CN1177378A - 稳定的外部指导序列 - Google Patents

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Abstract

构建了介导特异性靶RNA裂解的修饰的外部指导序列(EGS)分子。该修饰的分子是RNA酶P的外部指导序列分子,设计成特异性地结合并启动RNA酶P介导的靶RNA分子裂解并增强了核酸酶抗性。特异性的区域修饰成达到稳定性增强且维持RNA酶P活性。构建了适用于治疗乙肝病毒感染的修饰的外部指导序列分子。

Description

稳定的外部指导序列
                     本发明的背景
本申请涉及设计成以RNA酶P进行RNA靶裂解的方法和外部指导序列组合物。
I.核酶和外部指导序列分子
核糖核酸(RNA)分子不仅可用作遗传信息的载体，例如，基因组逆转录病毒RNA和信使RNA(mRNA)分子，和作为蛋白质合成所必需的结构，例如，转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)分子，而且还可作为特异性地裂解核酸分子的酶。该催化性RNA分子称为核酶。
于1989年获得诺贝尔奖的Altman和Cech博士发现的催化性RNA在商业上的应用，特别是在治疗上引起了极大的兴趣(Altman，Prac.Ntl.Acad.Sci.USA 90：10898-10900(1993)；Symons，Annu，Rev.Biochem.61：641-671(1992)；Rossi等，Artisense Res.Dev.，1：285-288(1991)；Cech，Annu Rev.Biochhem.59：543-568，(1990))。已描述了催化性RNA(核酶)的一些类别，包括来自内含子核酶(WO88/04300，也见Cech.T.，Annu.Rev.Biochem.，59：543-568，(1990))，锤头状核酶(WO89/05852和EP321021，GeneShears)，斧头状核酶(WO91/04319和WO91/04324，Innovir)。
RNA酶P
另一类核酶包括酶的RNA部分，RNA酶P，它涉及转移RNA(tRNA)，蛋白质合成机制中的一种常见的细胞成份的加工。细菌RNA酶P包括2种成份，蛋白质(C5)和RNA(M1)。Sidney Altman及其合作者证实了M1 RNA能象完整的酶一样发挥功能，显示了在大肠杆菌中，RNA是必需的催化成份(Guerrier-Takada等，Cell 35：849-857(1983))。在随后的工作中，Altman博士和同事经过使用一种外部指导序列(EGS)建立了用于将实际上任意RNA序列转变成细菌RNA酶P的底物的方法，EGS在其5′端具有至少7个核苷酸互补于所要裂解的RNA3′至裂解位点的核苷酸，且在其5′端具有核苷酸NCCA(N是任意核苷酸)(WO 92/03566和Forster和Altman，Science 238：407-409(1990))。使用相似的原理，建立了用于真核系统的EGS/RNA酶P介导的RNA裂解，(Yuan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8006-8010(1992))。本文使用的“外部指导序列”和“EGS”指在靶RNA中形成RNA酶P活性裂解位点的任意寡核苷酸。
II.乙肝病毒(HBV)
HBV，引起肝脏持久性非细胞致病性感染的一组含DNA的小病毒中的一个成员是在全世界发现的人感染原，它永久存在于慢性携带者的大型人类群体中。估计占地球人口大约6-7％受到了感染(3亿携带者)。在全世界该感染的流行率不均匀。HBV的分布有一个地理梯度。在北美和西欧最低，在那里该病毒可检测到占人口的0.1到0.5％，而在东南亚和近撒哈拉的非洲地区最高，那里感染率可占人口的5％到20％。这种倾斜的分布与肝细胞癌相平行，且提供了慢性HBV感染与这类恶性肿瘤之间相联系的有力的流行病学证据。
乙型具有极大的医学重要性，因为它可能是慢性肝脏疾病包括人类肝细胞癌的最常见的起因。感染的肝细胞不断分泌在血液中高水平积累的病毒颗粒。这些颗粒有两类：(i)非感染性颗粒，由过剩的病毒衣壳蛋白(HBsAg)组成且不含核酸(浓度达到1013个颗粒/ml血液)，和(ii)感染性的，含DNA的颗粒(Dane颗粒)，由周围装配有含主要病毒衣壳蛋白，碳水化合物和类脂的27nm核衣壳核心(HBcAg)组成，以较低浓度存在(109个颗粒/ml血液)。人乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒家族的一个成员，与其亲缘关系较近的包括土拨鼠肝炎病毒(WHV)，鸭肝炎病毒(DHV)，和松鼠肝炎病毒(GHV)(Robinson(1990))。与逆转录病毒一样，嗜肝DNA病毒对其3.2kb DNA基因组进行逆转录(Pugh(1990))。乙肝病毒基因是环型且部分为单链，含有不完全的正链。不完全的正链与病毒颗粒中的DNA聚合酶复合，显示出使用完全质链为模板延伸正链。这些形态学和结构特征使乙肝病毒区别于所有已知的含DNA病毒的类型。
乙肝病毒的复制循环也明显区别于其它含DNA的病毒，且表明与含RNA的逆转录病毒有较近的亲缘关系。基本的反常特征是使用基因组RNA拷贝作为DNA基因组复制的中间体。感染性DNA基因组转变成双链形式，作为RNA转录的模板。多个RNA转录子从各感染的基因组合成，它具有信使功能或DNA复制功能。下文所称的“基因组前体”是子代DNA基因组的前体，因为它们装配成核衣壳核心并在从细胞中包被和输出前逆转录成DNA。因此，各成熟的病毒粒子含有RNA基因组前体的DNA拷贝和DNA聚合酶。
待合成的第一DNA是负链极性并在病毒遗传图谱的单个位点起动。非常小的新生DNA负链(不超过30个核苷酸)共价连接到蛋白质上，并很可能作为负链DNA合成的引物。负链DNA的生长伴随着前体基因组的协同降解，使该产物是全长的单链DNA，而不是RNA：DNA杂交体。正链DNA合成仅在负链完成后观察到，且在与负链5′端相近的单个位点起始。正链的完全延长对核衣壳核心的包被和输出是不需要的，因此，大多数细胞外病毒粒子在其基因组中含不完全的正链和较大的单链缺口。由于肝炎病毒基因组的复制是自主性的且不利用DNA到DNA的途经，其基因组的连续细胞内复制对于该病毒的维持是必需的。
组成病毒外壳的乙肝病毒表面抗原(HBsAgs)是由病毒S1前体，S2前体和S基因编码的多肽。主要的蛋白质是来自2.1kb亚基因组信息的226氨基酸的S基因产物。
III.急性前髓细胞的白血病(APL)
在成年人中大约10％的急性成骨髓细胞的白血病(AML)是急性前髓细胞白血病(APL，法美英分类(FAB)M3)，见Warrell等，New EnglandJ.Med.，329：177-189(1993))。该疾病典型地以一种出血性素质存在，常由化疗加剧，导致较高的早期死亡率，主要是死于颅内出血。这种出血性素质是由于存在恶性前髓细胞，它释放前体凝血剂物质。然后，这些物质激活凝血级联，排除纤维蛋白原，凝血因子和血小板。
尽管常规化疗在大多数病人中可达到完全缓和，但5年存活率平均只有百分之35到45。这些数字不包括较高的早期死亡率(Warrell等，(1993))。
治疗APL患者的第二条途径涉及使用视黄酸，特别是全反式视黄酸(ATRA：商标为tretioinTM，Hoffman La Roche，Nutley，NJ)。在一些公开的研究中，tretinoinTM能导致大约48％的所治疗的病人缓解(Warrell等(1993))；Huang等，Blood，72：567-572(1988)；Castaigne等Blood，76：1704-1709(1990)；Warrell等，New Engl.J.Med.，324：1385-1393(1991)；Cheson，New England J.Med.，327：422-424(1992))。然而，缓解的期限较短，平均3.5个月，随后病人表现出对视黄酸的获得性抗性。该抗性很可能解释为从血液中清除药物的能力增加，这是由于细胞色素P-450酶的诱导和细胞视黄酸结合蛋白的表达增强。目前极积进行视黄酸治疗与常规化疗的结合，早期的结果显示60至70％的治愈率(Cheson，New England J.Med.，327：422-424(1992))。
APL与非随机的染色体异常密切相关，该异常的特征是在染色体15和17(t(15；17))的长臂之间的平衡的和相互的易位，这在超过90％的来自APL的病人细胞中发现(kakizuka等，Cell，66：663-674，(1991)；de The等，Cell，66：675-684(1991)；Pandolfi等，Oncogene，6：1285-1292(1991)；Chang等，Mol.Cell.Biol.，12：800-810，(1992))。这种易位导致视黄酸受体基因(RARα)与一种推断的转录因子PML的基因融合。融合产物PML-RARα与野生型RARα基因产物相比表现出改变的反式激活特征，该野生型产物在与视黄酸(RA)的反应中充当转录增强子(Kakizuka等，Cell，66：663-674，(1991)；de The等，Cell.66：675-684(1991)；Pandolfi等Oncogene，6：1285-1292(1991))。已显示ATRA在体内(Warrell等，New England J.Med.，329：177-189，(1991)和在培养细胞(Lanotte等，Blood，77：1080-1086，(1991))中诱导白血病细胞的成熟，这解释了视黄酸的临床效果。该视黄酸(RA)的敏感性与PML-RARα基因产物的存在紧密相联(Lanotle等，Blood，77：1080-1086，(1991)；Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：2694-2698(1992))。从这些和其它发现(Grignani等，Cell，74：423-431(1993))，假定PML-RARα以主要的阴性突变发挥功能，其产物抑制髓样体分化。在APL病理形成中涉及PML-RARα蛋白质的证据是其在U937细胞中的表达，导致抑制分化，增强对RA的敏感性，并在培养基中存在有限血清时增强细胞存活率(Grignani等，Cell，74：423-431(1993))。
几乎所有的APL病人显出具有前面所述t(15∶17)易位的未成熟的前髓细胞。该易位在分子水平的精确定位是重要的，因为在融合接头中产生了不同的序列。对一系列的APL病人的研究显示，在各种PML-RARα转录子之间有很大程度的不均一性(Miller等，Proc.Natll.Acad.Sci.USA，89：2694-2698(1992)；Pandolfi等，EMBO.J.，11：1397-1407(1992))。有3种来源的可变性：(1)可选择在mRNA的PML的侧剪接，(2)可选择在PML-RARα侧(转录子3′端)的多聚腺苷化位点，(3)可变的融合点。对大量APL病例的研究表明，染色体17上的断点通常位于RARα序列内含子2内部(Miller等Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：2694-2698(1992)；Pandolfi等，EMBO J.，11：1397-1407(1992))。这导致相同的RARα序列存在于所有PML-RARα转录子变异体中。染色体15上的断点在PML基因上代替在定义为bcrl，bcr2和bcr3的3个不同区域的群集(Pandolfi等，EMBO J.，11：1397-1407(1992))。bcr1区域跨越PML基因内含子6的全长，涉及该断点的易位导致产生的成熟mRNA中，PML的外显子6和RARα的的外显子3一起剪接。bcr2区域横跨包含PML小部分内含子4，外显子5，内含子5和外显子6的区域。涉及该断点的易位基本上互不相同，且许多发生在PML外显子内，引起融合序列的大量变化，偶尔产生异常的阅读框，编码畸变和截短的蛋白质。bcr3区域位于PML内含子3内，一律产生PML的外显子3和RARα的外显子3一起剪接的mRNA。融合接头中的序列在所有bcr3的情况下是相同的。综合起来，bcr1和bcr3型接头占试验APL病例的至少80％(Pandolfi等，EMBO J.，11：1397-1407(1992))，一个研究发现bcr1型接头为bcr3型接头出现率的2倍(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：694-2698(1992))。
