CN102178690B

CN102178690B - 一种抗流行性感冒病毒egs核酸药物的制备方法

Info

Publication number: CN102178690B
Application number: CN 201110007423
Authority: CN
Inventors: 王宇; 李小军
Original assignee: TAIZHOU INSTITUTE OF VIROLOGY
Current assignee: TAIZHOU INSTITUTE OF VIROLOGY
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2031-01-14
Also published as: CN102178690A

Abstract

本发明公开了一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，它包括以下步骤：步骤一，进行EGS位点的选择；步骤二，对EGS进行设计合成；步骤三，针对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因位点的序列，设计合成的三个EGS分别为E-PA、E-PB1、E-M1：步骤四，将设计好的三个EGS序列进行合成，用无菌三蒸水将合成后的EGS冻干物溶解，并稀释至100uM，制得EGS核酸药物，EGS核酸药物分装保存于-20℃、-80℃，备用；步骤五，对EGS核酸药物进行药物筛选；步骤六，最后检测EGS核酸药物对靶向序列在细胞水平对流行性感冒病毒的复制具有抑制作用。本发明制备的EGS核酸药物具有很高的靶向引导切割活性，不但可以有效地抵抗细胞内的流行性感冒病毒，而且对细胞内流行性感冒病毒复制的抑制作用。

Description

一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法。

背景技术

流行性感冒病毒(Influenza virus)是流行性感冒的病原体。长期以来，流感一直是危害人类健康和公众安全的严重传染病，每年由此造成的经济损失也十分巨大,流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属的单股RNA病毒。典型的病毒粒子呈球形，有囊膜，直径为80-120纳米，个别有长短不齐的丝状粒子，囊膜表面覆盖有紧密排列的纤突，分别为病毒的血凝素和神经氨酸酶蛋白。

根据NP蛋白性的不同，可将流感病毒分为A,B,C三型。根据HA和NA抗原性的差异，可分为不同亚型，迄今已发现16种HA（H1-H16）,10种NA（N1-N10）,任一种HA与任一种NA结合后即为一种血清亚型。在自然界，流感病毒在人以及猪和马等动物，尤其是鸟类中间持续流行。流感病毒基因组为分节段、单股负链RNA，共有8个独立的RNA片段。分别编码聚合酶PB1、PB2、PA、血凝素(HA)、核衣壳蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白Ml和M2、非结构蛋白NS1和NS2。

流感病毒的聚合酶(Polymerase)由PB2、PB1和PA组成，由病毒RNA片段(1- 3)编码，其分子量依次为87KD.96KD.85KD。PB2，在病毒mRNA转录的起始阶段识别并结合在6’端I型帽状结构上，另外它还有限制性内切酶的活性，参与宿主mRNA帽状结构的切割。PB1，在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长。PA，在病毒RNA转录和复制过程中与PB1、PB2一起随链的延长而移动，主要参与病毒RNA的复制，与PB1、PB2共同构成RNA聚合酶复合体。在病毒RNA的合成过程中起蛋白激酶或解旋酶的作用。

血凝素(Hemagglutinin,HA)是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，由片段4编码。是结合宿主唾液酸之类的细胞受体，使病毒附着于细胞上，帮助病毒穿透宿主的细胞膜并改变抗原性，以逃脱宿主免疫系统的监视。

核蛋白(Nucleoprotein, NP)由片段5编码的结构蛋白.分子量为60KD，它是病毒核衣壳的主要蛋白成分。具有型特异性。

神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)也构成病毒囊膜的纤突，呈簇存在。NA是一种唾液酸酶，可以识别细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基，使病毒能够进入细胞,NA的另一个功能是为要出芽的病毒粒子清理通道，防止病毒粒子聚集，有利于病毒粒子的成熟和释放。

基质蛋白(Matrix proteins,M )有两种基质蛋白Ml、M2。M1由252个氨基酸残基组成，分子量约为26KD,是所有蛋白成分中含量最多的一种，构成病毒的基质膜，具有型特异性。M2由97个氨基酸残基组成，分子量约为15KD。是一种跨膜蛋白，以四聚体的形式存在于感染细胞的细胞膜上。

非结构蛋白(Nonstructural Proteins, NS)有种非结构蛋白即NS1和NS2，分子量分别为25KD和12KD，NSl在感染的早期合成，NS2在感染的后期合成。NS1蛋白为结合蛋白，它具有抑制带poly(A)结构的mRNA从细胞核内向外运输的功能。NS2又叫核转出蛋白(NEP)，是磷酸化蛋白直接参与子代病毒RNP从病毒细胞中释放出来的过程。

