CN1267552C - 以反转录病毒包装序列为靶的核酶的表达构建体及含有所述构建体的重组反转录病毒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，该化合物含有其序列定义了一个保守催化区的核苷酸和其序列能够与RNA病毒包装序列内预定的靶序列杂交的核苷酸。优选的，病毒包装序列是反转录病毒包装序列，或是HIV-1Psi包装序列。RNA病毒可以是HIV-1，猫白血病病毒，猫免疫缺损病毒或表I中所列病毒之一。保守催化区可以得自锤头核酶，发夹核酶，肝炎δ核酶，RNAase P核酶，I组内含子，II组内含子。本发明还涉及以RNA病毒为靶的多核酶，含有或不含有反义链的核酶组合物和含有反义链和polyTAR，RRE或TAR引诱物的核酶组合物。本发明还描述了载体。此外，还描述了体内和间接体内的治疗方法和使用方法。

Description

以反转录病毒包装序列为靶的核酶的表达构建体 及含有所述构建体的重组反转录病毒

本申请是美国系列申请No.08/178082(1994年1月5日申请)的继续部分。在本申请中，各文献的作者和年代在括号内。所有的参考文献按字母顺序列在实验部分的后面。这些文献以其全部的公开内容引入本文作为参考，以便更完整地描述本发明所涉及的现有技术。

本发明的背景：

反转录病毒

反转录病毒是以RNA为其基因组物质的病毒。它们稳定地将其基因组RNA的cDNA拷贝整合到宿主基因组中，这样利用宿主细胞进行其复制(Miller，1992，和Brown，1987)。病毒基因组由在病毒的原病毒cDNA形式两个末端(5’和3’)的长末端重复片段(LTR)组成。从5’到3’，LTR由经一称为R的短序列相连的U3和U5组成。转录在5’LTR内开始，在3’LTR内在多聚腺苷酸位点终止。与LTR相邻的是经反转录酶引发正负DNA链合成所必需的短序列。剪接供体和受体序列均在基因组内，而且这些序列涉及亚基因组RNA的生产。直接接近5’LTR的是对于将病毒RNA包被到病毒粒子中所必需的序列。将其称为Psi包装序列。它是确保病毒RNA包装的必要和特异性的信号序列。病毒RNA的主体由分别编码核心蛋白(gag)，整合酶，蛋白酶和反转录酶(pol)及被膜蛋白(env)的gag，pol和env复制基因组成。

反转录病毒感染细胞是从病毒糖蛋白与细胞受体(A)的相互作用开始的(见附图1)。在吸附和脱壳后，病毒RNA进入靶细胞，然后在反转录酶(病毒粒子中所携带的酶)的作用下，反转录成cDNA。cDNA采用环状形式(C)，转变成双链cDNA，然后通过整合酶(D)的作用整合到宿主细胞的基因组DNA中。整合后，原病毒cDNA从5’LTR内的启动子(E)开始转录。转录出的RNA要么作为mRNA并翻译产生病毒蛋白质(F)，要么作为新的病毒RNA保留。所述的病毒RNA含有对于其包装成病毒粒子(G)所必需的Psi包装序列。一旦产生出病毒粒子，通过从质膜中长出芽状物而从细胞中释放出来。总之，反转录病毒不会引起宿主细胞的溶解；但HIV例外。原病毒cDNA仍稳定地整合在宿主基因组中，而且随宿主DNA的复制而复制，以致于子代细胞也遗传了原病毒。潜在的抗病毒剂可以以这些复制控制点中的任何一个为靶。

人免疫缺损病毒(HIV)

HIV属于反转录病毒，其复制与上述过程大体相同。HIV进入到细胞(包括T淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞)中，主要是受HIVgp120被膜蛋白与靶细胞表面的CD4受体的相互作用的影响。gp120的氨基酸序列在不同的患者(或甚至同一患者)中可以有高度的可变性，从而给疫苗生产带来困难(Brown，1987，和Peterlin etal.，988)。这种可变性表明与疾病的进展有关。HIV的主要特征是i)(象慢病毒组的其他成员一样)有一个潜伏期，其中原病毒在整合到宿主细胞基因组中后，可以进入休眠状态，和ii)它给T淋巴细胞靶细胞带来细胞病。在带有原病毒的细胞被激活后，HIV开始复制。细胞活化和伴随病毒复制的刺激因素至今尚未清楚地鉴定出(Brown，1987和Peterlin et al.，1988)。象所有的反转录病毒一样，gag，，pol和env基因产物被翻译成结构和酶蛋白。对于HIV来说，还有其他的调节基因。具体地说，tat和rev基因产物被翻译成调节蛋白，然后作为转录增强子来诱导高水平的基因表达。Nef是另一个调节病毒复制水平的调节基因(Jones，1989，Greene，1990，和Epstein，1991)。

HIV复制水平在活化和正在增殖的细胞中最高；细胞活化引起核转录和细胞增强子因子与HIV LTR相结合导致转录水平提高。与所有的反转录病毒一样，包装区(Psi)是位于HIV基因组中的顺式作用的RNA序列，对基因组RNA的包被是必需的。掺入gag蛋白，pol酶和病毒RNA之核心的形成是在HIV复制周期的晚期。所述的核心得到一个膜，然后通过细胞膜长出芽状物而脱离细胞(Peterlin etal.，1988，Jones，K.A.，1989，Greene，1990和Epstein，1991)。

迄今为止，已经研究了许多抑制HIV复制的试剂。在附图1中列出了以复制阶段为靶的特定试剂的说明。

(A)病毒对靶细胞的吸附

已经使用了可溶性CD4以便占据高比例的病毒受体，从而使病毒不能与细胞膜结合。但是，到目前为止，还未发现这是一种成功的治疗策略(Stevenson et al.，1992)。已经表明硫酸化的多糖具有可能通过阻断细胞-病毒融合来抑制HIV感染的能力(McClure et a1.，1992)。针对HIV本身，宿主细胞受体或HIV被膜决定簇的抗体，以及CD4结合的外毒素(Stevenson et a.l.，1992)是阻止病毒进入细胞的其他的可能的方法。

(B)通过反转录酶产生cDNA

已经发现化学物质例如叠氮基胸苷三磷酸(AZT)体外抑制反转录酶。目前常规地将AZT施用于AID患者和当其接受骨髓移植时，后者是为了保护正常骨髓免于残留的HIV的感染(Miller，1992)。

(C)cDNA从胞质中易位到核中

可能可以阻断cDNA跨越核孔易位或核运输的本身，但目前为止还未成功地做到这点。

(D)cDNA整合到宿主基因组中

可能还可以阻断原病毒cDNA整合到宿主细胞基因组中(Stevenson et al.，1992)。迄今为止，没有候选化合物被证明是有效的。

(E)原病毒转录

已知5，6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑干扰转录延长(Stevenson et al.，1992)。通过结合tat蛋白质，由此抑制其激活HIV的能力，有意义TAR类似物也可以影响转录(Miller，1992和Sullenger et al.，1990)。

(F)HIV mRNA的翻译

反义RNA通过与病毒RNA的结合，可以抑制病毒复制(Sczakielet al.，1992)。与mRNA结合可以抑制翻译；与新生病毒RNA结合也可以抑制将RNA生产性包装成病毒粒子。

(G)病毒的包装和成熟病毒粒子的产生

蛋白酶诱导HIV多聚蛋白的特异性裂解。这种活性对于产生成熟的感染性病毒粒子是必需的。已经发现数种化合物，例如α，α-二氟酮抑制用V蛋白酶，而且已经表明在组织培养中有一定程度的抗病毒活性。但是大多数蛋白酶抑制剂只有短的血清半衰期、迅速的胆汁清除率和不佳的口服利用率(Debouck，1992)。

核酶(Ribozyme)

核酶是裂解RNA并有更新的酶解性RNA。在有些类型的核酶中，通过加入互补序列臂，它们可以与特异性的靶RNA配对并在RNA磷酸二酯骨架上的特异性位点诱导裂解(Haseloff et al.，1988；Rossi et al.，19992；Hampel，1990；Ojwang，1992)。锤头核酶是小而简单的，而且在掺入到各种侧翼序列的基序中时，仍能保持位点特异性裂解(Haseloff et al.，1988；Rossi et al.，1992)。这些特征使其能特别好地适用于基因抑制。

发明概述：

本发明涉及合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，含有其序列定义了一个保守催化区的核苷酸和其序列能够与RNA病毒包装序列内预定的靶序列杂交的核苷酸。优选的，病毒包装序列是反转录病毒包装序列，而且在一个实施方案中，是HIV-1 Psi包装序列。RNA病毒可以是HIV-1，猫白血病病毒，猫免疫缺损病毒或表6中所列的病毒之一。保守催化区可以得自锤头核酶，发夹核酶，肝炎δ核酶，RNAase P核酶，I组内含子，II组内含子。本发明还涉及多核酶，核酶的组合物和抗RNA病毒的反义链，而且所述的组合物还包括polyTAR，RRE或TAR引诱物。还描述了含有或不含有反义链和poly TAR，RRE或TAR引诱物的载体或核酶。此外，还描述了体内和间接体内(ex vivo)的治疗方法和使用方法。

附图的简要描述：

图1：典型反转录病毒的复制循环。

(A)病毒与靶细胞上的细胞表面受体结合，然后，在融合和病毒脱壳后，基因组RNA进入靶细胞。

(B)进行反转录，病毒RNA反转录成cDNA。

(C)cDNA进入核，并转变成环状形式。

(D)cDNA整合到宿主细胞基因组。

(E)原病毒转录以产生病毒RNA和mRNA。

(F)翻译产生病毒蛋白质。

(G)从病毒编码的蛋白质和被包装的病毒RNA形成病毒核心。

(H)核心获得膜，然后通过透细胞膜发芽而从细胞中出来。

图2：在Mo-MLV Psi包装区中的核酶靶位点。

Mo-MLV5’区代表pMLV-1(在本文中定义的)的BalI/BalI片段(nt 212-nt 747)。箭头指示的是核酶靶位点，所有核酶靶位点都是GUC残基。

图3：莫洛尼氏小鼠白血病病毒的基因组

MoMLV的基因组由复制基因gag，pol和env以及5’和3’的长末端重复(LTR)序列组成。Psi包装位点对于将病毒RNA包装成病毒粒子中是必需的。

图4：抗Mo-MLV和抗HIV包装位点构建体。

标准表达构建体是以pSV2neo为基础的，由neo^r基因上游的SV40启动子和一个设计的核酶或与插入到neo^r的Sma I位点的Psi包装序列互补的反义序列(抗Psi)组成。

图5：以HIV包装位点为靶。

本附图是带有核酶9的HIV基因组的简图，所述核酶9以Psi包装位点内的序列为靶。

图6：用核酶体外裂解体外产生的Mo-MLV包装区RNA。

道1是用HinfI消化的pBR322标记DNA。道2是约550kb的底物。道3、5、7和9分别是体外产生的Rz243，Rz274，Rz366和Rz-M7。下列核酶被加到靶底物RNA中：道4，Rz243；道6，Rz274；道8，Rz366；道10，Rz-M7。在将样品在10mMTris·Cl，pH7.5中于80℃加热2分钟后，在37℃，10mM MgCl₂，50mM Tris·Cl，pH7.5中30分钟完成裂解反应。

