ES2260376T3

ES2260376T3 - Ribozimas dirigidas contra una secuencia tat del vih.

Info

Publication number: ES2260376T3
Application number: ES02025406T
Authority: ES
Inventors: Geoffrey P. Symonds; Lun-Quan Sun
Original assignee: Gene Shears Pty Ltd
Current assignee: Gene Shears Pty Ltd
Priority date: 1994-01-05
Filing date: 1995-01-05
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2015-01-05
Also published as: DE69534864D1; WO1995018854A1; DK1298208T3; NO962826D0; EP0753062A1; NO962826L; NO319376B1; EP1298208B1; JPH09508004A; EP1298208A2; DE69534864T2; AU1391295A; CN1267552C; AU698730B2; ATE320487T1; IL112261A0; JP3691849B2; IL112261A; CN1145638A; EP0753062A4

Abstract

Compuesto oligonucleotídico que comprende una ribozima dirigida a la secuencia diana GUA en el nucleótido 5849 del aislado SF-2 del VIH-1 o a una secuencia diana correspondiente de otros aislados del VIH-1, en el que dicho compuesto es: - una única ribozima, o - una ribozima múltiple dirigida a diferentes secuencias en tat.

Description

Ribozimas dirigidas contra una secuencia tat del VIH.

A lo largo de la presente solicitud se hace referencia a varias publicaciones por el autor y el año entre paréntesis. Las referencias completas están enumeradas en orden alfabético después del apartado Experimental. Todas estas publicaciones describen el estado de la técnica al que se refiere la presente invención.

Antecedentes de la invención Retrovirus

Los retrovirus son virus con ARN como su material genómico. Utilizan células huésped para su replicación integrando de manera estable una copia de ADNc de su ARN genómico en el genoma de la célula huésped (Miller, 1992, y Brown, 1987). El genoma vírico comprende una repetición terminal larga (LTR) en cada extremo (5' y 3') de la forma provírica del ADNc del virus. Avanzando desde 5' a 3', la LTR comprende las secuencias U3 y U5 ligadas por una secuencia corta denominada R. La transcripción comienza en la LTR 5' y termina en una secuencia de poliadenilación en la LTR 3'. Al lado de las LTR están las secuencias cortas necesarias para el cebado de la síntesis de ADN de cadena positiva y negativa mediante la transcriptasa inversa. Las secuencias donante y aceptora de corte y empalme están también presentes en el genoma y éstas están involucradas en la producción de especies subgenómicas de ARN. Una secuencia necesaria para la encapsidación del ARN vírico en los viriones está directamente proximal a la 5' LTR. Ésta se denomina secuencia de empaquetamiento Psi. Es una señal esencial y específica que asegura que el ARN vírico está empaquetado. El conjunto del ARN vírico comprende los genes replicantes gag, pol y env que codifican, respectivamente, las proteínas nucleares (gag), las enzimas integrasa, proteasa y transcriptasa inversa (pol) y las proteínas la envoltura (env).

La infección retrovírica de una célula se inicia por la interacción de glucoproteínas víricas con receptores celulares (A) (véase la Figura 1). Después de la adsorción y retirada de capas, el ARN vírico se introduce en la célula diana y se convierte en el ADNc mediante la acción de la transcriptasa inversa, una enzima transportada en el virión (B). El ADNc adopta una forma circular (C), se convierte en ADNc de doble cadena y a continuación se llega a integrar en el ADN genómico de la célula huésped mediante la acción de la integrasa (D). Una vez integrado, el ADNc provírico se transcribe en el promotor dentro del 5' LTR (E). El ARN transcrito actúa como ARNm y se traduce para producir las proteínas víricas (F) o se deja como ARN vírico naciente. Este ARN vírico contiene una secuencia de empaquetamiento Psi que es esencial para su empaquetamiento en los viriones (G). Una vez se produce el virión, se libera de la célula germinando desde la membrana plasmática (H). En general, los retrovirus no producen la lisis de la célula huésped; VIH es una excepción a esto. El ADNc provírico permanece integrado de manera estable en el genoma del huésped y se replica con el ADN del huésped de modo que las células descendientes también heredan el provirus. Los agentes antivíricos potenciales pueden dirigirse a cualquiera de estos puntos de control replicativos.

Virus de inmunodeficiencia humana (VIH)

El VIH pertenece a la clase retrovirus y su replicación es como se esbozó anteriormente. La introducción del VIH en las células, incluyendo a los linfocitos T, monocitos y macrófagos, se efectúa generalmente mediante la interacción de la proteína de la envoltura gp120 del VIH con un receptor CD4 en la superficie de la célula diana. La secuencia de aminoácidos de gp120 puede ser muy variable en diferentes pacientes (o incluso en el mismo paciente) haciendo muy difícil producción de vacuna (Brown, 1987 y Peterlin et al., 1988). Esta variabilidad parece que está asociada a la evolución de la enfermedad. Las principales peculiaridades del VIH son i) que (como para otros miembros del grupo lentivirus) tiene una fase latente en la que el provirus puede encontrarse latente después de la integración en el genoma de la célula huésped, y ii) es citopático para las células diana linfocitos T. VIH comienza la replicación una vez que las células que albergan el provirus se activan. El estímulo (o estímulos) para la activación celular y la replicación vírica acompañante no han sido identificados todavía de manera clara (Brown, 1987 y Peterlin et al., 1988). Como para todos los retrovirus, los productos génicos gag, pol, y env se traducen en proteínas estructurales y enzimáticas. En el caso del VIH, existen genes reguladores adicionales. Particularmente, los productos génicos tat y rev se traducen en proteínas reguladoras y actúan como potenciadores de la transcripción para producir niveles elevados de expresión génica. Nef es otro gen regulador que sirve para modular los niveles de replicación vírica (Jones, 1989, Greene, 1990 y Epstein, 1991).

La replicación del VIH es mayor en las células activadas y proliferantes; la activación celular conduce a la unión de la transcripción nuclear y a factores potenciadores celulares para el LTR del VIH que produce un aumento de los niveles de la transcripción. Como para todos los retrovirus, la zona de empaquetamiento (Psi) es una secuencia de ARN con actuación cis presente en el genoma del VIH, necesaria para la encapsidación del ARN genómico. La formación de un núcleo que incorpora proteínas gag, enzimas pol y ARN vírico es la última etapa del ciclo de replicación del VIH. Este núcleo obtiene una membrana y deja la célula germinando a través de la membrana celular (Peterlin et al., 1988, Jones, K. A., 1989, Greene, 1990 y Epstein, 1991).

Hasta la fecha, se han estudiado numerosos agentes para la supresión de la replicación del VIH. Sigue una descripción de determinados agentes que se han dirigido en las etapas replicativas representadas en la Figura 1.

A) Adsorción vírica a la célula diana

Se ha utilizado CD4 soluble en un intento de ocupar una gran producción de receptores víricos de modo que el virus es incapaz de fijarse a la membrana celular. Sin embargo, hasta la fecha no se ha observado que sea una estrategia terapéutica lograda (Stevenson et al., 1992). Los polisacáridos sulfatados han demostrado una capacidad para inhibir la infección por VIH posiblemente al interrumpir la fusión célula-virus (McClure et al., 1992). Los anticuerpos contra el propio VIH, los receptores de células huésped o los determinantes de la envoltura del VIH así como la exotoxina conjugada con CD4 (Stevenson et al., 1992) son otros métodos posibles de interrupción de la introducción vírica en una célula.

(B) Producción de ADNc mediante transcriptasa inversa

Se ha observado que productos químicos tal como el trifosfato de azidotimidina (AZT) inhiben la transcriptasa inversa (in vitro). AZT se administra actualmente tanto de forma rutinaria a los pacientes de SIDA como cuando reciben trasplantes de médula ósea, esto último en un intento de proteger del VIH residual la médula normal (Miller, 1992).

(C) Transposición del ADNc desde el citoplasma al núcleo

Puede que sea posible interrumpir la transposición del ADNc a través de los poros nucleares o del propio transporte nuclear pero esto todavía no se ha demostrado que se realice con éxito.

(D) Integración del ADNc en el genoma del huésped

Puede también que sea posible bloquear la integración del ADNc provírico en el genoma de la célula huésped (Stevenson et al., 1992). Hasta la fecha, no existen compuestos experimentales que hayan demostrado ser eficaces.

(E) Transcripción provírica

El 5,6-dicloro-1-beta-D-ribofuranosil benzimidazol es conocido porque interfiere con el alargamiento de la transcripción (Stevenson et al., 1992). Los análogos de TAR de cadena transcrita pueden también afectar la transcripción uniéndose a la proteína tat inhibiendo de este modo su capacidad para activar el VIH (Miller, 1992 y Sullenger et al., 1990).

(F) Traducción del ARNm del VIH

El ARN de cadena complementaria, mediante la unión al ARN vírico, puede inhibir la duplicación vírica (Sczakiel et al., 1992). La fijación al ARNm puede servir para inhibir la traducción; uniéndose al ARN vírico naciente puede también actuar para inhibir el empaquetamiento productivo del ARN en los viriones.

(G) Empaquetamiento vírico y producción de viriones maduros

La proteasa produce la escisión específica de la poliproteína del VIH. Esta actividad es esencial para la producción de viriones maduros e infecciosos. Se ha descubierto que varios compuestos tales como las \alpha,\alpha-difluorocetonas, inhiben la VIH proteasa y han demostrado un grado de actividad antivírica en el cultivo tisular. Sin embargo, la mayoría de los inhibidores de proteasa han presentado una vida media corta del suero, depuración biliar rápida y escasa disponibilidad oral (Debouck, 1992).

Ribozimas

Las ribozimas son los ARN enzimáticos que escinden el ARN y presentan ciclo metabólico. En algunas clases de ribozimas mediante la adición de brazos de secuencia complementarios, pueden volverse capaces de emparejarse con un ARN diana específico y producir la escisión en secuencias específicas a lo largo del eje central de fosfodiéster del ARN (Haseloff et al., 1988; Rossi et al., 1992; Hampel, 1990; Ojwang, 1992). La ribozima cabeza de martillo es pequeña, sencilla y presenta capacidad para mantener la escisión específica para la secuencia cuando se incorpora en una variedad de motivos de secuencias flanqueantes (Haseloff et al., 1988; Rossi et al., 1992). Estas características la hacen particularmente muy adecuada para la supresión génica.

Ribozimas contra el VIH del gen tat

Las ribozimas dirigidas contra secuencias en el gen tat del VIH-1 han sido descritas en la bibliografía, específicamente contra la secuencia 1 (Crisell et al., 1993) y la secuencia 3 (Lo et al., 1992) como se ilustra en la Figura 13.

Un vector de expresión de la multirribozima que se dirige, entre otros, al gen tat del VIH-1, también se describe en Ohkawa et al. (1993). Sin embargo, ninguna de estas publicaciones identifica la secuencia diana específica en el nucleótido 5849 del gen tat del VIH-1 que confiere propiedades ventajosas a las ribozimas que se dirigen a dicha secuencia.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un compuesto oligonucleotídico que comprende una ribozima dirigida a la secuencia diana GUA en el nucleótido 5849 del aislado SF-2 del VIH-1 o a una secuencia diana correspondiente de otros aislados del VIH-1, en el que dicho compuesto es:

-: una única ribozima, o

-: una ribozima múltiple dirigida a diferentes secuencias en tat.

La presente invención da a conocer asimismo un compuesto oligonucleotídico no natural, sintético que comprende nucleótidos cuya secuencia define una zona catalítica conservada y nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con una secuencia diana predeterminada en una secuencia de empaquetamiento de un virus con ARN. Preferentemente, la secuencia de empaquetamiento vírica es una secuencia de empaquetamiento retrovírica y en una forma de realización, la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH-1. El virus con ARN puede ser el VIH-1, el virus de la leucemia felina, el virus de la inmunodeficiencia felina o uno de los virus relacionados en la Tabla 6. La zona catalítica conservada puede proceder de una ribozima cabeza de martillo, de una ribozima de horquilla, de una ribozima delta de la hepatitis, de una ribozima de ARNasa P, de un intrón del grupo I, de un intrón del grupo II. La invención también da a conocer múltiples ribozimas y combinaciones de ribozimas y con cadena complementaria dirigida contra el virus con ARN e incluyendo además dichas combinaciones señuelos poliTAR, RRE o TAR. Se describen también vectores o ribozimas con o sin cadena complementaria y los señuelos poliTAR, RRE o TAR. Además, se describen los métodos de utilización ex vivo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Ciclo de duplicación de un retrovirus típico

(A) El virus se une a los receptores de la superficie celular en la célula diana y el ARN genómico se introduce en la célula diana después de la fusión y del desprendimiento de la capa vírica.

(B) La transcripción inversa tiene lugar dando como resultado la conversión del ARN vírico en ADNc.

(C) El ADNc se introduce en el núcleo y se convierte en una forma circular.

(D) El ADNc a continuación se integra en el genoma de la célula huésped.

(E) Transcripción del provirus para producir el ARN vírico y el ARNm.

(F) La traducción produce proteínas víricas.

(G) El núcleo vírico se forma a partir de las proteínas codificadas víricamente y del ARN vírico empaquetado.

(H) El núcleo obtiene una membrana y sale de la célula germinando a través de la membrana celular.

Figura 2

Secuencias de direccionamiento de la ribozima en la zona de empaquetamiento Psi de Mo-MLV

La zona 5' de Mo-MLV representa un fragmento de BaII/BaII (nt 212 a nt 747) de pMLV-1 (definido en el texto). Las flechas indican las secuencias de direccionamiento de la ribozima todas las cuales eran restos de GUC.

Figura 3

Genoma del virus de la leucemia murina de Moloney

El genoma del MoMLV está constituido por los genes replicantes gag, pol y env y las repeticiones terminales largas 5' y 3' (LTR). La secuencia de empaquetamiento Psi es necesaria para empaquetar el ARN vírico en el virión.

Figura 4

Montajes de la secuencia de empaquetamiento de anti-Mo-MLV y anti-VIH

Los montajes de expresión se basaron en pSV2neo y consistían en el promotor SV40 corriente arriba del gen neo^{r} con una de las ribozimas diseñadas o una secuencia de cadena complementaria complementaria a la secuencia de empaquetamiento Psi (anti-Psi) insertada en la secuencia Sma I de neo^{r}.

Figura 5

Secuencia de empaquetamiento del VIH dirigida

La figura presenta una vista simplificada del genoma VIH estando dirigida la ribozima 9 a una secuencia en la secuencia de empaquetamiento Psi.

Figura 6

Escisión in vitro del ARN de la zona de empaquetamiento de Mo-MLV generada in vitro por ribozimas

La banda 1 es el ADN del marcador pBR322 digerido con HinfI. La banda 2 es el sustrato de aproximadamente 550 kb. Las bandas 3, 5, 7 y 9 fueron las Rz243, Rz274, Rz366 y Rz-M7 solas generadas in vitro. Las siguientes ribozimas se añadieron al sustrato diana ARN; banda 4, Rz243; banda 6, Rz274; banda 8, Rz366; banda 10, Rz-M7. Las reacciones de escisión se realizaron a 37ºC durante 30 min en MgCl_{2} 10 mM, Tris\cdotCl 50 mM, pH 7,5, después se calentaron las muestras a 80ºC durante 2 min en Tris\cdotCl, 10 mM, pH 7,5.

