Creme, Gel, Paste, Schaum oder Spray vorliegen und zusätzlich zum Wirkstoff Träger enthalten, wie sie auf dem Gebiet als geeignet bekannt sind. Ebenso kann der Wirkstoff mit einem Gleitmittel als Beschichtung auf einem Kondom kombiniert werden.
Die einem Lebewesen, insbesondere einem Menschen verabreichte Dosis im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte ausreichend sein, damit eine therapeutische Reaktion in dem infizierten Individuum innerhalb eines vernünftigen Zeitrahmens erfolgt. Die Dosis wird bestimmt durch die Wirksamkeit des speziell für die Behandlung verwendeten Vektors, die Schwere der Erkrankung sowie das Körpergewicht und das Alter des infizierten Individuums. Die Größe der Dosis wird auch vom Vorkommen nachteiliger Nebenwirkungen bestimmt, die mit der Verwendung des speziellen, verwendeten Vektors verbunden sein können. Es ist immer wünschens wert, wann immer das möglich ist, dass die nachteiligen Nebenwirkungen minimal gehalten werden.
Die Dosierung kann in Einheitsdosierungsform erfolgen, wie einer Tablette oder Kapsel. Der Ausdruck „Einheitsdosierungsform", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einzeldosis für menschliche oder tierische Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge eines Vektors allein oder in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln enthält, und zwar berechnet in einer Menge, die zum Hervorrufen des gewünschten Effektes geeignet ist, zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel. Die Spezifizierungen für die Einheitsdosierungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung hängen von der oder den speziellen Verbindungen) ab, die verwendet wird/werden, und dem zu erzielenden Effekt sowie der Pharmakodynamik, die mit jeder einzelnen Verbindung im Wirt verbunden ist. Die verabreichte Dosis sollte eine „antivirale wirksame Menge" sein oder eine Menge, die zum Erreichen eines "wirksamen Spiegels" in einem Patienten erforderlich ist.
Da der „wirksame Spiegel" als bevorzugter Endpunkt der Dosierung verwendet wird, können die tatsächliche Dosis und das Schema in Abhängigkeit von interindividuellen Differenzen bezüglich der Pharmakokinetik, der Verteilung des Wirkstoffes und des Metabolismus variieren. Der „wirksame Spiegel" kann beispielsweise als der bei einem Patienten im Blut oder im Gewebe gewünschte Spiegel definiert werden, der einer Konzentration von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Vektoren) entspricht, die ein Virus, wie HIV, in einem Assay hemmt, der geeignet ist, die klinische antivirale Aktivität chemischer Verbindungen vorherzusagen. Der „wirksame Spiegel" für erfindungsgemäße Verbindungen kann auch variieren, wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Kombination mit Zidovudin oder anderen bekannten antiviralen Verbindungen oder Kombinationen davon verwendet werden.
Ein Fachmann auf dem Gebiet kann leicht die geeignete Dosis, das Schema und die Verabreichungsmethode für die genaue Formulierung der verwendeten Zusammensetzung bestimmen, um den gewünschten „wirksamen Spiegel" bei einem Patienten zu erreichen. Der einschlägige Fachmann kann auch leicht einen geeigneten Indikator für den „wirksamen Spiegel" der erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine direkte (z. B. analytische chemische Analyse) oder indirekte (z. B. mit Ersatzindikatoren für Virusinfektionen, wie p24 oder Reverse Transkriptase für die Behandlung von AIDS oder AIDS-ähnlichen Erkrankungen) Analyse geeigneter Proben des Patienten (z. B. Blut und/oder Gewebe) bestimmen und verwenden.
Weiter sind in Bezug auf die Bestimmung des wirksamen Spiegels bei einem Patienten speziell für die Behandlung von AIDS oder AIDS-ähnlichen Erkrankungen geeignete Tiermodelle verfügbar, und sie sind in großem Umfang für die Bestimmung der Wirksamkeit verschiedener Gentherapieprotokolle (Sarver et al. (1993b), supra) gegen HIV in vivo eingesetzt worden. Diese Modelle schließen Mäuse, Affen und Katzen ein. Obwohl diese Tiere von Natur aus nicht empfänglich für die HIV-Erkrankung sind, können chimäre Mäusemodelle (z. B. SCID, bg/nu/xid, BALB/c nach Knochenmarkentfernung), die mit menschlichem peripheren einkernigen Blutzellen (PBMCs), Lymphknoten oder fetaler Leber/Thymusgewebe rekonstituiert wurden, mit HIV infiziert und als Modelle für die HIV-Pathogenese und die Gentherapie verwendet werden. Ebenso kann das Simiane-Immunschwäche-Virus (SIV)/Affen-Modell verwendet werden, wie auch das Feline-Immunschwäche-Virus (FIV)/Katzen-Modell.
Im Allgemeinen wird eine Menge des Vektor vorgezogen, die ausreichend ist, um eine Gewebekonzentration des verabreichten Ribozyms (oder Vektors) von etwa 50 bis etwa 300 mg/kg Körpergewicht pro Tag zu erreichen, speziell etwa 100 bis etwa 200 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Bei bestimmten Anwendungen, z. B. topischen, okularen oder vaginalen Anwendungen, werden mehrere Tagesdosen vorgezogen. Außerdem variiert die Zahl der Dosen in Abhängigkeit vom Verabreichungsmittel und dem speziellen Vektor, der verabreicht wird.
Bei der Behandlung mancher mit einem Virus infizierter Individuen kann es zweckmäßig sein, ein „Megadosierungs"-Schema anzuwenden, wo man eine große Dosis eines Vektors verabreicht, Zeit verstreichen lässt, bis die Verbindung wirkt, und dann dem Individuum ein geeignetes Reagenz verabreicht, um den/die Wirkstoffe) zu inaktivieren. Bei Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung (i. e. Replikation des Vektors im Wettbewerb mit dem behandelten Virus) notwendigerweise limitiert. Mit anderen Worten, wenn der Spiegel, beispielsweise von HIV, abnimmt, nimmt der Spiegel eines Vektors, der für die Produktion von Virionen von HIV abhängt, auch ab.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann andere Arzneimittel in Verbindung mit einem erfindungsgemäßen Vektor enthalten, wenn sie zur therapeutischen Behandlung von AIDS verwendet wird. Diese anderen Arzneimittel können auf herkömmliche Art verwendet werden (i. e. als Mittel zur Behandlung der HIV-Infektion) sowie spezieller bei einem Verfahren zur Selektion hinsichtlich crHIV in vivo. Eine solche Selektion, wie sie hier beschrieben wird, fördert die Ausbreitung von bedingt replizierendem HIV und ermöglicht, dass bedingt replizierende HIV wirksamer mit Wildtyp-HIV konkurrieren, was notwendigerweise die Pathogenizität von Wildtyp-HIV limitiert. Insbesondere wird in Betracht gezogen, dass ein anti-retrovirales Mittel verwendet wird, wie vorzugsweise Zidovudin. Weitere repräsentative Beispiele für diese zusätzlichen Arzneimittel, die zusätzlich zu den zuvor beschriebenen verwendet werden können, schließen ein: antivirale Verbindungen, Immunmodulatoren, Immunstimulantien, Antibiotika und andere Mittel und Behandlungsschemata (einschließlich der als Alternativmedizin anerkannten), die zur Behandlung von AIDS herangezogen werden können. Antivirale Verbindungen schießen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, ein: ddl, ddC, Gancylclovir, fluorierte Dideoxynukleotide, nichtnukleosidische analoge Verbindungen wie Nevirapin (Shih et al., PNAS, 88, 9878–9882 (1991)), TIBO-Derivate wie R82913 (White et al., Antiviral Research, 16, 257–266 (1991)) und BI-RJ-70 (Shih et al., Am. J. Med., 90(Suppl. 4A), 8S–17S (1991)). Immunmodulatoren und Immunstimulantien schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, ein: verschiedene Interleukine, CD4, Cytokine, Antikörperzubereitungen, Bluttransfusionen und Zelltransfusionen. Antibiotika schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, ein: Antimykotika, antibakterielle Mittel und Mittel gegen Pneumocystis carinii.
Die Verabreichung der virushemmenden Verbindung mit anderen anti-retroviralen Mitteln und insbesondere mit bekannten RT-Inhibitoren, wie ddC, Zidovudin, ddl, ddA oder anderen Inhibitoren, die gegen andere HIV-Proteine wirken, wie Anti-TAT-Mittel, hemmen im Allgemeinen die meisten oder alle Replikationsstufen des Lebenszyklus des Virus. Die Dosierungen von ddC und Zidovudin, die bei Patienten mit AIDS oder ARC verwendet werden, sind publiziert. Ein virustatischer Bereich von ddC liegt im Allgemeinen zwischen 0,05 μM und 1,0 μM. Ein Bereich von etwa 0,005–0,25 mg/kg Körpergewicht ist bei den meisten Patienten virustatisch. Die Dosierungsbereiche für die orale Verabreichung sind etwas breiter, beispielsweise 0,001 bis 0,25 mg/kg, in einer oder mehreren Dosen in Intervallen von 2, 4, 6, 8 und 12 etc. Stunden verabreicht. Vorzugsweise werden 0,01 mg ddC/kg Körpergewicht alle 8 Stunden gege ben. Wenn sie in einer Kombinationstherapie verabreicht wird, kann die andere antiviraie Verbindung beispielsweise gleichzeitig wie der erfindungsgemäße Vektor gegeben werden, oder die Dosierung kann auf Wunsch gestaffelt werden. Der Vektor kann auch in einer Zusammensetzung kombiniert werden. Die jeweiligen Dosierungen können bei Verwendung in Kombination geringer sein als bei alleiniger Verwendung.
BEISPIELE
Die vorliegenden erfindungsgemäßen Verbindungen und Verfahren werden weiter im Kontext der folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen der weiteren Illustration der gegenständlichen Erfindung und sind nicht als Einschränkung ihres Umfangs zu sehen.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von für die bedingte Replikation kompetenten Vektoren gemäß dieser Erfindung. Insbesondere beschreibt dieses Beispiel die Konstruktion von bedingt replizierenden Vektoren auf Basis von HIV, i. e. crHIV-Vektoren.
