KR19990071728A - 조건 복제성 바이러스 벡터 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조건 복제성 바이러스 벡터, 그 제조방법, 변형방법, 증식 및 선택적으로 패키징하는 방법 및 이러한 벡터를 이용하는 방법, 이러한 벡터와 관련된 특정 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 된 분자, 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물 및 숙주 세포와 약물을 찾아내는데 상기 숙주 세포를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법들은 바이러스 감염, 특히 HIV 감염을 예방 및 치료하는 방법을 포함하므로 바이러스 백신과 암, 특히 바이러스를 원인으로 하는 암의 치료방법과도 관련이 있으며, 유전자 치료법과 기타 다른 용도로 상기 조건 복제성 바이러스 벡터를 이용하는 방법도 본 발명에 포함된다.

Description

조건 복제성 바이러스 벡터 및 그 용도
후천성 면역 결핍증(AIDS)을 일으키는 인간 면역결핍성 바이러스(HIV)의 발견으로 인해 바이러스의 감염 사이클 및 바이러스의 발병 기전에 관한 과도한 연구가 촉진되었다. 이러한 기전에 대한 연구의 결과로, HIV 뿐 아니라 다른 바이러스에 대해서도 항바이러스 활성을 갖는, 항바이러스제의 개발을 가능하게 하는 수많은 표적들이 계속해서 증가되고 있다. 이러한 항바이러스제들, 특히 HIV에 작용하도록 되어 있는 항바이러스제는 그 작용하는 방식에 따라 몇몇 군으로 분류할 수 있다. 그 분류 군으로는 역전사효소 저해제, 세포내로 바이러스가 진입하는 단계에 대한 경합제, 백신, 및 프로테아제 저해제가 있다. 이외에도 본 발명에서 "유전적-항바이러스제 (genetic antiviral agent)"라고 불리는, 좀 더 근래의 분류 군이 있다.
각종 항바이러스제는 그 고유의 사용상의 잇점과 사용상의 한계점이 연관지어져 있는 것이 일반적이어서, 특정의 치료 상황이 얼마나 위급한가라는 관점에서 상기 항바이러스제를 사용할 것인지 여부를 평가하여야 한다. 지도부딘(3'-아지도-3'-데옥시티미딘, 또는 AZT로 알려져 있음) 및 프로테아제 저해제 등과 같은 항바이러스제들은 환자에게 투여되어 비교적 용이하게 세포내로 송달되므로, 지금까지 심도있게 연구되어 온 항바이러스제이다. 바이러스의 감염 사이클 중의 특정 인자를 표적화하려고 할 때, 상기 항바이러스제들은 HIV에 대해서는 상대적으로 효과가 없다고 밝혀졌다. 이는, HIV 균주가 급속히 변화를 일으켜 단일 부위에 작용하는 상기 항바이러스제들에 대해 내성을 갖게 된다는 데 일차적인 원인이 있다. (Richman, ADIS Res. and Hum. Retrovir., 8, 1065~1071 (1992)). 그러므로, HIV 게놈상의 유전자 변이(variation)가 일어나고 돌연변이가 급속히 일어나는 문제때문에, HIV를 치료하는 새로운 항바이러스 전략을 고려할 수밖에 없게 되었다. 이러한 맥락에서 볼 때 유전적 항바이러스제는, 서로 다른 다양한 레벨에서 세포에 작용한다는 점 때문에 충분히 관심을 끌 만하다.
유전적 항바이러스제는, 표적 세포에 분자성분으로 전달되어 바이러스 감염으로부터 세포를 보호한다는 점에서 다른 치료제와 구별된다. (Baltimore, Nature, 325, 395-396 (1988); Dropulic' 등., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). 유전적 항바이러스제는 모든 유전자 서열일 수 가 있는데, 안티센스 분자, RNA 디코이(decoy), 전이우성 변이체(transdominant mutant), 인터페론, 독소, 면역원, 및 리보자임을 포함한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 리보자임은 HIV RNA를 포함해 표적 RNAs를 서열-특이적으로 절단하는 유전적 항바이러스제이다. 리보자임을 매개로 하여 표적 RNA를 절단하는데 있어서의 특이성은, HIV 복제 등의 바이러스 복제를 저해하는, 치료활성을 가진 저해제로서 리보자임이 사용될 수 있는 가능성을 시사한다. 해머헤드형 리보자임과 헤어핀형 리보자임과 같이 서로 다른 종류의 리보자임을 안티-HIV 전략에 이용하여 왔다. (미국특허 5,144,019호, 5,180,818호, 및 5,272,262호, PCT 특허출원 WO 94/01549호와 WO 93/23569호 참조). 해머헤드형 리보자임과 헤어핀형 리보자임 모두를, GUC 서열을 포함하고 있는 RNA는 모두 표적으로 삼아 절단하게끔 기술적인 처리를 할 수 있다. (Haseloff 등., Nature, 334, 585-591 (1988); Uhlenbek, Nature, 334, 585 (1987); Hampel 등, Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990); 및 Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). 일반적으로 말해서, 해머헤드형 리보자임은 두종류의 기능 영역을 가지는데, 그중 하나인 촉매성 보존 영역은 나머지 한 종류인 두 개의 하이브리드화 영역 사이에 프랭크(flanked)되어 있다. 상기 하이브리드화 영역이 GUC 서열을 둘러싸고 있는 아미노산 서열에 결합하면, 촉매작용 영역이 RNA의 표적 3'을 GUC 서열에서 절단한다. (Uhlenbeck (1987), 상기 문헌; Haseloff 등 (1988), 상기문헌; Simons (1992), 상기문헌)
수많은 연구 결과를 보면, 리보자임이 조직 배양 세포에 있어서 HIV 증식을 적어도 부분적으로 억제하는 효과가 있다는 것이 확인된다. (Sarver 등., Science, 247, 1222-1225 (1990); Sarver 등., NIH Res., 5, 43-49 (1993a); Ojwang 등., PNAS, 89, 10802-10806 (1992); Yu 등., PNAS, 90, 6340-6344 (1993); 및 Weerasinghe 등., J.Virol., 65, 5531-5534 (1991)). 특히, Sarver 등은 ((1990) 상기문헌), HIV gag 유전자의 전사된 영역내에서 절단하도록 고안되어 있는 해머헤드형 리보자임, 즉 안티-gag 리보자임은 시험관내에서 HIV gag RNA를 특이적으로 절단할 수 있다는 점을 증명하였다. 나아가, 안티-gag 리보자임을 발현하는 세포계가, HIV-1의 공격을 받으면, HIV 복제를 50배 내지 100배로 저해하는 것을 관찰하였다. 이와 유사하게 Weerasinghe 등은 ((1991) 상기문헌), HIV-1 RNA의 U5 서열에서 절단하도록 고안되어 있는 리보자임을 코딩하는 레트로바이러스 벡터는, HIV가 계속 공격을 하는 경우, 형질도입된 세포가 내성을 갖도록 한다는 점을 보여주었다. 비록, 형질도입된 세포의 서로 다른 클론들은 HIV 공격을 받는 경우, 리보좀 발현을 촉진하는데 사용되는 프로모터 시스템에 의해 정해진대로 서로 다른 내성을 나타내나, 대부분의 리보자임-발현 세포계는 배양시 제한된 시간 후에는 HIV 발현에 내성을 갖지 못하고 희생되고 만다.
특이적으로 HIV U5 부위에 반응하는 하이브리드화 영역 을 가진 리보자임이 도입되어 있는 프로바이러스를, 조직 배양세포의 nef 유전자 (이 유전자가 조직 배양시 바이러스 복제에 필수적인 것은 아님) 내로 형질도입을하면, 야생형 프로바이러스로 형질도입된 세포 보다 형질도입 세포내에서의 바이러스 복제가 100배 더 저해되는 것을 볼 수 있다. (Dropulic' 등. (1992) 및 (1993), 상기 문헌). 유사하게, U5 헤어핀형 리보자임을 포함하는 벡터로 형질도입된 후 HIV의 공격을 받으면, U5 헤어핀형 리보자임은 T-세포내에서 HIV 복제를 저해하는 것을 알 수 있다. (오장 등. (1992), 상기문헌) 또 다른 연구에 의하면 tRNA 프로모터로 부터 발현되는 리보자임을 포함하는 벡터도 여러 종류의 HIV 균주를 저해한다. (Yu 등. (1993), 상기문헌)
HIV로 감염된 세포내의 표적 부위(예, CD4+ T-세포와 단구형 마크로파지)로 리보자임 또는 다른 유전적 항바이러스제를 운반해야 하는 점이, 유전적 치료 요법을 사용해 에이즈를 효과적으로 치료하고자 하는데 있어 장애 요소가 된다. 현재의 조혈세포계 (HIV 감염의 일차적인 표적부위임)를 표적화하려는 시도에 있어서는, 분화를 거쳐 성숙 T-세포가 되는 T-세포의 전구체인 멀티포턴트 간세포로, 치료활성을 가진 유전자를 도입시키거나, 아니면 성숙 한 CD4+ T 임파구 자체내로 치료활성을 가진 유전자를 도입시키는 것이 필요하다. 그러나 상기 간세포를 표적화하는 것은, 간세포가 시험관내에서는 배양되기 어렵고 또 형질도입되기 어렵다는 점에서 문제가 있다. 순환성 T 임파구를 표적화하는 것 역시 상기 T-세포가 너무 넓게 분포하고 있기 때문에, 현재의 벡터 운반시스템을 사용하여 모든 표적 세포에 벡터를 운반하는 것이 어렵다는 문제가 있다. 게다가, 마크로파지는 바이러스가 다른 기관으로 전파해 나가기 위한 주요 저장고이므로 세포성 표적부위로 간주될 필요가 있으나, 마크로파지는 말단으로 분화하기 때문에 세포분열을 거치기 않아서, 통상의 벡터를 이용하여 용이하게 형질도입을 할 수 는 없다는 문제가 있다. 따라서, 현재는 HIV 치료를 위해, 복제-결함 바이러스 벡터와 패키징("헬퍼") 세포계를 이용하여, 바이러스 복제를 특이적으로 방해하거나, 또는 감염 세포를 사멸시키는(Buchschacher에 의해 검토됨, (1993), 상기 문헌) 외래 유전자를 바이러스 감염에 민감한 세포 (예: HIV 세포)내로 도입하는 방식의 시도가 두드러지고 있다. (예, Buchschacher, JAMA, 269(22), 2880-2886 (1993); Anderson, Science, 256, 808-813 (1992); Miller, Nature, 357, 455-460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926-931 (1993); Friedmann, Science, 244, 1275-1281 (1989); 및 Cournoyer 등., Ann. Rev. Immunol., 11, 297-329 (1993)) 이러한 복제-결함 바이러스 벡터는 관심사가 되는 외래 유전자 외에도, 바이러스 복제에는 필수적이지만 바이러스의 필수 단백질은 코딩하지 않는 시스-작용의 서열을 포함한다. 그 결과 이러한 벡터는 바이러스 복제 사이클을 완성할 수가 없어, 게놈중에 바이러스 유전자를 함유하고 있고 구성요소로서 함유 유전자를 발현하는 헬퍼 세포계를 이용하여 증식을 한다. 헬퍼 세포계로 복제-결함 바이러스 벡터를 도입한 다음, 이어서 바이러스 입자가 형성되는데 필요한 단백질이 상기 벡터에 트랜스 형태로 제공되면, 벡터 바이러스 입자가 생산된다. 생산된 벡터 바이러스 입자는 표적 세포를 감염시키고 그 안에서 유전자 발현을 하여 발현된 유전자가 바이러스 복제를 방해하하거나 또는 감염 세포를 치사시킨다.
복제-결함 레트로바이러스 벡터로는, HIV 유전자 요법의 임상 실험에 사용되는 레트로바이러스 벡터가 있고 이외에도 아데노바이러스와 아데노-관련 바이러스가 있으며, 특히 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 (Molony murine liukemia virus, MuLV)라고 알려진 마우스 암포트로픽 레트로바이러스 벡터 등이 있다. 상기 복제-결함 바이러스 벡터는, 안티-HIV 리보자임과 같은 유전적 항바이러스제를 CD4+ 세포에 형질도입하는데 사용되어 왔으며 그 결과 다양한 성공을 거두었다. (Sarver 등 (1990), 상기 문헌; Weerasinghe 등 (1991), 상기 문헌; Dropulic' 등, (1993), 상기 문헌; Ojwang 등, (1992), 상기 문헌; 및 Yu 등, (1993), 상기 문헌). 그러나, 상기 벡터는 HIV 유전자 요법에 응용하는데 있어서는 본질적인 한계가 있다. 예를 들어, HIV 치료에 있어서는 형질도입되는 빈도가 높아야 한다는 점이 특히 중요한데, 벡터는 그 존재가 드문 CD4+ 선조 조혈 간세포에 형질도입되거나 또는 넓게 분포되어 있는 CD4+ T-표적 세포에 도입되어야만 한다. 그러나, 상기 세포들의 대부분은 임상단계에서의 질병의 "잠복기" 동안 이미 HIV에 감염되어 있다. 그러나, MuLV 백터를 역가가 높게 얻는 것이 어렵기 때문에, 형질도입 정도가 양호하지 못하다. 더 나아가 CD34+ 선조간세포에서는, 특히 성숙한 T-임파구로 분화한 후에, 형질도입된 DNA가 장기간 발현되지 않는다. 게다가 복제-결함 바이러스 벡터를 이용하려면 생체외에서의 유전자 전이 전략이 필요한데 (미국 특허 5,399,346호 참조), 그 비용이 고가인데다 일반 개체군에 드는 비용의 이상일 수 있다.
현재 이용가능한 벡터를 사용하여 AIDS를 유전공학적 방법으로 치료하려고 할 때 상기 벡터와 연관되어 있는 이러한 단점 때문에, 연구자들은 다른 새로운 벡터를 찾게 되었는데, 그 새로운 벡터중의 하나가 HIV 자체이다. HIV 벡터는 감염성 연구에 사용되어 왔고 (Page 등., J. Viol., 64, 5270-5276 (1990)) 유전자 (예: 자살 유전자 등)를 CD4+ 세포, 특히 CD4+ HIV-감염 세포내로 도입하는 연구에 사용되어 왔다. (Buchschacher 등, Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992); Richardson 등., J. Virol., 67. 3998-4005 (1993); Carroll 등., J. Virol, 68, 6047-6051 (1994); 및 Parolin 등., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). 이러한 연구 전략은, HIV 벡터를 사용하여 CD4+ T-세포 및 단구세포내로 유전자를 도입한다는 전략이다.
그러나, 오늘날까지 상기와 같은 벡터는 극히 복잡하다. 더욱이 상기와 같은 벡터를 사용하는데 있어서는, 세포내적인 재조합을 거쳐 야생형 HIV가 생산될 수 있다는 위험성이 수반된다. 결함-벡터의 서열과 헬퍼 바이러스를 공동형질감염/공동감염시키면 바이러스 게놈의 상동 영역들간에 재조합이 일어난다는 것을 관찰하였다. (Inoue 등., PNAS, 88, 2278-2282 (1991)). 시험관내에서 관찰되는 상보작용으로 미루어 볼때, 이와 유사하게 생체내에서도 복제-결함 HIV 벡터가 재조합되어, 이미 존재하는 HIV 감염을 악화시킨다는 것을 알 수 있다. 레트로바이러스가 하나의 비리온(virion)안에 두 개의 RNA 게놈을 패키징한다는 사실로부터, 레트로바이러스가 상보성 및/또는 재조합으로 인한 모든 유전적 결합을 회피하기 위해 두 개의 바이러스 RNA를 가지고 있다는 것이 제안되었다. (Inoue 등, (1991), 상기 문헌)
세포내에서 재조합되어 그 결과 야생형 HIV로 될 수 있다는 위험성 외에도, HIV 벡터가 생체내에서 돌연변이를 일으킬 수 있다는 위험성도 있는데, 그렇게되면 바이러스 벡터의 병원성이 증가된다. 이러한 사실은 Sarber 등으로 하여금, 복제능력은 있으나 비병원성인 차세대 재조합 HIV 벡터를 개발하는것에 대해 깊이 고심하게 만들었다. (AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b). 상기 차세대 재조합 HIV 벡터는, 주로 사용되고 있는 비복제성 벡터 (복제-결함 벡터)와 비교하여 볼 때 환자의 체내에서 지속적으로 복제되며 그 결과 야생형 HIV와 계속 경쟁하도록 한다. 그러나 지금까지 상기와 같은 벡터는 이용가능하지 않다.
이상적으로 말해 감염된 개체를 치료하는 가장 기회가 좋은 시기는 바이러스가 아직 숙주를 감염시키기 전인 접종때이다. 그러나, 많은 개체들이 임상 잠복기때까지도 스스로가 HIV에 감염되었다는 사실을 알아차리지 못하기 때문에, 상기 이상적인 시기에 치료를 한다는 것은 달성하기 어렵다. 이러한 사실에 기초할 때 항바이러스제를 사용하는 것이 몹시 요구되는 단계는 임상 잠복기때이다. 이 단계에서 HIV 감염을 치료하려면, 바이러스 게놈을 함유하는, 미리 감염된 수많은 CD4+ 임파구의 공격에 맞서야될 필요가 있다. 이는 절대 사소한 공격이 아니다. 지금까지 HIV가 불치성 바이러스로 남아있고 현재 이용할 수 있는 치료법으로도 겨우 불완전하게 밖에 치료될 수 없다 사실이 이를 뒷받침 해준다. 효과적인 백신이 준비되어 있는 것도 아니다. 비록 조직 배양에 있어서 역전사효소 저해제와 프로테아제 저해제가 HIV의 복제를 막고 있다는 것을 보여주지만, 체내 바이러스의 내성으로 인해 치료가 실패되었다. 따라서, 2000년까지 약 4천만에 이를것으로 추정되는 거대다수의 HIV-감염자들에게 HIV 유전자 요법은, 별로 실익이 없다.
이와같은 관점에서 볼 때, 예를 들어 AIDS 와 암과 관련된 어떤 병원균 특히 바이러스에 대해, 장기적이면서도 지속적인 면역 반응을 개발하는 것 역시, 그 중요성을 더해가고 있다. 복제 능력은 있으나 비병원성인 바이러스를 이용하는 생-약독화 백신(Live-attenuated vaccines, LA vaccines)이 고려되어 왔다. (Daniel 등., Science, 258, 1938-1941 (1992); 및 Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)). 그러나 상기 비병원성 바이러스는, 하나 이상의 유전자가 결손되어 있다는 점에서 대응되는 야생형 바이러스와 구별 되는데, (1) 항원이 계속적으로 존속하지 못하기 때문에 (LA-바이러스가 효율적으로 복제되지 않기 때문임) 방어를 위한 면역 반응을 불러일으킬 수 없거나, (2) 어린 동물 모델에 병을 유발시키는 LA-바이러스의 능력 (Baba 등., Science, 267 1823-1825 (1995))에서 증명된 것처럼, LA-바이러스의 복제는 되는데 다른 잠재적인 병원성을 가진다.
앞서 언급한 이유 때문에, 바이러스 감염, 특히 AIDS 및 암과 관련해서 다른 예방책 및 치료책이 필요하다. 본 발명에서는 조건에따라 복제되는 벡터를 제공함으로써 상기의 대체 방법을 제공한다. 본 발명의 부가적인 특성외에도 본 발명의 이러저러한 목적 및 잇점은, 여기에서 개시되는 본 발명의 상세한 설명으로부터 명확히 알 수 있다.
본 발명은 1995.9.28일자 미국 특허 출원되고 이후 가출원으로 변경된 미국 특허출원 08/563,459호에 대한 우선권 주장 출원으로서, 상기 미국특허 출원은 그 내용 그대로 본 출원에 인용되고 있다.
본 발명은 조건에 따라 복제되는 바이러스 벡터, 그 제조 방법, 변형 방법, 증식 및 선택적으로 패키징하는 방법, 상기 벡터와 관련된 특정 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로 된 분자, 상기 벡터를 포함하는 약학적 조성물 및 숙주 세포, 및 상기 벡터와 숙주세포를 이용하는 방법에 관한 것이다.
도 1a 내지 1e는 야생형 HIV (도 1a), crHIV-1.1 (도 1b), crHIV-1.11 (도 1c), crHIV-1.12 (도 1d) 및 crHIV-1.111 (도 1e)에 존재하는 바이러스 게놈의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 1에서, cr은 조건 복제성; U5는 U5 코딩 서열; Rz은 리보자임; Ψ는 패키징 신호; gag, pol 및 env는 바이러스 코어, 역전사효소 및 엔벨로프를 각각 형성하는 단백질에 대한 코딩 서열을 나타내며; tat, rev, rre 및 nef는 추가적인 바이러스 유전자들을 나타내며; 오픈-박스들은 바이러스의 길다란 말단 반복부를 나타낸다. 야생형 U5 코딩 영역의 "X" 표시들은 본 발명에 따른 리보자임이 변형된 crHIV U5 영역 (즉, "mU5")이 아니라 야생형 U5 RNA내에서 절단을 일으키는 영역들을 나타낸다.
도 2는 야생형 HIV U5 RNA (서열번호:1) (A)와 변형된 crHIV U5 RNA (서열번호:2) (B)의 DNA 서열을 나타낸다. 도 2에서, 숫자들은 전사 개시부위로부터 하방으로의 염기의 수를 나타낸다.
도 3은 시험관내 리보자임 절단 실험에 대한 감수성을 보여주는 오토라디오그래프 (autoradiograph)를 나타내는데, 야생형 U5 RNA에서는 절단이 일어나는데 반해 (레인 1-7), crHIV U5 RNA에서는 절단이 일어나지 않는다 (레인 8-14): 야생형 HIV U5 RNA 전사체 (레인 1); +115 부위 (즉, 전사 개시부위로부터 하방으로 염기쌍의 수에 상응하는 부위)를 표적으로 하는 싱글 리보자임을 함유하는 리보자임 RNA (레인 2와 9); +115 부위를 표적으로 하는 싱글 리보자임과 함께 배양된 야생형 HIV U5 RNA가 절단 생성물인 P1과 P2를 만들어 냄 (레인 3); +115 부위를 표적으로 하는 더블 리보자임을 함유하는 리보자임 RNA (레인 4와 11); +115 부위를 표적으로 하는 더블 리보자임과 함께 배양된 야생형 HIV RNA (레인 5); +115 부위와 +133 부위를 표적으로 하는 더블 리보자임을 함유하는 리보자임 RNA (레인 6과 13); +115 부위와 +133 부위를 표적으로 하는 더블 리보자임과 함께 배양된 야생형 HIV RNA (레인 7); crHIV U5 RNA 전사체 (레인 8); 및 +115 부위를 표적으로 하는 싱글 리보자임 또는 더블 리보자임과 함께 배양된 crHIV U5 RNA (레인 10, 12 및 14)의 경우에는 절단이 일어나지 않았다. 별표는 리보자임 절단 생성물이 존재한다면 분리될 영역을 나타낸다.
도 4는 시간 (공동형질감염 후 경과된 일수)에 대한 역전사효소의 활성 (cpm/㎕)을 나타내는 그래프로서 주르켓 (Jurkat) 세포에서 야생형 HIV 복제가 crHIV에 의해 저해되는 것을 보여주고 있는데, ?-? 모양의 그래프는 야생형 HIV와 crHIV-1.1이 공동형질감염된 주르켓 세포의 경우이고,모양의 그래프는 야생형 HIV와 crHIV-1.11이 공동형질감염된 경우,모양의 그래프는 야생형 HIV와 crHIV-1.12가 공동형질감염된 경우,모양의 그래프는 야생형 HIV와 대조군 플라스미드 pGEM-3Z이 공동형질감염된 주르켓 세포에 대해 각각 얻어진 것이다.
도 5는 시간 (공동형질감염 후 경과된 일수)에 대한 역전사효소의 활성 (cpm/㎕)을 나타내는 그래프로서 주르켓 세포에서 야생형 HIV 복제가 crHIV에 의해 저해되는 것을 보여주고 있는데, ?-? 모양의 그래프는 야생형 HIV와 crHIV-1.1이 공동형질감염된 주르켓 세포의 경우이고,모양의 그래프는 야생형 HIV와 crHIV-1.11이 공동형질감염된 경우,모양의 그래프는 야생형 HIV와 crHIV-1.111이 공동형질감염된 경우,모양의 그래프는 야생형 HIV와 대조군 플라스미드 pGEM-3Z이 공동형질감염된 주르켓 세포에 대해 각각 얻어진 것이다.
도 6a 내지 6c는 야생형 HIV (도 6a), crHIV-1.1 (도 6b), 및 crHIV-1.111 (도 6c)로부터 U5 RNA 전사체를 검출하는데 이용되는 프로브와 프라이머를 개략적으로 나타낸 것이다. U5는 U5 코딩 서열; Ψ는 패키징 신호; gag, pol 및 env는 바이러스 코어, 역전사효소 및 엔벨로프를 각각 형성하는 단백질에 대한 코딩 서열을 나타내며; 오픈-박스들은 바이러스의 길다란 말단 반복부를 나타낸다. 검은 박스 모양은 tat 와 rev 코딩서열을 나타내며; PE, V1, V2, V3, R1 및 R2는 야생형 및/또는 조건 복제성 바이러스에 이용되는 프라이머들을 나타낸다. 야생형 U5 코딩 영역의 "X" 표시들은 본 발명에 따른 리보자임이 변형된 crHIV U5 영역 (즉, "mU5")이 아니라 야생형 U5 RNA내에서 절단을 일으키는 영역들을 나타낸다.