Figura 7

Hibridación Southern del ADN de la ribozima o de las líneas celulares transfectadas con el montaje de cadena complementaria

ADN genómico (10 \mug) de las células 3T3-Mo-MLV transfectadas con los diversos montajes: banda 1, pSV243; banda 2, pSV274; banda 3, pSV366; banda 4, pSV-M7; banda 5, pSVAs-Psi; y banda 6, vector pSV2neo solo se digirieron con HindIII/NruI, se separaron en un gel de agarosa al 0,6%, se transfirieron sobre un filtro de nitrocelulosa y se hibridaron con una sonda del gen neo^{r} marcada con ^{32}P. Las cabezas de las flechas indican el tamaño previsto del gen neo^{r} solo (1,34 kb) y el gen neo^{r} más las ribozimas aisladas (1,38 kb), más una Rz múltiple (1,98 kb) o más la cadena complementaria (1,89 kb).

Figura 8

Análisis de protección de la ARNasa para estudiar la expresión de los montajes ribozima/cadena complementaria

Se analizó la expresión en 20 \mug de ARN completo de una serie de células transfectadas de las ribozimas o de montajes de la cadena complementaria utilizando ribosondas marcadas con ^{32}P. Banda 1, fragmentos de ADN marcados en el extremo del marcador de tamaño de pBR322 digeridos con HinfI; banda 2, ribosonda de RzM7 hibridada con ARN de levadura y digerida con ARNasa; banda 3, ribosonda de RzM7 hibridada con ARN de levadura, seguida de digestión con ARNasa; bandas 4 a 8, ribosondas de Rz243, Rz274, Rz366, RzM7 y As-Psi hibrizada con ARN de células transfectadas con pSV243, pSV274, pSV366, pSV-M7 y pSVAs-Psi respectivamente y digeridas con ARNasa; bandas 9 a 13, ribosondas de RzM7, Rz243, Rz274, Rz366 y As-Psi únicamente. En este ensayo se utilizó un clon de cada montaje que presentaba la mejor supresión de la duplicación de Mo-MLV.

Figura 9

Autorradiografía de una transferencia de manchas del ARN vírico procedente de diferentes células 3T3 que producen Mo-MLV

Preparaciones de ARN vírico a diluciones 1:1, 1:5 y 1:10 se sondaron con ribosonda marcada de ^{32}P complementaria con la zona de empaquetamiento Psi de Mo-MLV como se describió anteriormente. Banda 1, ARN de levadura; bandas 2 a 7, ARN de sobrenadantes de células 3T3-Mo-MLV transfectadas con pSV243, pSV274, pSV366, pSV-M7, pSVAsPsi y pSV2neo. Se puede apreciar que las concentraciones de ARN víricos se reducen por las ribozimas eficaces en la escisión de las moléculas diana de ARN in vitro y por la cadena complementaria.

Figura 10

Concentraciones de p24 en un análisis de larga duración

El histograma presenta los datos de la replicación del VIH medidos por las concentraciones de p24 los días 8, 13 y 22 para la ribozima 9 (Rz-9), el montaje de ribozima dirigido a la secuencia de empaquetamiento del VIH. El vector, es el montaje de referencia. Rz-2 y Rz-M son dos montajes de la ribozima dirigidos al gen tat de VIH. Rz-M es una multi-ribozima que contiene varias ribozimas dirigidas a diferentes secuencias en tat. Esto incluye la secuencia dirigida por Rz-2.

Figura 11

Se diseñaron las ribozimas tat anti-VIH-1 según los datos de la secuencia del aislado SF2 del VIH-1 procedentes del Genebank (LOCUS: HIVSF2CG). Las secuencias diana son GUC (Rz 1), GUA (Rz 2), GUC (Rz 3) y CUC
(Rz 4).

Figura 12

Secuencia tat conservada

Figura 13

Comparación de varias secuencias tat diana

Figura 14

Líneas de linfocitos T clónicos transfectadas (Sup T1) que demuestran protección en Rz2 (a, d, f). Línea celular que contiene vector (pSV2neo, neo-a) y referencias aleatorias (Ran a, b, c, d, e, f).

Fig. 15A a 15C

Representación esquemática de los montajes de vector retrovíricos y su consiguiente expresión (no dibujada a escala). 15A, montaje de la ribozima RRz2; 15B, montaje de cadena complementaria RASH5; 15C, montaje polimérico-TAR R20TAR. Los vectores retrovíricos paternos se indican entre paréntesis. Véase el texto para detalles.

Fig. 16A a 16C

Expresión de los montajes retrovíricos en las BPL transducidas. La expresión de la ribozima (Fig. 16A), de la cadena complementaria (Fig. 16B) y del ARN de 20TAR (Fig. 16C) se examinaron por análisis Northern utilizando las sondas correspondientes marcadas con ^{32}P. Véase el texto para detalles.

Fig. 17A a 17C

Inhibición de la replicación IIIB del VIH-1 en las PBL transducidas. Las PBL transducidas y seleccionadas se sometieron a una prueba de provocación y se analizaron como se indica en Materiales y Métodos.

Los datos representados son las medias de cinco donantes (Fig. 17A, montajes de ribozimas y Fig. 17B, montajes con cadena complementaria) y dos donantes (Fig. 17C, montajes poliméricos-TAR).

Fig. 18A a 18C

Resistencia a la infección de las PBL transducidas por un aislado clínico 82H. Se transdujeron las PBL con el montaje de la ribozima (Fig. 18A), el montaje de la cadena complementaria (Fig. 18B) y del montaje polimérico-TAR (Fig. 18C), infectadas con 82H, como se describe en Materiales y Métodos. Los datos representados son las medias de dos donantes.

Fig. 19

Ensayos de proliferación de las PBL transducidas. Los datos se presentan como media \pm SD (n=3). PBL únicamente, PBL no transducidas; LXSN, R-20TAR, LNHL, RASH-5, LNL6 y RRz2, PBL transducidas con los retrovirus correspondientes.

Fig. 20

La línea celular CEM T4 de linfocitos T está transducida con virus y sometida a selección con G418. El conjunto de la población contiene células con integrantes aleatorios y niveles de expresión del montaje variables que se someten a continuación a la prueba de provocación con VIH-1.

Fig. 21A a 21B

RzM es una ribozima múltiple dirigida contra tat y RRzpsi/M es una ribozima dirigida contra la ribozima múltiple de empaquetamiento contra tat conjuntamente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención da a conocer un compuesto oligonucleotídico no natural, sintético que comprende nucleótidos cuya secuencia define una zona catalítica conservada y nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con una secuencia diana predeterminada en una secuencia de empaquetamiento de un virus con ARN. Preferentemente, la secuencia de empaquetamiento vírica es una secuencia de empaquetamiento retrovírica, por ejemplo dicha secuencia de empaquetamiento es la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH-1.

En una forma de realización preferida, el ARN virus es un virus de leucemia felina. En otra forma de realización el ARN virus es un virus de inmunodeficiencia felina.

Un compuesto preferido presenta la estructura:

1

en la que cada X representa un nucleótido que es el mismo o diferente y puede ser modificado o sustituido en su azúcar, fosfato o base;

en la que cada A, C, U y G representa un ribonucleótido que puede estar inalterado, modificado o sustituido en su azúcar, fosfato o base;

en la que 3' AAG....AGUCX 5' define la zona catalítica conservada;

en la que cada (X)_{n}A y (X)_{n'} define los nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con la secuencia diana predeterminada en la secuencia de empaquetamiento del ARN virus;

en la que cada * representa el emparejamiento de bases entre los nucleótidos situados en una de sus dos caras;

en la que cada línea llena representa un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de las dos caras; en la que cada una de las líneas de puntos representa independientemente bien un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de sus dos caras o bien la ausencia de alguno de dichos enlaces químicos;

en la que a representa un número entero que define un número de nucleótidos con la condición de que a puede ser 0 ó 1 y si es 0, la A situada en 5' de (X)_{a} está unida a la X situada en 3' de (X)_{a};

en la que cada m y m' representa un número entero que es mayor o igual a 1;

en la que (X)_{b} representa un oligonucleótido y b representa un número entero que es mayor o igual a 2.

Otro compuesto preferido de la invención presenta la estructura:

2

en la que 3' AAG....AGUCX 5' define la zona catalítica conservada;

en la que cada línea llena representa un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de las dos caras;

en la que m representa un número entero de 2 a 20; y

en la que ninguno de los nucleótidos (X)_{m} son bases emparejadas de Watson-Crick a cualquier otro nucleótido en el compuesto.

Otro compuesto preferido de la invención presenta la estructura:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

en la que cada X representa un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido que puede ser modificado o sustituido en su azúcar, fosfato o base;

en la que 3' (X)_{p4}....(X)p1 5' define la zona catalítica conservada;

en la que cada (X)_{F4} y (X)_{F3} define los nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con la secuencia diana predeterminada en la secuencia de empaquetamiento de un virus con ARN;

en la que F3 representa un número entero que define el número de nucleótidos en el oligonucleótido con la condición de que F3 sea mayor o igual a 3;

en la que F4 representa un número entero que define el número de nucleótidos en el oligonucleótido con la condición de que F4 esté comprendido entre 3 y 5;

en la que cada (X)_{P1} y (X)_{P4} representa un oligonucleótido con una secuencia predeterminada de modo que (X)_{P4} empareja las bases con 3 a 6 bases de (X)_{P1};

en la que P1 representa un número entero que define el número de nucleótidos en el oligonucleótido con la condición de que P1 esté comprendida entre 3 y 6 y la suma de P1 y F4 sea igual a 9;

en la que cada (X)_{P2} y (X)_{P3} representa un oligonucleótido con una secuencia predeterminada de modo que (X)_{P2} empareja las bases con 3 bases de (X)_{P3};

en la que cada una de las líneas de puntos representa independientemente bien un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de sus dos caras o bien la ausencia de alguno de dichos enlaces químicos; y

en la que (X)_{L2} representa un oligonucleótido que puede estar presente o ausente con la condición de que L2 representa un número entero que es mayor o igual a 3 si (X)_{L2} está presente.

En una forma de realización preferida, el compuesto de la invención comprende nucleótidos, cuya secuencia define una zona catalítica conservada, que son de la zona conservada del virus de la hepatitis delta.

En otra forma de realización preferida, el compuesto de la invención comprende nucleótidos, cuya secuencia define una zona catalítica conservada, que contiene la secuencia NCCA y su terminal 3'.

En otra forma de realización la presente invención da a conocer un compuesto oligonucleotídico no natural sintético que comprende dos o más dominios que pueden ser iguales o diferentes, en el que cada dominio comprende nucleótidos cuya secuencia define una zona catalítica conservada y nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con una secuencia diana predeterminada en una secuencia de empaquetamiento de un ARN virus.

En una forma de realización preferida el compuesto de la invención comprende además un compuesto de ácido nucleico de cadena complementaria unido por enlace covalente capaz de hibridarse con una secuencia predeterminada, que puede ser igual o diferente, en una secuencia de empaquetamiento del virus con ARN.

Preferentemente, el compuesto de la invención comprende nucleótidos capaces de hibridarse con la secuencia diana 243, 274, 366 ó 553 en el MoMLV, y la secuencia 749 en la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH.

La invención también da a conocer un compuesto que comprende el compuesto mencionado anteriormente y que comprende además por lo menos un compuesto oligonucleotídico no natural sintético adicional con o sin una molécula de cadena complementaria unida por enlaces covalentes y dirigida a un gen diferente del genoma del ARN virus. En una forma de realización preferida, dicho ARN virus es el VIH y la zona diferente del genoma del VIH se selecciona de entre el grupo constituido por la repetición terminal larga, la zona 5' no traducida, las secuencias de donante-receptor de corte y empalme, las secuencias de unión al cebador, la zona no traducida 3', la zona gag, pol, proteasa, integrasa, env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, vpx o tev.

En una forma de realización preferida de este compuesto, los nucleótidos son capaces de hibridarse con las secuencias dianas 243, 274, 366 ó 553 o la combinación de las mismas en el MoMLV y la secuencia 749 en la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH y los nucleótidos del compuesto adicional son capaces de hibridarse con las secuencias diana 5792, 5849, 5886 ó 6042 o una combinación de las mismas en la zona tat de VIH.

La presente invención también da a conocer una composición que comprende el compuesto descrito anteriormente, junto con un vehículo o excipiente farmacéutica, veterinaria o agriculturalmente aceptable.

La presente invención también da a conocer una composición que comprende un compuesto oligonucleotídico no natural sintético descrito, con o sin cadena complementaria y que comprende además un señuelo TAR, poliTAR o un señuelo RRE.

La presente invención también da a conocer un método para la producción del compuesto descrito anteriormente que comprende las etapas siguientes:

(a): ligar un vector de transferencia compuesto de ADN, ARN o una combinación de los mismos una secuencia de nucleótidos correspondiente al compuesto;

(b): transcribir la secuencia nucleotídica de la etapa (a) con una ARN polimerasa; y

(c): recuperar el compuesto.

La presente invención también da a conocer un método para la producción de un vector de transferencia compuesto de ARN o de ADN o una combinación de los mismos que contiene una secuencia de nucleótidos que en la transcripción da lugar al compuesto descrito anteriormente.

Preferentemente, dicho vector de transferencia comprende la repetición terminal larga del VIH, un adenovirus asociado al vector de transferencia, un promotor SV40, Mo-MLV o un vector retrovírico anfótropo. Más preferentemente, el vector de transferencia comprende además una secuencia que se dirige al compuesto oligonucleotídico a una zona determinada en la célula ex vivo.

La presente invención también da a conocer una composición que comprende el vector de transferencia descrito anteriormente, junto con un vehículo o excipiente farmacéutica, veterinaria o agriculturalmente aceptable.

La presente invención da a conocer asimismo una célula procariótica o eucariótica que comprende una secuencia de nucleótidos que es el compuesto descrito anteriormente o en la transcripción da lugar al mismo.

Preferentemente, la célula es una célula eucariótica, más preferentemente una célula animal.

En una forma de realización preferida, dicha célula eucariótica es una célula madre hematopoyética que da lugar a células madre, más maduras y células completamente maduras de todas las estirpes de células hematopoyéticas.

En otra forma de realización preferida, dicha célula eucariótica es una célula madre que da lugar a células maduras de todas las estirpes de células hematopoyéticas.

En otra forma de realización preferida, dicha célula eucariótica es una célula madre comprometida que da lugar a una estirpe hematopoyética específica.

Preferentemente la célula eucariótica es una célula madre de linfocitos T. Otra célula eucariótica preferida es el linfocito T inmaduro. Todavía otra célula eucariótica preferida es el linfocito T maduro. En otra forma de realización, la célula eucariótica es una célula madre mieloide o una célula monocito/macrófago.

La presente invención da a conocer asimismo la utilización del compuesto descrito anteriormente para proteger las células madre hematopoyéticas, las células madre, las células madre comprometidas, las células madre de linfocitos T, los linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, células madre mieloides o células monocito/macrófago.

La presente invención se refiere también a la introducción ex vivo o al vector de transferencia descrito anteriormente, en las células hematopoyéticas haciendo resistentes de este modo las células al VIH de modo que suprimen por esta razón el VIH en un paciente de SIDA. Por este método, las células son células autólogas o heterólogas.

En otra forma de realización preferida de dicho método, la introducción se realiza ex vivo y las células son transplantadas sin mieloablación.

En otra forma de realización preferida de este método, la introducción se realiza ex vivo y las células son transplantadas con mieloablación.