Einer der hervorstechendsten Aspekte der Pathogenese von HIV-1 ist die Produktion genetischer Varianten des Virus. Die schnelle Produktion von HIV-Varianten in vivo zeigt an, dass das Virus innerhalb des Netzwerks von darwinschem genetischem Modellieren gesehen werden kann (siehe z. B. Coffin, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 176, 143–164 (1992); und Coffin, Science, 267, 483–489 (1995)). Die Varianten sind ein Ergebnis der Ungenauigkeit des HIV-1 Reverse-Transkriptase-Moleküls, das Mutationen in neu transkribierten Proviren aus viraler genomischer RNA produziert. Daher gibt es unter in vivo-Bedingungen mit keinem signifikanten Engpass und vielen Replikationszyklen einen beträchtlichen Grad an genetischer Variation mit der Produktion vieler viraler Varianten. Dennoch dominiert Wildtyp-HIV, da es unter nicht restriktiven Bedingungen den höchsten Selektionsvorteil hat. In Gegenwart eines Inhibitors, beispielsweise Zidovudin, wird eine virale Variante selektiert, die einen höheren Selektionsvorteil als der Wildtyp-Stamm hat und folglich vorherrscht (Coffin (1992) und (1995), supra). Auf dieser Basis stellt die gegenständliche Erfindung eine Strategie mit einem bedingt replizierenden viralen Vektor bereit, die nicht-pathogene HIV-1-Genome mit einem Selektionsvorteil über pathogenes Wildtyp-HIV-1 bietet.
Diese nicht-pathogenen, bedingt replizierenden HIV- (crHIV-) Vektoren sind defekte HIVs, bei denen Replikation und Verpackung nur in Zellen erfolgt, die mit Wildtyp-HIV infiziert sind. crHIV-Genome stehen in Konkurrenz mit der Viruslast an pathogenem Wildtyp-HIV und senken diese. Der Effekt der Verminderung der Viruslast an Wildtyp-HIV in einem infizierten Wirt sollte zu erhöhter Lebenserwartung führen. Er sollte auch die Fähigkeit des infizierten Wirtes zur Weitergabe von Wildtyp-HIV an nicht infizierte Individuen vermindern. Für einen erfolgreichen Wettbewerb von crHIVs mit Wildtyp-HIV-1 scheinen zwei Faktoren wichtig zu sein: (1) ein Selektionsvorteil von crHIV-Genomen über Wildtyp-HIV-Genome und (2) ein Selektionsvorteil von crHIV exprimierenden Zellen über Zellen, welche Wildtyp-HIV exprimieren (i. e. ein Selektionsvorteil für die Produktion von crHIV-Virionen aus crHIV exprimierenden Zellen über Wildtyp-HIV exprimierende Zellen).
Die crHIV-Vektoren replizieren bedingt aufgrund der Tatsache, dass sie die Sequenzen enthalten, welche für die RNA-Expression, Dimerisierung und Verpackung erforderlich sind, dass sie aber nicht funktionale (i. e. Wildtyp) HIV-1-Proteine exprimieren. Den crHIV-Vektoren wurde ein Selektionsvorteil durch Inserieren einer in der U5-Region des Wildtyp-HIV-Genoms, nicht aber die crHIV-U5-RNA schneidenden Ribozym-Kassette verliehen.
Die in den Vektoren vorhandenen Ribozyme schneiden die crHIV-RNA nicht, weil die U5-Region von crHIV-RNA durch konservierte Basensubstitution (in anderen HIV-Stämmen vorhandene Basensubstitutionen) modifiziert wurde, um zu verhindern, dass die Ribozyme effizient an diese Stellen binden und dort schneiden. Zudem sind die crHIVs nicht-pathogen, weil sie nicht für Proteine codieren, von denen man annimmt, dass sie für den Zelltod von CD4+ verantwortlich sind. Wenn die HIV-infizierten Zellen (die mit dem crHIV-Vektor transfiziert wurden) aktiviert werden, werden die Zellen befähigt, die genomischen Defizite von crHIV zu ergänzen, was zur Produktion von crHIV-Virionen-Nachkommenschaft führt.
Im Allgemeinen wurden crHIV-Genome aus dem infektiösen HIV-Volllängenklon, pNL4-3 (Adachi et al. (1986), supra) konstruiert. Alle Klonierungsreaktionen und DNA-, RNA- und Proteinmanipulationen wurden unter Verwendung der dem Durchschnittsfachmann gut bekannten und auf diesem Gebiet bereits beschriebenen Verfahren, z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., (Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)), durchgeführt. Die in diesen Reaktionen verwendeten Enzyme und Reagenzien wurden von kommerziellen Lieferanten (z. B. New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA; und Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN) erworben und gemäß den Empfehlungen der Hersteller verwendet. Weiter erfolgte die Haltung und Vermehrung des Vektors unter Verwendung von Techniken, die allgemein bekannt sind und früher beschrieben wurden (z. B. Dropulic et al. (1992), supra; und Dropulic et al. (1993), supra).
pNL4-3 wurde mit den Enzymen Pst I (das in gag schneidet, ungefähr bei der Position +1000 vom Transkriptionsstart) und Xho 1 (das in nef schneidet, ungefähr bei der Position +8400 vom Transkriptionsstart) geschnitten, und ein Polylinker mit geeigneten Restriktionsstellen wurde inseriert. Ein 0,86 kb Bgl II bis Bam HI Fragment, welches das RRE (rev responsive element) enthielt, wurde in eine Bam HI-Stelle kloniert, welche in dem Polylinker vorhanden war. Diese Manipulationen führten zur Deletion des HIV-Wildtyp-Genoms aus der gag codierenden Region bis in die U3 codierende Region (i. e. also auch das nef-Gen deletierend). Während der Vektor in der Lage ist, ein trunkiertes gag-Transkript zu produzieren, wird ein funktionales „fulllength" Gag-Protein von dem Vektor nicht produziert. Da Wildtyp-Gag-Funktionen gemäß dieser Erfindung nicht erforderlich sind, können außerdem die gag-Sequenzen mutiert werden, um zu verhindern, dass Gag-Protein translatiert wird.
Eine Ribozym-Kassette, die ein oder mehrere Ribozyme enthält, wie hier beschrieben, wurde in eine Sal l-Stelle stromab von der Bam HI-Stelle inseriert. Um dies durchzuführen, wurden komplementäre Deoxyoligonukleotide, die Ribozymsequenzen codieren, synthetisiert, annealed und dann in die Sal I-Stelle kloniert. Die für die Konstruktion der crHIV-Vektoren verwendeten Ribozyme waren Hammerhead-Ribozyme. Diese Ribozyme enthielten eine katalytische Domäne von 22 Basenpaaren und zwei Hybridisierungsdomänen von jeweils 9 Basenpaaren. Die Ribozyme wurden entweder auf die Stelle +115 oder +133 (i. e. entsprechend der Zahl der Basenpaare stromab vom Transkriptionsstart) der U5-RNA-Sequenz ausgerichtet. Die Hybridisierungsdomänen und die katalytische Domäne (unterstrichen) der auf die Stelle +115 und die Stelle +133 zielenden Ribozyme sind wie folgt:
Die Ribozym-Kassette bestand aus Einzel-, Doppel- oder Tripel-Ribozym(en), im Tandem angeordnet. Vektoren, die Einzel- (i. e. "crHIV-1.1"-Vektor, 1B) oder Tripel- (i. e. "crHIV-1.111"-Vektor, 1E) Ribozyme enthielten, wurden auf die gleiche Stelle der U5-HIV-RNA ausgerichtet, bei Position +115. Vektoren, die Doppel-Ribozyme enthielten, wurden auf die gleiche Stelle, bei Position +115 (i. e. "crHIV-1.11"-Vektor, 1C), oder auf verschiedene Stellen ausgerichtet, an den Positionen +115 und +133 der U5-HIV-RNA; crHIV-1.12 (i. e. "crHIV-1.12"-Vektor, 1D). Diese Vektoren werden hier generisch als "crHIV"-Vektoren bezeichnet.
Um die Konstruktion der Vektoren zu vervollständigen, wurden die crHIV-Vektoren gegen Ribozym-Spaltung resistent gemacht (i. e. in ihrer Manifestation als RNA) durch Mutation einer Stelle, die von den Hammerhead-Ribozymen erkannt wird, in der U5-Region des crHIV-Genoms vorkommend. Um dies durchzuführen, wurde ein doppelsträngiges Oligonukleotid (i. e. AAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGT GCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCA GTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC [SEQ ID NR. 13]), das die in der 2 [SEQ ID NR. 2] gezeigten Basensubstitutionen enthielt, verwendet, um modifizierte Stellen in den Vektor einzuführen. Speziell wurden Basensubstitutionen in die Hybridisierungs- und Spaltungsstellen des Ribozyms bei den Basenpaaren 115 und 133 eingebaut. Insbesondere wurden, wie in der 2 illustriert, bei den Basenpaaren 113, 114, 132, 134 und 142 Mutationen eingeführt. Diese Stellen können so modifiziert werden, dass sie irgendeine Mutation enthalten (i. e. GTGTGCCCNNCTGTTGT GTGACTCTGGNANCTAGAGANC, worin N jedwedes mutante Nukleotid sein kann [SEQ ID NR. 14]). Vorzugsweise werden die Sequenzen jedoch so mutiert, dass beispielsweise eine Substitution von G zu A an der Stelle +113 (i. e. so dass die Sequenz GTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC [SEQ ID NR. 15] umfasst), eine Substitution von U (i. e. T hinsichtlich der DNA-Sequenz) zu C an der Stelle +114 [SEQ ID NR. 5], eine Substitution von U (i. e. T hinsichtlich der DNA-Sequenz) zu C an der Stelle +132 [SEQ ID NR. 6], eine Substitution A zu G an der Stelle +134 (i. e. so dass die Sequenz GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAG CTAGAGATC [SEQ ID NR. 16] umfasst) und eine Substitution von U (i. e. T hinsichtlich der DNA-Sequenz) zu A an der Stelle +142 vorliegt, wobei diese Mutationen allein oder in Kombination durchgeführt werden können. Insbesondere in Abwesenheit anderer U5-Mutationen verhindert die Substitution von U (i. e. T hinsichtlich der DNA-Sequenz) zu C an der Stelle +114 [SEQ ID NR. 5] und/oder an der Stelle +132 [SEQ ID NR. 6] in der crHIV-US-RNA ihre Spaltung durch Ribozyme (Uhlenbeck (1987), supra). Die inserierten Basensubstitutionen sind in verschiedenen anderen Stämmen von HIV vorhanden (Myers et al., HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), was zeigt, dass diese Substitutionen das Replikationsvermögen des HIV-Genoms nicht vermindem.