图7：核酶或反义构建体转染的细胞系的DNA的Southern杂交。

分别用不同构建体：道1：pSV243；道2：pSV274；道3：pSV366；道4：pSV-M7；道5：pSVAs-Psi；和道6：pSV2neo转染3T3-Mo-MLV细胞，用HindIII/NruI消化来自所述细胞的基因组DNA(10μg)，在0.6％琼脂糖凝胶上分离，印迹到硝酸纤维素滤纸上，然后与³²P-标记的neo^r基因探针杂交。箭头表明neo^r基因本身(1.34kb)和neo^r基因加一个核酶(1.38kb)，加多Rz(1.98kb)或加反义链(1.89kb)的预期大小。

图8：为研究核酶/反义构建体表达而进行的RNase保护分析。

用³²P-标记的核糖探针分析一系列转染细胞的20μg总RNA有关核酶或反义构建体表达的情况。道1，用HinfI消化的末端标记的分子量标记物pBR322的DNA片段；道2，与酵母RNA杂交的RzM7的核糖探针，然后用RNase消化；道3，与酵母RNA杂交的RzM7的核糖探针，然后未用RNase消化；道4-8，分别与来自pSV243，pSV274，pSV366，pSV-M7和pSVAs-Psi转染之细胞的RNA杂交的RzM7的核糖探针，然后用RNase消化；道9-13，分别是RzM7，Rz243，Rz274，Rz366和As-Psi的核糖探针。在检测中使用对Mo-MLV有最好抑制水平的各构建体的克隆。图9：来自不同的3T3细胞(产生Mo-MLV)的病毒RNA点印迹的放射自显影。

用与前文所述的Mo-MLV Psi包装区互补的³²P-标记的核糖探针检测以1∶1，1∶5和1∶10稀释的病毒RNA制品。道1，酵母RNA；道2-7，来自用pSV243，pSV274，pSV366，pSV-M7，pSVAs Psi和pSVneo转染的3T3-Mo-MLV细胞上清的RNA。可以看出通过核酶在体外有效地裂解RNA靶分子以及通过反义序列，降低了病毒RNA的水平。

图10：在长期检测中的p24水平

该直方图表示了按在8、13和22天核酶9(Rz-9)的p24水平测量的HIV复制数据，核酶构建体的靶为HIV包装位点。载体是对照构建体。Rz-2和Rz-M是两种以HIV的tat基因为靶的核酶构建体。Rz-M是含有以tat内的不同位点为靶的几种核酶的多核酶。这包括被Rz-2攻击的位点。

图11：根据从Genebank(LOCUS：HIVSF2CG)分离的HIV-1 SF2的序列资料设计抗HIV-1 tat核酶。靶位点是GUC(Rz 1)，GUA(Rz2)，GUC(Rz 3)和CUC(Rz 4)。

图12：Tat保守序列。

图13：不同tat靶序列的比较。

图14：用Rz2(a，d，f)表明保护作用的转染的克隆T细胞系(Sup T1)。克隆细胞系含有载体(pSV2 neo neo-a)和随机对照(Rana，b，c，d，e，f)。

图15A-15C：图示反转录病毒载体构建体及其表达(未画出比例)。15A，核酶构建体RRz2；15B，反义构建体RASH5；15C，聚合物-TAR构建体S20TAR。括号中注明了亲本反转录病毒。参见文章中的详细描述。

图16A-16C：反转录病毒构建体在转导的PBL中的表达。用相应的³²P-标记的探针经Northern分析检测核酶(图16A)、反义序列(图16B)和20TAR RNA(图16C)的表达。参见说明书中的详细描述。

图17A-17C：HIV-1 IIIB在转导的PBL中复制的抑制。按材料和方法部分的描述攻击和检测转导的和筛选的PBL。表明的数据是五个供体(图17A，核酶构建体和图17B，反义构建体)和两个供体(图17C，聚合物-TAR构建体)的平均值。

图18A-18C：转导的PBL对临床分离物82H感染的抗性。按材料和方法部分的描述，用核酶构建体(图18A)，反义构建体(图18)和聚合物-TAR构建体(图18C)转导PBL，用82H感染。所列的数据是两个供体的平均值。

图19：转导的PBL的增殖实验。所列的数据为平均值±SD(n＝3)。仅PBL，未转导的PBL；带有相应的反转录病毒的LXSN，R-20TAR，LNHL，RASH-5，LNL6和RRz2，转导的PBL。

图20：用病毒转导CEM T4 T淋巴细胞系，然后经G418筛选。收集的群体含有带随机整合体和不同构建体表达水平的细胞，该细胞随后将用HIV-1进行攻击。

图21A-21B：RzM是针对tat的多核酶，RRzpsi/M是同时针对包装序列/抗tat的多核酶的核酶。

本发明的详细描述：

本发明涉及合成的非天然存在的寡核苷酸化合物，含有其序列定义了一个保守催化区的核苷酸和其序列能够与RNA病毒包装序列内预定的靶序列杂交的核苷酸。优选的，病毒包装序列是反转录病毒包装序列，而且在一个实施方案中，是HIV-1 Psi包装序列。RNA病毒可以是HIV-1，猫白血病病毒，猫免疫缺损病毒或表6-7中所列在病毒之一。保守的催化区可以得自锤头核酶(见Haseloff et al.，美国专利5,245,678；Rossi et al.，美国专利5,249,796)，发夹核酶(见Hampel et al.，欧洲申请89 117 424，1989年9月20日申请)，肝炎δ核酶(Goldberg et al，PCT国际申请WO 91/04319和WO 91/04324，1991年4月4日公开)，RNAaseP核酶(见Altman et al.，美国专利5,168,053)，I组内含子(见Cech et al.，美国专利4,987,071)，或II组内含子(见Pyle，1993)。

在一个实施方案中，本发明的化合物可以具有下列结构(SEQID NO：1)：

其中X代表相同或不同的并且可以是在其糖、磷酸或碱基上有修饰或取代的核苷酸；各A，C，U和G代表在其糖，磷酸或碱基上可以没有修饰或有修饰或取代的核糖核苷酸；3’-AAG…AGUCX-5’指保守的催化区；各(X)_nA和(X)_n指其序列能够与在RNA病毒包装序列内的预定靶序列杂交的核苷酸；各*代表位于核苷酸任一侧的核苷酸之间的碱基配对；每条实线代表在位于核苷酸任一侧的核苷酸之间的提供共价键的化学键；虚线各自独立地代表在位于核苷酸任一侧的核苷酸之间提供共价键的化学键或者没有任何所述的化学键；a代表表示核苷酸数的一个整数，前提是a可以是0或1，而且如果是0，则位于(X)_n5’的A与(X)_n3’的X键合；各m和m’代表大于或等于1的整数；(X)_b代表寡核苷酸，b代表大于或等于2的整数。

另外，化合物可以具有下列结构(SEQ ID NO：2)：

其中3’-AAG…AGUCX-5’指保守的催化区；m代表2-20的整数；其中(X)_m中没有核苷酸与所述化合物内的任何其它核苷酸Watson-Crick碱基配对。

在另一实施方案中，权利要求1的化合物具有下列结构式(SEQ IDNO：3)：

其中3’(X)_P4…(X)_P1-5’指保守的催化区；(X)_F4和(X)_F3指其序列能够与在RNA病毒包装序列内的预定靶序列杂交的核苷酸；每条实线代表在位于核苷酸任一侧的核苷酸之间的提供共价键的化学键；F3代表定义寡核苷酸中核苷酸数的整数，条件是F3大于或等于3；F4代表定义寡核苷酸中核苷酸数的整数，条件是F4为3-5；各(X)_P1和(X)_P4分别代表含有预定序列的寡核苷酸以便(X)_P4与(X)_P1的3-6个碱基能够碱基配对；P1代表定义寡核苷酸中的核苷酸数的整数，条件是P1是3-6，P1与F4的总和等于9；(X)_P2和(X)_P3各代表有预定序列的寡核苷酸，以致(X)_P2与(X)_P3的至少3个碱基配对；各虚线各自独立地代表在位于核苷酸任一侧的核苷酸之间提供共价键的化学键或者没有任何所述的化学键；其中(X)_L2代表可以存在或不存在的寡核苷酸，条件是如果(X)_L2存在，L2代表大于或等于3的整数。

在另一实施方案中，其序列定义一保守催化区的核苷酸是来自肝炎δ病毒的保守区。另外，其序列定义一保守催化区的核苷酸在其3’末端含序列NCCA。

本发明还涉及带有相同或不同保守催化区的多化合物或多核酶，所述保守催化区以相同或不同的预定靶序列为靶目标。在该实施方案中，合成的非天然存在的寡核苷酸化合物含有两个或多个相同或不同的区域，其中各区域含有其序列定义一保守催化区的核苷酸以及其序列能够与RNA病毒包装序列内的预定靶序列杂交的核苷酸。所述化合物还可以与反义核酸化合物共价相连，所述反义核酸化合物可以是与所述寡核苷酸化合物相同或不同，而且能够与RNA病毒包装序列内的预定序列杂交。

在一优选的实施方案中，核苷酸能够与MoMLV中的243，274，366或553靶序列以及在HIV Psi包装位点内的位点749杂交。所述寡核苷酸化合物还含有至少一个共价相连的，以RNA病毒基因组的不同基因为靶的另一合成的非天然产生的寡核苷酸化合物或反义分子。在RNA病毒是HIV的情况下，HIV基因组的不同区域可以选自长末端重复序列，5’非翻译区，剪接供体-受体位点，引物结合位点，3’非翻译区，gag，pol，蛋白酶，整合酶，env，tat，rev，nef，vif，vpr，vpu，vpx或tev区。

优选的，第一个寡核苷酸化合物能够与MoLV中的243，274，366或553靶位点或其结合物以及HIV Psi包装位点中的位点749杂交，而第二个化合物的核苷酸能够与HIV tat区中的5792，5849，5886或6042靶位点或其结合物杂交。在HIV基因组中可以发现其他靶目标(表III)(SEQ ID NO：4-7)，特别是在tat序列和psi包装区(HIV-1 SF2)636 GUGGC GCCCG AACAG GGACGCGAAA GCGAA A GUAG AACCA GAGGA G CUCU CUCGACGCAG GA CUC GG CUU GCUGA AGCGC GCACA GCAAGAGGCG AGGGG CGGCG ACUGG UGA GU ACGCC AAUUUUUGA C UAGCG GAGG C UAGAA GGAGA GAGAG AUGGGUGCGA GAGCG 805内，或表III。这里所用的特异性核酶序列是Rz-2，，Rz-M和Rz-ψ。抗HIV核酶序列Rz-2(单个抗-tat)TTAGGATC CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCRz-M(多个抗tat序列)CCTAGGCT CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATC CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTT CTGA TGAGTCCGTGAGGACGAAACACCCAARz-ψ(单个抗HIV-ψ序列)GTCAAAAATTGGCG CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG。

用核酶裂解HIV RNA是一种很有潜力的有用的方法。在治疗学上，它有几个重要的特征：

i)特异性，

ii)以相对大量的潜在位点为靶的能力，

iii)对细胞没有毒性，

iv)核酶分子的转换，

v)可应用的传递方法的变化性和

vi)潜在的不同生产方法：a)化学合成(当其为短分子时)，b)借助体外转录的生物化学方法生产和c)从整合的构建体用启动子驱动体内生产。

本发明利用抗包装位点(Psi)核酶以抑制HIV复制。该活性作用水平为A，E，F和G。在所述位点的切割可以对以下过程产生抑制作用：i)病毒进入靶细胞ii)产生病毒RNA iii)病毒mRNA翻译成病毒蛋白质和iv)病毒基因组RNA包装成病毒粒子。

