CZ294170B6 - Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití - Google Patents

Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ294170B6
CZ294170B6 CZ19981624A CZ162498A CZ294170B6 CZ 294170 B6 CZ294170 B6 CZ 294170B6 CZ 19981624 A CZ19981624 A CZ 19981624A CZ 162498 A CZ162498 A CZ 162498A CZ 294170 B6 CZ294170 B6 CZ 294170B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
vector
wild
seq
nucleotide sequence
type
Prior art date
Application number
CZ19981624A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ162498A3 (cs
Inventor
Dropulicáboro
Pithaápaulaám
Original Assignee
Theájohnsáhopkinsáuniversityáschooláofámedicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Theájohnsáhopkinsáuniversityáschooláofámedicine filed Critical Theájohnsáhopkinsáuniversityáschooláofámedicine
Publication of CZ162498A3 publication Critical patent/CZ162498A3/cs
Publication of CZ294170B6 publication Critical patent/CZ294170B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení popisuje podmíněně se replikující virový vektorŹ způsoby přípravyŹ modifikaceŹ propagace a selektivního balení a použití takového vektoruŹ izolované molekuly specifikovaných nukleotidových a aminokyselinových sekvencíŹ které se týkají takových vektorůŹ farmaceutickou kompozici a hostitelskou buňkuŹ zahrnující takový vektorŹ použití takové hostitelské buňky při testování léčiv@ Metody zahrnují profylaxi a léčbu virové infekceŹ zvláště infekce virem HIVŹ a jsou tedy také zaměřeny na virové vakcíny a léčbu zhoubného bujeníŹ zvláště zhoubného bujení virového původu@ Jiné metody zahrnují použití takových podmíněně se replikujících virových vektorů v genové terapii a při jiných aplikacíchŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká podmíněně se replikujícího virálního vektoru, způsobů získávání, modifikace, propagace a selektivního balení takového vektoru, izolovaných molekul se specifikovanými nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi relevantních pro takové vektory, farmaceutické kompozice a hostitelské buňky zahrnujících takový vektor a způsobů použití takového vektoru a hostitelské buňky.
Dosavadní stav techniky
Objev viru lidské imunodeficience (HIV) jako původce syndromu získané imunitní nedostatečnosti (AIDS) podpořil obrovský výzkum souvisejících mechanizmu virového infekčního cyklu a virální patogeneze. Studie těchto mechanismů vyvolaly výzkum stále rostoucího počtu cílů vývoje antivirálních prostředků, účinných nejen proti HIV, ale také proti jiným virům. Tyto antivirální prostředky, zejména jsou-li zaměřeny proti HIV, mohou být kategorizovány do dvou skupin podle charakteru působení. Jedná se o skupinu inhibitorů reverzní transkriptázy, kompetitorů vstupu virů do buněk, vakcín a inhibitorů proteáz a o novější skupinu, která se zde označuje jako „genetické antivirální prostředky“.
Obecně má každý typ antivirálního prostředku své vlastní přínosy a omezení a musí být hodnocen z hlediska požadavků konkrétní léčebné situace. Antivirální prostředky jako azidovudin (3azido-3'-deoxythymidin, známý též jako AZT), inhibitory proteáz apod. mohou být do buněk pacientova organizmu vpraveny relativně snadno a byly intenzivně studovány. Tyto prostředky, které jsou zacíleny najeden specifický faktor ve virálním infekčním cyklu, se ukázaly relativně neúčinné proti HIV. Primárně je to způsobeno skutečností, že kmeny HIV se rychle mění a získávají rezistenci vůči prostředkům, které mají jediné místo působení (Richman, AIDS Res. and Hum. Retrovir., 8, 1065-1071 (1992)). Problémy genetických variací a rychlé mutace genomů HIV proto vyvolávají potřebu hledat nové antivirální strategie potírání infekcí HIV. Z tohoto hlediska jsou atraktivní genetické antivirální prostředky, protože působí intracelulárně na mnoha různých úrovních.
Genetické antivirální prostředky se liší od jiných terapeutických prostředků vtom, že jsou přenášeny jako molekulární prvky do cílové buňky, kde mohou buňku chránit před virální infekcí (Baltiomer, Nátuře, 325, 395-396 (1988), a Dropulic a kol., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Genetickými antivirálními prostředky mohou být jakékoli genetické sekvence a zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, antisense molekuly, syntetické fragmenty RNA (RNA decoy), transdominantní mutanty, interferony, toxiny, imunogeny a ribozymy. Konkrétně ribozymy jsou genetické antivirální prostředky, které štěpí sekvenčně specifickým způsobem cílové RNA, včetně RNA viru HIV. Specificita ribozymy zprostředkovaného štěpení cílové RNA naznačuje možné použití ribozymů jako terapeutických inhibitorů virální replikace, včetně replikace HTV. V anti-HTV strategii byly dosud použity různé typy ribozymů, například „hammerhead“ a vlásenkové ribozymy (viz například patenty US 5 144 019, US 5 180 818 a US 5 272 262 a patentové přihlášky PCT č. WO 94/01549 a WO 93/23569). Jak „hammerhead“, tak vlásenkové ribozymy mohou být konstruovány tak, aby štěpily jakoukoli cílovou RNA, která obsahuje sekvenci GUC (Haseloff a kol., Nátuře, 334, 595-591 (1988), Uhlenbeck, Nátuře, 334, 585 (1987), Hampel a kol., Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990), a Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). Obecně řečeno mají „hammerhead“ ribozymy dva typy funkčních domén, a to konzervativní katalytickou doménu, lemovanou dvěma hybridizačními doménami. Hybridizační domény se vážou na sekvence obklopující sekvenci GUC a katalytická doména štěpí cílovou RNA, která je 3' vzhledem k sekvenci GUC (Uhlenbeck (1987), viz výše, Haseloff a kol. (1988), viz výše, a Symons (1992), viz výše).
-1 CZ 294170 B6
Četné studie potvrdily, že ribozymy mohou být alespoň částečně účinné při inhibici propagace HIV v buňkách tkáňových kultur (viz například Sarver a kol., Science, 247, 1222-1225 (1990), Sarver a kol., NIH Res., 5, 63-67 (1993a), Dropulič a kol., J. Virol., 66, 1432-1441 (1992), Dropulič a kol., Methods: Comp. Met., Enzymol., 5, 43-49 (1993), Ojwang a kol., PNAS, 89, 10802-10806 (1992), Yu a kol., PNAS, 90, 6340-6344 (1993), a Weerasinghe a kol., J. Virol., 65, 5531-5534 (1991). Konkrétně Sarver a kol. (1990, viz výše) demonstrovali, že „hammerhead“ ribozymy, konstruované pro štěpení uvnitř přepisované oblasti genu gag HTV, tj. anti-gag ribozymy, mohou specificky štěpit RNA gag HIV in vitro. Navíc byly-li buněčné linie exprimující anti-gag ribozymy vystaveny působení HTV-1, byla pozorována 50- až 100-násobná inhibice replikace HTV. Podobně Weerasinghe a kol. (1991, viz výše) ukázali, že retrovirální vektory, kódující ribozymy určené ke štěpení uvnitř sekvence U5 RNA HIV-1, dodávají transdukovaným buňkám po následném působení HTV rezistenci vůči HTV. Přestože různé klony transdukovaných buněk demonstrovaly různou úroveň rezistence, jak bylo zjištěno podle promotorového systému použitého křížení exprese ribozymů, většina buněčných linií exprimujících ribozymy po omezené době v kultuře podlehla expresi HIV.
Ukázalo se, že transdukce buněk tkáňové kultury provirem, do jehož genu nef (který není nezbytný pro replikaci viru v tkáňové kultuře) byl zaveden ribozym, jehož hybridizační domény jsou specifické pro oblast U5 HTV, inhibuje replikaci viru v transdukovaných buňkách lOOnásobně v porovnání s buňkami transdukovanými standardními proviry (viz například Dropulič a kol., (1992) a (1993), viz výše). Podobně bylo zjištěno, že vlásenkové ribozymy inhibují replikaci HIV v T-buňkách transdukovaných vektory obsahujícími vlásenkové ribozymy U5 a vystavenými působení HTV (Ojwang a kol. (1992), viz výše). Jiné studie ukázaly, že vektory obsahující ribozymy exprimované z promotoru tRNA také inhibují různé kmeny HIV (Yu a kol. (1993), viz výše).
Hlavní překážkou účinné genetické léčby AIDS je dodání ribozymů nebo jiných genetických antivirálních prostředků k buněčným cílům infekce HTV (například CD4+ T-buňkám a monocytickým makrofágům). Současné přístupy ve směrování na buňky hematopoetického systému (tj. primární cíle infekce HIV) vyžadují zavedení terapeutických genů do prekurzorových vícefunkčních kmenových buněk, ze kterých diferenciací vznikají maturované T-buňky, nebo alternativně do samotných maturovaných CD4+ T lymfocytů. Směrování na kmenové buňky je však problematické, protože se tyto buňky in vitro obtížně kultivují a transdukují. Směrování na cirkulující T lymfocyty je také problematické, protože tyto buňky jsou tak široce rozptýleny, že je obtížné pomocí současných vektorových systémů dosáhnout všech cílových buněk. Navíc musejí být za buněčný cíl považovány makrofágy, protože jsou hlavním rezervoárem šíření viru do ostatních orgánů. Protože však jsou makrofágy terminálně diferencovány, a tudíž nepodléhají buněčnému dělení, nedají se snadno transdukovat běžně používanými vektory.
Převládající současný přístup k léčbě HIV tedy používá replikačně defektní virální vektory a balicí (tj. „pomocné“) buněčné linie (viz například Buchschacher, JAMA, 269(22), 2880-2886 (1993), Anderson, Science, 256, 808-813 (1992), Miller, Nátuře, 357, 455-460 (1992), Mulligan, Science, 260, 926-931 (1993), Friedman, Science, 24, 1275-1281 (1989), a Coumoyer a kol., Ann. Rev. Immunol., 11, 297-329 (1993)) k zavedení cizího genu, který specificky interferuje s replikací viru nebo který způsobuje smrt infikované buňky (přehled viz Buchschacher (1993), viz výše), do buněk náchylných k virové infekci (například infekci virem HTV). Takové replikačně defektní virální vektory obsahují kromě příslušného cizího genu sekvence působící v poloze cis, nezbytné pro replikaci viru, avšak nikoli sekvence, které kódují podstatné virové proteiny. V důsledku toho je takový vektor neschopen ukončit virální replikační cyklus a k jeho propagaci je použita pomocná buněčná linie, která obsahuje a konstitutivně exprimuje virální geny vjeho genomů. Po zavedení replikačně defektního virálního vektoru do pomocné buněčné linie jsou pro vektor v poloze trans k dispozici proteiny potřebné pro vytvoření virální částice a jsou produkovány vektorové virální částice, schopné infikovat cílové buňky a exprimovat v nich gen, který interferuje s replikací viru nebo způsobuje smrt virálně infikované buňky.
-2CZ 294170 B6
Takové replikačně defektní retrovirální vektory zahrnují adenoviry a adeno-asociované viry, jakož i retrovirální vektory používané v klinických testech genové terapie HIV, a zvláště myší amfotropní retrovirální vektor známý jako Moloneyův virus myší leukemie (MuLV). Tyto defektní virální vektory se s různou mírou úspěchu používají ktransdukci CD4+ buněk genetickými antivirálními prostředky, jako jsou anti-HIV ribozymy (Sarver a kol. (1990), viz výše, Weerasinghe a kol. (1991), viz výše, Dropulié a kol. (1993), viz výše, Ojwang a kol. (1992), viz výše, a Yu a kol. (1993), viz výše). Tyto vektory však mají pro aplikace v genové terapii HIV svá vlastní omezení. Například při léčbě HIV je zvláště důležitá vysoká frekvence transdukce, protože vektor musí transdukovat buď vzácné progenitorové hematopoetické kmenové buňky CD4+ nebo široce rozptýlené cílové CD4+ T-buňky, z nichž většina je během klinického „latentního“ stadia nemoci již virem HTV infikována. Vektory MuLV se však obtížně získávají s vysokým titrem a tudíž vedou ke slabé transdukci. Kromě toho nebylo u progenitorových kmenových buněk CD4+ dosaženo dlouhodobé exprese transdukované DNA, zejména po diferenciaci na maturované T lymfocyty. Použití defektních virálních vektorů navíc vyžaduje strategie přenosu genů ex vivo (viz například patent US 5 399 346), které mohou být nákladné a nedostupné pro běžnou populaci.
Tyto nevýhody spojené s používáním v současnosti dostupných vektorů pro genetickou léčbu AIDS vedly výzkumné pracovníky k hledání nových virálních vektorů. Jedním takovým vektorem je samotný HTV. Vektory HIV byl použity pro studie infektivity (Page a kol., J. Virol., 64, 5270-5276 (1990)) a pro zavádění genů (jako jsou sebevražedné geny) do CD4+ buněk, zejména do CD4+ buněk, infikovaných HIV (viz například Buchschacher a kol., Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992), Richardson a kol., J. Virol., 67, 3997-4005 (1993), Carroll a kol., J. Virol., 68, 6047-6051 (1994), a Parolin a kol., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). Strategie těchto studií spočívá v použití vektorů HIV k zavádění genů do CD4+ T-buněk a monocytických buněk.
Tyto vektory jsou však dosud velice složité. Navíc je použití těchto vektorů doprovázeno nebezpečím vzniku standardního HIV intracelulámí rekombinací. Bylo pozorováno, že kotransfekce/koinfekce defektních vektorových sekvencí a pomocného viru vede k rekombinací mezi homologními oblastmi virálních genomů (Inoue a kol., PNAS, 88, 2278-282 (1991)). Pozorovaná komplementace in vitro naznačuje, že in vivo by se mohl rekombinovat podobný replikačně defektní vektor HIV, a tak aktivovat již existující infekci HIV. Skutečnost, že retroviry balí dva genomy RNA do jednoho virionu, vedla výzkumné pracovníky k hypotéze, že retroviry nesou dvě virální RNA, aby obešly veškeré genetické defekty, způsobené komplementací a/nebo rekombinací (Inoue a kol. (1991), viz výše).
Kromě nebezpečí intracelulámí rekombinace, vedoucí ke standardnímu HIV (tj. HIV divokého typu), je s vektory HIV spojeno riziko mutace in vivo, která zvyšuje patogenitu virálního vektoru. To vedlo Sarvera a kol. {AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b)) ke spekulacím ohledně vývoje druhé generace rekombinantních vektorů HTV, které jsou replikačně kompetentní a přitom nepatogenní. Takové vektory, v porovnání s převážně používanými nereplikujícími vektory (tj. replikačně deficitními vektory) pokračují v replikaci v těle pacienta, a tak dochází k trvalé soutěži se standardním HIV. Dosud však takové vektory nejsou k dispozici.
V ideálním případě nastává nejlepší příležitost pro léčbu infikovaného jedince v době inokulace, než ještě virus hostitele infikuje. To je však obtížně proveditelné, poněvadž mnozí jedinci si neuvědomí, že byli infikováni HIV, dokud nenastane klinicky latentní fáze onemocnění. Proto nastává nejvážnější potřeba antivirální intervence během klinické latence. Terapie v tomto stadiu vyžaduje řešit problém, představovaný velkým počtem již infikovaných CD4+ lymfocytů, které obsahují virální genomy. Tento problém není jednoduchý, což dokazuje skutečnost, že infekce HIV zůstává dosud nevyléčitelná a dosud dostupnými terapiemi je léčitelná pouze špatně. Účinná vakcína není na dohled a i když se zjistilo, že inhibitory reverzní transkriptázy a proteázy brání replikaci HIV v tkáňové kultuře, vývoj rezistence virů in vivo vedl k neúspěchu léčby. Genová
-3 CZ 294170 B6 terapie HIV tedy může být jen malým přínosem pro převážnou většinu jedinců infikovaných HTV, jejichž počet se odhaduje v roce 2000 na 40 milionů.
S ohledem na tyto skutečnosti se zvyšuje význam vývoje dlouhodobých a trvalých imunologických odpovědí na určité patogeny, zejména viry, konkrétně například v kontextu AIDS a rakoviny. Byly uvažovány živé oslabené (live-attenuated, LA) vakcíny s použitím replikačně kompetentních, ale nepatogenních virů (Daniel a kol., Science, 258, 1938-1941 (1992), a Desrosiers, AIDS Res. &Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)). Takové nepatogenní viiy, které se liší od odpovídajících standardních virů delecí jednoho nebo více genů, buď (i) nemohou vyvolávat ochranou imunitní odpověď, protože antigen nepřetrvává (protože virus LA se účinně nereplikuje), nebo (ii) se virus LA replikuje, ale má jiný patogenní potenciál, což dokazuje schopnost viru LA vyvolávat onemocnění na mladých zvířecích modelech (Baba a kol., Science, 267, 1823-1825(1995)).
Z výše uvedených důvodů přetrvává potřeba alternativních možností proíylaktického a terapeutického ošetření virálních infekcí, zejména v kontextu AIDS a rakoviny. Vynález takové alternativní metody poskytuje na základě podmíněně se replikujícího vektoru. Dále vynález poskytuje další způsoby, při nichž je možno takového vektoru použít.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je podmíněně se replikující virový vektor, který je charakterizován schopností replikovat se pouze v hostitelské buňce, která umožňuje replikaci tohoto vektoru (tj. je pro jeho replikaci permisivní).
V jednom provedení zahrnuje podmíněně se replikující vektor alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace dodává vektoru v replikačně permisivní hostitelské buňce selektivní výhodu oproti standardnímu kmeni viru odpovídajícího viru, z něhož byl vektor odvozen.
V dalším provedení podmíněně replikujícího virálního vektoru tento vektor, kteiým je přednostně retrovirus, zahrnuje alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace dodává hostitelské buňce, která je vektorem infikována, selektivní výhodu oproti buňce infikované standardním kmenem viru odpovídajícího viru, z něhož byl vektor odvozen.
Dále je předmětem vynálezu farmaceutická kompozice, zahrnující podmíněně replikující virální vektor a farmaceuticky přijatelný nosič. Předmětem vynálezu je dále hostitelská buňka, zahrnující podmíněně se replikující virální vektor. Předmětem vynálezu je rovněž vektor, kde tento vektor, jde-li o DNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16 a kde tento vektor, jde-li o RNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, stejně jako jsou předmětem vynálezu izolované a purifikované molekuly zde uvedených nukleových kyselin. Podobně je předmětem vynálezu způsob vytvoření vektoru s ribozymem, způsob modifikace vektoru a způsob propagace a selektivního balení podmíněně replikujícího vektoru bez použití balicí buněčné linie.
V dalším provedení je předmětem vynálezu způsob terapeutického a proíylaktického ošetření buňky proti virové infekci. Takové způsoby mohou navíc podle potřeby zahrnovat použití pomocného expresního vektoru, cytotoxického léčiva, proteinů/faktorů nebo inhibitoru proteázy/reverzní transkriptázy. Takový způsob může být použit například k inhibici replikace viru, k léčbě rakoviny, k přenosu genů in vivo nebo k expresi potřebného genu v hostitelské buňce.
-4CZ 294170 B6
V dalším provedení je předmětem vynálezu způsob použití hostitelské buňky, zahrnující podmíněně se replikující vektor k detekci interakce mezi léčivem/faktorem a proteinem. Takový způsob umožňuje charakterizaci proteinu a screening aktivity léčiv/faktorů vzhledem k danému proteinu.
Vynález popisuje způsob inhibice replikace kmene viru divokého typu. Způsob zahrnuje kontakt hostitele, který je schopný být infikován uvedeným kmenem viru divokého typu, upřednostňuje se aktuální infekce kmenem viru divokého typu, dále vektorem, který se pomnožuje pouze v hostiteli, jenž umožňuje replikaci vektoru (to znamená nepatogenního, podmíněně se replikujícího (cr) vektoru).
Dále popisuje způsob konkurenční infekce hostitele takovým nepatogenním, podmíněně se replikujícím vektorem. Podmíněně se replikující vektor podle vynálezu obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která poskytuje selektivní výhodu při replikaci a prodlužuje podmíněně se replikující vektor, což se srovnává s virem divokého typu, a/nebo nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která poskytuje selektivní výhodu při pomnožení virových partikulí v hostitelské buňce, která obsahuje podmíněně se replikující vektor, což se srovnává s hostitelskou buňkou obsahující virus divokého typu.
V preferovaném provedení podle vynálezu vektor obsahuje sekvenci HIV a používá se při léčbě infekce HIV. Pak vektor nebo hostitelská buňka obsahující vektor zahrnuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která (1) činí genom crHIV selektivně výhodným ve srovnání s genomem standardního HIV při balení do progenu virionů (tzn. v buňkách, kde jsou oba obsaženy) a/nebo (2) činí hostitelskou buňku, která produkuje podmíněně replikující se vektor (virus), selektivně výhodnou při produkci crHIV virionů ve srovnání s hostitelskou buňkou, jež produkuje standardní virus. Jedna možnost (vynález však není na ni omezen) je vytvořit genomy crHIV selektivně výhodné při balení tím, že se vybaví jedním nebo více ribozymy, které jsou schopné štěpit standardní genom.