Das hier dargelegte Verfahren kann verwendet werden, um andere bedingt replizierende Vektoren zu konstruieren, die beispielsweise aus unterschiedlichen viralen Genomen (z. B. verschiedenen RNA-Viren) bestehen oder aus verschiedenen genetischen antiviralen Mitteln. Außerdem kann ein bedingt replizierender Vektor weiter modifiziert werden, um einer Wirtszelle, in die der Vektor eingeführt wird, einen Selektionsvorteil gegenüber einer Wirtszelle zu verleihen, die das Wildtyp-Virus enthält. Beispielsweise kann ein solcher Vektor modifiziert werden, damit er weiter Resistenz gegen mehrere Wirkstoffe oder eine mutierte Protease oder Reverse Transkriptase codiert.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Resistenz bedingt replizierender Vektoren, insbesondere der crHIV-Vektoren, gegen Ribozym-Spaltung.
Um die Resistenz der crHIV-Vektoren gegen Ribozym-Spaltung zu bestätigen, wurde Transkription in vitro durchgeführt. Um dies durchzuführen, wurden die Ribozym-Sequenzen in die Xho I-Stelle von pBluescript KSII (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Ein Bgl II-Fragment mit 0,21 Kilobasenpaaren (kb), das die mutierte crHIV-U5-Region enthielt, wurde ähnlich aus dem crHIV-Vektor ausgeschnitten und in die Bam HI-Stelle von pBluescript KSII kloniert. Die resultierenden modifizierten pBluescript KSII-Vektoren wurden mit Bss HII vor der in vitro-Transkription linearisiert. Ein ähnliches Plasmid, das Wildtyp-HIV U5-RNA exprimiert (beschrieben in Myers et al. (1994), supra), wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde vor der in vitro-Transkription mit Eco RI linearisiert.
Radiomarkierte U5-HIV-RNA und Ribozym-RNA wurden durch in vitro-Transkription der Vektoren hergestellt, wie zuvor beschrieben (Dropulic et al. (1992), supra). Die radiomarkierten Transkripte wurden zusammen (bei einem Molverhältnis Target zu Ribozym von 1 : 2) in 1X Transkriptionspuffer inkubiert, der 40 mM Tris-HCI, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin and 10 mM NaCl enthielt. Die Proben wurden auf 65°C erhitzt, dann für 5 min vor der Zugabe von Stopp-Pufferlösung, die 95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylencyanol FF enthielt, auf 37°C abgekühlt. Die Produkte wurden dann durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgelöst und mittels Autoradiographie detektiert.
Wenn Wildtyp-U5-HIV-RNA mit einem Transkript inkubiert wurde, das ein Einze-Ribozym zur Stelle +115 enthielt, wurde schnell Spaltung beobachtet. Eine solche Spaltung führt zu den Produkten P1 und P2. Die Spaltung sieht man auch, wenn Wildtyp-HIV-RNA mit RNAs inkubiert wurde, die Doppel-Ribozyme zur gleichen Stelle oder zu verschiedenen Stellen enthielten. Wenn ein Ribozym-enthaltendes Transkript, das auf zwei verschiedene Stellen ausgerichtet war, mit Wildtyp-HIV-RNA inkubiert wurde, wurden die Produkte P1, P2 und P3 gebildet. P3 resultiert aus der Spaltung an der Stelle +133.
Zum Vergleich, wenn die modifizierte U5 enthaltende crHIV-RNA mit einem Einzel-Ribozym inkubiert wurde, das auf die Stelle +115 ausgerichtet war, oder mit einem Doppel-Ribozym, das auf die Stelle +115 oder die Stelle +133 ausgerichtet war, wurden keine Spaltprodukte nachgewiesen. Diese Ergebnisse bestätigen also, dass crHIV-U5-RNAs gegen Ribozym-Spaltung resistent sind, während Wildtyp-HIV-US-RNAs durch Anti-U5-Ribozyme geschnitten werden. Außerdem bestätigen die Ergebnisse, dass der Ansatz der gegenständlichen Erfindung verwendet werden kann, um bedingt replizierenden Vektoren (einschließlich anderer Vektoren als crHIV-Vektoren) einen Selektionsvorteil für die Replikation, wenn sie in eine Wirtszelle eingeführt werden, im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm des Virus zu verleihen.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit Ribozym enthaltender, bedingt replizierender Vektoren, virale Wildtyp-RNA intrazellulär zu schneiden. Insbesondere beschreibt dieses Beispiel die Fähigkeit von crHIV-Vektoren, Wildtyp HIV-RNA intrazellulär zu schneiden.
Die Wirksamkeit der durch den crHIV-Vektor vermittelten Hemmung von Wildtyp-HIV wurde durch Co-Transfektion der Genome in Jurkat-Zellen geprüft. Die Transfektion wurde durch Waschen von etwa 106 Jurkat-Zellen in Opti-MEM-Medium (Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) und Co-Transfektion der Zellen mit etwa 0,6 μg Wildtyp-HIV-DNA (i. e. pNL4-3) und etwa 1,8 μg crHIV-DNA durchgeführt. Ein Molverhältnis von Wildtyp-HIV zu crHIV-Provirus von etwa 1 : 3 wurde verwendet um sicherzustellen, dass alle mit Wildtyp-HIV transfizierten Zellen auch crHIV-Proviren enthielten. DNA wurde 30 min in Lipofectin-Lösung (Life Technologies) gemischt und dann etwa 3 bis 6 h mit Jurkat-Zellen inkubiert, wonach komplettes RPMI 1640 Medium, das 10% fetales bovines Serum (FBS) enthielt, zugesetzt wurde. Virushaltige Überstände wurden alle 2 bis 4 Tage geerntet, und die Virus-Spiegel wurden durch die Reverse-Transkriptase-Aktivität in Zellüberständen geprüft, wie früher beschrieben (Dropulic et al. (1992), supra).
Die Wirkung von crHIV-Genomen auf die Replikation von Wildtyp-HIV wird in der 3 gezeigt. Wenn Wildtyp-HIV mit crHIV-1.1 co-transfiziert wurde, wurde das Viruswachstum verzögert (3, offene Kästchen) im Verhältnis zu den mit Wildtyp-HIV und einem Kontrollvirus co-transfizierten Zellen (3, ausgefüllte Kästchen), aber es wurde nicht gehemmt. Da Anti-U5-Ribozyme die HIV-Replikation in vivo unter colokalisierten Bedingungen hemmen können (z. B. Dropulic et al. (1992), supra), kann das beobachtete Viruswachstum das Ergebnis entweder (a) einer bevorzugten Verpackung von Wildtyp-HIV-RNAs in Virionen-Nachkommenschaft, (b) der Bildung von Wildtyp-HIV-RNAs, die gegen Ribozymspaltung resistent sind, oder (c) einer Akkumulation von nicht-funktionalen Ribozymen in crHIV-RNAs sein.
Die Natur des "Escape"-Viruswachstums wurde durch Co-Transfektion von Wildtyp-HIV mit crHIV-Vektoren, die Doppel-Ribozyme enthielten, geprüft. Wenn ein bevorzugtes Verpacken von Wildtyp-HIV für das Viruswachstum verantwortlich ist, sollten Kulturen, die Doppel-Ribozym-crHIVs enthalten, ähnliche Wachstumskinetik haben wie Kulturen, die Einzel-Ribozym-crHIVs enthalten. Falls jedoch das Viruswachstum das Ergebnis von Wildtyp-HIV-RNAs ist, die gegen Ribozymwirkung resistent geworden sind (i. e. als Ergebnis einer Ungenauigkeit der viralen Reversen Transkriptase), sollte die Kinetik des Viruswachstums eine größere Verzögerung für Kulturen zeigen, welche crHIV-1.12 (i. e. gegen zwei virale Stellen gerichtet) enthalten, im Vergleich zu Kulturen, welche crHIV-1.11 (i. e. gegen eine einzelne virale Steile gerichtet) enthalten. Andererseits, wenn eine Verzögerung beim Viruswachstum beobachtet wurde, die bei Kulturen, die die unterschiedliches Doppel-Ribozym enthaltenden crHIVs enthielten, vergleichbar war, würde dies nahe legen, dass ein Anteil der einzeln exprimierten Ribozyme in vivo nicht-funktionell ist.
Wie man anhand der 3 sehen kann, zeigten crHIV-1.11 (3, offene, durchkreuzte Kästchen) oder crHIV-1.12 (3, gepunktete Kästchen) enthaltende Kulturen eine größere Verzögerung beim Einsetzen des Viruswachstums als crHIV-1.1, das ein einzeln transkribiertes Ribozym (3, offene Kästchen) enthielt. Die Verzögerung beim Einsetzen des Viruswachstums bei crHIV-1.11 und crHIV-1.12 war jedoch ähnlich, was ein Hinweis für die Richtigkeit der dritten Möglichkeit ist, i. e. dass einzeln transkribierte Ribozyme bei der Spaltung von Target-RNAs kinetisch weniger wirksam ist als Doppel-Ribozyme. Dies legt nahe, dass sich ein bestimmter Anteil intrazellulär transkribierter Ribozyme in einer nicht-funktionellen, möglicherweise fehlgefalteten Konformation bilden kann, da die Co-Transfektionsversuche in einem molaren Überschuss an Ribozym enthaltenden crHIV-Genomen durchgeführt wurden.
Die Fähigkeit multipler Ribozyme, diese kinetische Beschränkung aufzuheben, indem eine größere Wahrscheinlichkeit für funktionale Ribozyme zur Assoziation mit Wildtyp-HIV-RNAs bereitgestellt wird, wurde untersucht. Für diese Versuche wurden Jurkat-Zellen mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.111, das ein Tripel-Ribozym zur Stelle +115 enthält, co-transfiziert. Wie man anhand der 3 (gepunktete Kästchen) sehen kann, gibt es selbst nach 22 Tagen in Kultur keinen Hinweis auf Viruswachstum bei der Verwendung eines Tripel-Ribozyms. Diese Ergebnisse sind besonders signifikant im Hinblick auf die Tatsache, dass normale primäre T-Zellen oft kurz (z. B. etwa 1 Woche) nach der Infektion mit HIV sterben.