도 7은 야생형 HIV와 crHIV-1.111로 공동형질감염되었거나 (레인 4) 또는 야생형 HIV만으로 형질감염된 (레인 2) 주르켓 세포를 20일동안 배양한 후 생산되는 비리온으로부터 얻은 리보자임 RNA의 R1 및 R2 프라이머를 이용하여 RT-PCR 증폭을 실시하여 얻은 결과를 나타내는 오토라디오그래프이다. 레인 1과 3은 RT-PCR 음성 대조군 (negative control)을 포함하는데, 여기서 RNA는 역전사효소의 부재하에서 모의 역전사되었다.
도 8은 야생형 HIV와 crHIV-1.111로 공동형질감염되었거나 (레인 4와 8) 또는 야생형 HIV만으로 형질감염된 (레인 2와 6) 주르켓 세포를 20일동안 배양한 후 얻은 바이러스 RNA의 V1, V2 및 V3 프라이머를 이용하여, 비리온 (레인 1-4) 및 세포내 (레인 5-8) RT-PCR 증폭을 실시하여 얻은 결과를 나타내는 오토라디오그래프이다. 레인 1, 3, 5 및 7은 RT-PCR 음성 대조군을 포함한다.
도 9는 야생형 HIV와 crHIV-1.111로 공동형질감염되었거나 (레인 4) 또는 야생형 HIV만으로 형질감염된 (레인 3) 주르켓 세포를 20일동안 배양한 후 얻은 세포내 HIV RNA를 노던 블롯팅 방법으로 분석한 결과를 나타내는 오토라디오그래프이다. RNA 제조방법의 특성과 로딩양이 야생형 HIV RNA (레인 3)와 crHIV-1.111 RNA (레인 4)에 대해 나타나 있다.
도 10a 내지 10c는 야생형 HIV 헬퍼의 존재하에서 crHIV의 복제를 나타내는 오토라디오그래프이다. 도 10a는 crHIV-1.111 (레인 4) 또는 pGEM 3Z (레인 2)로 형질감염되어 자극된 ACH2 세포에서 crHIV-1.111 RNA를 함유하는 비리온이 생산되는 것을 나타내며, 레인 1과 3은 RT-PCR 음성 대조군을 포함한다. 도 10b는 미리 crHIV-1.11로 형질감염된 (레인 2) 또는 감염되지 않은 (레인 1) 자극된 ACH2 세포의 상등액으로 주르켓 세포를 감염시킨 후 crHIV-1.11 리보자임 DNA이 생산되는 것을 나타낸다. 도 10c는 crHIV-1.11로 먼저 형질감염된 다음 pNL4-3 바이러스로 재감염된 (레인 2) 주르켓 세포에서 crHIV-1.11 RNA를 함유하는 비리온이 생산되는 것을 나타낸다. 또한, 먼저 pGEM 3Z 대조군 플라스미드로 형질감염된 다음 다시 pNL4-3 바이러스로 재감염된 (레인 2) 세포에서 비리온이 생산되는 것도 나타나 있다. 레인 1과 3은 RT-PCR 음성 대조군을 포함한다.
도 11은 야생형 HIV RNA와 crHIV-1.11로 공동형질감염되었거나 (레인 4와 8) 또는 야생형 HIV만으로 형질감염된 (레인 2와 6) 배양물로부터 얻은 비리온의, 초기 (레인 1-4) 및 후기 (레인 5-8) 바이러스 성장단계에 있어서의 비리온-연관형 RNA (virion-associated RNA)의 바이러스-특이적 프라이머들 (V1, V2 및 V3)을 이용하여 RT-PCR을 실시하여 얻은 결과를 나타내는 오토라디오그래프이다. 레인 1, 3, 5와 7은 RT-PCR 음성 대조군을 포함한다.
도 12는 야생형 HIV만으로 형질감염되었거나 (레인 1) 또는 야생형 HIV와 crHIV-1.11로 공동형질감염된 (레인 2) 세포에 있어서 바이러스 성장의 후기 단계에 있는 crHIV-1.11 배양물로부터 얻은 비리온-연관형 RNA의 PE 프라이머를 이용하여 프라이머 연장실험을 실시한 결과를 나타내는 오토라디오그래프이다.
발명의 개요
본 발명은 조건에 따라 복제되는 바이러스 벡터를 제공하는데, 이 벡터는 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포에서만 복제될 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구체적인 실시예에 있어서, 조건에 따라 복제되는 벡터는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 서열의 존재, 전사 또는 번역은 복제 허용 숙주 세포내에 존재하는 벡터에게, 그 벡터가 유도되어 나온 바이러스에 대응하는 야생형 바이러스와 비교하여, 선택상의 잇점을 부여한다.
본 발명의 조건 복제성 바이러스 벡터의 또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 바람직하게는 레트로바이러스인 벡터가 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 서열의 존재, 전사 또는 번역은, 그 벡터로 감염된 숙주 세포에게, 그 벡터가 유도되어 나온 바이러스에 대응하는 야생형 바이러스로 감염된 세포와 비교하여, 선택상의 잇점을 부여한다
본 발명에 의하면 또한 조건 복제성 바이러스 벡터와 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 또한 조건 복제성 바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 벡터가 DNA로 되어 있는 것이라면, 상기 벡터는 뉴클레오티드 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 벡터가 RNA로 되어 있는 것이라면, 상기 벡터는 뉴클레오티드 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터가 본 명세서에 기재된 방법에 따라 분리 및 정제된 핵산 분자로서 제공된다. 마찬가지로, 리보자임을 이용하여 벡터를 만드는 방법, 벡터를 변형시키는 방법 및 패키징 세포계를 이용하지 않고서도 조건 복제성 벡터를 증식시키고 선택적으로 패키징하는 방법도 제공된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 바이러스 감염에 대해 숙주 세포를 치료하고 예방하는 방법이 제공된다. 이러한 방법들에 있어서는, 추가적으로 헬퍼-발현 벡터, 세포독성 약물, 단백질/인자 (factor) 또는 프로테아제/역전사 효소 저해제가 적절히 이용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 바이러스의 복제를 저해, 암의 치료 또는 생체내에서의 유전자 전달에 이용될 수 있거나 또는 숙주 세포에서 관심사가 되는 유전자를 발현시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체적 실시예에 따르면, 조건에 따라 복제되는 벡터를 포함하고 있는 숙주 세포를 이용하여 약물/인자와 단백질 사이의 상호작용을 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 주어진 단백질에 대해 활성을 지닌 약물/인자의 선택 및 단백질의 특성화를 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 대한 상세한 설명
본 발명에서는 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 야생형 바이러스로 감염시키는 것이 가능하고 바람직하게는 야생형 바이러스로 실제 감염되는 숙주를, 벡터의 복제를 허용하는 숙주내에서만 증식하는 벡터 (비병원성, 조건 복제성 (cr)벡터)에 접촉시키는 단계를 포함한다.
여기서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 방법의 더 상세한 목적은, 상기한 바와 같은 비병원성이면서 조건에 따라 복제되는 벡터가 숙주내에서 경쟁력있게 감염되도록 하는 데에 있다. 본 발명의 조건 복제성 바이러스는, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는데, 이러한 서열은 야생형 바이러스와 비교하여 조건부 복제 벡터에 더 많이 퍼져있고, 복제에 선택상의 잇점을 제공하며, 및/또는 바이러스 입자가 야생형 바이러스 벡터를 포함하고 있는 숙주 세포와 비교하여 조건부 복제 벡터를 포함하고 있는 숙주 세포로 더 선택적으로 유리하게 증식해 나가도록 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 벡터는 HIV 서열을 포함하며 HIV 감염을 치료하는데 사용된다. 따라서, 상기 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는데, 상기 핵산 서열은 첫째, crHIV 게놈이 자손 비리온 (progeny virion) (즉, crHIV 게놈과 자손 비리온 양자가 모두 거주하는 세포)으로 패키징되는데 있어 야생형 HIV 게놈에 비해 선택상의 잇점을 부여하고, 둘째, 조건부 복제 벡터 (또는 바이러스)가 crHIV 비리온을 생산하는데 있어서 야생형 바이러스를 생산하는 숙주 세포에 비해 선택상의 잇점을 부여한다. 하나의 방법은 (본 발명이 이 방법에만 한정되는 것은 아님), crHIV 게놈에 야생형 HIV 게놈을 절단할 수 있는 하나 이상의 리보자임을 제공하여 crHIV가 패키징됨에 있어 선택상의 잇점을 갖게하는 것이다.
야생형 바이러스 (Wild-Type Virus)
본 발명에 따른, "바이러스(Virus)"는, 단백질 과 핵산으로 이루어진 감염성 물질로서, 바이러스 핵산에 의해 특정되는 바이러스 생산물을 생산하는데 있어 숙주의 유전 기구를 이용한다. "핵산 (Nucleic acid)"이란, 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA 중합체로서, 선형 또는 환형이고, 임의적으로 합성 뉴클레오티드, 비천연 뉴클레오티드, 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하기도 하는데, 임의적으로 포함된 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 중합체 중에 혼합되어 들어갈 수 있다. 바람직하게는 DNA 폴리뉴클레오티드는 게놈성 서열 또는 cDNA 서열을 포함한다.
"야생형 바이러스(Wild-Type strain of a virus)"란, 여기서 언급하는 바와 같이, 인위적인 돌연변이체를 전혀 포함하지 않은 균주, 즉 자연으로부터 분리될 수 있는 바이러스를 말한다. 또 다르게는, 야생형 균주란 실험실에서 배양될 수 있는 균주지만 여전히 다른 어떠한 바이러스도 존재하지 않는 상태에서 배양되는 균주로서, 자연에서 분리한 바이러스와 같이 자손 게놈 또는 자손 비리온을 포함하는 균주를 말한다. 예를 들면, 후술하는 실시예에서 언급하게 될 pNL4-3 HIV 분자성 클론이 야생형 균주이다.
일반적으로 말해, 본 발명에서 제공되는 방법은 바이러스의 감염이 원인이 되는 바이러스 질환을 치료하는데 적용되는 것이 바람직하다. 상기 바이러스로는 (이하 논의되는 바와 같이 벡터를 포함하여) RNA 바이러스 뿐 아니라 DNA 바이러스인 것이 바람직하다. RNA 바이러스로는 원핵생물 (예, 박테리오파아지) 뿐 아니라 포유동물, 특히 인간을 포함하는 다수의 진핵 생물을 감염시키는 다양한 바이러스군이 포함된다. 물론 최소 하나의 과(科)는 이중 가닥 RNA를 유전 물질로 가지지만, 대부분의 RNA 바이러스는 유전물질로서 단일 가닥 RNA를 가지고 있다. RNA 바이러스는 세 개의 주요 군으로 분류되는데; 첫째는, 양성-가닥 바이러스 (즉, 바이러스에 의해 전이된 게놈이 단백질로 번역되고, 탈단백질된 핵산은 감염되기에 충분한 바이러스)이고, 둘째는 음성-가닥 바이러스 (즉, 바이러스에 의해 전이된 게놈이 메시지 센스를 보완하고 번역되기 전 단계에서 비리온-관련 효소에 의해 전사되는 바이러스)이며, 셋째는 이중-가닥 바이러스이다. 본 발명의 방법은 양성-가닥 바이러스, 음성-가닥 바이러스, 및 이중-가닥 RNA 바이러스를 치료하는데 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, RNA 바이러스로는, 신드비스(Sindbis)-유사 바이러스류 (예: 토가바이러스과(Togaviridae), 브로모바이러스(Bromvirus), 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus), 토바바이러스(Tobavirus), 일라바이러스(Ilarvirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 및 포텍스바이러스(Potexvirus)), 피코르나바이러스(Picornavirus)-유사 바이러스류 (예: 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 코모바이러스(Comovirus), 네포바이러스(Nepovirus), 및 포티바이러스(Potyvirus)), 마이너스-균주 바이러스류(예: 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 라브도바이러스과(Rhabdoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 부니아바이러스과(Bunyaviridae), 및 아레나바이러스과(Arenaviridae)), 이중-가닥 바이러스류(예: 레오바이러스과(Reoviridae) 및 비르나바이러스과(Birnaviridae)), 플라비바이러스-유사 바이러스류(예: 플라비바이러스과(Flaviviridae), 페스티바이러스(Pestivirus)), 레트로바이러스-유사 바이러스류(예: 레트로바이러스과(Retroviridae)), 코로나바이러스과(Coronaviridae)가 포함되고 여기에 노다바이러스과(Nodaviridae)를 포함하는 다른 군이 포함된다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 RNA 바이러스 과(科)로는, 플라비바이러스과(Flaviviridae)가 바람직하고, 바이러스 속(屬)으로는 플라비바이러스(Flavivirus), 특히 마르브르그(Marburg) 또는 에볼라(Ebola) 바이러스가 바람직하다. 플라비바이러스과에 속하는 바이러스로는, 황색열 바이러스 (yellow fever virus), 뎅그열 바이러스 (dengue virus), 서-나일 바이어스 (West Nile virus), 성루이스 뇌염 바이러스 (St. Louis encephalitis virus), 일본 뇌염 바이러스 (Japanese encephalitis virus), 뮤레이 계곡 뇌염 바이러스 (Murray Valley encephalitis), 로시오 바이러스 (Rocio virus), 진드기-맥개 뇌염 바이러스 (tick-borne encephalitis) 등과 같은 플라비바이러스(Flavivirus) 속(屬) 바이러스가 바람직하다.
또한, 피코르나바이러스과의 바이러스가 바람직한데, 특히 A형 간염 바이러스 (Hepatitis A virus, HAV), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus), 또는 비-A형 또는 비-B형 간염 바이러스가 바람직하다.
또 다른 RNA 바이러스로는, 레트로바이러스과 (즉, 레트로바
이러스)의 바이러스가 바람직한데, 특히 종(種) 또는 아과(亞科)인 종양 바이러스(Oncovirinae), 스푸마바이러스아과(Spumavirinae), 스푸마바이러스(Spumavirus), 렌티바이러스아과(Lentivirinae), 및 렌티바이러스(Lentivirus)가 바람직하다. 종양바이러스아과(Oncovirinae)의 RNA 바이러스로는, 인간 T-임포트로픽 바이러스 1형 또는 2형 (HTLV-1 또는 HTLV-2) 또는 우형백혈병 바이러스(bovine leukemia virus, BLV); 조류의 백혈병-육종 바이러스(avian leukosis-sarcoma virus) (예: 로이스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 조류 골수아구증 바이러스(avian myeloblastosis virus, AMV), 조류 적혈구아구증 바이러스(avian erythroblastosis virus, AEV), 및 로이스-관련 바이러스(RAV; RAV-0 에서부터 RAV-50); 포유동물의 C형 바이러스(예, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MuLV), 하비 마우스 육종 바이러스(Harvey murine sarcoma virus, HaMSV), 아벨슨 마우스 백혈병 바이러스(Abelson murine leukemia virus, A-MuLV), AKR-MuLV, 고양이 백혈병 바이러스(feline leukemia virus, FeLV), 유인원 육종 바이러스(simian sarcoma virus), 세망내피증 바이러스(reticuloendotheliosis virus, REV), 비장 괴사 바이러스(spleen necrosis virus, SNV)), B형 바이러스 (예, 마우스 유방암 바이러스(MMTV), 및 D형 바이러스(예, 메이손-화이저 원숭이 바이러스(Mason-pfizer monkey virus, MMTV) 및 "SAIDS" 바이러스)가 바람직하다. 렌티바이러스아과의 RNA 바이러스로는, 인간 면역 결핍성 바이러스 1형 또는 2형 (즉, HIV-1 또는 HIV-2로, HIV-1은 예전에는 임파선증 관련 바이러스 3(HTLV-Ⅲ) 및 후천성 면역 결핍증(AIDS)-관련 바이러스(ARV)라고 불렀다.), 또는 AIDS 또는 AIDS-유사 질환으로 판명되어 왔고 이와 관련이 있는, HIV-1 또는 HIV-2와 관련된 기타의 바이러스가 바람직하다. "HIV" 두문자 또는 "AIDS-바이러스" 또는 "인간 면역 결핍성 바이러스 "라는 용어는 여기에서는 상기 HIV 바이러스, HIV-관련 바이러스 또는 HIV-연관 바이러스를 말한다. 이에 덧붙여, 렌티바이러스아과의 RNA 바이러스로는, 비스나(Visna)/마에디(maedi) 바이러스 (예컨대 양등을 감염시킴), 고양이 면역 결핍성 바이러스(SIV), 말 감염성 빈혈증 바이러스(EIAV), 및 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV)가 바람직하다.
상기 다수의 바이러스들은, 모든 작업에 최대 오염 설비가 요구되는 "체내안전성 레벨 4(Biosafety level 4" (즉, 세계 건강 기구(WHO)의 "위험 군 4")에 속하는 병원균으로 분류된다. 그러나, 통상의 기술자들은 상기 바이러스에 익숙하므로 상기 바이러스에 필요한 안전성 경고만을 고집할 수 있다.
"숙주 세포(host cell)"로는, 어떠한 세포도 포함될 수 있는데, 바람직하게는 진핵세포이다. 숙주 세포는 바람직하게는 임파구 (T-임파구 등), 마크로파지(단구형 마크로파지 등), 또는 임파구 또는 마크로파지 전구체 (조혈간세포 등)이다. 상기 세포들은 세포 표면에 CD4+ 당단백질을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 바람직하게는 AIDS 바이러스로 감염되는 CD4+ T-임파구는 아직 활성화되지 않는것이다. (즉, 아직 nef 유전자가 발현되지 않는 것이 바람직하고, 나아가서는, 이후 더 상세히 논의되는 바와같이, CD4 유전자의 발현이 감소되지 않는 것이 더욱 바람직하다). 또한, 숙주 세포는, CD4 마커가 없어 여전히 본 발명에 따른 바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포인 것이 바람직하다. 이러한 세포로는 성상세포, 피부 섬유아세포, 장상피세포, 및 이와 유사한 세포 등이 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주 세포는 진핵세포, 또는 다세포종(예, 단세포 효모 세포와 대조되는 개념으로서의 다세포)인 것이 바람직하고, 예컨대 인간과 같이 포유동물 세포인 것이 더욱 바람직하다. 세포는 단일체로 존재할 수도 있고 거대한 세포집합체의 일부로 존재할 수도 있다. 이러한 "거대 세포집합체" 는 예컨대, 세포 배양(혼합 배양 또는 순수배양), 조직(예: 표피 또는 기타 다른 조직), 기관(예:심장, 폐, 간, 담낭, 방광, 눈 등), 기관계(예: 순환계, 호흡계, 위장관계, 비뇨계, 신경계, 표피계 등), 또는 유기체(예: 조류, 포유동물,또는 이와 유사한 유기체)등 일수 있다. 상기 표적 기관/조직/세포는 순환계, (예:심장, 혈과, 및 혈액을 포함하나 반드시 이에 한정되지는 않음), 호흡계 (예: 코, 인두, 후두, 흉관, 기관지, 세기관지, 폐 등을 포함), 위장관계 (예: 입, 인두, 식도, 위, 장, 타액선, 췌장, 간, 담낭 등을 포함), 비뇨계 (예: 신장, 수뇨관, 방광 등을 포함), 신경계 (예: 뇌, 척수, 눈과 같은 특별한 감각기 등을 포함하나 반드시 이에 한정되는 것은 아님), 및 표피계 (예: 피부 등)인 것이 바람직하다. 더 나아가 상기 표적 세포로는, 심장, 혈관, 폐, 간, 방광, 담낭, 및 안세포로 이루어진 군중에서 선택되는 세포인 것이 더욱 바람직하다.
벡터 (vector)
"벡터"란, 핵산 분자 (통상 DNA 또는 RNA임)로서 패신저 핵산 서열(DNA 또는 RNA)을 숙주 세포로 전달해준다. 통상의 벡터로는 3종이 있는데, 플라스미드, 파지, 및 바이러스이다. 벡터는 바람직하게는 바이러스이다.
상기 벡터는, 바람직하게는 인위적인 변이를 포함하므로 야생형 바이러스 균주가 아니다. 따라서, 상기 벡터는 이후 더 상세히 기술하는 바와 같이, 통상적으로 야생형 바이러스 균주로부터 유전자 조작(즉, 유전자 결손)에 의해 조건 복제성 바이러스를 포함하도록 한다. 상기 바이러스 벡터는, 가장 바람직하기로는 치료하고자 하는 감염증을 일으키는 야생형 바이러스와 동종인 것이고, 바람직하기로는 앞서 언급한 야생형 바이러스중의 하나 이다. 따라서, 상기 벡터는 바람직하게는 RNA 바이러스로부터 유래하는 것이고, 더욱 바람직하게는 레트로바이러스로부터 유래하는 것이며, 가장 바람직하게는 인간 면역 결핍성 바이러스로부터 유래하는 것이다. 인간 면역 결핍성 바이러스로부터 유래하는 벡터를 여기에서는, "crHIV" 벡터라고 부르기로 한다.
또한 상기 벡터는, 예컨대 바이러스 벡터와 다른 서열을 조합하여 만든 "키메릭 벡터"인 것이 바람직하다. 키메릭 벡터의 예로는 HIV 서열과 다른 바이러스(다른 바이러스는 야생형 바이러스 균주에서 유래하는 것으로서 조건부 복제 벡터를 포함하는 것이 바람직하다)를 조합하여 만든 벡터가 있다. 보다 상세하게는, HIV 서열은 아데노바이러스의 변형 균주 (비야생형 바이러스), 아데노-관련 바이러스, 신디비스 바이러스 벡터, 또는 암포트로픽 마우스 레트로바이러스 벡터의 서열와 결합될 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에서와 마찬가지로, 벡터는 DAN 또는 RNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스를 얻기 위해 DNA 또는 RNA 벡터를 사용할 수 있다. 유사하게, 바이러스의 RNA 게놈으로 cDNA를 복사할 수 있다. 또 다른 방법으로는 cDNA (또는 바이러스 게놈성 DNA) 성분을 시험관내에서 전사시켜 RNA를 생산할 수도 있다. 이러한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 다음에 기술하는 실시예에서도 기재되어 있다.
"조건 복제성 바이러스 (conditionally replicating virus)"란, 복제-결함 바이러스로서, 특정 조건하에서만 복제에 결함이 있는 바이러스를 말한다. 보다 상세하게는, 상기 바이러스는 바이러스의 복제를 허용하는 숙주에서는 복제 사이클을 완성할 수 있으나, 제한 숙주 세포내에서는 복제 사이클을 완성할 수 없는 바이러스를 말한다. "허용 숙주 세포(permissive host cell)"란, 야생형 바이러스 균주에 감염된 세포를 말한다. 야생형 바이러스의 감염은 본 발명에 따른 조건 복제성 바이러스로 감염되기 전 또는 감염된 후에 일어날 수 있다. 이와 달리 "허용 숙주"는 바이러스 복제에 필요한 야생형 바이러스 유전자 생산물을 코딩하는 세포를 말하기도 한다. 따라서, 본 발명에 따른 조건부 복제성 벡터는 야생형 바이러스 균주와의 상보 조건하에서만 복제를 하거나 또는 야생형 바이러스가 조건부 복제 벡터의 게놈을 함유하고 있는 세포를 감염시키는 경우에만 복제를 하는 바이러스 (치료하고자 하는 감염 바이러스와 동종류인 것이 바람직하다) 이다.
바람직한 실시예에 있어서, 벡터는 RNA 바이러스 (예: 조건부 복제 HIV 바이러스)를 포함하여 이루어진다. 상기 RNA 바이러스는 DNA형태로 도입된다. 병원성 야생형 HIV 게놈에 대해 선택적인 잇점을 갖는 비병원성 crHIV-1 벡터 게놈을 제공할 수 있는, 복제성 HIV-1 (crHIV) 벡터 전략을 상기 바람직한 실시예에서 제공한다. 보다 명확하게 말하면, 야생형 HIV와 crHIV 게놈 양자를 모두 함유하는 세포에 있어서, crHIV RNAs는 비리온내로 패키징되는데 있어 선택상의 잇점을 갖는다. 이는 crHIV RNAs이, 예컨대 야생형 RNA는 절단하고 crHIV RNA는 절단하지 않는 리보자임을 포함하고 있기 때문이다. 이러한 비병원성 crHIVs는, 야생형 헬퍼 바이러스가 존재하면 HIV에 감염되기 쉬운 비감염 세포(예: CD4+ 세포)로 전파해 나갈 수 있다. 이러한 방식으로, crHIV의 선택적인 패키징 및 전파가 야생형 HIV의 복제를 방해하는 것이다.