其它易位癌症
在文献中已报道许多其它的癌症起因于或与染色体易位相关。其例子包括RBTN2和T细胞急性白血病中的t[11；14][p13；q11]，淋巴样瘤中的红细胞生成，translin，急性淋巴母细胞淋巴瘤中的T[5；14][q34；q11]，泡状淋巴瘤中的T14；18染色体易位，非霍奇金氏淋巴瘤，霍奇金氏疾病；在人滑膜肉瘤中的T18易位；Burkitt氏淋巴瘤；Ewing肉瘤中的t[11；22][q24；q12]易位；人小细胞肺癌中的t[3p；6p]和t[12q；19p]易位；传播性纵隔瘤中的t[15；19]易位。在许多这类例子中，融合的转录产物或融合本身代表治疗靶，如果治疗剂能设计成选择性地杀死或灭活具有该易位的那些细胞。
因此，本发明的一个目的是提供治疗病毒性疾病和涉及异常转录产物的疾病的治疗剂及其使用方法。
本发明的另一个目的是提供对核酸酶降解抗性增强的RNA酶P的修饰的外部指导序列。
本发明的另一个目的是提供用RNA酶P的修饰的外部指导序列介导的裂解靶RNA分子的方法。
本发明的另一个目的是提供特异性地靶向肝炎的RNA酶P的外部指导序列，编码该外部指导序列的载体及其使用方法。
                    本发明的概述
真核RNA酶P的外部指导序列(EGS)分子改造成有效靶向且特异性地裂解靶RNA。设计并合成的构建的RNA分子含特异性的核苷酸序列，使RNA酶P的外部指导序列能优选结合并促进RNA酶P介导的肝炎病毒RNA的裂解。具有修饰的核苷酸或核苷酸连接物的这些改造的RNA分子的修饰形式设计成增强其对核酸酶降解的抗性。特异性的区域修饰成达到增强稳定性且维持RNA酶P的靶向活性。实施例证实了构建的RNA酶P的EGS分子结合并启动肝炎病毒RNA的RNA酶P的裂解。还公开了用于筛选构建体的测定EGS活性的方法及使用并产生该RNA分子的方法。
                       附图的简要描述
图1是具有核苷酸序列SEQ ID NO.4且在特异性区域具有化学修饰的EGS的结构图。
图2是具有核苷酸序列SEQ ID NO.2的EGS和具有核苷酸序列SEQ ID NO.1的短横型靶RNA的结构图。两个寡核苷酸的序列对比显示碱基配对形成RNA酶P样结构。RNA酶P裂解位点用箭头表示。
图3是具有核苷酸序列SEQ ID NO.2(INNO-102，INNO-102，INNO-102，INNO-102和INNO-102)或SEQ ID NO.3(INNO-139)的EGS结构图。含2′-O-甲基修饰的核苷酸用下面划线表示。
图4是图3所示的EGS分子的裂解效率图。
图5是具有核苷酸序列SEQ ID NO.2的各种EGS分子相对RNA酶P裂解效力(％)的图示。试验的所有EGS分子除INNO-102(wt)外，在两个识别臂，可变环和T型主干上完全用2-O-甲基修饰。对各EGS的另外的修饰在相应的图线段下面表示。2′-O-甲基修饰用下面划线表示。具有5′-硫代磷酸基因的核苷酸说明书中概要表示。
图6是具有核苷酸序列SEQ ID NO.3的各种EGS分子的相对RNA酶P裂解率(％)图。对各EGS的修饰在相应的图线段下以图解表示。未修饰的区域在图中以最细线表示。仅具有2′-O-甲基修饰的区域在图中以第二粗线表示。仅具有5′-硫代磷酸基团的区域在图中以第二粗线表示。具有2′-O-甲基修饰及5′-硫代磷酸基团的区域在图中以最粗线表示。
图7是在胎牛血清试验中显示修饰的EGS分子稳定性的表。对于各EGS，显示了相对裂解活性(％)和在试验中的半衰期。对各EGS的修饰在相应的表条目下以图示表明。未修饰的区域在图中以最细线表示。仅具有2′-O-甲基修饰的区域在图中以第二粗线表示。仅具有5′-硫代磷酸基团的区域在图中以第二粗线表示。具有2′-O-甲基修饰和5′-硫代磷酸基团的区域在图中以最粗线表示。
图8是显示用所有RNA和化学修饰的EGS分子对2.1kb HBV转录子进行RNA酶P介导的裂解试验的图示。对各EGS的修饰在相应的凝胶泳道下面以图示表示。
图9是具有核苷酸序列SEQ ID NO.5和在特定区域具有化学修饰的EGS结构的示意图。
图10是具有核苷酸序列SEQ ID NO.6和在特定区域具有化学修饰的EGS的结构示意图。
图11是具有核苷酸序列SEQ ID NO.4和在特定区域具有化学修饰的EGS的结构示意图。
图12是具有核苷酸序列SEQ ID NO.7和在特定区域具有化学修饰的EGS的结构示意图。
图13a，13b，13c和13d是靶向PML RAR融合接头的外部指导序列的结构和序列。图13a是EGS APL A20(靶APL RNA是SEQ IDNO.10的核苷酸7至24；EGS APLA 20是SEQ ID NO.11)；图13b是无活性对照A20D(SEQ ID NO.11减去核苷酸22和23)；图13c是EGSAPL 1009(靶APL RNA是SEQ ID NO.10的核苷酸6至22；EGS APL1009是SEQ ID NO.12)；图13d是无活性对照APL 1017(SEQ ID NO.11减去核苷酸14，17，18，29)。
图14a和14b是抑制细胞生长的MTT试验的图示，对于浓度为10μm(■)，9μm(□)，8μm(◆)，7μm(◇)，6μm(▲)，5μm(△)，4μm(●)，3μm(○)，2μm(×)，和1μm(※)的APL靶EGS A20(图14a)和无活性对照EGS(图14b)的光密度(即，细胞数量)对时间(天)的布点图。
图15a和15b是细胞生长抑制的MTT试验的图示，对于浓度为10μm(■)，9μm(□)，8μm(◆)，7μm(◇)，6μm(▲)，5μm(△)，4μm(●)，3μm(○)，2μm(×)，和1μm(※)的APL靶EGS 1009(图15a)和无活性对照EGS(图15b)的光密度(即，细胞数)对时间(天)的布点图。
图16是显示在裂解试验中EGS分子转换率的图示。图中绘制了裂解的HBV底物百分数对培养时间的布点图。
图17是显示名称和核苷酸序列的表，包括针对HBV的EGS分子的化学修饰。在这些序列中，“A”，“C”，“G”和“V”指2′-O-甲基核糖核苷酸。“A”，“C”，“G”和“V”指所示的核糖核苷酸。核苷酸之间的小写“s”指核苷酸之间的硫代磷酸键。核苷酸之间的所有其它键是磷酸二酯键。在一些EGS序列末端的标记“ T(3′-3′)-5指经3′至3′键附着到胸腺嘧啶核苷酸上，从而在这些EGS上形成的一个第二5′端。EGS序列是从头至尾，SEQ ID NO：14，SEQID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，和SEQ ID NO：25。
图18是显示靶向HBV的化学修饰的EGS的抗病毒活性的表。在栏显示各EGS的名称，中栏显示对各EGS测定的μm下的EC50，右栏显示各EGS靶向的HBV基因组的裂解位点。最后一排显示潜在的抗HBV核苷类似物2′-3′-ddC的EC50。
图19是显示EGS分子EGS2和EGS2A与HBV RNA中其靶序列杂交的核苷酸序列和结构的示意图。裂解位点的核苷酸用编号的箭头表示。主干结构后的数字指在主干中水及的碱基对数目。
图20是显示与在HBV RNA中其靶序列杂交的EGS分子EGS 62和EGS 62A的核苷酸序列和结构的图示。裂解位点的核苷酸用编号的箭头表示。主干结构后的数字指主干中涉及的碱基对数。
图21是显示体内表达EGS分子的以pol III启动子为基础的载体的结构图示。这一载体具有插入到以埃-巴二氏病毒(EBV)为基础的载体中的有效连接到人U6 RNA(hU6P)pol IV启动子上的编码EGS分子的区域。
图22是显示与HBV RNA中其靶序列杂交的EGS分子EGS 62B的核苷酸序列和结构的图示。在该裂解位点的核苷酸以编号的箭头表示。主要结构后的数字指主干中涉及的碱基对的数目。
图23是显示用从pol III启动子表达EGS的载体瞬时感染的HepG2、2、15细胞产生HBV的相对量的图示。各线段顶部的百分数是相对于用不表达EGS的载体感染的细胞产生的量所产生的HBV百分数。
                   本发明的详细描述
构建了适于启动靶RNA分子裂解的RNA分子。RNA分子是RNA酶P的外部指导序列(EGS)分子，它设计成特异性地结合并启动靶RNA分子的RNA酶P介导的裂解及具有增强的核酸酶抗性。已构建了适用于治疗乙肝病毒感染的RNA分子。
I.EGS分子的设计和合成
EGS分子是合成的寡核苷酸，它与靶底物结合形成相似于前体tRNA的真核RNA酶P天然裂解位点的二级和三级结构。使用RNA酶P裂解肝炎RNA序列的体外活性试验易于测定EGS分子靶向RNA酶P活性的能力，以下将作详述。在具有修饰的核苷酸或核苷酸连接物的EGS分子的情况下，稳定性试验允许测定各种类型的修饰对核酸酶的抗性。活性试验允许比较具有不同修饰的EGS分子介导的RNA酶P裂解效力。综合起来，这些试验用于优化和平衡修饰的EGS分子的稳定性和裂解效力。
已构建的示例性的EGS分子适用于治疗病毒性疾病和癌症。特异性的靶是乙肝病毒，更具体地说，是编码乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的RNA。由于HBsAg在病毒超级结构和感染中起主要作用，以EGS为基础的治疗剂可用于通过裂解HBsAg mRNA减量调节肝炎。乙肝RNA或其它靶RNA内优选的靶位点是在靶RNA的所有形式中都出现的保守序列区。在乙肝RNA的HBsAg编码区已鉴定了2个这种优选的位点并由具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸碱基序列的EGS分子靶向。
现在使用自动核酸合成生产或合成EGS分子和编码具有已知序列的EGS分子的DNA序列的方法是常规的，例如，在由应用生物系统公司(Foster City，CA)或Pharmacia Oligo Pilot(Pharmacia，Piscataway，NJ)提供的DNA 392型合成仪上使用氰乙基亚磷酰胺的方法。也可利用合成核酸分子的其它方法(例如，见Ikuta等，Ann，Rev.Biochem.53：323-356(1984)(磷酸三酯和亚磷酸三酯方法)；Narang等，MethodsEnzymol.65：610-620(1980)(磷酸三酯方法))。作为选择，可经过诸如用T7 RNA聚合酶转录DNA模板合成EGS分子(Mrlligan等，Nucl.Acids.Res.15：8783(1987))。也可以经过将编码和表达EGS的载体放入细胞在细胞中合成EGS分子。
A.EGS分子的活性
在不限量的RNA酶P存在的条件下，测量与各种量的构建EGS培养后剩余的底物RNA的百分数的体外裂解测定用作EGS/RNA酶P复合物的有效活性的指示剂。选择表现出最高体外活性的EGS/RNA酶P复合物用于后来的试验。可绘制剩余RNA的百分数作为EGS浓度的函数的曲线。EGS/RNA酶P的催化效力可用Kcat/Km表达(其中，Kcat是裂解的速度常数，Km是Michaelis常数)，它是自由EGS与底物RNA分子反应的二级速率常数。按Heidenreich和Echstein的方法(J.Biol.Chem.，267：1904-1909(1992))，使用下式测定Kcat/Km：
                -ln F/t＝(Kcat/Km)[C]
其中，F是底物剩余部分，t是反应时间，[C]是EGS浓度。
优选的EGS构建体是那些结合并启动肝炎底物RNA优选进行RNA酶P裂解的构建体。优选的构建体的选择可使用实施例1所述的核酶裂解试验并测定哪些构建体在介导肝炎底物RNA序列的特异性RNA酶P裂解中最有效，这可用上面所述的Kcat/Km值来测定。
B.EGS分子的构建
经过改变前体tRNA分子(前体tRNATYr)的基本结构并加入底物识别序列可设计EGS分子，例如，如WO92/03566(本文引用以供参考)所述。例如，可用与靶序列互补的序列取代氨酰受体主干和D主干的序列。这些取代的序列称为识别臂。与氨酰受体主干相应的识别臂称为A识别臂，与D主干相应的识别臂称作D识别臂。相应于tRNA序列和结构成份的剩余序列称为裂解靶向序列。选择识别臂的序列使具有与靶RNA紧靠所需裂解位点3′的序列特异性互补的区域。选择识别臂的序列，使靶向序列的互补区域互相相邻但以小的末配对区分开。这种关系的一个例子在图2中表示。识别臂可以是产生功能性EGS分子的任意长度。一般来说，3′端识别臂应至少是7个核苷酸长且具有至少7个核苷酸长的与靶RNA分子互补的区域。