目前抗流感病毒化学药物存在的主要问题包括耐药性、毒副作用和烷胺类药物对B型流感无作用三方面。因此高效、特异、无明显毒副作用是抗流感药物研制首先要解决的问题。

发明内容

本发明提供涉及一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法,，它制备的EGS核酸药物具有很高的靶向引导切割活性，不但可以有效地抵抗细胞内的流行性感冒病毒，而且对细胞内流行性感冒病毒复制的抑制作用。

本发明采用了以下技术方案：一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，它包括以下步骤：步骤一，进行EGS位点的选择：RNase P 在EGS引导下对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因片段mRNA进行切割的靶序列区域的确定，靶RNA的高效切割位点一般具备以下特征，即切点的-1和+1位应分别为嘧啶(U/C)和鸟嘌呤(G)，切点的+8位最好应为尿嘧啶(U)，根据序列通式5’-U/CGNNNNNNＵ-3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点，在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻到3个潜在切点，分别为从翻译起始开始的第15, 1224, 222位核苷；步骤二，对EGS进行设计合成：EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成，其中，T茎环与额外环区序列是固定的，全部EGS的该部分序列均选自于人tRNA，5’结合区和3’结合区序列在不同EGS则不相同，在潜在切点已确定的情况下，根据该切点附近的序列，按照碱基互补配对的原则，设计针对该切点的EGS结合区序列，靶RNA与EGS两侧结合区互补的序列之间应间隔2nt，EGS结合区序列至少具备12nt以尽量保证互补结合的特异性，所设计的全部EGS的结合区序列长度为14-16nt ，5’结合区和3’结合区序列的长度各为7-9nt；步骤三，针对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因位点的序列，设计合成的三个EGS分别为E-PA、E-PB1、E-M1，它们的序列分别为：

E-PA序列：

5’-GGUUAACAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCUUGUCGC

ACCA-3’；

E-PB1序列：

5’-GUAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCGCCCAUCACC

A-3’；

E-M1序列：

5’-GCAAAGCGCGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCACGCUGCACC

A-3’；

步骤四，将设计好的三个EGS序列进行合成，用无菌三蒸水将合成后的EGS冻干物溶解，并稀释至100 uM，制得EGS核酸药物，EGS核酸药物分装保存于-20℃、-80℃，备用；

步骤五，对EGS核酸药物进行药物筛选；

步骤六，最后检测EGS核酸药物对靶向序列在细胞水平对流行性感冒病毒的复制具有抑制作用。

本发明步骤四中对三个EGS序列进行合成时添加2’-O-methyl进行化学修饰。本发明步骤五中对EGS核酸药物进行药物筛选的方法是首先进行细胞外靶向引导切割实验，从人细胞HeLa cells中提取具体外切割活性的RNase P，体外转录流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因mRNA结合设计合成的EGS建立了一种细胞外筛选系统，通过细胞外筛选系统验证所设计EGS的靶向引导切割活性。本发明步骤六中步骤六采用以下方法检测：将细胞外初筛及胞内复筛证实有效的EGS分别以脂质体转染MDCK细胞，然后再以流行性感冒病毒感染，在感染6h、12h、24h、48h和72h后，抽提感染细胞的总RNA，通过Northern blot的方法在细胞水平分析EGS对病毒复制的抑制能力，并在感染6h、12h、24h、48h、60h、72h和96h后吸取MDCK细胞及培养上清测其病毒滴度，并绘制病毒生长曲线，通过病毒生长曲线评价三个EGS1对细胞内流行性感冒病毒复制的抑制活性。