PSI包装序列

Psi包装序列是对于病毒RNA特异性包装成病毒粒子所必需的顺式作用病毒基因组序列(Aronoff et al.，1991)。已经标明RNA包装成病毒颗粒有高度特异性，而且这种特异性似乎是由Psi位点产生的。Mo-MLV和HIV-1 Psi包装位点的定位都是通过功能缺失来鉴定的，即除去特定的序列，然后观察病毒RNA的包装过程是否会继续。已经标明，所述序列在反转录病毒的5’非翻译区内，而且在未被包装的RNA内没有该序列。根据本发明，我们推断为了使RNA像被包装的RNA那样容易识别，包装序列就必须是暴露的，可接近的，而且是能够识别的。对Mo-MLV和HIV-1Psi包装信号的研究表明，在每种情况下都有一个保守的稳定的二级结构(Alford et al.，1992和Harreson et al.，1992)。根据我们的观点，这些特征使得Psi包装位点成为有吸引力的核酶作用靶位点。以前用反转录病毒包装序列的反义序列进行的研究表明：在转基因动物中，通过用Psi序列干扰可以抑制莫洛尼氏鼠白血病病毒(mo-MLV)的复制(Han et al.，1992)。

莫洛尼氏鼠白血病病毒(Mo-MLV)和人免疫缺损病毒(HIV-1)

Mo-MLV是一种不携带癌基因的鼠野生型反转录病毒(Teich etal.，1985)。由于插入性诱变而可导致小鼠患潜伏期长的白血病。我们用Mo-MLV作为用于评价抗病毒核酶效率之方法的证据的第一步。Mo-MLV是典型的反转录病毒，其中复制过程沿图1所示的线路进行，而且经Psi包装位点的包装是有效的。在本发明的一个实施方案中，在组织培养中检测抗Mo-MLV核酶降低病毒产生的能力，所述的抗-Mo-MLV核酶以Psi包装位点为靶并被克隆在一表达载体中。

HIV-1，在获得性免疫缺损综合症(AIDS)中的活性组分在T淋巴细胞中会导致细胞死亡(McCune，1991；Levy，1993)。这些细胞是引起免疫反应的重要因素。在任何潜在的抗HIV方法中，它对于在免疫系统因损失了这些细胞而导致损伤之前实质性地降低或抑制病毒复制是必不可少的。目前还没有有效治愈AIDS的方法。但是，通过降低病毒滴度，期望可以减缓疾病的进程，而且可能甚至使其得到抑制。抗HIV-包装序列核酶的研制看起来是实质性地抑制或甚至中止病毒产生的有效方法。

以前对抗HIV gag核酶的研究表明，其能够在表达核酶的细胞中降低gag-RNA和p24的水平(Sarver et al.，1990)。已经研究了锤头核酶以使其在大肠杆菌中裂解HIV-1整合酶，从而阻断整合酶蛋白质的翻译(Sioud et al.，1991)。研究已经表明在HIV的U5，5’非翻译区或tat裂解HIV-1 RNA的核酶能够保护T细胞免于HIV-1的攻击(Dropulic et al.，1992，Ojwang et al.，1992，Lo et al.，1992，和Weerasinghe et al.，1991)。

在本发明的另一优选实施方案中，抗HIV核酶以Psi包装位点为靶，而且与抗Mo-MLV构建体一样被克隆在同一表达载体中。同样在组织培养中检测这些构建体降低病毒产生的能力。

表达构建体的传递

将表达构建体导入靶细胞的主要方法是包括电穿孔，脂质体介导的和反转录病毒介导的基因转移的转染方法。

定义

如本文所用的“Psi包装位点”指与病毒RNA包被成病毒粒子有关的，直接邻接5’LTR的区域。

如本文所用的“互补臂”是附着于核心锤头核酶的序列，所述序列可以与靶RNA的特定区域结合。

如本文所用的“核酶”可以是能够裂解靶RNA的锤头、发夹、肝炎δ、RNase P、I组内含子或II组内含子。锤头核酶是Haseloff和Gerlach(Haseloff et al.，1988)的文献以及随后许多实验室文章的主题。

描述

本发明涉及病毒性疾病，特别是AIDS的治疗，在所述的疾病中致病因子以RNA为其基因组物质，而且将所述RNA包装到病毒粒子中。所述方法通过破坏在Psi包装位点的病毒RNA，包装病毒基因组RNA所必需的识别序列来抑制病毒的复制。在所述位点的切割有下列抑制作用：i)病毒进入靶细胞以及随后的原病毒整合到宿主基因组中，ii)病毒RNA的产生，iii)病毒mRNA翻译成病毒蛋白质和iv)病毒基因组RNA包装成病毒粒子。

在本发明的一个实施方案中，提供含有所需核苷酸序列的特定表达构建体。在优选的表达构建体中，提供了核酸表达构建体，当核酶表达构建体被导入到细胞(可以是Mo-MLV或HIV-1感染的细胞)中后，所述的核酶表达构建体由于核酶周围的互补臂，而可以指导能够与Mo-MLV或HIV-1RNA结合的RNA的转录。这些互补臂较短，存在于切割RNA的核酶序列中，由此干扰RNA分子的作用。

已经以数种方法实验了本发明。一组实验表明核酶介导的体外Mo-MLV病毒Psi包装序列的裂解与体内Mo-MLV复制的抑制有直接的关系。为得出该结论用了下列三个主要步骤：

i)说明核酶介导的体外裂解。

ii)含所述核酶的构建体转染到Mo-MLV感染的细胞。

iii)用各种检测来表明a)构建体的整合，b)核酶构建体表达，c)核酶构建体对病毒复制水平的影响。

对于HIV，相似的步骤如下：

i)设计并构建核酶构建体。

ii)将含核酶的构建体转染到人T淋巴细胞系中。

iii)用各种检测来表明a)构建体的整合，b)核酶构建体的表达，

c)核酶构建体对病毒复制水平的影响。

本发明作为病毒抑制剂以i)通过在病毒进入靶细胞时切去病毒RNA来抑制病毒进入未感染的细胞，以及ii)降低受感染细胞排出的功能病毒的水平。在两种情况下，它都可以切割病毒RNA，第一种情况下是在进入点，在第二种情况下是在排出点。在后一种情况下，切割病毒和mRNA均会降低RNA水平。在Psi包装位点的特异性切割也会抑制病毒RNA的包装。

为了选择抗病毒核酶作用的靶位置，使用了几个标准。本发明所用的标准如下：

i)靶位置必须是有重要功能的。ii)在不同HIV-1分离物靶区域中，必须有高度的序列保守性。iii)如果是锤头核酶，核酶靶序列(如GUC或GUA)优选的是存在于所述序列或有关的三联体GUU，CUC等之中。(Perriman，et al.，1992)iv)靶序列应该是容易接近的，例如它应该没有大范围的二级结构(Rossi et al.，1992)。

Psi包装位点符合上述标准，因此将其选为核酶裂解的靶，该位点有：i)在反转录病毒复制循环中有必不可少的功能，ii)相对的易接近性，作为RNA上的位点，它必须要能够被识别并且易于其他组分接近以便进行包装，和iii)相同病毒不同毒株之间的保守性。

已经观察到在Mo-MLV和HIV的不同毒株中，在各病毒的Psi包装区中，在序列和结构上有强的保守性。而在HIV和Mo-MLV包装位点之间的结构或序列方面，没有明显的保守性，由于在各病毒中的Psi位点有相同的功能，有理由推测必须有相似性。检测病毒RNA的二级结构，选择核酶作用时易于接近的Psi序列上的位点。它们位于环区，即RNA的单链未配对的碱基区。用Zuker的FOLDRNA程序确定Psi包装序列非碱基配对的区域。设计以这些位点为靶的核酶。所选的位点还有GUC碱基序列。

本发明所用的构建体应用了插入到新霉素抗性基因(neo^r)的3’非翻译区的核酶。基本构建体如图4所示。所述构建体可以对整合和表达进行评价。用Southern分析确定前者，用对G418毒性的细胞抗性和RNase保护性测定确定后者。所使用的设计的其他优点在于在较大neo^r基因信使的3’末端带有小核酶序列的嵌合RNA可以使核酶稳定地保持在细胞内。后一点是极为重要的，因为没有稳定性，核酶的作用就会最小。

讨论

本发明提供了一种方法的基础，所述的方法利用核酶保护动物，包括人，免于由反转录病毒引起的疾病。本发明的基本原理是在较大的基因内掺入针对反转录病毒包装位点的核酶。载体基因可以是选择性(如本发明所用的)或非选择性的。较大载体基因的表达提供了更稳定的嵌合核酶RNA分子。将DNA构建体转染到天然细胞群体中以保护所述细胞或者将其导入到病毒感染的细胞群体中以降低病毒滴度。在另一个实施方案中，可以借助反转录病毒介导的基因转移导入核酶表达构建体以提高导入的效率。本发明的第三种实施方案是携带抗包装位点核酶的反转录病毒。如果反转录病毒载体是以MoMLV为基础的，那么由于两种反转录病毒的序列差异，以HIV的包装位点为靶的核酶将不会裂解MoMLV包装位点。

治疗学上的应用可能涉及将所述构建体经间接体内导入T淋巴细胞或经间接体内导入到造血干细胞。一种优选的方法是经反转录病毒载体，例如两亲(amphotropic)的Mo-MLV将核酶构建体掺入到淋巴细胞或干细胞中。造血祖细胞和真干细胞是基因治疗中有希望的靶，因为它们存在于骨髓中或可移动到外周血中。祖细胞可以产生髓样和淋巴样细胞，真干细胞产生所有细胞谱系的细胞。治疗可包括辐射疗法以破坏HIV感染的造血系统，然后将含核酶的干细胞注射到患者中。结果给患者的细胞提供了HIV抗性。

本发明还涉及由RNA或DNA或其结合物组成的转移载体，所述RNA或DNA或其结合物含有在转录时产生上述化合物的核苷酸序列。转移载体可以是HIV长末端重复序列，腺病毒相关的转移载体，SV40启动子，Mo-MLV或两性反转录病毒载体。所述转移载体还含有指导所述核苷酸化合物到体内特定器官或细胞或细胞内特定区域的序列。定位到细胞特定区域的实例包括使用包装信号(Sullenger et al，1993)。本发明还涉及在适宜的载体中含有上述化合物或转移载体的组合物。所述载体可以是药物学，兽医学或农业上可接受的载体或赋形剂。所述组合物还含有TAR引诱剂，polyTAR或RRE引诱剂。

为了在原核或真核宿主中生产本发明的DNA序列，本发明的启动子序列可以是原核的，真核的或病毒的。适宜的启动子是可诱导的，可阻遏的或更优选的是组成型的。适宜的原核启动子的实例包括能够识别T4聚合酶的启动子(Malik，S.et al.，J.Molec.Biol.195：471-480(1987)Hu，M.et al.，Gene 42：21-30(1986)，T3，Sp6，andT7(Chamberlin，M.，et al.，Nature 228：227-231(1970)；Bailey，J.N.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)80：2814-2818(1983)；Davanloo，P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)81：2035-2039(1984))；λ噬菌体的P_R和P_L启动子(The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.，Ed.，Cold SpringHarbor press，Cold Spring Harbor，NY(1973)；Lambda II，Hendrix，R.W.，Ed.，Cold Spring Harbor press，Cold Spring Harbor，NY(1980)；大肠杆菌的trp，recA，热休克和lacZ启动子；λ噬菌体的int启动子；pBR322β-内酰胺酶基基因的bla启动子和pPR325氯霉素乙酰基转移酶基因的CAT启动子等。原核启动子的综述见Glick，B.R.，(J.Ind.Microbiol.，1：277-282(1987))；Cenztiempo，Y.(Biochimie 68：505-516(1986))；Watson，J.D.et al.，J.Mol.Appl.Gen.1：273-288(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，s.，Cell 31；355-365(1982))；SV40早期启动子)Benosist，C.，et al.，Nature(London)290：304-310(1981)和酵母ga14基因启动子(Johnston，S.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)79：6971-6975(1982)；Silver P.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)81：5951-5955(1984))。