已发现除了识别臂外，功能性EGS分子仅需要相应于前体tRNA的T主干和环的结构。因此，功能性EGS分子仅需要T主干和环作为其裂解靶向序列。EGS分子的T主干和环可以是产生功能性EGS分子，即介导靶RNA分子的RNA酶P裂解的EGS分子的任意长度和序列。例如，可使用任意tRNA T环序列。具有6，7和8个核苷酸的环长的EGS分子是有功能的。具有有限序列的EGS分子T环中的变化超过在tRNA T环序列中所发现的变化，且保留EGS功能。T主干可具有形成主干结构的任意序列。具有4，5和6个碱基对的主干长度的EGS分子预期是具有功能的。优选的T主干和环序列(SEQ ID NO.4的核苷酸7至23)在图1中显示。还发现在tRNA分子D主干和T主干之间出现的额外的或可变的环是EGS功能所不需要的。
因此，本文所述的EGS分子仅需要与靶序列互补的，附着于T主干和环5′和3′端的2个识别臂。EGS分子也可以含有与在tRNA前体分子中发现的那些相应的其它序列和结构，如D环或3′端NCCA序列。这些额外的序列和结构可认为是裂解靶向序列的一部分。EGS分子还可以在远端的一侧或两侧含有与靶向序列不互补且与tRNA结构不相关的序列。该序列不认为是识别序列或裂解靶向序列的一部分。
使用在Yuan等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：8006-8010(1992)中描述的试验或上文描述的试验易于筛选EGS分子启动靶RNA的RNA酶P裂解的能力。
可偶联EGS和RNA酶P的催化性RNA亚基以形成具有EGS靶向功能和RNA酶P催化性RNA裂解功能的单个寡核苷酸分子。在单个寡核苷酸分子中的这种结合称为RNA酶P内部指导序列(RIGS)。RIGS可以与EGS相同的方式用于裂解靶RNA分子。
可经过以任意合适的方式连接指导序列和RNA酶P催化性序列形成RIGS。例如，EGS和RNA酶P催化性RNA可作为分离的分子进行制备，然后在体外共价偶联。可选择地，可经过化学合成或经过体外或体内转录编码连接的EGS和RNA酶P催化性序列的DNA分子作为单个分子来合成完整的RIGS。RIGS的EGS与RNA酶P功能区之间的连接可以是允许该功能区裂解靶RNA的任何形式。例如，两个功能区可通过一个寡核苷酸连接子连接。优选的是，连接子可以由以磷酸二酯键连接的普通核苷酸组成。EGS和RNA酶P催化性序列成份可以以任一顺序相连，RNA酶P催化性序列可连接到EGS成份的3′端或5′端。构建和使用RIGS的方法在耶鲁大学的PCT申请WO95/24489中描述。
EGS分子也可以是可调节的。可调节的EGS分子是上面所述的EGS序列连接到配体结合序列上，将EGS分子的活性置于该配体的控制下，需要该配体的存在来激活或灭活。构建的RNA分子一部分能结合配体，而另一部分是EGS序列。选择结合配体的分子后，出现第二轮选择过程，其中在存在和缺乏配体或“辅助药品”的条件下测定配体结合分子的催化功能。以这种方式选择可调节的EGS分子用于在配体存在的条件下裂解靶RNA，或在缺乏配体的条件下裂解靶RNA。
该方法和可调节的EGS分子在以控制的方式裂解靶RNA分子中有用。当靶RNA分子存在于细胞中，要使这些RNA分子完全失活而不需要杀死宿主细胞时特别有用。可调性EGS分子的形成，选择和使用在PCT申请WO94/13791和WO94/13833(本文引用以供参考)中进行了充分的描述。
II.核酸酶抗性EGS分子
A.修饰类型
尽管未修饰的寡聚核糖核苷酸在无核酸酶环境中可作为有效的EGS发挥功能，但在血清中和在细胞内的短寿命减少了作为治疗剂的有效性。可进行化学修饰以极大地增强EGS的核酸酶抗性而不损害共诱导RNA靶的RNA酶P介导的裂解的生物学功能。例如，可使用方便的核酸合成方法用2′甲氧核糖核苷酸，硫代磷酸脱氧核糖核苷酸或硫代磷酸核糖核苷酸取代EGS构建体的一个或多个碱基(例如，见Offensperger等，EMBO J.，12：1257-1262(1993)；Rosenberg等的WO93/01286(硫代硫酸寡核苷酸合成)，Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，85：7079-7083(1988)；Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：7448-7794(1989)；Shaw等，Nacleic Acids Res，19：747-750(1991)(含3′端亚磷氨酰修饰的3′核酸外切酶抗性的寡核苷酸的合成)，本文引用以供参考)。
目前的文献已充分记载了寡核苷酸类似物的降解主要是由于3′-核酸外切酶。一些研究也证实了各种3′-修饰能极大地减小这些类似物的核酸酶敏感性。因此，减小对3′核酸外切酶的敏感性的另一方法是将一个自由氨基导入EGS分子的3′端羟基(例如，见Orson等Nucl.AcidsRes.，19：3435-3441(1991))。另一有用的3′端修饰是用3′至3′连接将胸腺嘧啶核苷酸偶联到EGS的3′端。这种结构在本文中称为3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸或T(3′-3′)。其它有用的修饰包括可能存在于序列中的胞嘧啶碱基的甲基化，插入剂如吖啶衍生物，共价连接到5′端磷酸上(例如，使用五亚甲基桥)以减小核酸分子对细胞内核酸酶的敏感性(例如，见Maher等Science，245：725-730(1989)；Grigoriev等，J.Biol.Chem.，267：3389-3395(1992))。
预期有用的另一类化学修饰是核苷酸核糖基团2′OH基的修饰，它显示出对各种细胞内和细胞外核酸酶的活性是关键的。典型的2′修饰是合成2′-O-甲基寡核苷酸(Paolella等，EMBOJ.11：1913-1919，1992)和2′-氟和2′-氨基-寡核苷酸(Pieken，等，Science，253：314-317(1991)；Heidenreich和Eckstain，J.Biol.Chem，267：1904-1909(1992))。核酸酶抗性EGS构建体的例子在图3和6中显示。EGS分子的部分也可含有脱氧核糖核苷酸。该取代经过消除关键的2′-OH基增强了核酸酶抗性。
Ribozyme Pharmaceuticals，Inc.的WO95/23225描述了增强核酶稳定性的化学修饰，如在核苷或核苷酸糖的5′碳处导入烷基。该修饰也可用于EGS分子。烷基指饱和的脂肪族烃，包括直链，支链和环烷基。优选的是该烷基具有1至12个碳原子。W95/23225还描述了可提供增强寡聚核苷酸稳定性的2′-脱氧-2′烷基核苷酸。例如，在对功能非必需的核苷酸糖分子2′位具有烷基的寡核苷酸更稳定。WO95/23225还描述了使用3′和/或5′二卤代磷酸盐取代的核苷酸，例如，3′和/或5′-CF2-磷酸酯取代的核苷酸。该核苷酸可用于EGS分子以增强其核酸酶抗性。
这类修饰影响使用该修饰的EGS分子启动靶RNA核酶介导的裂解的效力的程度使用上面描述的裂解试验易于测定。
B.嵌合EGS分子
上述修饰可用于EGS分子的限定区域和/或组合产生修饰的EGS分子的嵌合体。由于需要合适的核苷酸相互作用以形成有活性的三维结构，EGS分子某些区域的修饰比其它区域更合理。例如，已发现插入2′-O-甲基修饰的核苷酸和硫代磷酸连接物可导入EGS的某些区域而不明显减弱RNA酶P的靶向活性。还发现2′-O-甲基核糖核苷酸可取代与靶序列互补的序列和T主干中的任意核苷酸。在T环中只有部分核苷酸可用2′-O-甲基核苷酸取代而不明显影响核酶裂解。为了使核酶裂解活性达到最大，优选EGS分子T环部分的所有核苷酸包含未修饰的核糖核苷酸或具有硫代磷酸键的核糖核苷酸。实施例2，3和5说明了修饰的可能组合和修饰的核苷酸的优选的排列。
修饰影响该修饰的EGS分子启动靶RNA的RNA酶P介导的裂解效力的程度用上面描述的裂解试验易于测定。根据当与未修饰的EGS(即具有与修饰的EGS具有相同的核苷酸序列但由未修饰的核糖核苷酸，未修饰的磷酸二酯键和未修饰的3′和5′端组成的EGS分子)介导的核酶裂解活性相比修饰的EGS介导的核酶裂解活性的水平可分类化学修饰的EGS分子。该比较提供了由修饰的EGS分子介导的相对核酶裂解活性，优选以由未修饰的EGS分子介导的核酶裂解活性的百分数来表达。修饰的EGS分子可根据这些活性水平分类。以这种方式，例如可将修饰的EGS分子分成四类：(1)修饰的EGS分子介导大于未修饰的EGS所介导的核酶裂解活性的70％，(2)修饰的EGS分子介导50％至70％的未修饰的EGS所介导的核酶裂解活性，(3)修饰的EGS分子介导25％至50％的未修饰的EGS所介导的核酶裂解活性，和(4)修饰的EGS分子介导不足25％的未修饰的EGS所介导的核酶裂解活性。优选的修饰的EGS分子介导至少25％的未修饰的EGS所介导的核酶裂解活性。更优选的EGS分子介导至少50％的未修饰的EGS所介导的核酶裂解活性。最优选的EGS分子介导至少70％的未修饰的EGS所介导的核酶裂解活性。
III.克隆和表达载体
将EGS分子导入哺乳动物细胞的优选的载体包括病毒载体，如逆转录病毒，它将编码EGS分子的DNA直接导入核中，然后在核中转录DNA以产生所编码的EGS分子。
使用逆转录病毒载体进行基因治疗的方法的例子在美国专利号4868116和4980286；PCT申请WO90/02806和WO89/07136，Mulligan，Science 260：926-932(1993)中进行了描述，其教导本文引用以供参考。
可构建将其自身RNA序列以DNA的形式插入宿主染色体的缺陷型逆转录病毒载体以便将EGS插入宿主的细胞中，并在细胞中制备EGS的拷贝并释放进细胞质中或滞留在核中与肝类RNA的靶核苷酸序列相互作用。
骨髓干细胞和造血细胞可相当容易地从人类取出和替代，提供了一种用于繁裂转移的基因的自我再生性细胞群体。可用编码EGS分子的以逆转录病毒为基础的载体进行体内或体外转染该细胞。当进行干细胞的体外转染时，一旦转染的细胞开始产生特定的EGS分子，可将该细胞植入病人并建立表达EGS的整个细胞克隆群体，从而抵抗病毒感染，转化和其它疾病。
作为一个例子，用于克隆和表达编码DNA序列的构建体的载体可以包括：
1.克隆位点，用于插入所要表达的编码EGS分子的DNA序列。
2.哺乳动物复制起点(任选)，允许游离型(非整合型)复制，如来自Epstein-Barr病毒的复制起点。
3.在细菌细胞中有功能的复制起点，用于产生所需量的编码EGS构建体的DNA，如来自pBR322质粒的复制起点。
4.启动子，如来自Rous肉瘤病毒(RSV)，巨细胞病毒(CMV)的启动子，或指导所要表达的编码EGS构建体的插入的DNA序列在哺乳动物细胞中转录的哺乳动物U6基因启动子(一种RNA聚合酶III启动子)。
5.哺乳动物选择标记(任选)，如新霉素或潮霉素抗性，它允许选择用构建体转染的哺乳动物细胞。
6.细菌抗生素抗性标记，如新霉素或氨苄青霉素抗性，它允许选择用质粒载体转化的细菌细胞。
体内传递和表达EGS分子的优选的载体使用RNA聚合酶III(pol III)启动子用于表达。图21显示了该载体的一个例子的结构。该启动子可产生在结构上无细胞类型特异型表达的转录子。pol III启动子也产生构建成保留于细胞核中许多，靶RNA分子位置的转录子。优选的是，使用完整的pol III转录单位，包括pol III启动子，终端信号和终止序列。pol III启动子和其它pol III转录信号存在于tRNA基因，SS RNA基因，小核RNA基因和小胞质RNA基因中。优选的用于EGS表达载体的polIII启动子是人小核U6基因启动子和tRNA基因启动子。使用U6基因转录信号在体内产生矩RNA分子在Noonberg等，Nucleic Acids Res.22：2830-2836(1995)中有描述，使用tRNA转录信号由Thompson等，Nucleie Acids Res.，23：2259-2268(1995)描述，本文引用两篇文献以供参考。
许多pol III启动子是内部的，即它们位于转录单位内。因此，这些pol III转录子包括启动子序列。为了在表达EGS分子中有用，这些启动子序列不应干扰EGS的结构或功能。由于EGS分子来自tRNA分子，因此tRNA基因启动子序列易于插入EGS分子。tRNA基因的内部启动子以两个部分出现，一个A盒和一个B盒。在tRNA分子中，A盒序列一般存在于tRNA分子的D环和D主干的一半处，B盒序列一般存在于T环和T主干的邻近核苷酸中。最小的EGS分子保留T主干和环结构，B盒序列可以它们插入tRNA分子T主干和环相同的方式插入EGS的该部分。由于最小的EGS不需要D环或主干，A盒序列不必存在于EGS分子的任意功能结构中。例如，A盒序列可连接于EGS的5′端，位于D识别臂后，以便维持A盒与B盒之间的合适的剪接。