La presente invención se refiere asimismo a la incorporación ex vivo del vector de transferencia descrito anteriormente en células de un individuo protegiendo de este modo a este individuo de los efectos de grandes concentraciones del virus y de la infección por VIH. Específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto oligonucleotídico que comprende una ribozima dirigida a la secuencia diana GUA en el nucleótido 5849 del aislado SF-2 del VIH-1 o a una secuencia diana correspondiente de otros aislados del VIH-1, en la que dicho compuesto es uno de los siguientes:

-: una única ribozima, o

-: una ribozima múltiple dirigida a diferentes secuencias en tat.

En las formas de realización preferidas, el compuesto está codificado por un montaje que comprende la secuencia:

TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC

o la secuencia

CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAA
ACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACCCAA,

en la que cada T, G, A y C representa un nucleótido. En otra forma de realización preferida, el compuesto está codificado por un montaje que comprende además la secuencia

GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG

La presente invención da a conocer asimismo un compuesto oligonucleotídico no natural, sintético que comprende nucleótidos cuya secuencia define una zona catalítica conservada y nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con una secuencia diana predeterminada en una secuencia de empaquetamiento de un virus con ARN. Preferentemente, la secuencia de empaquetamiento vírica es una secuencia de empaquetamiento retrovírica y en una forma de realización la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH-1. El virus con ARN puede ser el VIH-1, el virus de la leucemia felina, el virus de la inmunodeficiencia felina o uno de los virus relacionados en las Tablas 6 y 7. La zona catalítica conservada puede proceder de una ribozima cabeza de martillo (véase Haseloff et al. patente US nº 5.245.678; Rossi et al., patente US nº 5.249.796), una ribozima en horquilla (véase Hampel et al., solicitud europea nº 89.117.424 presentada el 20 de septiembre de 1989), una ribozima de la hepatitis delta (Goldberg et al., solicitud internacional PCT nº WO 91/04319 y nº WO 91/04324, publicadas el 4 de abril de 1991), una ribozima ARNasa P (véase Altman et al., patente US nº 5.168.053), un intrón del grupo I (véase Cech et al. patente US nº 4.987.071), o un intrón del grupo II (véase Pyle, 1993).

En una forma de realización el compuesto preferido puede presentar la estructura (SEC. ID. nº: 1):

4

en la que cada X representa un nucleótido que es el mismo o diferente y puede ser modificado o sustituido en su azúcar, fosfato o base; en la que cada A, C, U y G representa un ribonucleótido que puede estar inalterado, modificado o sustituido en su azúcar, fosfato o base; en la que 3' -AAG....AGUCX-5' define la zona catalítica conservada; en la que cada (X)_{n}A y (X)_{n'} define los nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con la secuencia diana predeterminada en la secuencia de empaquetamiento del ARN virus; en la que cada * representa el emparejamiento de bases entre los nucleótidos situados en una de sus dos caras; en la que cada línea llena representa un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de las dos caras; en la que cada una de las líneas de puntos representa independientemente bien un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de sus dos caras o bien la ausencia de alguno de dichos enlaces químicos; en la que a representa un número entero que define un número de nucleótidos con la condición de que a puede ser 0 ó 1 y si es 0, la A situada en 5' de (X)_{a} está unida a la X situada en 3' de (X)_{a}; en la que cada m y m' representa un número entero que es mayor o igual a 1; en la que (X)_{b} representa un oligonucleótido y b representa un número entero que es mayor o
igual a 2.

Alternativamente, el compuesto puede presentar la estructura (SEC. ID nº: 2):

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5

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en la que 3'-AAG...AGUCX-5' define la zona catalítica conservada; en la que m representa un número entero del 2 al 20; y en la que ninguno de los nucleótidos (X)_{m} son bases de Watson-Crick emparejadas a algún otro nucleótido en el compuesto.

En otra forma de realización, el compuesto según la reivindicación 1 que presenta la estructura (SEC. ID nº: 3):

\vskip1.000000\baselineskip

6

en la que 3' (X)_{P4}...(X)_{P1}-5' define la zona catalítica conservada; en la que cada (X)_{F4} y (X)_{F3} define los nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con la secuencia diana predeterminada en la secuencia de empaquetamiento de un ARN virus; en la que cada línea llena representa un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de sus dos caras; en la que F3 representa un número entero que define el número de nucleótidos en el oligonucleótido con la condición de que F3 sea mayor o igual a 3; en la que F4 representa un número entero que define el número de nucleótidos en el oligonucleótido con la condición de que F4 esté comprendido entre 3 y 5; en la que cada (X)_{P1} y (X)_{P4} represente un oligonucleótido con una secuencia predeterminada que modo que los pares de bases (X)_{P4} con 3 a 6 bases de (X)_{P1}; en la que P1 representa un número entero que define el número de nucleótidos en el oligonucleótido con la condición de que P1 esté comprendido entre 3 y 6 y la suma de P1 y F4 sea igual a 9; en la que cada (X)_{P2} y (X)_{P3} representa un oligonucleótido con una secuencia predeterminada de modo que los pares de bases (X)_{P2} con al menos 3 bases de (X)_{P3}; en la que cada una de las líneas de puntos representa independientemente bien un enlace químico que proporciona enlaces covalentes entre los nucleótidos situados en una de sus dos caras o la ausencia de algunos de dichos enlaces químicos; y en la que (X)_{L2} representa un oligonucleótido que puede estar presente o ausente con la condición de que L2 representa un número entero que es mayor o igual a 3 si (X)_{L2} está presente.

En otra forma de realización, los nucleótidos cuyas secuencias definen una zona catalítica conservada proceden de la zona conservada del virus de la hepatitis delta. Alternativamente, los nucleótidos cuyas secuencias definen una zona catalítica conservada contienen la secuencia NCCA en su terminal 3'.

La invención se refiere asimismo a compuestos múltiples o ribozimas con zonas catalíticas conservadas que pueden ser iguales o diferentes dirigidos a secuencias diana predeterminadas que pueden ser iguales o diferentes. En esta forma de realización, un compuesto oligonucleotídico no natural sintético que comprende dos o más dominios que pueden ser iguales o diferentes en los que cada dominio comprende nucleótidos cuya secuencia define una zona catalítica conservada y nucleótidos cuya secuencia es capaz de hibridarse con una secuencia diana predeterminada en una secuencia de empaquetamiento de un virus con ARN. Los compuestos pueden asimismo estar unidos por enlaces covalentes a un compuesto de ácido nucleico de cadena complementaria capaz de hibridarse con una secuencia predeterminada, que puede ser igual o diferente del compuesto oligonucleotídico, con una secuencia de empaquetamiento del virus con ARN.

En una forma de realización preferida de este compuesto, los nucleótidos son capaces de hibridarse con las secuencias dianas 243, 274, 366 ó 553 en el MoMLV y la secuencia 749 en la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH. Los compuestos nucleótidos pueden comprender además por lo menos un compuesto oligonucleotídico no natural sintético adicional o una molécula de cadena complementaria unida por enlaces covalentes, dirigida a un gen diferente del genoma del virus con ARN. En el caso en el que el virus con ARN sea el VIH y la zona diferente del genoma del VIH se selecciona de entre el grupo constituido por la repetición terminal larga, la zona 5' no traducida, las secuencias de donante-receptor de corte y empalme, las secuencias de unión al cebador, la zona no traducida 3', la zona gag, pol, proteasa, integrasa, env, tat, rev, nef, vif, vpr, vpu, vpx o tev.

Preferentemente, el primer compuesto oligonucleotídico es capaz de hibridarse con las secuencias diana 243, 274, 366 ó 553 o la combinación de las mismas en el MoLV y la secuencia 749 en la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH y los nucleótidos del segundo compuesto adicional son capaces de hibridarse con las secuencias diana 5.792, 5.849, 5.886 ó 6.042 o la combinación de las mismas en la zona tat del VIH. Pueden encontrarse dianas adicionales en el genoma del VIH (Tabla III) (SEC. ID nº: 4-7), particularmente en la secuencia tat y en la zona de empaquetamiento psi (SF2 de VIH-1) 636 GUGGC GCCCG AACAG GGACG CGAAA GCGAA A GUA G AACCA GAGGA
G CUCU CUC GA CGCAG GACU C GGCUU GCUGA AGCGC GCACA GCAAG AGGCG AGGGG' CGGCG ACUGG UGA GU A CGCC AA UUU UU GA C UA GCG GAGG C UA GAA GGAGA GAGAG AUGGG UGCGA GAGCG 805, o Tabla III. Las secuencias de ribozima específicas utilizadas en la presente memoria son Rz-2, Rz-M y Rz-\psi. Las secuencias de ribozima Rz-2 anti-VIH (anti-tat individuales)

TTAGGATC CTGATGAGTCCGTGAGGCGGAA ACTGGCTC

Rz-M (anti-tat múltiple)

CCTAGGCT CTGATGAGTCCGTGAGGACGAA ACTTCCTGTTAGGATC CTGATGAGTCCGTGAGGACGAA AC
TGGCTCGCTATGTT CTGATGAGTCCGTGAGGACGAA ACACCCAA

Rz-\psi (anti-VIH\psi individual),

GTCAAAAATTGGCG CTGATGAGTCCGTGAGGACGAA ACTCACCAGTCGCCG.

La escisión del ARN de VIH por ribozimas es un método potencialmente útil. Terapéuticamente, presenta varias propiedades importantes:

i): especificidad,

ii): capacidad para dirigir un número relativamente grande de secuencias potenciales,

iii): falta de toxicidad para las células,

iv): ciclo metabólico de la molécula de ribozima,

v): variedad de métodos de administración aplicables y

vi): potencial para una variedad de métodos de producción: a) síntesis química (ya que es una molécula corta), b) producción bioquímica mediante transcripción in vitro y c) promotor dirigido a la producción in vivo de montajes integrados.

La presente invención utiliza la secuencia de antiempaquetamiento (Psi; ribozimas para inhibir la replicación del VIH. Esta actividad actuaría en los niveles A, E, F y G. Cortando en este punto puede presentar efectos inhibidores sobre: i) la introducción del virus en las células diana ii) la reducción del ARN vírico iii) la traducción del ARNm vírico en proteínas víricas y iv) el empaquetamiento del ARN genómico vírico en los viriones.

Secuencia de empaquetamiento Psi

La secuencia de empaquetamiento Psi es una secuencia genómica vírica de actuación en cis que es necesaria para la encapsidación específica del ARN vírico en viriones (Aronoff et al., 1991). Se ha demostrado que el empaquetamiento del ARN en partículas de virus presenta gran especificidad y ésta parece ser comunicada por la secuencia Psi. La posición de la secuencia de empaquetamiento Psi tanto para Mo-MLV como para VIH-1 fue identificada mediante eliminación operativa, esto es eliminando determinadas secuencias y observando si continuaba el proceso de empaquetamiento del ARN vírico. Se ha demostrado que la secuencia está en la zona 5' no traducida del retrovirus y que está ausente en los ARN que no están empaquetados. Desde el punto de vista de la presente invención, los solicitantes han deducido que, a fin de que el ARN se reconozca fácilmente como el que está empaquetado, la secuencia de empaquetamiento debe estar expuesta, accesible y capaz de ser reconocida. Los estudios tanto de Mo-MLV como de la señal de empaquetamiento del VIH han indicado que en cada caso existe una estructura secundaria estable conservada (Alford et al., 1992, y Harrison et al., 1992). Desde el punto de vista de los solicitantes estas propiedades han hecho que la secuencia de empaquetamiento Psi una diana atractiva para la acción de la ribozima. Un estudio que utiliza la cadena complementaria a la secuencia de empaquetamiento retrovírico ha demostrado anteriormente que la replicación del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV) puede estar inhibido en animales transgénicos por interferencia con la secuencia de Psi (Han et al., 1991).

Virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV) y virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1)

El Mo-MLV es un retrovirus natural murino que no transporta un oncogen (Fig. 3) (Teich et al., 1985). Produce leucemia en ratones con una latencia prolongada debido a la mutagénesis con inserción. Los solicitantes han utilizado Mo-MLV como una primera etapa para evaluar la demostración del principio para la eficacia de ribozimas antivíricas. El Mo-MLV es un retrovirus típico en el que la replicación continúa a lo largo de las líneas esbozadas en la Figura 1 y el empaquetamiento se efectúa mediante la secuencia de empaquetamiento Psi. En una forma de realización de la presente invención, se probó la capacidad de las ribozimas anti-Mo-MLV dirigidas a la secuencia de empaquetamiento Psi y clonadas en un vector de expresión para reducir la producción de virus en cultivos tisulares.

VIH-1, el principio activo en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) provoca la muerte celular en los linfocitos T (McCune, 1991; Levy, 1993). Estas células son contribuyentes vitales a la respuesta inmunitaria. En cualquier método anti-VIH potencial es esencial reducir o inhibir sustancialmente la replicación vírica antes de que el sistema inmunitario quede incapacitado debido a la pérdida de estas células. No existe actualmente ninguna curación eficaz para el SIDA. Sin embargo, al reducir el título vírico es de esperar que la evolución de la enfermedad disminuya o incluso pueda detenerse. El desarrollo de ribozimas con secuencia de empaquetamiento anti-VIH parece ser un método viable para inhibir sustancialmente o incluso detener la producción de virus.

Las ribozimas anti-VIH-gag se han desarrollado anteriormente, las cuales demostraron ser capaces de reducir los niveles de gag-ARN y p24 en las células que expresan la ribozima (Sarver et al., 1990). Se han desarrollado ribozimas cabeza de martillo para escindir el ARN de VIH-1 integrasa en E. coli para bloquear la traducción de la proteína integrasa (Sioud et al., 1991). Los estudios han demostrado asimismo que una ribozima que también escinde el ARN del VIH-1 en la zona U5, 5' no traducida del VIH o tat pueden proteger los linfocitos T del VIH-1 (Dropulic et al., 1992, Ojwang et al., 1992, Lo et al., 1992 y Weerasinghe et al., 1991).

En otra forma de realización preferida de la presente invención, las ribozimas anti-VIH se dirigieron a la secuencia de empaquetamiento Psi y se clonaron en el mismo vector de expresión como para el montaje anti-Mo-MLV. Estos montajes demostraron también sus capacidades para reducir la producción vírica en el cultivo tisular.

Liberación de montajes de expresión

Los medios principales mediante los cuales se introducen los montajes de expresión en las células diana son la transfección incluyendo la electroporación, la transferencia génica mediada por liposomas y mediada por retrovirus.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, "secuencia de empaquetamiento Psi" se refiere a una zona directamente proximal a la LTR 5' que está implicada en la encapsidación del ARN vírico en los viriones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "brazos complementarios" son las secuencias fijadas al ribozoma con núcleo de cabeza de martillo que permiten fijarse a una zona específica del ARN diana.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "ribozima" puede ser de cabeza de martillo, horquilla, hepatitis delta, ARNasa P, intrón del grupo I o intrón del grupo II, que sean capaces de escindir el ARN diana. La ribozima cabeza de martillo es el tema de la publicación de Haseloff y Gerlach (Haseloff et al., 1988) y de artículos posteriores por numerosos laboratorios.

Descripción

La invención se refiere al tratamiento de enfermedades víricas, especialmente el SIDA, en las que el agente patógeno tiene al ARN como su material genómico y este ARN está empaquetado en viriones. El método consiste en inhibir la replicación del virus destruyendo el ARN vírico en la secuencia de empaquetamiento Psi, la secuencia de reconocimiento necesaria para el empaquetamiento del ARN genómico vírico. El corte en esta secuencia presenta efectos inhibidores sobre: i) la introducción del virus en las células diana y, tras la integración del provirus en el genoma del huésped, ii) producción del ARN vírico, iii) la traducción del ARNm vírico en proteínas víricas y iv) el empaquetamiento del ARN genómico vírico en viriones.