Außerdem bestätigen diese Ergebnisse, dass Ribozym enthaltende bedingt replizierende Vektoren, wie die crHIV-Vektoren, und insbesondere jene, die Mehrfach-Ribozyme enthalten, verwendet werden können, um intrazellulär mit einem Wildtyp-Virusgenom, wie HIV, in Konkurrenz zu treten.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt eine Untersuchung des Mechanismus, welcher der Fähigkeit von Ribozym enthaltenden bedingt replizierenden Vektoren, insbesondere crHIV Vektoren, Wildtyp-Virus-RNA intrazellulär zu schneiden, zugrunde liegt.
Für diese Versuche wurde RNA aus Zellüberstand von mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.111 co-transfizierten Kulturen unter Verwendung der Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht wie hier beschrieben. RT-PCR wurde unter Verwendung der in 5A dargestellten Primer durchgeführt. Ribozym-RNA wurde unter Verwendung der Primen R1 und R2 detektiert, Wildtyp-HIV-RNA unter Verwendung der Primer V1 und V3, und crHIV-RNA unter Verwendung der Primen V2 und V3. Die Primer R1 (TGTGACGTCGACCACACAACACTGATG [SEQ ID NR. 7]) und R2 (TGTGACGTCGACTCTAGATGTGCCCGTTTCGGC [SEQ ID NR. 8]) enthalten jeweils eine Sal l-Restriktionsstelle und amplifizieren die Anti-U5-Ribozym-RNA durch Bindung an die Ribozym-Hybridisierungssequenzen. In crHIV-1.111 exprimierenden Zellen sieht man Einzel-, Doppel- und Tripel-Ribozym-Amplifizierungsprodukte. Die Primer VI (GGTTAAGCTTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCC [SEQ ID NR. 9]) und V2 (GGTTGGATCCGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG [SEQ ID NR. 10]) umfassen jeweils Bam HI- oder Hin dlll-Restriktionsstellen und amplifizieren Wildtyp-HIV-RNAs. Zusammen mit dem genannten V1-Primen, umfasst der V3-Primer (CGGATCCACGCGTGTCGACGAGCTCCCATGGTGATCAG [SEQ ID NR. 11]) Bam HI und andere Restriktionsstellen. Dieser Satz von Primern amplifiziert crHIV-RNAs von einer crHIV-spezifischen Polylinker-Sequenz.
Um RT-PCR durchzuführen, wurden Virion- und intrazelluläre RNAs unter Verwendung von Trizol^TM (Life Technologies) isoliert. Intrazelluläre virale RNAs wurden direkt aus mikrozentrifugierten Zellpellets isoliert. Virion-RNAs wurden aus Kulturüberständen isoliert, die zuerst durch 5minütiges Mikrozentrifugieren bei 12 000 × g von Zellen und Bruchstücken befreit wurden. Zu den zellfreien Überständen wurde Trizol^TM zu gesetzt, und die Mischungen wurden vor der Zugabe von Chloroform für die Phasentrennung 5 min inkubiert. Die wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen transferiert, und die RNA wurde mit Isopropanol unter Verwendung von Glycogen präzipitiert. Nach der Rekonstitution des RNA-Pellets wurden die viralen RNAs revers transkribiert und dann durch PCR unter Verwendung von radiomarkierten Primern amplifiziert.
Die reverse Transkription wurde 1 h bei 42°C in first-strand Puffer durchgeführt, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM dNTPs und 20 Einheiten (U) RNase-Inhibitor enthielt, wozu 25 U MuLV Reverse Transkriptase zugesetzt wurden. Nachdem die reverse Transkription beendet war, wurde die Reverse Transkriptase bei 65°C 10 min inaktiviert. Die gesamte Mischung wurde dann direkt zu PCR-Puffer zugegeben, um eine Mischung zu erhalten, die eine Endkonzentration von 10 mM Tris-HCI, pH 8,3, 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂ enthielt. Die Mischung wurde unter Verwendung von 2,5 U Taq-Enzym für 30 Zyklen amplifiziert. Die radiomarkierten PCR-Produkte wurden dann durch denaturierende PAGE aufgelöst und mittels Autoradiographie nachgewiesen.
crHIV-1.111-Ribozym-RNAs sind in den Überständen von Zellen mehr als 20 Tage nach der Co-Transfektion mit Wildtyp-HIV-1 und crHIV-1.111 proviralen Genomen vorhanden. Dies wird durch das Vorhandensein von Einzel-, Doppel- und Tripel-Ribozym-RNA PCR-Produkten bestätigt. Zum Vergleich, in Virionen, die durch mit Wildtyp-HIV transfizierte Kontrollkulturen produziert wurden, sind keine solchen Produkte zu sehen. Während dieser Periode erscheinen die Zellen normal, ohne sichtbare Anzeichen für crHIV-induzierte Zytotoxizität. Dies bestätigt, dass crHIVs in Viruspartikel verpackt werden, obwohl keine Aktivität von Reverser Transkriptase beobachtet wurde. Weiter zeigt dies an, dass crHIVs intrazellulär durch HIV-Genfunktionen komplementiert werden können.
Diese Ergebnisse zeigen also, dass crHIVs die Replikation von Wildtyp-HIV durch Hemmung der Ausbreitung von Wildtyp-HIV hemmen. Die Ergebnisse zeigen weiter, dass andere bedingt replizierende Vektoren, beispielsweise andere virale Vektoren und/oder Vektoren, die andere genetische antivirale Mittel enthalten, ähnlich verwendet werden können, um die Wildtyp-Virusreplikation und -ausbreitung zu hemmen.
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt eine weitere Untersuchung des Mechanismus, welcher der Fähigkeit von Ribozym enthaltenden, bedingt replizierenden Vektoren, insbesondere crHIV-Vektoren, zur intrazellulären Spaltung von viraler Wildtyp-RNA zugrunde liegt.
Ein möglicher Mechanismus ist der, dass sowohl Wildtyp-HIV- als auch crHIV-RNAs in Virionen-Nachkommenschaft verkapselt werden und wirksame Spaltung in diesem kleinen Virusvolumen aufgrund der Co-Lokalisation von Ribozym und Target-RNAs auftritt. Alternativ kann das selektive Verpacken von crHIV-RNAs in Virionen-Nachkommenschaft auftreten, weil die Spaltung von Wildtyp-HIV-RNAs hauptsächlich intrazellulär auftritt und nicht im HIV-Virion. Diese Mechanismen wurden hier untersucht.
Die Mittel, durch die crHIV-1.111 die Ausbreitung von Wildtyp-HIV hemmte, wurden mittels RT-PCR von Virion- und Zell-assoziierten viralen RNAs untersucht, und zwar in Zellkulturen, die mit Wildtyp-HIV allein transfiziert wurden oder die mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.111 co-transfiziert wurden. crHIV-1.111-RNAs waren exklusiv in Virionen-Nachkommenschaft vorhanden, die nach Co-Transfektion produziert wurde. Zum Vergleich, mit Wildtyp-HIV transfizierte Kontrollkulturen produzierten Virionen, die nur Wildtyp-HIV-RNAs enthielten. Intrazellulär waren Wildtyp-HIV- und crHiV-1.111-RNAs in co-transfizierten Kulturen evident. Daher werden, obwohl sowohl Wildtyp-HIV als auch crHIV-RNAs intrazellulär synthetisiert werden, crHIV-RNAs selektiv in Virionen-Nachkommenschaft verpackt. Dies legt nahe, dass crHIV-1.111 die Ausbreitung von Wildtyp-HIV durch selektive Spaltung von genomischen Wildtyp-HIV-RNAs vor der Enkapsidation hemmte, während einige subgenomische Wildtyp-RNAs in Proteine für die Virionenproduktion translatiert werden konnten.
Um zu prüfen, ob genomische Wildtyp-RNAs selektiv durch crHIV-RNAs geschnitten werden, wurden die Arten von intrazellulären RNAs, die in Jurkat-Zellkulturen vorhanden sind, die etwa 20 Tage nach der Co-Transfektion erhalten wurden, durch Northern-Hybridisierung untersucht. Die für die Northern-Blot-Analyse verwendete Sonde, wie in 5 gezeigt, wurde aus einem 0,21 kb Bgl II-Fragment aus der U5-Region von pNL4-3 isoliert.
Mit Wildtyp-HIV transfizierte Kulturen exprimieren alle Wildtyp-HIV-RNA-Spezies, i. e. genomische und subgenomische RNA-Spezies. Zum Vergleich, mit crHIV-1.111 cotransfizierte Kulturen exprimieren keine signifikanten Mengen an genomischer (9,7 kb) Wildtyp-HIV-RNA. RNAs mit niedrigem Molekulargewicht (die das Vorhandensein subgenomischer Wildtyp-HIV-RNAs reflektieren) wurden in co-transfizierten Kulturen beobachtet. Das Verschmieren von HIV-RNA in diesen Proben legt nahe, dass einige abgebaute genomische HIV-RNAs in diesen RNAs mit niedrigem Molekulargewicht vorhanden sein können. Zum Vergleich, das Verschmieren von Wildtyp-HIV-RNA von Wildtyp-HIV-Kontrollzellen beruht auf RNA-Abbau, der vom signifikanten CPE auftritt, der in der letzten Phase der HIV-Infektion beobachtet wird.
Folglich bestätigen diese Ergebnisse, dass genomische Wildtyp-HIV-RNAs in Zellen, die Wildtyp-HIV- und crHIV-1.111-Genome enthalten, selektiv geschnitten und abgebaut werden, wobei die selektive Verpackung von crHIV-RNA in Virionen möglich ist. Weiter zeigen diese Ergebnisse, dass das Verfahren ähnlich bei anderen Viren verwendet werden kann, insbesondere bei anderen RNA-Viren.
Beispiel 6
Dieses Beispiel beschreibt eine Untersuchung der Fähigkeit von Ribozym enthaltenden, bedingt replizierenden Vektoren, insbesondere crHIV-Vektoren, den vollständigen viralen Replikationszyklus in Gegenwart von Wildtyp-Helfervirus zu durchlaufen.