U6基因启动子不是内部的(Kunkel和Pederson，Nucleic Acids Res.18：7371-7379(1989)；Kunkel等。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8575-8579(1987)；Reddy等J.Biol.Chem.262：75-81(1987))。对于表达EGS分子有用的合适的pol III启动子系统在Hall等，Cell 29：3-5(1982)，Nielsen等，Nucleic Acids Res 21：3631-3636(1993)，Fowlkes和Shenk，Cell 22：405-413(1980)，Gupta和Reddy，NucleicAcids Res.19：2073-2075(1990)，Kickoefer等，J.Biol.Chem.268：7868-7873(1993)，和Romero和Balckburn，Cell 67：343-353(1991)中描述。表达核酶的pol III启动子的使用也在Ribozyme Pharmaceuticals Inc的WO95/23225中描述。
IV.治疗
A.药物组合物
EGS分子可直接与药学上可接受的载体结合使用以形成适于治疗病人的药物组合物。作为选择，EGS可经过含有编码和表达对特定RNA有特异性的EGS分子的序列的载体来传递。
直接传递涉及将预先合成的EGS分子插入靶细胞，通常借助于有利于穿过细胞膜的类脂复合物(脂质体)和其它分子，如抗体或其它小配体以增大靶向性。由于RNA对降解的敏感性，在许多情况下，直接传递的EGS分子可经化学修饰，使它们具有核酸酶抗性，如上所述。该传递方法允许更精确地监控治疗剂量。
载体介导的传递涉及用自我复制或非复制系统，如修饰的病毒载体或质粒感染靶细胞，产生大量由载体携带的序列编码的EGS。细胞的靶向和进入的机制可由病毒提供，或者，如果使用质粒，可使用直接传递EGS分子所述相似两方法。载体介导的传递产生持久不变量的EGS分子。与直接传递，如静脉内注射EGS分子相比，它基本上更便宜和需要较少次的用药。
在感染的急性关键期可使用直接传递方法。优选的是，使用静脉内或皮下注射直接传递EGS分子。有效量的寡核苷酸的传递以其到达目的靶位点前减小寡核苷酸的降解的形式是必需的。
最优选的是，药用载体特异性地将EGS传递给受影响的细胞。例如，肝炎B病毒影响肝细胞，因此，优选的药用载体将抗肝炎EGS分子传递给肝细胞。
B.EGS分子的传递
可采用两种传递方法，(1)合成EGS分子的传递，或(2)以瞬时方式传递表达EGS分子的载体。使用标准方法学，以基础研究确定选择的方法，也可能将它们结合使用。例如，经过使用阳离子脂质体制剂可有效地传递它们。
各种非载体方法也可用于将EGS分子传递给细胞。例如，一般来说，EGS分子或编码EGS分子的DNA序列可掺入进或到微颗粒上。本文使用的微颗粒包括脂质体，病毒体，合成和/或天然聚合物形成的微球体和微囊体。制备微囊体和微球体的方法是本领域的技术人员已知的且包括溶剂蒸发，溶剂灌制，喷射干燥和溶剂延展。可掺入各种微粒的有用的聚合物的例子包括多糖、聚酐、聚原酸酯、聚羟基化物和蛋白质和肽。
可用标准方法生产脂质体，如Kim等，Biochem.Biophys.Acta.728：339-348(1983)；Liu等，Biochim.Biophys.Acta.1104：95-101(1992)；和Lee等，Biochim.Biophys.Acta.，1103：185-197(1992)；Wang等，Biochem.，28：9508-9514(1989))中所报道的方法，本文引用以供参考。EGS分子或编码该分子的DNA当以微型颗粒制品提供时可包装进脂质体。简单地说，选择类脂，溶于有机溶剂，混合并在真空中干燥到玻璃管底部。使用待包封的EGS分子，编码EGS分子的DNA的水缓冲液重新水合脂膜，然后所得的水合脂载体或包装有物质的脂质体可经离心洗涤并过滤，贮存于4℃。这一方法已用于将核酸分子传递进MOLT-3白血病细胞系细胞的核和胞质中(Thierry和Dritschilo，Nucl.Acids Res.，20：5691-5698(1992))。作为选择，EGS分子或编码该分子的DNA可经离子或共价方式掺入微颗粒内，或结合到微颗粒外。
阳离子脂质体或微囊体是在传递诸如核酸基的化合物的带负电的化合物中特别有用的微颗粒，核酸基的化合物可经离子作用结合到这些脂质体带正电的外表面上。以前已列出的许多阳离子脂质体在将核酸或核酸蛋白复合物传递给体外和体内的细胞中非常有效，如Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417(1987)；Felgner，Advanced Durg Delivery Reviews，5：163-187(1990))；Clarenc等，Anti-Cancer Durg Design.8：81-94(1993)中所报道的，本文引用以供参考。使用包括一种或多种类脂的混合物可制备阳离子脂质体或微囊体，该脂类含有足够数量的阳离子侧基，使从该混合物形成的脂质体或微囊体具有净正电荷，能以离子键结合带负电荷的化合物。可用于生产阳离子脂质体的带正电的类脂的例子包括氨基脂，二油酰磷脂酰乙醇胺(PE)，它具有带正电荷的伯胺头部基团；磷脂酰胆碱(PC)，它具有不是伯胺的带正电的头部基团；和N[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三乙铵(“DOTMA”，见Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417(1987)；Felgner等，Nature，337：387-388(1989)；Felgner，Advanced Drug Delivery Reviews，5：163-187(1990))。
用于传递EGS分子的微颗粒的优选形式是携带血红素的微颗粒。在这些微颗粒中，血红素插入或共价连接到微颗粒的外表面。携带血红素的微颗粒的优势在于：由于它们优先结合并被表达血红素受体的细胞，如肝细胞，吸收，为有效剂量所需的药物或其它化合物的量明显减少。这种靶向传递也可减小在非靶向传递方法中使用相当高药物浓度引起的全身性副作用。用于形成携带血红素的微颗粒的优选的脂类是1，2-二油酰氧-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)和二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)。携带血红素的微颗粒的生产和使用在Innovir的PCT申请WO95/27480中描述。
核酸也可经在阳离子脂质体包被或涂覆其上，经静脉内注射入哺乳动物。该系统用于将DNA导入成年小鼠多组织的细胞中，包括内皮和骨髓，此处存在造血细胞(例如，见Zhu等，Science，261：209-211(1993))。
含EGS分子或编码这些分子的DNA的脂质体可用对于将抗肝炎EGS分子传递到靶向细胞有效的量经内吸性，例如，经静脉内或腹膜内用药进行给药。当与合适的微型颗粒结合使用时，其它可能的途径包括经过皮肤或口服。一般来说，施用给个体的与脂质体相联的核酸的总量应小于为相同所需或试图达到的效力所必须施用的未相联的核酸的总量。
包括多种聚合体(如聚乳酸与聚乙醇酸共聚体，聚乙烯和聚原酸酯)和抗肝炎EGS分子或编码该分子的DNA的组合物可经过使用插管或注射器局部传递给合适的细胞。将该组合物局部传递给细胞的其它方式包括使用输注泵(例如，Alza公司，Palo Alto，California的产品)或将组合物掺入聚合植入体(例如，见Johnson和Lloyd-Jones.编辑，药物传递系统(Chichester，England：Ellis Horwood Ltd.，1987))。它可将治疗性抗肝炎EGS组合物持久释放到植入体邻近区域而发挥效力。
下面提供的实施例用于说明目的及进一步的指示。
                         实施例
实施例1：寡核苷酸的合成，用于构建和分析EGS分子的质粒和转录反应。
寡核苷酸：根据Ogilvie等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：5764-5768(1988)的方法，采用5′-二甲氧基三苯甲基-2′-甲基硅-核糖核苷3′-CE-亚磷酰胺(Biosearch，MA，或ChemGenes Corp.，MA)制备寡聚核糖核苷酸(RNA)。使用Biosearch或Glen Research RNA合成方法合成2′-O-甲基寡聚核糖核苷酸(2′-O-甲基RNA)，亚酰胺购自Biosearch或Glen Research。合成在Millipore 8909 Experdite DNA/RNA合成仪上进行。可控孔度玻璃(CPG)用作固体支持基质。偶联时间为大约13分钟。为了合成含硫代磷酸键的类似物，用硫化代替氧化，使用Beaucage试剂进行10到15分钟。以三苯甲基测量试验的平均偶联产率为96至98％。
按Scaring等，Nucleic Acids Research，18：5433-5441(1990)的描述进行以支持物上裂解，碱基和磷酸去保护，去掉2′-O-TBDMS基团。在TBAF溶液中的粗制寡核苷酸在使用15-20％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶进行标准电泳纯化前在Sephadex G-25柱上脱盐。产物带以UV照射观察，切下并从凝胶基质上洗脱下来。洗脱的寡聚体最后在C18 Sep-Pak柱体上脱盐并经OD260测量定量。纯化的类似物的匀质性经5′端标记或分析性HPLC来检查。可用碱基组成分析来进一步鉴定它们，如Seela和Kaiser，Nucleic Acids Res.，15：3113-3129(1987)所述，硫代酸键的含量以31P-NMR测定。经过从含氨基的修饰的CPG支持物上开始合成进行3′端的末端修饰。
质粒：经过克隆跨越PML-RARα融合区的788核苷酸片段(SEQ IDNO.13的核苷酸1060至1848，相应于克隆B16的核苷酸1076至1739的PML序列和PML-RARα克隆B467的核苷酸1766至1890的RARα序列，de The等(Cell，66：675-684(1991)进入载体PCR1000(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)构建质粒pAPL7-5。该片段从细胞系的总mRNA中进行PCR扩增，其断点和序列与NB4细胞系相同(de The等，Lanotte等，Blood，77：1080-1086(1991))。融合区的序列证实与前面所报道的相同(de The等)。将该质粒的EcoRI/Hind III限制性片段克隆进载体pGEMTM-3Z(Promega，Madison，Wisconsin)以产生质粒pAPL-3Z3。
转录：在含40mM Tris-HCl，pH7.5，18mM MgCl2，1mM亚精胺，5M同DTT，2000U/ml胎盘RNA酶抑制剂(Promega)，各3mM的ATP，UTP，CTP和GTP，50μCi的α-[32P]-rNTP(通常是CTP、New England Nuclear)和3000U/ml的T7 RNA聚合酶(New EnglandBiolabs)的100μl反应物中进行线型质粒(2.5μg)的失控转录。HindIII-线型化的pAPL-3Z3的转录产生含PML-RARα788个核苷酸和载体序列3′端大约60个核苷酸的转录子。使用基本上按Milligan等(Nucl.Acids Res.，15：8783-8798(1987))所述的标准方法，使用跨越启动子区的完全编码链和部分互补链进行从寡核苷酸的转录。所有转录在37℃下进行2到16小时并经过加入120μl终止混合液(甲酰胺，EDTA和痕量染料)终止反应。然后，反应混合物在90℃加热3分钟，在冰上冷却，并在尿素/聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳。
经过紫外光照射观察转录产物，切下合适的带并从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱。纯化的RNA重悬于水中并贮存于-20℃。