Standardní virus („Virus divokého typu“) „Virus“ podle vynálezu je infekční agens, které je tvořeno proteinem a nukleovou kyselinou a které používá genetickou výbavu hostitelské buňky k produkci virových produktů specifikovaných virovou nukleovou kyselinou. Termín „nukleová kyselina“ označuje polymer RNA nebo DNA, který je jednořetězcový nebo dvouřetězcový, lineární nebo kruhový a může obsahovat syntetické, nepřirozené nebo modifikované nukleotidy, které jsou schopny být inkorporovány do polymerů DNA nebo RNA. DNA polynukleotid je s výhodou obsažen v sekvencích genomové DNA nebo cDNA.
Termín „kmen viru divokého typu“ označuje kmen, který neobsahuje žádné umělé mutace podle vynálezu, tzn. že jde o jakýkoliv virus, který se může izolovat v přírodě. Alternativně představuje standardní kmen jakýkoli virus, který se kultivuje v laboratoři v nepřítomnosti dalších virů a je schopný produkovat genomy potomků nebo viriony, podobné těm izolovaným v přírodě. Například molekulární klon pNL4-3 HIV popsaný v následujících příkladech je kmen divokého typu, který je dostupný prostřednictvím National Institutes of Health z AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog (viz také Adachi a kol., J. Virol. 59, 284-291 (1986).
Způsob podle vynálezu se přednostně užívá při léčbě virových onemocnění, které vznikají na základě virové infekce. Požaduje se, aby virus (stejně jako vektor, jak se popisuje dále v textu) byl RNA virus, ale může být také DNA virem. RNA viry jsou diverzní skupina, která infikuje prokaryonty (například bakteriofágy) stejně jako řadu eukaiyont, savce a zvláště lidi. U většiny RNA virů jejich genetický materiál tvoří jednořetězcovou RNA, ačkoli nejméně jedna čeleď má jako genetický materiál dvouřetězcovou RNA. RNA viry se rozdělují do třech hlavních skupin: viry s pozitivním řetězcem (to znamená, že genom přenesený virem je přeložen na protein a jejich deproteinizovaná nukleová kyselina je dostatečná k iniciaci infekce), viry s negativním řetězcem (to znamená, že genom přenesený virem je komplementární se smyslem message
-5CZ 294170 B6 a musí se před translací přepsat virion-asociovanými enzymy) a viry s dvouřetězcovou RNA. Způsob podle vynálezu se s výhodou používá při aplikaci na viry s pozitivním řetězcem, s negativním řetězcem a viry s dvouřetězcovou RNA.
Mezi RNA viry podle vynálezu patří viry podobně Sindbis-virům (např. Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus a Potexvirus), viry podobné Picomavirům (např. Picomaviriade, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus a Potyvirus), viry s negativním řetězcem (například Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae a Arenaviridae), viry s dvouřetězcovou RNA (např. Reoviridae, Bimaviridae), viry podobné Flavivirům (např. Flaviviridae a Pestivirus), viry podobné Retrovirům (např. Retroviridae), Coronaviridae a jiné skupiny virů mezi něž například patří Nodaviridae.
Preferovaným RNA virem podle vynálezu je virus čeledi Flaviviridae, upřednostňuje se virus rodu Filovirus a zvláště virus Marburg nebo Ebola. Virus čeledi Flaviviridae je virus rodu Flavivirus, jako je virus žluté horečky, virus dengue, virus západního Nilu, virus encefalitidy ze St. Louis, Japonský virus encefalitidy, virus encefalitidy údolí Murray, Rocio virus, virus klíšťové encefalitidy a podobně.
Preferují se také viry čeledi Picomaviridae, upřednostňuje se virus hepatitidy A (HAV), virus hepatitidy B (HBV) nebo virus hepatitidy ani A ani B.
Dalším preferovaným virem je virus čeledi Retroviridae (to jsou retriviiy), zvláště virus rodu nebo podčeledi Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae a Lentivirus. RNA virus podčeledi Oncovirinae je lidský T-lymfotropní virus typu 1 nebo 2 (to je HTLV-1 nebo HTLV-2) nebo virus bovinní leukemie (BLV), virus sarkomu ptačí leukózy (např. Virus Rousova sarkomu (RSV), virus ptačí myeloblastózy (AMV), virus ptačí eiytroblastózy (AEV) a Rous-asociovaný virus (RAV; RAV-0 až RAV-50), savčí virus C-typu (např. Moloneyův myší virus leukemie (MuLV), myší virus Harveyova sarkomu (HaMSV), Abelsonům myší virus leukemie (A-MuLV), AKR-MuLV, kočičí virus leukemie (FeLV), virus opičího sarkomu, virus retikuloendoteliózy (REV), virus nekrózy sleziny (SNV)), virus B-typu (např. opičí virus nádoru prsní žlázy (MMTV)) a virus T-typu (např. Mason-Pfizerův opičí virus (MPMV) a „SAIDS“ viry). Mezi RNA virus podčeledi Lentivirus patří HIV-1 nebo HIV-2, kde HIV-1 se nazývá lymfadenopatie asociovaný virus 3 (HTLV-III) a virus syndromu získaného selhání imunity (ARV) nebo jiný virus příbuzný HTV-1 nebo HIV-2, který je spojován AIDS nebo nemocemi, které jsou podobné AIDS. Termíny „HTV“ nebo „AIDS“ nebo „lidský virus nedostatečné imunity“ se používají obecně ve spojení s HIV viry a s HTV-příbuznými nebo spojovacími viry. RNA virus podčeledi Lentivirus je přednostně Visna/maedi virus (např. co infikuje ovce), kočičí virus nedostatečné imunity (FIV), boviní lentivirus, opičí virus nedostatečné imunity (STV), koňský virus infekční anemie (EIAV) a kozí virus arthritis-encefalitis (CAEV).
Virus podle vynálezu může být také DNA virus. DNA virus je Epstein-Barrové virus, adenovirus, virus herpes simplex, papilomavirus, virus vakcinie a podobně.
Řada těchto virů se klasifikuje jako patogeny spadající do „úrovně bezpečnosti 4“ (to je (WHO) Světová zdravotní organizace „Risk Group 4“), které vyžadují pro všechny práce v laboratoři maximální kontrolní zařízení. Odborník je seznámen se všemi bezpečnostními nařízeními vztahujícími se na práci s těmito viry. „Hostitelská buňka“ může být libovolná buňka, upřednostňuje se eukaryontní buňka. Hostitelská buňka je lymfocyt (jako je T-lymfocyt) nebo makrofág (jako je monocytický makrofág) nebo prekurzorem takových buněk, jako jsou hematopoietické kmenové buňky. Upřednostňuje se, aby buňky na svém povrchu obsahovaly CD4+ glykoprotein, to znamená, že jsou CD4+. Požaduje se, aby CD4+ T-lymfocyt, který se infikoval virem AIDS, nebyl ještě aktivován (to znamená, aby ještě nedošlo k expresi genu nef a dokonce více se preferuje, aby se exprese CD4 neoslabila, jak se popisuje dále v textu). Avšak hostitelská buňka je s výhodou buňka, která nemá CD4 markér a je ještě schopna být infikována virem podle vynálezu. Takové buňka zahrnuje například astrocyt, fíbroblast kůže, buňku střevního epitelu a podobně.
-6CZ 294170 B6
Hostitelskou buňkou je s výhodou eukaryontní, vícebuněčná specie (např. opak jednobuněčné kvasinky) a dokonce více se upřednostňuje savčí, například lidská buňka. Buňka může být přítomna jako jedinec nebo jako součást větší sbírky buněk. Taková „větší sbírka buněk“ může obsahovat např. buněčnou kulturu (buď smíchanou nebo čistou), tkáň (např. epiteliální nebo jinou tkáň), orgán (např. srdce, plíce, játra, žlučník, močový měchýř, oči a jiné orgány), orgánový systém (např. cirkulační systém, respirační systém, trávicí systém, močový systém, nervový systém, kožní systém a jiný orgánový systém) nebo organizmus (např. pták, savec a podobně). Upřednostňuje se, aby orgán/tkáně/buňky, které jsou cílem, byly cirkulační systém (např. zahrnující krevní cévy a krev), respirační systém (např. nos, faryng, laryng, trachea, bronchi, průdušnice, plíce a podobně), trávicí systém (např. ústa, hltan, jícen, žaludek, střeva, slinné žlázy, pankreas, játra, žlučník a jiné), systém močových cest (jako např. ledviny, močovody, močový měchýř, močová trubice a podobně), nervový systém (např. mozek, míchu a speciální smyslové orgány, jako jsou oči) a kožní systém (např. kůže). Jako cílové buňky se dokonce více upřednostňují buňky vybrané ze skupiny obsahující buňky srdce, krevních cév, plic, jater, žlučníku, močového měchýře a očí.
Vektor
Termín „vektor“ je molekula nukleové kyseliny (DNA nebo RNA), která slouží k přenosu sekvence cizorodé nukleové kyseliny (to je DNA nebo RNA) do hostitelské buňky. Existují tři běžné typy vektorů: plazmidy, fágy a viry. Jako vektor se upřednostňuje virus.
Vektor není kmen viru divokého typu, protože obsahuje mutace vytvořené člověkem. Pak vektor je odvozen genetickou manipulací od kmene viru divokého typu (to je delecí), aby obsahoval podmíněně se replikující virus, jak se dále popisuje v textu. Virový vektor v optimálním případě obsahuje kmen viru, který je stejného typu jako virus divokého typu, který způsobuje léčenou infekci. S výhodou se používá jeden ze dříve zmiňovaných virů divokého typu. Vektor se odvodil z viru RNA, více se upřednostňuje vektor odvozený z retrovirů a optimální je vektor odvozený od HTV. Takový vektor odvozený z HIV je označován jako vektor „crHTV“.
Také se upřednostňuje „chimérický vektor“, např. kombinace virového vektoru s jinými sekvencemi, jako např. kombinace sekvencí HIV s jiným virem (který je odvozen od virového kmene divokého typu, aby obsahoval podmíněně replikujícího se vektor). HIV sekvence mohou být zvláště spojeny se sekvencemi modifikovaného (to znamená ne divokého typu) kmene adenoviru, adeno-asociovaného viru, vektor Sindbisova viru nebo aufotrofního myšího retrovirového vektoru.
Vektor může obsahovat buď DNA nebo RNA. Pro odvození viru se může použít buď DNA nebo RNA vektor. Podobně kopie cDNA se může vytvořit s virového RNA genomu. V jiném případě cDNA (nebo virová genomová DNA) se může přepisovat in vitro za produkce RNA. Tyto metody jsou v oboru dobře známy a také jsou popsány v následujících příkladech.
Termín „podmíněně se replikující virus“ je replikačně defektní virus, který je defektní pouze za určitých podmínek. Virus si může doplnit svůj replikační cyklus v permisivní hostitelské buňce a nemůže si doplnit svůj replikační cyklus v restriktivní hostitelské buňce. Termín „permisivní hostitelská buňka“ je hostitelská buňka infikovaná kmenem viru divokého typu. K takové infekci může dojít buď před nebo po infekci s podmíněně se replikujícím vírem podle vynálezu. V jiném případě termín „permisivní hostitelská buňka“ znamená buňku, která kóduje produkty virových genů divokého typu, jenž jsou nezbytné při replikaci viru. Podmíněně se replikující vektor podle vynálezu je virus (upřednostňuje se stejný typ viru, jako je léčená infekce), který se replikuje pouze při komplementaci kmene viru divokého typu nebo v případě, že virus divokého typu infikuje buňky obsahující genomy podmíněně se replikujícího vektoru.
V preferovaném provedení vynálezu vektor obsahuje RNA virus (např. podmíněně se replikující HIV virus), který je začleněn ve formě DNA). Toto preferované provedení vynálezu poskytuje
-7CZ 294170 B6 strategii replikujícího se HTV-1 vektoru (crHTV), která nabízí nepatogenní crHIV-1 vektorový genom se selektivní výhodou ve srovnání patogenními HIV genomy divokého typu. crHIV RNA má v buňkách obsahujících genomy HTV divokého typu i crHIV selektivní výhodu při balení do virionů, protože obsahují například ribozymy, které štěpí RNA divokého typu, ale ne RNA crHIV. Takové nepatogenní crHTV jsou schopny se dostat do neinfikovaných buněk, které jsou náchylné na infekci virem HIV (např. CD4+ buňky) za přítomnosti pomocného viru divokého typu. Tímto způsobem interferuje selektivní balení a rozšíření crHTV s replikací HIV divokého typu.
Genomy crHTV se zavedly do infikovaných nebo neinfikovaných buněk. Infikované buňky poskytují genomu crHTV proteiny, které jsou nutné při tvoření kapsidu a produkci progenu virionů. Genomy crHTV se zavádějí do neinfikovaných buněk s výhodou přímo transdukcí (např. transdukcí zprostředkovanou DNA crHIV nebo použitím chimérového virového vektoru) nebo infekcí crHTV partikulí, které vznikají při transfekci infikovaných buněk HIV divokého typu. Samotné neinfikované buňky neprodukují partikule crHTV. Avšak mohou být superinfikovány virem divokého typu, který poskytuje proteiny požadované při další produkci partikulí crHTV. V tomto smyslu podmíněně se replikující vektor podle vynálezu také funguje jako typ „virového transportního vektoru“, které se mohou použít při crHTV infekci v několika cyklech (to znamená při existenci konkurenční infekce HIV divokého typu). Takový vektor, který poskytne zdroj viru pro více jak jeden cyklus virové replikace, je v kontrastu s jinými současně používanými vektory, jako jsou ty, které se používají s balicími buněčnými liniemi a které jsou vhodné pouze při replikaci v jednom cyklu.
Je-li to nutné (např. při použití vektoru in vitro) produkty genu viru divokého typu se mohou zavést do buňky, která je infikovaná podmíněně se replikujícím vektorem. Produkty genu viru divokého typu se mohou dodat ne pouze koinfekcí kmenem viru divokého typu (nebo cDNA nebo provirem RNA viru), ale také zavedením expresivního vektoru (např. pomocný expresivní vektor, který je schopen propůjčovat hostitelské buňce sekvence transkripce nebo translace (regulační nebo strukturální)), kde jsou subklonovány jejich geny nebo v jiném případě genové produkty se mohou dodávat exogenně, to je přidáním proteinových produktů do buňky. Exprese „pomocného vektoru“ může být buněčně specifická nebo nezávislá na typu buňky a může být zavedena do hostitelské buňky v souladu s podmíněně se replikujícím virovým vektorem, přičemž buňka je schopna pokračovat v replikaci podmíněně se replikujícího virového vektoru.
Termín „komplementace“ znamená negenovou interakci produktů genů viru z různých zdrojů v buňkách. Při smíšené infekci komplementace zahrnuje zvýšení výtěžku jednoho nebo obou virových parenterálních genomů, zatímco genotypy parenterálních genomů zůstávají nezměněny. Komplementace může být nealelická (to znamená intergenní, přičemž mutanty defektní v různých funkcích asistují jeden druhému při replikaci viru tím, že poskytují funkci, která je defektní v jiném viru) nebo alelová (to znamená intergenní, přičemž dva rodiče mají defekty v odlišných doménách multimémího proteinu).
Typy buněk, které mohou být transfekovány (transdukovány) DNA crHIV (to je lipozymy nebo použitím adenovirového vektoru nebo amfotropním retrovirovým vektorem) mohou být buď buňky infikované HTV nebo neinfikované buňky. Buňky infikované HIV se mohou aktivovat nebo nemusí. Jestliže jsou aktivovány, budou bezprostředně přepisovat RNA HTV divokého typu a RNA crHIV, což vede k selektivnímu balení RNA crHIV do virionů progenů. Jestliže buňky infikované HIV nejsou aktivovány DNA, crHTV v nich zůstanou až do okamžiku aktivace (např. stimulací mitogeny, antigeny a podobně), což vede k selektivnímu balení crHIV RNA do virionů progenů. Aktivované a neaktivované neinfikované buňky, které jsou transfekovány crHIV DNA neprodukují viriony až do okamžiku, kdy jsou superinfikovány HIV divokého typu a aktivovány stimulací, přičemž opět dochází k selektivnímu balení crHIV RNA do virionů progenů.
Superinfekce buněk obsahujících genomy crHIV (např. jako výsledek transfekce nebo infekce) se objevuje, protože genomy crHIV nekódují virové proteiny, které blokují superinfekci (jako env
- 8 CZ 294170 B6 a nef). Výsledné viriony crHIV mohou infikovat neinfikované buňky, protože virové partikule obsahují molekulu reverzní transkriptázy, kterou nesou všechny partikule HIV tak, že mohou tvořit provirus DNA ze své genomové RNA. Tento proces se nazývá reverzní transkripce. Jestliže viriony crHIV infikují neinfikované buňky, podrobí se reverzní transkripci a produkují z jejich genomové RNA provirus. Pak tyto buňky jsou ekvivalentem ktěm neinfikovaným buňkám, které jsou přímo transdukovány crHTV DNA. Tyto buňky nemohou produkovat crHTV partikule až do okamžiku, kdy se superinfikují HIV divokého typu a aktivují se, pak opět dochází k selektivnímu balení crHTV RNA do virionů progenů. Je možné, že crHIV partikule by mohly také infikovat některé buňky, které jsou už infikované HIV (např. Yunoki et al., Arch. Virol., 116, 143-158 (1991); Winslow et al., Virol., 196, 849-854 (1993); Chen et al., Nuc. Acids Res., 20, 4581-4589 (1992); a Kim et al., AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 875-882 (1993)). Aby však došlo k této skutečnosti, tyto buňky infikované HTV nesmí exprimovat proteiny, které zeslabují expresi CD4, protože to by bránilo virionům crHIV infikovat tyto buňky. Aktivované buňky infikované HTV obecně zeslabují expresi CD4. Buňky infikované HTV, které nejsou aktivovány jsou potenciálně náchylné k superinfekci s crHTV a tak mohou být dalším zdrojem pro produkci crHIV partikulí.
Preferovaný crHIV vektor podle vynálezu obsahuje sekvence nutné pro transkripci RNA, vázání primeru tRNA, dimerizaci a balení a buď mu chybí sekvence obsahující proteiny, které blokují superinfekci HTV divokého typu (např. nef nebo env proteiny) nebo obsahuje takové sekvence, ale buď nejsou přepsány nebo nejsou přeloženy do funkčního proteinu tak, že jejich exprese se považuje za „latentní“. Dokonce více se upřednostňuje, když vektor nemá oblast nebo sekvence kódující oblast HIV divokého typu z kódující sekvence gag a zahrnující gen nef. V optimálním případě však vektor neobsahuje element odezvy rev (RRE), který je klonován do vektoru v oblasti delece nebo některé jiné vhodné oblasti. Takovému preferovanému HTV vektoru, jak bylo uvedeno, „chybí oblast nebo sekvence kódující oblasti“.
Způsob konstrukce vektoru je dobře znám v oboru. Jak se popisuje v příkladu 1, DNA RNA viru, jako je HIV, je štěpena použitím restrikčních enzymů za účelem excize kódujících sekvencí HIV z kódující oblasti gag do oblasti U3, která následuje po genu nef. Klonující kazeta zahrnující polylinker obsahující několik restrikčních míst je před ligaci začleněna do oblasti delece, aby se získala vhodná restrikční místa pro klonování do vektoru. Fragment DNA obsahující RRE je subklonován do jednoho z těchto restrikčních míst. Výsledný vektor produkuje zkrácený transkript gag a neprodukuje protein Gag divokého typu nebo jiné proteiny HIV divokého typu. Není však nezbytné, aby vektor exprimoval dokonce zkrácený protein gag, protože iniciační sekvence translace gag se mohou mutovat, aby se předešlo jejich translaci.
Při stejném přístupu se mohou sekvence crHTV spojit s jinými sekvencemi, jako jsou sekvence viru nebo jiného vektoru za vzniku chimérického vektoru. Sekvence crHIV se mohou ligovat k sekvencím Sindbisova viru, AAV, adenoviru nebo amfotrofního retroviru, jmenuje se zde pouze několik takových virů, které se mohou použít pro zavedení sekvencí crHTV. Vektor se může zavést do buňky buď použitím mechanizmu spojeného viru (např. receptorem zprostředkovanou endocytózou v případě adenoviru) nebo jiným způsobem, např. lipozymy.
Podle vynálezu se upřednostňuje vektor (to je podmíněně se replikující virus, který s výhodou je vektor crHTV) obsahující nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny (to znamená její přítomnost, transkripce nebo translace), která udílí selektivní výhodu. Existují dva typy takových sekvencí nukleových kyselin, které se mohou použít při inkluzi do vektoru: (1) sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost optimálně poskytuje selektivní výhodu při replikaci viru a rozšíření vektoru obsahujícího takové sekvence do kmenu viru divokého typu (to je s výhodou kmen divokého typu, ze kterého je vektor odvozen a který neobsahuje tuto sekvenci) a (2) sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost optimálně udílí buňkám infikovaným vektorem, který obsahuje sekvenci, selektivní výhodu ve srovnání s buňkami infikovanými kmenem viru divokého typu (to znamená, že se upřednostňuje kmen divokého typu, ze kterého se odvodil vektor (a také např. pomocný expresivní vektor, který podporuje replikaci vektoru a/nebo funkci v neinfikované
-9CZ 294170 B6 hostitelské buňce), a který neobsahuje tuto sekvenci), např. podporuje přežití buňky, podporuje produkci vektorových partikulí a/nebo propagaci, podporuje produkci vektorových virionů crHIV z buněk produkujících vektor crHTV, indukuje apoptózu, umožňuje produkci proteinu nebo podporuje imunologickou funkci nebo cílení tak, aby se dosáhlo požadovaného proíylaktického, terapeutického nebo biologického výstupu. Každá z těchto sekvencí nebo velké množství každé z těchto sekvencí, to znamená sekvence, která sama nebo v kombinaci s jiným faktorem(y) podporuje propagaci vektoru a/nebo podporuje určitou funkci hostitelské buňky, což umožňuje vhodný profylaktický, terapeutický a/nebo biologický výstup, může být zahrnuto do vektoru, buď v nepřítomnosti nebo v přítomnosti jiné sekvence, to znamená, že vektor může obsahovat „nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny“ a „nejméně jednu přidanou sekvenci nukleové kyseliny“.