Um zu bestätigen, dass crHIV-Genome den vollständigen viralen Replikationszyklus in Gegenwart eines Wildtyp-HIV-Helfergenoms durchlaufen, wurde die Produktion von crHIV-Genome enthaltenden Viruspartikeln unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Speziell wurde zuerst die Produktion von crHIV-Genome enthaltenden Viruspartikeln in aktivierten ACH2-Zellen (AIDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland) untersucht. Diese Zellen umfassen eine latent HIV-1-infizierte Zelllinie. Dann wurde die Fähigkeit von crHIV-Partikeln, die von diesen Kulturen abgeleitet sind, zur Infektion nicht-infizierter Jurkat-Zellen und zur Produktion von crHIV-DNA untersucht.
Für diese Versuche wurden etwa 10⁶ ACH2-Zellen mit etwa 2,5 μg Vektor-DNA transfiziert. Die Zellen wurden mit 50 nM 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) etwa 24 h nach der Transfektion stimuliert. RNA wurde aus den Zellüberständen etwa 72 h nach der Transfektion isoliert. RT-PCR wurde unter Verwendung der R1-und R2-Primer, wie im Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. crHIV-Ribozym-RNAs wurden in Virionen nachgewiesen, die durch aktivierte ACH2-Zellen nach Transfektion mit crHIV-1.11 produziert wurden, aber nicht nach Transfektion mit pGEM 3Z Kontroll-Plasmid (Promega, Madison, WI). Daher führt die Transfektion von crHIV-Vektoren in infizierte CD4+-Zellen zur Produktion von Viruspartikeln, die crHIV-RNAs enthalten.
Die Fähigkeit der von diesen Kulturen abgeleiteten crHIV-Virionen, nicht-infizierte Jurkat-Zellen zu infizieren und crHIV-Proviren zu produzieren, wurde als Nächstes untersucht. Solche Proviren wurden durch Isolieren von zellulärer DNA unter Verwendung von Trizol^TM, Schneiden der DNA mit Eco R1 und Amplifizieren ribozymaler DNA durch PCR unter Verwendung der R1- & R2-Primer, wie im Beispiel 4 beschrieben, nachgewiesen. crHIV-DNA wurde in Jurkat-Zellen nach Infektion von Zellüberständen produziert, die von crHIV-transfizierten ACH2-Zellen abgeleitet waren. In diesem Fall war nämlich spezifische Amplifizierung von crHIV-1.11 ribozymaler DNA zu sehen. Zum Vergleich, mit stimulierten ACH2-Zellüberständen allein (i. e. in Abwesenheit irgendwelcher Infektion von ACH2-Zellen mit crHIV-1.111) infizierte Zellen zeigten keine ribozymalen DNA-Produkte.
Da sich crHIV-Vektoren nur in Gegenwart von Wildtyp-Helfer-HIV Genomen ausbreiten, wurde die Fähigkeit uninfizierter, crHIV-Genome enthaltender Zellen, nach Infektion mit Wildtyp-HIV gerettet zu werden, untersucht. Diese Versuche wurden durchgeführt, indem zuerst Zellen mit crHIV-1.11 (i. e. repräsentativ für die crHIV-Vektoren) transfiziert, dann mit Wildtyp-HIV (i. e. pNL4-3) superinfiziert wurden. Folglich wurden etwa 10⁶ Jurkat-Zellen mit etwa 2,5 μg crHIV-DNA transfiziert. Man ließ die Zellen etwa 72 h vor der Infektion mit Wildtyp-HIV-Stammvirus wachsen. Mit crHIV-1.11 transfizierte Jurkat-Zellen wurden mit Stamm-pNL4-3 (2 × 10⁵ TCID₅₀ Einheiten pro 10⁶ Zellen) etwa 2 h bei 37°C inkubiert, drei MaI mit Opti-MEM^® 1 Reduced Serum Medium gewaschen und dann erneut in Komplettmedium (RPMI 1640 mit 10% FBS) suspendiert. RNA wurde aus Zellüberständen, wie im Beispiel 4 beschrieben, etwa 5 Tage nach der Infektion isoliert.
Für den TCID₅₀-Assay wurden HIV enthaltende Überstände auf Platten mit 96 Vertiefungen durch 5fache limitierende Verdünnung ausplattiert. Etwa 10⁴ MT4-ZeIIen (AIDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland; und Harada et al., Science, 229, 563–566 (1985)) wurden dann zu den verdünnten Virussuspensionen zugegeben, und die resultierenden Suspensionen wurden 7 Tage inkubiert, bis vollständiges Viruswachstum erfolgt war. MT4-Zellen sind modifizierte T-Zellen, die das Tax-Gen von HTLV-1 enthalten, das ein Transaktivator-Gen ist, welches zum Tat in HIV-1 analog ist. Überstände wurden dann hinsichtlich der Aktivität von Reverser Transkriptase untersucht und wie früher beschrieben bewertet (Dropulic et al. (1992), supra). Die TCID₅₀ (Gewebekultur-Infektionsdosis) wurde nach dem Verfahren von Reed und Muench bestimmt (in: Tech. in HIV Res., Johnson et al., Hg., Stockton Press, 71–76 (1990)).
Die Superinfektion von crHIV-transfizierten Jurkat-Zellen mit Wildtyp-HIV führte dazu, dass crHIV-Genome in Viruspartikel gerettet wurde. Die crHIV-Genome werden nach der Superinfektion mit Wildtyp-HIV in Viruspartikel verpackt. Während dieser Zeit schienen die Zellen normal, ohne signifikante Anzeichen von Zytotoxizität.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass crHIV-Genome in der Lage sind, nach Komplementation mit Wildtyp-HIV-Helfervirus den vollen Replikationszyklus zu durchlaufen. Diese Ergebnisse bestätigen auch, dass andere virale Genome wahrscheinlich ebenfalls in der Lage sind, nach Komplementation mit dem entsprechenden Wildtyp-Virus den vollen Replikationszyklus zu durchlaufen.
Beispiel 7
Dieses Beispiel beschreibt die Nature des Escape-Viruswachstums, von dem in bisherigen Beispielen die Rede war.
Die Natur des Escape-Viruswachstums von mit Wildtyp-HIV transfizierten oder mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.11 co-transfizierten Kulturen wurde durch Analysieren von Virionen-RNAs unter Verwendung von RT-PCR wie zuvor beschrieben untersucht. Viren, die von Kulturen auf frühen Stufen des Viruswachstums produziert wurden (i. e. mit Wildtyp HIV transfizierte Kultur am Tag +11, mit crHIV-1.11 co-transfizierte Kultur am Tag +19), enthielten hauptsächlich crHIV-RNAs. Zum Vergleich, Kulturen von späten Stufen des Wachstums (i. e. mit Wildtyp-HIV transfizierte Kultur am Tag +17, mit crHIV-1.11 co-transfizierte Kultur am Tag +23) enthielt hauptsächlich Wildtyp-HIV-RNAs. Daher schien das Viruswachstum von Zellen, die mit Wildtyp-HIV und crHIV-1.11-Proviren co-transfiziert waren, aus dem Wachstum von Wildtyp-HIV zu resultieren, das der intrazellulären Ribozymrestriktion entkam. Signifikanterweise enthielten crHIV-Genome noch einen substantiellen Anteil der gesamten HIV-Genome, selbst in Kulturen auf späten Stufen des Viruswachstums. Dies legt nahe, dass sich trotz des Vorherrschens von Wildtyp-HIV-Genomen crHIV-Genome dennoch durch die Kultur ausbreiteten, wenn auch mit niedrigerer Effizienz als Wildtyp-HIV-Genome.
Dies bestätigt, dass die crHIV-Vektoren, ebenso wie weitere bedingt replizierende Vektoren, wirksam mit vitalen Genomen vom Wildtyp hinsichtlich der Virusreplikation in Konkurrenz treten können.
Beispiel 8
Dieses Beispiel beschreibt weiter die Nature von Escape-Viruswachstum, über das in früheren Beispielen berichtet wurde.
Der Effekt des Verpackens von crHIV-RNA in Virionen während des Escape-Viruswachstum wurde untersucht, indem infektiöse Wildtyp-HIV-Titer gemessen wurden. TCID₅₀-Assays mit limitierender Verdünnung (wie im Beispiel 6 beschrieben) wurden an Virusüberständen von Kulturen auf der exponentiellen Stufe des Viruswachstums durchgeführt (i. e. Wildtyp-HIV-Kulturen am Tag +14, crHIV-1.1-Kulturen am Tag +16, crHIV-1.11- oder crHIV-1.12-Kulturen am Tag +20). Die Proben wurden vor der Prüfung unter Verwendung von Reverse-Transkriptase-Aktivität normalisiert. Überstände von Wildtyp-HIV-, crHIV-1.1-, crHIV-1.11- und crHIV-1.12-Kulturen hatten eine infektiöse Dosis von 1,3 × 10⁴ TCID₅₀/ml, 5,4 × 10³ TCID₅₀/ml, 3,8 × 10³ TCID₅₀/ml bzw. 3,8 × 10³ TCID₅₀/ml. Das Verpacken von crHIV-RNAs in Virionen während des Escape-Viruswachstums führt also zu einer Abnahme der Zahl der infektiösen Wildtyp-HIV-Partikel, die gebildet werden.
Als Nächstes wurde untersucht, ob die Abnahme des infektiösen Wildtyp-HIV-Titers das Ergebnis der Spaltung von Wildtyp-HIV-RNAs innerhalb von Escape-Virionen war. RNA-Spaltprodukte aus Virionen, die in den Überständen co-transfizierter Zellen vorhanden waren, wurden durch Primen-Extension untersucht. Der in 6 identifizierte, eine Hin dIII-Restriktionsstelle aufweisende PE-Primen (GGTTAAGCTTGTCG CCGCCCCTCGCCTCTTG [SEQ ID NR. 12] wurde verwendet. Die Primen-Extension über die Spaltstelle wurde 2 h bei 42°C in first-strand Puffer durchgeführt, der 50 mM Tris-HCI, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM dNTPs und 20 U RNase-Inhibitor enthielt, wozu 25 U MuLV Reverse Transkriptase zugegeben wurden. Virale RNAs wurden aus konzentrierten Virionenzubereitungen isoliert, die von mit crHIV co-transfizierten Kulturen abgeleitet waren. Zellen und Bruchstücke wurden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 2000 × g bei 4°C entfernt. Das Virus wurde dann durch 4stündige Ultrazentrifugation bei 30000 × g bei 4°C konzentriert. Virale RNAs wurden dann aus den Virus-Pellets unter Verwendung von Trizol^TM, wie zuvor beschrieben, isoliert.