RNA酶P裂解试验：一般根据Yuan等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：8006-8010(1992)(本文引用以供参考)所述的方法进行裂解反应。简单地说，短底物反应达到总体积31μ，其中含50mM Tris-HClpH7.4，10mM MgCl2，25mM KCl，0.1mM EDTA，EGS浓度为200nm，靶分子浓度为20nm或更少。反应物在37℃培养1小时。培养后，反应溶液与上样缓冲液(98％甲酰胺，100mMEDTA，0.025％溴酚兰)混合。经过在含7M尿素的15％丙烯酰胺凝胶上电泳将裂解的底物和未裂解的分开。在分子动力学磷成像仪(Molecular DynamicsPhosphorimager)上将带定量。
使用β显示凝胶分析仪(Betagen)从干凝胶中计数相应于前体RNA底物和所得的2个裂解产物的带。
基本上按Bartkiewicz等Genes Dev.3：388-499(1989)(本文引用以供参考)的描述经DEAE Sepharose色谱和甘油密度梯度离心纯化RNA酶P。
为了试验具有较长靶RNA分子的裂解，使用不同的反应条件。在总体积为10μl的反应物中含40mM Tris-HCl(pH7.4)，10mMMgCl2，1mM亚精胺，10mM二硫苏糖醇，0.05μgμl无核酸酶牛血清白蛋白，0.01％(v/v)Triton-X100，0.8单位/μl RNASIN，0.2mM ATP，0.2mM GTP，0.2mM UTP，0.2mM CTP，0.1μCi/μl[a32P]CTP.2mMm7G(5′)pppG，0.06μg/μl酵母RNA，25mM KCl，3单位的T7 RNA聚合酶，250nM EGS，1μl的人RNA酶P和3ng/μl线型化的质粒。经过加入线型化的质粒启动反应，在37℃温育30分钟。经过加入10μl 80％的甲酰胺，10mM EDTA，0.1％溴酚兰终止反应。在90℃加热2分钟后，样品在5％变性的聚丙烯酰胺凝胶上48瓦电泳2小时。60℃真空干燥1小时后，经磷成像分析凝胶。
在各试验中残留的前体RNA底物的百分数以EGS浓度为函数绘图，催化效力以Kcat/Km(其中Kcat是裂解的速度常数，Km是Michaelis常数)，自由EGS和底物反应的二级速度常数来表达。按照Heidenreich和Eckstein的方法(J.Biol.Chem.，267：1904-1909(1992))，使用公式-ln F/t＝(Kcat/Km)[C]测定裂解反应的效力，其中F是RNA底物的剩余部分，t是反应时间，[C]是EGS浓度。
胎牛血清稳定性试验：在胎牛血清(FCS)试验中试验修饰的EGS分子的核酸酶抗性。Shaw等Nucleic Acids Res，19：747-750(1991)报道了10％FCS加热灭活时，非常相似于人血清。试验条件非常相似于以前Hoke等，Nucleic Acids Res.19：5743-5748(1991)所描述的。简单地说，待测EGS类似物是用T4多核苷酸激酶和[γ-35S]ATP进行5′端标记(该方法可产生对去磷酸化有抗性的放射标记的寡核苷酸)。然后经过苯酚/氯仿提取，随后用Sephadex G-25旋转柱过滤纯化标记的EGS。纯化的EGS与冷EGS和10％加热灭活的胎牛血清(FCS)混合，使EGS终浓度为大约5μm。处理EGS类似物超过24小时。在不同时间点从反应混合物提取等份试样，与2X上样染料混合，在90℃加热灭活3分钟，然后于-20℃贮存。在12％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶上分析结果。
实施例2：构建介导HBsAg RNA的RNA酶P裂解的EGS分子
设计人外部指导序列(EGS)分子以在编码HBsAg的RNA中产生RNA酶P裂解。在靶存在的条件下，EGS分子形成tRNA样结构，诱导RNA酶P的裂解。
靶向HBsAg的EGS构建体：EGS序列HBV102(SEQ ID NO.2)，HBV#1(SEQ ID NO.5)和HBV#2(SEQ ID NO.6)设计成靶向编码肝炎B表面抗原(HBsAg)的RNA的保守区。如图2所示，HBV102识别臂的一个序列(A识别臂；SEQ ID NO.2的核苷酸25至31)与编码HBsAg序列中的7个核苷酸(SEQ ID NO.1的核苷酸13至19)互补。HBV102的另一识别臂的序列(D识别臂；SEQ ID NO.2的核苷酸1至4)与编码HBsAg的序列中的4个核苷酸(SEQ ID NO.1的核苷酸22至25)互补。因此，该靶序列含有与两个未配对的核苷酸分开的EGS的2个识别臂互补的2个区域。
无可变环的EGS：EGS构建体HBV140(SEQ ID NO.3)设计成靶向与HBV102编码肝炎B表面抗原之RNA的保守区域。HBV140的识别臂具有与HBV102的识别臂相同的序列。具体地说，HBV140的A识别臂的序列(SEQ ID NO.3)的核苷酸22至28)与HBsAg编码序列的7个核苷酸(SEQ ID NO.1的核苷酸13至19)互补。HBV140的D识别臂的序列(SEQ ID NO.3的核苷酸1至4)与HBsAg编码序列的4个核苷酸(SEQID NO.1的核苷酸22至25)。EGS HBV140仅28个核苷酸长。
含2′-O-甲基的EGS分子：制备含一些2′-O-甲基核苷酸的以HBV102和HBV140为基础的一些EGS分子。按以前的描述在自动寡核苷酸合成仪中制备寡核苷酸，除了核苷酸试剂中含2′-O-甲基。以三苯甲基测量分析平均偶联产率范围为96至98％。完成去保护后，经变性凝胶电泳纯化完全去保护的寡核苷酸，经5′端标记，分析性HPLC，碱基组成分析和31P-NMR评价其纯度。图3显示了构建的一些修饰的EGS分子。这一系列允许试验EGS分子能被2′-O-甲基化且仍保留EGS功能的程度及由这些修饰提供的核酸酶抗性的程度。
2′-O-甲基/硫代磷酸嵌合的EGS分子：制备含硫代磷酸核苷酸键及一些2′-O-甲基核苷酸的基于HBV102和HBV140的一些EGS分子。EGS分子的不同区域是未修饰的，2′-O-甲基化的，硫醇盐化的，或两者。所得的分子是修饰的嵌合体。按以前的描述在自动寡核苷酸合成仪中制备这些寡核苷酸，除了核苷酸试剂含有上面所述的2′-O-甲基基团。使用Beaucage试剂进行硫化10至15分钟。图3显示了构建的一些修饰的EGS分子。这一系列允许试验EGS分子能被2′-O-甲基化并仍保留EGS功能的程度及由这些修饰提供的核酸酶抗性的程度。
实施例3：测量EGS的裂解活性
使用实施例1中所述的RNA酶P裂解试验以测定裂解反应的效力以分析实施例2所述的EGS构建体。图1描述了使用短底物的模型系统，它用于评价修饰的EGS分子在诱导RNA酶P介导的靶裂解中的能力。短底物的序列(SEQ ID NO.1)来自全长基因组前体HBV RNA。该数据在图4，5和6中提供。
2′-O-甲基取代：2′-O-甲基-寡聚核糖核苷酸作为合理的修饰选择具有一些优选的特征。这些类似物的合成非常相似于DNA合成：它们比DNA类似物对RNA靶具有更好的结合亲和力且所得的双螺旋具有RNA-RNA双螺旋(A-形)和DNA-DNA双螺旋(B-型)之间的结构。另外，证实它们对RNA-或DNA特异性的核酸酶的降解具有较好的抗性。图3显示了具有2′-O-甲基残基的所有RNA EGS(INNO-102)的不同片段的系列顺序取代。取代的核苷酸以在下面划线来表示。如图4所示，识别序列(INNO-108)的取代不影响RNA酶P介导的靶裂解相对于野生型EGS的效力。另一方面可变环(INNO-109)和T主干(INNO-110)的进一步取代导致活性进一步和额外的减小。然而，许多失去的活性可经过去掉可变环(INNO-139)而恢复。结果，全部RNA EGS识别序列和T主干被2′-O-甲基RNA残基的取代为RNA酶P完全耐受。与此明显相反，在T环(INNO-111)上7个核苷酸的取代导致修饰的EGS基本上无活性。这些结果表明：T环中的一些或全部RNA残基对于维持EGS的正确的三级结构和/或与RNA酶P的特异性相互作用是关键的。
T环修饰：本系列修饰的目的是为了鉴定负责失去EGS活性的残基从而建立产生核酸酶抗性EGS类似物的可供选择的方案。最后，设计并试验了7个类似物。每个类似物具有完全2′-O-甲基取代的识别序列，可变环和T主干。另外，T环7个残基中的一个也用2′-O-甲基取代而剩下的6个位置保留为完整RNA(图5)。裂解试验的结果显示：第一个5′-U(INNO-124)和第3个5′-C(INNO-126)引起最显著的裂解效力减小。随后试验了除这2个关键残基外所有残基都用2′-O-甲基RNA取代的类似物134。不幸的是，类似物134仍只有非常小的活性。这可能暗示T环可能采取相互协同的结构，在该区域2′-O-甲基残基的聚集似乎明显破坏了这一结构。对于T环中7个残基中的3个被2′-O-甲基残基取代的类似物141也碰到了活性不可忽视的减小。根据这些资料，采用了另一类修饰，即用硫代磷酸主链代替磷酸二酯键。这两类修饰的结合产生了充分修饰的类似物143，其中T环区被硫代磷酸RNA取代，剩余的分子被2′-O-甲基残基取代。经过裂解试验评价，该嵌合EGS类似物仍保留野生型活性的大约70％。
主链修饰：尽管2′-O-甲基取代可为未修饰的EGS提供明显的核酸酶抗性，还研究了经过导入修饰的主链进一步增强稳定性。例如，检查了一系列2′-O-甲基硫代磷酸取代。以充分修饰的EGS143开始，硫代磷酸键选择性地加到该分子的不同区域(图6，INNO-151至INNO-154)。然而，这些类似物的体外裂解分析表明：用这些双倍修饰的残基进行的取代引起相当明显的和额外的活性损失。由于一些研究已显示在寡核苷酸末端的简单修饰可提供增强的核酸酶抗性，合成并试验3四个末端磷酸二酯键(3′端2个和5′端2个)被硫代磷酸主链取代的类似物155。如图6所示，末端封端的EGS类似物155当用纯化的人RNA酶P制品试验时仍能诱导有效的靶裂解。
末端修饰：分析了两类末端修饰。在一种情况下，3′和5′端都用2个2′-O-甲基硫代磷酸键加帽(INNO-155)；在另一种情况下，经过在修饰的CPG支持物上开始合成用氨基保护3′端(INNO-149)。如图8所示，两个类似物都能诱导2.1kb HBV RNA的RNA酶P介导的裂解，尽管类似物149似乎比类似物155更有效。
大型靶RNA的裂解：含有HBV AYW株2.1kb RNA编码序列的质粒pAYW2.1经过用Not I消化使之线型化，然后在[α32P]CTP存在的条件下用T7 RNA聚合酶转录。标记的转录子在各种EGS分子存在的条件下用RNA酶P在37℃保温30分钟。反应产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经磷成像分析。EGS介导的在2.1kb转录子靶位点的裂解产生大约1.7和0.4kb长的裂解产物，结果如图8所示。
对于泳道1(CTRL)，转录子用CAT-9 EGS培养，描述见Yuan和Altman，Science，263：1269-1273(1994)。CAT-9 EGS对HBV转录子无活性。与预期的一样，检测不到裂解。对于泳道2(EGS H62)，转录子与EGS H62保温，它是一种全RNA EGS，具有SEQ ID NO.3的序列，经过T7 RNA聚合酶转录DNA寡核苷酸制备。观察到2.1kb RNA的完全裂解。对于泳道3(EGS149)，转录子与INNO-149保温，它是一种化学合成的RNA，具有SEQ ID NO.3的序列，其修饰为：(1)在A识别臂，T主干和D识别臂的各各位置用2′-O-甲基修饰，(2)在T环各位置的硫代磷酸和(3)3′-氨基。观察到2.1kb RNA大部分被该EGS裂解。对于泳道4(EGS 155)用INNO-155保温转录子，它是一种化学合成的RNA，具有SEQ ID NO.3的序列，对其进行的修饰为：(1)在A识别臂的后4个位置，D识别臂的前4个位置和T主干的各位置为2′-O-甲基修饰，(2)在T环各位置为硫代磷酸，和(3)在A识别臂的前3个位置和D识别臂的后3个位置为2′-O-甲基硫代磷酸。观察到2.1kb被该EGS部分裂解。
使用实施例1所述的短底物试验在浓度各为20nM的INNO-140和INNO-139(图3所示)测量EGS介导的裂解的转换率。靶分子浓度为400nM，超出20倍。在各时间点，取出2μl等份试样并在10μl上样缓冲液中终止反应。结果在图16中所示。很明显对识别臂和T环的2′-O-甲基修饰不明显影响转换率。
实施例4：测量EGS的稳定性
为了评价不同修饰对修饰的EGS分子增加的核酸酶抗性的影响，使用实施例1中所述的胎牛血清试验分析实施例2所述的EGS构建体。结果在图7中概括。与预期的一样，全RNA EGS(INNO-140)在10％FCS中具有非常短的半衰期(不超过10分钟)。2′-O-甲基取代的INNO-139的半衰期大量增加但仍相对较短，很可能是由于存在未修饰的全RNA T环。用硫代磷酸RNA取代T环(INNO-143)将半衰期从2小时增加到接近10小时，增加2个2′-O-甲基硫代磷酸封(INNO-155)进一步将半衰期增加到超过18小时。