Termín „nukleová kyselina“ byl popsán už dříve. „Sekvence nukleové kyseliny“ zvláště obsahuje libovolný gen nebo kódující sekvenci (to je DNA nebo RNA) potenciálně libovolné velikosti (to znamená samozřejmě limitované balením, což určuje vektor), které udílí selektivní výhodu, jak se popisuje dále v textu. „Gen“ je sekvence nukleové kyseliny kódující protein nebo nascentní molekulu mRNA (s ohledem na skutečnost, zda sekvence se přepisuje a/nebo překládá). Zatímco gen obsahuje kódující sekvence stejně jako nekódující sekvence (např. regulační sekvence), „kódující sekvence“ nezahrnuje žádnou nekódující DNA.
1. Sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost udílí v hostitelské buňce selektivní výhodu vektoru, který obsahuje takovou sekvenci, před kmenem viru divokého typu.
Sekvence nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu vektoru v hostitelské buňce před kmenem viru divokého typu, je s výhodou libovolná sekvence, která umožňuje, na rozdíl od partikulí propagovaných z viru divokého typu, selektivní produkci nebo balení virových partikulí propagovaných z vektoru. Takové sekvence zahrnují, ale nejsou omezeny na sekvenci, která umožňuje zvýšení počtu vektorových genomů, jež se produkují intracelulárně, což se srovnává s genomy divokého typu, a antivirovou sekvenci nukleové kyseliny.
První kategorie sekvencí nukleových kyselin, které udílí v hostitelské buňce selektivní výhodu vektoru, který obsahuje sekvenci, ve srovnání s kmene viru divokého typu jsou sekvence, jako je promotor. „Promotor“ je sekvence, která řídí navázání RNA polymerázy, přičemž podporuje syntézu RNA, a která může obsahovat jeden nebo více zesilovačů. „Zesilovače“ jsou cispůsobící elementy, které stimulují nebo inhibují transkripci přilehlých genů. Zesilovač, který inhibuje transkripci se také nazývá „tlumič“. Zesilovač pro sekvenčně specifické DNA vázající proteiny, které se nachází pouze v promotoru (také se nazývají „promotorové elementy“), se liší podle míst vázajících DNA, přičemž zesilovač může fungovat v každé orientaci a na vzdálenost až několika párů kilobází (kb), dokonce z místa, které leží downstream od přepisované oblasti.
Upřednostňuje se, aby se promotor (např. dlouhé terminální repetice (LTR)) podmíněně se replikujícího vektoru HIV modifikoval tak, že vektor způsobuje lepší odezvu na jisté cytokiny, než kmen HIV divokého typu. Například modifikovaný HIV promotor je schopný demonstrovat v přítomnosti interleukinu-2 zvýšenou transkripční aktivitu. Inkorporace tohoto promotoru do vektoru a zavedení vektoru do buněk infikovaných HIV divokého typu s výhodou vede ke zvýšené produkci virionů progenu z genomu vektoru a jejich balení ve srovnání s genomem HTV divokého typu. Jiné cytokiny a/nebo chemokiny (např. nádorový nekrotický faktor a, RANTES a podobně) se mohou podobně použít k podpoře selektivního balení virionů kódovaných vektorem.
Druhá kategorie sekvence nukleové kyseliny, která udílí v hostitelské buňce selektivní výhodu vektoru, který obsahuje sekvenci, ve srovnání s kmenem viru divokého typu, zahrnuje jako preferovanou sekvenci nukleové kyseliny antivirovou sekvenci nukleové kyseliny. „Antivirová agens“ se rozdělují do kategorií na základě způsobu působení, např. inhibitory reverzní transkriptázy, kompetitory vstupu viru do buňky, vakcíny, proteázové inhibitory a genetická antivirová
-10CZ 294170 B6 činidla. „Genetická antivirová činidla“ jsou molekuly DNA nebo RNA, které jsou přenášeny do buněk a působí na své intracelulámí cíle buď přímo (to znamená, že jsou zavedeny intracelulámě) nebo po jejich konverzi buď na RNA nebo protein (Dropuliďet al., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Genová antivirová sekvence je také preferovanou sekvencí nukleové kyseliny. Genová antivirová agens zahrnují například antisense molekuly, syntetické fragmenty RNA (RNA decoy), transdominantní mutanty, interferony, toxiny, imunogeny a ribozymy. Genovým antivirovým agens je antisense molekula, imunogen a ribozym. Preferovanou sekvencí nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu vektoru před kmenem viru divokého typu, je v podstatě genové antivirové agens vybrané ze skupiny zahrnující antisense molekulu, imunogen a ribozym.
Termín „antisense molekula“ je molekula, která zrcadluje krátký segment genu, jehož exprese má být blokována. Antisense molekula určená proti HIV hybridizuje s RNA HIV divokého typu, což umožňuje její preferenční degradaci buněčnými nukleázami. Antisense molekuly jsou s výhodou DNA oligonukleotidy, jejichž délka by měla být okolo 20 až 200 párů bází, upřednostňuje se okolo 20 až 50 párů bází a v optimálním případě méně než 25 párů bází. Antisense molekula může být exprimována z crHTV RNA, která se preferenčně váže na genomovou RNA divokého typu, přičemž udílí crHTV RNA selektivní výhodu při balení do virionů progenů.
„Imunogen“ je jednořetězcová protilátka (scAb) směrovaná na virový strukturální protein. Imunogen je přenesen jako nukleová kyselina a exprimuje se intracelulámě. Imunogen může také být libovolný antigen, povrchový protein (zahrnuje ty rozdělené do tříd) nebo protilátka, která umožňuje selekci vektoru a/nebo hostitelské buňky. U preferovaného vektoru sekvence nukleové kyseliny obsahuje scAb, která se váže na Rev protein HIV divokého typu. To s výhodou brání maturaci Rev proteinu, což vede k jeho utajení v endoplazmatickém retikulu. Proteiny Rev exportují HIV RNA neupravenou sestřihem do cytoplazmy prostřednictvím navázání na RRE a pak oligomerizaci na okolní RNA HIV. HIV RNA, která tvoří komplex s Rev jsou exportovány do cytoplazmy a obchází buněčnou úpravu sestřihem. V případě, že se Rev divokého typu neváže na RRE divokého typu, se HTV RNA divokého typu neexportují do cytoplazmy a nejsou uzavřeny do kapsidu virionů progenů.
V optimálním případě vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny scAb dále obsahuje modifikovanou RRE sekvenci a kóduje mutovaný Rev protein, který rozeznává modifikovaný RRE, ale nerozeznává RRE divokého typu. V buňkách, které obsahují HTV divokého typu a vektor obsahující sekvenci nukleové kyseliny scAb, je vektor s výhodou balen do virionů. Podobná strategie se s výhodou použije tam, kde proteiny matrice HIV divokého typu nebo nukleokapsidu (nebo libovolného proteinu, který se podílí na interakcích protein/RNA, které ovlivňují vznik kapsidu virové RNA) jsou cílem scAb.
„Ribozym“ je antisense molekula s katalytickou aktivitou, to znamená, že místo vázání RNA a inhibice translace ribozymy se váží na RNA a působí místně specifické štěpení navázané molekuly RNA. Obecně existují čtyři skupiny ribozymů: intervenující sekvence Tetrahymena skupina I, RNáza P a ribozym „hammerhead“ a vlásenkový (hairpin) ribozym. Další katalytické motivy však existují také vjiných molekulách RNA, např. virus hepatitidy delta a ribozomální RNA v mitochondriích hub.
Preferované ribozymy jsou ty, kde katalytická doména štěpí 3'-nukleotid NUH sekvence, kde N může být nukleotid (to znamená G, A, U nebo C) a H může být buď A, C nebo U. Protože sekvence, která se štěpí nejúčinněji takovými ribozymy, je místo GUC, upřednostňuje se, aby sekvence NUH obsahovala místo GUC.
Takový ribozym štěpí v oblasti kmene viru divokého typu nebo jeho transkripty, ale neštěpí v oblasti vektoru nebo jeho transkripty. Ribozym štěpí virus nebo jeho transkripty ve smyslu, že takový virus nebo vektor může být buď RNA nebo DNA, jak se popisuje dříve v textu. Termín štěpení „v oblasti“ míní štěpení v cílové oblasti, to znamená s výhodou oblast viru, která je
-11 CZ 294170 B6 nezbytná při propagaci viru. Vektor se modifikuje tak, že tato určitá cílená oblast (to znamená jeli celá přítomna ve vektoru) není štěpena ribozymem. Ribozym může štěpit vektor tak dlouho, pokud se štěpení neobjeví v oblasti, která je nutná při propagaci viru, např. crHIV partikulí.
V optimálním případě ribozym je kódován sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQIDNO:3 (to je CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA) aSEQIDNO:4 (to je ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC). Zatímco SEQ ID NO: 3 obsahuje ribozym, který směřuje do místa +115 (to je počet bází downstream od počátku transkripce) oblasti U5 HIV divokého typu, SEQ ID NO: 4 obsahuje ribozym, který je cílen do místa +133 oblasti U5 HIV divokého typu.
Takový ribozym je schopný štěpit genom HTV divokého typu (nebo jeho transkripty), ale ne genom vektoru (nebo jeho transkripty), protože sekvence vektoru U5 jsou modifikovány místně specifickou in vitro mutagenezí, která je dobře známa v oboru a je popsána v příkladu 1. Upřednostňované sekvence vektoru se modifikují tak, že vektor obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2 (to je GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGAAC), SEQ ID NO:5, (to je GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC), SEQ ID NO:6 (to je GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAACTAGAGATC), SEQ ID NO: 14, kde alespoň jeden N je mutován, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 16. Jestliže se vektor vyskytuje ve formě RNA, obsahuje s výhodou sekvenci kódovanou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, kde alespoň jeden N je mutován, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO:16. Naopak HIV divokého typu obsahuje U5 sekvenci kódovanou sekvencí SEQ ID NO:1 (to je GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC). Modifikace in toto a srovnání se sekvencí U5 divokého typu (ve formě DNA) jsou zobrazeny na obrázku č. 2.
Mohou se použít buď samotné ribozymy cílené do dalších oblastí virového genomu, zvláště do genomu HTV, nebo mohou být v kombinaci. Ribozym může například štěpit další sekvence RNA nutné při replikaci viru, např. oblast reverzní RNA nutné při replikaci viru, např. oblast reverzní transkriptázy, proteázy nebo transaktivátoru proteinu, Rev nebo je-li to nezbytné již popsané sekvence. Vektor obsahuje více ribozymů, které jsou například cíleny do více míst. V takových případech analogové sekvence ve vektoru se modifikují místně řízenou mutagenezí nebo některými jinými způsoby, které jsou známy v oboru, přičemž vzniká vektor, který je rezistentní ke štěpení takového ribozymů.
Jestliže vektorem je HIV, upřednostňuje se, aby vektor neobsahoval gen tat a jeho 5' místo sestřihu obsahuje trojnásobnou anti-Tat ribozymovou kazetu, kde katalytická doména každého ribozymů trojnásobné ribozymové kazety štěpí různé místo v molekule nukleové kyseliny HIV divokého typu, zvláště v odlišném místě v genu tat. Upřednostňuje se, aby katalytická doména každého ribozymů štěpila nukleotidovou sekvenci v oblasti samotné molekuly nukleové kyseliny HTV divokého typu, pro který neexistuje ve vektoru protějšek citlivý vůči ribozymů.
2. Sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost udílí selektivní výhodu buňkám, které jsou infikovány vektorem obsahujícím tuto sekvenci, před buňkami infikovanými kmenem viru divokého typu.
Sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost udílí selektivní výhodu buňkám, které jsou infikovány vektorem obsahujícím tuto sekvenci, před buňkami infikovanými kmenem viru divokého typu (to znamená, že nemají danou sekvenci), je s výhodou libovolná sekvence, která umožňuje buňce obsahující vektor přežít a propagovat virové partikule (to znamená crHIV virových partikulí) ve srovnání s buňkou obsahující virus divokého typu. Takové sekvence zahrnují například libovolnou sekvenci, která umožňuje buňce nebo vektoru, který je obsažený v buňce, uniknout poškození, dále sekvence, které podporují přežití buňky, sekvence, které indukují apoptózu, sekvence, které umožňují produkci proteinu nebo sekvence, které podporují imunitní funkci nebo cílení.
-12CZ 294170 B6
Upřednostňuje se například, aby taková sekvence nukleové kyseliny obsažená ve vektoru kódovala geny pro rezistenci na několik léků (např. Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 141, 956-962 (1986); Ueda et al., J. Biol. Chem., 262, 505-508 (1987); a Ueda et al., PNAS, 84, 3004-3008 (1987)). Jestliže se přidá cytotoxická látka (např. jako se užívá při chemoterapii v případě zhoubného bujení) buňka obsahující vektor přežívá, zatímco buňka, která obsahuje virus divokého typu, jako je HIV, odumírá. Takové cytotoxické látky zahrnují např. aktinomycin D, sulfát vinblastinu, sulfát vinkristinu, daunomycin, adriamycin, VP-16 a AMSA.
V jiném případě je nutné, aby sekvence nukleové kyseliny obsahovala sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvenci (nebo sekvenci, která kóduje) mutované (to je mutant) proteázy a sekvenci (nebo sekvenci, která kóduje) mutovanou (to je mutant) reverzní transkriptázy. Mutovaná reverzní transkriptáza je přednostně připravena tak, že je rezistentní k inhibitorům nukleosidové a nenukleosidové reverzní transkriptázy a mutovaná proteáza je připravena tak, aby byla rezistentní k běžně používaným inhibitorům proteázy.
Aplikace těchto inhibitorů proteáz nebo reverzních transkriptáz na hostitele v konjugaci s vektorem se používá při selekci buněk, které produkují vektor, na rozdíl od buněk, jež produkují virus divokého typu. Podobně se tento přístup modifikuje za účelem použití s libovolným lékem, který inhibuje virovou replikaci tak, že se virus může mutovat, aby unikl inhibici. Za účelem léčby HIV sekvence nukleové kyseliny selektivně inkorporovaná do vektoru s výhodou obsahuje mutované sekvence HTV. V optimálním případě tyto sekvence však nepředcházejí superinfekci HIV divokého typu.
Upřednostňovaný vektor je jeden z těch, které jsou popsány shora v textu a zvláště preferované vektory crHIV jsou zobrazeny na obrázcích č. 1B až 1E, což jsou crHIV-1.1, crHIV-l.il, crHIV-1.12 a crHIV-1.111 (Dropulic et al., PNAS, 93, 11103-11108 (1996)). Také se preferuje vektor popsaný v příkladu 11, to znamená cr2HTV.
Vektor cr2HIV přednostně neobsahuje gen tat a místo sestřihu z genomu HTV divokého typu. Na místě genu tat a jeho místě sestřihu vektor cr2HIV obsahuje trojnásobnou Tat ribozymovou kazetu, kde katalytická doména každého ribozymu trojnásobně ribozymové kazety štěpí různé místo v molekule nukleové kyseliny HIV divokého typu. Upřednostňuje se, aby katalytická doména každého ribozymu trojnásobné ribozymové kazety štěpila odlišné místo v genu tat v molekule nukleové kyseliny HIV divokého typu. Výhodnější je, aby katalytická doména každého ribozymu štěpila nukleotidovou sekvenci v oblasti molekuly nukleové kyseliny HIV divokého typu, pro kterou neexistuje ve vektoru protějšek rezistentní k ribozymu.
V optimálním případě je vektor kompatibilní s buňkou, do které se vnáší, např. je schopen v buňce zajistit expresi sekvencí nukleové kyseliny kódovaných vektorem. Vektor obsahuje počátek replikace, který je funkční v buňce. V případě, že sekvence nukleové kyseliny se transformuje do formy DNA kódující sekvence (např. versus formě celého genu, který obsahuje svůj vlastní promotor), pak v optimálním případě vektor také obsahuje promotor, který je schopný řídit expresi kódující sekvence a je operativně spojen s kódující sekvencí. Kódující sekvence je „operabilně spojena“ s promotorem (např. v případě, že kódující sekvence a promotor dohromady tvoří nativní nebo rekombinantní gen), kdy promotor je schopný řídit transkripci kódující sekvence.
V rekombinantním vektoru podle vynálezu jsou správně umístěny všechny signály transkripce (např. iniciační a terminační signály), translace (např. vstupní nebo vazebné místo na ribozymu a podobně) a signály zpracování (např. donorová nebo akceptorová místa sestřihu, jsou-li nezbytná, a polyadenylační signály) tak, že libovolný gen nebo kódující sekvence je správně přepisována (a/nebo překládána, je-li to nutné) v buňce, do které je vektor vnesen. Provádí se manipulace s takovými signály, aby se zajistila správná exprese v hostitelských buňkách.
-13CZ 294170 B6
Vektor přednostně také obsahuje některé prostředky, pomocí kterých je možné identifikovat a vybrat vektor nebo jeho obsaženou subklonovanou sekvenci. Identifikace a/nebo selekce vektoru je provedena za použití různých přístupů, které jsou v oboru dobře známy. Vektory, které například obsahují určité geny nebo kódující sekvence se s výhodou identifikují hybridizací, přítomností nebo absencí funkcí genů, které se nazývají „signální“ a jsou kódovány signálními geny přítomnými na vektoru a/nebo expresí určitých sekvencí. V případě prvního přístupu přítomnost určité sekvence ve vektoru se detekuje hybridizací (např. DNA-DNA hybridizací) za použití sond obsahujících sekvence, které jsou homologní s relevantní sekvencí. V případě druhého přístupu rekombinantní systém hostitel/vektor se identifikoval a vybral na základě přítomnosti nebo absence jistých funkcí signálního genu, jako je rezistence na antibiotika, aktivita tymidinové kinázy a podobně, které jsou dány přítomností určitých genů, jež kódují tyto funkce, ve vektoru. V případě třetího přístupu vektory se identifikovaly na základě testování určitého genového produktu, který je kódován vektorem. Takové testy jsou založeny na fyzikálních, imunologických nebo funkčních vlastnostech produktu genu.
Vynález také poskytuje vektor, který v případě, že jde o DNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16 a který v případě, že jde o RNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16.
Vynález dále popisuje způsob přípravy vektoru s ribozymem, který je odvozen od HIV divokého typu a který je schopný se replikovat pouze v hostitelské buňce, která je permisivní pro replikaci uvedeného vektoru. Ribozym, který je obsažen ve vektoru nebo je jím kódován, štěpí nukleovou kyselinu HIV divokého typu, ale neštěpí samotný vektor a jeho transkripty, jestliže existují. Způsob zahrnuje získání vektoru, který je odvozen od HIV divokého typu a který je schopný se replikovat pouze v hostitelské buňce, která je permisivní pro replikaci uvedeného vektoru, a začlenění sekvence nukleové kyseliny do vektoru, přičemž sekvence nukleové kyseliny obsahuje nebo kóduje ribozym, jehož katalytická doména štěpí nukleovou kyselinu HIV divokého typu, ale neštěpí samotný vektor nebo jeho transkripty v případě, že existují. U takových metod nukleotidová sekvence obsahující nebo kódující sekvenci U5 HIV divokého typu může být z vektoru deletována a nahrazena nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, v případě, že vektor je DNA, a nukleotidovou sekvencí kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, jestliže vektor je RNA. Upřednostňuje se, aby se vektor replikoval v hostitelské buňce, která umožňuje replikaci uvedeného vektoru, více než jednou.
Vynález dále popisuje způsob modifikace vektoru. Způsob zahrnuje získání vektoru a zavedení nukleotidové sekvence do vektoru, která je vybrána ze skupiny obsahující DNA sekvence SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, v případě, že vektor je DNA, a nukleotidové sekvence kódované nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, v případě, že vektorem je RNA.
Dále vynález popisuje způsob propagace a selektivního balení podmíněně se replikujícího vektoru, kdy se nepoužívá balicí buněčná linie. Způsob zahrnuje kontakt podmíněně se replikujícího vektoru s buňkou, která je schopna se infikovat dalším vektorem, jde o vektor stejného typu, jako je podmíněně se replikující vektor, a liší se od podmíněně se replikujícího vektoru tím, že s ohledem na kompetentnost replikace se chová jako divoký typ; pak následuje kontakt buňky s dalším vektorem; a kultivace buňky za podmínek, které přispívají propagaci podmíněně se replikujícího vektoru.
Vynález také popisuje molekulu izolované a čištěné nukleové kyseliny vybrané ze skupiny zahrnující molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny
- 14CZ 294170 B6 obsahující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16 a molekulu RNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16.
Způsob použití
Vektory popsané shora v textu jsou přednostně zavedeny do hostitelské buňky za účelem profylaxe a léčby virové infekce, jednoduchého udržování vektoru a z dalších důvodů. Vynález popisuje hostitelskou buňku, která obsahuje vektor podle vynálezu. Izolace hostitelských buněk a/nebo udržování takových buněk nebo buněčných linií, které se v kultuře od nich odvodily, se stávají rutinou a jsou dobře známy v oboru.