如上所述，为了制备用于抑制反转录病毒感染的载体，在敏感的真核细胞或完整动物中，必须使用真核启动子。优选的启动子和附加的调节元件，例如多聚腺苷酸信号，是在抑制反转录病毒感染的细胞类型中产生最大表达的那些。因此，例如，HIV-1，HIV-2，HTLV-1和HTLV-2以及莫洛尼氏鼠白血病病毒，所有感染的淋巴样细胞，并且为了有效地单独表达核酶构建体或有效地表达核酶构建体和与这些病毒之一(或多个)的包装序列互补的反义RNA的结合物，选择在造血，特别是淋巴样细胞(或组织)中能够提供有效表达的转录控制单位(启动子和多聚腺苷酸信号)。如下文所举证的，优选的启动子是巨细胞病毒即早期的启动子(32)，可选地与生长激素多聚腺苷酸信号(33)结合使用，莫洛尼氏-MuLV LTR启动子，与淋巴细胞趋性的反转录病毒一起使用。CMV启动子在淋巴细胞中表达。其它的启动子包括VA1和tRNA启动子。金属硫蛋白启动子有可诱导性的优点。SV40早期启动子在体外骨髓细胞中高水平的表达。

本发明还涉及生产所述化合物的方法，包括步骤：(a)将由DNA，RNA或其结合物组成的转移载体与相应于所述化合物的核苷酸序列相连；(b)用RNA聚合酶转录步骤(a)的核苷酸序列；和(c)回收所述化合物。

本发明还涉及含有核苷酸序列的原核或真核宿主细胞，所述核苷酸序列是或在转录后产生上述的化合物。所述细胞可以是动物细胞，产生所有造血细胞谱系中祖细胞更成熟的和完全成熟的细胞的造血干细胞，产生所有造血细胞谱系的成熟细胞的祖细胞，产生特定造血谱系的定型祖细胞，T淋巴细胞祖细胞，不成熟的T淋巴细胞，成熟的T淋巴细胞，髓样祖细胞，或单核/巨噬细胞。

本发明还涉及利用上述化合物保护造血干细胞，祖细胞，定型祖细胞，T淋巴祖细胞，未成熟的T淋巴细胞，成熟的T淋巴细胞，髓样祖细胞，或单核/巨噬细胞。此外，还涉及抑制/治疗或保护患者抗HIV的方法，包括将上述转移载体导入造血细胞，由此使细胞具有HIV抗性，从而针对HIV产生抑制/治疗或保护作用。导入是经间接体内进行的，细胞是有或未骨髓抑制(myeloablation)的自体的或异源细胞。在本发明的一个实施方案中，设计三个单一和一个多锤头核酶以便以Mo-MLV Psi包装位点内的不同位点为靶，同时设计一种以HIV Psi包装位点内的位点为靶的核酶(见图2)。选择Mo-MLV为反转录病毒的实例以确定其中的作用原理。这些原理可应用于包括HIV的其他反转录病毒。也进行了HIV-1的检测。

在本发明中，非人动物和其子代含有至少一些表达或保持非天然存在的寡核苷酸化合物的细胞。转基因的非人动物的所有生殖和体细胞含有在如美国专利4,736,866，5,175,383，5,175,384，或5,175,385中所述，在胚胎阶段导入到所述动物或其前代中的，可表达形式的非天然产生的寡核苷酸化合物。另参见Vanbrunt，1988；Hammer，1985；gordon et al.，1987；Pittius et al.，1988；Simons et al.，1987；simons et al.，1988。

本发明还包括使细胞获得对病毒感染的抗性的方法，包括用上述非天然产生的寡核苷酸化合物处理细胞。优选的，进行间接体内处理。除本文所用的外，术语反义序列和核酶还包括带有修饰的核苷酸，脱氧核苷酸，肽，核酸等的化合物。可将其用于间接体内处理或局部处理。

本发明非天然产生的寡核苷酸化合物的有效量在例如用于局部应用的乳膏，无菌可注射组合物或肠外施用的其他组合物的剂型中通常为1nM-1mM浓度。从局部配方来看，通常优选的是施用约50μM-500μM的非天然产生的寡核苷酸化合物。含有核苷酸衍生物的化合物在纳摩尔浓度可以是有活性的，所述衍生物可以是化学修饰的基团，例如偶磷硫代酸化物(phosphorothioate)或甲基膦酸化物(methyl phosphonate)衍生物。也可以施用所述浓度以避免毒性。

利用本发明的化合物进行疾病治疗的治疗策略总的来讲与用反义方法，例如在Chrisley.1991的反义目录中所描述的相同。特别是，使用的化合物的浓度，施用的方法和方式，以及所用的配方可以与用于反义应用时的那些相同。

本发明所用的“有效量”指在有特定的疾病和施药方案的哺乳动物中提供所需效果的量。用于治疗的是含有有效量以及适宜的稀释剂，防腐剂，增溶剂，乳化剂，助剂和/或载体的组合物。所述组合物是液体或冻干的或其他干燥的配方，并包括各种缓冲成分(例如，Tris-HCl，乙酸盐磷酸盐)，pH和离子强度的稀释剂，防止吸附到表面上的添加剂，例如白蛋白或明胶，洗涤剂(例如吐温20，吐温80，Pluronic F68，胆酸盐)，增溶剂(例如，Thimerosal，苯基醇)，填充物质或张力改性剂(例如，乳糖，甘露醇)，聚合物例如聚乙二醇共价附着到所述非天然产生的寡核苷酸化合物的表面，与金属离子的复合物或将羧酸物质掺入于或掺上于聚合化合物，例如聚乳酸，聚乙醇酸，聚丙烯吡咯烷酮颗粒制品等，或掺入到脂质体，微乳剂，胶团，单片层或多片层泡囊，红细胞影或原生质球。所述组合物将影响所述寡核苷酸的生理状态，溶解性，稳定性，体内释放率，和体内清除率。可选择地加入其他成分，例如抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的多肽，即多聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇。可缓慢释放的组合物包括亲脂的贮存物(如脂肪酸，蜡，油)的配方。本发明还包括用聚合物(例如polyoxamer或polyoxamines)包被的颗粒组合物以及与抗组织特异性受体，配体或抗原的抗体结合的或与组织特异性受体的配体结合的非天然产生的寡核苷酸化合物。此外，可以将特异性的核苷酸序列加到以核，质体，胞质或特定的细胞类型为靶的本发明的非天然产生的寡核苷酸化合物中。本发明组合物的其他实施方案包括掺入用于各种施用途径，包括经肠外，肺，鼻和口的保护性包被，蛋白酶抑制剂或渗透增强剂而形成的颗粒形式。

适宜的局部配方包括凝胶，乳剂，溶液，乳液，碳水化合物聚合物，其生物可降解基质；气雾，气溶胶或其他吸入剂。可以用薄膜，蜡，胶片或固体载体，包括口香糖，将所述非天然产生的寡核苷酸化合物封入胶囊中。为加强跨越上皮层的运输活力而使用的渗透增强剂是本领域已知，包括，单不限于二甲硫砜和甘油。

核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸衍生物或修饰物是本领域熟知的，而且可以与市售的DNA合成仪兼容。(见Saenger，1984，pp159-200)。核苷酸含有碱基，糖和单磷酸基团。因此，在碱基，糖或单磷酸水平可以制备核苷酸衍生物，取代物或修饰物。

在自然界发现了大量的修饰的碱基，而且用合成的方法生产了其中许多的修饰的碱基(Saenger，1984；and CRC Handbook ofBiochemistry)。适宜的碱基包括肌苷，5’-甲基胞嘧啶，5’-溴尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤和其他类似的碱基。例如氨基和环氮可以被烷基化，例如环氮原子或碳原子，如鸟嘌呤N¹和N⁷以及胞嘧啶C⁵烷基化；用硫代酮基取代酮；C＝C双键的饱和，在假尿苷中C-糖基键的掺入。硫代酮衍生物的实例是6-巯基嘌呤和6-巯基鸟嘌呤。

可以用各种基团，例如卤素，羟基，胺基，烷基，叠氮基，硝基，苯基等取代碱基。可以用其他化学物，例如可以或不可掺入其他化学独立体，如酸或碱性基团的氨基酸侧链或接头取代碱基。例如可以用酪氨酸取代鸟嘌呤(G₃)，相似地用组氨酸取代胞嘧啶(C1)或腺嘌呤(A11)。

可以用本领域熟知的方法修饰核苷酸的糖部分(Saenger，1984)。本发明修饰的糖的实例包括用卤素，氨基或叠氮基取代二级羟基；2’-甲基化；构型变异体，例如O₂-羟基被顺向成糖基C₁’-N键以得到阿糖核苷，以及在C₁’的构型异构体以得到α-核苷等。此外可以使用非核糖糖，例如六碳糖，如葡萄糖，五碳糖，如阿拉伯糖。

也可以用本领域熟知的方法对核苷酸的磷酸部分进行衍生化或修饰。例如，用氮，硫或碳衍生物取代氧以分别得到氨基磷酸酯，偶磷硫代酸酯(phosphorothioates)，磷酸二硫代酸酯(phosphodithiolates)和膦酸酯。在桥键或非桥键的位置用碳衍生物的氮，硫取代氧。已经从有关反义寡核苷酸的研究中确定磷酸二酯键和硫代磷酸衍生物可以有效地进入细胞(特别是长度较短时)，可能是由于与细胞受体有关。利用其电中性，细胞可能很容易摄取甲基膦酸酯。

用肽核酸可以完全取代磷酸部分(见Hanvey et al.，1992；Nielson1991；and Egholm，1992)。其他取代是本领域专业人员熟知的例如硅氧烷键，碳酸盐桥键，acetamidate桥键，氨甲酸酯桥键，硫代醚桥键等(Uhlmann and Peymann，1990)。

下列实施例是为了说明本发明要求的范围。将在下列实验的详细描述部分说明本发明。列出这些部分是为了进一步理解本发明，而不是，而且应该不构成以任何方式对此后权利要求所要求的本发明的限制。

实施例1

体外经核酶催化裂解Mo-MLV Psi包装序列

为了表明靶位点确实是可裂解的，检测核酶前，在细胞培养液中完成体外裂解反应。

根据GUC碱基的存在以及从Zuker的FOLDRNA程序(Zukeret al.，1981)所建议的RNA二级结构内潜在的位点易接近性，在Mo-MLV包装区选择了四个位点。根据距病毒转录物5’末端的核苷酸距离，将这些位点命名为243，274，366和553(见图2)。在RNA肿瘤病毒中描述了这些核苷酸位置(Coffin，1985)。设计了两种类型的核酶：具有12个核苷酸的臂长范围的分别以位点243，274和366为靶的三个单核酶，以及以所有四个位点为靶的一个多核酶，该核酶带有在各靶位点之间的序列长度的间接臂。所述位点和总设计示于图2。

通过将含伸出Pst I和EcoR I末端的人工双链插入段克隆到pGEB3Zf(+)中而构建单核酶。所得的质粒是pGEM243，pGEM274和pGEM366。通过标准体外诱变方法的变通法构建多核酶(Warrilow et al.，1992)。该质粒称为pGEM-M7。用DNA测序确定成功的克隆和序列完整性。