实施例5：APL EGS效力的检验
EGS的合成：在应用生物系统的394 DNA/RNA合成仪上化学合成靶向于PML RNAα的融合接头的2个EGS，APL A20(SEQ ID NO.11)和APL 1009(SEQ ID NO.12)。这些EGS的序列和其化学组成在图13a和13c中显示。在相应于EGS T环的序列中缺少2个核苷酸，此外相似于A20的EGS A20D在图13b中显示。在图13d中显示的EGS APL 1017在T环中缺少3个核苷酸，此外相似于APL 1009。对照EGS(A20D和APL1017)在RNA酶P存在的条件下不能诱导APL mRNA的裂解，但能与融合接头杂交。EGS经反相HPLC纯化，浓缩并悬浮于2M NaCl中以便将EGS转变成钠盐形成，用水充分透析并冻干。EGS悬浮于水中用于试管裂解分析或悬浮于150mM NaCl中用于细胞培养试验。
试管裂解分析：用Hind III限制性酶线型化的pAPL-3Z3质粒3ng在32P-ATP存在下按实施例1所述转录30分钟。在转录过程中向转录反应中加入0.25μM(终浓度)EGS和2μl来自HeLa细胞的RNA酶P的纯化制品(Bartkiewicz等，Genes and Development，3：488-499(1989))。反应产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离并使用分子动子学磷成像仪观察。
A20和APL1009都诱导APL RNA在融合接头的裂解，而A20D和APL 1017不能诱导APL RNA的裂解。
细胞培养试验：NB4细胞，一种含从急性前髓细胞白血病病人分离出的t(15；17)易位标记的成熟诱导的细胞系(Lanotte等，(1991))用于试验靶向PML-RNAα的EGS抗增生活性。这些细胞应答全反式视黄酸的成熟诱导效应。一个NB4细胞的亚克隆NB4/D5通常与视黄酸反应(Ahn等，(1995))，它用于细胞培养试验。NB4细胞在含10％胎牛血清(Intergen，Purchase，NY)，100U/ml青霉素，200μg/ml链霉素，200mM谷氨酰胺的RPMI培养基中37℃，5％的pCO2下生长。
所有处理以一式三份进行，实验重复超过一次。在对数生长期维持的NB4/D5细胞以1ml RPMI培养基中1×105个细胞的密度接种于24孔组织培养板上。向细胞中加入浓度不断增加的EGS。每24小时去掉超过90％的培养基并用含相同浓度的EGS的新鲜培养基取代。每24小时取出细胞等份试样并在这些细胞中进行MTT增生试验(描述见Mosmann等，Journal of Immunological Methods，65：55(1983))。
经MTT试验测量，EGS A20(图14a)和APL 1009(图15a)都抑制细胞生长，而相应的无活性对照A20D(图14b)和APL 1007(图15b)对细胞生长无影响。用超过3μM浓度进行观察，A20和APL 1009都显示出对NB4细胞生长的剂量依赖性抑制。
实施例6：EGS在表达HBV的细胞中的抗HBV的效力
为了鉴定在HBV RNA中，在合适的EGS存在下易于被RNA酶P裂解的序列，经体外转录合成了靶向HBV RNA各保守区的80种EGS并在实施例3所述的试验中使用HBV 2.1kb RNA转录子作底物试验其体外裂解诱导活性。这些试验揭示了RNA上在EGS存在下易于被RNA酶P裂解的一些位点。这些EGS的大多数限定于HBV RNA的2个明显的区域，HBV 2.1kb RNA上从大约核苷酸350到大约核苷酸700，及从大约核苷酸1425至大约核苷酸1625。这表明在HBV RNA内可能存在大型非结构区。该靶选择的方法也可应用于不同于HBV的靶RNA。
合成了12个显示出诱导体外裂解的EGS的化学修饰的和核酸酶抗性的形式。这些EGS的序列和化学成份在图17中显示。所有EGS在HepG2.2.15细胞中试验其对病毒复制的抑制，该细胞在组成上表面HBVRNA和完全装配的HBV颗粒(Sell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：1005-100(91987))。一般按Korba和Gerin(Antiviral Res.19：55-70(1992))所述进行该试验。EGS以与血红素脂颗粒，特别是与血红素相连的1，2-二油酰氧-3-(三甲铵基)丙烷(DOTAP)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(称为DDH)的复合物传递进细胞10天，使用点印迹试验分析分泌进培养基的HBV颗粒的DNA基因组。
一般按下述制备血红素脂颗粒。血红素(作为Fe原卟啉IX氯化物，高铁血红素)溶于含8.3mM NaOH的乙醇中，在14krpm离心10分钟沉淀不溶物。为了允许使用碳二亚胺进行有效的连接，经过加入少量体积的HCl而不沉淀血红素来降低血红素溶液的pH。在典型的反应中，200mg高铁血红素加入到10ml含8.3mM NaOH的乙醇中。将HCl加到上清血红素溶液中使pH下降为1.7，加入血红素溶液(含大约1.6mg血红素)，760μl(10μmol)DOPE(10mg/ml)和500μl(10mg/ml)，在室温下黑暗中允许进行连接过夜。向无菌玻璃试管的血红素连接的DOPE中加入溶于氯仿的10微摩尔DOTAP并在真空中在涡流干燥器内50℃处理20分钟使类脂干燥成薄膜。向类脂膜中加入1毫升无菌150mM NaCl并在Bransonic 1210水浴声处理器中声处理乳剂30分钟，操作在20℃47kHz下进行以产生混浊溶液。使用Lipex Extruder(LipexBiomembranes，Vancouver，Canada)将脂颗粒挤出多聚碳酸膜。
经过将含EGS分子的溶液加入150mM NaCl中，向EGS溶液中加入DDH类脂颗粒(于150mM NaCl)至终浓度为0.2mg/ml来制备EGS/类脂组合物。室温下培养15分钟后，加入培养基，稀释EGS/类脂混合物以获得具有所需EGS终浓度的EGS组合物。等体积的150mM NaCl用作对照。
HepG2.2.15细胞的汇合培养物在96孔平底培养板上维持。每个EGS处理使用2份平板。每个平板上总共3份培养物用各个稀释的EGS组合物处理。用10个连续日剂量的EGS组合物处理培养物。每天用新鲜的EGS组合物改变培养基。经过测量胞外HBV DNA水平监测这些处理的效应。
这些EGS的抗病毒活性在图18中显示。图18中中栏提供了列于左栏的EGS的EC50。EC50是相对于用对照组合物处理的细胞产生的HBV量减少50％时的化合物的浓度。作为对照，在相同试验中测量了2′-3′ddC，一种已知有效的抗-HBV核苷类似物的抗病毒效力。EGS的EC50可比得上2′-3′-ddC，表明这些EGS具有明显的抗HBV活性。
测量已接受EGS的细胞活性的酚红试验揭示的与施用EGS相关的毒性(定义为大于在未处理的细胞中观察到的染料吸收水平50％的抑制)表明复制抑制与任意有效的毒性无关。
实施例7：使用pol III启动子启动的表达载体表达抗HBVRNA的
         EGS
EGS2和EGS62的克隆：用XbaI和KpnI切割PREP9(Invitrogen，San Diego，CA)，一种以Epstein-Barr病毒为基础的载体(Yates等，Nature，313：812-815(1985)以去掉载体中的RSV LTR启动子序列，将244核苷酸的人U6启动子(hU6；从核苷酸+1至-244)克隆进该区域。在Applied Biosystems DNA合成仪上合成相应于EGS2和EGS62(分别见图19和20)的cDNA，纯化并克隆KpnI和BamHI之间的hU6启动子下游。使用XbaI和BamHI切割EGS序列和hU6启动子序列并在用BglII和NheI消化的pCEP4(Invitrogen，San Diego，CA)中亚克隆。
EGS 2A，EFS 62A和EGS 62B的克隆：用Bgl II t Kpn I消化pCEP4质粒以去掉CMV启动子，然后将包括U6基因5′封区的人U6启动子(从核苷酸+25至-244)克隆进该位点。在Applied Biosystems DNA合成仪上合成相应于EGS 2A，EGS 62A和EGS 62B(分别见图19，20和22)的cDNA，纯化并克隆在KpnI和BamHI位点之间的5′封区下游。
在细胞中扩增所有的质粒，使用Qiagen(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)柱纯化质粒DNA。然后使用实施例6中所述的DOTAP-DOPE-血红素(DDH)脂质体将纯化的质粒用于转染HepG2.2.15。HepG2.2.15细胞以3×105细胞/孔接种于6孔平板上。细胞在含4％胎牛血清的RPMI培养基中培养，当细胞变成60-80％汇合时进行转染。无EGS插入子的质粒载体也作为对照进行转染。使用Chomczynski-Sacchi所述的方法(Anal.Biochem.162：156-159(1987))在转染后2天和6天时从细胞中提取总RNA。对总细胞RNA进行RNA酶保护试验以确定EGS RNA，HBV RNA和GAPDH RNA的水平，该试验根据Bordonaro等的方法(Biotechniques 3：428-430(1994))使用相应的放射标记的反义RNA探针进行。在6％变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离保护的片段，使用分子动力学磷成像定量与保护带相关的放射活性。GAPDH RNA的定量用于规范样品。RNA酶保护试验证实在用各EGS-质粒构建体杂的细胞中表达EGS RNA。不同EGS的表达与对照相比导致HBV RNA表达的抑制程度化范围从29到53％(图23)。EGS 2A显示出HBV RNA表达的最大抑制，而对照质粒对HBV RNA水平无影响。
这些实验清楚地证实了使用pol III启动子表达抗HBV RNA的EGS导致HepG2.2.15细胞中HBV RNA水平的减小。
从上面的详细描述，本发明的方法的修饰和变化对本领域的技术人员而言是显而易见的。这些修饰和变化应落在所附权利要求的范围内。
               序列表(1)一般信息：
(i)申请人：伊诺瓦研究室公司
(ii)发明题目：稳定的外部指导序列
(iii)序列数：13
(iv)联系地址：
    (A)联系人：Patrea L.Pabst
    (B)街道：2800 One Atlantic Center
             1201 West Peachtree Street
    (C)城市：亚特兰大
    (D)街：乔治亚
    (E)国家：美国
    (F)邮编：30309-3450
(v)计算机可读形式：
    (A)媒体类型：Floppy disk
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patentin Release#1.0，Version#1.25
(vi)目前申请资料：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类：
(viii)代理/代理人资料：
    (A)姓名：Pabst，Patrea L.
    (B)登记号：31，284
    (C)参考/文卷号：ILI109CIP
(ix)电信资料：
    (A)电话：(404)873-8794
    (B)电传：(404)873-8795(2)SEQ ID NO：1资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：37个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：1序列描述：GUCCUCCAAU UUGUCCUGGU UAUCGCUGGA UGUUGUC(2)SEQ ID NO：2资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：2序列描述：CGAUACGGAA GGUUCGAAUC CUUCCCAGGA C(2)SEQ ID NO：3资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：28个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：3序列描述：CGAUGAAGGU UCGAAUCCUU CCCAGGAC(2)SEQ ID NO：4资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：4序列描述：NNNNNNGAAG GUUCGAAUCC UUCNNNNNNN(2)SEQ ID NO：5资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