Popsaný vektor se používá při profylaxi a léčbě virové infekce, upřednostňuje se infekce způsobí virem divokého typu, s výhodou jde o RNA virus divokého typu, dokonce ještě výhodnější je retrovirus divokého typu a v optimálním případě je infekce způsobena HIV divokého typu.
Způsob zahrnuje kontakt hostitelské buňky, která je schopna být infikována virem divokého typu, s podmíněně replikujícím se vektorem, který je schopen se replikovat pouze v hostitelské buňce permisivní pro replikaci vektoru, jehož přítomnost, transkripce nebo translace inhibuje replikaci kmene viru divokého typu v hostitelské buňce. Vektor se replikuje více než jednou a obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která (to znamená její přítomnost, transkripce nebo translace) udílí vektoru v hostitelské buňce selektivní výhodu před kmenem viru divokého typu, který je v optimálním případě kmen, ze kterého je vektor odvozen.
Na základě tohoto způsobu sekvence nukleové kyseliny s výhodou zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která obsahuje nebo kóduje genové antivirové agens, které negativně působí na replikaci a/nebo expresi viru, jenž je jiný než uvedený vektor. Genové antivirové agens je vybráno ze skupiny zahrnující antisense molekulu, ribozym a imunogen. V optimálním případě genově antivirové agens je ribozym, jehož katalytická doména s výhodou štěpí 3'nukleotidovou NUH sekvenci (to je zvláště sekvenci GUC). V optimálním případě je ribozym kódován nejméně z části sekvencí, vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4. Ribozym štěpí v oblasti kmene viru divokého typu nebo jeho transkripty, neštěpí v oblasti vektoru nebo jeho transkriptů. Tato skutečnost je způsobena tím, že kmen viru divokého typu obsahuje sekvenci kódovanou SEQ ID NO:1, zatímco vektor, jestliže je ve formě DNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16, a jestliže je ve formě RNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 14, kde alespoň jeden N je mutován, 15 a 16.
Tento způsob se také používá v případě, že vektor obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která (to znamená její přítomnost, transkripce nebo translace) udílí v hostitelské buňce infikované vektorem selektivní výhodu před buňkou infikovanou kmenem viru divokého typu, který je v optimálním případě kmen, ze kterého je vektor odvozen. V tomto ohledu vektor může obsahovat nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu hostitelské buňce infikované virem a nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která udílí selektivní výhodu vektoru před kmenem viru divokého typu, který odpovídá viru, ze kterého byl vektor odvozen.
Způsob se s výhodou používá tam, kde sekvence nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující rezistenci na více léků. V jiném případě se způsob používá tam, kde sekvence nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující mutovanou (mutant) proteázu a nukleotidovou sekvenci kódující mutovanou (mutant) reverzní transkriptázu, jako v případě, když virová infekce, která má být profýlakticky nebo terapeuticky léčena, je způsobena retrovirem.
-15 CZ 294170 B6
Způsob dále s výhodou zahrnuje aplikaci agens vybraného ze skupiny zahrnující cytotoxickou látku, inhibitor proteázy a inhibitor reverzní transkriptázy (to je vedle aplikace vektoru) na hostitelskou buňku.
Vektor se může použít v souladu se způsobem popsaným shora v textu, ne pouze při léčbě virové infekce, ale také při ochraně potenciální hostitelské buňky před virovou infekcí, to znamená způsob profylaxe virové infekce nebo „vakcinace“ proti viru, jakým je RNA virus, zvláště retrovirus, jako je HIV. Způsob v podstatě inhibuje replikaci kmene viru divokého typu předtím, než se hostitelská buňka dostane do kontaktu s kmenem viru divokého typu. S ohledem na to vektor může obsahovat nebo kódovat proteiny, které blokují superinfekci virem divokého typu. Způsob zahrnuje kontakt hostitelské buňky s podmíněně se replikujícím vektorem, jak se popisuje shora v textu, a „pomocný expresivní vektor“, to je virový genom, kteiý podporuje replikaci „vektoru“ v neinfikovaném hostiteli. Podmíněně se replikující vektor obsahuje selektivní výhodu při balení a/nebo propagaci. Navíc vektor například může obsahovat sekvenci, která zvyšuje počet buněk, které přežijí, podporuje produkci viru, indukuje apoptózu, umožňuje produkci viru a/nebo podporuje imunitní funkci a/nebo cílení. Konstrukce „pomocného expresivního vektoru“ je libovolný expresivní vektor, který doplňuje neschopnost „vektoru“ se replikovat. Takové pomocné expresivní vektory jsou běžné a pro odborníky je jednoduché je vytvořit. Pomocný expresivní vektor se bud’ balí do virionů, podobně jako vektor, nebo se exprimuje bez nutnosti balení. Protože „vektor“ má selektivní výhodu pro balení a/nebo propagaci, tento systém umožňuje bezpečný způsob pro dosažení vysoké replikace viru bez možných patogenních účinků, ke kterým může potenciálně dojít při použití živého oslabeného viru. Navíc vektor se může smísit s nespecifickým adjuvans za účelem zvýšení imunogenicity. Taková adjuvans jsou v oboru známa a zahrnují například Freundovo úplné nebo neúplné adjuvans, emulze obsahující komponenty stěn bakteriálních a mykobakteriálních buněk a podobně.
V případě, že se vektor používá v souladu se shora popsaným způsobem při profylaxi virové infekce, vektor může kódovat antigen proteinu, který není kódován virem divokého typu, jako je mutantní virový protein nebo nevirový protein. Vektorem kódovaný antigen může například být bakteriálního původu nebo může pocházet z kancerogenních buněk. Dále „vektor“ také může kódovat gen MHC za účelem vhodné prezentace antigenu v hostitelském imunitním systému. Pak se takový vektor může použít k vyvolání perzistentní imunní odezvy proti souboru potenciálních patogenů a/nebo endogenních proteinů (např. nádorově specifickému antigenu), které jsou selektivně exprimovány v abnormálních buňkách.
Navíc expresivní vektor „pomocného viru“ se může zkonstruovat tak, že je exprimován pouze ve specifických typech buněk (např. kmenové buňky, profesionální buňky, ve kterých je přítomen antigen a nádorové buňky) adicí nebo vypuštěním specifického genového elementu/faktoru (buď ve vektoru nebo v expresivní konstrukci pomocného viru), což umožňuje buněčně specifickému vektoru replikaci a rozšíření. Takový vektor se stále rozšiřuje komplementací s konstrukcí pomocného viru, je buněčně specifický v závislosti na jistém genovém elementu/faktoru, je-li přidán do vektoru nebo je-li z něho vypuštěn, nebo na konstrukci pomocného vektoru. Tento způsob se může užívat samostatně nebo v kombinaci s další shora uvedenou strategií.
Např. podmíněně se replikující vektor HIV se replikuje specificky v makrofágách, spíše než v T-buňkách. Vektor, který obsahuje Tat-defektní HTV (vektor kóduje další proteiny HIV, ale ty nejsou exprimovány, protože není přítomen transaktivátor transkripce Tat), může kódovat ribozym, který štěpí HTV divokého typu, ale ne podmíněně se replikující HTV RNA. Pomocný expresivní vektor tohoto vektoru může kódovat gen tat exprimovaný z promotoru, který je specifický pro makrofága. Pak crHTV se bude podmíněně replikovat pouze v makrofágových buňkách, protože není schopen se replikovat v T-buňkách nebo v jiném typu buněk.
V jiném případě může být gen tat operabilně spojen s nádorově specifickým promotorem; pak crHIV se bude replikovat pouze v nádorových buňkách CD4 a ne v normálních CD4 buňkách. Genový element/faktor může také být modifikace promotorové sekvence vektoru, který je
-16CZ 294170 B6 exprimován pouze ve specifických buněčných typech a ne v jiných typech buněk v souladu s expresivní konstrukcí „pomocného viru“.
V jiném provedení pomocná expresivní konstrukce nebo vektorová konstrukce obalových proteinů (jestliže taková konstrukce je upravena tak, že obsahuje obalové proteiny) se může modifikovat tak, že virion s vektorem bude specificky infikovat jisté buněčné typy (např. nádorové buňky), zatímco není schopen infikovat jiné typy buněk (např. normálních buněk). V ještě dalším provedení adenovirus, kterému chybí jeden nebo více klíčových faktorů pro replikaci, může být komplementován použitím pomocné konstrukce, která poskytuje takové faktoiy spojené k nádorově specifickému promotoru. Faktory, které mohou doplňovat replikaci adenoviru, se budou exprimovat pouze v nádorových buňkách, přičemž umožňují replikaci viru v nádorových buňkách (exprese proteinů je nutná pro usmrcení buňky), ale ne v normálních buňkách.
Vynález dále popisuje také způsob léčby zhoubného bujení a zvláště léčbu leukemie T-buněk. „Léčba zhoubného bujení“ podle vynálezu zahrnuje aplikaci hostiteli dále modifikovaného vektoru, který je zde popsán, za účelem způsobení léčebné odezvy. Taková odezva může být odhadnuta například monitorováním utlumení růstu nádoru a/nebo regrese nádoru. „Růst nádoru“ znamená zvětšování velikosti nádoru a/nebo počet nádorů.
„Zhoubné bujení“ podle vynálezu je charakterizováno abnormální proliferací buněk a absencí kontaktní inhibíce, která je prokázána tvořením nádoru. Termín znamená zhoubné bujení lokalizované v nádorech stejně jako zhoubné bujení, které není lokalizované v nádorech, např. se jedná o karcinomové buňky, které se šíří z lokality nádoru invazí nebo se systematicky rozšiřují tvorbou metastáz. V teoretickém případě podle vynálezu se libovolný typ nádoru může podrobit léčbě podle vynálezu. Zhoubné bujení musí být virového původu.
Shora popsané vektory se mohou přímo použít při genové terapii in vivo. Současné strategie genové terapie trpí tím, že do velkého procenta buněk nelze zprostředkovat zavedení genu. Infekce je dosažena pouze u určitého procenta buněk. To je zvláště důležité při strategii předcházení nádorů, kde je nutná transdukce genu do celé nádorové populace. Jestliže se přidá „vektor“ v souladu s „pomocným vektorem“ transdukované buňky budou bezprostředně produkovat virové partikule, které mohou infikovat okolní buňky a tak umožňují dosažení úplné transdukce a vysoké účinnosti transdukce. U jednoho provedení vynálezu lidský retrovirus (kterým může být HTV nebo retrotranspozovaný element) se může s „pomocnou“ konstrukcí zavést do tkáně (nebo do buněk in vitro). Buňky obsahující vektor a pomocný vektor budou bezprostředně produkovat virus a budou balit vektor do virionú. Tyto viriony budou schopny zprostředkovat transdukci okolních buněk s vysokou účinností (protože kontakt buňka-buňka je nejúčinnější způsob transdukce buněk). Transdukované buňky mohou nebo nemusí zemřít, což závisí na skutečnosti zda kombinace vektor/„pomocník“ vede k cytolytické infekci. V případě, že se použije retrotranspozon, „pomocník“ nemusí obsahovat strukturální proteiny, protože normální nebo nádorové buňky mohou obsahovat protein/faktor nezbytný při kapsidaci virionů.
V takovém případě pomocník může pouze být transaktivátorový protein, který aktivuje transkripci faktorů nutných při retrotranspozonové kapsidaci. V případě HTV mohou být při kapsidaci genomu HTV do progenových virionů pro infekci/transdukci buněk nutné další faktory.
Shora popsané vektory se také mohou použít při „counter-chemical“ a „counter-biological“ konfliktní strategii. Například podmíněně se replikující vektor se může zavést do jednotlivých právě infikovaných buněk s vysoce patogenním virem nebo bakterií nebo chemickým činidlem (např. toxin). Vektor interferuje s replikací patogenního viru, jak se popisuje shora v textu. Podmíněně se replikující vektor se také může použít při antibakteriální nebo antichemické strategii v souladu s expresí pomocného vektoru („pomocníka“).
Podmíněně se replikující vektor například může vylučovat protilátky proti bakteriím a toxinům poté, co pomocník umožní jejich expresi a propagaci. „Pomocník“ se může řídit (což není
- 17CZ 294170 B6 nezbytné) indukovatelným promotorem, který umožní jeho expresi při aktivaci pomocí bakterií, cytokinu (při odezvě na bakteriální infekci), antibiotika (pomocí promotorového systému indukovatelného tetracyklinem (Paulus et. al., J. Virol., 70, 62-67 (1996)) nebo chemikálií (např. samotným toxinem). Pak podmíněně replikující se vektor se nebude pouze selektivně množit za pomoci „pomocníka“ jako odezva na vyskytující se patogen nebo toxin (což je výsledek aktivace pomocníka), ale také bude vylučovat protilátky proti patogenu nebo toxinu za účelem inhibice patogenních účinků nádorového antigenu, patogenu nebo chemikálie (např. toxinu). Pak libovolný protein, faktor nebo genetický element, který se může přepsat na buď mRNA a/nebo protein se může vložit do podmíněně se replikujícího vektoru za účelem inhibice patogenní odezvy, což je v souladu s „pomocníkem“, který podporuje jeho selektivní propagaci a expresi (jde o selektivní propagaci nebo expresi, protože produkty pomocníka se exprimují podmíněně (např. (a) indukovatelný promotorový systém, což znamená, že faktor v nádorové buňce aktivuje produkci pomocného faktoru, sekvenci odezvy na toxin, která exprimuje pomocný faktor, nebo promotor odezvy na cytokin indukuje produkci pomocného faktoru, (b) pomocná RNA/protein/faktor se selektivně stabilizuje pouze v určitých buňkách) a (c) nepřímá indukce genu třetí třídy, která ovlivňuje produkci pomocného virového proteinu, cílení, strukturu nebo jinou biofunkci). Takové strategie se mohou používat u transgenních rostlin a zvířat při jejich ochraně před patogeny. Taková strategie se podobně může použít v transgenních systémech za účelem produkce heterologních proteinů/faktorů.
V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy buněčné linie za účelem testování léku/faktoru pro určení například části proteinu/faktoru, která je důležitá pro určitou funkci. Vektor se může připravit za účelem exprese mutagenizovaného proteinu v dané buněčné linii. RNA kódující mutagenizovaný protein se však může připravit tak, že je rezistentní na ribozym, například inzercí tiché bodové mutace. Exprese proteinu divokého typu se však inhibuje v buněčné linii. Mohou se konstruovat vektory, které exprimují ribozym k proteinu, jenž je středem zájmu, za účelem exprese mutovaného testovacího proteinu. V případě, že vektor se transdukuje do buněk, štěpí se většina nativní RNA kódující normální protein, zatímco se exprimuje mutovaný testovací protein. Tato metoda se používá společně se současně vyvinutou zaváděcí a selekční metodou, jako rychlá a velmi účinná metoda stanovení funkcí daného proteinu a interakcí daného faktoru/léku s proteinem.
Existuje řada použití způsobu a vektorů podle vynálezu in vitro. Vektory se například mohou použít při zjištění jistých nuancí virové replikace a ribozymové funkce. Podobně vektory obsahující ribozym se mohou použít jako diagnostika, například pro stanovení mutace přítomné v nemocných buňkách nebo při stanovení genového posunu.
Výhody vynálezu
Výhody použití crHIV strategie při genové terapii AIDS a jiných virů jsou zřejmé. Vyřešil se například problém cílení vektoru do buněk infikovaných HIV. Po in vivo transfekci crHTV do buněk infikovaných CD4+, se crHIV zabalily do progenových virionů za použití endogenních infekčních obalových proteinů HTV. RNA crHIV se drží uvnitř progenových virionů a infikuje buněčné typy, které jsou normálně infikovatelné pouze určitým kmenem HIV, vznikají nepatogenní viriony. Takto se obchází problémy s cílovými buňkami, jako jsou mikroglie mozku, které jsou hlavním zásobníkem infekce HIV centrálního nervového systému. S crHTV vektory, které infikují neinfikované buňky CD4+, je spojena slabá toxicita, protože crHTV vektory nekódují žádné virové proteiny. Výsledkem soutěže crHTV a HIV divokého typu je produkce nepatogenních partikulí, které vedou ke snížení množství viru. Snížení množství patogenního HTV-1 nemusí pouze zvýšit čas přežití infikovaných jedinců, ale také může snížit rychlost transmise do neinfikovaných jedinců, protože partikule crHTV se také mohou šířit systematicky (to znamená jako infekční HIV). Snížení množství patogenního HTV-1 v krvi může být zvláště důležité u těhotných jednotlivců infikovaných HIV, protože produkce crHIV může také snížit přenos HIV-1 z infikovaných matek na plod v děloze.
-18CZ 294170 B6
Směs plazmidová DNA/lipid, která se může použít při zavedení vektoru crHTV do hostitelských buněk, by měl být stabilní a jeho produkce by měla být laciná, což umožňuje obejít vysoké náklady na in vivo strategie. Způsob podle vynálezu je samozřejmě flexibilní a může se také použít, je-li to nutné, při ex vivo zavedení genu. Bez ohledu na to schopnost přístupu zprostřed5 kovaného lipozomy otevírá možnost léčby obecné populace, což není možné ve spojení se současnou strategií genové terapie. Vektory crHTV se mohou upravit tak, že obsahují několik ribozymů, které se mohou připravit pro různé cíle na genomu HIV. To redukuje možnost mutace infekčních HIV a úniku účinku anti-HIV ribozymů. Dále strategie podmíněně se replikujících kompetentních virů se může použít při léčbě jiných virových infekcí, zvláště těch, kde je vysoká 10 frekvence přeměny viru. Zvláště užitečným rysem vektorů crHIV je, že se mohou použít posttranskripčně pro expresi genového antivirového agens, např. ribozymů. Tak infekce buněk, které nejsou infikovány vektory crHTV mají nízkou toxicitu, protože slabá exprese je řízena promotorem HIV dlouhé terminální repetice (LTR) za nepřítomnosti proteinu Tat. Vysoká úroveň exprese crHTV a jeho podstatná antivirová aktivita se vyskytuje pouze, když protein Tat se 15 objevuje na základě komplementace s HIV divokého typu. Vektory crHIV nejsou připraveny za účelem ochránit buňky před infekcí HTV, ale snížit zatížení HIV divokého typu pomocí akumulace nepatogenních partikulí crHIV.
Věří se, že ribozymy se mohou použít, jak potvrzují následující příklady tak, že poskytují geno20 my crHTV se selektivní výhodou vzhledem k dvěma použitelným vlastnostem: (1) mají vysoký stupeň specifity a (2) mají relativní účinnost v závislosti na jejich schopnosti ko-lokalizace s cílovou RNA (Cech, Science, 236, 1532-1539 (1987)). Specifíta ribozymů se prokazuje jejich specifickou hybridizací s komplementárně cílovými sekvencemi, které obsahují místo XUY. Ribozymy jsou relativně účinné, protože s vysokou účinností štěpí cílové RNA, pouze je-li 25 účinně ko-lokalizován s cílovou RNA. V případě smíšené infekce HTV/crHIV musí dojít ke kolokalizaci RNA crHTV, která obsahuje ribozym, s RNA HTV divokého typu, protože genomy RNA HIV dimerizují předtím, než jsou zabaleny do progenových virionů. Štěpení negenomových RNA HTV divokého typu je nutné při produkci virových proteinů, je pravděpodobně méně účinné, než štěpení genomové RNA HTV divokého typu, když negenomová RNA HIV není 30 dimerizována. Na základě zde popsaných experimentů se zjistilo, že selektivní výhoda, kterou způsobuje RNA crHIV, je zprostředkována selektivním balením crHTV do virových partikulí. Tyto prostředky naznačují, že k nejúčinnějšímu štěpení dochází uvnitř buňky během dimerizace, což vede k selektivnímu poškození RNA HIV nukleázami hostitele. To umožňuje s výhodou balení RNA crHTV do virových partikulí.
Aplikace vektorů crHIV při terapii HTV nemusí zahrnovat pouze selekci genomu crHIV, ale také buněčnou selekci buněk, které produkují partikule crHTV. V jiném případě buňky produkující HTV divokého typu budou produkovat partikule HIV divokého typu, přičemž buňky produkující partikule crHTV mají selektivní výhodu, a rychle převládají. Selektivní výhoda může být pro 40 crHTV exprimující buňky zajištěna začleněním genu do crHTV genomů (např. gen rezistence na více léků), kterou propůjčují buňky exprimující crHIV (v přítomnosti léku) spolu s výhodou přežití pro všechny buňky, které exprimují HTV divokého typu. Za těchto podmínek buňky exprimující HIV divokého typu progresivně umírají, ale stále produkují nějaký HTV divokého typu, zatímco buňky exprimující crHTV, které selektivně produkují crHIV přežívají. Infekce 45 buněk, které obsahují crHIV, se zbývajícím HIV divokého typu povede dále k produkci virových partikulí, jež obsahují crHTV. Tak posun virového genomu může vést ke kumulativní infekci buněk CD4+ s genomem crHIV, přičemž se mění rovnováha viru v hostiteli z genomů patogenního HTV divokého typu na nepatogenní crHIV. Taková strategie může vést k odstranění HTV divokého typu poté, co je rovnováha genomů HTV selektivně posunuta směrem k crHIV. 50 Replikace viru se zastaví, protože crHTV se může pouze replikovat v přítomnosti pomocných genomů HTV divokého typu. Proto za takových mutantně restriktivních podmínek je možné připravit vektory crHIV, které ne pouze snižují množství viru HIV divokého typu, ale také vytěsní virus z hostitele infikovaného HIV.