보다 상세하게는, crHIV 게놈은 감염 세포 또는 비감염 세포로 도입된다. 감염 세포는, 자손 비리온을 생산하고 캡시드화하는데 필요한 단백질 을 crHIV 게놈에 제공한다. crHIV 게놈은 형질도입에 의해 직접 비감염 세포내로 도입되거나 (이는 예컨대 리포좀을 매개로하여 crHIV DNA의 형질도입을 하는 방법에 의해 이루어진다.) 또는, 야생형 HIV-감염 세포의 형질감염의 결과로 생기는 crHIV 입자의 감염에 의해 비감염 세포내로 도입된다. 비감염 세포는 자체적으로 crHIV 입자를 생산하지는 못한다. 그러나, 야생형 바이러스에 의해 중감염(superinfection)될 수 있는데, 이 야생형 바이러스가 crHIV 입자를 생산하는데 필요한 단백질을 제공한다. 이러한 의미에서, 본 발명에 따른 조건 복제성 벡터는 "바이러스 운반성 벡터"로서도 기능하며, 이로써 수회의 crHIV 감염 (즉, 야생형 HIV에 의한 동시 감염의 존재하에서)이 뒤따라 일어날 수 있는 수단을 제공한다. 1회 이상의 바이러스 복제에 필요한 바이러스 소스를 제공하는 이러한 벡터는, 현재 사용되는 벡터가 단지 1회의 바이러스 복제만을 가능하게 한다는 점에서, 세포계를 패키징하는데 현재 사용되는 벡터와 대비된다.
원한다면, (예컨대, 상기 벡터를 시험관내에서 사용하기 용이하도록 하기위한 목적의 경우) 야생형 바이러스 유전자 생산물을 조건 복제성 벡터로 감염된 세포에 함께 제공할 수 있다. 야생형 바이러스의 유전자 생산물은, 야생형 바이러스 균주(또는 cDNA 또는 RNA 바이러스의 프로바이러스)와 함께 공동감염(co-infection)시켜 제공할 수 있을 뿐만 아니라 야생형 바이러스 생산물을 예컨대 헬퍼 발현 벡터 (이하 "헬퍼"라 함)와 같은 발현 벡터에 넣어 서브클론 유전자 형태로 세포에 제공할 수도 있다. 이때 헬퍼-발현 벡터는, 숙주 세포가 서열(조절 서열 또는 구조 서열)을 전사하고 또는 번역하는데 상기 야생형 바이러스 생산물을 나누어줄 수 있다. 상기 유전자 생산물은, 또 다른 방법으로는 외부에서 제공할 수 있는데 단백질 생산물을 세포에 첨가하는 식으로 제공할 수있다. "헬퍼"에 관해서 말하자면, 헬퍼는 세포 특이적 또는 세포 비특이적으로 발현될 수 있는데, 본 발명에서 정의한 조건 복제성 바이러스 벡터와 함께 숙주 세포내로 도입되어 조건 복제성 바이러스 벡터가 계속적으로 복제될 수 있게 한다.
본 발명에서 사용하는 "상보성(complementation)"은, 서로 다른 소스로부터 생산된 바이러스 유전자 생산물들이 세포안에서 비유전적으로 상호작용하는 것을 말한다. 보다 명확하게 말하자면, 혼합감염의 경우 "상보성"은 어버이 게놈의 유전자형은 변하지 않고 남아있는 반면 한쪽 또는 양쪽 어버이 게놈에 대한 바이러스 수율에 있어서는 증가되는 것을 의미한다. 상보성은 비대립적 (유전자간의 상보성으로, 서로 다른 기능에 있어서 결함을 가진 돌연변이체가 다른 바이러스에 결핍되어 있는 기능을 제공하여 바이러스 복제시 상호 조력한다.)일 수도 있고, 대립적 (유전자내 상보성으로, 두 어버이는 중합체 단백질 의 서로 다른 영역에 결함을 갖는다)일 수도 있다.
바람직하게는, crHIV DNA로 형질감염될 수 있는(리보좀에 의한 형질감염 또는 아데노바이러스 벡터 또는 암포트로픽 레트로바이러스 벡터를 이용한 형질감염) 세포의 종류는 HIV-감염 또는 비감염 세포중 어느 하나일 수 있다. HIV 감염 세포는 활성화 될 수도 있고 활성화되지 않을 수도 있다. 만일 HIV 감염 세포가 활성화되면, 즉각적으로 야생형 HIV RNA 및 crHIV RNA를 전사할 것이고, crHIV RNA가 자손 비리온으로 선택적으로 패키징된다. 만일 HIV-감염 세포가 활성화되지 않으면, crHIV DNA는 HIV-감염 세포가 활성화될 때 까지(예를 들어, 유사분열 촉진 인자인 미토겐, 항원, 및 이와 유사한 물질에 의해 자극되어 활성화되는 경우 등) 그 안에서 거주하다가, HIV-감염 세포가 활성화되면 다시 crHIV RNA가 자손 비리온 안으로 선택적으로 패키징된다. crHIV DNA로 형질도입된 활성-비감염 세포 및 비활성-비감염 세포는 모두 야생형 HIV로 중감염(superinfect)된 후에야 비로서 비리온을 생산하게 되며, 자극에 의해 활성화되어 다시 crHIV RNA가 자손 비리온 안으로 선택적으로 패키징된다.
crHIV 게놈을 포함하고 있는 세포의 중감염은(예컨대, 형질감염 또는 감염의 결과로 생긴 세포의 중감염), crHIV 게놈이 상기 중감염을 차단할 수 있는 바이러스 단백질(env 또는 nef등)을 코딩하지 않기 때문이다. crHIV RNA가 자손 비리온 안으로 패키징되어서 생기는 crHIV 비리온은, 모든 HIV 입자가 그들의 게놈 RNA로부터 DNA 프로바이러스를 만들기 위해 가지고 다니는 역전사효소 분자를, 상기 바이러스 입자가 포함하고 있기 때문이다. 이 과정을 역전사라고 한다. crHIV 비리온이 일단 비감염 세포를 전염시키면, 상기 비리온은 역전사 과정을 거쳐 게놈 RNA로부터 프로바이러스를 생산할 수 있다. 따라서, 이러한 세포들은 crHIV DNA로 직접 형질도입된 비감염 세포와 똑같게 된다. 상기 세포들은 야생형 HIV로 중감염된 후에야 비로서 crHIV 입자를 생산하며, 활성화되면 다시 한번 crHIV RNA가 자손 비리온 안으로 선택적으로 패키징된다. crHIV 입자가 이미 HIV로 감염되어 있는 어떤 세포를 또다시 감염시키는 것도 가능하다 (예, Yunoki 등., Arch. Viro., 116, 143-158 (1991); Winslow 등., Virol., 196, 849-854 (1993); Chen 등., Nuc. Acids Res., 20, 4581-4589 (1992); 및 Kim 등., AIDS Res. & Hum. Retrovir., 9, 875-882 (1993)). 그러나, 이러한 감염이 일어나기 위해서는 상기 HIV-감염 세포가 CD4 발현을 억제하는 단백질을 발현하지 않아야만 한다. 왜냐하면, 발현된 CD4 억제 단백질에 의해 crHIV 비리온이 상기 감염 세포를 감염시키는 것이 방지하기 때문이다. 활성화되면, HIV-감염 세포는 CD4의 발현을 억제(down-regulate)하는 것이 일반적이다. 따라서, 활성화되지 않은 HIV-감염 세포는 잠재적으로 crHIV 중감염에 감염되기 쉬우며, 이 때문에 crHIV 입자를 생산하는 또 하나의 소스가 될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 crHIV 벡터에 있어서, 상기 벡터는 RNA 전사, tRNA 프라이머 결합, 이합체화, 패키징에 필요한 서열을 포함한다. 또한 야생형 HIV의 중감염을 차단하는 단백질 (nef 또는 env 단백질)을 코딩하는 서열이 결여되어 있거나, 아니면 상기 단백질을 코딩하는 서열은 포함하되, 기능 단백질로 전사되지 않거나 번역되지 않아 이들 서열의 발현은 "침묵"일 수밖에 없는 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 벡터는 야생형 HIV 영역을 코팅하는 영역 또는 서열이 결여되어 있는데, 결여 부위는 gag 코딩 서열안에서부터 시작하여 nef 유전자를 포함하는데 까지 결여되어 있다. 그러나, 가장 바람직하게는 상기 벡터는 결손 영역 또는 다른 편리한 영역에서 벡터로 클론되는 rev 반응 인자 (RRE)를 포함하는 것이다. 상기 바람직한 HIV 벡터는, 이러한 벡터가 RNA를 표명하며 또 다르게는 앞서 언급한대로 DNA로서 투여될 수 있는 한은 "영역-코딩 서열 또는 영역의 결핍(lack the region or sequence coding the region)"이라 부른다.
벡터를 구성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 실시예 1에 기재된 바와 같이, HIV와 같은 RNA 바이러스가 DNA를 표명(manifestation)하는 것은, HIV를 코딩하는 서열을 gag 코딩 영역안에서부터 nef 유전자 뒤에 오는 U3 영역안까지를 절제하는 제한 효소를 사용하여 절단한다. 다중 제한 부위를 포함하는 폴리링커로 이루어지는 클로닝 카셋트는, 접합(ligation) 전 단계에서 결손 영역으로 삽입되어, 벡터에 클로닝을 위한 편리한 제한 부위를 제공한다. RRE를 포함하는 DNA 단편은 상기 제한 부위중 한곳에 서브클로닝 된다. 상기 결과로 생긴 벡터는 절두상 gag 전사체를 생산하고, 야생형 Gag 단백질 또는 다른 야생형 HIV 단백질은 생산하지 않는다. 게다가, 상기 벡터는 상기 gag 번역을 개시하는 서열이 자체의 번역을 방지하기 위해 돌연변이 될 수 있는 한은 절두상 gag 단백질 조차 발현할 필요가 없다.
동일한 접근법을 이용하면, crHIV 서열을 바이러스 서열 또는 다른 벡터의 서열등 다른 서열에 연결하여 키메릭 벡터를 얻을 수 있다. 예를 들어, 신디비스 바이러스, AAV, 아데노바이러스, 또는 암포트로픽 레트로바이러스라고 불리는것중 crHIV 서열을 운반하는데 사용될 수 있는 바이러스에, crHIV 서열을 연결시킬 수 있다. 상기 키메릭 벡터를 세포내 도입하기 위해 바이러스의 연합 기전 (예: 아데노바이러스에 있어서 수용체-매개의 엔도시토시스)을 이용하거나 또는 예컨대 리포좀과 같은 수단을 이용힐 수 있다.
본 발명에 따른 벡터(바람직하기로는 crHIV 벡터인 조건 복제성 바이러스)는, 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직한데, 이러한 서열의 존재, 전사, 또는 번역은 핵산에 선택상의 잇점을 부여한다. 벡터안에 포함되도록 고안된 상기 핵산 서열로는 두종류가 있는데; 하나는, 이러한 서열의 존재가, 상기 벡터가 유도되어 나온 야생형 바이러스로서 상기 서열을 포함하지 않는 야생형 바이러스에 비하여, 바이러스 복제 및 상기 서열을 포함하는 벡터로 전파하는데 있어 선택적인 잇점을 부여하는 핵산 서열이고, 또 하나는, 이러한 서열의 존재가, 상기 벡터가 유도되어 나온 야생형 바이러스 및, 예를 들어, 숙주 세포내에서 벡터 복제 및/또는 기능을 촉진시키는 헬퍼-발현 벡터로서 상기 서열을 포함하지 않는 야생형 바이러스 에 의해 감염된 세포와 비교하여, 상기 서열을 포함하는 벡터에 의해 감염된 세포에 선택상의 잇점을 가장 바람직하게 부여하는 핵산 서열이다. 여기서 선택상의 잇점이 부여되는 것은, 예컨대 세포의 생존 촉진, 벡터 입자의 생산 및/또는 증식 촉진, crHIV 벡터-생산 세포로부터 crHIV 벡터 비리온의 생산 촉진, 세포소멸(apoptosis) 유도, 단백질 생산 용이화, 또는 면역기능이나 표적화 촉진에 의해 원하는 예방, 치료, 또는 생물학적 결과가 달성되기 때문이다. 상기 서열 하나하나 또는 각 서열의 복수체, 즉 서열 단독 또는 다른 인자(들)와의 조합 서열은, 벡터의 증식을 촉진하고 및/또는 특정 숙주 세포의 기능을 촉진함으로써 예방, 치료, 및/또는 생물학적 결과를 유리하게 할 수있고, 다른 서열의 존재 또는 부존재하에 벡터안으로 포함될 수 있다. 다시 말해서, 상기 벡터는 "하나 이상의 핵산 서열"과 "하나 이상의 부가적인 핵산 서열"을 포함한다.
"핵산(nucleic acid)"은 앞서 언급된 바와 같다. 특히 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"이란, 잠재적으로 어떠한 크기를 가진(물론 벡터에 의해 부과되는 패키징 속박에 의해 크기가 제한되기는 함) 모든 유전자 또는 코딩 서열을 포함하는데, 이러한 유전자 또는 서열의 존재로 인해, 여기서 더 상세히 기재된 바와 같이, 선택상의 잇점이 부여된다. "유전자(gene)"란 단백질 또는 발생초기의 mRNA 분자를 코딩하는 모든 핵산 서열을 말한다 (상기 서열의 전사 및/또는 번역 여부와는 무관함). 유전자가 코딩 서열 뿐 아니라 코딩되지 않는 서열(예: 조절 서열)을 포함하는 데 반해 "코딩 서열"은 비코딩 DNA는 어떠한 것도 포함하지 않는다.
1. 핵산 서열의 존재가, 야생형 바이러스에 비하여 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터가 숙주 세포내에서 선택상의 잇점을 갖도록 하는. 헥산 서열.
그 핵산 서열을 포함하는 벡터가 야생형 바이러스에 비해 숙주 세포내에서 선택상의 잇점을 갖도록 하는 핵산 서열은, 상기 벡터로부터 증식된 바이러스 입자가 야생형 바이러스로부터 증식된 바이러스 입자에 비하여 선택적으로 생산 또는 패키징 되도록 하는 것이면 바람직하다. 이러한 서열로는, 야생형 게놈과 비교하여 세포내에서 생산되는 벡터의 게놈 숫자가 더 증가되도록 하는 서열 및 항바이러스 핵산 서열이 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터가 야생형 바이러스에 비해서, 숙주 세포내에서 선택상의 잇점을 갖도록 하는 핵산 서열의 첫 번째 분류는 프로모터와 같은 서열이다. "프로모터(promotor)"란 RNA 폴리머라아제의 결합을 지배하여 RNA의 합성을 촉진시키는 서열로, 하나 이상의 증강제를 포함한다. "증강제(inhancer)"란 인접하는 유전자의 전사를 자극하거나 또는 저해하는 시스-작용 인자를 말한다. 전사를 저해하는 증강제는 "침묵제(silencer)"라고도 한다. 증강제는 어느 한쪽 방향에서 기능할 수도 있고 몇 킬로염기쌍 (kb) 떨어진 위치에서도 기능할 수 있으며 심지어는 전사 영역의 하방 위치로부터 작용하기도 한다는 점에서, 프로모터 (또는 "촉진 인자(promotor elements)"라고도 함)에서만 발견되고 서열-특이적으로 DNA 결합을 하는 단백질을 위한, DNA-결합 부위와는 구별된다.
따라서, 프로모터는 야생형 HIV에 대해서보다 특정 시토킨에 대해서 벡터가 더 크게 반응하도록 변형된, 조건 복제성 HIV 벡터의 프로모터 (예: 길다란-말단 반복부(LTR))인 것이 바람직하다. 예를 들면, 인터루킨-2의 존재하에서 전사 활성의 증가를 보이는 변형된 HIV 프로모터를 이용할 수 있다. 상기 프로모터를 벡터에 삽입하고 이 벡터를 야생형 바이러스에 도입하면, HIV-감염 세포는, 야생형 HIV 게놈와 비교하여 우선적으로 상기 벡터 게놈으로부터 자손 비리온의 생산 및 패키징이 증가한다. 벡터로 코딩된 비리온의 선택적 패키징을 촉진시키기 위해서, 다른 시토킨 및/또는 케모킨(예: 알파 종양 괴사 인자, RANTES, 및 이와 유사한 것을 포함, 단 이에 한정되는 것은 아님)을 상기와 유사하게 이용할 수 있다.
야생형 바이러스와 비교하여 상기 서열을 포함하는 벡터가 선택상의 잇점을 갖도록 선택성을 부여하는 핵산 서열의 두 번째 분류는, 항바이러스 핵산 서열이 바람직하다. "항바이러스제 (Antiviral agent)"는 그 작용 양상에 따라 분류되는데, 예를 들면, 역전사효소 저해제, 세포내로 바이러스가 도입되는데 있어서의 경합제, 프로테아제 저해제, 및 유전적 항바이러스제가 있다. "유전적 항바이러스제(Genetic antiviral agents)"란, 세포내로 전이되어, 직접(세포내로 도입되어서) 세포내 표적에 영향을 미치거나 또는 RNA 또는 단백질로 전환된 후에 세포내 표적물에 영향을 미치는 DNA 또는 RNA를 말한다. (Dropuli 등. (1994), 상기 문헌). 유전학적 항바이러스 서열도 핵산 서열로서 바람직하다. 유전적 항바이러스제로는 안티센스 분자, RNA 디코이, 전이우성 돌연변이체, 독소, 면역원, 및 리보자임이 포함된다.그러나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유전적 항바이러스제는 바람직하게는 안티센스 분자, 면역원, 및 리보자임이다. 따라서, 야생형 바이러스와 비교하여 이러한 서열을 포함하는 벡터에 선택상의 잇점을 부여하는 핵산 서열은, 안티센스 분자, 면역원, 및 리보자임으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
"안티센스 분자(antisense molecule)"란, 유전자 발현이 차단된 유전자 단편을 반영하는 분자를 말한다. HIV에 대항하도록 된 안티센스 분자는 야생형 HIV RNA와 하이브리드화 되어 세포 뉴클레아제에 의해 야생형 HIV RNA를 선택적으로 분해시킨다. 안티센스 분자로는 DNA 올리고뉴클레오티드가 바람직한데, 바람직하게는 길이가 20 내지 200 염기쌍이고 더욱 바람직하게는 길이가 20 내지 50 염기쌍이며 가장 바람직하게는 길이가 25 염기쌍 이하이다. 안티센스 분자는 야생형 RNA에 우선적으로 결합하는 crHIV RNA로부터 발현될 수 있는데 이에 의해 crHIV RNA가 자손 비리온으로 패키징되는데 선택상의 잇점을 부여한다.
"면역원(immunogen)"이란, 바이러스의 구조 단백질에 반응하도록 된 단일-사슬 항원(scAb)을 말한다. 면역원은 핵산으로서 전이되고 세포내에서 발현된다. 이와 유사하게, 면역원은 벡터 및/또는 숙주 세포의 선택을 용이하게 해주는 항원, 표면 단백질 (군-제한 단백질을 포함), 또는 항체일 수도 있다. 벡터의 핵산 서열은 야생형 HIV Rev 단백질에 결합하는 scAb을 포함하는 것이 바람직하다. scAb는 내형질세망에서 Rev 단백질을 억제함으로써 Rev 단백질의 변이를 예방한다. 보다 명확히 말하자면, Rev 단백질은 RRE에 결합하여 조각나지 않은 HIV RNA를 세포질로 보내고 올리고머화되어 HIV RNA를 둘러싼다. Rev 단백질과 복합체를 이룬 HIV RNAs는 세포질로 보내지고 세포의 스플라이싱 기구를 우회한다. 그러므로, 만일 야생형 Rev가 야생형 RRE와 결합하지 않으면 야생형 HIV RNAs는 세포질로 보내지지 않게 되고 따라서 자손 비리온으로 캡시드화되지 않는다.
scAb 핵산 서열을 포함하는 벡터는, 변형된 RRE 서열을 부가적으로 포함하고 변형은 되었으나 야생형은 아닌 RRE를 인식하는 돌연변이 Rev 단백질을 코딩하는 것이 가장 바람직하다. 따라서 야생형 HIV를 포함하는 세포와 scAb 핵산 서열을 포함하는 벡터에 있어서, 상기 벡터는 비리온안으로 우선적으로 패키징 된다. 야생형 HIV 매트릭스 또는 뉴클레오캡시드 단백질 (또는 바이러스 RNA의 캡시드화에 영향을 미치는 단백질 /RNA 상호작용에 관여하는 모든 단백질 )을 scAb의 표적으로 삼는 상기와 유사한 전략을 이용하는 것이 바람직하다.
"리보자임(ribozyme)"이란, 촉매 활성을 가진 안티센스 분자를 말한다. 즉 RNA에 결합하여 번역을 저해하는 대신 리보자임은 RNA에 결합하여 결합한 RNA 분자를 부위-특이적으로 절단하다. 일반적으로, 리보자임에는 4군이 있다. 첫째는, 테트라하이메나 군 Ⅰ으로 서열, RNase P, 및 해머헤드형 리보자임과 헤어핀형 리보자임을 방해한다. 그러나 다른 RNA 분자, 예컨대 델타 간염 바이러스와 진균 미토콘드리아에 있는 리보솜 RNA와 같은 RNA 분자에도 또다른 촉매 모티브가 존재한다.
상기 리보자임으로는, 리보자임의 촉매 영역이 3'-뉴클레오티드 NUH 서열 [서열번호 3] (여기서 N은 예컨대 G, A, U, 또는 C중 어느 뉴클레오티드도 가능하고 H는 A, C, 또는 U 중 하나일 수 있음)을 절단하는 리보자임인 것이 바람직하다. 그러나 상기 리보자임에 의해 가장 효율좋게 절단되는 서열이 GUC 부위이므로, 상기 NUH 서열은 GUC 부위를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 리보자임은 야생형 바이러스 또는 그 전사체 영역에서 절단하고 벡터 또는 그 전사체 영역에서는 절단하지 않는 것이 바람직하다. 리보자임이 바이러스 또는 그 전사체를 절단하는 것은 앞서 언급한 바와 같이 상기 바이러스 또는 벡터가 RNA 또는 DNA중 하나라고 인식하기 때문이다. "영역안에서" 절단함으로써 라는 것은 표적 영역, 즉 바람직하게는 바이러스 증식에 필요한 바이러스 영역에서의 절단을 의미한다. 표적이 되는 상기 특정 영역이 (상기 벡터에 존재한다면) 리보자임에 의해 절단되지 않도록 상기 벡터를 변형시킨다. 예컨대 crHIV 입자와 같은 바이러스 증식에 필요한 영역안에서 절단이 일어나는 한, 리보자임은 임의적으로 벡터를 절단 할 수도 있다.
리보자임은 뉴클레오티드 서열번호 4 ( CACACAACACTGATgagGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA) 와 뉴클레오티드 서열번호 5 (즉, ATCTCTAGTCTGATgagGCCGAAAGGCCGAAACCAgagTC)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 의해 코딩되는 것이 바람직하다. 반면 서열번호 4는 야생형 HIV U5 영역의 +115 부위 (전사 시작점으로부터 아래쪽으로 존재하는 염기의 숫자에 근거한것)를 표적으로 하는 리보자임을 포함하고, 서열번호 5는 야생형 HIV U5 영역의 +133을 표적으로 하는 리보자임을 포함한다.
상기와 같은 리보자임은 야생형 HIV 게놈 (또는 그 전사체)내에서는 절단할 수 있으나, 부위-지향의 돌연변이 유발에 의해 상기 벡터 U5 서열이 시험관내에서 변형을 일으키는 한 벡터 게놈 (또는 그 전사체)내에서는 절단할 수 없다. 이러한 사실은 당업계에 알려져 있고 실시예 1에도 기재되어 있다. 보다 상세하게는, 상기 벡터 서열은 뉴클레오티드 서열 번호 2 (즉, GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAgagAAC), 뉴클레오티드 서열번호 4, 뉴클레오티드 서열번호 5, 뉴클레오티드 서열번호 6(즉, GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAgagATC), 뉴클레오티드 서열번호 7 (즉, GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAACTAgagATC), 뉴클레오티드 서열번호 15, 뉴클레오티드 서열번호16, 뉴클레오티드 서열번호 17, 및 뉴클레오티드 서열번호 18로 이루어진 군중에서 선택된 서열을 포함하도록 변형시키는 것이 바람직하다. RNA 형에 있어서는, 상기 벡터는 뉴클레오티드 서열번호 4, 뉴클레오티드 서열번호5, 뉴클레오티드 서열번호 6, 뉴클레오티드 서열번호 7, 뉴클레오티드 서열번호 15, 뉴클레오티드 서열번호 16, 뉴클레오티드 서열번호 17, 및 뉴클레오티드 서열번호 18로 이루어진 군중에서 선택된 서열에 의해 코딩된 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 반면, 야생형 HIV는 뉴클레오티드 서열번호 1 (즉, GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAgagATC)에 의해 코딩된 U5 서열을 포함한다. 큰 차이를 보이는 변형 및 야생형 U5 서열(DNA형)과의 비교가 도 2에 나타나 있다.