将在得自pMLV-1(Coffin，1985)的Mo-MLV的Bal I-Bal I片段的Psi包装序列克隆到pGEM3Zf(+)载体中，然后转录为体外核酶裂解的底物。为产生核酶或底物的转录混合物(50μl)含1μg线性化的蛋白酶K处理的DNA模板，30mM二硫苏糖醇，各400μM的rNTP，40mM Tris-Cl，pH 8.0，2mM亚精胺，6mMMgCl₂，50mM NaCl，1μl[^α-32P]-UTP(400-800Ci/mmole，10mCi/ml)，1单位RNasin和10单位T7或SP6 RNA聚合酶(Stratagene)。于37℃保温1小时后，加入10单位的无RNase的DNase(Promega)，然后将混合物在37℃保温15分钟。酚-氯仿抽提后，加入0.1体积的3M乙酸钠和2.5体积的乙醇沉淀RNA转录物。为了进行裂解反应，将核酶和底物(1∶1摩尔比)在80℃预保温2分钟，然后于37℃，在50mM Tris-Cl，pH7.5和10mM MgCl₂存在的条件下，保温30分钟。加入等体积的终止混合物(8M脲，50mM EDTA，0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯苯胺)使反应终止，然后在含8M脲的变性6％聚丙烯酰胺凝胶上分析，然后放射自显影。

结果表明以Mo-MLV原病毒包装序列的不同位点为靶的工程核酶在所选择的位点体外裂解了靶RNA。

对于大多数核酶构建体，将³²P-标记的Psi转录物与³²P-标记的核酶RNA以近似等摩尔的量一起保温可以导致在缓和的生理条件下(37℃，10mM MgCl₂和50mM Tris-Cl，pH7.5)有效地裂解底物。在图6中列出了这些消化性裂解的代表性实例。由Rz274和Rz366产生的裂解后的Psi片段的大小与预测的裂解位点的位置一致，得到分别为62nt+473nt和154nt+381nt的带。正如预测的，多核酶(Rz-M7)产生四个片段(50nt，92nt，187nt和240nt)以及数个部分裂解的片段(图3)。对于Rz243，在37℃没有肉眼可见的裂解，在50℃没有产生适宜大小的片段的弱裂解(数据未列出)。除核酶243外，这些结果表明了有效的位点特异性核酶介导的裂解。

实施例2

抗Mo-MLV包装位点(Psi)构建体

在表现出有效的体外裂解后，工程核酶以及与Psi包装区互补的长反义序列被克隆到与猴病毒40(SV40)早期启动子结合的neo^r基因的3’非翻译区(图4)。neo^r是编码磷酸化酶的原核基因，并由此使新霉素或新霉素类似物G418失活。后者对于哺乳动物细胞是有毒性的，外源neo^r基因的表达可以使细胞存活。带有与neo^r基因结合的SV40启动子的构建体在哺乳动物表达载体pSV2neo内并图示于图4中。

将核酶插入序列和反义对照经平末端连接克隆到neo^r3’非翻译区的Sma I位点。所得的载体分别称为pSV243，pSV274，pSV366，pSVM7和pSVas Psi(反义构建体)。

实施例3

将所述构建体转染到产生3T3-Mo-MLV细胞系中

用磷酸钙转染方法(Chen et al.，1987)将各种pSV2neo为基础的构建体转染到3T3-Mo-MLV细胞中。阳性菌落是在存在500μg/ml G418的条件下生长了9-12天后形成的那些。对每个构建体，用克隆柱(cloning cylinder)分离4-7个菌落。培养这些菌落，贮存于液氮中，然后用于进一步的检测。在500μg/ml G418中筛选了10-14天后，为每个构建体建立数个稳定的克隆细胞系。为了确定转染的DNA表达构建体的整合情况，从特定转染的细胞系制备基因组DNA，然后进行Southern分析。用限制酶Hind III和Nru I消化基因组DNA以产生含neo^r加插入片段(核酶或反义序列)的片段。然后用neo^r特异性探针确定所述构建体的存在。从图7的Southern分析清楚地表明，用核酶和反义构建体转染的并用G418筛选的细胞含有neo^r基因加上适宜的核酶或反义序列。已发现与neo^r探针杂交的Hind III-Nru I片段的大小在不同情况下均与预期的一致，只有neo^r基因时，为1.3kb；neo^r加单核酶时，为1.38kb；neo^r加多核酶时，为1.98kb；neo^r加反义序列时，为1.89kb。由于存在阳性转染子中的G418抗性，所以预测了核酶或反义构建体的表达。这一点用RNase保护作用测定法在转染的细胞中进一步检测。用硫氰酸胍法，从特定的细胞系中提取总RNA，然后在含80％去离子甲酰胺，100mM柠檬酸钠pH6.4，300mM乙酸钠pH6.4，1mM EDTA的溶液中，用相应的³²P-标记的核糖探针(5×10⁴cpm)杂交20ug/ml的总RNA，然后用RNase消化杂交的RNA(5μg/ml Rnase A和10单位/ml RNaseT1)。如果未表达核酶，则互补的核糖探针就不能结合。RNA保持单链，并完全被RNase消化。然后用电泳分离反应混合物。如图8所示，检测表明，所有的核酶和反义构建体均如预期的那样得到表达。受保护的片段是65bp(单核酶)；588bp(多核酶)和524bp(反义)。

实施例4

构建体抑制Mo-MLV复制的能力

在建立了用不同构建体转染的稳定3T3Mo-MLV克隆细胞系后，用XC噬菌斑实验评价Mo-MLV复制的水平。XC实验是Mo-MLV的syncitial噬菌斑实验，它是以观察到产生Mo-MLV的细胞可以导致XC细胞融合为基础。按Gautsch等人(1976)所述滴定Mo-MLV，除在感染过程中有8ug/ml聚凝胺(Sigma)存在以增强病毒与靶细胞的结合外。将来自不同Mo-MLV产生细胞系的培养物上清液加到未感染的小鼠NIH3T3细胞中，所述细胞在感染前用8ug/ml聚凝胺预处理了1小时。在生长培养基中保温20小时后，在2×2mm²的栅格平皿中将能够受到感染的NIH3T3细胞与XC细胞共培养3-4天。然后用甲醇固定所述平皿，用1％亚甲兰加0.1％龙胆紫染色，然后用显微镜对syncitium噬菌斑进行扫描。为了确保检测在剂量-反应曲线的线性部分内完成，用2倍的病毒系列稀释液感染3.5×10⁵细胞/平皿，传代24小时后与XC细胞混合培养。表1中的结果来自三个独立的实验。相对于含pSVneo载体的细胞，在含Rz274，Rz366，Rz-M7和As-Psi的细胞中观察到对syncitium噬菌斑形成有74％-77％的抑制作用，而在含Rz243的细胞中没有明显的抑制作用。这些数据与体外裂解结果(图6)一致，在体外裂解中Rz243在所用的条件下，也没有有效地裂解底物。

用病毒RNA点印迹确定这些抑制作用，其中通过在微离心管中离心16小时(12,000rpm，10分钟，4℃)澄清1ml的生产NIH3T3病毒细胞的培养物上清液。用8％PEG 8000和0.5M NaCl沉淀病毒RNA。酚-氯仿抽提后，在碱性转移溶液中将RNA印迹到带正电荷的尼龙膜(zetaOProbe，Bio-Rad)上(Reed et al.，1985)。在50％甲酰胺，5X SSPE，5X Denhardt溶液，0.5％SDS，100mg/ml变性的鲱鱼精子DNA和从pGEM-Psi的T7启动子转录的³²P-标记的核糖探针中，于42℃过夜完成杂交。通过点闪烁计数确定病毒RNA的量。测量在来自核酶或反义序列转染的3T3-Mo-MLV细胞上清液中的病毒RNA，然后与来自pSVneo转染的3T3-Mo-MLV细胞上清液的进行比较。正如从图9和表2中可看到的(除表达Rz243的细胞外)，从表达核酶或反义序列的所有细胞系产生的病毒RNA的量与在合胞体实验中见到的实质上降低的量相似。

在将这些核酶构建体转染到Mo-MLV感染的细胞中后，只有表现出有效体外裂解的那些核酶有体内抑制Mo-MLV复制的能力(约70-80％)。这些结果说明在体外裂解和体内核酶介导的病毒抑制之间有直接的关系。

前面的实验成为进一步研究以HIV Psi包装序列为靶的核酶以便降低病毒滴度的基础。

表1.从转染细胞中释放的由Mo-MLV诱导的合胞体噬菌斑

细胞*	合胞体噬菌斑ψ	抑制作用(％)
			Rz243	32±12	-

Rz274Rz366Rz-M7As-PsipSV2neo

7±38±17±38±231±1

777477740

^*在NIH3T3细胞的感染中使用10^-2稀释的、来自含Rz或As构建体细胞的上清液。

ψ数据是在三个独立的实验中来自每个构建体的两个克隆系的噬菌斑计数的平均值。数据表示为平均值±标准误。有相同感染细胞稀释度的复制平皿一般含有相似数目的合胞体噬菌斑。

表2.与病毒RNA点印迹的杂交程度

样品	cpm×10-3*	抑制作用(％)
			tRNARz243Rz274Rz366Rz-M7As-ψpSV2neo	0.002.590.631.360.930.963.30	-21815972710

^*cpm计数得自以1∶1稀释的两个印迹。按材料和方法中的描述完成病毒RNA点印迹。在放射自显影后，切下对应于各点的滤纸以便进行液体闪烁计数。

实施例5

抗HIV包装位点构建体

在HIV-1(HIVSF2，Levy，1984)Psi包装区(从HIV基因组5’端核苷酸735-765)选择一个GUA位点用于核酶攻击。象前面的构建体一样，通过平末端连接，将合成的核酶插入序列克隆到pSV2neo载体neo^r基因的3’非翻译区的Sma I位点。用DNA测序确定克隆是否成功以及序列的完整性。将所述构建体称为pSV-Rz-HIV-Psi。图4是所述构建体的图示。

实施例6

将pSV-Rz-HIV-Psi构建体转染到T淋巴细胞中

将抗HIV包装位点构建体pSV-Rz-HIV-Psi电穿孔到Sup T-1细胞〔一种人T淋巴瘤细胞系〕中。收集对数生长细胞，然后，用染料排除法计数活细胞数。用PBS洗涤细胞，然后以在不含FCS，但含10mM葡聚糖和0.1mM二硫苏糖醇的RPMI培养基中以1×10⁷活细胞/ml的密度重悬。在0.4cm杯(Bio-Rad)中，每次电穿孔用0.4ml细胞悬浮液和10μg pSV-Rz-HIV-Psi质粒DNA。使细胞和DNA混合物经Gene Pulser(Bio-Rad)的960μF，200V的单脉中。电击后，在室温将所述杯保温10分钟，然后将细胞转移到10ml含10％FCS的RPMI培养基中，并放在保温箱(5％CO₂，37℃)中。电穿孔后48小时，在用800μg/ml G418补充的培养基中筛选细胞。9-12天后，分离阳性菌落并培养之，作为用于HIV保护实验的克隆分离物。

实施例7

评价核酶表达构建体赋予抗HIV攻击的保护的能力

完成两个检测p24抗原和合胞体形成的实验以评价抗HIV Psi核酶构建体在细胞培养中的功效。HIV-1 p24抗原检测是酶免疫检测，使用包被到微孔带上的抗HIV核心抗原的鼠单克隆抗体。HIV-1合胞体测定是以观察到HIV-1与靶T淋巴细胞，通过引起融合，从而导致合胞体，含有许多核的大细胞的形成而相互作用为基础。用HIV-1(SF2)以0.1-1的m.o.i.感染表达克隆核酶构建体的细胞和对照。2小时后，洗涤细胞，加入10ml新鲜的培养基。每隔3-4天，计数合胞体和活细胞的数量。为了形成合胞体，需要大约高两个数量级的剂量，以便与不包括核酶的对照表现出相同的结果(表3)。此外，核酶的存在使得合胞体的形成延缓(表4)。