En una forma de realización de la invención, se proporcionan determinados montajes de expresión, que comprenden secuencias de nucleótidos de interés. En un montaje de expresión preferido, se proporciona el montaje de expresión de la ribozima que, cuando se introduce en una célula, que puede ser una célula infectada por Mo-MLV o VIH-1, es capaz de dirigir la transcripción del ARN que, debido a los brazos complementarios que rodean la ribozima, puede fijarse al Mo-MLV o al ARN del VIH-1. Estos brazos complementarios son cortos y es la presencia de la secuencia de la ribozima la que actúa para cortar el ARN, interfiriendo de este modo con la acción de la molécula
de ARN.

La invención se ha demostrado de varias maneras. Una serie de experimentos demostró una correlación directa entre la escisión mediada por la ribozima de la secuencia de empaquetamiento Psi vírico del Mo-MLV in vitro y la supresión in vivo de la replicación de Mo-MLV. Existen tres etapas principales que se siguieron a fin de alcanzar esta conclusión:

i): Demostración de la escisión in vitro mediada por la ribozima.

ii): Transfección de los montajes que contienen las ribozimas en las células infectadas con Mo-MLV.

iii): Varios ensayos demuestran a) la integración de los montajes, b) la expresión del montaje de la ribozima, c) el efecto de la expresión del montaje de la ribozima sobre los niveles de replicación vírica.

Para VIH, se siguieron etapas similares:

i): diseño y construcción de montajes de ribozima,

ii): transfección de montajes que contienen ribozima en una línea celular de linfocitos T humana, iii) varios ensayos demuestran a) la integración de los montajes, b) la expresión del montaje de la ribozima, c) el efecto de la expresión del montaje de la ribozima sobre los niveles de replicación vírica.

La invención actúa como un supresor vírico tanto para i) inhibir la introducción vírica en una célula no infectada, cortando el ARN vírico a medida que se introduce en la célula diana como ii) para disminuir los niveles de virus operativo que salen de la célula infectada. En ambos casos, actúa cortando el ARN vírico, en el punto de entrada en el primer caso y en el punto de salida en el segundo. En el último caso, el corte disminuye los niveles de ARN cortando ambos ARN vírico y ARNm. El corte específicamente en la secuencia de empaquetamiento Psi sirve también para inhibir el empaquetamiento del ARN vírico.

Se emplearon varias consideraciones a fin de seleccionar una diana para la acción de la ribozima antivírica. Los criterios utilizados para la presente invención fueron:

i): La diana debe ser operativamente importante.

ii): Debe existir un grado elevado de conservación de la secuencia entre los diferentes aislados de VIH-1 en la zona diana.

iii): En el caso de las ribozimas cabeza de martillo, la secuencia diana de la ribozima tal como GUC o GUA esta presente preferentemente en la secuencia o en los tripletes GUU, CUC, etc. relacionados (Perriman, et al., 1992).

iv): La secuencia diana debería ser fácilmente accesible, por ejemplo debería faltar la estructura secundaria extensa (Rossi et al., 1992).

La secuencia de empaquetamiento Psi fijó los criterios anteriores y se seleccionó como diana para la escisión por ribozimas. Esta secuencia presenta: i) una función esencial en el ciclo de replicación retrovírico, ii) accesibilidad relativa, siendo una secuencia en el ARN que debe reconocerse y ser accesible a otros componentes para que tenga lugar el empaquetamiento, y iii) una naturaleza conservada entre las diferentes cepas del mismo virus.

Se ha observado que en diferentes cepas tanto de Mo-MLV como de VIH existe una fuerte conservación de la secuencia y de la estructura en la zona de empaquetamiento Psi de cada virus. Aunque no existe conservación aparente de la estructura o de la secuencia entre la secuencia de empaquetamiento de VIH y Mo-MLV, debido a la función idéntica de la secuencia Psi en cada virus, es razonable suponer que deben existir similitudes. Se examinó la estructura secundaria del ARN vírico y en la secuencia Psi se seleccionaron las secuencias que parecían que eran accesibles a la acción de la ribozima. Éstas existían en las zonas bucle, que son zonas con bases no emparejadas de una sola cadena del ARN. Se utilizó el programa FOLDRNA de Zuker para localizar las zonas con bases no emparejadas de la secuencia de empaquetamiento Psi. Se diseñaron ribozimas para dirigirse a estas secuencias. Las secuencias seleccionadas también presentaban una secuencia de bases GUC presente.

Los montajes utilizados en la presente invención empleaban ribozimas insertadas en la zona 3' no traducida del gen resistente a la neomicina (neo^{r}). El montaje básico se presenta en la Figura 4. Dicho montaje permitió la evaluación de la integración y de la expresión. Determinándose el anterior por análisis Southern, el último por resistencia celular a la toxicidad por G418 y mediante el ensayo de protección a la ARNasa. Una ventaja más del diseño empleado fue que el ARN híbrido con una pequeña secuencia de ribozima en el extremo 3' de un gen mensajero neo^{r} mayor parecía que actuaba para conservar las ribozimas estables en las células. Esto último es un punto sumamente importante ya que sin estabilidad el efecto de las ribozimas será mínimo.

Exposición

La invención proporciona las bases para un procedimiento mediante el cual las ribozimas podrían utilizarse para proteger a animales, incluyendo los seres humanos de las enfermedades producidas por retrovirus. El principio básico de la invención consiste en incorporar, en un gen mayor, ribozimas contra la secuencia de empaquetamiento del retrovirus diana. El gen portador puede ser seleccionable (como en el caso presente) o no seleccionable. La expresión de un gen portador mayor proporciona una molécula de ARN de la ribozima híbrida más estable. El montaje del ADN se transfiere a una población de células naturales para proteger las células o puede introducirse en una población de células infectadas por virus para reducir el título vírico. En una forma de realización adicional, el montaje de la expresión de la ribozima puede introducirse también mediante la transferencia génica mediada por retrovirus para aumentar la eficacia de la introducción. Una tercera forma de realización de la invención consiste en un retrovirus que transporta una ribozima con la secuencia de antiempaquetamiento. Si el vector retrovírico es un vector a base de MoMLV, entonces la ribozima dirigida a la secuencia de empaquetamiento del VIH no escindirá la secuencia de empaquetamiento del MoMLV debido a la divergencia de la secuencia para los dos retrovirus.

Terapéuticamente, la aplicación podría implicar la introducción a los montajes en linfocitos T ex vivo o en células madre hematopoyéticas ex vivo. Un método preferido consistiría en incorporar los montajes de ribozima en linfocitos o células madre humanas no embrionarias mediante un vector retrovírico tal como el Mo-MLV anfótropo. El precursor hematopoyético y las células madre no embrionarias humanas verdaderas, son dianas prometedoras para la terapia génica debido a que están presentes en la médula ósea o pueden movilizarse en la sangre periférica. Las células madre pueden dar lugar tanto a células mieloides como linfoides, células madre no embrionarias humanas verdaderas que dan lugar a células de todas las estirpes celulares. La terapia podría implicar la irradiación para destruir el sistema hematopoyético infectado por VIH y las células madre no embrionarias humanas que contienen la ribozima se inyectarían a continuación en el paciente. Como resultado las células del paciente se volverían resistentes al VIH.

La invención se refiere también a vectores de transferencia compuestos por ARN o ADN o a una combinación de los mismos que contiene una secuencia de nucleótidos que en la transcripción da lugar a los compuestos descritos anteriormente. El vector de transferencia puede ser la repetición terminal larga del VIH, un vector de transferencia asociado al adenovirus, un promotor SV40, Mo-MLV o un vector retrovírico anfótropo. El vector de transferencia puede comprender además una secuencia que se dirige al compuesto oligonucleotídico a una zona determinada dentro de la célula ex vivo. Ejemplos de localización en una zona determinada de una célula incluyen la utilización de la señal de empaquetamiento (Sullenger et al. 1993). La invención se refiere también a composiciones que contienen los compuestos o vectores de transferencia descritos anteriormente en un vehículo adecuado. El vehículo puede ser un vehículo o excipiente farmacéutica, veterinaria o agriculturalmente aceptable. La composición puede comprender además un señuelo TAR, poliTAR o un señuelo RRE.

Para la producción de secuencias de ADN de la presente invención en huéspedes procariótico o eucariótico, la secuencia promotora de la presente invención puede ser procariótica, eucariótica o vírica. Los promotores adecuados son inducibles, reprimibles o, más preferentemente, constitutivos. Ejemplos de promotores procarióticos adecuados comprenden los promotores capaces de reconocer las T4 polimerasas (Malik, S. et al., J. Molec. Biol. 195:471-480 (1987) Hu, M. et al., Gene 42:21-30 (1988). T3, Sp6 y T7 (Chamberlin, M. et al., Nature 228:227-231 (1970); Bailey, J. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80:2814-2818 (1983); Davanloo, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 81:2035-2039 (1984)); los promotores P_{R} y P_{L} del bacteriófago lambda (The Bacteriophage Lambda, Hershey, A. D., ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1973); Lambda II, Hendrix, R. W., ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)); los promotores trp, recA, del choque térmico y lacZ de E. coli; el promotor int del bacteriófago lambda; el promotor bla del gen de \beta-lactamasa de pBR322 y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa de pPR325, etc. Los promotores procarióticos son estudiados por Glick, B. R., (J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68:505-516 (1986)); Watson, J. D. et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-285 (1982)); el promotor TK de herpes virus (McKnight, S., Cell 31:355-365 (1982)); el promotor precoz SV40 (Benoist, C., et al., Nature (Londres) 290:304-310 (1981) y el promotor del gen gal4 de levadura (Johnston, S. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975 (1982), Silver, P. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951-5955 (1984)).

Para la preparación de los vectores destinados a su utilización en la inhibición de la infección retrovírica, en células eucarióticas sensibles o en animales completos, deben utilizarse promotores eucarióticos, como se describió anteriormente. Los promotores preferidos y los elementos reguladores adicionales, tales como las señales de poliadenilación, son aquellos que proporcionan la expresión máxima en el tipo de célula que infecta el retrovirus que debe inhibirse. Por lo tanto, por ejemplo, VIH-1, VIH-2, HTLV-1 y HTLV-2, así como el virus de la leucemia murina de Moloney, todos ellos infectan las células linfoides, y a fin de expresar de manera eficaz un montaje de ribozima solo o en combinación con un ARN complementario con cadena complementaria a la secuencia de empaquetamiento de uno (o más) de estos virus, una unidad de control de la transcripción (promotor y señal de poliadenilación) se seleccionan las cuales proporcionan la expresión eficaz en células (o tejidos) hematopoyéticos, particularmente linfoides. Tal como se ejemplificó anteriormente, los promotores preferidos son el promotor precoz inmediato al citomegalovirus (32), utilizado opcionalmente junto con las señales de poliadenilación (33) de la hormona del crecimiento y el promotor LTR de MuLV de Moloney, para su utilización con un retrovirus linfótropo. Una propiedad deseable del promotor LTR de MuLV de Moloney es la que presenta el mismo tropismo tisular que el retrovirus. El promotor CMV se expresa en linfocitos. Otros promotores incluyen los promotores VA1 y ARNt. El promotor de la metalotioneína presenta la ventaja de la induci-
bilidad. El promotor precoz SV40 presenta un nivel de expresión elevado in vitro en las células de la médula ósea.

La invención se refiere también a los métodos para la producción de compuestos que comprenden las etapas siguientes: (a) ligar en un vector de transferencia compuesto por ADN, ARN o una combinación de los mismos una secuencia de nucleótidos correspondiente al compuesto; (b) transcribir la secuencia de nucleótidos de la etapa (a) con una ARN polimerasa; y (c) recuperar el compuesto.

La invención también se refiere a células huésped procarióticas o eucarióticas que comprenden una secuencia de nucleótidos que está constituida por los compuestos descritos anteriormente o en la transcripción da lugar a los mismos. La célula puede ser una célula animal, una célula madre hematopoyética que dé lugar a las células madre, más maduras, y a las células completamente maduras de todas las estirpes celulares hematopoyéticas, una célula madre que de lugar a células maduras de todas las estirpes celulares hematopoyéticas, una célula madre comprometida que dé lugar a una estirpe hematopoyética específica, una célula madre de linfocitos T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T maduro, una célula madre mieloide o una célula monocito/macrófago.

La invención también se refiere a la utilización de los compuestos anteriores para proteger las células madre hematopoyéticas, las células madre, las células madre comprometidas, las células madre de linfocitos T, los linfocitos T inmaduros, los linfocitos T maduros, las células madre mieloides o las células monocito/macrófago. Además, la introducción ex vivo del vector de transferencia anterior en células hematopoyéticas que hace resistentes por esta razón a las células al VIH de manera que suprime/trata por esta razón o protege contra el VIH. Las células son células autólogas o heterólogas con o sin mieloablación. En una forma de realización de la presente invención, se diseñaron tres ribozimas cabeza de martillo individuales y una múltiple para dirigir a las diferentes secuencias en la secuencia de empaquetamiento Psi de Mo-MLV y se diseñó una ribozima para dirigir a una secuencia en la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH (véase la Figura 2). Se seleccionó Mo-MLV como un ejemplo de retrovirus en el que determinar los principios de actuación. Estos principios deberían aplicarse a otros retrovirus incluyendo el VIH. Se realizó también experimentación para VIH-1.

En la presente invención el animal no humano y su descendencia contienen por lo menos algunas células que expresan o conservan el compuesto oligonucleotídico no natural. El animal transgénico no humano del cual todas las células germinales isomáticas contienen el compuesto oligonucleotídico no natural en forma expresable en dicho animal, o un antecesor del mismo, en una etapa embrionaria tal como se describe en las patentes US nº 4.736.866, nº 5.175.383, nº 5.175.384 o nº 5.175.385. Véase también (Van Brunt, 1988; Hammer, 1985; Gordon et al., 1987; Pittius et al., 1988; Simons et al., 1987; Simons et al., 1988).

La invención comprende también un procedimiento para hacer resistentes las células a la infección vírica que comprende el tratamiento de las células ex vivo con el compuesto oligonucleotídico no natural descrito anteriormente. Además tal como se utiliza en la presente memoria los términos cadena complementaria y ribozimas también comprenden compuestos con nucleótidos, desoxinucleótidos, ácidos peptidonucleicos, etc. modificados. Estos deberían utilizarse para el tratamiento ex vivo o para el tratamiento tópico.

Una cantidad eficaz del compuesto oligonucleotídico no natural de la presente invención debería comprender generalmente una concentración entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 1 mM en una forma galénica, tal como una crema para aplicación tópica, una composición inyectable esterilizada u otra composición para administración parenteral. Con respecto de las formulaciones tópicas, es preferible generalmente emplear entre aproximadamente 50 \muM y aproximadamente 500 \muM de compuesto oligonucleotídico no natural. Los compuestos que comprenden derivados nucleotídicos, cuyos derivados pueden conllevar grupos clínicamente modificados, tales como derivados de fosforotioato o de fosfonato de metilo pueden ser activos en concentraciones nanomolares. Dichas concentraciones pueden emplearse asimismo para evitar la toxicidad.