또한, 바이러스 특히 HIV 게놈의 다른 영역을 표적으로 하는 또 다른 리보자임을 단독 또는 조합하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 리보자임은 바이러스 복제에 필요한 다른 RNA 서열, 예컨대, 역전사효소, 프로테아제, 또는 트랜스액티베이터 단백질내에서, Rev내에서, 또는 다른 필요한 서열내에서 절단할 수 있다. 벡터는 예컨대 다중 부위를 표적으로하는 다중 리보자임을 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 경우에 있어서, 벡터안에 있는 유사한 서열은 부위-지향의 돌연변이 유발로 변형되거나 또는 당업계에 알려진 여타의 다른 수단에 의해 변형되어 상기와 같은 리보자임 절단에 내성을 갖는 벡터를 얻는다.
벡터가 인간 면역 결핍성 바이러스인 경우, 상기 벡터는 tat 유전자와 그의 5' 스플라이스 부위가 결여되고, 이 부위를 대신하는, 트리플 안티-Tat 리보자임 카셋트을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 트리플 리보자임 카셋트중의 각 리보자임의 촉매 영역은 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스 핵산 분자위에 존재하는 상이한 부위, 보다 상세하게는 tat내의 상이한 부위를 절단한다. 상기 리보자임의 각 촉매 영역은, 벡터 자체내에는 리보자임에 내성을 보이는 상응부가 없는 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스의 핵산 분자 영역에 있는 뉴클레오티드 서열을 절단하는 것이 바람직하다.
2. 핵산 서열의 존재가, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 감염된 세포가 야생형 바이러스로 감염된 세포와 비교하여 선택상의 잇점을 가지도록 하는 핵산 서열
야생형 바이러스(즉 상기 서열이 결핍되어 있는 바이러스)를 포함하는 세포에 비하여, 상기 서열을 포함하는 벡터가 선택상의 잇점을 갖도록 하는 핵산 서열로는, 야생형 바이러스를 포함하는 세포와 비교해, 상기 서열을 포함하는 세포가 바이러스 입자 (즉, crHIV 바이러스 입자)를 생존하게 하고 증식하게 할 수 있도록 하는 서열인 것이 바람직하다. 이러한 서열에는, 상기 세포 또는 상기 세포를 포함하는 벡터가 파괴되지 않도록하는 서열, 세포의 생존을 촉진하는 서열, 세포소멸(apoptosis)을 유도하는 서열, 단백질 생산을 용이하게 하는 서열, 또는 면역 기능 또는 표적화를 촉진하는 서열등이 포함된다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 벡터에 포함되어 있는 이러한 핵산 서열은 다종약물 내성을 위한 유전자를 코딩한다. (예: Ueda 등., Biochem. Biophys. Res. Comun., 141, 956-962 (1986): Ueda 등., J.Bilo. Chem., 262. 505-508 (1987): 및Ueda 등., PNAS, 84, 3004-3008 (1987) 참조). 첨가된 세포독성 약물 (예: 암 화학요법에 사용되는 약물)의 존재하에서, 이는 상기 벡터를 포함하는 세포가 생존하게 하는 반면, HIV와 같은 야생형 바이러스를 포함하는 세포에 대해서는 그러하지 아니하다. 이러한 세포독성 약물로는 악티노마이신 D, 황산 빈브라스틴, 황산 빈크리스틴, 아드리아마이신, VP-16, 및 AMSA가 포함된다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다르게는, 상기와 같은 핵산 서열은 돌연변이를 일으킨(돌연변이체) 프로테아제 서열(또는 이를 코딩하는 서열)과 돌연변이를 일으킨(돌연변이체) 역전사효소 서열(또는 이를 코딩하는 서열)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 변이를 일으킨 역전사효소는 뉴클레오시드 및 비-뉴클레오시드 역전사 효소 저해제에 내성을 갖도록 공학적으로 처리되고, 변이를 일으킨 프로테아제는 흔히 사용되는 프로테아제 저해제에 내성을 갖도록 공학적으로 처리되는 것이 바람직하다.
상기와 같은 프로테아제 또는 역전사효소 저해제를 벡터와 함께 숙주내로 투여하는 방법은, 야생형 바이러스를 생산하는 세포와 대비되는 벡터를 생산하는 세포를 가려내기 위해 이용된다. 유사하게는, 약물 저해성을 회피하기 위해 돌연변이를 일으킬 수 있는 바이러스 복제를 저해하는 약물사용에 이러한 접근법을 변형시켜 이용할 수 있다. 따라서, HIV를 치료하기 위해, 벡터내로 삽입된 선택적 핵산 배열은, 변이를 일으킨 HIV 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 서열은 야생형 HIV에 의한 중감염을 예방하지 않는 것이 가장 바람직하다.
벡터는 위에서 언급한 것 중 하나인 것이 바람직하다. 보다 상세하게는, 도 1b 내지 1e 에서 묘사한 crHIV-1.1, crHIV-1.11, crHIV-1.12, 및 crHIV-1.111의 crHIV 벡터인 것이 비교적 바람직하다. (Dropulic' 등., PNAS, 93, 11103-11108 (1996)). 또한 실시예 2에 기재한 벡터, 즉 cr2HIV인 것이 바람직하다.
상기 crHIV 벡터는 tat 유전자와 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스 게놈으로부터 유래하고 스플라이스 부위가 결여되어 있는 것이 바람직하다. tat 유전자 및 그 스플라이스 부위 대신, cr2HIV 벡터는 트리플 안티-Tat 리보자임 카셋트을 포함하는데, 상기 트리플 리보자임 카셋트의 각 리보자임에 있는 촉매성 영역은 야생형 HIV 핵산 분자위에 위치한 상이한 부위를 절단한다. 상기 트리플 리보자임 카셋트의 각 리보자임에 있는 촉매 영역은 야생형 HIV 핵산 분자에 있는 tat내에 있는 상이한 부위를 절단하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 각 리보자임의 촉매 영역은, 벡터 자체에 리보자임-내성을 갖는 대응부를 포함하고 있지 않는 야생형 HIV의 핵산 분자에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 절단한다.
가장 바람직하게는, 벡터는 벡터가 도입되는 세포, 예컨대 벡터-코딩 핵산 서열이 세포위에 발현되도록 할 수 있는 세포와 양립할 수 있다. 상기 벡터는 세포내에 있는 복제 기관을 포함하는 것이 바람직하다. 핵산 서열이 DNA 코딩 서열 형태로 전이될 때 (예를 들어, 자체의 프로모터를 포함하는 완전한 유전자 형태로 전이되는 것과 비교하여), 상기 벡터는 코딩 서열이 발현되도록 촉구할 수 있고 또한 코딩 서열에 운영가능하게 연결될 수 있는 프로모터도 포함하는 것이 바람직하다. 코딩 서열은, 프로모터가 코딩 서열의 전사를 지휘할 수 있을 때 프로모터에 "운영가능하게 연결(operably linked)" 된다고 한다. (예컨대, 코딩 서열과 프로모터가 함께 원래의 유전자 또는 재조합 유전자를 구성하는 경우)
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 모든 적절한 전사(예컨대, 개시 신호와 종결 신호), 번역 (예컨대, 리보좀 도입 또는 결합 부위 및 이와 유사한 것), 및 프로세싱 신호 (예컨대, 접합 제공자 부위 또는 수용자 부위와, 필요한 경우 폴리아데닐화 신호)가 벡터위에 정확하게 배열되어, 어떠한 유전자 또는 코딩 서열도 상기 벡터가 도입되는 세포내에서 적절하게 전사(원한다면 및/또는 번역)되는 것이 바람직하다. 숙주 세포내에서 확실하고도 적절한 발현이 되도록하기 위해 상기 신호를 표명(manifestation)하는 것은 당업자의 지식 수준내이고 잘 알려져 있다.
상기 벡터는, 벡터 또는 벡터에 포함된 서브클론 서열을 확인하고 선택하는 수단이 될 수 있는 것을 일부 포함하는 것이 바람직하다. 당업계에 알려져 있는 다양한 접근 방법을 이용하여 벡터를 확인하고 및/또는 선택할 수 있다. 예를 들면, 특정 유전자 또는 코딩 서열을 포함하는 벡터는, 하이브리드화, 벡터위에 존재하는 마커 유전자에 의해 코딩되는 소위 "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부존재, 및/또는 특정 서열의 발현에 의해 우선적으로 확인된다. 첫 번째 접근 방법에서는, 관련 서열에 상동물인 서열을 포함하는 프로브를 이용하여 하이브리드화 (예컨대, DNA-DNA 하이브리드화)에 의해 벡터내에 특정 서열이 존재하는가를 검출된다. 두 번째 접근 방법에서는, 벡터에 존재하는 이러한 기능들을 코딩하는 특정 유전자에 의해서 생기는, 항생제 내성, 티미딘-키나아제 활성, 및 이와 유사한 것과 같이, 어떤 마커 유전자 기능이 존재하는가에 근거해, 재조합 벡터/숙주 시스템이 확인되고 선택된다. 세 번째 접근 방법에서는, 벡터에 의해 코딩되는 특정 유전자 생산물을 검정함으로써 벡터를 확인한다. 이러한 검정은 유전자 생산물의 물리학적, 면역학적, 또는 기능상의 성질에 근거한다.
본 발명에서는 벡터를 제공한다. 벡터가 DNA로 되어 있는 것이라면, 서열 번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 만일 RNA로 되어 있는 것이라면, 뉴클레오티드 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군중에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 누틀레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에서는, 더 나아가 벡터를 생산하는 방법도 제공하는데, 상기 벡터는 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스 로부터 얻어지고, 상기 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포 안에서만, 리보자임 존재하에 복제될 수 있다. 리보자임은, 벡터에 의해 코딩되고 또 벡터내에 포함되어 있는데, 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스의 핵산을 절단한다. 그러나 벡터 자체의 핵산이나 그 전사체(만일 존재하는 경우)는 절단하지 않는다. 본 발명에서 제공하는 방법에는, 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스로부터 유되되어 나오고 또 상기 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포 안에서만 복제가 가능한 벡터를 얻는 방법과, 핵산 서열을, 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스의 핵산은 절단하고 벡터 자체 또는 그 전사체 (존재하는 경우)는 절단하지 않는 촉매 영역을 갖는 리보자임을 포함 또는 코딩하는 벡터 안으로 삽입하는 방법을 포함한다. 이 방법에서는, 야생형 인간 면역 결핍성 바이러스의 U5 서열을 포함 또는 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 벡터로부터 결손될 수 있다. 이 결손된 자리는, 벡터가 DNA이면 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열로 치환될 수 있고, 만일 벡터가 RNA이면 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열에 의해 코딩된 뉴클레오티드 서열로 치환될 수 있다. 벡터는 상기 벡터의 복제를 1회 이상 허용하는 숙주 세포 안에서 복제하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는, 또한, 벡터를 변형시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 벡터를 얻는 방법 및 이 벡터안으로, 벡터가 DNA이면 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열을 삽입하고, 만일 벡터가 RNA이면 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열에 의해 코딩된 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 방법으로 이루어진다.
본 발명에서는 패키징 세포계를 이용하지 않고도 조건 복제성 바이러스를 증식시키고 선택적으로 패키징하는 방법을 제공한다. 상기 방법에는, 조건 복제성 바이러스를, 다른 벡터 즉 조건 복제성 벡터와 같은 종류의 벡터로서 복제 감응성에 있어서는 야생형으로 되는 점에서 조건 복제성 바이러스와는 구별되는 벡터로 감염될 수 있는 세포와 접촉시키는 방법; 그 결과로 상기 세포를 다른 하나의 벡터에 접촉시키는 방법; 및 조건 복제성 벡터의 증식을 유도할 수 있는 조건 하에서 상기 세포를 배양시키는 방법을 포함한다.
또한, 본 발명에서는 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자와, 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열에 의해 코딩된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 분리 정제된 핵산을 제공한다.
이용 방법
위에 언급한 벡터는 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위해서, 벡터 보유의 용이성을 위해서, 및 기타 다른 이유를 위해서 숙주 세포 안으로 도입된다. 따라서, 본 발명에서는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포의 분리, 및/또는 이로부터 배양하여 유래한 이러한 세포 또는 세포계의 보유는 흔히 있는 문제이며 당업자들이 잘 알고 있는 문제이다.
보다 상세하게, 상기 벡터는 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위해 사용된다. 이때의 바이러스 감염은, 바람직하게는 야생형 바이러스, 또는 야생형 RNA 바이러스이고 더욱 바람직하게는 야생형 레트로바이러스이고, 가장 바람직하게는 야생형 HIV이다.
상기 이용방법은, 조건 복제성 바이러스를 야생형 바이러스에 의해 감염될 ATN 있는 숙주 세포에 접촉하는 단계를 포함한다. 상기 조건 복제성 바이러스는 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포에서만 복제가 가능하고 벡터의 존재, 전사, 또는 번역으로 숙주 세포안에 있는 야생형 바이러스를 저해하는 바이러스이다. 상기 벡터는 하나 이상의 핵산 서열을 포함 (즉, 존재, 전사 또는 번역)하는 것이 바람직한데, 이 핵산 서열은 세포내에서 야생형 바이러스 (상기 벡터가 유래한 바이러스인 것이 바람직함)에 비해 상기 벡터에 선택상의 잇점을 부여한다.
상기 방법에 따르면, 핵산 서열은 유전적 항바이러스제를 포함 또는 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 유전적 항바이러스제는 상기 벡터이외의 다른 바이러스의 복제 및/또는 발현에 악영향을 미치는 것으로, 안티센스 분자, 리보자임, 및 면역원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 리보자임인 것이 가장 바람직한데 상기 리보자임의 촉매 영역은 3' 뉴클레오티드 NUH 서열(특히 GUC 서열)을 절단하는 것이 바람직하다.상기 리보자임은 뉴클레오티드 서열번호 4 및 뉴클레오티드 서열번호 5로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열에 의해 적어도 일부가 임의적으로 코딩된다. 리보자임은 야생형 바이러스 또는 그 전사체 영역을 절단하고 상기 벡터 또는 그 전사체 영역은 절단하지 않는 것이 바람직하다. 이는 무엇보다도 벡터는, 만일 벡터가 DNA이면, 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열을 포함하고, RNA이면 뉴클레오티드 서열번호 2, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 누틀레오티드 서열에 의해 코딩된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 반면, 야생형 바이러스는 뉴클레오티드 서열번호 1에 의해 코딩되는 서열을 포함하고 있기 때문이다.
상기 방법은 또한, 하나 이상의 핵산 서열을 포함 (즉, 존재, 전사 또는 번역)하는 벡터에 의해 실시되는 것이 바람직한데, 상기 핵산 서열은 세포내에서 야생형 바이러스(상기 벡터가 유래한 바이러스인 것이 바람직함)로 감염된 세포에 비해 상기 벡터로 감염된 세포에 선택상의 잇점을 부여한다. 이점에 있어서, 벡터는 바이러스로 감염된 숙주 세포에 선택상의 잇점을 부여하는 하나 이상의 핵산 서열과, 벡터가 유도되어 나온 바이러스에 상응하는 야생형 바이러스와 비교하여 상기 벡터에 선택상의 잇점을 제공하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
그러므로, 본 발며에서 제공되는 상기 방법은 다종약물 내성을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열로서 실시되는 것이 바람직하다. 또 다르게는, 예방 또는 치료되는 바이러스 감염이 레트로바이러스일 때처럼, 돌연변이를 일으킨(돌연변이체) 프로테아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 핵산과, 돌연변이를 일으킨 (돌연변이체) 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 실시되는 것이 바람직하다.
상기 방법은, 더 나아가서는 세포독성 약물, 프로테아제 저해제, 및 역전사효소 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 약물을 숙주 세포에 투여하는(즉, 벡터 투여외에도 상기 약물들을 투여하는 것) 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
그러므로, 앞서 언급한 바와 같이 벡터는 바이러스 감염을 치료하기위해 투여될 뿐 아니라 잠재성 숙주 세포를 바이러스 감염으로부터 예방하기 위해서도 이용된다. 다시 말해, RNA 바이러스, 특히 HIV와 같은 레트로바이러스와 같이 관심사가 되는 바이러스에 대한 예방법 또는 이에 대한 백신을 만드는법에 벡터가 이용되기도 한다. 상기 방법에서는 숙주 세포가 야생형 바이러스에 접촉되기 전에 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 것이 필수적이다. 이점에 있어서, 상기 벡터는 야생형 바이러스로 인한 중감염을 차단하는 단백질을 포함 또는 코딩할 수 있다. 상기 방법은 앞에서 언급한 바와 같이 숙주 세포를 조건 복제성 벡터와 "헬퍼-발현 벡터" 즉 비감염 숙주안에서 "벡터"의 복제를 촉진하는 바이러스 게놈에 접촉하는 단계를 포함한다.
상기 조건 복제성 벡터는 패키징 및/또는 증식에 있어 선택상의 잇점을 갖는다. 게다가, 예컨대, 벡터는 세포의 생존을 강화하고 바이러스 생산을 촉진하고 세포소멸(apoptosis)을 유도하고 단백질 생산을 수월하게 하며 및/또는 면역 기능 및/또는 표적화를 촉진하는 서열을 포함할 수 있다. "헬퍼-발현 벡터"구조는 "벡터"의 복제 불능성을 상보하는 발현 벡터를 말한다. 이러산 헬퍼-발현 벡터는 통상적이며 당업자가 용이하게 구성할 수 있다. 헬퍼-발현 벡터는 벡터처럼 비리온 안으로 패키징 될 수도 있고, 아니면 패키징될 필요없이 발현될 수도 있다. "벡터"는 패키징 및/또는 증식에 대해 선택상의 잇점을 가지므로, 이러한 시스템은 약독화-생바이러스가 잠재적으로 야기할 수 있는 발병 효과를 가지지 않고 많은 바이러스 복제를 할 수 있는, 안전한 수단을 제공한다. 이외에도, 벡터는 면역성을 증강시키기 위해 비특이적 보조제(ajuvant)와 혼합시킬 수 있다. 상기 보조제는 당업계에 공지되어 있으며, 프레운드(Freund's)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제, 박테리아성 및 마이코박테리아성 세포벽 성분을 포함하여 이루어지는 에멀젼, 및 이와 유사한 것들이 있다.
위에서 언급된 바와 같이 바이러스 감염에 대한 예방으로서 벡터를 사용하는 경우, 돌연변이 바이러스성 단백질 또는 비바이러스성 단백질과 같이 야생형 바이러스에 의해서 코딩되지 않는 단백질 항원을 코딩할 수 있다. 그러므로, 상기 벡터에 의해 코딩된 항원은 박테리아에서 기원한 것일 수도 있고 암 세포에서 기원한 것일 수도 있다. 게다가, "벡터"는 숙주의 면역시스템에 항원을 적절히 제공(presentation) 하기 위해 MHC 유전자를 코딩할 수도 있다. 따라서, 이러한 벡터는, 비정상 세포에서 선택적으로 발현되는 잠재적 병원체 및/또는 다양한 내인성 단백질 (예: 종양-특이적 항원)에 대해, 용이하게 계속적으로 면역학적 반응을 하도록 하는데 사용될 수 있다.
더 나아가, 벡터가 세포-특이적으로 복제 및 전파하는 것을 허용하는 특정 유전 성분/인자 (벡터 또는 헬퍼-바이러스 발현 구성의 형태로)를 첨가하거나 또는 배제함으로써, "헬퍼-바이러스" (여기서는 "헬퍼"라고도 부른다.) 발현 벡터가, 특정 세포종(예: 간세포, 전문 항원제공 세포(professional antigen presenting cells), 및 종양 세포)에서만 발현되도록 공학적으로 처리할 수 있다. 따라서, 상기 벡터는 여전히 헬퍼-바이러스의 상보에 의해 전파되나, 이러한 전파는, 세포 특이적이고, 벡터 또는 헬퍼-바이러스 발현 구성물로부터 어떤 유전자 성분/인자가 첨가 또는 배제되느냐에 좌우된다. 이러한 벡터는 단독으로 사용되거나 또는 위에서 언급한 전략에서 사용되는 다른 것과 조합하여 사용되기도 한다.
예를 들어, 조건 복제성 HIV 벡터가 T-세포에서 보다 마크로파지에서 더 특이적으로 복제되도록 고안할 수 있다. 상기 벡터는, Tat-결함 HIV를 구성하는데 (상기 벡터는 다른 HIV 단백질 을 코딩하나 Tat 전사성 트랜스액티베이터가 존재하지 않기 때문에 발현되지는 않는다.), 야생형 HIV는 절단하나 조건 복제성 HIV RNA는 절단하지 않는 리보자임을 코딩할 수 있다. 이 벡터를 위한 헬퍼-발현 벡터는, 마크로파지-특이적 프로모터로부터 떨어져서 발현되는 tat 유전자를 코딩할 수 있다. 따라서, crHIV마크로파지 세포에서만 특정 조건하에서 복제될 수 있다. 반면 T-세포 또는 기타 다른 세포종에서는 복제될 수 없다.
또 다르게, 상기 tat 유전자는 종양-특이적 프로모터에 운영가능하게 연결될 수 있다; 따라서, crHIV는 CD4 종양 세포에서만 복제될 수 있고 CD4 정상 세포안에서는 복제될 수 없다. 유전 성분/인자는, "헬퍼-바이러스"와 연합하여 특정 세포종에서만 발현되고 다른 세포종에서는 발현되지 않도록, 상기 벡터 프로모터 서열의 변형일 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서는, 상기 헬퍼-발현 구성물 또는 상기 벡터 구성물 엔벨로프 단백질(이러한 구성물이 엔벨로프 단백질을 포함하도록 공학적으로 처리되는 경우)은, 상기 벡터-비리온이 어떤 세포종 (예: 종양 세포)은 특이적으로 감염시키고 반면 다른 세포종 (예: 정상 세포)은 감염 시킬 수 없도록 변형시킬 수 있다. 여전히 또 다른 실시예에서, 아데노바이러스는, 복제에 필요한 하나 또는 수개의 주요 인자가 결여되어 있는데, 헬퍼 구성물을 이용하여 보완할 수 있다. 상기 헬퍼 구성물은 종양-특이적 프로모터에 연결되어 있는 상기의 주요 인자들을 제공한다. 따라서, 아데노바이러스의 복제를 상보하는 이러한 인자들은 종양 세포 안에서만 발현될 수 있고, 이에 의해 종양 세포안에서만 바이러스 복제를 허용(세포 사멸에 요하는 단백질의 발현으로)되고 정상 세포에서는 발현되지 않는다.
따라서, 본 발명에서는 암치료 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, T-세포 백혈병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 "암 치료 (Treating cancer)"방법은, 치료 반응에 영향을 미칠 목적으로 여기에서 제공된 더욱 변형시킨 벡터를 숙주 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 치료 반응은, 예컨대, 종양 성장 및/또는 종양 퇴화(regression)가 약화되는 것을 모니터링함으로써 평가할 수 있다. "종양 성장"이란 종양의 크기 및/또는 종양의 숫자상의 증가를 포함한다. "종양 퇴화"란 종양의 양의 감소를 포함한다.
본 발명에 따른 "암(cancer)"에는, 종양의 형성(formation)으로 뒷받침될 수 있는, 비정상적인 세포성 증식 및 접촉 저해의 부재를 특징으로하는 암을 포함한다. 상기 "암"이라는 용어는 종양내에 편재 하는 암뿐 아니라 비편재하는 암, 예컨대 종양에서부터 침입(invasion)에 의해 국소적으로 번지거나 또는 암전이에 의해 전신으로 번지는 암세포들과 같은 것도 포함한다. 이론적으로는, 어떠한 종류의 암도 본 발명에서의 치료를 위한 표적이 될 수 있다. 그러나, 바이러스가 원인인 암이 본 발명의 표적으로 바람직하다.
궁극적으로, 위에서 언급한 벡터는 생체내 유전자 요법에 직접적으로 사용될 수 있다. 유전자 요법을 위한 현재의 전략들은 어려움을 겪는데 이는 다수의 비율을 차지하는 세포로 유전자가 운반되는 것을 조정하지 못하기 때문이다; 단지 일정 비율의 세포만이 감염된다. 이러한 사실은 전체 종양 군집을 유전자 형질도입하는 것이 결정적인 항-종양 전략에서 특히 중요하다. "헬퍼"와 연합하여 "벡터"를 첨가함으로써, 즉시 형질도입된 세포는, 인접 세포를 전염시킬 수 있는 바이러스 입자를 생산할 것이고 따라서 형질 도입의 효율의 완전성을 높게 또는 가능하게 할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, "헬퍼"구조물로 인간 레트로바이러스 (HIV 일 수도 있고 레트로트랜스포손 성분일 수도 있음)를 조직 (또는 시험관내에서의 세포로)으로 운반할 수 있다. 상기 벡터와 헬퍼를 즉시 포함하는 세포는 바이러스를 생산할 것이고 특정 조건하에서 이 벡터를 비리온 안으로 패키징할 것이다. 이러한 비리온들은 인접 세포들이 상당히 효율적으로 도입되도록 할 것이다. (왜냐하면 세포-세포 접촉이 세포를 도입하는 가장 효율적인 수단이기 때문이다.) 즉시 형질도입된 세포들은 벡터/헬퍼 조합이 세포용해성 감염이 되느냐에 따라 죽을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 레트로트랜스포손의 경우에 있어서는, 헬퍼는 구조 단백질을 포함유하고 있을 필요가 없는데, 왜냐하면 정상 세포 또는 종양 세포가 비리온 안으로 캡시드화되는데 필요한 단백질/인자를 포함할 수도 있기 때문이다. 이러한 경우에 헬퍼는 단지 레트로트랜스포손 캡시드화에 필요한 인자의 전사를 활성화시키는 트랜스액티베이토 단백질일 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. HIV 경우에 있어서는, HIV 게놈을 자손 비리온으로 캡시드화시켜 세포를 감염/형질도입시키기 위해 다른 인자를 필요로 할 수도 있다. 그러나 반드시 그러한 것은 아니다.