-19CZ 294170 B6
Způsoby aplikace
Vektor je podle vynálezu zaveden do hostitelské buňky pro účely genové terapie virové infekce způsobem, který byl už dříve popsán. Způsob zavedení zahrnuje kontakt hostitele, který je schopný být infikován virem s vektorem podle vynálezu. S výhodou takový kontakt zahrnuje libovolné způsoby, kterými se vektor zavádí do hostitelské buňky; způsob nezávisí na jakémkoli určitém způsobu zavedení a není tak konstruovaný. Způsoby zavedení jsou v oboru dobře známy a jsou zde také uvedeny.
Zavedení se uskutečňuje např. buď in vitro (např. způsob genové terapie ex vivo) nebo in vivo, což zahrnuje použití elektroporace, transformace, transdukce, konjugace triparentální párování, transfekce, infekce, membránová fuze s kationickými lipidy, vysokorychlostní bombardování mikroprojektily potaženými DNA, inkubace se sraženinou fosforečnanu vápenatého a DNA, přímá mikroinjektáž do jednotlivých buněk a podobně. Jiné metody jsou také dostupné a jsou v oboru dobře známy.
Vektory a ribozymy jsou s výhodou zaváděny způsobem kationických lipidů, například lipozomů. Takové lipozomy jsou běžně dostupné (např. Lipofectin®, Lipofectamine™ a podobně, z firmy Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Podle vynálezu se mohou použít lipozomy, které mají zvýšenou kapacitu přenosu a/nebo sníženou toxicitu in vivo (např. jak se popisuje v patentové přihlášce PCT WO 95/21259). V případě použití lipozomů se může postupovat podle doporučení, uvedeného v patentové přihlášce PCT WO 93/23569. Obecně taková formulace je pohlcena většinou lymfocytů během 8 hodin při teplotě 37 °C. Po jedné hodině od intravenózní aplikace se ve slezině detekovalo více jak 50 % injekcí zavedené dávky. Pro zavádění se dále mohou použít hydrogely a polymery s řízeným uvolňováním.
Forma vektoru zavedená do hostitelské buňky může být různá, což závisí na skutečnosti, zda vektor se zavádí in vitro nebo in vivo. Nukleová kyselina se může uzavřít do kruhu, může mít zlom, může být linearizovaná, což závisí na vektoru, jestli je udržován vně genomu (to znamená jako autonomně se replikující vektor), zdaje integrován jako provirus nebo profág, přechodně transfekován, přechodně infikován, jako při použití replikačně deficitního nebo podmíněně se replikujícího viru nebo stabilně zavedeného do hostitelského genomu pomocí zdvojené nebo jednoduché rekombinace mezi páry chromozomů.
Před zavedením do hostitele vektor podle vynálezu se může přidat do různých kompozic za účelem použití při léčbě a profylaxi. Vektor se může přidat do farmaceutických kompozic v kombinaci s vhodnými farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo ředidly a mohou se připravit tak, aby byly vhodné při aplikaci na lidech nebo na zvířatech.
Kompozice, která se používá při metodách podle vynálezu, může obsahovat jeden nebo více dříve zmiňovaných vektorů, s výhodou v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem. Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou v oboru dobře známy stejně jako metody aplikace. Volba nosiče závisí zčásti na určitém vektoru, na způsobu aplikace kompozice. Je vhodné, aby existovalo více cest aplikace kompozice a ačkoli se může použít více jak jeden způsob aplikace, mohou se lišit v délce trvání reakce a v účinnosti reakce. Existuje řada vhodných formulací kompozice podle vynálezu.
Kompozice obsahující vektor podle vynálezu samotná nebo v kombinaci s jinými antivirovými látkami, se může připravit do formulace, která je vhodná pro parenterální aplikaci, s výhodou pro intraperitoneální aplikaci. Taková formulace může zahrnovat vodné a nevodné, izotonické sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostaty a rozpouštědla, která činí formulaci izotonickou s krví recipienta, dále jsou to vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspendující činidla, rozpouštědla, zahušťovadla, stabilizátory a konzervační činidla. Formulace se mohou vyskytovat ve formě jednotkové dávky nebo v multidávkách v uzavřených kontejnerech, jako jsou ampule a lahvičky a mohou se skladovat v lyofilizované
-20CZ 294170 B6 formě, což vyžaduje bezprostředně před aplikací pouze přidání sterilního kapalného nosiče, například vody, vhodného pro aplikaci injekcí. Roztoky a suspenze, které se mohou zavést injekcí, se mohou připravit ze sterilních prášků, granulí a tablet.
Formulace vhodná pro orální aplikaci může obsahovat: kapalné roztoky, kde účinné množství látky je rozpuštěno v rozpouštědle, jako je voda, fyziologický roztok nebo ovocný džus; kapsule, váčky nebo tablety, kde každá obsahuje předem určené množství aktivní látky, jako je pevná látka nebo granule; roztoky nebo suspenze ve vodném roztoku; a emulze oleje ve vodě. Tabletové formy mohou zahrnovat jednu nebo více látek ze skupiny obsahující laktózu, mannitol, kukuřičný škrob, bramborový škrob, mikrokiystalickou celulózu, arabskou gumu, želatinu, koloidní oxid křemičitý, korskarmelózu sodíku, talek, stearát magnézia, stearovou kyselinu a jiné excipienty, barviva, rozpouštědla, pufrující činidla, zvlhčovadla, konzervační činidla, aromatizační činidla a farmaceuticky kompatibilní nosiče.
Mohou se připravit aerosolové formulace, které se inhalují. Aerosolové formulace se balí do tlakované přijatelné hnací látky, jako je dichloriddifluoromethan, propan, dusík a podobně.
Formulace vhodná k orální aplikaci může zahrnovat formy pastilek, které mohou obsahovat aktivní látku s aromatickou příchutí, obvykle je to sacharóza a arabská guma nebo tragakant; pastilky obsahují aktivní látku v inertní bázi, jako je želatina a glycerin nebo sacharóza a arabská guma; a ústní vody obsahují aktivní látku ve vhodném kapalném nosiči; krémy, emulze, gely a podobně obsahují mimo aktivní látky nosiče, které jsou dobře známy v oboru.
Formulace vhodné pro povrchovou aplikaci se používají ve formě krémů, mastí nebo roztoků.
Formulace vhodné pro rektální aplikaci mohou být ve formě čípků s vhodnou bází, která obsahuje například kakaové máslo nebo salicylát. Formulace vhodná při vaginální aplikaci může být ve formě pesaru, tamponu, krému, gelu, pasty, pěny nebo spreje. Tyto formy mimo aktivní látky obsahují nosiče, které jsou v oboru dobře známy. Podobně aktivní látka se může kombinovat s lubrikantem, jenž se použije jako potah na kondom.
Dávka, která se aplikuje zvířeti, zvláště pak člověku, v souladu s vynálezem, by měla být dostatečná k vyvolání terapeutické odezvy u infikovaných jedinců ve významném časovém úseku. Dávka se určí na základě účinnosti určitého vektoru při léčbě, vážnosti fáze onemocnění, hmotnosti těla a věku infikovaného jedince. Velikost dávky se také určí na základě výskytu nežádoucích vedlejších účinků, které doprovázejí použití určitého používaného vektoru. Je nutné vždy, je-li to možné, minimalizovat nežádoucí vedlejší účinky.
Dávka může být ve formě jednotkové dávky, jako jsou kapsule nebo tablety. Termín „forma jednotkové dávky“ jsou fyzikálně nespojité jednotky vhodné jako komplexní dávka pro lidské a zvířecí objekty, přičemž každá jednotka obsahuje předem určené množství vektoru samotného nebo v kombinaci s jinými antivirovými činidly. Uvedené množství je spočítáno tak, aby bylo dostatečné k dosažení požadovaného účinku ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem, nosičem nebo jiným excipientem. Specifikace forem jednotkové dávky závisí na použití určité látky nebo více látek a na účinku, který má být dosažen, stejně jako na dynamice rozkladu každé účinné látky v hostiteli. Aplikovaná dávka by měla být v „množství, které má antivirový účinek“ nebo v množství, jenž je nezbytné pro dosažení „účinné hladiny“ u jednotlivého pacienta.
Protože „účinná hladina“ se preferuje jako konečný výsledek dávkování, aktuální dávka a časové intervaly dávky se mohou měnit v závislosti na rozdílech farmakokinetiky, distribuce léku a metabolizmu u jednotlivců. „Účinná hladina“ se může definovat například jako hladina v krvi nebo v tkáni pacienta, která odpovídá koncentraci jednoho nebo více vektorů podle vynálezu, jenž inhibuje virus, jako je HIV, v testu, kterým se testuje klinická antivirová aktivita chemických látek. „Účinná hladina“ látek podle vynálezu může také kolísat, jestliže se kompozice podle
-21 CZ 294170 B6 vynálezu používají v kombinaci se zidovudinem nebo s jinými antivirovými látkami nebo s jejich kombinacemi.
Odborník, aby dosáhl „účinné hladiny“ látky u jednotlivého pacienta, může pro určitou formulaci látky snadno určit vhodnou dávku, interval a způsob aplikace. Odborník také může snadno určit a použit vhodný indikátor „účinné hladiny“ látek podle vynálezu přímo (např. chemickou analýzou) nebo nepřímou (např. pomocí náhradního indikátoru virové infekce, jako je p24 nebo reverzní transkriptáza při léčbě AIDS nebo onemocnění podobnému AIDS) analýzou patřičných vzorků pacienta (např. to jsou krev a/nebo tkáně).
Ke stanovení účinné hladiny u pacienta, která je vhodná pro léčení AIDS nebo onemocnění podobné AIDS, se s výhodou používají zvířecí modely. Zvířecí modely nacházejí široké použití při určování účinnosti protokolů genové terapie in vivo proti HIV (Sarver et al., AIDS Res. And Hum. Retrovir., 9, 483—487 (1993b)). Tyto modely zahrnují myši, opice a kočky. Dokonce ačkoli tato zvířata nejsou přirozeně náchylná k infekci virem HIV, chimérické myší modely (např. SCID, bg/nu/xid, BALB/c bez kostní dřeně), které obsahují lidské periferní krevní mononukleámí buňky (PBMC), lymfatické uzliny nebo fetální tkáň jater/thymu se mohou infikovat virem HIV a mohou se použít jako modely při patogenezi HTV a genové terapii. Podobně se může použít virus opičí imunodeficience (SIV)/opičí model, stejně jako virus kočičí imunodeficience (FIV)/kočičí model.
Preferuje se množství vektoru, které je dostatečné k dosažení koncentrace v tkáni přibližně 50 až 300 mg/kg tělesné váhy za den, zvláště okolo 100 až 200 mg/kg tělesné váhy za den. U jistého způsobu aplikace, například povrchové, vaginální nebo aplikace do očí, se preferuje vícenásobná denní dávka. Počet dávek bude kolísat v závislosti na způsobu zavedení a aplikaci určitého vektoru.
Při léčbě některých jedinců infikovaných virem může být nutné použití režimu „mega-dávky“, kde se aplikuje velká dávka vektoru a umožní se působení této dávky po určitý časový úsek a pak se jedinci aplikuje vhodné činidlo, které deaktivuje aktivní látku(y). Za použití způsobu podle vynálezu je léčba (to znamená replikace vektoru v kompetici s virem, který se léčí) nezbytně limitována. Řečeno jinak, když se sníží množství například viru HIV, sníží se také množství vektoru produkujícího viriony závislého na HIV.
V případě léčby AIDS může farmaceutická kompozice ve spojení s vektorem podle vynálezu obsahovat jiná farmaka. Uvedená jiná farmaka se mohou použít tradičním způsobem (např. jako agens při léčbě infekce HTV) nebo při selekci virů crHTV in vivo. Taková selekce, jak se zde popisuje, bude podporovat rozšíření podmíněně se replikujícího HIV a umožní podmíněně se replikující HIV účinněji konkurovat HTV divokého typu, který bude nezbytně omezovat patogenitu HIV divokého typu. Uvažuje se, že je možné použít antiretrovirové agens, jako je s výhodou zidovudin. Další reprezentativní příklady těchto farmak, které se mohou použít vedle těchto popsaných shora v textu, zahrnují antivirové látky, aimunomodulátory, imunostimulátory, antibiotika a jiné agens a režimy léčby (což zahrnuje ty látky, které se používají v alternativní medicíně) a mohou se používat při léčbě AIDS. Antivirové látky zahrnují například ddl, ddC, gancylclovir, fluorizované dideoxynukleotidy, nonnukleosidové analogové látky, jak oje nevirapine (Shih et al., PNAS, 88, 9878-9882 (1991)), deriváty TIBO, jako R82913 (White et al., Antiviral Research, 16, 257-266 (1991)) a BI-RJ-70 (Shih et al., Am. J. Med., 90 (Suppl. A4), 8S-17S (1991)). Imunomodulátory a imunostimulátory zahrnují například různé interleukiny, CD4, cytokiny, přípravky protilátek, krevní transfuze a transfuze buněk. Protilátky zahrnují například činidla proti houbám, antibakteriální činidla a agens proti Pneumocystic carinii.
Aplikace látky inhibující virus s jiným antiretrovirovým agens a zvláště se známými inhibitory RT, jako je ddC, zidovudin, ddl, ddA nebo jiné inhibitory, které působí proti dalším HIV proteinům, jako je anti-TAT agens, bude obecně inhibovat většinu nebo všechna replikační stadia životního cyklu viru. Publikovaly se dávky ddC na zidovudinu a používané při léčbě AIDS
-22CZ 294170 B6 a ARC. Virostatické rozmezí v případě ddC je obecně mezi 0,05 μΜ do 1,0 μΜ. Rozmezí okolo 0,005 až 0,25 mg/kg tělesné váhy působí u většiny pacientů virostaticky. Rozmezí dávky v případě orální aplikace je větší, například 0,001 až 0,25 mg/kg. Aplikuje se jedna nebo více dávek v časových intervalech 2, 4, 6, 8 a 12 hodin. V případě ddC se upřednostňuje, aby se dávka 0,01 mg na kg tělesné váhy podávala každých 8 hodin. Při kombinované terapii se další antivirová látka dá aplikovat například ve stejný čas jako vektor podle vynálezu nebo dávkování se může rozložit podle potřeby. Vektor se také může kombinovat do kompozice. Jestliže se látky používají v kombinaci, pak dávka každé může být nižší, než kdyby se užívaly samostatně.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. IA až IE představují schematické znázornění struktury virálního genomu, přítomného ve standardním HIV (obr. IA), crHIV-1.1 (obr. 1B), crHTV-l.il (obr. IC), crHIV 1.12 (obr. ID) a crHIV-1.111 (obr. IE). Význam symbolů: cr - podmíněně replikující; U5 - kódující sekvence U5; Rz - ribozym; Ψ - balicí signál; gag, pol. resp. env - kódující sekvence pro proteiny, které tvoří jádro viru, reverzní transkriptázu, resp. obálku; tat, rev, rre a nef - další virální geny; prázdné čtverečky - virální repetice s dlouhým terminálem. Křížky ve standardní kódující oblasti U5 označují přibližné oblasti, v nichž štěpí ribozymy podle vynálezu v RNA standardní U5, ale ne v RNA U5 modifikované crHIV (tj., „mU5“).
Obr. 2 znázorňuje sekvence DNA U5 RNA HIV (SEQ ID NO:1) (A) a modifikovanou U5 RNA crHIV (SEQ ID NO:2) (B). Čísla označují počet bází downstream od počátku transkripce.
Obrázek č. 3 je graf znázorňující aktivitu reverzní transkriptázy (cpm/μΐ) na čase (dny po kotransfekci) inhibice replikace HIV divokého typu zprostředkovanou crHIV v Jurkartových buňkách, která jsou ko-transfektovány HIV divokého typu a crHTV-1.1 (prázdné čtverce), HTV divokého typu a crHTV-l.il (čtverce s křížkem), HTV divokého typu a crHIV-1.12 (tečkované čtverce) a HIV divokého typu a kontrolní plazmid pGEM-3Z (plné čtverce).
Obrázek č. 4 je graf znázorňující aktivitu inhibice replikace HTV divokého typu zprostředkovanou crHIV a Jurkartových buňkách, které jsou ko-transfektovány HIV divokého typu a ceHIV-1.1 (prázdné čtverce), HTV divokého typu a crHIV-1.11 (čtverce s křížkem), HIV divokého typu a crHTV-1.111 (tečkované čtverce) a HTV divokého typu a kontrolní plazmid pGEM-3Z (plné čtverce).
Obrázky č. 5A až 5C jsou schematická znázornění primerů a sond použitých při detekci transkriptů U5 RNA z HTV divokého typu (obrázek č. 5A), crHIV-1.1 (obrázek č. 5B) a cr HIV-1.111 (obrázek č. 5C). Vysvětlení zkratek: U5, kódující sekvence U5; Ψ, balicí signál; gag, pol a env, kódující sekvence proteinů, které tvoří virové jádro, reverzní transkriptázu a obal; prázdné čtverce, virová dlouhá terminální repetice; tat, rev kódující sekvence; plné čtverce; a PE, VI, V2, V3, R1 a R2 jsou primery použité v případě viru divokého typu a/nebo podmíněně replikujících se virů. Křížky u U5 kódující oblasti divokého typu označují přibližně oblast, ve které ribozymy podle vynálezu štěpí U5 RNA divokého typu, ale nezměnily U5 RNA crHIV (to znamená „mU5“).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příklad popisuje konstrukci podmíněně se replikujících kompetentních vektorů podle vynálezu. Tento příklad zvláště popisuje konstrukci podmíněně se replikujících vektorů založených na viru HIV, což jsou crHIV vektory.
-23 CZ 294170 B6
Jeden z nejdůležitějších aspektů patogeneze HIV-1 je produkce genetických variant viru. Rychlá produkce variant viru HIV in viv indikuje, že virus je v souladu s teorií Darwinova genetického modelování (např. Coffin, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 176, 143-164 (1992); a Coffin Science, 267, 483-489 (1995)). Uvedené varianty jsou výsledkem nepřesnosti molekuly reverzní transkriptázy HIV-1, která tvoří mutace vnově přepisovaných provirech z virové genomové RNA. Proto za podmínek in vivo se objevuje podstatný stupeň genové variace, což vede k produkci mnoha virových variant. Stále převládá HIV divokého typu, protože za takových neomezených podmínek má největší selektivní výhodu. V přítomnosti inhibitoru, jako je například zidovudin, bude vybrána virová varianta, která má vyšší selektivní výhodu ve srovnání s kmenem divokého typu a bude v podstatě převládat (Coffin et al., Curr. Top Microbiol. Immuno., 176, 143-164 (1992); a Coffin, Science, 267, 483X89 (1995)). Na tomto základě vynález poskytuje strategii podmíněně se replikujícího virového vektoru, která poskytuje nepatogenní genomy HTV-1 se selektivní výhodou před patogenním HIV-1 divokého typu.
Tyto nepatogenní podmíněně se replikující vektory HIV (crHIV) jsou defektní HTV, které jsou infikovány virem HTV divokého typu. Genomy crHIV soutěží s HIV divokého typu a snižují jeho patogenitu. Účinek snížení zatížení v hostiteli infikovaném virem HTV divokého typu by měl vést ke zvýšení naděje na přežití. Tím by se také měla snížit schopnost infikovaného hostitele převést virus HIV divokého typu na neinfíkované jedince. V případě úspěšné kompetice crHIV s HTV-1 divokého typu se jeví důležitými dva faktory: (1) selektivní výhoda genomů crHIV před genomy HTV divokého typu a (2) selektivní výhoda buněk exprimujících crHIV před buňkami, které exprimují HTV divokého typu (to je selektivní výhoda při produkci virionů crHIV z buněk exprimujících crHIV před buňkami, jež exprimují HIV divokého typu).
Podmíněně se replikují vektory crHTV způsobují skutečnost, že obsahují sekvence nutné při expresi RNA, dimerizaci a balení, ale neexprimují funkční HIV-1 proteiny (to znamená divokého typu). Vektory crHIV získaly selektivní výhodu začleněním ribozymové kazety, která štěpí v oblasti U5 genomu viru HTV divokého typu, ale neštěpí U5 RNA crHIV.
Ribozymy přítomné ve vektoru neštěpí RNA crHIV, protože oblast U5 RNA crHIV, protože oblast U5 RNA crHIV se modifikovala substitucí konzervativní báze (substituce bází se vyskytují v dalších kmenech viru HIV), což brání ribozymům se účinně navázat a štěpit tato místa. crHTV nejsou patogenní, protože nekódují proteiny, které odpovídají za odumření buněk CD4+. V případě, že se buňky infikované HTV (jenž se transfekovaly vektorem crHTV) aktivovaly, jsou schopny doplnit genomovou nedostatečnost crHIV, což vede k produkci progenových virionů crHIV.