在另一实验方法中，沉淀细胞，取1份上清液进行p24检测。有代表性的结果列于图10。在该实验中，在攻击后22天对p24水平还有抑制作用。在感染后8天和13天，与只含有载体的细胞相比，在表达核酶的细胞中对p24的产生还有80％的抑制作用，而在22天，观察到约60％的抑制水平。

这些结果提供的证据表明，通过将抗Psi包装位点的核酶加到T淋巴细胞中可以抑制HIV的复制。

表3.合胞体的形成

		病毒	稀释度*
					克隆Rz-2Rz-MRz-Psi随机pSV2neo	10-3++++++++++++++++++++	10-4+-------++--++++++++	10-5--------+---++--++++	10-6------------+---++--

^*在感染性检测(0.1-1的m.o.i.)中用HIV-1(SF33)。

表4.被感染的SupT1细胞的合胞体形成

	感染后天数
							组	6	7	8	9	10	11
pSV-Rz-HIV PsipSV2neo模拟	---	-+-	-++-	-+++-	-+++-	++++-

用四个low-power field计数每个培养中的合胞体数，-，没有合胞体；+，1-5个合胞体；++，6-10个合胞体；+++，10以上合胞体合胞体。模拟是未感染的SupT1细胞。

实施例8

我们还评估了其他(除以ψ为靶外)核酶构建体的效率。意想不到的是，我们发现，以HIV-1的tat基因为靶的单核酶(Rz2)也能有效地抑制HIV-1复制。我们检测了tat中该区的序列保守性，发现在不同HIV-1分离物中是高度保守的(见图12)。这些是以该tat序列为HIV-1核酶靶位点的第一个实验。文献中的报道在图13中作了注明，其中注明的tat靶位点是由其他研究者确定的位点1(Crisell et al.，1993)和位点3(Lo et al.，1992和Zhou et al.，1992)。

总结

用大量的重组反转录病毒转导人外周血淋巴细胞(PBL)，所述重组反转录病毒包括RRz2，一种带有以插入到新霉素抗性基因(neo^r)3’区的HIV tat基因转录物为靶的核酶的以LNL6为基础的病毒；RASH-5，一种含有人巨细胞病毒(HCMV)启动子HIV-1下游的5’前导区反义序列的以LNHL为基础的病毒；和R20TAR，一种带有用莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复序列(LTR)驱动的HIV-1 TAR序列的20个串联拷贝的以LXSN为基础的病毒。G418选择后，用HIV-1实验室菌株IIIB和初级临床分离物攻击转导的PBL。结果表明，可以转导来自不同供体的PBL，而且赋予对HIV-1感染的抗性。对于每个构建体来说，与相应对照载体转导的PBL相比，p24抗原水平有约70％的降低。分子分析表明了从来自反转录病毒LTR的所有转导基因的组成型表达，但由反义构建体的内部HCMV启动子未观察到有可检测的转录物。转导PBL，随后在其中转基因表达不会损坏CD4⁺/CD8⁺(由流式细胞计数测量的)的表面表达或细胞增殖(用[³H]胸苷摄取实验测定)。这些结果表明了这些抗HIV-1基因治疗剂的潜在实用性并说明了所述PBL检测系统的前临床价值。

已经将人免疫缺损病毒(HIV)鉴定为获得性免疫缺损综合症(AIDS)及其相关疾病的病原因素(Barre-Sinoussi，F.et al.1983；Gallo，R.C.et al.，1984)目前，对该疾病没有足够的治疗方法，而利用基因操作抑制HIV复制似乎是AIDS治疗的一种新的有前途的方法。干扰HIV复制的可能的基因治疗方法包括利用核酶的表达催化裂解并因此使HIV RNA失活；表达反义RNA以抑制HIV RNA的反转录，加工和翻译；表达带有显著抑制活性的突变HIV结构或调节基因；表达RNA引诱物以抑制HIV-1的转录，加工和包装。

在迄今为止的公开报道中，反转录病毒载体已经被选择用来导入转基因和基因治疗抗HIV-1剂的传递方法。在人造血T淋巴细胞系，例如CEM，SupT1和MOLT-4(Sarver，N.et al.1990；weerashingee，M.et al.1991；Yu，M.et al.1993；Yamada，O.et al.1994；Rhodes，A.and James W.1991；Sczakiel，G.et al.1992；Lisziewicz，J.et al.，1991，1993；Trono，D.et al.，1989；Malim，M.H.et al.1992)中检测了这些载体，它们有许多令人满意的特征，包括在体外检测中无限生长潜力，但缺点是被转化的细胞。因此，必需检测抗HIV基因治疗剂在人初级细胞，例如外周血淋巴细胞(PBL)中的效率。对于这些细胞，CD4⁺亚群是HIV感染的关键靶细胞，而且在AIDS患者中主要是该种群贫乏。然而，目前还没有将初级PBL检测用于抗-HIV基因治疗方法的报道。

我们已经对人PBL完成了复杂的研究以便i)检测抗HIV剂，包括核酶，反义序列和RNA TAR引诱物，和ii)用实验室和临床HIV-1分离物确定PBL转导，G418选择和HIV-1攻击的条件。这些实验表明，用表达以HIV-1 tat基因为靶的核酶的反转录病毒构建体；与HIV-15’前导区互补的反义序列；或20 TAR RNA引诱物转导初级PBL实质上赋予了其对HIV感染的抗性。该检测系统是在以前抗HIV反转录病毒构建体的检测基础上的改进，而且用于补充现有的T细胞系检测。利用该检测系统，我们已经得到了大量与HIV基因治疗有关的临床数据。

材料和方法

细胞系：在含10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改性的Eagle氏培养基(DME)中培养包装细胞系ψ2(Mann，R.et al，1983)和PA317(ATCC CRL 9078)。在HAT培养基中，必须每隔6星期选择PA317细胞(5-7天)。在DME加10％牛血清(BCF)中生长ψCRE和ψCRIP(Danos；O.and mulligan，R.C.1988)。反转录病毒构建体：将化学合成的以HIV-1 tat基因转录物(HIV-1 IIIB核苷酸5865-核苷酸5882，GGAGCCA GTAGATCCTA)为靶的锤头核酶克隆到新霉素抗性基因3’非翻译区内LNL6载体(Bender，M.A.et al.1987)的Sal I位点(图15A)。将该构建体命名为RRz2。对于反义构建体，将含部分R，U5和gag基因5’部分(核苷酸78-628)的HXB2克隆的550bp BamH I片段以反义方向克隆到LNHL载体的BamH I位点(图15B)，所述LNHL载体得自除去在人BamH I位点的HPRT cDNA而得到的pNHP-1载体(Yee，J.K.et al.1987)。将所得的反义构建体称为RASH5。通过将20TAR片段(20串联拷贝)插入到LXSN载体(Miller A.D.et al.1989)中的Xho I和BamHI位点制得聚合-TAR构建体，称为R20TAR(图15C)。用DNA测序或限制酶图谱确定构建体的序列完整性和方向。

两亲反转录病毒的产生：用涉及包装细胞系ψ2和PA317细胞的转染方法生产反转录病毒LNL6和RRz2。用10μg的构建体DNA经钙沉淀转染80％汇合的ψ2细胞，然后在含1O％FBS的DME培养基(DME生长培养基)中保温14小时。然后除去所述培养基，用新鲜的DME生长培养基代替，于37℃，5％CO₂中保温过夜。从转染的ψ2细胞中收集外生的病毒上清液，然后在存在4μg/ml聚凝胺的条件下，用其感染在DME生长培养基中亚汇合(60-80％)的PA317细胞。于37℃，5％CO₂保温24小时后，将感染的PA3.7细胞胰蛋白酶化，在含750μg/ml的G418的DME生长培养基中分成1∶20。每隔3-4天换一次培养基直到菌落形成。挑取10-29个来自各构建体的克隆，扩展进行病毒滴定(新霉素抗性菌落检测)和可复制反转录病毒(RCR)检测(M iller A.D.andRosma，G.J.1989)。用转染的ψCRE和感染的ψCRIP细胞生产反转录病毒LNHL，RASH5，LXSN和R20TAR。分离各构建体的20-96个克隆以便进行滴定和RCR检测。

人PBL的转导：用Ficoll-Hypaque梯度离心，从健康供体的leukopacks制备外周血单核细胞(PBMC)。按制造商的说明，用MicroCELLector Flask(Applied Immune Science)通过消耗掉CD8⁺而富集CD4⁺细胞。在用10％FBS和20单位/ml人重组白细胞介素2补充的RPMI-1640培养基(RPMI生长培养基)中，用5μg/ml植物凝血素(PHA，Sigma)或10ng/ml OKT3单克隆抗体(Janssen-Cilag)将CD4⁺富集的PBL(5×10⁵细胞/ml)刺激48-72小时。存在4μg/ml聚凝胺(使用0.5的m.o.i.)的条件下，通过将细胞暴露于无生产者细胞反转录病毒原液18小时而转导受到刺激的PBL。转导48小时后，在含300-500μg/ml G418的RPMI生长培养基中选择PBL 10-14天。然后是在用HIV-1攻击PBL前，在不含G418的新鲜RPMI生长培养基中为期一周的回收期。

HIV-1感染：按文献所述(Johnson，V.A.et al.1990)对人PBL确定HIV-1实验室菌株IIIB和临床分离物82H的感染滴度(TCID50)。在37℃，用100 TCID50 HIV病毒将5/10⁵转导的PBL感染2小时，然后，用RPMI-1640将细胞洗涤两次，并将细胞重悬于5ml RPMI生长培养基中。每隔3-4天，取若干等份上清液进行p24抗原ELISA(Coulter)。

RNA分析：用异硫氰酸胍方法(Chirgwin，J.H.et al.1979)从转导的PBL中提取总细胞RNA。在1％琼脂糖-甲醛凝胶上分离15μg RNA，转移到尼龙膜(Hybond-N)上，然后与³²P-标记的neo^r-特异性探针，550bp的HIV-1 HXB2的BamH I片段或20 TAR片段杂交，以便分别检测neo^r-核酶，反义分子和TAR的表达。

转导的PBL的FACS分析：将1×10⁵转导的PBL与CD4或CD8特异的异硫氰酸荧光素盐(FITC)结合的单克隆抗体(BectonDickinson)或与对照抗体(FITC鼠IgG1，Becton Dickinson)一起于4℃保温20分钟。用PBS洗二次后，在Becton Dickinson FACScan上分析细胞。

增生测定：按上文所述转导PBL。用G418选择，并在新鲜的RPMI生长培养基中回收后，用台盼兰排除法评价其生存性，然后，将细胞数调到1×10⁶活细胞/ml。用1×10⁶细胞接种三份孔(Cornig 24孔平板)，然后将1μCi6-[³H]-胸苷(5Ci/mmol，Amersham)加到各孔中。培养48小时后，真空条件下将细胞转移到玻璃纤维滤器中，用冰冷的磷酸缓冲的溶液洗涤三次，用3×5ml冰冷的10％三氯乙酸(w/v)沉淀。用乙醇漂洗滤器，然后进行β-闪烁计数。用Student t-检验完成统计分析。