위에서 언급한 벡터는 반-생물학적 또는 반-화학적 전쟁 전략에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 병원성이 매우 높은 바이러스 또는 박테리아 또는 화학물질 (예: 독소)에 최근에 감염된 개체에 조건 복제성 벡터을 투여하여 전달할 수 있다. 벡터는 앞서 언급한 대로 병원성 바이러스의 복제를 방해할 것이다. 그러나, 조건 복제성 바이러스는 헬퍼-발현 벡터 (이하 "헬퍼")와 연합하여 반세균성 또는 반화학적 전략에 사용할 수도 있다.
예를 들어, 조건 복제성 바이러스는 "헬퍼"가 바이러스의 발현 및 증식을 허용한 후, 항-세균성 또는 항-독소 항체를 분비할 수 있다. "헬퍼"는 박테리아, 사이토킨 (박테리아 감염에 반응하여), 항생제 (테트라사이클린 유도 프로모터 시스템으로.(Paulus 등., J. Virol., 70, 62-67 (1996)), 또는 화학물질 (예: 독소 자체)에 의해 활성화되면, 그 발현을 허용하는 유도성 프로모터를 제거당할 수 있다. 그러나 반드시 그러한 것은 아니다. 따라서, 조건 복제성 벡터는 병원체 또는 독소 (헬퍼의 활성화의 결과)에 반응하여 "헬퍼"의 도움을 받아 선택적으로 증식할 뿐만 아니라, 종양 항원, 병원체, 또는 화학물질(예:독소)들의 발병 효과를 저해하기 위한 항-병원체 또는 항-독소 항체를 분비한다. 따라서, mRNA 및/또는 단백질로 전사될 수 있는 어떠한 단백질, 인자, 또는 유전 성분도 조건 복제성 바이러스에 삽입되어, 자신의 선택적 증식 및 발현을 촉진하는 "헬퍼"와 연합하여 병원성 반응을 저해할 수가 있다. 여기서 "헬퍼"가 촉진시키는 바이러스의 증식 및 발현이 선택적인 것은, 헬퍼 생산물이 특정 조건에서 발현되기 때문인데, 예를 들어, (a) 유도성 프로모터 시스템 -- 종양 세포에 있는 인자가 헬퍼 인자의 생산을 활성화시키거나, 독소 반응성 서열이 헬퍼 인자를 발현시키거나, 또는 시토킨 반응성 프로모터 가 헬퍼 인자의 생산을 유도하는 경우, (b) 헬퍼 RNA/단백질/인자가 어떤 세포안에서는 선택적으로 안정화되고 다른 세포안에서는 그렇지 아니한 경우, 및 (c) 헬퍼 바이러스 단백질의 생산, 동반 (chaperoning), 표적화, 구조 또는 다는 생체 기능에 영향을 미치는 제 3의 유전자를 간접적으로 유도하는 경우가 그러하다. 그러나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 전략은 병원체로부터 식물종 또는 동물종을 보호하기 위한 유전자전이 식물 또는 동물에 사용될 수 있다. 유사하게는, 귀중한 잡종 단백질/인자를 생산하기위한 유전자전이 시스템에 사용될 수도 있다.
본 발명의 방법에 따른 다른 일실시예에 있어서, 세포계는 예컨대 특정 기능을 수행하는데 있어 단백질/인자의 어떤 부위가 중요한 부분인지를 결정하기 위한 약물/인자를 찾아잴 목적으로 개발될 수 있다. 주어진 세포계안에서 관심사가 되는 변이 단백질을 발현하기 위해 벡터를 만들 수 있다. 그러나, 변이 단백질을 코딩하는 RNA는 예컨대 침묵점 변이 (silent point mutation)를 끼워넣음으로써 리보자임에 저항성을 갖게 된다. 그러나, 야생형 단백질의 발현은 세포계 안에서 저해된다. 관심사가 되는 단백질에 대해 리보자임을 발현하는 벡터는 또한 돌연변이 시험단백질을 발현하도록 구성될 수 있다. 세포안으로 벡터가 형질도입되면, 정상 단백질을 코딩하는 대부분의 원래의 RNA는 절단되는 반면 돌연변이 시험 단백질은 발현된다. 상기 방법은 주어진 단백질이 어떻게 기능하는가와 주어진 인자/약물이 상기 단백질과 어떻게 상호작용하는가를 결정하는데 있어 신속하고도 효과좋은 기술로서 근래에 개발된 운반 및 선택 기술을 이용하여 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 벡터의 시험관내에서의 용도 및 본 발명에서 제공하는 방법의 용도는 수없이 다양하다. 예를 들어, 바이러스 복제와 리보자임 기능의 어떤 미묘한 차이를 확인하는데 벡터를 사용될 수 있다. 유사하게, 리보자임-함유 벡터를, 예컨대, 병든 세포에 존재하는 돌연변이를 평가한다거나 또는 유전학적 흐름을 조사하는데 하나의 진단 수단으로 사용할 수 있다. 앞에서 언급한 이러한 논의는 결코 본 발명의 용도를 다 포괄하지는 못는다.
본 발명의 잇점
AIDS 및 기타 다른 바이러스 질환에 대한 유전학적 치료를 위해 crHIV 전략을 이용하는 잇점은 상당히 크다. 예를들어, HIV로 감염된 세포에 벡터를 표적화하는 문제가 해결된다. 감염된 CD4+ 세포로 crHIV를 생체내에서 형질감염시킨 후에, crHIV는 내인성 감염 HIV 엔벨로프 단백질을 이용하여 자손 비리온으로 패키징된다. 따라서, crHIV RNA는 자손 비리온 안에서 꼬리표로서 붙어다니며 HIV 특정 바이러스에 의해 정상적으로 감염되는 세포종을 감염시켜 비병원성 비리온을 생산한다. 상기 방법은 중추신경계의 HIV 감염의 주요 장소(reservoir)로 작용하는 뇌 소교세포와 같이 표적화하기 어려운 세포를 포함한다. crHIV 벡터에 의해 코딩되는 바이러스 단백질은 없기때문에 비감염 CD4+ 세포를 감염시키는 crHIV 벡터와 연관된 독성은 거의 없는 것 같다. 더욱이, crHIV 벡터가 야생형 HIV와 경합하는 결과 비병원성 입자를 생산하고 그 결과 바이러스 부하를 감소시킨다. 병원성 HIV-1 부하를 감소시키면 감염 개체의 생존 시간이 연장될 수 있을 뿐 아니라 비감염 개체로 옮아가는 비율이 감소될 수 있다. 이는 crHIV 입자가 전신으로 퍼져 나갈 수 있기 때문이다. (즉, 감염성 HIV가 그러하듯이). HIV-1 부하가 감소되는 것은 HIV에 감염된 임신부에 있어서 특히 더 중요한데, 이는 생산되는 crHIV 감염된 어머니로부터 HIV-1이 자궁내에서 태아에게 옮겨가는 것 역시 감소시킬 수 있기 때문이다.
crHIV 벡터를 숙주 세포내로 도입하기 위해 사용되는 플라스미드 DNA/지질 혼합체는 안정하고 또 생산가가 저렴하여, 고비용이 드는 생체내 에서의 전략을 우회할 수 있어야만 한다. 물론, 본 발명에서 제공하는 방법은, 만일 요구된다면, 이를 생체외 유전자 전달에도 이용할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 속성상 융통성이 있다. 그럼에도 불구하고, 현재의 유전자 치료 전략을 실행할 수 없을 것 같은 일반 집단들 치료에는 리포좀-매개의 접근법이 가능성을 열어주고 있다. crHIV 벡터는 수 개의 리보자임을 포함하게끔 공학적으로 처리되어 HIV 게놈상의 상이한 부위를 표적으로 삼게 할 수 있다. 이렇게 함으로써 감염성 HIV가 돌연변이를 일으켜 항-HIV 리보자임의 효과를 피할 수 있는 가능성을 감소시킨다. 더욱이, 조건 복제 감응성이 있는 바이러스 전략을 다른 바이러스 감염, 특히 바이러스의 교체율(turnover)이 높은 질병을 치료하는데 이용할 수 있다.
crHIV 벡터의 특히 유용한 성질은, crHIV 벡터를 예컨대 리보자임과 같은 유전적 항바이러스제를 후-전사적으로 발현하는데 이용할 수 있다는 것이다. 따라서, crHIV 벡터에 비감염 세포가 감염되면, Tat 단백질의 부존재하에서 HIV 길다란-말단 반복부 (LTR) 프로모터로부터 발현이 거의 되지 않기 때문에, 결과적으로 낮은 독성을 보인다. 높은 crHIV의 발현과 그 결과 생기는 항바이러스 활성은, Tat 단백질이 야생형 HIV에 의해 상보되는 경우에만 생긴다. 따라서, crHIV 벡터는 HIV 감염으로부터 세포를 보호하도록 고안되는 것이 아니라, 비병원성 crHIV 입자를 선택적으로 축적하여 전체 야생형 HIV 바이러스 부담을 낮추도록 고안된다.
본 발명의 실시 또는 작용에 대해 어떠한 특정 이론으로 결집하지 않는 반면, 후술하는 실시예에서 확인되었듯이, 리보자임은 다음과 같은 두가지 특성때문에, crHIV 게놈에 선택상의 잇점을 제공하기 위해 사용될 수 있다고 믿어진다: 한가지 특성은, 리보자임은 특이성이 높기 때문이고, 또 한가지 특성은 리보자임은 표적 RNAs와 공동-편재 할 수 있는 능력에 근거한 상대적인 효율성을 갖기 때문이다. (Cech, Science, 236, 1532-1539 (1987)). 리보자임이 갖는 특이성은, XUY 부위를 포함하는 상보적 표적 서열과 리보자임이 특이적으로 하이브리드화 하기 때문이다. 리보자임이 갖는 상대적 효율성은, 리보자임이 표적 RNAs와 효율적으로 공동-편재하는 경우에만 표적 RNA를 매우 효율적으로 절단하기 때문이다. HIV/crHIV 혼합 감염에 있어서는, HIV RNA 게놈이 자손 비리온으로 패키징되기 전에 이합체화 하므로 리보자임-함유 crHIV RNAs와 야생형 HIV RNAs와의 공동-편재가 생겨야만 한다. 바이러스 단백질 생성에 필요한, 야생형 HIV RNAs 비-게놈성 종을 절단하는 것은, 비게놈성 HIV RNAs가 이합체하지 않는 이상 게놈성 야생형 HIV RNAs를 절단하는 것보다 덜 효율적일 것 같다. 여기서 기술되는 실험에서, crHIV RNAs에 부여되는 선택적 잇점은 crHIV가 비리온 입자 안으로 선택적으로 패키징되기 때문이라는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 효율적으로 이루어지는 대부분의 절단은 이합체를 이루는 동안 세포내적으로 일어나며 그 결과 숙주 뉴클레아제에 의해 야생형 HIV RNAs가 선택적으로 파괴된다는 것을 시사한다. 이렇게 하여 crHIV RNAs가 바이러스 입자내로 우선적으로 패키징되도록 한다.
HIV 요법에 crHIV RNAs를 응용하는 방법에는, crHIVs의 게놈성 선택 뿐 아니라 crHIV 입자를 생산하는 세포들의 세포성 선택성 역시 관련된다. 그렇지 않으면, 야생형 HIVs를 생산하는 세포들은 crHIV 입자를 생산하는 세포들에 비해 선택상의 잇점을 가지고 야생형 HIV 입자를 생산할 것이고 빠르게 우위를 차지할 것이다. 야생형 HIV를 발현하는 세포에 비해 crHIV 발현 세포에 생존상의 잇점을 부여하는 (약물의 존재하에서) 유전자(예: 다종약물 내성 유전자)를 crHIV 게놈안으로 삽입함으로써, crHIV 발현 세포에 선택상의 잇점을 부여할 수 있다. 이러한 조건 하에서는, 야생형 HIV-발현 세포는 점차적으로 사멸하나 여전히 야생형 HIV를 생성한다. 반면 선택적으로 crHIV를 생성하는 crHIV-발현 세포는 살아남는다. 잔류하는 야생형 HIV로 crHIV-함유 세포가 감염되면 crHIV를 함유하는 바이러스 입자를 더욱 더생성할 것이다. 따라서, crHIV 게놈을 갖는 CD4+ 세포 감염의 축적으로 바이러스 게놈의 이동이 생기고, 그결과 숙주내에서 병원성 야생형 HIV로부터 비병원성 crHIV 게놈으로 바이러스의 균형이 바뀐다. 일단 HIV게몸의 균형이 야생형 HIV에서 crHIV로 선택적으로 흘러가면, 상기 전략은 야생형 HIV를 제거하는 결과가 된다. crHIV는 야생형 HIV 헬퍼 존재하에서만 복제가 가능하기 때문에 궁극적으로 바이러스 복제는 끝을 맺는다. 그러므로, 이렇듯 상호 제한적인 조건하에서는,야생형 HIV 바이러스 부하를 감소시킬 뿐 아니라 HIV-감염 숙주로부터 바이러스를 제거하도록 crHIV 벡터를 공학적으로 처리될 수 있다.
투여 수단 (Means of Administration)
본 발명에 따르면, 앞서 언급한 바와 같이 바이러스 감염에 유전자 요법이 필요한 숙주 세포내로 벡터를 도입한다. 벡터를 도입하는 수단은 본 발명에 따른 벡터를 바이러스에 감염될 수 있는 숙주와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 접촉단계는 숙주 세포내로 벡터를 도입하는 수단이면 모두 포함된다: 상기 방법은 벡터를 도입하는 특정 수단에 좌우되지 않으며 또한 그렇게 해석되지도 않는다. 도입 수단은 당업자들에게 잘 알려져 있고 또 여기서도 예시하기로 한다.
이에 따라, 벡터 도입은, 예컨대 생체내에서의 도입 (에: 생체외에서의 유전자 요법)이든 아니면 시험관내에서의 도입이든 효율적으로 이루어질 수 있다. 그 도입수단으로는 엘렉트로포레이션, 형질전환, 형질도입, 접합, 삼부모 교배, 형질도입, 감염, 양이온 지질과의 막 융합, DNA-코팅된 미세발포물에 의한 고속 충격, 인산칼슘-DNA 침전물로 항온배양, 및 이와 유사한 것들이 있다. 이외 다른 수단도 이용가능하며 당업자에게 알려져 있다.
그러나, 상기 벡터 또는 리보자임은 양이온 지질, 예컨대 리포좀과 같은 수단에 의해 도입되는 것이 바람직하다. 리포좀은 상업적으로 구입가능하다. (예: Life Techonlogies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD사에서 제공하는 리포펙틴(상표명), 리포펙타민(상표명), 및 이와 같은 것들). 더욱이, 본 발명에서는 수송 능력이 높고 및/또는 생체내 독성이 낮은 리포좀 (예: PCT 특허 출원 WO 95/21259호)을 사용한다. 리포좀을 투여하기 위해서, PCT 특허 출원 WO 93/23569호에서 확인된 추천을 따라도 좋다. 일반적으로, 상기와 같이 투여를 하면 37℃에서 8시간내에 다수의 임파구에 상기 제제가 포획되고, 정맥 투여한지 1시간 후에 비장에서 주입량의 50% 이상이 검출된다. 이와 유사하게, 다른 운반 수단으로는 하이드로겔과 방출 제어 폴리머가 있다.
숙주 세포내로 도입되는 벡터의 형태는 다양한데, 도입되는 벡터가 생체내에서 도입되는가 아니면 시험관내에서 도입되는가에 따라 일부 좌우된다. 예를 들어, 핵산은 벡터가 게놈외적으로 (즉, 자가 복제 벡터로서) 뷰유되어 있는가, 프로바이러스 또는 프로파아지로서 구성되어 있는가, 복제-결함 또는 조건 복제성 바이러스로서의 용도로서 일시적으로 형질도입 또는 일시적으로 감염되어 있는가, 또는 단일 또는 이중 교차 재조합을 거쳐 숙주 게놈 안으로 안정적으로 도입되어 있는가에 따라서, 폐환형일 수도 있고 봉합형일 수도 있고 또는 선형상일 수도 있다.
숙주내로 도입되기 전에, 본발명의 벡터는 에방 및 치료 방법에 사용되기 위한 다양한 조성물로 제제화될 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 벡터는 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 희석제와 함께 조합되어 약학적 조성물을 형성할 수 있고, 인간 또는 동물에 적용하기 적합하게 제형화될 수 있다.
따라서, 본 발명 방법에 사용되기 위한 조성물은 하나 또는 그 이상의 위에서 언급한 벡터를 포함할 수 있고, 바람직하게는 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 것이다. 약제학적으로 허용가능한 캐리어는 적합한 투여방법과 마찬가지로 당업자에게 잘 알려져 있다. 가장 적절한 캐리어는, 특정 벡터에 의해서 뿐 아니라상기 조성물을 투여하는 특정 방법에 의해서도 일부 결정될 것이다. 당업자도 상기 조성물을 투여하는 다양한 경로가 이용될 수 있다는 것을 이해하고 있을 것이다. 설사 하나 이상의 투여 경로를 이용할 수 있다 하더라도 그 중 하나의 특정 경로가 다른 경로보다 좀더 효과적이로 즉각적으로 반응을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물에 대한 광범위한 제제가 존재한다.
본 발명의 벡터를 단독으로 또는 다른 항바이러스 화합물과 조합하여 포함하고 있는 조성물을, 경구 투여에 적합하도록, 특히 복강내 투여하기에 적합하도록 제제화할 수 있다. 이러한 제제는 항산화제, 완충제, 세균 발육 저해제, 및 투여대상의 혈액과 등장이 될 수 있도록하는 등장화제 용질을 포함하는 액상 또는 비액상의 등장성 멸균 주사용액 일 수 있고, 현탁화제, 용해제, 점증제, 안정화제, 및 보존제를 포함하는 액상 또는 비액상의 멸균 현탁제 일 수도 있다. 상기 제제는 앰플 및 바이알에 담겨져 밀봉된 단위 용량 또는 다회 용량으로 제공될 수 있고, 또 사용전에 바로 예컨대 물과 같은 멸균액만을 첨가하면 되도록 냉동건조되어 있는 상태로 (동결건조) 저장될 수 있다. 여기에서 언급되는 멸균 분말, 조립체, 및 정제를 가지고 즉시 주사할 수 있는 용액 및 현탁제를 제조할 수 있다.
경구 투여에 적합한 제제로는, 물, 식염수, 또는 과일 쥬스와 같은 희석제에 유효량의 화합물이 용해되어 있는 액상 용액: 소정의 활성 성분을 고형 또는 조립체로서 포함하고 있는 캡슐, 1회용량 봉지(sachets), 또는 정제; 액상 용액형태의 용액제 또는 현탁제; 및 수중유형 또는 유중수형 유제 등이 포함된다. 정제 형태로는 하나 또는 그이상이 락토오스, 만니톨, 콘 스타치, 포테이토 스타치, 마이크로크리스탈린 셀룰로오스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드, 크로스카멜로오스 소디움, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 및 기타 다른 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 보습제, 보존제, 향료, 및 약학적으로 허용가능한 보조제를 포함할 수 있다.
흡입을 통해 투여하기에 적합한 에어로졸 제제를 만들 수도 있다. 에러로졸 제제는 압력을 수용할 수 있는 분사제, 즉 디클로로플루오로메탄, 프로판, 니트로겐, 및 이와 유사한 분사제로 충진될 수 있다.
유사하게, 경구 투여에 적합한 제제로는, 수크로오스, 아카시아 ,또는 트라가칸트가 통상 사용되는 향료내에 활성 성분을 포함할 수 있는 로겐즈; 젤라틴과 글리세린, 또는수크로오스와 아카시아와 같은 불활성 기제에 활성 성분을 포함하여 이루어지는 파스틸; 및 적절한 액상 보조제에 활성 성분을 포함하고 있는 구강세척제;가 있고 이외에도, 활성 성분과 함께 당업계에 공지되어 있는 보조제들을 을 포함하여 이루어지는 크림, 유제, 겔, 및 이와 같은 것이 포함된다.
외용제로 적용하기에 적합한 제제로는 크림제, 연고제, 또는 로숀제가 포함된다.
직장에 적용하는 제제로는 예컨대 코코아 버터 또는 살리실레이트로 이루어진 적절한 기제로 되어 있는 좌제가 포함된다. 질내 적용하는 제제로는 활성 성분을 포함하고 이외에도 당업계에 공지된 적절한 보조제를 포함하고 있는 페서리, 탐폰, 크림제, 겔제, 페이스트제, 포말제, 또는 분사제가 포함된다. 유사하게, 활성 성분은 콘돔상에 도포되는 활택제와 결합될 수 도 있다.
동물, 보다 상세하게는 인간에게 투여되는 투여량은, 본 발명의 여러 상황으로 볼 때 감염 개체가 합리적인 시간 틀에 비추어 충분한 치료 반응을 할 수 있도록 하는 양이어야 한다. 투여량은 치료에 이용되는 특정 벡터의 효능, 질병 상태의 심각성, 뿐 아니라 감염 개체의 체중과 연령에 따라 결정될 것이다. 투여량의 크기 역시 이용되는 특정 벡터의 사용으로 인해 수반될 수 있는 부작용이 존재하는 가에 의해 결정될 것이다. 가능하면 언제나 부작용을 최소화 하는 것이 바람직하다.
상기 투여량은 정제 또는 캡슐과 같이 일회용량 형태가 가능하다. 여기서 사용되는 "단위 용량형(unit dosage form)"이란, 인간 및 동물에 일정 단위로 된 용량 형태로 사용하기에 적합하게 물리적으로 구별지어진 단위를 말하는 것으로, 각 단위는 소정량의 벡터를 단독 또는 다른 항바이러스제와 함께 포함하고 있고 약제학적으로 허용되는 희석제, 보조제, 및 약물 캐리어와 관련하여 원하는 효과를 낳기에 충분한 양으로서 산출된다. 본 발명의 단위 용량 형태에 대한 보다 상세한 내용은, 이용되는 특정 화합물 또는 화합물들과 달성하고자 하는 효과 뿐 아니라 숙주 안에서 각 화합물과 관련한 약물동력학에 달려있다. 투여량은 "항바이러스 유효량" 또는 환자 개인에 있어서 "효과 농도"에 도달하기에 필요한 양이어야 한다.
"효과 농도(effective level)"란 바람직한 투여량의 종말점 개념으로사용되는 것이므로, 실제 투여량과 계획은 약물속도론에 있어서의 개인차와, 약물이 분포, 및 대사에 따라 변화될 수 있다. "효과 농도"은 예컨대, 환자에 있어 원하는 혈액농도 또는 조직농도로 정의될 수 있는데, 혈액 또는 조직 농도는, 화학물질의 임상적인 항바이러스 활성을 예측하는 검정에서 HIV와 같은 바이러스를 저해하는, 본 발명에 따른 하나 이상의 벡터(들)의 농도에 상응한다. 본 발명의 화합물의 "효과 농도"는 본 발명의 조성물이 지도부딘 또는 기타 다른 공지의 항바이러스 화합물 또는 이 화합물의 복합체들과 복합 사용되는 때도 변화될 수 있다.
당업자가 환자 개인에 대해 원하는 "효과 농도"를 얻기 위해, 사용하는 조성물의 적합한 투여 용량, 투여 계획, 및 투여 방법을 용이하게 결정하는 것이 가능하다. 또한 당업자가 적절한 환자용 샘풀(예: 혈액 및/또는 조직 샘플)을 직접적으로(예: 분석학적 화학분석) 또는 간접적으로 (예: AIDS 또는 AIDS-유사 질환의 치료에 사용되는, p24 또는 역전사효소와 같은 바이러스 감염 표지를 대신 이용하는 방법) 분석함으로써, 본 발명의 화합물들의 "효과 농도"에 대한 적절한 표지(지시제)를 손쉽게 결정하고 또 사용하는 것이 가능하다.