本发明具有以下有益效果：本发明将EGS(external guide sequences)和靶RNA结合，使之形成tRNA类似物，供RNase P识别，因此EGS能引导RNase P对靶RNA进行切割。McClain等人的研究显示，tRNA折叠后形成的上半部份茎环结构(minihelix or T-stem-loop)是RNase P的5’端催化反应的必要区域，可能参与了酶一底物的识别，在真细菌中，最小的EGS序列为NCCA，只要互补就可对靶RNA随意切割。在真核中，EGS和底物形成类似tRNA的结构，任何RNA都能被适当的EGS引导给RNase P切割，从设计策略上看，这种基于RNase P的EGS技术与其它技术相比具有明显的优越性。首先，EGS技术中对靶mRNA实现切割所依赖的RNase P，是原本存在于细胞内的天然核酶，并不需从外面导入，这与其他核酶技术(如锤头状核酶、发夹状核酶等)有所不同。正因为此，其切割活性不会因为导入的过程而有所减弱，只要细胞内EGS可引导靶mRNA结合并形成ptRNA的二级结构，RNase P对其中mRNA的切割活性是完全能够有保证的。其次，就是RNaseP在细胞内的含量非常丰富、活性高、且无细胞毒性，这样有利于实现对靶mRNA有效而完全的切割。再次，RNase P识别的是底物RNA的二级结构，其切割作用特异性高，通常情况下不会像RNase H一样产生非特异性的切割，最后还有一点，即EGS在导入细胞后，首先与靶RNA结合，这种结合本身就有一定的反义寡核苷酸的作用，再结合RNase P对靶mRNA的切割，因此可以说EGS具有双重反义作用，同时针对流行性感冒病毒的感染模式和增殖特点以及流感病毒药物预防和治疗上存在的问题，采用基于核酸的RNase P治疗策略，设计针对在流感病毒基因组复制、病毒粒子组装等过程中具有至关重要的作用的PA、PB1、M1基因的EGS，通过体外化学合成和修饰,研制可用于临床治疗A型流感病毒的基因干扰EGS药物，完全可行，制备的EGS核酸药物具有很高的靶向引导切割活性，不但可以有效地抵抗细胞内的流行性感冒病毒，而且对细胞内流行性感冒病毒复制的抑制作用。

附图说明

图1为本发明在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻到3个潜在切点的分布图。

图2为本发明所设计流行性感冒病毒PA基因mRNA/EGS复合物的二级结构模拟图。

图3为本发明所设计流行性感冒病毒PB1基因mRNA/EGS复合物的二级结构模拟图。

图4为本发明所设计流行性感冒病毒M1基因mRNA/EGS复合物的二级结构模拟图。

图5为本发明所设计的三个EGS对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因mRNA细胞外切割实验结果。

具体实施方式

实施例一，本发明公开了一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，它包括以下步骤：步骤一，进行EGS位点的选择：RNase P 在EGS引导下对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因片段mRNA进行切割的靶序列区域的确定，靶RNA的高效切割位点一般具备以下特征，即切点的-1和+1位应分别为嘧啶(U/C)和鸟嘌呤(G)，切点的+8位最好应为尿嘧啶(U)，根据序列通式5’-U/CGNNNNNNＵ-3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点，在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻到3个潜在切点，分别为从翻译起始开始的第15, 1224, 222位核苷，三个潜在切点的分布见图1所示；

步骤二，对EGS进行设计合成：EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成，其中，T茎环与额外环区序列是固定的，全部EGS的该部分序列均选自于人tRNA，5’结合区和3’结合区序列在不同EGS则不相同，在潜在切点已确定的情况下，根据该切点附近的序列，按照碱基互补配对的原则，设计针对该切点的EGS结合区序列，靶RNA与EGS两侧结合区互补的序列之间应间隔2nt，EGS结合区序列至少具备12nt以尽量保证互补结合的特异性，所设计的全部EGS的结合区序列长度为14-16nt ，5’结合区和3’结合区序列的长度各为7-9nt；

步骤三，针对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因位点的序列，设计合成的三个EGS分别为E-PA、E-PB1、E-M1，它们的序列分别为：

E-PA序列：

5’-GGUUAACAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCUUGUCGC

ACCA-3’；

E-PB1序列：

5’-GUAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCGCCCAUCACC

A-3’；

E-M1序列：

5’-GCAAAGCGCGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCACGCUGCACC

A-3’；流行性感冒病毒PA基因mRNA/EGS复合物的二级结构模拟图见图2，PB1基因mRNA/EGS复合物的二级结构模拟图见图,3所示，M1基因mRNA/EGS复合物的二级结构模拟图如图4所示；

步骤四，将设计好的三个EGS序列进行合成，合成时添加2’-O-methyl进行化学修饰，同时还针对所设计EGS的相应对照EGS (Control EGS，C-EGS )作为对照试验，用无菌三蒸水将合成后的EGS冻干物溶解，并稀释至100 uM，制得EGS核酸药物，EGS核酸药物分装保存于-20℃、-80℃，备用；