Genomy crHTV se konstruovaly z infekčního klonu HIV pNL4—3 v plné délce (Adachi et al., J. Virol., 59, 284-291 (1986)). Všechny reakce klonování, manipulace RNA, DNA a proteinů proběhly za použití metod, které jsou dobře známy v oboru a které se popisují například v publikaci Maniatis et al., Molekular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)). Enzymy a reakční činidla, která se používají při těchto reakcích, se získala z komerčně dostupných zdrojů (např. New England Biolabs, lne., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, Ca; a Boehringer Mannheim, lne., Indianapolis, IN) a při jejich použití se postupovalo podle doporučení výrobce. Vektor se udržoval a pomnožoval za použití způsobů, které jsou dobře známy v oboru a popisují se v předchozím textu (např. Drupuliďet al., (1992) a Dropuliďet al., (1993), citace uvedeny shora v textu).
pNL4-3 se štěpil restrikčními enzymy Pst I (které štěpí gen gag, v pozici + 1000 od počátku transkripce) a Xho I (které štěpí gen nef, v pozici + 8400 od počátku transkripce) a polylenker, který obsahuje začleněná vhodná restrikční místa. Fragment Bgl II až Bam HI o velikosti 0,86 kb, který obsahuje element odezvy rev (RRE), se klonoval do restrikčního místa Bam HI, které je přítomno v polylinkeru. Tyto manipulace vedou k deleci genomu HIV divokého typu z oblasti kódující gag až do kódující oblasti U3 (tímto způsobem se také deletuje gen nef).
-24CZ 294170 B6
Zatímco vektor je schopen produkovat zkrácený transkript gag, funkční protein Gag v plné délce není produkován vektorem. Protože podle vynálezu funkce proteinu Gag divokého typu nejsou nezbytné, mohou se sekvence gag mutoval za účelem prevence translace proteinu Gag.
Ribozymová kazeta obsahující buď jeden nebo více ribozymů, jak se zde popisuje, se začlenila do restrikčního místa Sal I downstream od restrikčního místa Bam HI. Pro uskutečnění tohoto záměru se syntetizovaly komplementární deoxyoligonukleotidy kódující ribozymové sekvence, spojily se a pak se klonovaly do restrikčního místa Sal I. Ribozymy, které se používají při konstrukci vektorů crHIV, byly „hammerhead“ ribozymy. Uvedené ribozymy obsahují katalytickou doménu s 22 páry bází a dvě hybridizační domény, kdy každá obsahuje 9 párů bází. Ribozymy směřovaly do míst +115 nebo +133 (což odpovídá počtu bází downstream od počátku transkripce) RNA sekvence U5. Hybridizační domény a katalytická doména (podtrženo) ribozymů směřující do míst +115 nebo +133 jsou následující:
CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA („+115 ribozym“) (SEQIDNO:3)
ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC („+133 ribozym“) (SEQ ID NO: 4)
Ribozymová kazeta obsahuje buď jeden, dva nebo tři ribozymy umístěné v tandemu. Vektory obsahují buď jeden (to je vektor „crHTV-1.111“, obrázek č. 1B) nebo tři (to je vektor „crHTV-1.1“, obrázek č. 1E) ribozymy na stejném místě oblasti U5 RNA HIV v pozici +115. Vektory obsahující dva ribozymy směřují buď do stejného místa do pozice +115 (to je vektor „crHTV-l.il, obrázek č. 1C) nebo do odlišných míst s pozicemi +115 a +133 oblasti U5 RAN HTV; (to je vektor „crHIV-1.12, obrázek č. ID). Tyto vektory se zde obecně nazývají jako vektory „crHTV“.
Při dokončení konstrukce vektorů se místo, které je rozeznáváno „hammerhead“ ribozymy, vyskytující se v oblasti U5 genomů crHIV, podrobilo mutaci a tím se vektory crHTV stávají rezistentní k štěpení ribozymy (to znamená, že se projevují jako RNA). Pro dosažení této mutace zavedením modifikovaných míst do vektoru se použil dvouřetězcový oligonukleotid (to je AAGTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTA GAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC (SEQ ID NO: 13) obsahující substituce bází znázorněné na obrázku č. 2 (SEQ ID NO: 2). Substance bází se provedly v místech hybridizace a štěpení ribozymů v pozici 115 a 133 párů bází. Jak je uvedeno na obrázku č. 2, mutace se zavedly do pozic 113, 114, 132, 134 a 142 párů bází. Tato místa se mohou modifikovat, aby obsahovala mutace (to je GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC, kde N může být libovolný mutantní nukleotid (SEQ ID NO: 14)). Upřednostňuje se však, aby se sekvence mutovaly tak, že vmiste +113 došlo například k substituci A nahrazuje G (to znamená, že sekvence obsahuje GTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC (SEQ ID NO: 15)), U (to znamená T v případě sekvence DNA) je nahrazeno C v pozici +114 (SEQ ID NO: 5) a U (to znamená T v případě sekvence DNA) je nahrazeno C v místě +132 (SEQ ID NO: 6) a A je nahrazeno G v místě +134 (tak že sekvence obsahuje GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC (SEQ ID NO: 16)) a U (to znamená T v případě sekvence DNA) je nahrazeno A v místě +142, přičemž uvedené mutace mohou být provedeny samostatně nebo v kombinaci. Jestliže není přítomna mutace v oblasti U5, U (to znamená T v případě sekvence DNA) je zaměněno za C v místě +114 (SEQ ID NO: 5) a/nebo v místě +132 (SEQ ID NO: 6) v oblasti U5 RNA crHIV, což brání jejímu štěpení ribozymy (Uhlenbeck, Nátuře, 334, 585 (1987)). Inzertovaná substituce bází se nachází v různých jiných kmenech HIV (Myers et al., HTV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), což naznačuje, že tyto substituce nesnižují replikační kapacitu genomů HTV.
-25 CZ 294170 B6
Zde uvedený způsob se může použít ke konstrukci jiných podmíněně se replikujících vektorů, které například obsahují různé virové genomy (např. různé RNA viry) nebo obsahují různá genová antivirová agens. Podmíněně se replikující vektor se může dále modifikovat a tak poskytuje buňkám hostitele, kam je vektor zaveden, selektivní výhodu před buňkami hostitele, které obsahují virus divokého typu. Takový vektor může být například modifikován tak, že dále kóduje rezistanci na více léků, nebo mutovanou proteázu nebo reverzní transkriptázu.
Příklad 2
Tento příklad popisuje rezistenci podmíněně se replikujících vektorů, zvláště vektorů crHIV, k štěpení ribozymem.
Za účelem potvrzení rezistence vektorů crHTV ke štěpení ribozymem se provedla in vitro transkripce. Ribozymální sekvence se klonovala do restrikčního místa Xho I plazmidu pBluescript KSII (Strategene, La Jolla, CA). Fragment Bgl II o velikosti 0,21 párů kilobází (kb), obsahující mutovanou oblast crHIV, U5, byl podobně vystřižen z vektoru crHTV a vložil se do restrikčního místa Bam HIV plazmidu pBluescript KSII. Výsledné vektory modifikovaného pBluescript KSII se linearizovaly před in vivo transkripcí restrikčním enzymem Bss HII. Jako kontrola se použil podobný plazmid exprimující U5 RNA HIV divokého typu (Myers et al, HTV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)). Před in vitro transkripcí se linearizoval restrikčním enzymem EcoR I.
Radioaktivně značená RNA oblasti U5 viru HIV a ribozymová RNA vznikají transkripcí vektorů in vitro, jak se popisuje v publikaci (Dropuliďet al., (1992), citace uvedena shora v textu). Radioaktivně značené transkripty se inkubovaly dohromady (při cílovém molámím poměru ribozymu 1:2) v lx koncentrovaném transkriptačním pufru, který obsahuje 40 mM tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 2 mM Spermidin a 10 mM NaCl. Vzorky se zahřály na teplotu 65 °C a pak se 5 minut před přidáním stop pufru, kteiý obsahoval 95% formamid, 20 mM EDTA 0,05% bromfenolovou modř a 0,05% xylen cyanol FF, zchladily na teplotu 37 °C. Produkty se pak rozdělily elektroforézou na denaturujícím polyakrylamidovém gelu (PAGE) a detekovaly se autoradiograficky.
V případě, že se U5-HIV RNA divokého typu inkubovala dohromady s transkriptem, který obsahuje jeden ribozym v místě +115, bylo možno ihned pozorovat štěpení. Při takovém štěpení vznikají produkty Pl a P2. Štěpení je také možno pozorovat v případě, že s RNA HTV divokého typu se inkubovala RNA, která obsahuje dva ribozymy, které jsou směrovány do stejného místa nebo do různých míst. Jestliže se transkript, který obsahuje ribozym směrovaný do dvou různých míst, inkuboval sRNA viru HIV divokého typu, vznikají produkty Pl, P2 a P3. Produkt P3 vzniká při štěpení v místě +133.
Jestliže se modifikovaná RNA crHIV obsahující oblast U5 inkubovala buď s jedním ribozymem směrovaným do místa +115 nebo se dvěma ribozymy směrovanými buď do místa +115 nebo do místa +133, produkty štěpení nebyly detekovány. Pak tyto výsledky potvrzují, že crHIV U5 RNA je rezistentní ke štěpení ribozymem, zatímco U5 RNA viru HTV divokého typu jsou štěpeny antiU5 ribozymy. Výsledky však potvrzují, že přístup podle vynálezu se může použít pro vybavení podmíněn se replikujících vektorů (zahrnující vektory jiné než jsou vektory crHIV) selektivní výhodou při replikaci tím, že se do hostitelské buňky zavede uvedený vektor na rozdíl od kmene viru divokého typu.
-26CZ 294170 B6
Příklad 3
Tento příklad popisuje schopnost podmíněně se replikujících vektorů obsahujících ribozym, vnitrobuněčně štěpit RNA viru divokého typu. Tento příklad zvláště popisuje schopnost vektorů crHIV intracelulárně štěpit RNA viru HIV divokého typu.
Účinnost inhibice viru HIV divokého typu, která je zprostředkována vektorem crHIV, se testovala ko-transfekcí genomů do Jurkatových buněk. Transfekce proběhla následujícím způsobem. Přibližně 106 Jurkatových buněk se promylo v Opti-MEM médiu (Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) a pak se buňky ko-transfekovaly přibližně 0,6 pg DNA viru HIV divokého typu (to je pNL4-3) a přibližně 1,8 pg DNA crHTV. Za účelem zajištění skutečnosti, že všechny buňky transfekované HTV divokého typu a provirus crHIV v molámím poměru 1:3. DNA se smísily v lipofektinovém roztoku (Life Technologies) po dobu 30 minut a pak se inkubovaly s Jurkatovými buňkami po dobu přibližně 3 až 6 hodin poté se přidalo celé médium RPMI 1640, které obsahuje 10% fetální boviní sérum (FBS). Supematanty obsahující virus se odebraly každé 2 až 4 dny a množství viru se určilo testováním aktiviry reverzní transkriptázy v buněčných suspernatantech, jak se dříve popisuje (Drpulič et al., (1992), citace uvedena shora).
Účinek genomů crHIV na replikaci viru HIV divokého typu je zobrazen na obr. č. 3. Jestliže virus HIV divokého typu se ko-transfekoval crHTV-1.1, růst viru se opozdil (obr. č. 3, prázdné čtverce) vzhledem k buňkám ko-transfekovaných HIV divokého typu a kontrolním virem (obr. č. 3, plné čtverce), ale nebyl inhibován. Protože anti-U5 ribozymy mohou inhibovat replikaci HIV invivo za ko-lokalizovaných podmínek (např. (Dropulié et al., (1992), citace uvedena shora), virový růst se zdá být výsledkem buď: (a) preferenčního balení RNA viru HIV divokého typu do progenových virionů, (b) produkce RNA HIV divokého typu, které jsou rezistentní ke štěpení ribozymem nebo (c) akumulace nefunkčních ribozymů v RNA crHIV.
Původ zastavení růstu viru se testoval ko-transfekcí HTV divokého typu vektory crHTV, které obsahují dva ribozymy. Jestliže preferenční balení viru HIV divokého typuje zodpovědné za růst viru, pak kultury obsahující crHIV s dvěma ribozymy by měly vykazovat stejnou kinetiku růstu jako kultury, které obsahují crHIV s jedním ribozymem. Jestliže však růst viru pramení z RNA viru HIV divokého typu, pak se stává rezistentní k působení ribozymů (to je výsledek nepřesnosti virové reverzní transkriptázy), pak kinetiky růstu viru by měly vykazovat větší zpoždění u kultur, které obsahují crHIV-1.12 (to znamená, že jsou směrovány proti dvěma místům viru), na rozdíl od kultur, které obsahují crHIV-1.11 (to znamená, že jsou směrovány proti jednomu místu viru). V jiném případě, je-li pozorované zpoždění virového růstu srovnatelné se zpožděním v kulturách, které obsahují různé crHTV s dvěma ribozymy, pak část jednotlivě exprimovaných ribozymů není in vivo funkční.
Jak je možné spatřit na obr. č. 3, kultury obsahující crHIV-l.il (obr. č. 3, prázdné čtverce s křížkem) nebo crHTV-1.12 (obr. č. 3, tečkované čtverce) vykazují větší zpoždění na začátku růstu viru, než crHTV-1.1, které obsahovaly jediný přepsaný ribozym (obr. č. 3, prázdné čtverce). Zpoždění na počátku růstu viru mezi crHTV-1.11 a crHIV-1.12 byl podobný, což indikuje správnost třetí možnosti, to znamená, že jednoduše transkribované ribozymy jsou kineticky méně účinné při štěpení cílové RNA, než jsou dva ribozymy. To naznačuje, že jistá část intracelulárně přepisovaných ribozymů může tvořit nefunkční, pravděpodobně chybně zabalení konformace, protože experimenty ko-transfekce se provedly při molámím přebytku genomů crHTV, které obsahují ribozym.
Zjistilo se, že více ribozymů má schopnost uvolnit tuto kinetickou limitaci tak, že vykazují vyšší pravděpodobnost funkčnosti ribozymů ve spojitosti s RNA viru HIV divokého typu. Při uvedených experimentech se Jurkatovy buňky kotransfekovaly virem HIV divokého typu a crHTV1.111, který obsahuje tři ribozymy směrované do místa +115. Jak je možné vidět na obrázku č. 3 (tečkované čtverce), neexistuje žádný důkaz růstu viru za použití tří ribozymů, dokonce ani po
-27CZ 294170 B6 dnech kultivace. Tyto výsledky jsou podstatné vzhledem ke skutečnosti, že normální primární T buňky často během krátkého časového úseku po infekci HIV odumírají (např. během týdne).
Tyto výsledky potvrzují, že podmíněně se replikující vektory, které obsahují ribozym, jako jsou vektory crHIV a zvláště pak ty, které obsahují více ribozymů se mohou použít intracelulárně ke kompetici s genomem viru divokého typu, jako je HIV.
Příklad 4
Tento příklad popisuje zkoumání mechanizmu, který podporuje schopnost podmíněně se replikujících vektorů, které obsahují ribozym, zvláště vektorů crHTV intracelulárně štěpit RNA viru divokého typu.
Při těchto experimentech se testoval za použití metody polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí (RT-PCR) buněčný supematant RNA z kultur ko-transfekovaných virem HIV divokého typu a crHTV-1.111. RT-PCR se uskutečnila za použití primerů zobrazených na obrázcích č. 5A až 5C. Jmenovitě ribozymová RNA se detekovala za použití primerů R1 a R2, RNA HTV divokého typu se detekovala za použití primerů VI a V3 a RNA crHTV se detekovala za použití primerů V2 a V3. Každý z primerů R1 (TGTGACGTCGACCACACAACACTGATG (SEQ ID NO: 7) a R2 (TGTGACGTCGACTCTAGATGTGCCCGTTTCGGC (SEQ ID NO: 8) obsahuje restrikční místo Sal I a amplifíkuje anti-U5 ribozymovou RNA tak, že se váže na ribozymové hybridizační sekvence. V buňkách, které exprimují crHIV-1.111, se objevují produkty amplifikace jednoho, dvou nebo tří ribozymů. Každý z primerů VI (GGTTAAGCTTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCC (SEQ ID NO: 9)) a V2 (GGTTGGATCCGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG (SEQ ID NO: 10)) obsahuje restrikční místa Bam HI a Hin dlll a amplifikují RNA viru HTV divokého typu. Vedle dříve uvedeného primerů VI primer V3 (CGGATCACGCGTGTCGACGAGCTCCCATGGTGATCAG (SEQ ID NO: 11)) obsahuje restrikční místo Bam HI a jiná restrikční místa. Tato sada primerů amplifíkuje RNA crHTV od crHTV specifické sekvence polylinkeru.
Za účelem provést RT-PCR se izolovaly viriony a vnitrobuněčná RNA za použití Trizolu™ (Life Technologies). Intracelulární virové RNA se izolovaly přímo z mikrocentrifugovaných buněčných pelet. Virionová RNA se izolovala ze supematantů kultury, z které se nejdříve odstranily buňky a buněčný odpad mikrocentrifugací při 12 000 x g po dobu 5 minut. Do supematantu bez buněk se přidal Trizol™ a směsi se inkubovaly po dobu 5 minut a pak se přidal chloroform a došlo k separaci fází. Vodná fáze se přenesla do nové zkumavky a RNA se precipitovala izopropanolem za použití glykogenu. Po rekonstituci pelety RNA se RNA reverzně transkribovala a amplifikovala se PCR za použití radioaktivně značených primerů.
Reverzní transkripce proběhla po dobu 1 hodiny při teplotě 42 °C v pufru, který obsahuje 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM dNTP a 20 jednotek (U) inhibitoru Rnasy, ke které se přidalo 25 U MuLV reverzní transkriptázy. Po ukončení reverzní transkripce se reverzní transkriptáza deaktivovala teplem při teplotě 65 °C po dobu 10 minut. Celá směs se pak přidala přímo do PCR pufru tak, aby vznikla směs, která obsahuje konečnou koncentraci 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1 a 1,5 mM MgCl2. Směs se amplifikovala ve 30 cyklech za použití 2,5 U enzymu Taq. Radioaktivně značené produkty PCR se pak rozdělily v denaturační PAGE a detekovaly se autoradiograficky.
Ribozymová RNA crHIV-1.111 se objevuje v supernatantech buněk po více než 20-ti dnech po ko-transfekci HTV-1 divokého typu a provirovými genomy crHTV-1.111. To je zřejmé z existence produktů PCR RNA jednoho, dvou nebo tří ribozymů. Takové produkty není možné vidět při amplifikaci RNA z virionů, které produkují kultury transfekované virem HIV divokého typu. Během této doby buňky vypadají normálně, neobjevují se zjevná znamená cytotoxicity indukované crHTV. To potvrzuje, že crHIV je balen do virových partikulí dokonce, ačkoli se
-28CZ 294170 B6 nepozorovala žádná aktivita reverzní transkriptázy. To však naznačuje, že crHIV se může vnitrobuněčně komplementovat funkcemi genu HIV.
Tyto výsledky indikují, že crHIV inhibuje replikaci viru HIV divokého typu inhibici rozšíření viru HIV divokého typu. Výsledky dále indikují, že další podmíněně se replikující vektory například jiné virové vektory a/nebo vektory obsahující jiná genová antivirová agens se mohou podobně použít k inhibici replikace a rozšíření viru divokého typu.
Příklad 5
Tento příklad popisuje další zkoumání mechanizmu, který podporuje aktivitu podmíněně se replikujících vektorů, které obsahují ribozym, zvláště vektorů crHTV, intracelulámě štěpit RNA viru divokého typu.
Jeden možný mechanizmus je, že RNA viru HIV divokého typu a crHIV jsou baleny do progenových virionů a v těchto malých virových objemech se objevuje účinné štěpení způsobené ko-lokalizací ribozymu a cílovými RNA. V jiném případě se může objevit selektivní balení RNA crHTV do progenových virionů, protože ke štěpení RNA viru HIV divokého typu převážně dochází intracelulámě a ne ve virionech HIV. Tyto mechanizmy se zde zkoumají.
Způsoby kterými crHTV-1.111 inhiboval roznesení HTV divokého typu se zkoumaly v buněčných kulturách, které se transfekovaly samotným virem divokého typu nebo ko-transfekovaly HIV divokého typu a crHIV-1.111, pomocí RT-PCR virových RNA spojených s viriony a s buňkami. RNA crHIV se nacházely pouze v progenových virionech, které vznikají po ko-transfekci. Kontrolní kultury transfekované HIV divokého typu produkují viriony, které obsahují pouze RNA viru HIV divokého typu. RNA viru HTV divokého typu a RNA crHIV-1.111 se prokázaly v ko-transfekovaných kulturách. Ačkoli jak RNA viru HTV divokého typu a RNA crHIV se syntetizují intracelulámě, jsou selektivně baleny do progenových virionů. To naznačuje, že crHIV-1.111 inhibuje rozšíření viru HIV divokého typu tím, že dochází k selektivnímu štěpení genomové RNA viru HTV divokého typu před kapsidizací, zatímco umožňuje translaci některých sub-genomových RNA divokého typu na proteiny nutné při produkci virionů.
Za účelem testování, zda genomové RNA divokého typu jsou selektivně štěpeny RNA crHIV, se typy intracelulámích RNA přítomných v kulturách Jurkatových buněk získaných přibližně 20 dnů po ko-transfekci analyzovaly northernovou hybridizací. Sonda, která se použila při analýze northemovým přenosem, jak je zobrazeno na obrázku č. 5, se izolovala zBgl II fragmentu o velikosti 0,21 kb, který pochází z oblasti U5 pNL4-3.
Kultury transfekované HTV divokého typu exprimují všechny druhy RNA viru HIV divokého typu, to znamená genomové a subgenomové typy RNA. Kultury ko-transfekované crHIV-1.111 nevykazují expresi podstatného množství genomové (9,7 kb) RNA viru divokého typu. V kotransfekovaných kulturách se pozorovala RNA s nízkou molekulovou hmotností (odrážející přítomnost subgenomové RNA viru HIV divokého typu). Šmouha u RNA viru HTV v těchto vzorcích naznačuje, že v těchto RNA o nízké molekulové váze mohou být přítomny některé degradované genomové RNA viru HIV. Šmouha u RNA viru HTV divokého typu získaná z kontrolních buněk HIV divokého typu je způsobena degradací RNA, která se vyskytuje z podstatné CPE a pozoruje se v pozdních stadiích infekce virem HIV.