더욱이, AIDS 또는 AIDS-유사 질환을 치료하기 위한 환자의 체내 유효 농도를 결정하는 것에 관하여, 특히, 적절한 동물 모델을 이용하여 다양한 유전자 요법 프로토콜의 HIV에 대한 생체내 역가를 평가할 수 있고 또 이러한 방법이 널리 실행되어 왔다. (Sarver 등. (1993b), 상기 문헌). 이러한 모델로는 마우스, 원숭이, 및 고양이가 있다. 비록 상기 동물들이 자연적으로는 HIV 질병에 걸리기 쉽지 않더라도, 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs), 림프절, 또는 태아의 간/흉선 조직으로 재구성된 키메릭 마우스 모델 (예: SCID, bg./nu/xid, 골수-제거 BALB/c)은 HIV에 감염될 수 있고 따라서 HIV 병인론과 유전자 요법을 위한 모델로 사용된다. 유사하게는, 유인원 면역 결핍성 바이러스(SIV)/원숭이 모델을 이용할 수도 있고 고양이 면역 결핍성 바이러스(FIV)/고양이 모델역시 이용가능하다.
일반적으로, 벡터의 양은 투여된 리보자임의 조직내 농도가 체중 1킬로그램당 약 50 내지 300 ㎎/day 가되기에 충분한 양이 바람직하고, 더욱 바람직하기로는 체중 1킬로그램당 100 내지 200㎎/day 이 되기에 충분한 양인 것이다. 예를 들어 외용, 안점막 및 질점막 적용 제제에 있어서는 하루에 수회 적용하는 용량이 바람직하다. 더욱이, 투여 횟수는 투여되는 특정 벡터 및 그 운반 수단에 따라 달라질 것이다.
바이러스에 감염된 일부의 환자들을 치료함에 있어서는, "메가-용량" 법을 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 메가 용량법에서는 대량이 벡터가 투여하고 화합물이 작용할 시간을 허용한 후, 그리고 나서 적정량의 시약을 투여해 상기 활성 화합물을 불활성화시킨다. 본 발명의 방법에 있어서는, 치료(즉, 투여된 바이러스와 경쟁하는 벡터의 복제성)가 제한될 수밖에 없다. 다시말해, 예컨대 HIV의 농도가 감소하면, 비리온을 생성하는 HIV에 의존하는 벡터의 농도도 감소할 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은, AIDS를 치료하기 위해 사용될 때 본 발명의 벡터와 함께 다른 약물들을 포함할 수있다. 상기 다른 약물들은 전통적인 방식(즉, HIV 감염을 치료하는 제제로서)으로 사용될 수도 있고, 뿐만 아니라 더욱 상세하게는, 생체내에서 crHIV 바이러스를 선택하는 방법으로 사용될 수 있다. 상기 언급된 선택에 의해, 조건 복제성 HIV 전파가 촉진되고 조건 복제성 HIV가 야생형 HIV와 좀더 효과적으로 경합하여 야생형 HIV의 병원성이 필연적으로 제한되게 한다. 보다 상세하게는, 지도부딘과 같은 항바이러스제가 사용되는 것이 바람직하다고 여겨진다. 앞서 언급된 것에 부가하여 사용될 수 있는 부가적인 약물의 대표적인 예로는, 항바이러스 화합물, 면역조절제, 면역자극제, 항생제, 및 기타 AIDS를 치료하는데 이용될 수 있는 제제 및 치료방법을 포함한다. 항바이러스 화합물로는 ddI, ddC, 간실클로버, 불소화 디데옥시뉴클레오티드, 네비라핀과 같은 비뉴클레오시드 유사체(Shih등., PNAS, 88, 9878-9882 (1991)), R82913과 같은 TIBO 유도체 (White 등., Antiviral Research, 16, 257-266 (1991)), 및 BI-RJ-70 (Shih 등., Am. J. Med., 90(Suppl. 4A), 8S-17S (1991))이 포함된다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 면역조절제 및 면역자극제로는, 여러종류의 인터루킨, CD4, 시토킨, 항체 제제, 혈액 수혈제, 및 세포 수혈제가 포함된다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 항생제로는 항진균제, 항균제, 및 항-뉴모시스티스 카르니제 (anti-Pneumocystis carinii agent)를 포함한다.
그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
항-레트로바이러스제와 함께 바이러스-저해 화합물을 투여하면, 특히 ddC, 지도부딘, ddI, ddA, 또는 항-TAT제와 같이 다른 HIV 단백질질에 대해 반응하는 다른 저해제들과 같이 공지된 RT 저해제들과 함께 바이러스-저해 화합물을 투여하면, 일반적으로 바이러스 라이프 사이클의 모든 단계 또는 대부분의 단계를 저해할 것이다. AIDS 또는 ARC에 사용되는 ddC 및 지도부틴의 용량이 공지되어 있다. ddC의 바이러스 성장억제 농도 범위는 일반적으로 0.05μ㏖ 내지 1.0 μ㏖이다. 체중 1킬로그램당 0.005 내지 0.25 ㎎의 범위이면 대다수의 환자에 있어서 바이러스 성장이 억제된다. 경구 투여를 위한 용량 범위는다소 넓다, 예를 들면 체중 1킬로그램당 0.001 내지 0.25㎎이 2, 4, 6, 8, 및 12등의 시간간격으로 한번에 또는 수회에 걸쳐 투여된다. 바람직하기로는 체중 1킬로그램당 0.01㎎의 ddC가 8시간 간격으로 투여된다. 복합 요법으로 투여되는 경우는, 예컨대 다른 항바이러스 화합물은 본 발명에 따른 벡터로서 동시에 투여되거나 또는 원하는바에 따라 용량이 시간차를 두고 엇갈리게 투여된다. 벡터는 조성물속에 함께 복합되어 있을 수 있다. 복합 요법으로 사용되면 각각의 사용 용량은 어느 하나가 단독으로 사용되는 경우에 비해 용량이 감소할 수 있다.
본 발명의 화합물과 방법은 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명된다. 이들 실시예들은 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것일뿐 본 발명의 범위를 제한하고자하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명에 따른 조건 복제성 감응 벡터 (competent vector)의 구조를 설명하기 위한 것이다. 특히, 본 실시예는 HIV를 기본으로 하는 조건 복제성 벡터, 즉 crHIV 벡터의 구조를 설명하고 있다.
발병학적 관점에서 HIV-1의 가장 두드러진 특징 중 하나는 바이러스의 유전적 변이체들을 생산해낸다는 것이다. 생체내에서의 HIV 변이체들의 급속한 생산은 바이러스가 다아윈의 유전 모델의 근간내에서 고찰될 수 있음을 의미한다 (Coffin, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 176, 143-164 (1992); Coffin, Science, 267, 483-489 (1995) 참조). 이러한 변이체들은 HIV-1 역전사효소 분자에 기인하는데, 이 효소 분자는 바이러스 게놈 RNA로부터 새로이 전사된 프로바이러스에서 돌연변이를 일으킨다. 그러므로, 심각한 장애나 많은 복제 사이클이 없는 생체 조건하에서, 유전적인 변이가 상당한 정도로 발생하여 바이러스 변이체들이 많이 생산된다. 그러나, 야생형이 여전히 우세하게 존재하는데, 이는 비제한적인 조건하에서는 야생형이 선택성면에서 가장 유리하기 때문이다. 그러나, 저해제, 예를 들어 지도부딘 (zidovudine)이 존재하는 경우에는, 선택성면에서 야생형보다 유리한 바이러스 변이체가 선택되어 우세한 종으로 존재하게 될 것이다 (Coffin (1992), (1995) 전술한 문헌 참조). 이를 토대로 하여, 본 발명은 병원성 야생형 HIV-1과 비교하여 선택성면에서 유리한 비병원성 HIV-1 게놈을 제공하는 조건 복제성 바이러스 벡터 전략을 제공한다.
이러한 비병원성의 조건 복제성 HIV (crHIV) 벡터들은 야생형 HIV로 감염된 세포에서만 복제 및 패키징 과정을 수행할 수 있는 결함을 지닌 HIV이다. crHIV 게놈은 병원성 야생형 HIV 바이러스와 경합하여 이들의 부하를 감소시킨다. 감염된 숙주에서 야생형 HIV 바이러스 부하를 감소시키는 효과는 평균예상수명을 증가시킨다. 또한, 감염된 숙주가 야생형 HIV를 비감염 개체에게 전염시키는 능력을 감소시킨다. crHIV와 야생형 HIV-1의 성공적인 경합에는 두가지 인자가 중요하다: (1) 선택성면에서 야생형 HIV 게놈에 비해 crHIV 게놈이 유리하다는 점, 및 (2) 선택성면에서 야생형 HIV를 발현하는 세포에 비해 crHIV를 발현하는 세포가 유리하다는 점 (즉, 선택성면에서 야생형 HIV를 발현하는 세포에 비해 crHIV를 발현하는 세포로부터 crHIV 비리온을 생산하는 것이 유리하다는 점).
crHIV 벡터는 RNA 발현, 이합체화 (dimerization) 및 패키징에 필요한 서열을 포함하지만 기능적인 (즉, 야생형) HIV-1 단백질을 발현하지 않는다는 사실때문에 조건에 따라 복제를 수행한다. crHIV의 선택상의 잇점은, crHIV U5 RNA가 아니라 야생형 HIV 게놈의 U5 영역내의 부위를 절단하는 리보자임 카셋트의 삽입에 의해 부여된 것이다.
벡터에 존재하는 리보자임은 crHIV RNA를 절단하지 못하는데, 그 이유는 crHIV RNA의 U5 영역이 보존된 염기 치환 (다른 HIV 균주에서 존재하는 염기 치환)에 의해 변형됨에 따라 리보자임이 상기 부위에 효과적으로 결합하여 상기 부위를 절단하는 것이 방지되기 때문이다. 또한, crHIV는 비병원성인데, 그 이유는 CD4+ 세포 치사를 일으키는 것으로 알려진 단백질을 코딩하지 않기 때문이다. HIV로 감염된 세포 (crHIV 벡터로 형질감염된 세포)가 활성화될때, 그 세포는 crHIV 게놈의 결함을 보완할 수 있어서 crHIV 자손 비리온이 생산되게 된다.
일반적으로, crHIV 게놈은 완전한 (일부가 아닌) 감염성 HIV 클론인 pNL4-3로부터 제조되었다 (Adachi et al., J. Virol., 59, 284-291 (1986)). 모든 클로닝 반응과 DNA, RNA 및 단백질 조작은 당업자에게 잘 알려진 방법으로서 문헌 (예: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982))에 기재되어 있는 방법을 이용하여 실시되었다. 상기 반응에서 이용된 효소들과 시약들은 상업적인 제조업체 (예, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA; Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, IN)로부터 입수하였으며, 제조업체에서 권장하는 방법에 따라 이용되었다. 또한, 벡터의 보존 관리와 증식은 통상적으로 알려진 방법으로서 문헌 (예: Dropulic' et al. (1992), 전술한 문헌 참조: Dropulic' et al. (1993), 전술한 문헌 참조)에 기재된 방법을 이용하여 이루어졌다.
pNL4-3는 Pst I (전사개시부위로부터 약 +1000 위치에서 gag를 절단함)과 Xho I (전사개시부위로부터 약 +8400 위치에서 nef를 절단함)에 의해 절단되고, 편리한 제한 부위들을 포함하는 폴리링커가 삽입되었다. rev 반응요소 (RRE: rev responsive element)를 포함하는 0.86kb의 Bgl II-Bam HI 단편을 폴리링커에 존재하는 Bam HI 부위에 클로닝하였다. 이러한 조작들에 의해 gag 코딩 영역내의 부위로부터 U3 코딩 영역내의 부위까지 야생형 HIV 게놈에 결손 (deletion)이 일어났다 (즉, nef 유전자 결손). 벡터가 절두상 gag 전사체 (truncated gag transcript)를 생산할 수는 있지만, 완전한 길이의 기능적인 Gag 단백질은 벡터에 의해 생산되지 않는다. 그러나, 본 발명에 따르면 야생형 Gag 기능은 불필요하기 때문에, gag 서열이 돌연변이되어 Gag 단백질이 번역되는 것을 방지할 수 있다.
본 명세서에 기재되어 있는 바와 같은 싱글 또는 멀티플 리보자임을 포함하는 리보자임 카셋트가 Bam HI 부위로부터 하방에 있는 Sal I 부위에 삽입되었다. 이를 위해, 리보자임 서열을 코딩하는 상보적인 데옥시올리고뉴클레오티드를 합성하여 Sal I 부위에 결합시켜 클로닝하였다. crHIV 벡터의 제조에 이용되는 리보자임들은 해머헤드형 리보자임이었다. 이들 리보자임은 22개의 염기쌍으로 이루어진 촉매 영역과 각각 9개의 염기쌍으로 이루어진 두개의 하이브리드화 영역을 포함한다. 리보자임은 U5 RNA 서열의 +115 또는 +133 부위 (즉, 전사개시부위로부터 하방으로의 염기쌍의 수에 상응함)를 표적으로 하고 있다. +115 부위와 +133 부위를 표적으로 하는 리보자임의 하이브리드화 영역과 촉매영역 (밑줄 친 부분)은 다음과 같다:
CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGGCACA ("+115 리보자임")(서열번호:4)
ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC ("+133 리보자임)(서열번호:5)
리보자임 카셋트는 나란하게 위치하고 있는 싱글, 더블 또는 트리플 리보자임으로 이루어져 있다. 싱글 (즉, 도 1b의 "crHIV-1.1" 벡터) 또는 트리플 (예: 도 1e의 "crHIV-1.1" 벡터) 리보자임을 포함하는 벡터들은 U5 HIV RNA의 동일한 부위, +115 부위를 표적으로 한다. 더블 리보자임을 포함하는 벡터들은 +115의 동일한 부위 (예: 도 1c의 "crHIV-1.11" 벡터) 또는 U5 HIV RNA의 서로 다른 부위, +115와 +133 부위를 표적으로 한다 (예: 도 1d의 "crHIV-1.12" 벡터). 이러한 벡터들은 본 명세서에서 "crHIV" 벡터로 총괄적으로 표현된다.
벡터 제조를 완료하기 위해, crHIV 게놈의 U5 영역내의 해머헤드형 리보자임에 의해 인식되는 부위를 돌연변이시킴으로써 crHIV 벡터들에게 리보자임 절단 내성을 부여하였다. 이를 위해, 도 2 (서열번호:2)에 도시된 바와 같은 염기 치환을 포함하고 있는 이중가닥형 올리고뉴클레오티드 (즉, AAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGT GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC (서열번호:14))가 벡터에 변형된 부위를 도입하는데 이용되었다. 보다 상세하게 설명하면, 염기쌍 115 및 133 부위에서 리보자임 하이브리드화 부위 및 절단 부위로 염기 치환이 이루어졌다. 특히, 도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 염기쌍 113, 114, 132, 134 및 142에 돌연변이가 도입되었다. 이러한 부위들은 임의의 돌연변이 (즉, GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드임 (서열번호:15))를 포함하는 것으로 변형될 수 있다. 그러나, 바람직한 것은, 예를 들어 +113 부위에서 G가 A로 되는 치환 (즉, 서열이 GTGTGCCCATCTGT TGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC (서열번호:16)를 포함하도록 함), +114 부위에서 U (즉, DNA 서열로는 T)가 C로 되는 치환 (서열번호:6), +132 부위에서 U (즉, DNA 서열로는 T)가 C로 되는 치환 (서열번호:7), +134 부위에서 A가 G로 되는 치환 (즉, 서열이 GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC (서열번호:17)를 포함하도록 함), +142 부위에서 U (DNA 서열로는 T)가 A로 되는 치환 (즉, 서열이 GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGAAC (서열번호:18)를 포함하도록 함)이 일어나도록 돌연변이되는 것인데, 이러한 돌연변이들은 단독으로 또는 조합된 형태로 이루어질 수 있다. 특히, 다른 U5 돌연변이가 없는 경우에 crHIV U5 RNA에서 +114 부위에서 U (DNA 서열로는 T)가 C로 되는 치환 (서열번호:6) 및/또는 +132 부위에서의 U가 C로 되는 치환 (서열번호:7)은 리보자임에 의한 절단을 방지한다 (Uhlenbeck (1987), 전술한 문헌 참조). 삽입된 염기-치환체들은 HIV의 여러 가지 다른 균주에서도 존재하는데 (Myers et al, HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), 이는 이러한 치환들이 HIV 게놈의 복제능력을 감소시키지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 방법들은 다른 조건 복제성 벡터들을 제조하는데도 이용될 수 있는데, 그 예로는 다른 바이러스 게놈 (예: 다른 RNA 바이러스들)을 포함하는 것 또는 유전적으로 다른 항 바이러스제를 포함하는 것이 있다. 또한, 조건 복제성 벡터는, 그 벡터가 도입되어 있는 숙주 세포에게 야생형 바이러스를 포함하는 숙주 세포와 비교하여 선택상의 잇점을 부여하도록, 추가적으로 더 변형될 수 있다. 예를 들어, 이러한 벡터는 추가적으로 변형되어 다종약물 내성이나 또는 돌연변이된 프로테아제 또는 역전사효소를 제공할 수 있다.
실시예 2
본 실시예는 조건 복제성 벡터, 특히 crHIV 벡터의 리보자임 절단 내성을 설명하기 위한 것이다.
crHIV 벡터의 리보자임 절단 내성을 알아보기 위해, 시험관내에서 전사를 실시하였다. 이를 위해, 리보자임 서열을 pBluescript KSII (Stratagene, La Jolla, CA)의 Xho I 부위에 클로닝하였다. 마찬가지 방법으로, 돌연변이된 crHIV U5 영역을 가지고 있는 0.21kb의 Bgl II 단편을 crHIV 벡터로부터 절단하여 pBluescript KSII의 Bam HI 부위에 삽입시켰다. 그 결과 형성된 변형된 pBluescript KSII벡터를 시험관내 전사에 앞서서 Bss HII를 이용하여 선형화시켰다. 야생형 HIV U5 RNA를 발현하는 유사한 플라스미드 (Myers et al. (1994), 전술한 문헌 참조)를 대조군으로서 이용하였다. 시험관내 전사에 앞서서, 대조군 플라스미드를 Eco RI을 이용하여 선형화시켰다.
문헌에 기재되어 있는 방법 (Dropulic' et al. (1992), 전술한 문헌 참조)에 따라 벡터를 시험관내에서 전사시킴으로써 방사성 표지된 U5 HIV RNA와 리보자임 RNA를 만들었다. 방사성 표지된 전사체들을 1X 전사용 완충용액 (40mM Tris-HCl, pH 7.5, 6mM MgCl2, 2mM 스퍼미딘, 10mM NaCl) 중에서 함께 배양하였다 (표적:리보자임의 몰비는 1:2로 함). 샘플들을 65℃로 가열한 다음, 반응 중지용 완충용액 (95% 포름아미드, 20mM EDTA, 0.05% 프로모페놀 블루, 0.05% 크실렌 시아놀 FF)을 첨가하기 전에 5분간 37℃로 냉각하였다. 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)법을 이용하여 생성물을 분리, 분석한 다음 오토라디오그래피로 검출하였다.
도 3으로부터 알 수 있듯이, 야생형 U5-HIV RNA (도 3, 레인 1)를 +115 부위에 대한 싱글 리보자임을 포함하는 전사체 (도 3, 레인 2)와 함께 배양한 경우에 절단이 일어난 것이 쉽게 관찰되었다 (도 3, 레인 3). 이러한 절단으로 인해 생성물 PI과 P2가 생성된다. 야생형 HIV RNA가 동일한 부위 (도 3, 레인 4와 5) 또는 다른 부위 (도 3, 레인 6과 7)에 대한 더블 리보자임을 포함하는 RNA와 함께 배양된 경우에도 역시 절단이 관찰될 수 있다. 두 개의 다른 부위와 관련된 리보자임-함유 전사체가 야생형 HIV RNA와 함께 배양된 경우에는, 생성물 P1, P2 및 P3가 생산되었다. P3는 +133 부위에서의 절단으로 인해 만들어진 것이다.
반면, 변형된 U5-함유 crHIV RNA (도 3, 레인 1)를 +115 부위에 대한 싱글 리보자임 또는 +115 부위 또는 +133 부위에 대한 더블 리보자임과 함께 배양한 경우에는 절단 생성물이 검출되지 않았다 (도 3, 레인 10, 12 및 14). 그러므로, 이러한 실험 결과들은, crHIV U5 RNA는 리보자임 절단에 대해 내성을 나타내지만 야생형 HIV-U5 RNA는 안티-U5 리보자임에 의해 절단된다는 것을 확실하게 보여주고 있다. 또한, 이러한 실험 결과들은, 본 발명의 방법이 (crHIV 벡터 이외의 벡터를 포함하여) 조건 복제성 벡터들에게, 이들 벡터가 숙주 세포로 도입될 때 야생형 바이러스와 비교하여 선택상의 잇점을 부여하는데 이용될 수 있다는 것을 확실하게 보여주는 것이다.
실시예 3
본 실시예는 리보자임을 가지고 있는 조건 복제성 벡터가 야생형 바이러스 RNA를 세포내에서 절단할 수 있다는 것을 보여주기 위한 것이다. 특히, 본 실시예는 crHIV 벡터가 세포내에서 야생형 바이러스 RNA를 절단할 수 있다는 것을 보여준다.
crHIV 벡터에 의한 야생형 HIV 저해에 대한 효과는 게놈들을 주르켓 세포에 공동형질감염시킴으로써 시험되었다. 형질감염은, Opti-MEM 배지 (Lefe Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 중에서 약 106개의 주르켓 세포들을 세척한 다음, 약 0.6㎕의 야생형 HIV DNA (즉, pNL4-3)와 약 1.8㎕의 crHIV DNA를 이용하여 공동형질감염시킴으로써 이루어졌다. 야생형 HIV:crHIV 프로바이러스의 몰비를 약 1:3으로 하여, 모든 세포들이 야생형 HIV와 crHIV 프로바이러스로 형질감염되도록 하였다. DNA를 리포펙틴 (lipofectin) 용액 (Life Technologies)과 30분 동안 혼합한 다음 약 3-6시간 동안 주르켓 세포와 함께 배양하고, 이어서, 태중 송아지 혈청 (FBS: fetal bovine serum) 10%를 포함하는 완전 RPMI 1640 배지를 첨가하였다. 바이러스가 포함된 상등액을 2-4일마다 수확하여 문헌에 기재된 방법 (Dropulic' et al. (1992), 전술한 문헌 참조)에 따라 세포 상등액내의 역전사효소 활성에 의해 바이러스 농도를 분석하였다.
야생형 HIV 복제에 미치는 crHIV 게놈의 효과가 도 4에 도시되어 있다. 야생형 HIV가 crHIV-1.1과 함께 공동형질감염된 경우에는 (도 4, □-□로 표시된 그래프), 야생형 HIV와 대조군 바이러스가 공동형질감염된 세포 (도 4, ■-■로 표시된 그래프)에 비해 바이러스 성장이 지연되기는 하였지만 저해되지는 않았다. 함께 공존하여 위치하는 조건하에서는, 안티-U5 리보자임이 HIV 복제를 저해할 수 있기 때문에 (Dropulic' et al. (1992), 전술한 문헌 참조), 관찰되는 바이러스 성장은 다음의: (a) 자손 비리온으로의 야생형 HIV RNA의 우선적 패키징, (b) 리보자임 절단에 대해 내성을 갖는 야생형 HIV RNA의 생산, 또는 (c) crHIV RNA에 비기능적 리보자임 축적 중 어느 한가지 현상의 결과로 나타난 것일 수 있다.
"일탈 (escape)" 바이러스 성장의 성질에 대해서는 더블 리보자임을 포함하는 crHIV 벡터와 야생형 HIV를 공동형질감염시킴으로써 알아보았다. 야생형 HIV의 우선적 패키징이 바이러스 성장을 이끄는 것이라면, 더블 리보자임 crHIV를 포함하는 배양물이 싱글 리보자임 crHIV를 포함하는 배양물과 유사한 성장 카이네틱스를 보여야 한다. 그러나, 바이러스 성장이 리보자임에 대해 내성을 가지게 되는 야생형 HIV RNA에 의한 것이라면 (즉, 바이러스 역전사효소의 잘못된 작용의 결과), 바이러스 성장 카이네틱스는 crHIV-1.11 (즉, 단일 바이러스 부위와 관련된 것)을 포함하는 배양물에 비해 crHIV-1.12 (즉, 두 개의 바이러스 부위와 관련된 것)를 포함하는 배양물이 보다 지연되는 것으로 나타나야 한다. 또한, 바이러스 성장의 지연이 다른 더블 리보자임 함유 crHIV를 포함하는 배양물에서 현저한 것으로 나타났다면, 이는 단일 발현된 리보자임의 일부가 생체내에서는 비기능적임을 의미하는 것이다.