步骤五，对EGS核酸药物进行药物筛选，对EGS核酸药物进行药物筛选的方法是首先进行细胞外靶向引导切割实验，从人细胞HeLa cells中提取具体外切割活性的RNase P，体外转录流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因mRNA结合设计合成的EGS建立了一种细胞外筛选系统，通过细胞外筛选系统验证所设计EGS的靶向引导切割活性，下面通过EGS介导的RNase P对靶基因mRNA进行细胞外切割实验来进一步说明：（1）流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因的克隆及体外转录：构建DNA模板表达PA、PB1、M1 mRNA序列，通过T7 RNA聚合酶体外转录试剂盒，对流行性感冒病毒PA、PB1、M1mRNA序列进行体外转录。反应完毕，每50u1转录体积加入lul无RNA酶的胰DNA酶I (1 mg/ml )，混合均匀于37℃温育15-30min。加入150 ul无RNA酶污染的水，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25: 24: 1)抽提。加入20ul 3M NaAC，加入3倍体积(660ul)的无水乙醇，混匀后冰1h, 4℃12000rpm离心25min。小心吸走上清，每管加入300u1 75%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000rpm离心15min，小心吸走上清，将eppendorf管放置于超净台内吹干(大约15min)，最后加无菌DEPC水溶解，-20℃保存备用。（2）RNase P的提取及活性鉴定：以DMEM培养基(含10% FBS)于37℃、5%C02条件下培养人细胞(例如：HeLa Cells)。待培养瓶中的细胞密度约70%时,弃上清并以PBS洗涤一次，然后用细胞刮将细胞轻轻刮下，2500rpm离心1Omin收集细胞。细胞沉淀以24m1缓冲液G重悬，补加甘油至甘油终浓度为20%(V/V) .然后将细胞置液氮中冷冻，之后于-80℃。取出-80℃冻存的细胞，自然解冻。加适量含1g MgC12.6H2O的PBS, 4℃, 2500rpm离心10min，弃上清；细胞沉淀加4倍细胞体积的缓冲液A重悬;细胞悬液于碎冰中静置30min，然后加入终浓度为0.1%的诺乃洗涤剂(NP-40)；以匀浆器迅速匀浆20次，使细胞裂解。细胞裂解液以100000g的离心力离心1Omin(4℃)，去除细胞器及细胞碎片。将上清液缓慢加至己平衡的DEAE-Sepharose Fast-flow柱中(2.5X56cm)，待样品几乎全部流入时，关闭蠕动泵约30min。然后，再以含100mM～5OOmM KCl的缓冲液A行梯度洗脱。通过紫外检测仪监测洗脱的蛋白峰，收集各峰蛋白。最后，并采用浓缩离心管以8000rpm离心30min浓缩之。RNase P活性测定用tRNA底物切割反应。（3）细胞外切割实验：将流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因体外转录的RNA与等摩尔的各EGS片段混合;然后分别加入提取的RNase P，于37℃下反应30min；以8%尿素变性PAGE(含7M尿素)分离，通过Northern blot分析各EGS对靶基因mRNA的切割情况，细胞外切割实验结果如图5所示，证实三个EGS（E-PA、E-PB1、E-M1）均能对靶mRNA实施有效切割；

步骤六，最后检测EGS核酸药物对靶向序列在细胞水平对流行性感冒病毒的复制具有抑制作用，它所采用的检测方法如下：将细胞外初筛及胞内复筛证实有效的EGS分别以脂质体转染MDCK细胞，然后再以流行性感冒病毒感染，在感染6h、12h、24h、48h和72h后，抽提感染细胞的总RNA，通过Northern blot的方法在细胞水平分析EGS对病毒复制的抑制能力，并在感染6h、12h、24h、48h、60h、72h和96h后吸取MDCK细胞及培养上清测其病毒滴度，并绘制病毒生长曲线，通过病毒生长曲线评价三个EGS1对细胞内流行性感冒病毒复制的抑制活性。

下面通过EGS介导的RNase P在细胞内抗病毒实验来进一步说明：

（1）EGS先转染MDCK再接种流行性感冒病毒的抗病毒实验

EGS的脂质体转染：待培养板孔中的MDCK细胞生长密度达到80%-90%时进行转染。转染开始前6h，吸除原来的培养液，换以无血清培养基。将稀释至一定浓度的EGS和脂质体混匀混合，室温下静置20min；将EGS/脂质体复合物加入至相应培养板的各孔，100u1/孔（EGS浓度为100uM）；轻摇匀后放入恒温箱转染6-8h；转染完毕，加入2%FBS血清的MEM培养基，终止转染；