Las estrategias terapéuticas que conllevan el tratamiento de la enfermedad que emplean compuestos de la presente invención son generalmente las mismas que las que conllevan métodos con cadena complementaria, tales como los descritos en la bibliografía de cadena complementaria de (Chrisley, 1991). Particularmente, las concentraciones de los compuestos utilizados, los métodos y modos de administración y las formulaciones involucradas pueden ser iguales a las empleadas para las aplicaciones de la cadena complementaria.

Una "cantidad eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la cantidad que proporciona un efecto deseado en un mamífero que presenta una enfermedad y un régimen de administración dados. Las composiciones que comprenden cantidades eficaces junto con los diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos adecuados son útiles para la terapia. Dichas composiciones son formulaciones líquidas, liofilizadas o si no anhidras e incluyen diluyentes de varios contenidos en tampón (p. ej., Tris-HCL, acetato fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a las superficies, detergentes (p. ej. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68 y sales de ácidos biliares), agentes solubilizantes (p. ej. Timerosal y alcohol bencílico), sustancias para esponjamiento o modificadores de tonicidad (p. ej. lactosa y manitol), enlace covalente de polímeros tales como polietilenglicol con el compuesto oligonucleotídico no natural, la formación de complejos con iones metálicos, o la incorporación del material en o sobre preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polivinilpirrolidona, etc. o en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, eritrocitos fantasmas o esferoblastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo del oligonucleótido. Opcionalmente pueden añadirse otros ingredientes tales como antioxidantes, p. ej., ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente diez restos), es decir, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina del suero, gelatina o inmunoglobulinas; aminoácidos; tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; agentes quelantes tal como EDTA; y alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol. Las composiciones de liberación lenta incluyen la formulación de sustancias lipófilas de liberación lenta (p. ej., ácidos grasos, ceras, aceites). Comprendidas también en la invención están las composiciones en partículas recubiertas de polímeros (p. ej., polioxámeros o polioxaminas) y el compuesto oligonucleotídico no natural acoplado a anticuerpos dirigidos contra receptores específicos del tejido, ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos para el
tejido.

Además, pueden añadirse secuencias nucleotídicas específicas para dirigirse al compuesto oligonucleotídico no natural de la presente invención al núcleo, plástido, citoplasma o a tipos específicos de células. Otras formas de realización de las composiciones de la invención incorporan recubrimientos protectores con formas en partículas, inhibidores de proteasa o potenciadores de penetración para varias vías de administración, incluyendo la parenteral, pulmonar, nasal y oral.

Las formulaciones tópicas adecuadas comprenden geles, cremas, soluciones, emulsiones, polímeros de carbohidratos, sus matrices biodegradables; vapores, nebulizaciones, aerosoles u otros inhaladores. El compuesto oligonucleotídico no natural puede estar encapsulado en una oblea, cera, película o vehículo sólido, incluyendo chicles. Los potenciadores de penetración para ligar en el transporte en el movimiento a través de la capa epitelial son también conocidos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, sulfóxido de dimetilo y glicoles.

Los derivados o modificaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos son bien conocidos en la materia y son compatibles con los sintetizadores de ADN disponibles en el mercado. (Véase Saenger, 1984, particularmente las páginas 159 a 200). Los nucleótidos comprenden una base, azúcar y un grupo monofosfato. Por consiguiente, los derivados, sustituciones o modificaciones de nucleótidos pueden realizarse en el nivel de la base, azúcar o mono-
fosfato.

En la naturaleza se encuentran numerosas bases modificadas y un intervalo amplio de bases modificadas se han producido por síntesis (Saenger, 1984; y CRC Handbook of Biochemistry). Las bases adecuadas incluirían la inosina, 5'-metilcitosina, 5'-bromouracilo, xantina, hipoxantina y otras de dichas bases. Por ejemplo, los grupos amino y los nitrógenos del anillo pueden estar alquilados, tal como la alquilación de los átomos de nitrógeno del anillo o de los átomos de carbono tales como N^{1} y N^{7} de la guanina y C^{5} de la citosina; la sustitución de los grupos ceto por tioceto; la saturación de los dobles enlaces carbono=carbono y la introducción de un enlace C-glucosilo en la pseudouridina. Ejemplos de derivados de tioceto son la 6-mercaptopurina y la 6-mercaptoguanina.

Las bases pueden estar sustituidas con varios grupos, tales como halógeno, hidroxi, amino, alquilo, azido, nitro, fenilo y similares. Las bases pueden estar sustituidas con otras especies químicas, tales como aminoácidos con cadena lateral o enlazadores que pueden o no incorporar otras entidades químicas, p. ej. grupos ácidos o básicos. Por ejemplo, la guanina (G_{3}) puede estar sustituida con tirosina y citosina (C1) o adenina (A11) igualmente sustituida con histidina.

El resto de azúcar del nucleótido puede también estar modificado según métodos bien conocidos en la técnica (Saenger, 1984). La presente invención comprende varias modificaciones al resto azúcar de los nucleótidos siempre que dichas modificaciones no anulen la actividad de escisión del compuesto. Ejemplos de azúcares modificados incluyen la sustitución de los grupos hidroxilo secundarios con halógeno, grupos amino o azido; 2'-metilación; variantes de la conformación tales como el O_{2}'-hidroxilo que está orientado en cis con respecto al enlace glucosilo C_{1}, enlace -N para proporcionar arabinonucleósidos, e isómeros conformacionales en el carbono C_{1}, para dar \alpha-nucleósidos y similares. Además, pueden utilizarse azúcares distintos de ribosa tales como las hexosas como por ejemplo glucosa, pentosas tal como arabinosa.

El resto fosfato de los nucleósidos está también sometido a modificación o modificaciones, que son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la sustitución del oxígeno con derivados de nitrógeno, azufre o carbono para dar respectivamente fosforamidatos, fosforotioatos, fosforoditioatos y fosfonatos. Las sustituciones de oxígeno con derivados de nitrógeno, azufre o carbono pueden realizarse en posiciones con puente o sin puente. Se ha demostrado bien en trabajos que implican oligonucleótidos de cadena complementaria que los derivados de fosfodiéster y fosforotioato pueden introducir células de forma eficaz (particularmente cuando sean de longitud corta), debido posiblemente a la asociación con un receptor celular. Los fosfonatos de metilo son probablemente absorbidos fácilmente por las células en virtud de su neutralidad eléctrica.

El resto fosfato puede sustituirse completamente con ácidos peptidonucleicos (véase Hanvey et al., 1992; Nielson, 1991; y Egholm, 1992). Otras sustituciones son bien conocidas por los expertos en la materia por ejemplo los puentes de siloxano, los puentes de carbonato, los puentes de acetamidato, los puentes de carbamato, los puentes de tioéter, etc. (Uhlmann y Peymann, 1990).

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención reivindicada. La presente invención se ilustra en los apartados de Detalle Experimental que siguen. Estos apartados se publican para ayudar a la comprensión de la invención.

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Ejemplo 1

Escisión de las secuencias de empaquetamiento Psi de Mo-MLV catalizada por ribozimas in vitro

Para demostrar que las secuencias diana eran realmente escindibles, se realizaron reacciones de escisión in vitro antes de las pruebas con ribozimas en cultivo celular.

Se seleccionaron cuatro secuencias en la zona de empaquetamiento de Mo-MLV de acuerdo con la presencia de bases GUC y la accesibilidad potencial de las secuencias en la estructura secundaria del ARN propuesta procedente del programa FOLDRNA de Zuker (Zuker et al., 1981). Las secuencias se denominaron 243, 274, 266 y 553, referidas a su distancia al nucleótido desde el extremo 5' del transcrito vírico (Fig. 2). Estas posiciones del nucleótido son las descritas en los virus tumorales del ARN (Coffir., 1985). Se diseñaron dos tipos de ribozima: tres ribozimas individuales dirigidas cada una a la secuencia 243, 274 y 366 con brazos de 12 nucleótidos de longitud y una ribozima múltiple dirigida a las cuatro secuencias con los brazos que intervienen de la longitud de las secuencias entre cada una de las secuencias diana. En la Figura 2 se presentan las secuencias y el diseño general.

Se construyeron ribozimas individuales clonando una inserción de doble cadena artificial con extremos salientes PstI y EcoRI en pGEM3Zf(+). Los plásmidos resultantes fueron pGEM243, pGEM274 y pGEM366. Se construyó la ribozima múltiple mediante una variación de los protocolos de mutagénesis estándar in vitro (Warrilow et al., 1992). Este plásmido se denominó pGEM-M7. La clonación lograda y la integridad de la secuencia se confirmaron mediante secuenciado del ADN.

La secuencia de empaquetamiento Psi, en el fragmento Bal I-Bal I del Mo-MLV procedente de pMLV-1 (Coffin, 1985) se clonó en el vector pGEM3Zf(+) y se transcribió como sustrato para la escisión de la ribozima in vitro. La mezcla de transcripción desarrollada (50 \mul) para generar ribozimas o sustratos contenía 1 \mug de plantilla de ADN tratada con proteinasa K linealizada, ditiotreitol 30 mM, cada uno de las NTPr 400 \muM, Tris-Cl 40 mM, pH 8,0, espermidina 2 mM, MgCl_{2} 6 mM, NaCl 50 mM, 1 \mul de [^{a-32}P]-UTP (400-800 Ci/mmoles, 10 mCi/ml), 1 unidad de ARNsin y 10 unidades de T7 o SP6 ARN polimerasa (Stratagene). Tras incubación a 37ºC, se añadieron 10 unidades de ADNasa (Promega) exentas de ARNasa, y se incubó la mezcla durante 15 min. a 37ºC. Tras la extracción con fenol-cloroformo, se precipitaron los transcritos del ARN añadiendo 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M y 2,5 volúmenes de etanol. Para las reacciones de escisión, la ribozima y el sustrato (relación molar 1:1) se preincubaron a 80ºC durante 2 minutos, seguido de 30 minutos de incubación a 37ºC en presencia de Tris-Cl 50 mM, pH 7,5 y MgCl_{2} 10 mM. Se interrumpieron las reacciones mediante la adición de un volumen igual de mezcla de terminación (urea 8 M, EDTA 50 mM, azul de bromofenol al 0,05% y xileno cianol al 0,05%) y se analizaron en un gel de poliacrilamida al 6% desnaturalizante que contenía urea 8 M, seguido de autorradiografía.

Las ribozimas modificadas genéticamente dirigidas a las diferentes secuencias de la secuencia de empaquetamiento provírico del Mo-MLV demostraron que escinden el ARN diana in vitro en las secuencias seleccionadas.

Para la mayoría de los montajes de ribozima, la incubación de un transcrito Psi marcado con ^{32}P con ARN de ribozima marcado con ^{32}P en una cantidad aproximadamente equimolar condujo a la escisión eficaz del sustrato en condiciones físicas suaves (37ºC, MgCl_{2} 10 mM y Tris-Cl 50 mM, pH 7,5). En la Figura 6 se presentan ejemplos representativos de estas digestiones. El tamaño de los fragmentos de Psi escindidos producidos por Rz274 y Rz366 eran coherentes con la posición de las secuencias previstas para la escisión, produciendo bandas de 62 nt más 473 nt y 154 nt más 381 nt respectivamente. La ribozima múltiple (Rz-M7) produjo cuatro fragmentos (50 nt, 92 nt, 187 nt y 240 nt) como se preveía así como varios fragmentos escindidos en parte (Figura 3). Para Rz243, no existía ninguna escisión visible a 37ºC ni escisión débil, dando fragmentos de tamaño apropiado a 50ºC (datos no mostrados). A excepción de la ribozima 243, estos resultados indicaban una escisión eficaz mediada por la ribozima específica para la secuencia.

Ejemplo 2

Montajes de la secuencia de empaquetamiento (Psi) de anti-Mo-MLV

Siguiendo la demostración de la escisión in vitro eficaz, se clonaron ribozimas modificadas genéticamente así como una secuencia de cadena complementaria complementaria con la zona de empaquetamiento Psi en una zona 3' no traducida del gen neo^{r} acoplada con el promotor precoz del virus 40 de simio (SV40) (Fig. 4). El gen neo^{r} es un gen procariótico que codifica una enzima que fosforila y, por esta razón inactiva la neomicina o el análogo G418 de neomicina. Este último es tóxico para las células de mamíferos y la expresión de un gen neo^{r} exógeno permite la supervivencia de las células. Este montaje con el promotor SV40 acoplado al gen neo^{r} está en un vector de expresión del mamífero, pSV2neo y se presenta en un diagrama en la Figura 4.

Las inserciones de la ribozima y una referencia de cadena complementaria se clonaron en una secuencia SmaI en la zona 3' no traducida de neo^{r} mediante ligadura con extremos truncados. Los vectores resultantes se denominaron pSV243, pSV274, pSV366, pSVM7 y pSVas Psi (montaje de cadena complementaria) respectivamente.

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Ejemplo 3

Transfección de montajes en las líneas celulares que producen 3T3-Mo-MLV

Se transfectaron varios montajes a base de pSV2neo en células 3T3-Mo-MLV utilizando un protocolo de transfección con fosfato cálcico (Chen et al., 1987). Las colonias positivas eran las que se formaban después de 9 a 12 días en presencia de 500 \mug/ml de G418. En cada montaje, se aislaron 4 a 7 colonias utilizando probetas de clonación. Estas colonias se cultivaron, se almacenaron en N_{2} líquido y a continuación se utilizaron para ensayos posteriores. Después de 10 a 14 días de selección en 500 \mug/ml de G418, se crearon varias líneas celulares clónicas estables para cada montaje. Para confirmar la integración de los montajes de expresión de ADN transfectados, se preparó ADN genómico de determinadas líneas celulares transfectadas y se realizó el análisis Southern. Se utilizaron enzimas de restricción HindIII y NruI para digerir el ADN genómico para generar un fragmento que contenía el gen neo^{r} más inserciones (ribozimas o cadena complementaria). A continuación pudo determinarse la presencia del montaje utilizando una sonda específica para neo^{r}. A partir del análisis Southern presentado en la Figura 7, es evidente que las células transfectadas tanto con ribozimas como con montajes de cadena complementaria y seleccionados en G418 contienen el gen neo^{r} más secuencias apropiadas de ribozima o de cadena complementaria. Se observó que el tamaño de los fragmentos HindIII-NruI que se hibridan con la sonda neo^{r} tenían el tamaño previsto en cada caso, es decir 1,3 kb para el gen neo^{r} solo, 1,38 kb para neo^{r} más la ribozima individual; 1,98 kb para neo^{r} más una ribozima múltiple; 1,89 kb para neo^{r} más la secuencia de la cadena complementaria.

Se predijo la expresión de los montajes de ribozima o de cadena complementaria debido a la resistencia a G418 en los transfectantes positivos. Esto se examinó más en las células transfectadas utilizando el ensayo de protección con ribonucleasa. Se extrajo ARN completo utilizando el procedimiento de tiocianato de guanidio de determinadas líneas celulares, se hibridaron a continuación 20 \mug de ARN completo con las ribosondas marcadas con ^{32}P correspondientes (5 \times 10^{4} cpm) en una solución que contiene formamida desionizada al 80%, citrato sódico 100 mM, pH 6,4, acetato sódico 300 mM, pH 6,4, EDTA 1 mM, seguido de la digestión con ARNasa de los ARN hibridazos (5 \mug/ml de ARNasa A y 10 unidades/ml de ARNasa T1). Si la ribozima no se expresaba, entonces la ribosonda complementaria sería incapaz de fijarse. El ARN permanecería entonces de una sola cadena y sería digerido completamente por la ARNasa. La mezcla de reacción se separaría a continuación por electroforesis. Como se muestra en la Figura 8, los ensayos pusieron de manifiesto que todas las ribozimas y los montajes de cadena complementaria se expresaban como era de esperar. Los fragmentos protegidos son ribozimas de 65 bp (ribozimas individuales); ribozimas múltiples de 588 bp y de 524 bp (de cadena complementaria).