도 4로부터 알 수 있듯이, crHIV-1.11 (도 4,로 표시된 그래프) 또는 crHIV-1.12 (도 4,로 표시된 그래프)를 포함하는 배양물들은 crHIV-1.1 (단일 전사된 리보자임을 포함함, 도 4에서 ?-?로표시된 그래프)에 비해 바이러스 성장 개시점에서 성장이 지연되는 것으로 나타났다. 그러나, crHIV-1.11과 crHIV-1.12에서 바이러스의 성장 개시점에서의 성장 지연은 비슷하였는데, 이는 제3의 가능성이 옳다는 것, 즉, 단일 전사된 리보자임이 더블 리보자임보다 타겟 RNA를 절단하는 성능면에서 덜 효과적이라는 것을 의미한다. 이는, 공동형질감염 실험이 리보자임 함유 crHIV 게놈이 과잉으로 존재하는 조건에서 이루어졌기 때문에, 세포내 전사된 리보자임의 어느 정도는 비기능적인 잘못된 폴딩 (folding)으로 된 구조로 형성될 수도 있음을 시사한다.
야생형 HIV RNA와 관련된 기능적 리보자임의 비율을 보다 증가시킴으로써 상기 제한사항을 해결할 수 있는 멀티플 리보자임의 능력에 대해 실험하였다. 이러한 실험을 위해, +115 부위에 대해 트리플 리보자임을 포함하는 crHIV-1.111과 야생형 HIV를 주르켓 세포에 공동형질감염시켰다. 도 5 ()에서 알 수 있듯이, 22일동안 배양을 실시한 경우에도 트리플 리보자임을 이용한 경우에는 바이러스 성장에 대한 증가가 없다. 이러한 결과들은 HIV로 감염된 직후 (약 1주일 후), 정상적인 1차 T 세포가 흔히 죽게 되는 사실면에서 특별한 의미가 있다.
또한, 상기 결과들은 crHIV 벡터와 같은 리보자임 함유-조건 복제성 벡터들, 특히 멀티플 리보자임을 포함하는 벡터들이 HIV와 같은 야생형 바이러스 게놈과 세포내에서 경쟁하는데 이용될 수 있다는 것을 확실하게 보여주는 것이다
실시예 4
본 실시예는 리보자임 함유-조건 복제성 벡터, 특히 crHIV 벡터가 세포내에서 야생형 바이러스 RNA를 절단하는 능력을 나타내는 근간이 되는 메카니즘을 알아보기 위한 것이다.
이러한 실험을 위해, 야생형 HIV와 crHIV-1.111이 공동형질감염된 배양물로부터 얻은 세포 상등액 RNA를 본 명세서에 기재되어 있는 역전사 폴리머라제 체인 반응 (RT-PCR)을 이용하여 분석하였다. 도 6a 내지 6c에 도시된 프라이머들을 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 즉, 프라이머 R1과 R2를 이용하여 리보자임 RNA를 검출하고, 프라이머 V1과 V3를 이용하여 야생형 HIV RNA를 검출하고, 프라이머 V2와 V3를 이용하여 crHIV RNA를 검출하였다. 프라이머 R1 (TGTGACGTCGACCACACAACACTGATG (서열번호:8))과 R2 (TGTGACGTCGACTCTAGATGTGCCCGTTTCGGC (서열번호:9))는 각각 Sal I 제한부위를 포함하며, 리보자임 하이브리드화 서열에 결합함으로써 안티-U5 리보자임 RNA를 증폭시킨다. crHIV-1.111를 발현하는 세포에서, 싱글, 더블 및 트리플 리보자임 증폭 생성물이 관찰된다. 프라이머 V1 (GGTTAAGCTTGAATTAGCCCTTCC AGTCCCC (서열번호:10))과 V2 (GGTTGGATCCGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG (서열번호:11))는 각각 Bam HI 또는 Hind III 제한 부위를 포함하며, 야생형 HIV RNA를 증폭시킨다. 전술한 V1 프라이머와 마찬가지로, V3 (CGGATCCACGCGTGTCGACGAGCTCCCATGGTGATCAG (서열번호:12) 프라이머는 Bam HI과 다른 제한 부위들을 포함한다. 이 프라이머 셋트는 crHIV-특이적 폴리링커 서열로부터 crHIV RNA를 증폭시킨다.
RT-PCR을 수행하기 위해, 비리온과 세포내 RNA를 트리졸 (TrizolTM, Life Technologies)을 이용하여 분리하였다. 세포내 바이러스 RNA는 미세원심분리된 세포 펠릿으로부터 직접 분리하였다. 비리온 RNA는 먼저 12,000g로 5분간 미세원심분리하여 세포와 세포 파편들을 제거하고 얻은 상등액으로부터 분리하였다. 무세포 상등액에 트리졸을 첨가한 다음, 클로로포름을 첨가하여 상 분리를 일으키기에 앞서서, 그 혼합물을 5분간 배양하였다. 수상을 새로운 튜브에 옮기고, 이소프로판올을 이용하여 RNA를 침전시켰다. RNA 펠릿을 재차 제조한 후, 바이러스 RNA를 역전사시킨 다음 방사성 표지된 프라이머를 이용하여 PCR법으로 증폭시켰다.
이러한 실험을 위해, 제1-스트랜드 완충용액 (50mM Tris-HCl, pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM dNTPs, 20유니트의 RNase 저해제)에 25유니트의 MuLV 역전사효소를 첨가한 용액을 이용하여 42℃에서 1시간동안 역전사를 실시하였다. 역전사를 완료한 후, 65℃에서 10분동안 가열하여 역전사효소를 불활성화시켰다. 이렇게 하여 얻은 혼합물 전체를 PCR 완충용액에 직접 첨가하여, 최종농도가 10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2인 혼합물을 얻었다. 2.5유니트의 Taq 효소를 이용하여 이 혼합물을 30회 증폭시켰다. 방사성 표지된 PCR 생성물에 대해 PAGE를 이용하여 분리, 분석하여 오토라디오그래피 방법으로 검출하였다.
도 7 (레인 4)에 도시되어 있는 바와 같이, 야생형 HIV-1과 crHIV-1.111 프로바이러스 게놈으로 공동형질감염되어 20일 이상 경과한 후에도 crHIV-1.111 리보자임 RNA가 세포의 상등액에 존재한다. 이는, 싱글, 더블, 트리플 리보자임 RNA PCR 생성물의 존재에 의해 증명이 된다. 이와는 달리, 대조군 야생형, HIV-형질감염된 배양물 (레인 2)에 의해서는 상기와 같은 생성물이 비리온에서 관찰되지 않는다. 이 기간동안, 세포는 정상적인 것으로 보였으며, crHIV-유도성 세포독성의 흔적은 나타나지 않았다. 이는, 역전사효소 활성이 관찰되지 않는다하더라도 crHIV가 바이러스 입자내로 패키징된다는 것을 확실하게 보여주는 것이다. 또한, HIV 유전자 기능에 의해 crHIV가 세포내에서 보완될 수 있다는 것을 의미하기도 한다.
그러므로, 상기 결과들은 crHIV가 야생형 HIV 전파를 저해함으로써 야생형 HIV 복제를 저해한다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 결과들은 또한 예를 들어 다른 바이러스 벡터 및/또는 다른 유전적 항바이러스제를 포함하는 벡터와 같은 다른 조건 복제성 벡터가 야생형 바이러스 복제 및 전파를 저해하는데 마찬가지로 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5
본 실시예는 리보자임 함유-조건 복제성 벡터, 특히 crHIV 벡터가 세포내에서 야생형 바이러스 RNA를 절단하는 능력을 나타내는 근간이 되는 메카니즘을 보다 상세히 알아보기 위한 것이다.
가능한 메카니즘 중의 하나는 야생형 HIV와 crHIV RNA가 모두 자손 비리온내로 패키징되고, 리보자임과 표적 RNA의 공존으로 인해 이렇게 작은 바이러스내에서 절단이 효율적으로 일어난다는 것이다. 다른 방법으로는, 야생형 HIV RNA의 절단이 HIV 비리온에서는 일어나지 않고 세포내에서 우선적으로 발생되므로 자손 비리온내로 crHIV RNA가 선택적으로 패키징될 수 있는 방법이 있다. 이들 메카니즘에 대해 조사하였다.
crHIV-1.111이 야생형 HIV 전파를 저해하는 방법은, 야생형 HIV만으로 감염된 경우 (도 8, 레인 2와 6), 또는 야생형 HIV와 crHIV-1.111이 공동형질감염된 경우의 세포 배양물에서, 비리온- 및 세포-관련 바이러스 RNA의 RT-PCR 방법으로 조사하였다. crHIV-1.111 RNA는 공동형질감염 (도 8, 레인 4)으로 제조되는 자손 비리온에서만 존재하였다. 반면, 대조군 야생형 HIV-형질감염 배양물은 야생형 HIV RNA만을 포함하는 비리온을 생산하였다 (도 8, 레인 2). 세포내에서는, 야생형 HIV와 crHIV-1.111 RNA가 모두 공동형질감염된 배양물에 존재하고 있었다 (도 8, 레인 8). 그러므로, 야생형 HIV와 crHIV RNA가 모두 세포내에서 합성된다고 하더라도, crHIV RNA가 자손 비리온내로 선택적으로 패키징된다. 이러한 사실은, crHIV-1.111이 캡시드화 단계에 앞서서 게놈성 야생형 HIV RNA를 선택적으로 절단함으로써 야생형 HIV 전파를 저해하기는 하지만, 일부 써브게놈성 야생형 RNA가 비리온 생산을 위한 단백질로 번역될 수 있게 한다는 것을 시사한다.
게놈성 야생형 RNA가 crHIV RNA에 의해 선택적으로 절단되는 지의 여부를 알아보기 위하여, 공동형질감염으로부터 약 20일 후에 얻은 주르켓 세포 배양물에 존재하는 새포내 RNA의 유형을 노던 하이브리드화 방법에 따라 분석하였다. 도 6에 도시되어 있는, 노던 블롯 분석법에 이용된 프로브는 pNL4-3의 U5 영역으로부터의 0.21kb Bgl II 단편으로부터 분리하였다.
이들 실험 결과들이 도 9에 도시되어 있다. 야생형 HIV로 형질감염된 배양물은 모든 종, 즉 게놈 및 써브게놈성 RNA 종과 같은 야생형 HIV RNA를 발현하였다 (도 9, 레인 1). 반면, crHIV-1.111와 함께 공동형질감염된 배양물들은 그다지 많은 양의 게놈성 (9.7kb), 야생형 HIV RNA (도 9, 레인 2)를 발현하지는 않는다. 저분자량의 RNA (써브게놈성 야생형 HIV RNA의 존재를 반영함)는 공동형질감염된 배양물에서 관찰되었다 (도 9, 레인 2). 이들 샘플에 HIV-RNA가 존재하는 것은 분해된 일부 게놈성 HIV RNA가 이들 저분자량 RNA에 존재할 수 있다는 것을 시사한다. 반면, 대조군 야생형 HIV 세포에 야생형 HIV RNA가 존재하는 것은 HIV 감염 후기에 관찰되는 상당량의 CPE로부터 발생되는 RNA 분해 때문이다.
따라서, 이러한 결과들은 야생형 HIV와 crHIV-1.111 게놈을 포함하는 세포에서 게놈성 야생형 HIV RNA가 선택적으로 절단되고 분해되어, crHIV RNA가 비리온내로 선택적으로 패키징될 수 있도록 하는 것을 확실하게 보여주는 것이다. 또한, 이러한 결과들은 본 발명의 방법이 다른 바이러스들, 특히 다른 RNA 바이러스에 대해서도 마찬가지로 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6
본 실시예는 리보자임을 포함하는, 조건 복제성 벡터, 특히 crHIV 벡터가 야생형 헬퍼 바이러스의 존재하에서 완전한 바이러스 복제 사이클을 거치게 되는 것을 보여주기 위한 것이다.
crHIV 게놈이 헬퍼 야생형 HIV 게놈의 존재하에서 완전한 바이러스 복제 사이클을 거치는 지의 여부를 알아보기 위하여, crHIV 게놈을 포함하는 바이러스 입자의 생산에 대해 여러 가지 조건하에서 실험하였다. 보다 구체적으로 설명하면, 먼저 활성화된 ACH2 세포 (AIDS Reahent Reference Program, Rockville, Maryland)를 이용하여, crHIV 게놈을 포함하는 바이러스 입자의 생산 여부에 대해 실험하였다. 이들 세포들은 잠재적으로 HIV-1 감염된 세포계를 포함한다. 이어서, 상기 배양물에서 유래된 임의의 crHIV 입자가, 감염되지 않은 주르켓 세포를 감염시켜 crHIV DNA를 생산하는 지의 여부에 대해 조사하였다.
이러한 실험을 위해, 약 106개의 ACH2 세포를 약 2.6㎕의 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 약 24시간이 경과한 다음 50nM 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트 (TPA)를 이용하여 세포를 자극하였다. 형질감염 후 약 72시간이 경과한 다음 세포 상등액으로부터 RNA를 분리하였다. 실시예 4에 기재되어 있는 방법에 따라 R1 및 R2 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 도 10a에 나타나 있는 바와 같이, crHIV-1.11 (레인 4)로 형질감염된 후 활성화된 ACH2 세포에 의해 생산되는 비리온에서 crHIV 리보자임 RNA가 검출되었지만, pGEM 3Z 대조군 플라스미드 (Promega, Madison, WI) (레인 2)로 감염된 것에서는 검출되지 않았다. 그러므로, 감염된 CD4+ 세포에 crHIV 벡터를 형질감염시킨 경우에는 crHIV RNA를 포함하는 바이러스 입자가 생산된다.
이어서, 이러한 배양물로부터 유래된 crHIV 비리온이 감염되지 않은 주르켓 세포를 감염시켜 crHIV 프로바이러스를 생산하는 지의 여부에 대해 조사하였다. 이러한 프로바이러스들은, 트리졸을 이용하여 세포내 DNA를 분리하고 Eco RI을 이용하여 DNA를 절단한 다음, 실시예 4에 기재되어 있는 방법에 따라 R1 및 R2 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의해 리보자임 DNA를 증폭시키는 방법에 의해, 검출되었다. 도 10b는 crHIV-형질감염된 ACH2 세포로부터 얻은 세포 상등액을 감염시킨 후, 주르켓 세포에서 crHIV DNA가 생산되는 것을 보여주고 있다. 즉, 이 경우, crHIV-1.11 리보자임 DNA의 특이적인 증폭이 관찰되었다 (도 10b, 레인 2). 반면, 자극된 ACH2 세포 상등액만으로 감염된 세포 (즉, ACH2 세포를 crHIV-1.111로 전혀 감염시키지 않은 경우)에서는 리보자임 DNA 생성물이 발견되지 않았다 (도 10c, 레인 1).
crHIV 벡터는 야생형 헬퍼 HIV 게놈이 존재하는 경우에만 전파되므로, 야생형 HIV로 감염 후 crHIV 게놈을 포함하는 감염되지 않은 세포가 구제될 수 있는 지의 여부를 조사하였다. 이러한 실험들은 먼저 세포를 crHIV-1.11 (crHIV 벡터의 전형적인 예)로 형질감염시킨 다음, 야생형 HIV (즉, pNL4-3)로 재감염시킴으로써 이루어졌다. 따라서, 약 106개의 주르켓 세포를 약 2.5㎕의 crHIV DNA로 형질감염시켰다. 야생형 HIV 스톡 바이러스로 감염시키기에 앞서서 약 72시간 동안 상기 세포들이 성장할 수 있도록 하였다. crHIV-1.11로 형질감염된 주르켓 세포를 37℃에서 약 2시간동안 스톡 pNL4-3 (2x105TCID50유니트/106세포)과 함께 배양한 다음, 배지 (Opti-MEMTMI Reduced Serum Medium)로 3회 세척하고, 완전 배지 (RPMI 1640 + 10% FBS)에 재현탁시켰다. 실시예 4에 기재되어 있는 방법에 따라 감염 후 약 5일이 경과한 다음 RNA를 세포 상등액으로부터 분리하였다.
TCID50분석을 위해 HIV를 함유하는 상등액을 5-폴르 제한희석법 (5-fold limiting dilution)에 따라 희석하여 96-웰 플레이트에 도말하였다. 희석된 바이러스 현탁액에 약 104개의 MT4 세포 (AIDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland; Harada et al., Science, 229, 563-566 (1985))를 첨가하고, 그 결과 형성된 현탁액을 완전한 바이러스 성장이 일어날때까지 7일동안 배양하였다. MT4 세포는 HTLV-1으로부터의 Tax 유전자를 포함하는, 변형된 T-세포인데, Tax 유전자는 HIV-1의 Tat와 유사한 트랜스액티베이터 (transactivator) 유전자이다. 역전사효소 활성에 대해 상등액을 조사하였다 (Dropulic' et al. (1992), 전술한 문헌 참조). 조직배양 감염양 (TCID50: Tissue culture infectious dose)은 리드 등의 방법에 따라 측정하였다 (Reed and Muench: In: Tech. in HIV Res., Johnson et al., eds., Stockton Press, 71-76 (1990)).
crHIV-형질감염된 주르켓 세포를 야생형 HIV로 재감염시키게 되면, crHIV 게놈이 바이러스 입자내로 구제된다 (도 10c, 레인 4). crHIV 게놈은 야생형 HIV에 의한 재감염 후 바이러스 입자로 패키징된다. 이 기간동안, 세포는 정상적으로 보였으며, 세포독성의 징후는 없었다.
이러한 결과들은 crHIV 게놈이 야생형 HIV 헬퍼 바이러스에 의한 상보작용 후 완전한 복제 사이클을 수행할 수 있다는 것을 확실하게 보여주는 것이다. 이러한 결과들은 또한 다른 바이러스 게놈도 마찬가지 방식으로 대응하는 야생형 바이러스에 의한 상보작용 후 완전한 복제 사이클을 수행할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 7
본 실시예는 전술한 실시예에 언급되어 있는 일탈 바이러스 성장의 성질에 관한 것이다.
야생형 HIV로 형질감염된, 또는 야생형 HIV와 crHIV-1.11로 공동형질감염된 배양물로부터 일탈 바이러스 성장의 성질을 조사하기 위해 전술한 바와 같이 RT-PCR을 이용하여 비리온 RNA를 분석하였다. 바이러스 성장 초기에 배양물에 의해 생산되는 바이러스는 (즉, 야생형 HIV로 형질감염된 배양물의 경우는 +11일, crHIV-1.11와 함께 공동형질감염된 배양물의 경우는 +19일), crHIV RNA를 우점종으로서 포함하였다 (도 11; 야생형 HIV로 형질감염된 배양물, 레인 2, crHIV-1.11과 함께 공동형질감염된 배양물, 레인 4). 반면, 여러 가지 성장의 후기단계에 있는 배양물은 (즉, 야생형 HIV로 형질감염된 배양물의 경우는 +17일, crHIV-1.11와 함께 공동형질감염된 배양물의 경우는 +23일), 야생형 HIV RNA를 우점종으로서 포함하였다 (도 11; 야생형 HIV로 형질감염된 배양물, 레인 6, crHIV-1.11과 함께 공동형질감염된 배양물, 레인 8). 그러므로, 야생형 HIV와 crHIV-1.11 프로바이러스 (도 11, 레인 4, 8)로 공동형질감염된 세포에서의 바이러스 성장은 세포내 리보자임 절단으로 인해 일탈된 야생형 HIV의 성장에 기인하는 것으로 나타났다. 중요한 것은, crHIV 게놈이 바이러스 성장의 후기단계의 배양물에서도 여전히 전체 HIV 게놈의 상당한 부분을 포함한다는 것이다. 이는, 야생형 HIV 게놈이 우세하게 존재하고 있다고 하더라도, crHIV가 비록 야생형 HIV 게놈보다 낮은 효율이기는 해도 배양물을 통해 전파되었다는 것을 의미한다.
이는, 다른 조건 복제성 벡터와 마찬가지로 crHIV 벡터도 바이러스 복제에 대해 야생형 바이러스 게놈과 효과적으로 경쟁할 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 8
본 실시예는 전술한 실시예에 언급되어 있는 일탈 바이러스 성장의 성질에 관한 것이다.
일탈 바이러스 성장기간 중 crHIV가 비리온내로 패키징되는 효과를 감염성 야생형 HIV 역가를 측정함으로써 조사하였다. 바이러스 성장의 지수기에 있는 배양물 (즉, 야생형 HIV 배양물의 경우는 +14일, crHIV-1.1 배양물의 경우는 +16일, crHIV-1.11 또는 crHIV-1.12 배양물의 경우는 +20일)로부터 얻은 바이러스 상등액에 대해 제한희석법에 따른 TCID50분석 (실시예 6에 기재된 방법에 따름)을 실시하였다. 역전사효소 활성을 이용하여 분석하기에 앞서서 샘플을 노말화시켰다. 야생형 HIV, crHIV-1.1, crHIV-1.11 및 crHIV-1.12 배양물로부터 얻은 상등액들의 감염량 (infectious dose)은 각각 1.3x104TCID50/ml, 5.4x103TCID50/ml, 3.8x103TCID50/ml 및 3.8x103TCID50/ml 이었다. 그러므로, 일탈 바이러스 성장기간 중의 crHIV RNA의 비리온내로의 패키징은 생산되는 감염성 야생형 HIV 입자의 수를 감소시키는 결과를 초래한다.
이어서, 감염성 야생형 HIV 역가의 감소가 일탈 비리온내에서의 야생형 HIV RNA의 절단에 기인하는 것인 지의 여부를 알아보기 위해 조사하였다. 공동형질감염된 세포의 상등액에 존재하는 비리온으로부터 얻은 RNA 절단 생성물들에 대해 프라이머 연장방법을 이용하여 분석하였다. 실시예 6에 도시되어 있는 PE 프라이머 (GGTTAAGCTTGTCGCCGCCCCTCGCCTCTTG (서열번호:13))를 이용하였는데, 이 프라이머는 Hind III 제한부위를 포함한다. 42℃에서 2시간 동안 절단 부위를 가로질러 프라이머 연장실험을 실시하였는데, 이때 제1-스트랜드 완충용액 (50mM Tris-HCl, pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM dNTPs, 20유니트의 RNase 저해제)에 25유니트의 MuLV 역전사효소를 첨가한 용액을 이용하였다. crHIV 공동형질감염된 배양물로부터 유래된 농축된 비리온 생성물로부터 바이러스 RNA를 분리하였다. 4℃에서 2,000g로 15분간 원심분리시킴으로써 세포와 그 파편들을 제거하였다. 이어서 4℃에서 30,000g로 4시간동안 초원심분리시켜 바이러스를 농축하였다. 그런 다음 전술한 방법에 따라 트리졸을 이용하여 바이러스 펠릿으로부터 바이러스 RNA를 분리하였다.
바이러스 성장의 후기단계에 있는, 야생형, HIV-형질감염된 배양물 및 crHIV-1.11과 함께 공동형질감염된 배양물 상등액 (즉, 야생형 HIV로 형질감염된 배양물의 경우는 +17일, crHIV-1.11과 함께 공동형질감염된 배양물의 경우는 +23일)으로부터 바이러스 RNA를 분리하였다. 도 12에 도시되어 있듯이, 이러한 배양물의 비리온들은 야생형 HIV와 crHIV 게놈성 RNA를 모두 포함하고 있었다. 야생형 HIV로 형질감염된 경우 (도 12, 레인 1)와 crHIV-1.11과 함께 공동형질감염된 경우 (도 12, 레인 2) 모두 완전한 길이의, 프라이머-연장된 cDNA가 관찰되었다. U5 RNA 절단으로 초래된 것일 수 있는 작은 cDNA는, 프라이머 연장 실험이 광범위하게 실시되었음에도 불구하고 검출되지 않았다. 그러므로, 감염성 야생형 HIV 역가의 감소는 야생형 HIV RNA의 바이러스내 절단에 의한 것이 아니라 자손 비리온에서 crHIV RNA가 다량으로 치환되었기 때문에 생긴 것이다.
따라서, 이러한 결과들은 본 명세서에 기재된 방법들이 본 발명에 따른 조건 복제성 벡터를 이용하여, 자손 비리온으로부터 HIV 게놈 및 다른 게놈 등의 야생형 게놈을 전위시키는데 이용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 9
본 실시예는 플라스미드 또는 재조합 crHIV-1.111 바이러스 투여 후, crHIV 벡터가 야생형 HIV 복제를 저해하는 것을 설명하기 위한 것이다.
주르켓 세포를 스톡 HIV (클론 pNL4-3)로 감염시킨 다음 다시 (1) crHIV-1.111을 포함하는 플라스미드 DNA 또는 (2) 293 세포에 패키징된 재조합 crHIV-1.111 바이러스, 즉 돌연변이 crHIV-1.M (Nadlini et al., Science, 272, 263-267 (1998))를 투여하였다. 이들 세포에 대해, DLS 지방-중재형 형질감염 (DLS lipid-mediated transfection) (Thierry et al., PNAS, 92, 9742-9746 (1995)) 또는 crHIV-중재형 전달을 실시하였다. HIV로 처음 감염시킨 후 12일이 경과한 다음 역전사효소 분석법을 이용하여 바이러스 복제에 대해 조사하였다. 야생형 양성 대조군 배양물은 정상 수준의 야생형 HIV 성장을 보여주었다. 야생형 HIV로 감염된 세포에 대해 돌연변이 crHIV-1.M을 DLS-중재형 형질감염시킨 경우에는 야생형 HIV 바이러스 성장에 아무런 영향이 없었다. 반면, 야생형 HIV로 감염된 세포에 대해 안티-HIV 리보자임을 코딩하는 crHIV-1.111을 DLS-중재형 형질감염방법으로 투여한 경우에는 야생형 HIV 바이러스 성장 (즉, 복제)이 크게 저해되었다. 또한, 돌연변이 crHIV-1.M에 야생형 HIV를 투여한 경우에는 야생형 HIV 복제가 크게 저해되었다. 이러한 결과는 crHIV 벡터가 세포내에서 야생형 HIV 복제를 크게 저해하는데 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 10
본 실시예는 암을 치료하는데 있어서 조건 복제성 벡터를 이용하는 방법에 대해 설명하기 위한 것이다.