结果：

产生含各种转基因的高滴度两亲反转录病毒。以不同载体骨架为基础构建三种不同的表达转基因的反转录病毒(核酶，反义或聚合TAR)。通过将抗HIV tat核酶基因插入到由LNL6载体中MoMLV长末端重复序列(LTR)驱动的neo^r基因的3’非翻译区而构建RRz2(图15A)。期望从该反转录病毒得到含neo^r和核酶基因的嵌合RNA转录物。在RASH5反转录病毒(图15B)中，可以从病毒LTR或内含的人CMV启动子转录反义序列。在R20TAR构建体中，从病毒LTR表达聚合的TAR(图15C)。使用三个反转录病毒构建体和相应的对照载体，以生产两亲的生产者细胞系。按用标准方法(Miller A.D.and Rosma，G.J.et al.1989)测量的，病毒滴度为10⁵-5×10⁶cfu/ml。总之，在转导试验中，使用＞10⁶cfu/ml的反转录病毒滴度。检测所有病毒原液并确定没有RCR，然后贮存于-80℃。

PBL的反转录病毒转导。为了优化用于反转录病毒转导的PBL的刺激，比较CD4⁺富集的PBL与PHA或OKT3抗体的反应。从细胞翻倍时间，生存性和转导能力来看，用PHA或OKT3在培养物中没有观察到差别。在本发明的实验中，使用OKT3抗体，因为它适用于人类。用0.5m.o.i.的两亲反转录病毒转导受到刺激的PBL。以用G418选择后存活的细胞数量为基础，确定相对的转导效率。依不同的供体血pack，总的转导效率为2-7％。被转导PBL的G418选择是PBL检测中的关键步骤。为了达到完全选择而使用两步法。对于各批的PBL，进行G418毒性剂量检测，同时，将300μg/ml的基线G418浓度用于在开始7-9天中的转导PBL。在所述的开始期之后，将G418浓度调整到在毒性剂量实验中确定的浓度。从所试验的10个供体中发现，用10⁵细胞/ml的开始细胞浓度，G418的毒性剂量范围在300-500μg/ml。转导并选择后，在不含G418的新鲜培养基中将PBL培养一周。所述回收步骤对于随后HIV-1攻击检测中提高细胞生存性和增加细胞数量(相对于用G418所见到的，提高3-5倍)是非常重要的。

在转导的PBL中转基因的表达。评价核酶，反义或TAR序列在转导的PBL中的表达。图16A-16C表示Northern分析的代表性图谱。在RRz2和LNL6转导的细胞中(图16A)，用neo^r特异性探针检测到了剪接和未剪接的含neo^r-核酶或neo^r信使的转录物(3.2kb和2.4kb)。占多数的RNA是未剪接的转录物。当用核酶特异性探针与印迹杂交时，只有在RRz2 RNA中观察到相同的图谱。在RASH5转导的PBL中，用550bp探针检测到两个来自5’LTR的转录物(剪接和未剪接的)，而且具有预期的大小(4.8kb和4.0kb)(图16B)。然而，未表达预期来自内CMV启动子的较短的转录物，这说明CMV启动子在该构建体中已被切掉了。R20TAR载体产生了来自5’LTR的未剪接的4.6kb转录物，按预期的，由于LXSN中剪接供体的失活，该转录物与TAR探针杂交(图16C)。

抑制HIV-1在人PBL中的复制。为了分析PBL检测系统与HIV-1基因治疗研究的相关性，用实验室菌株(IIIB)和初级临床分离物(82H)在转导的PBL上完成HIV攻击实验。感染做双份，用3-5个不同批次的PBL重复。通过测量在培养物上清液中p24抗原的水平来监测HIV-1复制。在使用HIV-1 IIIB的攻击实验中，相对于用对照载体转导的PBL，表达核酶(图17A)，反义序列(图17B)和TAR引诱物(图17C)的PBL中的p24产生明显降低(70％)。同样转导并选择PBL以评估其对初级HIV-1分离物感染的抗性。从患者PBMC中直接得到初级临床分离物82H，而且将其特征鉴定为T细胞趋向性的和诱导合胞体的分离物。与IIIB一样，对82H复制的抑制(p24抗原ELISA评价)达到与HIV-1 IIIB感染的PBL中相似的水平(图18A-18C)。这些结果表明，通过反转录病毒载体传递到人PBL中的这些转基因可以抑制HIV-1在初级造血细胞中的复制。

分析转导的PBL。为了研究转导和构建体表达对PBL的潜在影响，对所有的转化和筛选的PBL完成[³H]-胸苷-摄取检测。与未转导的正常PBL相比，在用转基因构建体和载体转导的PBL中没有明显的不利影响(P＜0.002)；(图19)。此外，FACS分析表明转导后，CD4表面的标记没有改变(表5)。这说明在HIV-1攻击检测中观察到的抑制作用不是由于在转导的PBL中CD4受体数量的减少而造成的。

表5.用FACS分析检测在PBL上的CD4/CD8表面标记

	细胞百分比(％)
			细胞*总PBLCD4+PBLLNL6-PBLRRz2-PBL	CD4+83.8093.6593.0194.02	CD8+8.400.421.190.92

^*按材料和方法中的描述分析PBL。总PBL＝未转导的总PBL；CD4⁺＝未转导的CD4⁺富集的PBL；LNL6-PBL＝CD4⁺富集的用LNL6病毒转导的PBL；RRz2-PBL＝CD4⁺富集的用RRz2病毒转导的PBL。

图20表明用病毒转导的并经G418选择的CEM T4T淋巴细胞系的结果。所收集的种群含有带随机整合体和不同构建体表达水平的细胞，然后用HIV-1攻击所述细胞。

图21A-21B列出了针对tat的RzM(多核酶)，以及针对包装位点和tat的RRzpsi/M核酶的结果。

讨论：

为了用于基因治疗以最终用于抑制HIV-1的体内复制，首先在实验系统中检测所述的基因治疗方法。迄今为止，这些实验系统主要是利用人T淋巴细胞细胞系，而在初级PBL中没有公开的数据(Yu，M.et al.1994)。为了得到前临床数据，最重要的是在初级造血细胞中检测抗HIV-1基因治疗剂。这些细胞是HIV-1感染和复制的主要目标，而且在细胞系和PBL之间，在生长特征，对体外操作的反应以及对HIV-1感染的反应性方面有明显的差异。它就是HIV-1基因治疗的CD4⁺PBL种群。由于这些原因，我们完成了本发明建立PBL检测系统的研究。

在该研究中，检测了表达核酶，反义序列或TAR引诱物基因的三个不同的反转录病毒载体在人PBL中抗病毒效力。尽管用不同反转录病毒载体构建了它们，但按照用³H-胸苷掺入实验和FACS分析测量的，在HIV-1保护实验中，它们的有效水平相似。这些观察结果表明了PBL作为HIV-1基因治疗靶的可行性。

为了利用PBL作为检测系统或作为治疗的靶细胞，应该注意几点。首先，高病毒滴度是达到PBL有效转导的重要因素。在用G418不能令人满意地选择转导的PBL的情况下，这对于临床目的是特别重要的。我们检测了用高滴度治疗性反转录病毒(＞10⁶cfu/ml)转导的选择和未选择的PBL。分析未选择的PBL对HIV感染也有抗性，尽管抑制程度低于在选择过的PBL中所见到的，这表明，在临床上有可能使用未用G418选择的间接体内转导的PBL。但是G418选择能够使低滴度病毒被用于基因治疗的体外检测。我们还研制了两步G418选择方法，利用该方法可以很容易地完成完全的选择。这些方法使体外培养的时间减少到最少，由此减少了对T细胞种群的任何改变。在我们的实验中，将PBL体外连续培养两星期并未损害表面标记(CD4⁺和CD8⁺)。这一过程的长度(两星期)对于用于治疗目的的任何PBL体外操作已经足够了。

反转录病毒载体设计是有效地进行基因转移和表达的另一重要方面。尽管没有直接比较在本研究中所用的三种载体设计，但是注意到两个观察结果。首先，在人初级造血细胞中用组成型方法可以有效地表达由病毒LTR(但不是来自一个构建体的CMV内启动子)控制的所有转基因。第二，象在T细胞系中一样，将核酶基因插入到反转录病毒载体的基因(例如neo^r的3’非翻译区)的策略在PBL中也是有效的。这些结果在未来基因治疗设计的改进中可能是有用的。由此可以得出结论，用本发明公开的方法，可以完成人初级PBL的转导，并使其免于HIV间接体内感染。本发明不仅提供了体外评价基因治疗剂的有用的系统，而且形成了针对CD4⁺淋巴细胞的HIV-1基因治疗的基础。

                      表6

              动物反转录病毒

AIDS相关病毒(ARV)

鸟成红细胞增多症病毒

鸟造白细胞组织增生病毒(或淋巴样造白细胞组织增生病毒)

鸟成髓细胞血症病毒

鸟网状内皮组织增生病毒

鸟肉瘤病毒

狒狒内源病毒

牛白细病病毒

牛慢病毒

牛合胞体病毒

公山羊大脑炎-关节炎病毒(或山羊脑白质炎病毒)

鸟髓细胞组织增生病毒

Corn snake反转录病毒鸡合胞体病毒

鸭传染性贫血病毒

鹿肾病毒

马皮肤纤维肉瘤病毒

马传染性贫血病毒

Esh肉瘤病毒

猫免疫缺损病毒

猫白血病病毒

猫肉瘤病毒

猫合胞体形成病毒

Fujinami肉瘤病毒

长臂猿白血病病毒(或猿猴淋巴瘤病毒或猿猴骨髓性白血病病毒)

金野鸡病毒

人免疫缺损病毒1(HIV-1)

人免疫缺损病毒2(HIV-2)

人T淋巴营养性病毒1(HTLV-1)

人T淋巴营养性病毒2(HTLV-2)

人T淋巴营养性病毒3(HTLV-3)

类淋巴细胞增生病病毒

成髓细胞血症相关病毒

髓红细胞组织增生病毒

貂细胞病灶诱导病毒

髓红细胞组织增生病毒13

貂白血病病毒

小鼠乳腺肿瘤病毒

Mason-Pfizer猴病毒

鼠肉瘤病毒

髓样白血病病毒

髓红细胞组织增生病毒

进行性肺炎病毒

大鼠白血病病毒

大鼠肉瘤病毒

Rous相关病毒0

Rous相关病毒60

Rous相关病毒61

网状内皮组织增生相关病毒

网状内皮组织增生病毒

内皮组织增生转化病毒

雉鸡病毒

Rous肉瘤病毒

猿猴泡沫病毒

猿猴免疫缺损病毒

脾病灶形成病毒

松鼠猴反转录病毒

脾坏死性病毒

绵羊肺腺瘤/癌病毒

猿猴肉瘤相关病毒(或兔猴白血病病毒)

猿猴肉瘤病毒(或兔猴病毒)

表7：

包装序列表：

1网状内皮组织增生病毒(Rev)

基因组：Wilhelmsen，et al.J.virol.52：172-182(1984).碱基1-3149；Shimotohno，et al.Nature 285：550-554(1980).碱基3150-3607。包装序列(ψ)：相对于原病毒51末端，在0.676kbp和0.820kbp之间的144碱基。

J.Embretson and H.Temin J.virol.61(9)：2675-2683(1987)。

2人免疫缺损病毒1型(HIV-1)

基因组：Gallo et.al.Science 224：500-503(1984)包装序列(ψ)：在5’LTR和gag基因起始密码子之间的19个碱基对。

3莫洛尼氏鼠白血病病毒(Mo-MULV)

基因组：Shinnick，et al.Nature 293：543-548(1981).包装序列(ψ)：在gag蛋白质编码序列的剪接位点和AUG位点之间的350个核苷酸。R.Mann，R.Mulligan and D.Baltimore，Cell 33：153-159(1983).第二包装序列(ψ+)：仅在U5区的5’半区。J.Murphy and S.Goff，J.Virol.63(1)：319-327(1989)。

4鸟肉瘤病毒(ASV)

基因组：Neckameyer and-Wang J.Virol.52；879-884(1985).包装序列(ψ)：从原病毒的左(gag-pol)末端在300-600碱基之间的150个碱基对。P.Shank and M.Linial，j.Virol.36(2)：450-456(1980)。

5Rous肉瘤病毒(RSV)

基因组：Shwartz et al.Cell 32：853-869(1983).包装序列(ψ)：从碱基120(PB位点开始)至gag起始密码子前碱基22的230个碱基对。

6牛白血病病毒(BLV)

基因组：Couez，et al.J.Virol.49：615-620(1984)，碱基1-341；Rice etal.Virology 142：357-377(1985)，碱基1-4680；Sagata et al.Proc.natl.Acad.Sci.82：677-681(1985)，完整的BLV原病毒。包装序列(ψ)：

本发明人推测它在约碱基340引物结合位点末端和在约碱基41-8的gag起始密码子之间。

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81.Yu，M.，Ojwang，J.O.，Yamada，O.，Hampel，A.，Rappaport，J.，Looney，D.&Wong-Staal，F.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90，6340-6344.