Tyto výsledky potvrzují, že genomové RNA viru HIV divokého typu jsou selektivně štěpeny a degradovány v buňkách, které obsahují genomy viru HTV divokého typu a crHIV-1.111, umožňující selektivní balení RNA crHIV do virionů. Tyto výsledky indikují, že podobně lze využít tento způsob i pro jiné viry, zvláště pro další RNA viry.
-29CZ 294170 B6
Příklad 6
Tento příklad popisuje zkoumání schopnosti podmíněně se replikujících vektorů, které obsahují ribozym, zvláště vektorů crHTV, projít celým virovým replikačním cyklem v přítomnosti pomocného viru divokého typu.
Za účelem potvrzení, že genomy crHTV procházejí za přítomnosti pomocného genomu viru HTV divokého typu celým virovým replikačním cyklem, se zkoumala produkce virových partikulí, které obsahují genomy crHTV, za různých podmínek. První se zkoumala produkce virových partikulí, které obsahují genomy crHTV v aktivovaných ACH2 buňkách (AIDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland). Tyto buňky obsahují buněčnou linii latentně infikovanou HTV-1. Dále se zkoumala schopnost libovolných crHTV partikulí odvozených z těchto kultur, infikovat neinfíkované Jurkatovy buňky a produkovat DNA crHTV.
Při těchto experimentech se přibližně 106 buněk ACH2 transfekovalo s přibližně 2,5 pg vektorové DNA. Buňky se stimulovaly 50 nM 12-O-tetradekanoylforbol 13-acetátem (TPA) přibližně 24 hodin po transfekci. RNA se izolovala z buněčných supematantů přibližně 72 hodin po transfekci. RT-PCR se provedla za použití primerů R1 a R2, jak se popisuje v příkladu 4. Ribozymová RNA crHTV byla detekována ve virionech produkovaných aktivovanými buňkami ACH2 po transfekci crHTV-1.11, ale ne po transfekci kontrolním plazmidem pGEM 3Z (Promega, Madison, WI). Proto transfekce vektorů crHTV do infikovaných buněk CD4+ vede k produkci virových partikulí, které obsahují RNA crHTV.
Dále se testovala schopnost crHTV virionů odvozených z těchto kultur infikovat Jurkatovy buňky a produkovat crHTV proviry. Takové proviry se detekovaly izolací buněčné DNA za použití Trizolu™, štěpením DNA restrikčním enzymem Eco RJ a pak amplifikaci ribozomální DNA pomocí PCR, za použití R1 a R2 primerů, jak se popisuje v příkladu 4. DNA crHTV byla produkována vJurkatových buňkách po infekci buněčných supematantů získaných z buněk ACH2 transfekovaných crHTV. Právě v tomto případě se pozorovala specifická amplifikace ribozymální DNA crHIV. Buňky infikované samotnými stimulovanými supematanty buněk ACH2 (to je při absenci jakékoli infekce buněk ACH2 s crHTV-1.111) nevykazují žádné produkty ribozymální DNA.
Protože se vektory crHTV rozšiřují pouze v přítomnosti genomů pomocných virů HIV divokého typu, testovala se schopnost neinfíkovaných buněk, které obsahují genomy crHIV přežít infekci virem HTV divokého typu. Při těchto experimentech nejdříve proběhla transfekce buněk crHTV1.11 (to je reprezentovat vektorů crHIV) a pak se buňky superinfikovaly HIV divokého typu (to je pNL4-3). Přibližně 106 Jurkatových buněk se transfekovalo přibližně 2,5 pg DNA crHTV. Buňky se před infekcí virem HTV divokého typu nechaly růst po dobu přibližně 72 hodin. Jurkatovy buňky transfekované crHTV-1.11 se inkubovaly s pNL4-3 (2 x 105 TCID50 jednotek na 106 buněk) po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C, promyly se třikrát v Opti-MEM® I redukovaném médiu se sérem a pak se resuspendovaly v úplném médiu (RPMI 1640 s 10% FBS). RNA se izolovala z buněčných supematantů, jak se popisuje v příkladu 4, přibližně 5 dnů po infekci.
Při testu TCID50 se nanesly na plotny s 96 otvory supematanty obsahující HIV, přičemž maximální ředění bylo pětinásobné. Do naředěných virových suspenzí se přidalo přibližně 104 buněk MT4 (AIDS Reagent Reference Program, Rockville, Maryland; a Harada et al., Science, 229, 563—566 (1985)) a výsledné suspenze se inkubovaly po dobu 7-mi dní, až došlo k úplnému virovému růstu. Buňky MT4 jsou modifikované T-buňky, které obsahují gen Tax z HTLV-1, což je transaktivátor genu, který je analogem genu Tat v HTV-1. V supematantech se pak testovala aktivita reverzní transkriptázy a vyhodnocovaly se, jak se popisuje v publikaci (Dropulic et al., (1992), citace uvedena shora). Způsobem podle Reed a Muench (popsáno v publikaci Těch. InHTV Res., Johnson et al., eds., Stockton Press, 71-76 (1990)) se stanovila infekční dávka (TCID50) vhodná pro tkáňové kultury.
-30 CZ 294170 B6
Superinfekce Jurkatových buněk transfekovaných virem HIV divokého typu vedla k tomu, že virové partikule obsahují genomy crHIV. Genomy crHIV jsou po superinfekci virem HIV divokého typu zabaleny do virových partikulí. Během této doby se buňky jeví být normální bez podstatných znaků cytotoxicity.
Tyto výsledky potvrzují, že genomy crHIV jsou schopny projít celým replikačním cyklem po komplementaci pomocným virem HIV divokého typu. Tyto výsledky také potvrzují, že jiné virové genomy jsou podobně schopny projít úplným replikačním cyklem po komplementaci odpovídajícím virem divokého typu.
Příklad 7
Tento příklad popisuje podstatu zmizení produkce viru, což se popisuje v předchozím příkladu.
Podstata ztráty produkce viru z kultur, které se transfekovaly virem HTV divokého typu nebo se ko-transfekovaly virem HIV divokého typu a crHTV-1.11, se testovala analýzou RNA virionů za použití RT-PCR, jak se popisuje dříve v textu. Viry produkované v kulturách v raných stadiích virového růstu (u kultury transfekované virem HIV divokého typuje to den +11, u kultury ko-transfekované crHIV-1.11 je to den +19) obsahovaly převážně crHIV RNA. Kultury z pozdních stadií růstu (u kultury transfekované virem HTV divokého typu je to den +17, u kultury ko-transfekované crHIV-1.11 je to den +23) obsahovaly převážně RNA viru HIV divokého typu.
Produkce viru buňkami, které jsou ko-transfekované virem HIV divokého typu a proviry crHTV-I.il, pravděpodobně je výsledkem růstu viru HIV divokého typu, který unikl intracelulámí restrikci ribozymem. Genomy crHIV stále obsahují podstatnou část celého genomu viru HIV dokonce i v kulturách při pozdních fázích virového růstu. To naznačuje, že ačkoli převládají genomy viru HIV divokého typu, genomy crHIV se rozšířily v kultuře i vzhledem k nižším účinnostem ve srovnání s genomy HIV divokého typu.
To potvrzuje, že vektory crHTV stejně jako další podmíněně se replikující vektory, se mohou při replikaci viru účinně utkat s genomy viru divokého typu.
Příklad 8
Příklad dále popisuje podstatu zmizení produkce viru, což se popisuje v předchozím příkladu.
Měření infekčních titrů viru HTV divokého typu sloužilo ke studii účinku balení crHTV RNA do virionů během zmizení produkce viru. S virovými supematanty z kultur, které se nacházely v exponenciální fázi růstu viru, (u kultur viru divokého typuje to den +14, u kultur crHTV-1.1 to je den +16, u kultur crHTV-1.11 nebo crHIV-1.12 je to den +20) se provedly testy limitujícího ředění TCID50. Vzorky se před testem normalizovaly za použití aktivity reverzní transkriptázy. Infekční dávka supernatantů z kultur HTV divokého typu, crHTV-1.1, crHIV-1.11 a crHTV-1.12 byla 1,3 x 104 TCID5o/ml, 5,4 x 103 TCID50/ml, 3,8 x 103 TCID50/ml a 3,8 x 103 TCID50/ml. Balení RNA crHTV do virionů během zmizení produkce viru vede ke snížení počtu produkovaných infekčních partikulí HIV divokého typu.
Dále se zkoumalo, zda snížení infekčního titru viru HTV divokého typuje výsledek štěpení RNA viru HTV divokého typu ve virionech. Produkty štěpení RNA z virionů, které se nacházejí v supematantech ko-transfekovaných buněk se určovaly extenzí primeru. Použil se primer PE (o sekvenci GGTTAAGCTTGTCGCCGCCCCTCGCCTCTTG (SEQ ID NO: 12)), který je zobrazený na obr. č. 6 a který obsahuje restrikční místo Hin dlll. Extenze primeru přes místo štěpení probíhala po dobu 2 hodin při teplotě 42 °C v pufru, který zahrnuje 50 mM Tris-HCl,
-31 CZ 294170 B6 pH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM dNTP a 20 U inhibitoru Rnasy. Do pufru se přidalo 25 U MuLV reverzní transkriptázy. Virová RNA se izolovala z koncentrovaných virionů získaných z kultur ko-transfekovaných crHIV. Buňky a buněčný odpad se odstranil centrifugací při 2 000 x g po dobu 15 minut při teplotě 4 °C. Virus se pak koncentroval ultracentrifugací při 30 000 x g po dobu 4 hodin a teplotě 4 °C. Virové RNA se izolovaly z virové pelety za použití přípravku Trizol™, jak se popisuje dříve v textu.
Virové RNA se izolovaly ze supematantů kultur transfekovaných virem HIV divokého typu a ko-transfekovaných crHIV-1.11 během pozdních fází virového růstu (u kultur transfekované virem HIV divokého typuje to den +17, u kultury ko-transfekované crHTV-1.11 je to den +23). Viriony v této kultuře obsahují jak genomovou RNA viru HTV divokého typu, tak i genomovou RNA crHIV. cDNA v plné délce se pozorovala jak u kultury transfekované virem HTV divokého typu, tak i kultur ko-transfekovaných crHTV-1.11. Na základě analýzy primer-extenze se nezjistila žádná menší cDNA, která by byla výsledkem štěpení oblasti U5 RNA. Snížení infekčních titrů viru HIV divokého typu není způsobeno intravirovým štěpením RNA HIV divokého typu, ale vzhledem k jejich numerickému posunutí štěpením crHTV RNA vprogenových virionech.
Tyto výsledky indikují, že zde popsaný způsob se může použít pro přesun genomů divokého typu, jako jsou genomy HIV a jiné genomy, z progenových virionů, za použití podmíněně se replikujících vektorů podle vynálezu.
Příklad 9
Tento příklad ukazuje, že vektory crHIV mohou inhibovat replikaci viru HIV divokého typu po styku s plazmidem nebo rekombinantním virem crHIV-1.111.
Jurkatovy buňky se infikovaly virem HTV (klon pN14-3) a pak se stimulovaly buď (1) plazmidovou DNA, která obsahuje konstrukci crHTV-1.111 nebo (2) rekombinantním virem crHIV1.111 zabaleným do buněk 293, to je mutantní crHIV-l.M (Nadlini et al., Science, 272, 263-267 (1996)). Buňky se podrobily transfekci zprostředkovanou lipidy DLS (Thierry et al., PNAS, 92, 9742 - 9746 (1995)) nebo zavedení zprostředkované crHIV. Replikace viru se měřila za použití testu reverzní transkriptázy 12 dní po původní transfekci virem HIV. Kultury divokého typu, které slouží jako kontroly, vykazují normální růst viru HIV divokého typu. Když se buňky infikovaly virem HIV divokého typu, transfekovaly se mutantním crHIV-l.M prostřednictvím DLS, přičemž růst viru HTV divokého typu nebyl ovlivněn. Naopak, jestliže buňky infikované virem HIV divokého typu se stimulovaly crHTV-1.111, který kóduje anti-HIV ribozym, transfekcí zprostředkovanou DLS, pak růst viru HTV divokého typu (to je replikace) byl podstatně inhibován. Jestliže se mutantní crHIV-LM stimuloval virem HIV divokého typu, pak replikace viru HTV divokého typu nebyla ovlivněna. Naopak, jestliže se virus HIV divokého typu stimuloval crHTV-1.111, pak replikace viru HIV divokého typu byla podstatně inhibována. Data ukazují, že vektory crHTV se můžou použít pro podstatnou inhibici intracelulámí replikace viru HIV divokého typu.
Příklad 10
Tento příklad popisuje použití podmíněně se replikujících vektorů při léčbě zhoubného bujení.
Podmíněně se replikující virové vektory, které se používají při léčbě zhoubného bujení, se mohou konstruovat tak, aby jejich schopnost replikovat se v normálních buňkách byla nedostatečná, protože jim chybí virový protein, který je nutný při jejich replikaci. Jestliže však tento vektor infikuje rakovinové buňky, buňky jsou schopny produkovat faktor (např. upřednostňuje se stejný mutovaný buněčný protein, který podporuje odlišný růst rakovinových buněk), který umožňuje
-32CZ 294170 B6 replikaci defektního vektoru vhodného pro léčbu zhoubného bujení. Tento způsob se liší od způsobu, který se používá při léčbě virové infekce tím, že nedochází k selektivnímu balení virového vektoru, místo toho dochází k lyži buněk karcinomu, která je způsobena činností virionů, získaných z progenových vektorů do buňky. Způsob se však podobá metodě, která se používá při virových infekcích, kde se může použít expresivní vektor pomocného viru, aby došlo k selektivnímu pomnožení podmíněně se replikujícího viru v rakovinových buňkách. Vektor a/nebo expresivní vektor pomocného viru se vytvořil tak, že je odpovědný nádorovým specifickým faktorům, přičemž umožňuje selektivně rozšířit vektor do nádorových buněk.
Nádorové specifické faktory, které se využívají při této metodě léčby zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které působí na úrovni: (1) vstupu viru do buněk (např. přítomnost nádorově specifického receptoru, který umožňuje virovému vektoru selektivně vstoupit do buněk karcinomu, ale nikoli do normálních buněk); (2) virové transkripce (např. mutovaný protein rakovinových buněk umožní selektivní transkripci RNA vektoru, který se používá při léčbě zhoubného bujení, v rakovinových buňkách); a (3) maturace viru a uvolnění (např. mutované proteiny rakovinových buněk umožňují podmíněně se replikujícím vektorům, které se používají při léčbě zhoubného bujení, selektivně dozrát např. asociací mutovaných celulámích proteinů s virovými proteiny nebo genomem, což vede k podpoře maturace viru a jeho uvolnění). Mutované proteiny, které se vyskytují v rakovinových buňkách, mohou reagovat s virovými proteiny (nebo s genomovou RNA nebo DNA) v mnoha stadiích virového replikačního cyklu. Tyto interakce se mohou manipulovat, aby vznikly podmíněně se replikující vektory vhodné pro léčbu rakoviny, které jsou defektivní v normálních buňkách a které se mohou replikovat v rakovinových buňkách.
Tato metoda se může zvláště použít při léčbě leukemie T-buněk. Leukemie T-buněk je vážná forma zhoubného bujení s nízkou prognózou úspěšné léčby. Řada leukemických T-buněk jsou CD4+. Pak při konstrukci podmíněně se replikujících vektorů, které se aplikují při léčbě leukemie T-buněk, se používá virus HIV divokého typu jako kostra vektoru. Protože virus HIV vstupuje do buněk prostřednictvím CD4 glykoproteinu, tento vektor bude působit na úrovni vstupu vektoru do buněk.
Vektor se může pozměnit tak, aby byl vhodný pro léčbu rakoviny tím, že se například zavede do viru HIV divokého typu delece. Genom viru HIV se může mutovat tím, že se připraví v jeho DNA formě a uskuteční se jeho místně specifická mutageneze, jak se popisuje shora v textu. Způsob se může podobně použít při komplementaci nedostatečnosti viru jinými mutacemi, které způsobují potlačení nádorů, nebo negativními onkogeny, nebo se mohou využívat jiné nádorově specifické faktory, které interagují s virovými proteiny. Například se může deletovat gen tat, který kóduje protein důležitý při replikaci viru HIV. Jestliže není přítomen Tat, pak virus HIV nemůže déle pozitivně regulovat jeho expresi, která je absolutně podstatná při propagaci viru HTV. Protein Tat funguje tak, že se váže na strukturu kmenové smyčky TAR RNA, která je spojena s promotorem viru HIV a je schopna zvýšit expresi HIV víc jak 100 krát. Pak jestliže není přítomen Tat, vektor založený na viru HTV nebude exprimovat proteiny HIV a nebude se pomnožovat v normálních (ne v rakovinových) T-buňkách a nebude je usmrcovat.
Leukemické T-buňky však obsahují funkčně pozměněnou molekulu, která je buď mutovaná, nadměrně se exprimuje nebo je latentní. Toto pozměněné stadium molekulární funkce se nevyskytuje u normálních buněk. V jejím nemutovaném stadiu (ale ne v jejím mutovaném stadiu), se tato molekula podílí na řízení buněčné proliferace a/nebo apoptózy (programové usmrcení buněk). Změny spojené s mutovanými stadii se mohou použít ke specifické podpoře propagace podmíněně se replikujícího virového vektoru. Ktomu může dojít za přítomnosti nebo nepřítomnosti pomocného virového expresivního vektoru. Defekt v Tat se může komplementovat pomocným expresivním vektorem, který se řídí nádorově specifickým promotorem, kde promotor pochází z genu v leukemických buňkách, jehož exprese je nadměrná. Takový vektor se může pouze replikovat v leukemických T-buňkách a ne v normálních buňkách. Virová exprese a propagace v leukemických T-buňkách povede k lyži a odumření buněk. Vektor může také nést
-33CZ 294170 B6 další elementy, které podpoří odumření buněk (např. sekvence kódující toxin, cytokin nebo antigen, aby podpořily imunitní cílení).
Další metody a strategie se mohou při konstrukci podmíněně se replikujících vektorů vhodných při léčbě rakoviny použít podobným způsobem.
Příklad 11
Tento příklad popisuje vývoj druhé generace konstrukcí crHIV (cr2HIV), které vykazují lepší vlastnosti propagace, než vektoiy crHIV-1.111.
Vektory druhé generace jsou schopny zvýšit produkci partikulí crHTV u buněk produkujících crHIV. Zvýšená produkce crHTV partikulí umožňuje jejich rozšíření a brání v kulturách nadměrnému růstu viru HIV divokého typu. Tím, že vektory neobsahují sekvence kódující proteiny, které blokují superinfekci virem HTV divokého typu, vektory obsahují všechny sekvence nativního viru HIV divokého typu, ale nekódují gen Tat. Na místě genu Tat je ztrojená antiTat ribozymová kazeta (SEQ ID NO: 18), řízená do třech různých míst na genu Tat. Také se deletovalo místo sestřihu Tat genu tak, že ribozymy Tat budou selektivně štěpit genomové RNA viru HIV divokého typu a RNA viru HIV divokého typu nebude upravena sestřihem. RNA viru HIV divokého typu doplňuje defekt v genu Tat a umožňuje replikaci crHIV. Na rozdíl od dříve uvedených vektorů, které nekódují proteiny jiné než bílkovinné genové antivirové agens, jako je imunogen, vektory druhé generace kódují a exprimují tyto proteiny pouze v přítomnosti Tat. V buňce, která obsahuje oba genomy jak viru HIV divokého typu, tak i crHIV, genomy crHIV se nebudou pouze selektivně balit, ale bude se zde produkovat mnohem více virionů ve srovnání s buňkami, které obsahují crHIV-1.111, protože strukturální proteiny se produkují ne pouze z viru HIV divokého typu, ale také z genomů crHIV. Vektor má v podstatě selektivní výhodu při pomnožení, protože neprodukuje viriony pouze z templátů HTV divokého typu, ale také z templátů crHIV.
Vektory druhé generace se také charakterizují tím, že obsahují nebo kódují ribozymy, jejichž katalytické domény směřují do oblastí, které jsou jiné, než ty ve vektoru samotném. Na rozdíl od crHTV-l.lll, které obsahují nebo kódují ribozymy cílené do oblasti U5 vedoucí sekvence viru HTV, která nutně vyžaduje inkorporaci modifikovaných sekvencí U5 do vedoucí sekvence vektoru crHIV, ribozymy druhé generace vektorů směřují do oblastí, které nejsou ve vektoru samotném, přičemž eliminují potřebu modifikovat sekvenci vektoru. To redukuje možnost, že rezistentní virus HIV se může tvořit rekombinací viru HIV divokého typu s modifikovanými sekvencemi crHTV U5. Pak rekombinace viru HTV divokého typu se sekvencemi crHTV neposkytují žádnou výhodu pro virus HTV divokého typu; začlenění ribozymových sekvencí do viru HTV divokého typu bude mít pouze negativní účinek.
Vektory druhé generace jsou dále charakterizovány začleněním řady různých ribozymů, kdy každý z nich je cílem do odlišného místa, aby se snížila možnost tvorby ribozym rezistentních mutantů viru HIV divokého typu.