조건 복제성의 암 치료용 바이러스 벡터는, 자신의 복제에 필요한 단백질을 결여하고 있기 때문에, 정상적인 세포에서의 복제성에 결함을 지닌 것으로 만들어질 수 있다. 그러나, 이러한 벡터가 암 세포에 감염되면, 암 세포의 독특한 성질에 의해 결함성 암 치료용 벡터의 복제를 용이하게 해주는 인자 (예: 암 세포의 비정상적인 성장을 촉진하는, 동일하게 돌연변이된 세포성 단백질이 바람직함)가 제공된다. 따라서 이 방법은, 바이러스 벡터의 선택적인 패키징이 일어나지 않고 대신 세포내에서 자손 벡터로부터 유래된 비리온의 패키징으로 인해 암 세포의 용해현상 (lysis)이 우선적으로 일어나기 때문에, 바이러스 감염의 치료에 이용되는 방법과는 다르다. 그러나, 이 방법은 암 세포에서 조건 복제성 벡터를 선택적으로 증식시키기 위해 헬퍼 바이러스 발현 벡터를 이용할 수 있다는 점에서 바이러스 감염에 이용되는 방법과는 유사하다. 벡터 및/또는 헬퍼 바이러스 발현 벡터는 종양-특이적 인자에 반응하도록 만들어질 수 있기 때문에 종양 세포에서 벡터 전파를 선택적으로 촉진시킨다.
종양-특이적 인자는 본 발명의 치료방법에서 이용될 수 있으며, 다음과 같은 단계에서 작용하는 인자들을 포함하지만 이들로만 제한되는 것은 아니다: (1) 세포로 바이러스가 도입되는 단계 (예: 정상 세포가 아닌 암 세포로 바이러스 벡터를 선택적으로 도입시킬 수 있는 종양-특이적 수용체의 존재); (2) 바이러스 전사단계 (예: 돌연변이 암 세포 단백질은 정상 세포에 대항하여 암 세포에서 암 치료용 벡터가 선택적으로 그것의 RNA를 전사할 수 있도록 할 것이다); 및 (3) 바이러스 성숙 및 방출 단계 (예: 돌연변이 암 세포 단백질은, 예를 들어 바이러스 단백질 또는 게놈과 돌연변이 세포 단백질의 결합과 그 결과로서의 바이러스 성숙과 방출에 의해 조건 복제성 암 치료용 벡터의 선택적인 성숙을 가능하게 한다). 따라서, 암 세포에서 존재하는 돌연변이 단백질은 바이러스 복제 사이클의 여러 단계에서 바이러스 단백질 (또는 게놈성 RNA 또는 DNA)과 상호작용할 수 있다. 이러한 상호작용은 조건 복제성 암 치료용 벡터를 만들어낼 수 있으며, 이 벡터는 정상 세포에서는 결함을 지니고 있으나 암 세포에서는 복제될 수 있다.
특히, 본 실시예에 따른 방법은 T-세포 백혈병을 치료하는데 이용될 수 있다. T-세포 백혈병은 예후 (prognosis)가 별로 없는 심각한 형태의 암이다. 백혈병 T-세포는 대부분 CD4+이다. 그러므로, 안티-T-세포 백혈병 치료용의 조건 복제성 벡터가 야생형 HIV를 벡터의 근간으로 이용하여 만들어질 수 있다. 외견상 HIV가 CD4 글리코프로테인을 통해 세포에 도입되기 때문에, 이 벡터는 바이러스가 세포로 도입되는 단계에서 작용하게 된다.
벡터는, 예를 들어 야생형 HIV의 일부를 결손시킴으로써 암 치료용 벡터로 만들어질 수 있다. HIV 게놈은 전술한 바와 같이 DNA 형태로 만듦으로써, 또한 부위 특이적 돌연변이를 시킴으로써 돌연변이될 수 있다. 이 방법은, 바이러스 결함들을 다른 종양 억제 돌연변이 또는 종양형성 유전자로 보완시킴으로써, 또는 바이러스 단백질과 상호작용하는 다른 종양-특이적 인자들을 이용함으로써 마찬가지로 이용될 수 있다. 예를 들어, HIV 복제에 중요한 단백질을 코딩하는 tat 유전자가 결손될 수 있다. Tat가 없는 경우에는 HIV가 그 발현을 증가시킬 수 없게 되는데, 이 발현은 HIV 증식에 절대적으로 필요하다. Tat 단백질은 TAR RNA 스템-루프 구조체에 결합함으로써 기능을 발휘하게 되는데, 이 구조체는 HIV 프로모터와 결합하여 HIV 발현을 100 배 이상 증가시킬 수 있다. 그러므로, Tat가 없으면, HIV를 기본으로 하는 벡터는 HIV 단백질을 발현하지 못하며, 증식도 하지 못하고, 정상 (즉, 비암세포성) T-세포를 죽이게 될 것이다.
그러나, 백혈병 T-세포는 일반적으로 기능적으로 변경된 분자로서,예를 들어 돌연변이된 또는 과잉발현된 또는 무증상 돌연변이된 분자를 포함한다. 이와 같이 변경된 상태의 분자 기능은 정상 세포와는 관련이 없다. 돌연변이되지 않은 상태 (돌연변이된 상태가 아님)에서는, 상기 분자가 세포 증식 및/또는 세포 소멸 (apoptosis) (프로그램된 세포 치사)을 조절하는 작용을 한다. 돌연변이된 상태와 관련된 변화는 조건 복제성 바이러스 벡터의 증식을 선택적으로 증진시키는데 이용될 수 있다. 이는 헬퍼-바이러스 발현 벡터의 존재하 또는 부재하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 과잉발현되는 백혈병 세포의 유전자로부터 유래된, 종양-특이적 프로모터에 의해 작동되는 헬퍼-발현 벡터에 의해 Tat의 결함이 보완될 수 있다. 이러한 벡터는 정상 세포가 아닌 백혈병 T-세포에서만 복제될 수 있다. 백혈병 T-세포에서의 바이러스 발현과 증식은 초기의 바이러스 생산으로 세포의 용해와 치사를 초래하게 될 것이다. 벡터는 또한 세포 치사를 촉진하는 추가적인 요소 (예: 독소를 코딩하는 서열, 면역 반응을 촉진하는 사이토카인 또는 항원)도 가지고 있을 수 있다.
이외의 방법과 전략들이 또 다른 조건 복제성 암 치료용 벡터를 제조하는데도 마찬가지로 이용될 수 있다.
실시예 11
본 실시예는 crHIV-1.111 벡터보다 증식성이 좋은 제2세대 crHIV 구조체 (cr2HIV)를 제조하는데 관한 것이다.
제2세대 벡터들은 crHIV-생산 세포로부터 crHIV 입자 생산을 증가시킬 수 있다. crHIV 입자 생산이 많아질수록 전파가 용이하고 배양시 야생형 HIV 성장이 방지된다. 야생형 HIV에 의한 재감염을 방지하는 단백질을 코딩하는 서열이 결여되어 있는 경우에는, 원래의 야생형 HIV의 모든 서열이 포함되어 있지만 Tat 유전자를 코딩하지는 않는다. Tat 유전자 대신, Tat 유전자의 서로 다른 세 개의 부위에 트리플 안티-Tat 리보자임 카셋트 (서열번호:19)가 존재한다. 또한, Tat 스플라이스 부위가 결손되어 Tat 리보자임이 스플라이스된 야생형 HIV RNA가 아닌 게놈성 야생형 HIV RNA를 선택적으로 절단하는데, 그 결과 Tat의 결함이 보완되며 crHIV 복제가 용이하게 이루어지게 된다. 전술한 벡터들은 면역원과 같은 단백질성의 유전학적 항바이러스제 이외의 단백질을 코딩하지 않는데 반해, 제2세대 벡터들은 Tat의 존재하에서 이러한 단백질들을 발현시킨다. 야생형 HIV와 crHIV 게놈을 모두 가지고 있는 세포에서는, crHIV 게놈이 선택적으로 패키징될 뿐만 아니라, 구조단백질이 야생형 HIV 뿐만아니라 crHIV 게놈으로부터도 생산되기 때문에 crHIV-1.111 세포의 경우에서보다 많은 비리온이 생산될 것이다. 따라서, 야생형 HIV 주형으로부터 뿐만아니라 crHIV 주형으로부터도 비리온이 생산되기 때문에 증식과 관련하여 선택상의 잇점이 벡터에게 부여된다.
제2세대 벡터는 또한 그 촉매 영역이 벡터 자체내의 영역 이외의 영역을 표적으로 하는 리보자임을 포함하거나 또는 코딩하는 것을 특징으로 한다. HIV 리더 서열의 U5 영역을 표적으로 하는 리보자임을 포함하거나 코딩하는 crHIN-1.111은 변형된 U5 서열이 crHIV 벡터의 리더에 도입되어야 할 필요가 있는 반면, 제2세대 벡터의 리보자임은 벡터 자체내의 영역 이외의 영역을 표적으로 함으로써 벡터의 서열을 변형시킬 필요가 없다. 이는, 야생형 HIV와 변형된 crHIV U5 서열의 재조합에 의해 내성 HIV가 형성될 수 있는 가능성을 감소시킨다. 그러므로, 야생형 HIV와 crHIV 서열의 재조합은 야생형 HIV에 대해서는 잇점을 제공하지 않을 것이다; 야생형 HIV내로 리보자임이 도입되면 야생형 HIV에게만 유해하다.
제2세대 벡터는 또한 수많은 서로 다른 리보자임이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는데, 이들은 각각 다른 부위를 표적으로 하여 야생형 HIV가 리보자임-내성 돌연변이를 형성할 가능성을 감소시킨다.
안전한, 조건 복제성 백신을 위한 벡터 시스템을 보다 개량시키는데 있어서, 안전한 방식으로 crHIV 복제와 전파를 특이적으로 용이하게 해주는 유전학적 요소/인자들을 첨가함으로써 "헬퍼-벡터"가 보다 개량될 수 있다. 이러한 방법 중 한가지는 리보자임을 헬퍼-벡터에 도입하여 야생형 바이러스를 생산하는 벡터와의 유전학적 재조합을 방지하는 것이다. 그러므로, 상기 cr2HIV 벡터는 그것의 전파가 용이하게 이루어지도록 Tat 헬퍼-발현 벡터에 의해 보완될 수 있다. 안티-HIV 리보자임을 헬퍼-발현 벡터에 삽입함으로써 재조합의 가능성이 최소화되는데, 그 이유는 벡터와 헬퍼-벡터 RNA의 조우는 상호간의 절단과 파괴를 초래하기 때문이다. 그러므로, 헬퍼-발현 벡터는 여러 가지 방법으로 변형되어 특정의 예방 또는 치료목적으로 사용될 수 있다. 따라서, cr2HIV 벡터들은, (1) 복제하여 숙주의 면역반응을 영구적으로 자극하고, (2) HIV로부터 유래된 것으로서 항원적으로 변화되기 때문에 숙주로 하여금 다양한 에피토프의 인식을 가능하게 한다는 이유로 HIV에 대항하는 백신으로서 이용될 수 있다.
특허, 특허출원 및 간행물을 포함하여 본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌들은 그 전체로서 본 명세서에 도입되어 있다.
본 발명이 바람직한 구체적 실시예를 강조하여 설명되어 있기는 하지만, 당업자에게는 이러한 실시예의 변형예들이 마련되어 이용될 수 있으며 본 명세서에 기재된 방법 이외의 방법으로 본 발명이 실시될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 본 발명은 이러한 변형예 및 변경예들을 포함한다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 정신과 범주내에서 이루어지는 모든 변형예들을 포함한다.
서열 목록
(1) 일반적인 정보
(i) 출원인: 드로풀릭, 보로
피타, 폴라 엠.
(ii) 발명의 명칭: 조건 복제성 바이러스 벡터 및 그 용도
(iii) 서열의 수: 19
(iv) 우편물 수신처:
(A) 수신인: 레이딕, 보이트 앤 마이어, 리미티드
(B) 거리: 투 프루덴셜 플라자, 스위트 4900
(C) 시: 시카고
(D) 주: 일리노이
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 60601
(v) 컴퓨터 독출형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 처리 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현 출원상황:
(A) 출원번호: US
(B) 출원일: 1996년 11월 27일
(C) 분류:
(vii) 선출원 상황:
(A) 출원번호: US 08/563,459
(B) 출원일: 1995년 11월 28일
(C) 분류:
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 킬리크 주니어, 존
(B) 등록번호: 30,763
(C) 참조번호: 71899
(ix) 통신 정보:
(A) 전화번호: (312) 616-5600
(B) FAX 번호: (312) 616-5700
(C) TELEX: 25-3533
(2) 서열번호 1에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산 (게놈성)
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA
(xi) 서열번호 1
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC 39
(2) 서열번호 2에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA
(xi) 서열번호 2
GTGTGCCCAC CTGTTGTGTG ACTCTGGCAG CTAGAGAAC 39
(2) 서열번호 3에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 3 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: RNA
(xi) 서열번호 3
NUH 3
(2) 서열번호 4에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 40 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 4
CACACAACAC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACGGGCACA 40
(2) 서열번호 5에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 40 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 5
ATCTCTAGTC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACCAGAGTC 40
(2) 서열번호 6에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열번호 6
GTGTGCCCGC CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC 39
(2) 서열번호 7에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열번호 7
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGCAA CTAGAGATC 39
(2) 서열번호 8에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 27 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 8
TGTGACGTCG ACCACACAAC ACTGATG 27
(2) 서열번호 9에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 33 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 9
TGTGACGTCG ACTCTAGATG TGCCCGTTTC GGC 33
(2) 서열번호 10에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 31 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 10
GGTTAAGCTT GAATTAGCCC TTCCAGTCCC C 31
(2) 서열번호 11에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 31 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 11
GGTTGGATCC GGGTGGCAAG TGGTCAAAAA G 31
(2) 서열번호 12에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 38 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 12
CGGATCCACG CGTGTCGACG AGCTCCCATG GTGATCAG 38
(2) 서열번호 13에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 31 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 13
GGTTAAGCTT GTCGCCGCCC CTCGCCTCTT G 31
(2) 서열번호 14에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 112 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 14
AAGCTTGCCT TGAGTGCTCA AAGTAGTGTG TGCCCACCTG TTGTGTGACT CTGGCAGCTA 60
GAGATCCCAC AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CC 112
(2) 서열번호 15에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열번호 15
GTGTGCCCNN CTGTTGTGTG ACTCTGGNAN CTAGAGANC 39
(2) 서열번호 16에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열번호 16
GTGTGCCCAT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC 39
(2) 서열번호 17에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열번호 17
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAG CTAGAGATC 39
(2) 서열번호 18에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 39 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)
(xi) 서열번호 18
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGAAC 39
(2) 서열번호 19에 대한 정보
(i) 서열 특징:
(A) 서열의 길이: 152 bp
(B) 서열의 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: DNA (다른 핵산)
(xi) 서열번호 19
GATCGAATTC CTGCTATGTT CTGATGAGTC CGAAAGGACG AAACACCCAT TTCCCGGGTT 60
TAGGATCCTG ATGAGCGGAA AGCCGCGAAA CTGGCTCCGG CCGTTTTAGG CTCTGATGAG 120
CTGGAAACAG CGAAACTTCC TGGTCGACGA TC 152

Claims (52)

  1. 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포에서만 복제될 수 있는 조건 복제성 바이러스 벡터에 있어서, 상기 벡터가 하나 이상의 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열의 존재, 전사 또는 번역이 상기 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포내의 상기 벡터에 대해 상기 벡터가 유도되어 나온 바이러스에 상응하는 야생형 바이러스 또는 헬퍼와 비교하여 선택상의 잇점을 부여하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 서열이, 유전적 항바이러스제를 포함하거나 또는 코딩하며, 상기 벡터 이외의 바이러스의 복제 및/또는 발현에 악영향을 미치는, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 유전적 항바이러스제가 안티센스 분자, 리보자임 및 면역원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 유전적 항바이러스제가 리보자임인 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 벡터가 인간 면역결핍성 바이러스로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 벡터가 토가비리데로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 리보자임의 촉매 영역이 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 절단하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 리보자임이 서열번호 4 및 5로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 바이러스의 야생형이 서열번호 1에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 벡터가 DNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 벡터가 RNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  10. 제 5항에 있어서, 상기 벡터가 인간 면역결핍성 바이러스의 게놈으로부터 tat 유전자와 이 유전자의 스플라이스 부위를 결여하고 있는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 tat 유전자와 이 유전자의 스플라이스 부위 대신 상기 벡터는 트리플 안티-Tat 리보자임 카셋트를 포함하며, 상기 트리플 리보자임 카셋트의 각각의 리보자임의 촉매 영역은 야생형 인간 면역결핍성 바이러스 핵산 분자상에서 다른 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 야생형 인간 면역결핍성 바이러스 핵산 분자는 tat를 포함하며, 상기 트리플 리보자임 카셋트의 각각의 리보자임의 촉매 영역은 tat 내의 다른 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 각각의 리보자임의 촉매 영역이 야생형 인간 면역결핍성 바이러스의 핵산 분자 영역에서 뉴클레오티드 서열을 절단하며, 이로 인해 벡터 자체에 리보자임 내성 카운터파트가 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  14. 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포에서만 복제될 수 있는 조건 복제성 바이러스 벡터에 있어서, 상기 벡터가 하나 이상의 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열의 존재, 전사 또는 번역이 상기 벡터로 감염된 숙주 세포에 대해 상기 벡터가 유도되어 나온 바이러스에 상응하는 야생형 바이러스 또는 헬퍼로 감염된 세포와 비교하여 선택상의 잇점을 부여하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 서열이 다종 약물 내성을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 벡터가 인간 면역결핍성 바이러스로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 벡터가 토가비리데로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 서열이 돌연변이 프로테아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 돌연변이 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 벡터가 하나 이상의 추가 핵산 서열을 더 포함하며, 상기 핵산 서열의 존재, 전사 또는 번역이 상기 벡터로 감염된 숙주 세포에 대해 상기 벡터가 유도되어 나온 바이러스에 상응하는 야생형 바이러스 또는 헬퍼로 감염된 세포와 비교하여 선택상의 잇점을 부여하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 핵산 서열이 다종약물 내성을 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 벡터가 인간 면역결핍성 바이러스로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  22. 제 19항에 있어서, 상기 벡터가 토가비리데로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 서열이 돌연변이 프로테아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 돌연변이 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 벡터가 crHIV-1.1, crHIV-1.11, crHIV-1.12 및 crHIV-1.111로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조건 복제성 바이러스 벡터.
  25. 제 1항 기재의 벡터와 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물.
  26. 제 14항 기재의 벡터와 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 제 19항 기재의 벡터와 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물.
  28. 제 1항 기재의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  29. 제 14항 기재의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  30. 제 19항 기재의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. 벡터가 DNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 벡터가 RNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  32. 야생형 인간의 면역결핍성 바이러스로부터 유래된 것으로서 상기 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포에서만 복제될 수 있는 벡터를, 상기 벡터내에 포함되어 있거나 또는 상기 벡터에 의해 코딩되며 벡터 그 자체와 그 전사체가 아니라 야생형 인간 면역결핍성 바이러스의 핵산을 절단하는 리보자임을 이용하여 제조하는 방법에 있어서,
    (a) 야생형 인간 면역결핍성 바이러스로부터 유래된 것으로서 상기 벡터의 복제를 허용하는 숙주 세포에서만 복제될 수 있는 벡터를 얻는 단계; 및
    (b) 그 촉매 영역이 벡터 그 자체와 그 전사체가 아니라 야생형 인간 면역결핍성 바이러스의 핵산을 절단하는 리보자임을 포함하거나 또는 코딩하는 핵산 서열을 상기 (a) 단계의 벡터에 도입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 단계 (b)가 (i) 야생형 인간 면역결핍성 바이러스의 U5 서열을 포함하거나 또는 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상기 벡터로부터 삭제하는 단계; 및 (ii) 벡터가 DNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을, 벡터가 RNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을, 상기 단계 (i)의 벡터내로 삽입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 벡터가 상기 벡터의 복제를 1회 이상 허용하는 숙주 세포에서 복제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 벡터를 변형시키는 방법에 있어서,
    (a) 벡터를 얻는 단계; 및
    (b) 벡터가 DNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을, 벡터가 RNA인 경우 서열번호 2, 4, 5, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을, 상기 단계 (a)의 벡터내로 삽입하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 패키징 세포계를 이용하지 않고 조건 복제성 벡터를 증식시키고 선택적으로 패키징하는 방법에 있어서,
    (a) 상기 조건 복제성 벡터와 동종이지만 복제 감응성이 야생형이라는 점에서 차이를 갖고 있는, 다른 벡터에 의해 감염될 수 있는 세포와 조건 복제성 벡터를 접촉시키는 단계;
    상기 단계 (a)의 세포와 상기 단계 (a)의 상기 다른 벡터를 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 조건 복제성 벡터의 증식에 유리한 조건하에서 상기 단계 (b)의 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자; 및
    서열번호 2, 6, 7, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자;로 구성된 군으로부터 선택되는, 분리 및 정제된 핵산 분자.
  38. 숙주 세포에서 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 방법에 있어서, 야생형 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포와 제 1항 기재의 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 벡터의 존재, 전사 또는 번역이 숙주 세포에서의 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 숙주 세포에서 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 방법에 있어서, 야생형 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포와 제 14항 기재의 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 벡터의 존재, 전사 또는 번역이 숙주 세포에서의 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 숙주 세포에서 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 방법에 있어서, 야생형 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포와 제 19항 기재의 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 벡터의 존재, 전사 또는 번역이 숙주 세포에서의 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 숙주 세포에서 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 방법에 있어서, 야생형 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포와 제 13항 기재의 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 벡터의 존재, 전사 또는 번역이 숙주 세포에서의 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 세포독성 약물, 프로테아제 저해제 및 역전사효소 저해제로 구성된 군으로부터 선택된 물질과 숙주 세포를 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 숙주 세포에서 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 방법에 있어서, 야생형 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포와 제 18항 기재의 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 벡터의 존재, 전사 또는 번역이 숙주 세포에서의 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 세포독성 약물, 프로테아제 저해제 및 역전사효소 저해제로 구성된 군으로부터 선택된 물질과 숙주 세포를 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 38항에 있어서, 상기 바이러스가 암을 유발하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 38항에 있어서, 상기 숙주 세포가 야생형 바이러스와 접촉하지 않으며, 상기 방법이 상기 숙주 세포와 헬퍼-발현 벡터를 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 헬퍼-발현 벡터는 복제가 불가능한 상기 조건 복제성 바이러스 벡터를 보완하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 헬퍼-발현 벡터는 세포-특이적인 방식으로 상기 조건 복제성 바이러스 벡터를 보완하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 숙주 세포에서 특정 유전자를 발현시키는 방법에 있어서,
    (a) 상기 특정 유전자를 포함하며, 상기 숙주 세포에서 상기 유전자를 발현시킬 수 있는, 제 1항 기재의 조건 복제성 바이러스 벡터 및 헬퍼와 상기 숙주 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 숙주 세포내에서 상기 특정 유전자를 발현시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 숙주 세포에서의 상기 특정 유전자의 발현이 상기 숙주 세포에서의 야생형 바이러스의 복제를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 숙주 세포에서 특정 유전자를 발현시키는 방법에 있어서,
    (a) 상기 특정 유전자를 포함하며, 상기 숙주 세포에서 상기 유전자를 발현시킬 수 있는, 제 14항 기재의 조건 복제성 바이러스 벡터 및 헬퍼와 상기 숙주 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 숙주 세포내에서 상기 특정 유전자를 발현시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 숙주 세포에서 특정 유전자를 발현시키는 방법에 있어서,
    (a) 상기 특정 유전자를 포함하며, 상기 숙주 세포에서 상기 유전자를 발현시킬 수 있는, 제 19항 기재의 조건 복제성 바이러스 벡터 및 헬퍼와 상기 숙주 세포를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 숙주 세포내에서 상기 특정 유전자를 발현시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 약물/인자와 단백질 사이에서의 상호작용을 검출하는 방법에 있어서,
    (a) 벡터가 단백질을 코딩 및 발현시키는, 제 28항 기재의 숙주 세포와 약물/인자를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 약물/인자와 돌연변이 단백질 사이의 상호작용을 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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