Virale RNAs wurden von mit Wildtyp-HIV transfizierten und mit crHIV-1.11 co-transfizierten Kulturüberständen während der späten Stufen des Viruswachstums isoliert (i. e. mit Wildtyp-HIV transfizierte Kulturen am Tag +17, mit crHIV-1.11 co-transfizierte Kulturen am Tag +23). Die Virionen in diesen Kulturen enthielten sowohl Wildtyp-HIV als auch crHIV genomische RNAs. Mit Primen extendierte full-length cDNA wurde sowohl in mit Wildtyp-HIV transfizierten als auch in mit crHIV-1.11 co-transfizierten Kulturen beobachtet. Es wurden trotz der extensiven Primen-Extensionsanalyse keine kleineren cDNAs nachgewiesen, welche das Ergebnis von U5-RNA-Spaltung gewesen wären. Die Abnahme an infektiösen Wildtyp-HIV-Titern beruht also nicht auf intraviraler Spaltung von Wildtyp-HIV-RNAs, sondern auf ihrer numerischen Verdrängung durch crHIV-RNAs in Virionen-Nachkommenschaft.
Diese Ergebnisse zeigen also, dass das hier beschriebene Verfahren herangezogen werden kann, um Wildtyp-Genome, wie HIV-Genome und andere Genome, aus Virionen-Nachkommenschaft zu verdrängen, indem die erfindungsgemäßen bedingt replizierenden Vektoren verwendet werden.
Beispiel 9
Dieses Beispiel zeigt, dass crHIV-Vektoren Wildtyp-HIV-Replikation nach Challenge mit Plasmid oder rekombinantem crHIV-1.111-Virus hemmen können.
Jurkat-Zellen wurden mit Stamm-HIV (Klon pNL4-3) infiziert und dann entweder (1) Plasmid-DNA, die das crHIV-1.111-Konstrukt enthielt, oder (2) rekombinantem crHIV-1.111-Virus, verpackt in 293 Zellen, i. e. mutantes crHIV-1.M (Nadlini et al., Science, 272, 263–267 (1996)) ausgesetzt. Die Zellen wurden einer DLS-Lipid-vermittelten Transfektion (Thierry et al., PNAS, 92, 9742–9746 (1995)) oder crHIV-vermitteltem Transfer unterworfen. Die Virusreplikation wurde unter Verwendung des Reverse-Transkriptase-Assays 12 Tage nach der ursprünglichen Infektion mit HIV gemessen. Wildtyp-positive Kontrollkulturen zeigten normale Niveaus an Wildtyp-HIV-Wachstum. Wenn mit Wildtyp-HIV infizierte Zellen mutantem crHIV-1.M via DLS-vermittelte Transfektion ausgesetzt wurden, wurde das Wachstum von Wildtyp-HIV nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu wurde, wenn mit Wildtyp-HIV infizierte Zellen mit crHIV-1.111, das ein Anti-HIV-Ribozym codiert, via DLS-vermittelte Transfektion ausgesetzt wurden, das Wachstum von Wildtyp-HIV (i. e. Replikation) signifikant gehemmt. Weiter wurde, wenn mutantes crHIV-1.M Wildtyp-HIV ausgesetzt wurde, die Replikation von Wildtyp-HIV nicht beeinflusst. Im Gegensatz dazu wurde, wenn Wildtyp-HIV crHIV-1.111 ausgesetzt wurde, die Replikation von Wildtyp-HIV signifikant gehemmt. Die Daten zeigen, dass crHIV-Vektoren verwendet werden können, um die Wildtyp-HIV-Replikation intrazellulär signifikant zu hemmen.
Beispiel 10
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung bedingt replizierender Vektoren bei der therapeutischen Behandlung von Krebs.
Der bedingt replizierende, Krebs behandelnde, virale Vektor kann so konstruiert werden, dass er hinsichtlich seiner Fähigkeit, in normal Zellen zu replizieren, defekt ist, weil ihm ein Virusprotein fehlt, das für die Replikation erforderlich ist. Wenn dieser Vektor jedoch eine Krebszelle infiziert, stellen die einzigartigen Eigenschaften der Krebszelle einen Faktor bereit (z. B. vorzugsweise das gleiche mutierte zelluläre Protein, welches das abweichende Wachstum von Krebszellen fördert), der die Replikation des defekten Krebsbehandlungsvektors fördert. Folglich unterscheidet sich dieses Verfahren von dem für die Behandlung von Virusinfektionen angewendeten Verfahren insofern, als das selektive Verpacken des viralen Vektors nicht vorkommt und statt dessen eine bevorzugte Lyse von Krebszellen auf Grund der Verpackung von Vektor-abgeleiteter Virionen-Nachkommenschaft in der Zelle erfolgt. Das Verfahren ist dem zur Behandlung von Virusinfektionen herangezogenen Verfahren insofern ähnlich, als es einen Helfeivirusexpressionsvektor verwenden kann, um den bedingt replizierenden Vektor selektiv in Krebszellen zu vermehren. Der Vektor und/oder der Helfervirusexpressionsvektor kann so gemacht sein, dass er auf tumorspezifische Faktoren reagiert, wobei die selektive Ausbreitung des Vektors in Tumorzellen erleichtert wird.
Tumorspezifische Faktoren, die bei dieser Behandlungsmethode genutzt werden können, schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, jene ein, die auf dem Niveau (1) des Viruseintritts in Zellen (z. B. Gegenwart eines tumorspezifischen Rezeptors, der ermöglicht, dass ein viraler Vektor selektiv in eine Krebszelle, aber nicht in eine normale Zelle eintritt); (2) der Virustranskription (z. B. ein mutantes Krebszellenprotein ermöglicht, dass ein Krebsbehandlungsvektor seine RNA selektiv in Krebszellen, im Gegensatz zu normalen Zellen, transkribiert); und (3) der Virusreifung und freisetzung (z. B. können mutante Krebszellenproteine ermöglichen, dass der bedingt replizierende Krebsbehandlungsvektor selektiv reift, beispielsweise durch Assoziation des mutanten Zellproteins mit den viralen Proteinen oder Genom und resultierender Förderung der Virusreifung und -freisetzung) agieren. Folglich können mutante Proteine, die in Krebszellen vorhanden sind, mit Virusproteinen (oder der genomischen RNA oder DNA) an vielen Stufen des Virusreplikationszyklus interagieren. Diese Wechselwirkungen können beeinflusst werden, um bedingt replizierende Krebsbehandlungsvektoren schaffen, die in normalen Zellen defekt sind und in Krebszellen replizieren können.
Insbesondere kann dieses Verfahren zur Behandlung von T-Zellen-Leukämie angewendet werden. T-Zellen-Leukämien sind eine schwere Krebsfom mit schlechter Prognose. Viele der leukämischen T-Zellen sind CD4+. Daher kann ein Anti-T-Zellen Leukämie-behandelnder, bedingt replizierender Vektor konstruiert werden, wobei Wildtyp-HIV als Rückgrat des Vektors verwendet wird. Da HIV angeblich in Zellen über das CD4 Glycoprotein eindringt, würde dieser Vektor auf dem Niveau des Viruseintritts in Zellen agieren.
Der Vektor kann dadurch zu einem Krebsbehandlungsvektor gemacht werden, dass beispielsweise in Wildtyp-HIV Deletion(en) eingeführt wird(werden). Das HIV-Genom kann mutiert werden, indem es in seiner DNA-Form produziert und ortsspezifische Mutagenese durchgeführt wird, wie früher beschrieben. Das Verfahren kann auch angewendet werden durch Komplementation von vitalen Defiziten durch andere Tumorsuppressormutationen oder negative Onkogene oder durch Nutzung anderer tumorspezifischer Faktoren, die mit Virusproteinen interagieren. Zum Beispiel kann das tat-Gen, das ein für die HIV-Replikation wichtiges Protein codiert, deletiert werden. In Abwesenheit von Tat kann HIV seine Expression nicht länger hochregulieren, was absolut unerlässlich für die HIV-Vermehrung ist. Das Tat-Protein funktioniert durch Bindung an die TAR RNA stem-loop Struktur, die mit dem HIV-Promotor assoziiert ist, und ist in der Lage, die HIV-Expression um mehr als das 100fache hochzuregulieren. Ohne Tat wird also der auf HIV basierende Vektor keine HIV-Proteine exprimieren, und er wird sich nicht vermehren und normale (i. e. nicht kanzeröse) T-Zellen töten.
Leukämische T-Zellen enthalten jedoch typischerweise ein funktional verändertes Molekül, das mutiert, überexprimiert oder stillgelegt ist. Dieser veränderte Zustand der Molekülfunktion ist nicht mit normalen Zellen verbunden. In seinem nicht-mutierten Zustand (nicht aber in seinem mutierten Zustand) fungiert dieses Molekül in der Regulierung der Zeltproliferation und/oder der Apoptose (programmierter Zelttod). Die mit dem mutierten Zustand verbundenen Änderungen können genutzt werden, um spezifisch die Vermehrung eines bedingt replizierenden vitalen Vektors zu fördern. Dies könnte in Gegenwart oder Abwesenheit eines Helfervirusexpressionsvektors erfolgen. Zum Beispiel kann der Defekt in Tat durch einen Hilfs-Expressionsvektor komplementiert werden, der von einem tumorspezifischen Promotor getrieben ist, wobei der Promotor von einem Gen in leukämischen Zellen ist, das überexprimiert ist. Ein solcher Vektor kann nur in leukämischen T-Zellen und nicht in normalen Zellen replizieren. Die Virusexpression und -vermehrung in leukämischen T-Zellen würde zur Lyse und zum Tod der Zellen mit entstehender Virusproduktion führen. Der Vektor könnte auch zusätzliche Elemente tragen, um die Zelttötung zu fördern (z. B. eine Sequenz, die ein Toxin, ein Cytokin oder ein Antigen zur Förderung des Immun-Targeting codiert).