Ejemplo 4

Capacidad de los montajes para suprimir la replicación de Mo-MLV

Después de la creación de las líneas celulares clónicas estables 3T3 Mo-MLV transfectadas con diferentes montajes, se empleó el ensayo en placa XC para evaluar el nivel de replicación del Mo-MLV. El ensayo en XC es un ensayo en placa de sincitio para Mo-MLV, que se basa en la observación de que las células que producen Mo-MLV pueden producir la fusión de las células XC. Se valoró Mo-MLV como se describe en (Gautsch et al., 1976) excepto que 8 \mug/ml de polibreno (Sigma) estaban presentes durante la infección para aumentar la fijación vírica a las células diana. Se añadieron sobrenadantes del cultivo de las diferentes líneas celulares que producen Mo-MLV a células NIH3T3 de ratón no infectadas con 8 \mug/ml de polibreno durante 1 h. antes de la infección. Después de 20 h. de incubación en medio de cultivo, las células NIH3T3 infectadas se cultivaron conjuntamente con células XC en una placa con cuadrícula 2 \times 2 mm^{2} durante 3 a 4 días. Las placas se fijaron a continuación con metanol, se tiñeron con azul de metileno al 1% más violeta de genciana al 0,1% y se exploraron las placas con sincitio por microscopía. Para asegurar que los ensayos se realizaban en la parte lineal de la curva de dosis-respuesta, se infectaron 3,5 \times 10^{5} células con diluciones al doble en serie del virus y se atenuaron 24 h. después en un cultivo mezclado con células XC. Los resultados en la Tabla 1 eran de tres experimentos independientes. Se observó del 74% al 77% de inhibición de la formación de placa de sincitio en las células que contenían Rz274, Rz366, Rz-M7 y As-Psi en relación con las células que contenían el vector pSV2neo, mientras que las células que contenían Rz243 no presentaron ninguna inhibición aparente. Estos datos son coherentes con los resultados de la escisión in vitro (Figura 6) en los que Rz243 no parecía escindir de manera eficaz el sustrato en las condiciones
utilizadas.

Estos efectos sorprendentes se confirmaron utilizando transferencia de manchas de ARN vírico en la que 1 ml de sobrenadante de un cultivo de 16 h. de las células que producen el virus NIH3T3 se clarificó por centrifugación (12.000 rpm, 10 min., 4ºC) en una microcentrifugadora. Se precipitó el ARN vírico en PEG 8000 al 8% y NaCl 0,5 M. Tras la extracción con fenol-cloroformo, se transfirió el ARN a una membrana de nilón cargada positivamente (Zeta-Probe, Bio-Rad) en una solución de transferencia alcalina (Reed et al., 1985).

Se realizó la hibridación a 42ºC toda la noche en formamida al 50%, 5 \times SSPE, 5 \times solución de Denhardt, SDS al 0,5%, 100 mg/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado y ribosonda marcada con ^{32}P transcrita procedente del promotor T7 del Psi de pGEM. Se cuantificó el ARN vírico por recuento por centelleo de las manchas. Se midió el ARN vírico en los sobrenadantes de la ribozima o de las células 3T3-Mo-MLV transfectadas con la cadena complementaria y se comparó con las del sobrenadante de las células 3T3-Mo-MLV transfectadas con pSV2neo. Como puede observarse en la Figura 9 y en la Tabla 2 (excepto para las células que expresan a Rz243), la cantidad de ARN vírico producido a partir de todas las líneas celulares que expresan ribozimas o la cadena complementaria se redujeron sustancialmente en cantidades similares a las observadas mediante el ensayo del sincitio.

Después de la transfección de estos montajes de ribozimas en las células infectadas con Mo-MLV, solamente las ribozimas que presentaban escisión in vitro eficaz presentaron la capacidad para suprimir (aproximadamente del 70 al 80%) la replicación de Mo-MLV in vivo. Estos resultados demuestran una correlación directa entre la escisión in vitro e in vivo de la supresión del virus mediada por ribozimas.

Los experimentos anteriores se convierten en bases para estudios posteriores de ribozimas diseñadas para dirigirse a las secuencias en la secuencia de empaquetamiento Psi del VIH a fin de reducir el título vírico.

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TABLA 1 Placas de sincitio producidas por Mo-MLV liberado de células transfectadas

Célula*	Placas de sincitio\ding{61}	Inhibición (%)
Rz243	32\pm12	-
Rz274	7\pm3	77
Rz366	8\pm1	74
Rz-M7	7\pm3	77
As-Psi	8\pm2	74
pSV2neo	31\pm1	0
* \begin{minipage}[t]{150mm} Dilución 10^{-2} del sobrenadante de las células que contienen el montaje Rz o As se utilizó en la infección de las células NIH3T3. \end{minipage}
\ding{61} \begin{minipage}[t]{150mm} El número es una media de los recuentos de las placas de dos líneas clónicas de cada montaje en tres experimentos independientes. Los números se presentan como media \pm desviación estándar. Las placas replicadas que reciben la misma dilución o las células infectadas generalmente contenían números similares de placas de sincitio. \end{minipage}

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TABLA 2 Grado de inhibición en transferencias de manchas de ARN vírico

Muestra	cpm \times 10^{-3}	Inhibición (%)
tARN	0,00	-
Rz243	2,59	21
Rz274	0,63	81
Rz366	1,36	59
Rz-M7	0,93	72
As-\psi	0,96	71
pSV2neo	3,30	0
* Los recuentos en cpm procedían de dos transferencias en la fila de dilución 1:1.
\begin{minipage}[t]{150mm} Se realizó el ensayo de transferencia de manchas del ARN vírico como se describe en Materiales y Métodos. Según la autorradiografía, los filtros correspondientes a cada mancha se escindieron para el recuento por centelleo líquido. \end{minipage}

Ejemplo 5

Montaje de la secuencia de empaquetamiento del anti-VIH.

Se seleccionó una secuencia GUA en la zona de empaquetamiento Psi del VIH-1 (VIHSF2, Levy, 1984) (nuc. 735 a nuc. 765 del extremo 5' del genoma del VIH) para direccionamiento de la ribozima. Como en los montajes anteriores, se clonó la inserción de la ribozima sintética en una secuencia Sma 1 y la zona 3' no traducida del gen neo^{r} del vector pSV2neo por ligadura con los extremos truncados. Se confirmaron la clonación con éxito y la integridad de la secuencia mediante secuenciado del ADN. Este montaje se denominó pSV-Rz-VIH-Psi. La Figura 4 presenta un diagrama del montaje.

Ejemplo 6

Transfección del montaje pSV-Rz-VIH-Psi en linfocitos T

El montaje de la secuencia de empaquetamiento del anti-VIH, pSV-Rz-VIH-Psi, se electroporó en células Sup T-1, una línea celular de linfoma T humano. Se recogieron células con crecimiento exponencial y se hizo el recuento del número de células viables por exclusión del colorante. Se lavaron las células con PBS y volvieron a poner en suspensión a una densidad de 1 \times 10^{7} células viables/ml en medio RPMI sin FCS pero conteniendo dextrosa 10 mM y ditiotreitol 0,1 mM. Se utilizaron 0,4 ml de la suspensión celular y 10 \mug del ADN del plásmido pSV-Rz-VIH-Psi por electroporación en cubetas de 0,4 cm (Bio-Rad). La célula y la mezcla de ADN se sometió a una única pulsación de 960 \muF, 200 V de un Gene Pulser (Bio-Rad). Tras la descarga, la cubeta se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente, y las células se transfirieron a continuación a 10 ml de medio RPMI con FCS al 10% y se colocaron en un incubador (CO_{2} al 5%, 37ºC). A las 48 horas tras la electroporación, se seleccionaron las células en medio enriquecido con 800 \mug/ml de G418. 9 a 12 días más tarde, se aislaron las colonias positivas y se cultivaron como aislados clónicos que debían utilizarse en un ensayo de protección del VIH.

Ejemplo 7

Evaluación de la capacidad de los montajes de expresión de la ribozima para comunicar protección contra la prueba de provocación del VIH

Se realizaron dos ensayos, formación del antígeno p24 y del sincitio, para evaluar la eficacia del montaje de la ribozima Psi del anti-VIH en cultivo celular. El ensayo del antígeno p24 del VIH-1 es un inmunoanálisis enzimático, que utiliza un anticuerpo monoclonal murino contra el antígeno del núcleo del VIH recubierto en tiras en el micropocillo. El análisis del sincitio del VIH-1 se basa en la observación de que el VIH-1 interactúa con los linfocitos T diana produciendo la fusión que da como resultado la formación del sincitio, células grandes que contienen muchos núcleos. Las células clónicas que expresan la ribozima-montaje, más las referencias, se infectaron con VIH-1 (SF2) a una m.o.i. comprendida entre 0,1 y 1. Después de 2 horas, se lavaron las células y se añadieron 10 ml de medio reciente. Cada 3 a 4 días, se hizo el recuento tanto del número de las células del sincitio como de las viables. Para la formación del sincitio, se necesitó aproximadamente una dosis superior a dos log a fin de presentar el mismo resultado que en la referencia que no incluía la ribozima (Tabla 3). Además, la presencia de la ribozima produjo un retardo en la formación del sincitio (Tabla 4).

En otro protocolo experimental, se sedimentaron las células y se tomó una alícuota del sobrenadante para el análisis de p24. En la Figura 10 se presentan los resultados representativos. En este experimento existió una inhibición de las concentraciones de p24 el día 22 después de la prueba de provocación. Los días 8 y 13 después de la infección, se observó más de un 60% de inhibición de la producción de p24 en las células que expresan la ribozima en comparación con las células que contienen vector solo, mientras que el día 22 se observó aproximadamente un 80% del nivel de inhibición.

Los resultados proporcionan pruebas de que la replicación del VIH puede inhibirse mediante la adición de una ribozima contra la secuencia de empaquetamiento Psi en linfocitos T.

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TABLA 3 Formación del sincitio

Clones	Dilución del virus*
	10^{-3}	10^{-4}	10^{-5}	10^{-6}
Rz-2	++++	+- - -	- - - -	- - - -
Rz-M	++++	- - - -	- - - -	- - - -
Rz-Psi	++++	++- -	+- - -	- - - -
Aleatorios	++++	++++	++- -	+- - -
pSV2neo	++++	++++	++++	++- -
* Se utilizó VIH-1 (SF33) en el análisis de infectividad (m.o.i. de 0,1-1).

TABLA 4 Formación del sincitio de las células SupT1 infectadas

Grupo	Días tras la infección
	6	7	8	9	10	11
pSV-Rz-VIH Psi	-	-	-	-	-	+
pSV2neo	-	+	++	+++	+++	+++
Simulación	-	-	-	-	-	-
\begin{minipage}[t]{145mm} Se hizo el recuento del número de sincitios en cada cultivo en cuatro campos de baja potencia y se promedió, -, sin sincitios; +, 1 a 5 sincitios, ++, 6 a 10 sincitios; +++, más de 10 sincitios. La simulación es con células SupT1 no infectadas. \end{minipage}

Ejemplo 8

Los solicitantes evaluaron asimismo la eficacia de los demás montajes de ribozima (además del dirigido a \psi). Inesperadamente, los solicitantes observaron que una sola ribozima dirigida a una secuencia en el gen tat de VIH-1 (Rz2) fue también eficaz en la inhibición de la replicación del VIH-1. Los solicitantes examinaron la conservación de la secuencia de esta zona de tat y descubrieron que estaba muy conservada entre las diferentes aislados de VIH-1 (véase la Figura 12). Estos son los primeros experimentos con esta secuencia tat como secuencia diana de la ribozima del VIH-1. Los informes en la bibliografía se indican en la Figura 13 en la que las secuencias diana tat indicadas fueron dirigidas por otros investigadores a la secuencia 1 (Crisell et al., 1993) y a la secuencia 3 (Lo et al., 1992 y Zhou et al., 1992).

Sumario

Se transdujeron linfocitos de la sangre periférica humana (PBL) con numerosos retrovirus recombinantes incluyendo RRz2, un virus a base de LNL6 con una ribozima dirigida al transcrito del gen tat del VIH insertado en la zona 3' del gen resistente a la neomicina (neo^{r}) RASH-5, un virus a base de LNHL que contiene una secuencia de cadena complementaria en la zona principal 5' del VIH-1 corriente abajo del promotor del citomegalovirus humano (HCMV) y R20TAR, un virus a base de LXSN con 20 copias en serie de la secuencia TAR del VIH-1 dirigidas por la repetición del terminal largo del virus de la leucemia murina de Moloney (LTR). Después de la selección de G418, se hizo una prueba de provocación de las PBL transducidas con la cepa IIIB de laboratorio del VIH-1 y un aislado clínico primario. Los resultados demostraron que las PBL de diferentes donantes podían transducirse y que esto comunicaba resistencia a la infección por VIH-1. Para cada uno de los montajes, se observó una reducción de aproximadamente el 70% en el nivel de antígeno p24 en comparación con las correspondientes PBL transducidas del vector de referencia. Los análisis moleculares presentaron la expresión constitutiva de todos los genes transducidos procedentes del LTR retrovírico, pero no se observó transcrito detectable procedente del promotor interno de HCMV para el montaje de cadena complementaria. La transducción de las PBL y la expresión del transgén consiguiente en las mismas no impactó sobre la expresión de la superficie de CD4*/CD8* (medidos por citometría de flujo) o sobre la proliferación celular (examinada mediante el análisis de absorción de [^{3}H]timidina). Estos resultados indican la utilidad potencial de estos agentes terapéuticos del gen anti-VIH-1 y presentan el valor preclínico de este sistema de análisis de PBL.

Se ha identificado el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) como el antígeno etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y está asociado a trastornos (Barre-Sinoussi, F. et al., 1983; Gallo, R. C. et al., 1984). Actualmente, no existe tratamiento adecuado para esta enfermedad y la utilización de la manipulación genética para inhibir la replicación del VIH parece ser un nuevo y prometedor método para la terapia del SIDA. Los métodos terapéuticos génicos posibles para intervenir en aspectos de la replicación del VIH-1 incluyen la utilización de la expresión de la ribozima para escindir catalíticamente y de este modo inactivar el ARN del VIH-1; la expresión del ARN de cadena complementaria para inhibir la transcripción inversa, el tratamiento y la traducción del ARN del VIH; la expresión de genes estructurales o reguladores del VIH mutante con actividad de represión dominante; y la expresión de señuelos de ARN para inhibir la transcripción del VIH-1, el tratamiento y el empaquetamiento.