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    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：5序列描述：AGCGAUGAAG GUUCGAAUCC UUCCCAGGAC(2)SEQ ID NO：6资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
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    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：6序列描述：AUGAUAGAAG GUUCGAAUCC UUCACGCCGC(2)SEQ ID NO：7资料：
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    (A)长度：30个碱基对
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    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：7序列描述：NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN(2)SEQ ID NO：8资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：24个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：8序列描述：NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNN(2)SEQ ID NO：9资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：31个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：RNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(xi)SEQ ID NO：9序列描述：
NNNNGAAGGU UCGAAUCCUU CNNNNNNNNN N
(2)SEQ ID NO：10资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：50个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑：线型
    (ii)分子类型：RNA
    (ix)特征：
        (A)名称/键：misc_特征
        (B)位置：1..50
        (D)其它信息：/功能＝“APL RNA”
    (ix)特征：
        (A)名称/键：misc_特征
        (B)位置：11；12
        (D)其它信息：/功能＝“融合接头”
    (xi)SEQ ID NO：10的序列描述：CGGGGAGGCA GCCAUUGAGA CCCAGAGCAG CAGUUCUGAA GAGAUAGUGC
(2)SEQ ID NO：11资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：35个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑：线型
    (ii)分子类型：RNA
    (ix)特征：
        (A)名称/键：misc_特征
        (B)位置：1..35
        (D)其它信息：/功能＝“APL EGS A20”
    (ix)特征：
        (A)名称/键：misc_特征
    (B)位置：22…23
    (D)其它信息：/功能＝“变异体(A20D)缺失位置22和23的U和U”
(ix)特征：
    (A)名称/键：mise_特征
    (B)位置：17...23
    (D)其它信息：/功能＝“17-23的序列是硫代磷酸RNA；分子剩余部分由2′-O-甲基RNA组成”
(xi)SEQ ID NO：11的序列描述：GGGUCUCAGG CCCGGGUUCG AUUCCCGGUG GCUGC
(2)SEQ ID NO：12资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑：线型
    (ii)分子类型：RNA
    (ix)特征：
        (A)名称/键：misc_特征
        (B)位置：1..31
        (D)其它信息：/功能＝“APL EGS 1009”
    (ix)特征：
        (A)名称/键：misc_特征
        (B)位置：14；17；18；29
    (D)其它信息：/功能＝“变异体(1017)在位置14，17，18和29(分别为U，A，A，和G)位缺失RNA”
    (ix)特征：
        (A)名称/键：misc_特征
        (B)位置：13.19
        (D)其它信息：/功能＝“13-19的序列是硫代磷酸RNA，分子剩余部分由2′-O-甲基RNA组成”
    (xi)SEQ ID NO：12的序列描述：GUCUCAAGAA GGUUCGAAUC CUUCGGCUGC C(2)SEQ ID NO：13资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：3511个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑：线型
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假定：无
(iv)反义：无
(ix)特征：
    (A)名称/键：misc_特征
    (B)位置：1..3511
    (D)其它信息：/功能＝“PML-RARαDNA序列”
(xi)SEQ ID NO：13的序列描述：CTCCCCTTCA GCTTCTCTTC ACGCACTCCA AGATCTAAAC CGAGAATCGA AACTAAGCTGGGGTCCATGG AGCCTGCACC CGCCCGATCT CCGAGGCCCC AGCAGGACCC CGCCCGGCCCCAGGAGCCCA CCATGCCTCC CCCCGAGACC CCCTCTGAAG GCCGCCAGCC CAGCCCCAGCCCCAGCCCTA CAGAGCGAGC CCCCGCTTCG GAGGAGGAGT TCCAGTTTCT GCGCTGCCAGCAATGCCAGG CGGAAGCCAA GTGCCCGAAG CTGCTGCCTT GTCTGCACAC GCTGTGCTCAGGATGCCTGG AGGCGTCGGG CATGCAGTGC CCCATCTGCC AGGCGCCCTG GCCCCTAGGTGCAGACACAC CCGCCCTGGA TAACGTCTTT TTCGAGAGTC TGCAGCGGCG CCTGTCGGTGTACCGGCAGA TTGTGGATGC GCAGGCTGTG TGCACCCGCT GCAAAGAGTC GGCCGACTTCTGGTGCTTTG AGTGCGAGCA GCTCCTCTGC GCCAAGTGCT TCGAGGCACA CCAGTGGTTCCTCAAGCACG AGGCCCGGCC CCTAGCAGAG CTGCGCAACC AGTCGGTGCG TGAGTTCCTGGACGGCACCC GCAAGACCAA CAACATCTTC TGCTCCAACC CCAACCACCG CACCCCTACGCTGACCAGCA TCTACTGCCG AGGATGTTCC AAGCCGCTGT GCTGCTCGTG CGCGCTCCTTGACAGCAGCC ACAGTGAGCT CAAGTGCGAC ATCAGCGCAG AGATCCAGCA GCGACAGGAGGAGCTGGACG CCATGACGCA GGCGCTGCAG GAGCAGGATA GTGCCTTTGG CGCGGTTCACGCGCAGATGC ACGCGGCCGT CGGCCAGCTG GGCCGCGCGC GTGCCGAGAC CGAGGAGCTGATCCGCGAGC GCGTGCGCCA GGTGGTAGCT CACGTGCGGG CTCAGGAGCG CGAGCTGCTGGAGGCTGTGG ACGCGCGGTA CCAGCGCGAC TACGAGGAGA TGGCCAGTCG GCTGGGCCGCCTGGATGCTG TGCTGCAGCG CATCCGCACG GGCAGCGCGC TGGTGCAGAG GATGAAGTGC   1080TACGCCTCGG ACCAGGAGGT GCTGGACATG CACGGTTTCC TGCGCCAGGC GCTCTGCCGC   1140CTGCGCCAGG AGGAGCCCCA GAGCCTGCAA GCTGGCGTGC GCACCGATGG CTTCGACGAG   1200TTCAAGGTGC GCCTGCAGGA CCTCAGCTCT TGCATCACCC AGGGGAAAGA TGCAGCTGTA   1260TCCAAGAAAG CCAGCCCAGA GGCTGCCAGC ACTCCCAGGG ACCCTATTGA CGTTGACCTG   1320CCCGAGGAGG CAGAGAGAGT GAAGGCCCAG GTTCAGGCCC TGGGGCTGGC TGAAGCCCAG   1380CCTATGGCTG TGGTACAGTC AGTGCCCGGG GCACACCCCG TGCCAGTGTA CGCCTTCTCC   1440ATCAAAGGCC CTTCCTATGG AGAGGATGTC TCCAATNACA ACGACAGCCC AGAAGAGGAA   1500GTGCAGCCAG ACCCAGTGCC CCAGGAAGGT CATCAAGATG GAGTCTGAGG AGGGGAAGGA   1560GGCAAGGTTG GCTCGGAGCT CCCCGGAGCA GCCCAGGCCC AGCACCTCCA AGGCAGTCTC   1620ACCACCCCAC CTGGATGGAC CGCCTAGCCC CAGGAGCCCC GTCATAGGAA GTGAGGTCTT   1680CCTGCCCAAC AGCAACCACG TGGCCAGTGG CGCCGGGGAG GCAGCCATTG AGACCCAGAG   1740CAGCAGTTCT GAAGAGATAG TGCCCAGCCC TCCCTCGCCA CCCCCTCTAC CCCGCATCTA   1800CAAGCCTTGC TTTGTCTGTC AGGACAAGTC CTCAGGCTAC CACTATGGGG TCAGCGCCTG   1860TGAGGGCTGC AAGGGCTTCT TCCGCCGCAG CATCCAGAAG AACATGGTGT ACACGTGTCA   1920CCGGGACAAG AACTGCATCA TCAACAAGGT GACCCGGAAC CGCTGCCAGT ACTGCCGACT   1980GCAGAAGTGC TTTGAAGTGG GCATGTCCAA GGAGTCTGTG AGAAACGACC GAAACAAGAA   2040GAAGAAGGAG GTGCCCAAGC CCGAGTGCTC TGAGAGCTAC ACGCTGACGC CGGAGGTGGG   2100GGAGCTCATT GAGAAGGTGC