Andere Verfahren und Strategien können ähnlich bei der Konstruktion weiterer bedingt replizierender Krebsbehandlungsvektoren angewendet werden.
Beispiel 11
Dieses Beispiel beschreibt die Entwicklung von crHIV-Konstrukten der zweiten Generation (cr2HIV), die bessere Eigenschaften hinsichtlich der Vermehrung haben als crHIV-1.111-Vektoren.
Die Vektoren der zweiten Generation ermöglichen die erhöhte Produktion von crHIV-Partikeln aus crHIV produzierenden Zellen. Die Produktion von mehr crHIV-Partikeln erleichtert deren Ausbreitung und verhindert das Auswachsen von Wildtyp-HIV in Kulturen. Da es ihnen an Sequenzen mangelt, die Proteine codieren, die die Superinfektion mit Wildtyp-HIV blockieren, enthalten die Vektoren alle Sequenzen des nativen Wildtyp-HIV, aber sie codieren nicht das Tat-Gen. Anstelle des Tat-Gens gibt es eine Tripel-Anti-Tat-Ribozymkassette ([SEQ ID NR. 18)), die in Bezug auf drei verschiedene Stellen auf dem Tat-Gen gemacht ist. Auch die Tat-Spleißstelle wurde deletiert, so dass die Tat-Ribozyme genomische Wildtyp-HIV-RNAs selektiv schneiden und nicht gespleißte Wildtyp-HIV-RNAs, die den Defekt in Tat komplementieren und die crHIV-Replikation erleichtern. Im Gegensatz zu früheren Vektoren, die keine anderen Proteine codieren als vielleicht ein proteinähnliches genetisches antivirales Mittel, wie ein Immunogen, codieren die Vektoren der zweiten Generation diese Proteine, exprimieren sie aber nur in Gegenwart von Tat. In einer Zelle, die sowohl Wildtyp-HIV als auch crHIV-Genome enthält, werden crHIVs-Genome nicht nur selektiv verpackt, sondern es werden viel mehr Virionen produziert als von crHIV-1.111-Zellen, da die Strukturproteine nicht nur von Wildtyp-HIV produziert werden, sondern auch von crHIV-Genomen. Folglich ist der Vektor mit einem Selektionsvorteil für die Vermehrung versehen, da er nicht nur Virionen von Wildtyp-HIV-Matrizen produziert, sondern auch von crHIV-Matrizen.
Die Vektoren der zweiten Generation sind auch dadurch gekennzeichnet, dass sie Ribozyme umfassen oder codieren, deren katalytische Domänen auf andere Regionen ausgerichtet ist als die im Vektor selbst. Im Gegensatz zu crHIV-1.111, das Ribozyme enthält oder codiert, die auf die U5-Region der HIV-Leader-Sequenz ausgerichtet sind, was das Einbringen modifizierter U5-Sequenzen in den Leader des crHIV-Vektors erforderlich machte, sind die Ribozyme der Vektoren der zweiten Generation auf Regionen ausgerichtet, die nicht im Vektor selbst sind, wobei die Notwendigkeit eliminiert wird, die Sequenz des Vektors zu modifizieren. Dies reduziert die Möglichkeit, dass sich resistente HIVs durch die Rekombination von Wifdtyp-HIV mit modifizierten crHIV-U5-Sequenzen bilden. Die Rekombination von Wildtyp-HIV mit crHIV-Sequenzen würde keinen Vorteil für das Wildtyp-HIV bieten; das Einbringen von Ribozymsequenzen in Wildtyp-HIV wäre für Wildtyp-HIV nur nachteilig.
Die Vektoren der zweiten Generation sind weiter dadurch gekennzeichnet, dass eine Anzahl unterschiedlicher Ribozyme eingebracht sind, von denen jedes auf eine andere Stelle ausgerichtet ist, um die Möglichkeit zu reduzieren, dass Wildtyp-HIV Ribozym-resistente Mutanten bildet.
In einer weiteren Verbesserung des Vektorsystems zum Zweck eines sicheren, bedingt replizierenden Vakzins kann das "Helfer-Vektor"-Konstrukt weiter verbessert werden, indem genetische Elemente/Faktoren hinzugefügt werden, die spezifisch die crHIV-Replikation erleichtern und sich auf sichere Weise ausbreiten. Eine Ausführungsform ist das Einführen von Ribozymen in den Helfer-Vektor, um seine genetische Rekombination mit dem Vektor zur Produktion von Wildtyp-Virus zu verhindern. Der obige cr2HIV-Vektor kann also mit einem Tat-Hilfs-Expressionsvektor ergänzt werden, um seine Ausbreitung zu erleichtern. Durch inserieren von Anti-HIV-Ribozymen in den Hilfs-Expressionsvektor ist die Gelegenheit der Rekombination minimiert, weil ein Zusammentreffen des Vektors mit Helfervektor-RNA zu ihrer gegenseitigen Spaltung und Zerstörung führen würde. Daher kann der Hilfs-Expressionsvektor auf eine Anzahl von Arten modifiziert werden, um eine spezielle prophytaktische oder therapeutische Strategie zu unterstützen. Folglich sind cr2HIV-Vektoren als Vakzine gegen HIV nützlich, da sie (1) replizieren und daher persistent die Immunantwort des Wirts stimulieren und (2) dem Wirt erlauben, verschiedene Epitope zu erkennen, da sie von HIV abgeleitet sind und sich antigenisch ändern.

SEQUENZLISTE
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Dropulic, Boro Pitha, Paula M. TITEL DER ERFINDUNG: BEDINGT REPLIZIERENDE VIRALE VEKTO-REN UND IHRE VERWENDUNG
(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 17
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Leydig, Voit & Mayer, Ltd.
(B) STRASSE: Two Prudential Plaza, Suite 4900
(C) STADT: Chicago
(D) BUNDESSTAAT: IL
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60601
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: WO96US18997
(B) ANMELDETAG: 27. NOV. 1996
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 08-563459
(B) ANMELDETAG: 28. NOV. 1995
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) VERTRETER:
(A) NAME: Kilyk Jr., John
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 30763
(C) REFERENZ (DOCKET NUMBER): 74993
(ix) KONTAKTINFORMATION:
(A) TELEFON: (312) 616–5600
(B) TELEFAX: (312) 616–5700
(C) TELEX: 25–3533
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NR. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 40 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NR. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NR. 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NR. 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere Nukleinsäure)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 13:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 14:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 16:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 39 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 17:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 152 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (andere)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17:

Claims

Bedingt replizierender, vitaler Vektor, der durch eine Fähigkeit gekennzeichnet ist, nur in einer Wirtszelle zu replizieren, die eine Replikation des Vektors gestattet, und wobei der Vektor mindestens eine Nukleinsäuresequenz umfasst, deren Anwesenheit, Transkription oder Translation bewirkt, dass der Vektor, der gegenüber der Anwesenheit, der Transkription oder der Translation der mindestens einen Nukleinsäuresequenz unempfindlich ist, selektiv in eine Virionen-Nachkommenschaft über (i) einen Wildtypstamm eines Virus, der dem Virus entspricht, von dem der Vektor stammt, und der empfindlich gegenüber der Anwesenheit, der Transkription oder der Translation der mindestens einen Nukleinsäuresequenz ist, oder (ii) einen Helfer zur Replikation eines viralen Vektors, der empfindlich gegenüber der Anwesenheit, der Transkription oder der Translation der mindestens einen Nukleinsäuresequenz ist, verkapselt wird, während (i) der Wildtypstamm eines Virus oder (ii) der Helfer zur Replikation eines viralen Vektors in der Wirtszelle zugegen ist.
Bedingt replizierender, viralen Vektor nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz umfasst, die umfasst oder codiert, in welchem Fall sie ein genetisches antivirales Mittel exprimiert, welches die Replikation, die Expression oder die Replikation und Expression (i) eines Wildtypstammes eines Virus oder (ii) eines Helfers zur Replikation eines viralen Vektors nachteilig beeinflusst, aber nicht den viralen Vektor selbst.
Bedingt replizierender, vitaler Vektor nach Anspruch 2, wobei das genetische antivirale Agens aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense-Molekül, einem Ribozym und einem Immunogen ausgewählt ist.
Bedingt replizierender, vitaler Vektor nach Anspruch 3, wobei der Vektor aus einem Human-Immunschwäche-Virus stammt.
Bedingt replizierender, vitaler Vektor nach Anspruch 3, wobei der Vektor aus einem Togaviridae stammt.
Bedingt replizierender, vitaler Vektor nach Anspruch 3, wobei die katalytische Domäne des Ribozyms die NUH-Nukleotidsequenz schneidet.
Bedingt replizierender, vitaler Vektor nach Anspruch 3, wobei das Ribozym durch eine Sequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR. 3 und der SEQ ID NR. 4 ausgewählt ist.