Vektorový systém pro účely bezpečnosti, podmíněně se replikující vakcíny, konstrukce „pomocného vektoru“ se může zdokonalit přidáním genových elementů/faktorů, které umožňují specifickou replikaci crHIV a rozšiřují se bezpečným způsobem. Jedno provedení vynálezu je zavedení ribozymů do pomocného vektoru, aby se předešlo jejich genové rekombinací s vektorem za účelem produkce viru divokého typu. Pak shora uvedený vektor cr2HIV se může doplnit Tat pomocným expresivním vektorem, aby umožnil jeho rozšíření. Tím, že se zavedou anti-HIV ribozymy do pomocného expresivního vektoru, minimalizuje se šance pro rekombinací, protože střet vektoru sRNA pomocného vektoru povede kjejich vzájemnému rozštěpení a destrukci. Proto pomocný expresivní vektor se může modifikovat řadou způsobů tak, aby se dosáhlo určité profylaktické nebo terapeutické strategie. Vektory cr2HIV se mohou využít jako
-34CZ 294170 B6 vakcíny proti viru HIV, protože (1) se replikují a pak trvale stimulují imunitní odezvu hostitele a (2) umožňují hostiteli rozeznat různé epitopy, protože jsou odvozeny od viru HIV a nesou antigenní změny.
Změněný
SEKVENČNÍ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC (2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2
GTGTGCCCAC CTGTTGTGTG ACTCTGGCAG CTAGAGAAC (2) Údaje k SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 40 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina)
-35CZ 294170 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3
CACACAACCAC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACGGGCACA (2) Údaje k SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 40 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4
ATCTCTAGTC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACCAGAGTC (2) Údaje k SEQ ID NO: 5 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5
GTGTGCCCGC CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC (2) Údaje k SEQ ID NO: 6 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGCAA CTAGAGATC
-36CZ 294170 B6 (2) Údaje k SEQ ID NO: 7 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7
TGTGACGTCG ACCACACAAC ACTGATG 27 (2) Údaje k SEQ ID NO: 8 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 33 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8
TGTGACGTCG ACTCTAGATG TGCCCGTTTC GGC 33 (2) Údaje k SEQ ID NO: 9 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9
GGTTAAGCTT GAATTAGCCC TTCCAGTCCC C 31
-37CZ 294170 B6 (2) Údaje k SEQ ID NO: 10 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10
GGTTGGATCC GGGTGGCAAG TGGTCAAAAA G 31 (2) Údaje k SEQ ID NO: 11 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 38 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11
CGGATCCACG CGTGTCGACG AGCTCCCATG GTGATCAG (2) Údaje k SEQ ID NO: 12 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12
GGTTAAGCTT GTCGCCGCCC CTCGCCTCCTT G
-38 CZ 294170 B6 (2) Údaje k SEQ ID NO: 13 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 112 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná nukleová kyselina) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13
AAGCTTGCCT TGAGTGCTCA AAGTAGTGTG TGCCCACCTG TTGTGTGACT50
CTGGCAGCTA GAGATCCCAC AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT100
AGCAGTGGCG CC112 (2) Údaje k SEQ ID NO: 14 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14
GTGTGCCCNN CTGTTGTGTG ACTCTGGNAN CTAGAGANC (2) Údaje k SEQ ID NO: 15 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15
GTGTGCCCAT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC
-39CZ 294170 B6 (2) Údaje k SEQ ID NO: 16 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 39 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomová) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16
GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAG CTAGAGATC (2) Údaje k SEQ ID NO: 17 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 152 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (jiná) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17
GATCGAATTC CTGCTATGTT CTGATGAGTC CGAAAGGACG AAACACCCAT 50
TTCCCGGGTT TAGGATCCTG ATGAGCGGAA AGCCGCGAAA CTGGCTCCGG 100
CCGTTTTAGG CTCTGATGAG CTGGAAACAG CGAAACTTCC TGGTCGACGA 150
TC 152

Claims (40)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Podmíněně se replikující virový vektor, charakterizovaný schopností se replikovat pouze v hostitelské buňce, která dovoluje replikaci uvedeného vektoru, přičemž uvedený vektor zahrnuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace způsobuje, že uvedený vektor, který je rezistentní k přítomnosti, transkripci nebo translaci nejméně jedné uvedené sekvence nukleové kyseliny, se selektivně balí do dědičných virionů v porovnání s (i) kmenem viru divokého typu, kteiý odpovídá viru, ze kterého byl uvedený vektor získán, a je citlivý na přítomnost, transkripci nebo translaci nejméně jedné uvedené sekvence nukleové kyseliny, nebo (i i) pomocníkem replikace virového vektoru, který je citlivý na přítomnost, transkripci nebo translaci nejméně jedné uvedené sekvence nukleové kyseliny v případě, že (i) uvedený kmen viru divokého typu nebo (ii) uvedený pomocník replikace virového vektoru je přítomen v uvedené hostitelské buňce.
    -40CZ 294170 B6
  2. 2. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde uvedená nejméně jedna sekvence nukleové kyseliny zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která obsahuje nebo kóduje, v kterémžto případě exprimuje, genové antivirové agens, které nepříznivě ovlivňuje replikaci, expresi nebo replikaci a expresi (i) kmene viru divokého typu nebo (ii) pomocníka replikace virového vektoru, ale ne samotný uvedený virový vektor.
  3. 3. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 2, kde uvedené genové antivirové agens je vybráno ze skupiny, kterou tvoří antisense molekula, ribozym a imunogen.
  4. 4. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde uvedený vektor je odvozen od viru lidské imunodeficience.
  5. 5. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde uvedený vektor je odvozen od Togaviridae.
  6. 6. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde katalytická doména uvedeného ribozymů štěpí nukleotidovou sekvenci NUH.
  7. 7. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 3, kde uvedený ribozym je kódován vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4.
  8. 8. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde uvedený kmen viru divokého typu zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódovanou SEQ ID NO: 1 a uvedený vektor, jestliže jde o DNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde nejméně jeden N je mutován, 15 a 16, a uvedený vektor, jestliže jde o RNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 14, kde nejméně jeden N je mutován, 15 a 16.
  9. 9. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 8, kde tento vektor v případě, že jde o DNA, zahrnuje SEQ ID NO: 3 a nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5 a 15, a v případě, že jde o RNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódovanou SEQ ID NO: 3 a nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5 a 15.
  10. 10. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 8, kde uvedený vektor v případě, že jde o DNA, zahrnuje SEQ ID NO: 4 a nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6 a 16 a v případě, že jde o RNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódovanou SEQ ID NO: 4 a nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6 a 16.
  11. 11. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde uvedený vektor je odvozen z viru lidské imunodeficience a postrádá gen tat a jeho místo sestřihu z genomu viru lidské imunodefícience divokého typu.
  12. 12. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 11, kde na místě uvedeného genu tat a jeho místa sestřihu tento vektor zahrnuje trojitou anti-Tat ribozymovou kazetu, kde katalytická doména každého ribozymů trojité ribozymové kazety štěpí různé místo na molekule nukleové kyseliny viru lidské imunodefícience divokého typu.
  13. 13. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 12, kde uvedená molekula nukleové kyseliny viru lidské imunodefícience divokého typu zahrnuje tat a katalytická doména každého ribozymů trojité ribozymové kazety štěpí různé místo v tat.
  14. 14. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde alespoň jedna sekvence nukleové kyseliny způsobuje, že uvedený vektor se selektivně balí do dědičných virionů v porovnání s
    -41 CZ 294170 B6 (i) uvedeným kmenem viru divokého typu nebo (ii) uvedeným pomocníkem replikace virového vektoru.
  15. 15. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde tento vektor dále zahrnuje nejméně jednu další sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace poskytuje hostitelské buňce, která je infikována uvedeným vektorem, selektivní výhodu ve srovnání s buňkou infikovanou (i) kmene viru divokého typu nebo (ii) pomocníkem replikace virového vektoru.
  16. 16. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 15, kde uvedená nejméně jedna další sekvence nukleové kyseliny zahrnuje sekvenci kódující rezistenci proti více lékům.
  17. 17. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 16, kde uvedená nejméně jedna další sekvence nukleové kyseliny zahrnuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny, která zahrnuje nukleotidovou sekvenci kódující mutovanou proteázu a nukleotidovou sekvenci kódující mutovanou reverzní transkriptázu.
  18. 18. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 17, kde tento vektor je podmíněně se replikující vektor viru lidské imunodefícience, který zahrnuje ribozymovou kazetu obsahující jeden, dva nebo tři ribozymy, přičemž každý z nich je nezávisle cílen do místa +115 nebo +133 U5 HIV RNA.
  19. 19. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 1, kde alespoň jedna sekvence nukleové kyseliny způsobuje, že uvedený vektor se selektivně a ve větším množství balí do dědičných virionů v porovnání s (i) uvedeným kmenem viru divokého typu nebo (ii) uvedeným pomocníkem replikace virového vektoru.
  20. 20. Podmíněně se replikující virový vektor podle nároku 19, kde uvedená nejméně jedna sekvence nukleové kyseliny způsobuje selektivní balení uvedeného vektoru do dědičných virionů na úkor (i) uvedeného kmene viru divokého typu nebo (ii) uvedeného pomocníka replikace virového vektoru.
  21. 21. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje vektor podle nároku 1 nebo 15 a nosič pro tento vektor.
  22. 22. Hostitelská buňka, zahrnující vektor podle nároku 1 nebo 15.
  23. 23. Způsob přípravy vektoru podle kteréhokoli z nároků 1 až 20, vyznačující se tím, že (a) se získá vektor, který je odvozen z kmene viru divokého typu a který je schopen se replikovat pouze v hostitelské buňce, jež dovoluje replikaci uvedeného vektoru; a (b) do vektoru z kroku (a) se začlení sekvence nukleové kyseliny, která zahrnuje nebo kóduje, v kterémžto případě také exprimuje, antivirové agens, a tím nebo navíc k tomu se vektor z kroku (a) modifikuje tak, aby byl rezistentní k uvedenému antivirovému agens, přičemž uvedený vektor se selektivně balí do dědičných virionů ve srovnání s (i) kmenem viru divokého typu, jenž odpovídá viru, ze kterého byl odvozen uvedený vektor, a je citlivý na uvedené antivirové agens, nebo ve srovnání s (ii) pomocníkem replikace virového vektoru, který je citlivý k uvedenému antivirovému agens, v případě, že (i) uvedený kmen viru divokého typu nebo (ii) uvedený pomocník replikace virového vektoru je přítomen v hostitelské buňce.
  24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že uvedené antivirové agens je genové antivirové agens vybrané ze skupiny zahrnující antisense molekulu, ribozym a imunogen.
    -42CZ 294170 B6
  25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedený vektor je vektor viru lidské imunodefícience.
  26. 26. Způsob podle nároku 25, v y z n a č u j í c í se t í m , že krok (b) zahrnuje:
    (iii) začlenění nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4 do vektoru z kroku (a) v případě, že jde o DNA, nebo, jestliže jde o RNA, začlenění nukleotidové sekvence kódované nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4; a (iv) modifikaci vektoru z kroku (a) tak, aby v případě, jde-li o DNA, zahrnoval nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 14, ve které nejméně jeden N je mutován, nebo jde-li o RNA, nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 14, ve které nejméně jeden N je mutován.
  27. 27. Způsob podle nároku 26, v y z n a č u j í c í se t í m , že krok (b) zahrnuje:
    (iii) začlenění nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 3 do vektoru z kroku (a) v případě, že jde o DNA, a jestliže jde o RNA, začlenění nukleotidové sekvence kódované nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 3; a (iv) modifikaci vektoru z kroku (a) tak, aby v případě, jde-li o DNA, zahrnoval nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, a 15, nebo jde-li o RNA, nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, a 15.
  28. 28. Způsob podle nároku 26, v y z n a č u j í c í se t í m , že krok (b) zahrnuje:
    (iii) začlenění nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 4 do vektoru z kroku (a) v případě, že jde o DNA, a jestliže jde o RNA, začlenění nukleotidové sekvence kódované SEQ ID NO: 4; a (iv) modifikaci vektoru z kroku (a) tak, aby v případě, jde-li o DNA, zahrnoval nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6, a 16, nebo jde-li o RNA, nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 6, a 16.
  29. 29. Způsob modifikace vektoru podle kteréhokoli z nároků I až 20, vyznačující se t í m, že (a) se získá vektor; a (b) do vektoru z kroku (a) se začlení nukleotidová sekvence odpovídající SEQ ID NO: 14, ve které nejméně jeden N je mutován, v případě, že vektor je DNA, a nukleotidová sekvence kódovaná nukleotidovou sekvencí odpovídající SEQ ID NO: 14, ve které nejméně jeden N je mutován, v případě, že vektor je RNA.
  30. 30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že uvedená nukleotidová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 a 16 v případě, že vektor je DNA, a nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, 5, 6,15 a 16 v případě, že vektor je RNA.
    -43 CZ 294170 B6
  31. 31. Způsob propagace a selektivního balení podmíněně se replikujícího vektoru podle kteréhokoli z nároků 1 až 20 bez použití balicí buněčné linie, vyznačující se tím, že (a) podmíněně se replikující vektor se uvádí do styku s buňkou schopnou se infikovat dalším vektorem, který je stejného typu jako podmíněně se replikující vektor a liší se od něho tím, že je schopný se replikovat jako divoký typ;
    (b) buňka z kroku (a) se uvádí do styku s uvedeným dalším vektorem z kroku (a); a (c) buňka z kroku (b) se kultivuje za podmínek, vedoucích k propagaci uvedeného podmíněně se replikujícího vektoru.
  32. 32. Izolovaná a čištěná molekula nukleové kyseliny vybraná ze skupiny, kterou tvoří molekula DNA zahrnující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny tvořené SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 a 16 a molekula RNA zahrnující nukleotidovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny tvořené SEQ ID NO: 2, 5, 6, 15 a 16.
  33. 33. Použití vektoru podle kteréhokoli z nároků 1, 14 a 15 pro výrobu farmaceutického přípravku pro inhibici replikace kmene viru divokého typu v hostitelské buňce.
  34. 34. Použití podle nároku 33, kde uvedený virus způsobuje zhoubné bujení.
  35. 35. Použití podle nároku 33, kde farmaceutický přípravek dále zahrnuje prostředek vybraný ze skupiny tvořené cytotoxickým léčivem, inhibitorem proteázy a inhibitorem reverzní transkriptázy.
  36. 36. Použití podle nároku 33, kde uvedená hostitelská buňka dosud nepřišla do styku s uvedeným virem divokého typu a kde uvedený farmaceutický přípravek dále zahrnuje pomocný expresní vektor, kde tento pomocný expresní vektor doplňuje uvedený podmíněně se replikující virový vektor z hlediska jeho neschopnosti replikace.
  37. 37. Použití podle nároku 36, kde uvedený pomocný expresní vektor doplňuje uvedený podmíněně se replikující virový vektor buňkově specifickým způsobem.
  38. 38. Použití vektoru podle kteréhokoli z nároků 1 až 15 pro výrobu farmaceutického přípravku, kde uvedený podmíněně se replikující virový vektor dále zahrnuje předmětný gen a je schopen tento gen exprimovat v uvedené hostitelské buňce, a pomocný prostředek.
  39. 39. Použití podle nároku 38, kde uvedená exprese předmětného genu v hostitelské buňce inhibuje replikaci viru divokého typu v uvedené hostitelské buňce.
  40. 40. Použití vektoru podle kteréhokoli z nároků 1 až 15 pro výrobu farmaceutického přípravku, kde uvedený podmíněně se replikující virový vektor dále zahrnuje předmětný gen a je schopen tento gen exprimovat v uvedené hostitelské buňce, a pomocný prostředek pro detekci interakcí mezi léčivem/faktorem a proteinem kódovaným uvedeným genem.
CZ19981624A 1995-11-28 1996-11-27 Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití CZ294170B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56345995A 1995-11-28 1995-11-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ162498A3 CZ162498A3 (cs) 1998-12-16
CZ294170B6 true CZ294170B6 (cs) 2004-10-13

Family

ID=24250568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19981624A CZ294170B6 (cs) 1995-11-28 1996-11-27 Podmíněně se replikující virové vektory a jejich použití

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP0871757B1 (cs)
JP (2) JP2000503527A (cs)
KR (1) KR100537458B1 (cs)
CN (3) CN100390291C (cs)
AT (2) ATE455858T1 (cs)
AU (3) AU1124997A (cs)
BR (1) BR9612574A (cs)
CA (1) CA2236868C (cs)
CZ (1) CZ294170B6 (cs)
DE (2) DE69638120D1 (cs)
DK (1) DK0871757T3 (cs)
ES (1) ES2188802T3 (cs)
HK (1) HK1060152A1 (cs)
IL (2) IL124636A0 (cs)
NO (1) NO329619B1 (cs)
NZ (1) NZ324157A (cs)
PT (1) PT871757E (cs)
RU (1) RU2270250C2 (cs)
WO (1) WO1997020060A1 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1037669A4 (en) * 1997-12-12 2003-04-02 Cell Genesys Inc THERAPEUTIC USE OF LENTIVIRAL VECTORS
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
GB9906177D0 (en) * 1999-03-17 1999-05-12 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
AU9307501A (en) * 2000-09-22 2002-04-02 Virxsys Improved conditionally replicating vectors, methods for their production and use
US20030026791A1 (en) * 2001-03-27 2003-02-06 Laurent Humeau Conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections
HUE036103T2 (hu) 2007-12-11 2018-06-28 Univ North Carolina Chapel Hill Polipurin szakaszon módosított retrovirális vektorok
KR102162111B1 (ko) * 2010-10-11 2020-10-07 노파르티스 아게 항원 전달 플랫폼
CA3225013A1 (en) * 2015-02-24 2016-09-01 Bioatla, Llc Conditionally active proteins
CN104711294A (zh) * 2015-04-02 2015-06-17 扬州大学 一种基于禽网状内皮组织增生症病毒ltr的真核表达线性化载体的构建方法及应用
GB2543730A (en) * 2015-05-26 2017-05-03 Andrzejewski Slawomir Use of replication competent vector to eradicate viral latency presented on human immunodeficiency virus

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225337A (en) * 1989-09-25 1993-07-06 Innovir Laboratories, Inc. Ribozyme compositions and methods for use
IL108719A0 (en) * 1993-02-25 1994-08-26 Ortho Pharma Corp Expression constructs containing hiv inhibitory antisense and other nucleotide sequences, retroviralvectors and recombinant retroviruses containing them
WO1994026877A1 (en) * 1993-05-17 1994-11-24 The Regents Of The University Of California Ribozyme gene therapy for hiv infection and aids
ES2260376T3 (es) * 1994-01-05 2006-11-01 Gene Shears Pty Limited Ribozimas dirigidas contra una secuencia tat del vih.
AU2419595A (en) * 1994-05-10 1995-11-29 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Recombinant human immunodeficiency virus vector and process for producing the same
TW438601B (en) * 1994-05-18 2001-06-07 Janssen Pharmaceutica Nv New mucoadhesive emulsion compositions and a process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000503527A (ja) 2000-03-28
CN1940076A (zh) 2007-04-04
IL124636A (en) 2009-12-24
ATE234362T1 (de) 2003-03-15
EP0871757B1 (en) 2003-03-12
JP4384146B2 (ja) 2009-12-16
DE69626681T2 (de) 2004-02-12
NO329619B1 (no) 2010-11-22
EP1380650A1 (en) 2004-01-14
AU1124997A (en) 1998-06-19
AU767620B2 (en) 2003-11-20
EP0871757A1 (en) 1998-10-21
CN100390291C (zh) 2008-05-28
ES2188802T3 (es) 2003-07-01
CN1207775A (zh) 1999-02-10
AU2004200663B2 (en) 2007-07-05
CA2236868A1 (en) 1997-06-05
CA2236868C (en) 2014-01-21
AU1000001A (en) 2001-05-17
BR9612574A (pt) 2000-04-25
KR100537458B1 (ko) 2008-09-08
KR19990071728A (ko) 1999-09-27
RU2270250C2 (ru) 2006-02-20
DK0871757T3 (da) 2003-07-14
CZ162498A3 (cs) 1998-12-16
IL124636A0 (en) 1998-12-06
NO982418L (no) 1998-07-27
HK1060152A1 (en) 2004-07-30
PT871757E (pt) 2003-08-29
NO982418D0 (no) 1998-05-27
ATE455858T1 (de) 2010-02-15
DE69638120D1 (de) 2010-03-11
EP1380650B1 (en) 2010-01-20
JP2007014341A (ja) 2007-01-25
DE69626681D1 (de) 2003-04-17
NZ324157A (en) 2000-10-27
CN1651577A (zh) 2005-08-10
AU2004200663A1 (en) 2004-04-08
WO1997020060A1 (en) 1997-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7572906B2 (en) Viral vectors and host cells and methods of making and using them
JP4384146B2 (ja) 条件付き複製ウイルスベクターおよびその用途
RU2301260C2 (ru) Вирусные векторы с зависимой от условий репликацией и их применение
US5885806A (en) Methods to prepare conditionally replicating viral vectors
US20030026791A1 (en) Conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections
AU2001293075B2 (en) Conditionally replicating viral vectors and their use
AU2001293075A1 (en) Conditionally replicating viral vectors and their use
AU2002258639A1 (en) Improved conditionally replicating vectors for inhibiting viral infections

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20161127