En los informes publicados hasta la fecha, los vectores retrovíricos han sido el método de administración seleccionado para la introducción de transgenes y de agentes terapéuticos génicos anti-VIH-1. Estos vectores han sido probados en líneas celulares linfocíticas T hematopoyéticas humanas, tal como CEM, SupT1 y MOLT-4 (Sarver, N. et al., 1990; Weerashingee, M. et al., 1991; Yu, M. et al., 1993; Yamada, O. et al., 1994; Rhodes, A. y James W. 1991; Sczakiel, G. et al., 1992; Lisziewicz, J. et al., 1991, 1993; Trono, D. et al., 1989; Malim, M. H. et al., 1992) que presentan varias características deseables, incluyendo el crecimiento ilimitado potencial para ensayos in vitro, pero el inconveniente de ser células transformadas. Por consiguiente, es necesario probar la eficacia de agentes terapéuticos génicos anti-VIH en las células primarias humanas, tales como los linfocitos de la sangre periférica (PBL). Para estas células, la sobrepoblación de CD4^{-} es la célula diana clave para la infección por VIH y es esta población celular la que se elimina principalmente en los pacientes de SIDA. Sin embargo, actualmente no existen informes en los que se hayan utilizado análisis de PBL primarios para los métodos terapéuticos del gen de anti-VIH.

Los solicitantes han realizado un estudio comprensivo en las PBL humanas para i) probar los agentes anti-VIH, incluyendo ribozimas, cadena complementaria y señuelos TAR del ARN, y ii) crear las condiciones para la transducción de PBL, selección de G418 y prueba de provocación del VIH-1 utilizando aislados de VIH-1 tanto de laboratorio como clínicos. Estos experimentos demuestran que la transducción de las PBL primarias con montajes retrovíricos que expresan una ribozima dirigida al gen tat de VIH-1; una secuencia de cadena complementaria complementaria con la zona principal 5' de VIH 1; o un señuelo 20 TAR del ARN, comunicó resistencia sustancial a la infección por VIH-1. Este sistema analítico es una mejora sobre los análisis anteriores de montajes retrovíricos anti-VIH y sirve para complementar los presentes análisis de la línea de linfocitos T. Utilizando este sistema, los solicitantes han generado datos significativos de relevancia clínica para la terapia génica del VIH.

Materiales y métodos

Líneas celulares: Se cultivaron líneas celulares \psi2 de empaquetamiento (Mann, R. et al., 1983) y PA317 (ATCC CRL 9078) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) que contenían 10% de suero bovino fetal (FBS). Las células PA317 se sometieron a selección (5 a 7 días) cada seis semanas en medio HAT. Se cultivaron \psiCRE y \psiCRIP (Danos, O. y Mulligan, R. C. 1988) en DME más suero de ternero bovino al 10% (BCS).

Montajes de vector retrovírico: Una ribozima cabeza de martillo sintetizada químicamente dirigida al transcrito del gen tat del VIH-1 (nt 5865 a nt 5882 de VIH-1 IIIB, GGAGCCAGTAGATCCTA) se clonó en una secuencia SaII del vector LNL6 (Bender, M. A. et al., 1987) en la zona 3' no traducida del gen con resistencia a la neomicina (Fig. 15A). Este montaje se denominó RRz2. Para el montaje con cadena complementaria, un fragmento de BamHI de 550 bp del clon HXB2 que contiene parte de R, la porción U5 y 5' del gen gag (nt 78 a nt 628) se clonó en una orientación de la cadena complementaria en una secuencia de BamHI del vector LNHL (Fig. 15B) que procedía del vector pNHP-1 eliminando el ADNc de HPRT humano en la secuencia BamHI (Yee, J. K. et al., 1987). El montaje con cadena complementaria resultante se denominó RASH5. El montaje TAR polimérico se realizó insertando un fragmento 20TAR (20 copias en serie) en XhoI y BamHI en el vector LXSN (Miller, A. D. et al., 1989) y se denominó R20TAR (Fig. 15C). Se confirmaron la integridad de la secuencia y la orientación de los montajes por secuenciado del ADN o cartografía de la enzima de restricción.

Producción de retrovirus anfótropos: Se produjeron los retrovirus LNL6 y RRz2 por transinfección involucrando las líneas celulares \psi2 de empaquetamiento y las células PA317. Aproximadamente el 80% de células \psi2 confluentes se transfectaron con 10 \mug del ADN del montaje utilizando precipitación con calcio e incubando en medio DME que contenía FBS al 10% (medio de cultivo DME) durante 14 h. Este medio se eliminó a continuación, se sustituyó con medio de cultivo DME reciente y se incubó durante la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%. El sobrenadante vírico ecótropo se recogió a continuación de las células \psi2 transfectadas y se utilizó para infectar las células PA317 (60 a 80%) subconfluentes en medio de cultivo DME en presencia de 4 \mug/ml de polibreno. Después de 24 h. de incubación a 37ºC, CO_{2} al 5%, las células PA317 infectadas se trataron con tripsina y se dividieron 1:20 en medio de cultivo DME que contenía 750 \mug/ml de G418. El medio se cambió cada 3 a 4 días hasta que se formaron las colonias. Se cogieron 10 a 29 clones de cada uno de los montajes y se expandieron para análisis del título vírico (análisis de colonias resistentes a la neomicina) y de retrovirus competentes para replicación (RCR) (Miller, A. D. y Rosma, G. J. 1989). Se produjeron los retrovirus LNHL, RASH5, LXSN y R20TAR mediante transfección de \psiCRE e infectando las células \psiCRIP. Se aislaron 20 a 96 clones de cada montaje para elaboración y análisis de RCR.

Transducción de PBL humanas: Se prepararon células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) a partir de leucopaquetes de donantes sanos por centrifugación con gradiente Ficoll-Hypaque. Se enriquecieron las células CD4^{-} por eliminación de las células CD8^{-} utilizando un matraz MicroCELLector (Applied Immune Science) según las instrucciones del fabricante. Se estimularon las PBL enriquecidas con CD4^{+} (5 \times 10^{5} células/ml) utilizando 5 \mug/ml de fitohemaglutinina (PHA, Sigma) o 10 ng/ml de anticuerpo monoclonal OKT3 (Janssen-Cilag) en medio RPMI-1640 enriquecido con FBS al 10% y 20 unidades/ml de interleucina 2 recombinante humana (medio de cultivo RPMI) durante 48 a 72 h. Las PBL estimuladas se transdujeron por exposición de las células a una solución madre retrovírica exenta de células productoras durante 18 h. en presencia de 4 \mug/ml de polibreno (se empleó una m.o.i. de 0,5). Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se seleccionaron las PBL en medio de cultivo RPMI que contenía 300 a 500 \mug/ml de G418 durante 10 a 14 días. Esto fue seguido de un periodo de recuperación de una semana en medio de cultivo RPMI reciente sin G418 antes de que las PBL se sometieran a la prueba de provocación
con VIH-1

Infección por VIH-1: Se determinaron los títulos infecciosos (TCID50) de la cepa IIIB de laboratorio del VIH-1 y del aislado 82H clínica en las PBL humanas como se describe (Johnson, V. A. et al., 1990), 5/10^{5} PBL transducidas se infectaron con virus VIH de 100 TCID50 durante 2 h. a 37ºC seguido de lavado de las células dos veces con RPMI-1640 y volviendo a poner en suspensión las células en 5 ml de medio de cultivo RPMI. Cada 3 a 4 días, se tomaron muestras de alícuotas del sobrenadante para el ELISA del antígeno p24 (Coulter).

Análisis del ARN: Se extrajo ARN celular completo utilizando el método de isocianato de guanidio (Chirgwin,
J. J. et al., 1979) de las PBL transducidas. Se fraccionaron 15 \mug del ARN en un gel de agarosa-formaldehído al 1%, se transfirieron a una membrana de nilón (Hybond-N) y se hibridaron con sonda específica para neo^{r} marcada con ^{32}P,
fragmento BamHI de 550 bp de HXB2 de VIH-1 o fragmento 20 TAR para la detección de la expresión de neo^{r}-ribozima, de la cadena complementaria y de TAR respectivamente.

Análisis FACS de las PBL transducidas: Se incubaron 1 \times 10^{5} PBL transducidas durante 20 min. a 4ºC con anticuerpos monoclonales conjugados con isocianato de fluoresceína (FITC) específico para CD4 o CD8 (Becton Dickinson) o con un anticuerpo de referencia (IgG1 de ratón con FITC). Después de dos lavados en PBS, se analizaron las células en un FACScan de Becton Dickinson.

Análisis de proliferación: Se transdujeron las PBL como se describió anteriormente. Después de la selección en G418 y de la recuperación en medio de cultivo RPMI se evaluó la viabilidad mediante exclusión en azul de tripano y se ajustaron las cifras de las células a 1 \times 10^{6} células viables/ml. Se sembraron por triplicado en pocillos (placas Corning de 24 pocillos) con 1 \times 10^{6} células y se añadió 1 \muCi de 6-[^{3}H]-timidina (5 Ci/mmoles, Amersham) a cada pocillo. Después de 48 h. de cultivo, se transfirieron las células a filtros de fibra de vidrio al vacío, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo y se precipitaron con 3 \times 5 ml de ácido tricloroacético al 10% (p/v) enfriado en hielo. Se enjuagaron los filtros con etanol y se sometieron a recuento de centelleo de partículas \beta. Se realizó el análisis estadístico utilizando la prueba t de Student.

Resultados

Generación de retrovirus anfótropos de alto título que contienen varios transgenes. Se construyeron tres retrovirus diferentes que expresan los transgenes (ribozima, cadena complementaria o TAR polimérico) basándose en los diferentes ejes centrales del vector. Se construyó el RRz2 insertando un gen de la ribozima tat anti-VIH en la zona 3' no traducida del gen neo^{r} dirigido por la repetición terminal larga de MoMLV (LTR) en el vector LNL6 (Fig. 15A). Un transcrito del ARN híbrido que contiene ambos genes neo^{r} y de ribozima es de esperar de este retrovirus. En el retrovirus RASH5 (Fig. 15B), la secuencia de cadena complementaria pudo transcribirse a partir del LTR vírico o del promotor CMV humano interno. En el montaje R20TAR, el TAR polimérico se expresa en el LTR vírico (Fig. 15C). Los tres montajes retrovíricos y los correspondientes vectores de referencia se utilizaron para generar líneas celulares productoras anfótropas. Los títulos víricos estaban comprendidos en el intervalo entre 10^{5} y 5 \times 10^{6} cfu/ml, medidos mediante un protocolo estándar (Miller, A. D. y Rosma, G. J. et al., 1989). En general, en los experimentos de transducción se utilizaron los títulos retrovíricos >10^{6} cfu/ml. Todas las soluciones madre víricas se analizaron y se confirmó que estaban exentas de RCR y se almacenaron a -80ºC.

Transducción retrovírica de las PBL. Para optimizar la estimulación de las PBL para la transducción retrovírica, se compararon las respuestas de las PBL enriquecidas con CD4^{+} con el anticuerpo PHA o el OKT3. No se observó ninguna diferencia en los cultivos que utilizan PHA u OKT3 desde el punto de vista del periodo de duplicación celular, viabilidad y capacidad de transducción. En los presentes experimentos, se utilizó el anticuerpo OKT3 debido a que ha sido aprobado para su utilización en seres humanos. Las PBL estimuladas se transdujeron a continuación con los retrovirus anfótropos utilizando una m.o.i. de 0,5. La determinación de la eficacia de transducción relativa estaba basada en el número de células que sobreviven a la selección G418. Se observó que la eficacia de la transducción total varía desde el 2 al 7% dependiendo de los paquetes de sangre del donante.

La selección G418 de las PBL transducidas demostró que era una etapa crucial en los análisis de PBL. Para conseguir la selección completa, se empleó un procedimiento de dos etapas. Para cada lote de PBL, se montó un análisis de la dosis tóxica de G418 y simultáneamente, se aplicó una concentración de G418 de la línea de referencia de 300 \mug/ml a las PBL transducidas en los 7 a 9 días iniciales. Tras este periodo inicial, se ajustó la concentración de G418 a la determinada en el análisis de la dosis tóxica. Para los 10 donantes probados, se observó que la dosis tóxica de G418 estaba comprendida entre 300 y 500 \mug/ml utilizando una concentración de células inicial de 10^{5} células/ml. Después de la transducción y selección, las PBL se cultivaron a continuación en medio reciente sin G418 durante una semana. Esta etapa de recuperación es importante para aumentar la viabilidad celular y aumentar el número de células (un aumento de 3 a 5 veces se observó en relación con el apreciado con G418) para los ensayos de provocación de VIH-1 posteriores.

Expresión de los transgenes en las PBL transducidas. Se evaluó la expresión de la ribozima, cadena complementaria o de la secuencia TAR en las PBL transducidas. Las Figs. 16A a 16C presentan el modelo representativo de análisis Northern. En las células transducidas RRz2 y LNL6 (Fig. 16A), se detectaron tanto los transcritos de corte y empalme como sin corte ni empalme que contenían mensajes de neo^{r}-ribozima o de neo^{r} utilizando una sonda específica para neo^{r} (3,2 kb y 2,4 kb). La especie de ARN predominante fue el transcrito sin corte ni empalme. Al hibridar la transferencia con una sonda específica para la ribozima, se observó el mismo modelo para el ARN de RRz2 solamente. En las PBL transducidas con RASH5, se detectaron dos transcritos procedentes del 5' LTR (con y sin corte y empalme) utilizando la sonda de 550 bp y se confirmaron las dimensiones esperadas (4,8 kb y 4,0 kb) (Fig. 16B). Sin embargo, el transcrito más corto esperado procedente del promotor de CMV interno no se expresó, lo que indica que el promotor de CMV ha sido separado en este montaje. El vector R20TAR generó un transcrito de 4,6 kb sin corte ni empalme procedente del 5' LTR que se hibrida a la sonda TAR como era de esperar (Fig. 16C) debido a la inactivación del donante del corte y empalme en LXSN.

Inhibición de la replicación del VIH-1 en las PBL humanas. Para analizar la relevancia del sistema de análisis de PBL para el estudio de la terapia génica del VIH-1, se realizaron experimentos de provocación del VIH en las PBL transducidas utilizando tanto la cepa de laboratorio (IIIB) como un aislado clínico primario (82H). Se realizaron las infecciones por duplicado y se repitieron con tres a cinco lotes independientes de PBL. Se controló la replicación del VIH-1 en varios puntos de tiempo midiendo las concentraciones de antígenos p24 en el sobrenadante del cultivo. En los experimentos de provocación que utilizan la cepa IIIB del VIH-1, se redujo notablemente (70%) la producción de p24 en las PBL que expresan la ribozima (Fig. 17A), la cadena complementaria (Fig. 17B) y el señuelo TAR (Fig. 17C) en relación con las PBL transducidas con los vectores de referencia correspondientes. Se observó también la inhibición en menor grado (40% en comparación con el 70%) en las PBL transducidas, pero no seleccionadas. Se evaluó también la resistencia en las PBL transducidas y seleccionadas a la infección de un aislado primario de VIH-1. El aislado 82H clínico primario se extrajo directamente de las PBMC del paciente y se ha caracterizado como linfótropo T y aislado productor de sincitio. Como para la IIIB, la replicación de 82H (analizado por ELISA del antígeno p24) se inhibió a un nivel similar observado en las PBL infectadas con IIIB de VIH-1 (Fig. 18A a 18C). Estos resultados indican que estos transgenes administrados en las PBL humanas en todos los vectores retrovíricos pueden inhibir la replicación de VIH-1 en las células hematopoyéticas primarias.