Bedingt replizierender, vitaler Vektor nach Anspruch 1, wobei der Wildtypstamm eines Virus eine Nukleotidsequenz umfasst, die durch die SEQ ID NR. 1 codiert ist, und der Vektor, wenn er aus DNA gebildet ist, eine Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 3, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16 ausgewählt ist, und der Vektor, wenn er aus RNA gebildet ist, eine Nukleotidsequenz umfasst, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 3, 4, 5, 6, 14, worin mindestens ein N mutiert ist, 15 und 16 ausgewählt ist.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor, wenn er aus DNA gebildet ist, die SEQ ID NR. 3 und eine Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 5 und 15 ausgewählt ist, umfasst, und der Vektor, wenn er aus RNA gebildet ist, die Nukleotidsequenz, die durch die SEQ ID NR. 3 codiert ist, und eine Nukleotidsequenz, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 5 und 15 ausgewählt ist, umfasst.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor, wenn er aus DNA gebildet ist, die SEQ ID NR. 4 und eine Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 6 und 16 ausgewählt ist, umfasst, und der Vektor, wenn er aus RNA gebildet ist, die Nukleotidsequenz, die durch die SEQ ID NR. 4 codiert ist, und eine Nukleotidsequenz, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 6 und 16 ausgewählt ist, umfasst.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 1, wobei der Vektor aus einem Human-Immunschwäche-Virus stammt und ihm das TAT-Gen und seine Spleiß-Stelle aus dem Genom eines Wildtypstammes eines Human-Immunschwäche-Virus fehlt.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 11, wobei der Vektor anstatt des TAT-Gens und seiner Spleiß-Stelle eine Tripel-anti-TAT-Ribozym-Kassette umfasst, wobei die katalytische Domäne jedes Ribozyms der Tripel-Ribozym-Kassette eine unterschiedliche Stelle in einem viralen Nukleinsäuremolekül der Human-Immunschwäche vom Wildtyp schneidet.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 12, wobei das virale Nukleinsäuremolekül der Human-Immunschwäche vom Wildtyp TAT umfasst und die katalytische Domäne jedes Ribozyms der Tripel-Ribozym-Kassette eine unterschiedliche Stelle innerhalb von TAT schneidet.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 12, wobei die katalytische Domäne jedes Ribozyms eine Nukleotidsequenz in einem Bereich eines Nukleinsäuremoleküls eines Human-Immunschwäche-Virus vom Wildtyp schneidet, für die in dem Vektor selbst keine Ribozym-empfindliche Entsprechung vorhanden ist.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 1, wobei der Vektor ferner mindestens eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz umfasst, deren Anwesenheit, Transkription oder Translation einer Wirtszelle, die mit dem Vektor infiziert ist, einen Selektionsvorteil gegenüber einer Zelle verleiht, die mit (i) einem Wildtypstamm eines Virus oder (ii) einem Helfer zur Replikation eines viralen Vektors infiziert ist.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 15, wobei die mindestens eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die eine Resistenz gegenüber eine Vielzahl von Wirkstoffen codiert.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 16, wobei die mindestens eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz eine Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die eine mutierte Protease codiert, und einer Nukleotidsequenz, die eine mutierte Reverse Transkriptase codiert, ausgewählt ist.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 17, wobei der Vektor ein bedingt replizierender, viraler Vektor der Human-Immunschwäche ist, der eine Ribozym-Kassette umfasst, die ein, zwei oder drei Ribozyme umfasst, von denen jedes unabhängig voneinander auf die Stelle +115 oder die Stelle +113 der U5 HIV RNA ausgerichtet ist.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine Nukleinsäuresequenz bewirkt, dass im Wesentlichen mehr von dem Vektor als (i) von dem Wildtypstamm eines Virus oder (ii) von dem Helfer zur Replikation eines viralen Vektors selektiv in eine Virionen-Nachkommenschaft verkapselt wird.
Bedingt replizierender, viraler Vektor nach Anspruch 19, wobei die mindestens eine Nukleinsäuresequenz bewirkt, dass der Vektor selektiv in eine Virionen-Nachkommenschaft verkapselt wird zum Ausschluss (i) des Wildtypstammes eines Virus oder (ii) des Helfers zur Replikation eines viralen Vektors.
Zusammensetzung, umfassend einen Vektor nach Anspruch 1 oder 15 und einen Träger dafür.
Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 1 oder 15.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten eines Vektors, der aus einem Wildtypstamm eines Virus stammt und der geeignet ist, nur in einer Wirtszelle repliziert zu werden, die eine Replikation des Vektors gestattet; und (b) Inkorporieren einer Nukleinsäuresequenz in den Vektor gemäß (a), die umfasst und codiert, in welchem Fall sie ferner ein antivitales Agens exprimiert, und dabei, oder zusätzlich hierzu, ein Modifizieren des Vektors gemäß (a), um dem antiviralen Agens gegenüber unempfindlich zu sein, wobei die Inkorporation der Nukleinsäuresequenz in den Vektor und die Modifikation des Vektors, um dem antiviralen Agens gegenüber unempfindlich zu sein, bewirkt, dass der Vektor selektiv in eine Virionen-Nachkommenschaft über (i) einen Wildtypstamm eines Virus, welcher dem Virus entspricht, aus dem der Vektor stammt, und welcher dem antiviralen Agens gegenüber empfindlich ist, oder (ii) einen Helfer zur Replikation eines vitalen Vektors, welcher dem antiviralen Agens gegenüber empfindlich ist, verkapselt wird, während (i) der Wildtypstamm eines Virus oder (ii) der Helfer zur Replikation eines vitalen Vektors in der Wirtszelle zugegen ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das antivitale Agens ein genetisches antiviales Agens ist, das aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense-Molekül, einem Ribozym und einem Immunogen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Vektor ein vitaler Vektor der Human-Immunschwäche ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der Schritt (b) umfasst: (i) Inkorporieren einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR. 3 und der SEQ ID NR. 4 ausgewählt ist, in den Vektor gemäß (a), wenn er aus DNA gebildet ist, oder, wenn er aus RNA gebildet ist, einer Nukleotidsequenz, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR. 3 und der SEQ ID NR. 4 ausgewählt ist; und (ii) Modifizieren des Vektors gemäß (a), wenn er aus DNA gebildet ist, um eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NR. 14, in der mindestens ein N mutiert ist, oder, wenn er aus RNA gebildet ist, eine Nukleotidsequenz, die durch eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NR. 14 codiert ist, in welcher mindestens ein N mutiert ist, zu umfassen.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Schritt (b) umfasst: (i) Inkorporieren der SEQ ID NR. 3 in den Vektor gemäß (a), wenn er aus DNA gebildet ist, oder, wenn er aus RNA gebildet ist, der Nukleotidsequenz, die durch die SEQ ID NR. 3 codiert ist, und (ii) Modifizieren des Vektors gemäß (a), wenn er aus DNA gebildet ist, um eine Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 5 und 15 ausgewählt ist, oder, wenn er aus RNA gebildet ist, eine Nukleotidsequenz, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 5 und 15 ausgewählt ist, zu umfassen.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Schritt (b) umfasst: (i) Inkorporieren der SEQ ID NR. 4 in den Vektor gemäß (a), wenn er aus DNA gebildet ist, oder, wenn er aus RNA gebildet ist, der Nukleotidsequenz, die durch die SEQ ID NR. 4 codiert ist, und (ii) Modifizieren des Vektors gemäß (a), wenn er aus DNA gebildet ist, um eine Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 6 und 16 ausgewählt ist, oder, wenn er aus RNA gebildet ist, eine Nukleotidsequenz, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NRN. 2, 6 und 16 ausgewählt ist, zu umfassen.
Verfahren zum Modifizieren eines Vektors, wobei das Verfahren umfasst: (a) Erhalten eines Vektors; und (b) Einführen einer Nukleotidsequenz in den Vektor gemäß (a), welche der SEQ ID NR. 14 entspricht, in der mindestens ein N mutiert ist, wenn der Vektor aus DNA gebildet ist, und einer Nukleotidsequenz, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, welche der SEQ ID NR. 14 entspricht, in der mindestens ein N mutiert ist, wenn der Vektor aus RNA gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Nukleotidsequenz aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 15 und 16 ausgewählt ist, wenn der Vektor aus DNA gebildet ist, und eine Nukleotidsequenz, die durch eine Nukle otidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 15 und 16 ausgewählt ist, wenn der Vektor aus RNA gebildet ist.
Verfahren zum Vermehren und selektiven Verkapseln eines bedingt replizierenden Vektors, ohne eine Zelllinie zum Verkapseln zu verwenden, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen des bedingt replizierenden Vektors nach Anspruch 1 mit einer Zelle, die geeignet ist, mit einem anderen Vektor infiziert zu werden, der von dem gleichen Typ Vektor wie der bedingt replizierende Vektor ist und der sich von dem bedingt replizierenden Vektor dadurch unterscheidet, für die Replikationsfähigkeit vom Wildtyp zu sein; (b) Inkontaktbringen der Zelle gemäß (a) mit einem anderen Vektor gemäß (a); und (c) Kultivieren der Zelle gemäß (b) unter Bedingungen, welche für die Vermehrung des bedingt replizierenden Vektors förderlich sind.
Isoliertes und gereinigtes Nukleinsäuremolekül, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 15 und 16 ausgewählt ist, und einem RNA-Molekül besteht, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die durch eine Nukleotidsequenz codiert ist, die aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NRN. 2, 5, 6, 15 und 16 ausgewählt ist.
Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1, 14 und 15 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Inhibieren der Replikation eines Widtypstammes eines Virus in einer Wirtszelle, wobei die Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung zu einem Inkontaktbringen der Wirtszelle, die geeignet ist, mit dem Wildtypstamm des Virus infiziert zu werden, mit dem Vektor führt, dessen Anwesenheit, Transkription oder Translation die Replikation des Wildtypstammes des Virus in der Wirtszelle inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung zusätzlich ein Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einem Agens, das aus der Gruppe bestehend aus einem zytotoxischen Wirkstoff, ei nem Proteaseinhibitor und einem Reverse Transkriptase-Inhibitor ausgewählt ist, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei der Virus Krebs verursacht.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Wirtszelle noch nicht mit dem Wildtypstamm eines Virus in Kontakt gekommen ist und wobei die Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung zusätzlich ein Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einem Hilfs-Expressionsvektor umfasst, wobei der Hilfs-Expressionsvektor den bedingt replizierenden, viralen Vektor in seiner Fähigkeit zu replizieren ergänzt.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei der Hilfs-Expressionsvektor den bedingt replizierenden, viralen Vektor in einer zellspezifischen Weise ergänzt.
Verfahren zum Exprimieren eines Gens von Interesse in einer Wirtszelle in vitro, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen der Wirtszelle mit einem bedingt replizierenden, viralen Vektor nach Anspruch 1 oder 15, wobei der virale Vektor ferner das Gen von Interesse umfasst und zur Exprimierung des Gens in der Wirtszelle geeignet ist, und einem Helfer; und (b) Exprimieren des Gens von Interesse in der Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Expression des Gens von Interesse in der Wirtszelle die Replikation eines Wildtyp-Virus in der Wirtszelle inhibiert.
Verfahren zum Detektieren einer Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoft/Faktor und einem Protein in vitro, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkontaktbringen des Wirkstoffes/Faktors mit einer Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 1 umfasst, in welcher der Vektor das Protein codiert und exprimiert; und (b) Detektieren einer Wechselwirkung zwischen dem Wirkstoff/Faktor und dem Protein.