82.Yu，M.，Poeschla，E.&Wong-Staal，R.(1994)GeneTherapy  1，13-26.

83.Zhou，C.et al.(1992)Proc.Third InternationalSymposium on Catalytic RNA(Ribozymes)and TargetedGene Therapy for Treatment of HIV Infection.

84.Zuker，M.and Stiegler，P.(1981)Nucleic Acid.Res.9，133-148.

序列表

(1)一般资料：

    (I)申请人：Symonds Geoffrey P.

               Sun，Lun-Quan

    (ii)发明题目：以反转录病毒包装序列为靶的核酶的表达构建体及含有所述构建体的重组反转录病毒

    (iii)序列数：11

    (iv)通讯地址

        (A)受件人：Cooper&Dunham LLP

        (B)街道：1185 Avenue of the american

        (C)城市：纽约

        (D)州：纽约

        (E)国家：美国

        (F)邮政编码：10036

    (v)计算机可读形式：

        (A)介质类型：软盘

        (B)计算机：IBM PC兼容

        (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

        (D)软件：PatentIn Release#1.24

    (vi)目前的申请资料：

        (A)：申请号：尚不知

        (B)：申请日：1995年1月5日

        (C)：分类号：

    (vii)在先申请资料：

        (A)：申请号：08/310,259

        (B)：申请日：1994年9月21日

    (viii)代理人/代理资料：

        (A)：姓名：White，John P.

        (B)：注册号：28,678

        (C)：文献/档案号：43846-A-PCT

    (ix)电讯信息：

        (A)：电话：212-278-0400

        (B)：电传：212-391-0525

(2)SEQ ID NO：1的资料：

    (I)序列特征：

        (A)长度：19个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

NCUGANGANN NNNNGAAAN

(3)SEQ ID NO：2的资料：

    (I)序列特征：

        (A)长度：14个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

NCUGANGANG AAAN

(4)SEQ ID NO：3的资料：

    (I)序列特征：

        (A)长度：21个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

NGANNGAAAC NNNANANUAC N

(5)SEQ ID NO：4的资料：

    (I)序列特征：

        (A)长度：38个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

TTAGGATCCT GATGAGTCCG TGAGGACGAA ACTGGCTC

(6)SEQ ID NO：5的资料：

    (I)序列特征：

        (A)长度：114个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

        见原文67页序列L46-49

(7)SEQ ID NO：6的资料：

    (I)序列特征：

        (A)长度：51个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

GTCAAAAATT GGCGCTGATG AGTCCGTGAG GACGAAACTC

ACCAGTCGCC G

(8)SEQ ID NO：7的资料：

    (I)序列特征：

        (A)长度：170个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

见原文68页序列L9-13

Claims (25)

1.包含核苷酸的人造血细胞，其中的核苷酸具有限定RNA化合物或在转录后产生RNA化合物的序列，所述的RNA化合物包括以在HIV-1 SF-2分离物的核苷酸5849处的GUA靶位点或其它HIV-1分离物的相应靶位点为靶的核酶。

2.权利要求1的细胞，其中所述的核酶能够抑制人造血细胞中的HIV-1复制。

3.权利要求1的细胞，其中所述的核酶具有下式结构：

其中各X代表相同或不同的核糖核苷酸；

其中各A，C，U和G代表核糖核苷酸；

其中3’-AAG....AGUCX-5’限定保守的催化区；

其中(X)_nA限定核苷酸，这些核苷酸的序列包含与所述的靶位点的5’端紧邻的核苷酸序列杂交的序列，n限定核苷酸的数目；

其中(X)_n’限定核苷酸，这些核苷酸的序列包含与所述的靶位点的3’端紧邻的核苷酸序列杂交的序列，n’限定核苷酸的数目；

其中各*代表位于其任一侧的核苷酸之间的碱基配对；

其中每条实线代表位于其任一侧的核苷酸之间的共价键；

其中a代表一个限定核苷酸数目的整数，前提是a可以是0或1，而且如果是0，则位于(X)_a的5’端的A与位于(X)_a的3’端的X键合；

其中各m和m’代表大于或等于1的整数；和

其中(X)_b代表寡核苷酸，b代表大于或等于2的整数。

4.权利要求1的细胞，其中核酶具有下列结构：

其中各X相同或不同，代表核糖核苷酸；

其中各A，C，U和G代表核糖核苷酸；

其中3’-AAG....AGUCX-5’限定保守的催化区；

其中(X)_nA限定核苷酸，这些核苷酸的序列包含与所述的靶位点的5’端紧邻的核苷酸序列杂交的序列，n限定核苷酸的数目；

其中(X)_n’限定核苷酸，这些核苷酸的序列包含与所述的靶位点的3’端紧邻的核苷酸序列杂交的序列，n’限定核苷酸的数目；

其中每条实线代表位于其任一侧的核苷酸之间的共价键；

其中m代表2-20的整数；和

其中核苷酸(X)_m中没有一个与所述化合物内的任何其它核苷酸Watson-Crick碱基配对。

5.权利要求1的细胞，其中所述的核酶具有下列结构：

其中各X相同或不同，代表核糖核苷酸；

其中各A，C，U和G代表核糖核苷酸；

其中3’(X)_P4...(X)_P1-5’限定保守的催化区；

其中(X)_F4限定核苷酸，这些核苷酸的序列包含能够与所述靶位点的5’核苷酸序列杂交的序列；

其中(X)_F3限定核苷酸，这些核苷酸的序列包含能够与所述靶位点的3’核苷酸序列杂交的序列；

其中F3代表限定(X)_F3中核苷酸数目的整数，条件是F3大于或等于3；

其中F4代表限定(X)_F4中核苷酸数目的整数，条件是F4为3-5；

其中各(X)_P1和(X)_P4代表具有预定序列的寡核苷酸，该预定序列使(X)_P4与(X)_P1的3-6个碱基能够碱基配对；

其中P1代表限定寡核苷酸中的核苷酸数目的整数，条件是P1是3-6，并且P1与F4的总和等于9；

其中(X)_P2和(X)_P3各代表具有预定序列的寡核苷酸，该预定序列使(X)_P2与(X)_P3的至少3个碱基配对；

其中各*代表位于其任一侧的核苷酸之间的碱基配对；

其中每条实线代表一个能够给位于其任一侧的核苷酸之间提供共价键的化学键；

其中每条虚线独立地代表给位于核苷酸任一侧的核苷酸之间提供共价键的化学键或者没有任何所述的化学键；和

其中(X)_L2代表可能存在或不存在的寡核苷酸，条件是如果(X)_L2存在，则L2代表大于或等于3的整数。

6.权利要求1的细胞，其中核酶与一种反义核酸化合物共价相连，该反义核酸化合物与位于所述靶位点的3’或5’端的HIV病毒的预定序列杂交。

7.权利要求1的细胞，其中核酶与至少另外一种有或没有反义分子与其共价连接的核酶共价连接，并且以HIV病毒的基因组的不同区域为靶。

8.权利要求6的细胞，所述HIV基因组的不同区域选自长末端重复序列、5’非翻译区、剪接供体-受体位点、引物结合位点、3’非翻译区、gag、pol、蛋白酶、整合酶、env、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx和tev区。

9.权利要求7的细胞，其中所述的另外一种核酶以HIV SF-2分离物的核苷酸编号5792，5849，5886或6042处的靶位点或其它HIV分离物的相应靶位点为靶。

10.权利要求1的细胞，其中所述的核苷酸是转移载体构建体的一部分。

11.权利要求10的细胞，其中所述转移载体构建体含有HIV长末端重复序列、腺病毒相关转移载体，SV40启动子，Mo-MLV或两亲反转录病毒载体。

12.权利要求11的细胞，其中转移载体构建体是反转录病毒载体。

13.权利要求1的细胞，其中核酶在反转录病毒LTR启动子的控制下表达。

14.权利要求12的细胞，其中核苷酸位于反转录病毒转移载体的新霉素抗性基因的3’未翻译区。

15.权利要求10的细胞，其中所述转移载体构建体衍生自LNL6载体。

16.权利要求1的细胞，其中至少核苷酸的一部分具有下述序列：

CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGA

GTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAA

ACACCCAA

其中每个T、G、A和C代表一个核苷酸。

17.权利要求1的细胞，其中至少核苷酸的一部分具有下述序列：

TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC

其中每个T、G、A和C代表一个核苷酸。

18.权利要求1的细胞，其中至少核苷酸的一部分具有下述序列：

GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG

其中每个T、G、A和C代表一个核苷酸。

19.权利要求1的细胞，其中所述细胞是造血干细胞、祖细胞、定型的祖细胞、T淋巴细胞的祖细胞、不成熟的T淋巴细胞、成熟的T淋巴细胞、髓样祖细胞或单核细胞/巨噬细胞。

20.权利要求1的细胞，其中所述细胞是祖细胞。

21.权利要求1的细胞，其中所述细胞是T淋巴细胞。

22.一种寡核苷酸化合物，其中至少寡核苷酸化合物的一部分具有下列序列或由下列序列编码：

CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGA

GTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAA

ACACCCAA和

GTCAAAAATTGGCGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTCACCAGTCGCCG

其中每个T、G、A和C代表一个核苷酸。

23.一种寡核苷酸化合物，其中至少寡核苷酸化合物的一部分具有下列序列或由下列序列编码：

TTAGGATCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGGCTC

其中每个T、G、A和C代表一个核苷酸。

24.一种寡核苷酸化合物，其中至少寡核苷酸化合物的一部分具有下列序列或由下列序列编码：

CCTAGGCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTTCCTGTTAGGATCCTGATGA

GTCCGTGAGGACGAAACTGGCTCGCTATGTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAA

ACACCCAA

其中每个T、G、A和C代表一个核苷酸。

25.一种抗HIV感染的包含能产生RNA化合物的病毒载体的人体细胞，所述的RNA化合物包含其序列给催化RNA断裂的催化区域下定义的核苷酸和其序列给与核苷酸序列5’-TGGAGCCAGTAGATCCTAAT-3’杂交的核苷酸序列下定义的核苷酸，

其中RNA化合物抑制人体细胞中的HIV-1复制，因而使人体细胞能抵抗HIV的感染。

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