Análisis de las PBL transducidas. Para investigar los efectos potenciales de la transducción y expresión del montaje sobre la proliferación de PBL, se realizaron ensayos de absorción con [^{3}H]-timidina en todas las PBL transformadas y seleccionadas. Al comparar con las PBL normales no transducidas no existían ningún efecto perjudicial obvio en el montaje del transgén y en las PBL transducidas por el vector (P <0,02); (Fig. 19). Además, el análisis por FACS puso de manifiesto que el marcador de la superficie CD4 permanecía inalterado después de la transducción (Tabla 5). Esto demostró que el efecto inhibidor observado en los ensayos de provocación con VIH-1 no era debido a una reducción en el número de receptores de CD4 en las PBL transducidas.

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TABLA 5 Marcadores de superficie de CD4/CD8 en las PBL medidos por análisis FACS

	Porcentaje de células (%)
Células*	CD4^{+}	CD8^{+}
PBL totales	83,80	8,40
PBL con CD4*	93,65	0,42
PBL con LNL6	93,01	1,19
PBL con RRz2	94,02	0,92
* \begin{minipage}[t]{150mm} Se analizaron las PBL como se describe en Materiales y Métodos. PBL totales = PBL totales no transducidas; PBL con CD^{4+} = PBL enriquecidas con CD4^{+} no transducidas; PBL con LNL6 = PBL enriquecidas con CD^{+} transducidas con virus LNL6; PBL con RRz2 = PBL enriquecidas con CD^{4+} transducidas con virus RRz2. \end{minipage}

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La Figura 20 presenta los resultados de la línea celular de linfocitos T CEM T4 transducida con virus y sometida a selección con G418. El conjunto de la población contenía células con integrantes aleatorios y niveles de expresión del montaje variables que se someten a la prueba de provocación con VIH-1.

Las Figuras 21A a 21B presentan los resultados de la ribozima múltiple, RzM, dirigida contra tat y RRzpsi/M, ribozima dirigida tanto contra la secuencia de empaquetamiento como contra tat.

Exposición

Para que la terapia génica que se utiliza finalmente inhiba la replicación de VIH-1 in vivo, dichos métodos terapéuticos génicos deben examinarse en primer lugar en sistemas experimentales. Hasta la fecha, estos sistemas experimentales han conllevado principalmente la utilización de líneas celulares de linfocitos T humanos y ningún dato publicado está disponible en las PBL primarias (Yu, M. et al. 1994). Para generar los datos preclínicos, es importante probar los agentes terapéuticos génicos anti-VIH-1 en células hematopoyéticas primarias. Estas células son los principales objetivos para la infección por VIH-1 y la replicación y existen diferencias significativas en las características del crecimiento, respuesta a la manipulación in vitro y reactividad a la infección por VIH-1 entre las líneas celulares y las PBL. Esta es la población de PBL con CD4^{+} de la terapia génica del VIH-1. Por estas razones, los solicitantes han realizado el presente estudio para crear un sistema de análisis con PBL.

En este estudio, se ha analizado la eficacia antivírica de tres vectores retrovíricos diferentes que expresan la ribozima, la cadena complementaria o los genes del señuelo TAR en las PBL humanas. Aunque se construyeron en diferentes vectores retrovíricos, todos han demostrado ser eficaces a un nivel similar en los ensayos de protección del VIH sin citotoxicidad aparente, medida por el análisis de incorporación de ^{3}H-timidina y el análisis FACS. Estas observaciones demuestran la viabilidad de las PBL como diana para la terapia génica con VIH-1.

Para utilizar las PBL como sistema de análisis o como células diana terapéuticas, deberían indicarse varios puntos. En primer lugar, el alto título vírico es un factor crucial para conseguir la transducción eficaz de las PBL. Este es especialmente el caso a título clínico en que puede no ser deseable seleccionar las PBL transducidas con G418. Los solicitantes probaron tanto las seleccionadas como las no seleccionadas. Las PBL que estaban transducidas con retrovirus terapéuticos de título elevado (>10^{6} cfu/ml). Se observó que las PBL no seleccionadas eran resistentes también a la infección por el VIH-1 aunque el grado de inhibición era inferior al observado en las PBL seleccionadas, lo que sugiere que es clínicamente posible utilizar las PBL transducidas ex vivo sin selección con G418. La selección con G418, sin embargo, puede permitir que se utilicen virus con título bajo para la experimentación in vitro de productos terapéuticos génicos. Los solicitantes han desarrollado un procedimiento de selección con G418 en dos etapas mediante el cual puede conseguirse fácilmente la selección completa. Estos procedimientos minimizan el tiempo de cultivo in vitro sirviendo de este modo para reducir cualquier modificación en la población de linfocitos T. En los experimentos de los solicitantes, el cultivo continuo de las PBL in vitro durante dos semanas no produjo un impacto significativo en los marcadores superficiales (CD4^{+} y CD8^{+}). La longitud del periodo (dos semanas) puede ser suficiente para cualquier manipulación ex vivo de las PBL con fines terapéuticos.

El diseño del vector retrovírico es otro aspecto importante para la transferencia y expresión eficaz del gen. Aunque no puede hacerse ninguna comparación directa entre los tres diseños del vector utilizados en este estudio, son de destacar dos observaciones. En primer lugar, todos los transgenes controlados por el LTR vírico (pero no del promotor interno CMV para un montaje) se expresaron de forma eficaz en una manera constitutiva en las células hematopoyéticas primarias humanas. En segundo lugar, la estrategia por la que un gen de ribozima se inserta en la zona 3' no traducida de un gen tal como neo^{r} en el vector retrovírico parece que es eficaz en las PBL como lo es en las líneas de linfocitos T. Estas observaciones pueden ser útiles para mejoras futuras en el diseño terapéutico génico. En conclusión, puede realizarse la transducción de las PBL primarias humanas y su protección en la infección ex vivo por VIH-1 utilizando los protocolos presentados en esta descripción. Esto no sólo proporcionará un sistema útil para la evaluación de los agentes terapéuticos génicos in vitro, sino que también forma la base para la terapia génica con VIH-1 dirigida a los linfocitos con CD4^{-}.

TABLA 6 Retrovirus animales

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: Virus relacionados con el SIDA (ARV)

: Virus de la eritroblastosis aviar

: Virus de la leucosis aviar (o virus de la leucosis linfoide)

: Virus de la mieloblastosis aviar

: Virus de la reticuloendoteliosis aviar

: Virus del sarcoma aviar

: Virus endógeno del mandril

: Virus de la leucemia bovina

: Lentivirus bovino

: Virus del sincitio bovino

: Virus de la encefalitis-artritis caprina (o virus de la leucoencefalitis caprina)

: Virus de la mielocitomatosis aviar

: Virus del sincitio del pollo

: Retrovirus de la serpiente del maíz

: Virus de la anemia infecciosa del pato

: Virus del riñón del ciervo

: Virus del fibrosarcoma dérmico equino

: Virus de la anemia infecciosa equina

TABLA 6 (continuación)

: Virus del sarcoma de Esh

: Virus de la inmunodeficiencia felina

: Virus de la leucemia felina

: Virus del sarcoma felino

: Virus que se forma en el sincitio felino

: Virus del sarcoma de Fujinami

: Virus de la leucemia del gibón (o virus del linfoma del simio o virus de la leucemia mielógena del simio)

: Virus del faisán dorado

: Virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1)

: Virus 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH-2)

: Virus 1 linfótropo T humano (HTLV-1)

: Virus 2 linfótropo T humano (HTLV-2)

: Virus 3 linfótropo T humano (HTLV-3)

: Virus de procesos linfoproliferativos

: Virus asociada a la mieloblastosis

: Virus de la mielocitomatosis

: Virus que produce el centro celular del visón

: Virus 13 de la mielocitomatosis

: Virus de la leucemia del visón

: Virus del tumor de mama de ratón

: Virus del mono de Mason-Pfizer

: Virus del sarcoma murino

: Virus de la leucemia mieloide

: Virus de la mielocitomatosis

: Virus de la neumonía evolutiva

: Virus de la leucemia de rata

: Virus del sarcoma de rata

: Virus 0 asociado al sarcoma de Rous

: Virus 60 asociado al sarcoma de Rous

: Virus 61 asociado al sarcoma de Rous

: Virus asociado a la reticuloendoteliosis

: Virus de la reticuloendoteliosis

: Virus transformante de la reticuloendoteliosis

TABLA 6 (continuación)

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: Virus del faisán de anillo en el cuello

: Virus del sarcoma de Rous

: Virus esponjoso del simio

: Virus de la inmunodeficiencia del simio

: Virus formador de foco en el bazo

: Virus del mono ardilla

: Virus de la necrosis del bazo

: Virus de adenomatosis/carcinoma pulmonar de la oveja

: Virus asociado al sarcoma del simio (o virus de la leucemia del mono lanudo)

: Virus del sarcoma del simio (o virus del mono lanudo)

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TABLA 7 Tabla de secuencias de empaquetamiento

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1. Virus de la reticuloendoteliosis (Rev)

Genoma: Wilhemsem, et al., J. Virol. 52:172-182 (1984), bases 1 a 3.149; Shimotohno, et al., Nature 265:550-554 (1980), bases 3.150 a 3.607. Secuencia de empaquetamiento (\psi): 144 bases entre la secuencia Kpn I en 0,676 kbp y 0,820 kbp en relación con el extremo 51 del provirus.

J. Embretson y H. Temin J. Virol. 61(9):2675-2683 (1987).

2. Tipo 1 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1)

Genome: Gallo et al., Science 224:500-503 (1984) Secuencia de empaquetamiento (\psi): 19 pares de bases entre la 5' LTR y el codón de iniciación del gen gag. A. Lever, J. Virol. 63(9) 4085-4087 (1989).

3. Virus de la leucemia de Moloney (Mo-MuLV)

Genome: Shinnick, et al., Nature 293:543-548 (1981), Secuencia de empaquetamiento (\psi): 350 nucleótidos entre la secuencia de corte y empalme y la secuencia AUG para la secuencia de codificación de la proteína gag. R. Mann, R. Mulligan y D. Baltimore, Cell 33:153-159 (1983). Segunda secuencia de empaquetamiento (\psi+): Solamente en la mitad 5' de la zona U5. J. Murphy y S. Goff, J. Virol. 63(1):319-327 (1989).

4. Virus del sarcoma aviar (ASV)

Genome: Neckameyer y Wang J. Virol. 53:879-884 (1985). Secuencia de empaquetamiento (\psi): 150 pares de bases entre las bases 300 y 600 del extremo izquierdo (gag-pol) del provirus. P. Shank y M. Linial, J. Virol. 36(2):450-456 (1980).

5. Virus del sarcoma de Rous (RSV)

Genome: Schwartz et al., Cell 32:853-869 (1983). Secuencia de empaquetamiento (\psi):230 pares de bases desde la base 120 (comienzo de la secuencia PB) hasta la base 22 antes del codón de terminación gag. S. Hawai y T. Koyama (1984), J. Virol. 51:147-153.

6. Virus de la leucosis bovina (BLV)

Genome: Couez, et al., J. Virol. 49:615-620 (1984), bases 1 a 341; Rice et al., Virology 142:357-377 (1985), bases 1 a 4.680; Sagata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:577-681 (1985), provirus de BLV completo. Secuencia de empaquetamiento (\psi): los presentes inventores predicen que está situada entre el final de la secuencia de fijación del cebador en aproximadamente la base 340 y el codón de iniciación para gag en aproximadamente las bases 41 a 8.

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Claims

1. Compuesto oligonucleotídico que comprende una ribozima dirigida a la secuencia diana GUA en el nucleótido 5849 del aislado SF-2 del VIH-1 o a una secuencia diana correspondiente de otros aislados del VIH-1, en el que dicho compuesto es:

-: una única ribozima, o

-: una ribozima múltiple dirigida a diferentes secuencias en tat.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que la ribozima es una ribozima cabeza de martillo.

3. Compuesto según la reivindicación 1, que está codificado por un montaje que comprende la secuencia:

TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC,

en la que cada T, G, A y C representa un nucleótido.

4. Compuesto según la reivindicación 1, que está codificado por un montaje que comprende la secuencia:

en la que cada T, G, A y C representa un nucleótido.

5. Compuesto según la reivindicación 1, que está codificado por un montaje que comprende además la secuencia:

GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG,

en la que cada T, G, A y C representa un nucleótido.

6. Compuesto según la reivindicación 1, en el que las diferentes secuencias diana en tat están en el nucleótido 5792, 5886 ó 6042 del aislado SF-2 del VIH-1 o de las secuencias diana correspondientes de otros aislados de
VIH-1.

7. Vector de transferencia compuesto de ARN, ADN o una combinación de los mismos que en la transcripción da lugar al compuesto según la reivindicación 1.

8. Vector de transferencia según la reivindicación 7, que contiene un promotor eucariótico que permite la expresión del compuesto en un tipo de célula eucariótica que puede ser infectada por el VIH.

9. Vector de transferencia según la reivindicación 8, en el que el promotor es un promotor SV40.

10. Célula que comprende una secuencia nucleotídica que es, o en la transcripción da lugar a, un compuesto que comprende una ribozima dirigida a la secuencia diana GUA en el nucleótido 5849 del aislado SF-2 del VIH-1 o una secuencia diana correspondiente de otros aislados del VIH-1.

11. Célula según la reivindicación 10, en la que el compuesto es un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Célula según la reivindicación 10, en la que la ribozima es capaz de inhibir la replicación del VIH-1 en células hematopoyéticas primarias humanas.

13. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la secuencia de nucleótidos es una parte del constructo del vector de transferencia.

14. Célula según la reivindicación 13, en la que el vector de transferencia es un vector de transferencia asociado a un adenovirus, Mo-MLV, o un vector retrovírico anfótropo.

15. Célula según la reivindicación 13, en la que el vector de transferencia es un vector retrovírico.

16. Célula según la reivindicación 15, en la que la secuencia de nucleótidos está situada en la zona 3' no traducida de un gen con resistencia a la neomicina del vector de transferencia retrovírico.

17. Célula según la reivindicación 16, en la que el vector de transferencia procede del vector LNL6.

\newpage

18. Célula según la reivindicación 10, en la que la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia:

TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC,

en la que cada T, G, A y C representa un nucleótido.

19. Célula según la reivindicación 10, en la que la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia:

en la que cada T, G, A y C representa un nucleótido.

20. Célula según la reivindicación 10, en la que la secuencia de nucleótidos comprende además la secuencia:

GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG,

en la que cada T, G, A y C representa un nucleótido.

21. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20, en la que la célula es una célula madre hematopoyética, una célula madre, una célula madre comprometida, una célula madre de linfocitos T, un linfocito T inmaduro, un linfocito T maduro, una célula madre mieloide o una célula monocito/macrófago.

22. Célula según la reivindicación 21, en la que la célula es una célula madre.

23. Célula según la reivindicación 21, en la que la célula es un linfocito T.

24. Célula según la reivindicación 21, en la que la célula es una célula hematopoyética primaria humana.

25. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24, en la que la célula es resistente a la infección por VIH.

26. Célula humana resistente a la infección por VIH, que comprende un vector vírico que produce un compuesto de ARN que comprende nucleótidos cuya secuencia define una zona catalítica que cataliza la escisión del ARN y nucleótidos cuya secuencia define brazos complementarios que permiten fijarse a la secuencia nucleotídica: 5' TGGAGCCAGTAGATCCTAAT 3', en la que el compuesto del ARN inhibe la replicación del VIH-1 en la célula humana, haciendo de este modo la célula humana resistente a la infección por VIH.

27. Composición farmacéutica que contiene el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un vector de transferencia según la reivindicación 7, 8 ó 9, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.