流行性感冒病毒对MDCK的感染：转染8h后，吸除孔中的培养基，D-Hanks液洗涤一遍；向各培养孔细胞中接种稀释的病毒液(Multiplicity of Infection (MOI)=1)，于37℃，5%CO2条件下培养。

病毒感染后不同时间（感染后第6h、12h、24h、48h、72h）收获受感染细胞，提取总RNA，通过Northern blot来分析EGS对PA, PB1和M1 mRNA表达的抑制情况。结果表明:三个EGS对流行性感冒病毒PB1、PA、M1基因mRNA表达的抑制率分别为 85% 士7%, 83士6%, 81士5%。

EGS对流行性感冒病毒感染的预防作用：流行性感冒病毒感染MDCK细胞后通过病毒生长曲线等证实EGS对流行性感冒病毒具有抑制作用。其中，E-PB1的抑制作用较强，E-PA的抑制作用则相对较弱，E-M1最弱。

（2）MDCK先接种流行性感冒病毒再转染EGS的抗病毒实验

流行性感冒病毒对MDCK的感染：当MDCK长至80%～90%时，吸除孔中的培养基，D-Hanks液洗涤一遍；向各培养孔细胞中接种稀释的病毒液(Multiplicity of Infection (MOI)=1) ，于37℃，5%CO2条件下培养。

EGS的脂质体转染：待流行性感冒病毒接种MDCK细胞 8h后。转染开始前6h脂质体转染EGS，吸除原来的培养液，换以无血清培养基。将稀释至一定浓度的EGS和脂质体混匀混合，室温下静置20min；将EGS/脂质体复合物加入至相应培养板的各孔，100u1/孔（EGS浓度为100uM）；轻摇匀后放入恒温箱转染6h-8h；转染完毕，加入2%FBS血清的MEM培养基，终止转染。

EGS对流行性感冒病毒感染的治疗作用：流行性感冒病毒感染MDCK后通过病毒生长曲线等来分析证实EGS对流行性感冒病毒具有抑制作用。E-PB1的抑制作用较强，E-PA的抑制作用则相对较弱，E-M1最弱。

Claims

1.一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，进行EGS位点的选择：RNase P 在EGS引导下对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因片段mRNA进行切割的靶序列区域的确定，靶RNA的高效切割位点一般具备以下特征，即切点的-1和+1位应分别为嘧啶U/C和鸟嘌呤G，切点的+8位最好应为尿嘧啶U，根据序列通式5’-U/CGNNNNNNＵ-3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点，在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻到3个潜在切点，分别为从翻译起始开始的第15, 1224, 222位核苷；

E-PA序列：

5’-GGUUAACAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCUUGUCGCACCA-3’；

E-PB1序列：

5’-GUAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCGCCCAUCACCA-3’；

E-M1序列：

5’-GCAAAGCGCGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCACGCUGCACCA-3’；

步骤四，将设计好的三个EGS序列进行合成，合成时添加2’-O-methyl进行化学修饰，同时还针对所设计EGS的相应对照EGS (Control EGS，C-EGS )作为对照试验，用无菌三蒸水将合成后的EGS冻干物溶解，并稀释至100μM，制得EGS核酸药物，EGS核酸药物分装保存于-20℃、-80℃，备用；

步骤五，对EGS核酸药物进行药物筛选；

2.根据权利要求1所述的抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，其特征是对EGS核酸药物进行药物筛选，对EGS核酸药物进行药物筛选的方法是首先进行细胞外靶向引导切割实验，从人细胞HeLa cells中提取具有外切割活性的RNase P，体外转录流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因mRNA结合设计合成的EGS建立了一种细胞外筛选系统，通过细胞外筛选系统验证所设计EGS的靶向引导切割活性。

3.根据权利要求1所述的抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，其特征是步骤六，最后检测EGS核酸药物对靶向序列在细胞水平对流行性感冒病毒的复制具有抑制作用，它所采用的检测方法如下：将细胞外初筛及胞内复筛证实有效的EGS分别以脂质体转染MDCK细胞，然后再以流行性感冒病毒感染，在感染6h、12h、24h、48h和72h后，抽提感染细胞的总RNA，通过Northern blot的方法在细胞水平分析EGS对病毒复制的抑制能力，并在感染6h、12h、24h、48h、60h、72h和96h后吸取MDCK细胞及培养上清测其病毒滴度，并绘制病毒生长曲线，通过病毒生长曲线评价三个EGS对细胞内流行性感冒病毒复制的抑制活性。