GCAAAGCGCA CCAGGAAACC TTCCCTGCCC TCTGCCAGCT   2160GGGCAAATAC ACTACGAACA ACAGCTCAGA ACAACGTGTC TCTCTGGACA TTGACCTCTG   2220GGACAAGTTC AGTGAACTCT CCACCAAGTG CATCATTAAG ACTCTGGAGT TCGCCAAGCA   2280GCTGCCCGGC TTCACCACCC TCACCATCGC CGACCAGATC ACCCTCCTCA AGGCTGCCTG   2340CCTGGACATC CTGATCCTGC GGATCTGCAC GCGGTACACG CCCGAGCAGG ACACCATGAC   2400CTTCTCGGAC GGGCTGACCC TGAACCGGAC CCAGATGCAC AACGCTGGCT TCGGCCCCCT   2460CACCGACCTG GTCTTTGCCT TCGCCAACCA GCTGCTGCCC CTGGAGATGG ATGATGCGGA   2520GACGGGGCTG CTCAGCGGCA TCTGCCTCAT CTGCGGAGAC CGCCAGGACC TGGAGCAGCC   2580GGACCGGGTG GACATGCTGC AGGAGCCGCT GCTGGAGGCG CTAAAGGTCT ACGTGCGGAA   2640GCGGAGGCCC AGCCGCCCCC ACATGTTCCC CAAGATGCTA ATGAAGATTA CTGACCTGCG   2700AAGCATCAGC GCCAAGGGGG CTGAGCGGGT GATCACGCTG AAGATGGAGA TCCCGGGCTC   2760CATGCCGCCT CTCATCCAGG AAATGTTGGA GAACTCAGAG GGCCTGGACA CTCTGAGCGG   2820ACAGCCGGGG GGTGGGGGGC GGGACGGGGG TGGCCTGGCC CCCCCGCCAG GCAGCTGTAG   2880CCCCAGCCTC AGCCCCAGCT CCAACAGAAG CAGCCCGGCC ACCCACTCCC CGTGACCGCC   2940CACGCCACAT GGACACAGCC CTCGCCCTCC GCCCCGGCTT TTCTCTGCCT TTCTACCGAC   3000CATGTCACCC CGCACCAGCC CTGCCCCCAC CTGCCCTCCC GGGCAGTACT GGGGACCTTC   3060CCTGGGGGAC GGGGAGGGAG GAGGCAGCGA CTCCTTGGAC AGAGGCCTGG GCCCTCAGTG   3120GACTGCCTGC TCCCACAGCC TGGGCTGACG TCAGAGGCCG AGGCCAGGAA CTGAGTGAGG   3180CCCCTGGTCC TGGGTCTCAG GATGGGTCCT GGGGGCCTCG TGTTCATCAA GACACCCCTC   3240TGCCCAGCTC ACCACATCTT CATCACCAGC AAACGCCAGG ACTTGGCTCC CCCATCCTCA   3300CAACTCACAA GCCATTGCTC CCCAGCTGGG GAACCTCAAC CTCCCCCCTG CCTCGGTTGG   3360TGACAGAGGG GGTGGGACAG GGGCGGGGGG TTCCCCCTGT ACATACCCTG CCATACCAAC   3420CCCAGGTATT AATTCTCGCT GGTTTTGTTT TTATTTTAAT TTTTTTGTTT TGATTTTTTT   3480AATAAGAATT TTCATTTTAA GCAAAAAAAA A                                  3511

Claims (29)

1.包含分离的寡核苷酸分子的外部指导序列，包含：
RNA酶P裂解靶向序列，和
与靶RNA分子上的靶向序列互补的识别序列，
其中，外部指导序列促进RNA酶P介导的靶RNA分子的裂解，且
其中，在外部指导序列中至少一个核苷酸选自修饰的核苷酸的未修饰的脱氧核糖核苷酸。
2.权利要求1的外部指导序列，其中识别序列包含A识别臂和D识别臂，其中A识别臂位于外部指导序列的3′端，D识别臂位于外部指导序列的5′端。
3.外部指导序列，包含的核苷酸碱基序列选自SEQ ID NO.2，SEQID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，和SEQ ID NO：25。
4.权利要求1的外部指导序列，其中靶RNA分子是乙肝RNA分子。
5.一种用于促进靶RNA分子裂解的组合物，其中该组合物包含存在于药学上可接受的传递系统中的权利要求1的外部指导序列。
6.权利要求5的组合物，其中药学上可接受的传递系统选自脂质体，病毒体，微球体和微囊体。
7.权利要求2的外部指导序列，具有结构：
Figure A9619232500031
其中，R代表3′-OH，3′-OPO(O)CH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，
Z代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)的核糖核苷酸或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，
V代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸或具有5′-磷酸(酯)的核糖核苷酸，
M代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，
X代表具有5′-磷酸(酯)的核糖核苷酸或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，
其中n大于0，m大于0，n和m的和大于3。
8.权利要求2的外部指导序列，具有结构：
其中：R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，
Y代表具有5′-磷酸(酯)或5′-硫代磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，
J代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，
L代表具有5′-磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，或具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，
S代表具有5′-硫代磷酸(酯)的核糖核苷酸，
其中，n大于0，m大于0，n和m之和大于3。
9.权利要求2的外部指导序列，具有结构：
其中：R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，
Y代表具有5′-磷酸(酯)或5′-硫代磷酸(酯)的2′-O-甲基核糖核苷酸，
A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)，
A，C，G和U代表所示的核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，
其中，n大于0，m大于0，n和m之和大于3。
10.权利要求2的外部指导序列，具有结构：
其中，R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NH2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，
A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)，
A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，
A，C，G和U代表所示的核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，
11.权利要求2的外部指导序列，具有结构：
其中：，R代表3′-OH，3′-OPO(O)OCH2CH(OH)-CH2NE2，3′-OPO(S)OCH2CH(OH)CH2NH2，或3′-3′-胸腺嘧啶核苷酸，
A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-磷酸(酯)，
A，C，G和U代表所示的2′-O-甲基核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，
A，C，G和U代表所示的核糖核苷酸，具有5′-硫代磷酸(酯)，
12.权利要求7的外部指导序列，其中靶RNA分了是乙肝RNA分子。
13.一种用于裂解靶RNA分子的方法，包括：
在促进RNA酶P裂解的条件下，将RNA酶P，靶RNA分子和外部指导序列接触，该外部指导序列包含含有下列结构的分离和寡核苷酸分子：
RNA酶P裂解靶向序列，和
与靶RNA分子上的靶向序列互补的识别序列，
其中外部指导序列促进RNA酶P介导的靶RNA分子的裂解，以及
其中在外部指导序列中至少一个核苷酸选自修饰的核苷酸和未修饰的脱氧核糖核苷酸。
14.权利要求13的方法，其中靶RNA分子是乙肝RNA分子，
其中接触步骤经过给病人或来自病人的细胞施用外部指导序列来实现，
其中外部指导序列存在于药学上可接受的传递系统中。
15.权利要求14的方法，其中的药学上可接受的传递系统选自脂质体，病毒体，微球体和微囊体。
16.一种抑制乙肝病毒的方法，包含给病人和来自病人的细胞施用编码外部指导序列的构建的表达载体，该外部指导序列包括：
RNA酶P裂解靶向序列，
与乙肝RNA分子上的靶向序列互补的识别序列，
其中外部指导序列促进乙肝RNA分子RNA酶P介导的裂解。
17.权利要求16的方法，其中构建的表达载体存在于药学上可接受的传递系统中。
18.权利要求17的组合物，其中药学上可接受的传递系统选自脂质体，病毒体，微球体和微囊体。
19.权利要求18的方法，其中药学上可接受的传递系统是脂质体。
20.权利要求16的方法，其中载体是选自逆转录病毒载体，腺伴随病毒载体和Epstein-Barr病毒载体的病毒载体。
21.权利要求1的外部指导序列，包含：
RNA酶P裂解靶向序列，
与靶RNA综上的靶向序列互补的识别序列，和
与配体结合的RNA序列，
其中外部指导序列至少一个核苷酸选自修饰的核苷酸和未修饰的脱氧核糖核苷酸，
其中外部指导序列仅当与配体结合时促进RNA酶P对靶RNA分子的裂解。
22.权利要求1的外部指导序列，包含：
RNA酶P裂解靶向序列，
与靶RNA分子上的靶向序列互补的识别序列，和
结合配体的RNA序列，
其中，外部指导序列上的至少一个核苷酸选自修饰的核苷酸和未修饰的脱氧核糖核苷酸，
其中外部指导序列仅当不与配体结合时促进RNA酶P对靶RNA分子的裂解。
23.权利要求1的外部指导序列，其中核糖核苷酸的一个或多个2′-羟基被选自氢，O-烷基，氨基和氟的化学基团取代，
其中一个或多个磷酸(酯)连接基团用选自甲基磷酸(酯)的和硫代磷酸(酯)的连接基团取代，且
其中所述修饰增强了外部指导序列对核酸酶的抗性。
24.权利要求23的外部指导序列，其中核糖核苷酸的一个或多个2′-羟基基团被氢或甲基取代，且
其中一个或多个磷酸(酯)的连接基团用硫代磷酸(酯)取代。
25.权利要求23的外部指导序列，其中3′-端用3′-3′-连接的胸腺嘧啶苷酸封端。
26.一种构建的编码外部指导序列的表达载体，包含下列结构的分离的寡核苷酸分子：
RNA酶P裂解靶向序列，和
与乙肝RNA分子上靶向序列互补的识别序列，
其中外部指导序列促进乙肝RNA分子的RNA酶P介导的裂解。
27.一种用于促进乙肝RNA分子裂解的组合物，其中该组合物包含在于药学上可接受的传递系统中的权利要求25的构建的表达载体。
28.权利要求27的组合物，其中药学上可接受的传递系统选自脂质体，病毒体，微球体和微囊体。
29.一种外部指导序列，包含下列结构的分离的寡核苷酸分子：
RNA酶P裂解靶向序列，
与乙肝RNA分子靶向序列互补的识别序列，
其中外部指导序列促进乙肝RNA分子的RNA酶P介导的裂解。
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